JP2003310248A

JP2003310248A - 生分解性ポリマーを分解する微生物、及びそれを用いて生分解性ポリマーを分解処理する方法

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Publication number: JP2003310248A
Application number: JP2002125101A
Authority: JP
Inventors: Nobuki Hayase; 伸樹早瀬; Kazue Tsutsumi; 主計堤; Katsuhiko Nakagawa; 克彦中川; Yasushi Miyahara; 康史宮原; Kazusaku Tanaka; 一作田中; Suminori Tanaka; 住典田中
Original assignee: Okura Industrial Co Ltd
Current assignee: Okura Industrial Co Ltd
Priority date: 2002-04-26
Filing date: 2002-04-26
Publication date: 2003-11-05

Abstract

(57)【要約】【課題】生分解性ポリマーであるポリブチレンサクシネ
ートアジペート（ＰＢＳＡ）、ポリブチレンサクシネー
ト（ＰＢＳ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）を分解す
る微生物及びこれら生分解性ポリマーの分解方法を提供
する。【解決手段】生分解性ポリマーであるポリブチレンサク
シネートアジペート（ＰＢＳＡ）、ポリブチレンサクシ
ネート（ＰＢＳ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）を分
解するバルクフォーデリア（Burkhoderia）属に属する
微生物または培養物をポリブチレンサクシネートアジペ
ート（ＰＢＳＡ）、ポリブチレンサクシネート（ＰＢ
Ｓ）、ポリカプロラクトンに接触させることにより分解
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生分解性ポリマー
であるポリブチレンサクシネートアジペート（以下、Ｐ
ＢＳＡと略記する）、ポリブチレンサクシネート（以
下、ＰＢＳと略記する）、ポリカプロラクトン（以下、
ＰＣＬと略記する）を分解する微生物およびその培養物
による該生分解性ポリマーの効率的な分解方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】安価に大量生産されるプラスチックは、
自然界で分解が行われないため深刻な自然破壊や廃棄物
処理問題の要因となっている。このような社会的背景を
基に、環境中において分解の進む生分解性ポリマーに大
きな期待が集まっている。生分解性ポリマーは、プラス
チックの利便性と、廃棄物となると自然界で微生物によ
り水と二酸化炭素に完全に分解される環境適合性を有し
ている素材である。生分解性ポリマーには、生分解性の
あるでんぷんやセルロースなどの天然高分子を利用した
「天然物利用系」、微生物が細胞内蓄える脂肪族ポリエ
ステルを利用した「微生物産生系」、化学的にモノマー
の重合反応によって作られた脂肪族ポリエステル構造を
有する「化学合成系」と、製造方法により大きく３つに
分類される。特に、「化学合成系」は、大量に比較的安
価に製造することが可能であることより、多くの商品が
開発され、今後の需要の拡大が期待されている。

【０００３】しかし、これら「化学合成系」の生分解性
ポリマーは、「天然物利用系」、「微生物産生系」の生
分解性ポリマーと異なり、従来の汎用プラスチックと同
様に石油等を原料として人工的に化学合成されたポリマ
ーであり、これら「化学合成系」の生分解性ポリマーと
して市販されているＰＢＳＡ、ＰＢＳ、ＰＣＬ等の化学
合成系生分解性ポリマーを効率よく分解し、また有効利
用できる技術の開発が望まれている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＰＢＳＡ、
ＰＢＳ、ＰＣＬ等の化学合成系生分解性ポリマーを効率
よく分解する微生物、および分解方法を提供することを
課題とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＰＢＳ
Ａ、ＰＢＳ、ＰＣＬ等の化学合成系生分解性ポリマーを
効率よく分解する微生物について鋭意研究を重ねた結
果、ＰＢＳＡ、ＰＢＳ及びＰＣＬを分解する新規微生物
を自然界から分離することに成功し、本発明を完成する
に至った。かくして本発明によれば、（１）バルクフォーデリア（Burkhoderia）属微生物に
由来する、ＰＢＳＡ、ＰＢＳ、ＰＣＬを分解する微生物（２）上記（１）の微生物菌体、またはこの微生物菌体
の培養物を用いてＰＢＳＡ、ＰＢＳ、ＰＣＬ、ＰＥＳ及
びそれらを主骨格とするポリマーから選ばれる一種以上
を効率的に分解する方法が提供される。

【０００６】

【発明の実施の形態】以下、本発明をその実施の形態と
ともに詳細に説明する。本発明のＰＢＳＡ、ＰＢＳ、Ｐ
ＣＬを分解する微生物、またＰＢＳＡ、ＰＢＳ、ＰＣＬ
の効率的分解法に使用される微生物は、バルクフォーデ
リア（Burkhoderia）属に属し、該生分解ポリマー分解
活性を、構成的に発現するか、または誘導物質あるいは
温度等により誘導的に発現するか、生分解性ポリマー以
外の栄養源がポリマー分解に必要であるかなどの如何に
かかわらず、培養して得られる菌体もしくは培養物にＰ
ＢＳＡ、ＰＢＳ及びＰＣＬを分解する活性を有していれ
ば特に制限されない。

【０００７】このような微生物は、例えば以下のような
方法によって自然界より分離、取得、あるいは既存の保
存菌株より選定、取得することができる。生分解性ポリマー分解菌の分離生分解性ポリマー分解菌集積培養培地は、以下のような
組成からなる。（ＰＢＳＡまたはＰＢＳまたはＰＣＬ
１ｇ／ｌ、KH₂PO₄ ２．３４ｇ／ｌ、KH₂PO₄１．３３ｇ
／ｌ、MgSO₄・7H₂O ０．２０ｇ／ｌ、(NH₄)₂SO₄ １．
０ｇ／ｌ、NaCl ０．５ｇ／ｌ、酵母エキス０．２５
ｇ／ｌ、プライサーフ A210G（第一工業製薬製）
０．１ｇ／ｌ、微量元素溶液１．０ｍｌ（微量元素溶
液 CoCl ₂ (11.9mg/L) NiCl₂ (11.8g/L) CrCl₂ (6.3g
/L) CuSO₄ (15.7g/L) FeCl₃ (0.97g/L) CaCl₂ (0.78g/
L) MnCl₂ (10.0g/L) ）。ＰＢＳＡ、ＰＢＳ、ＰＣＬを
除く培地成分をビーカーで作成し、ＰＢＳＡまたはＰＢ
ＳまたはＰＣＬを試験管に入れ、そこに塩化メチレンを
ＰＢＳＡまたはＰＢＳまたはＰＣＬ 1gに対して40mLの
割合で加え溶解させる。この2つを混合し超音波で乳状
にする。

【０００８】その後、加熱して塩化メチレンを除去し
て、ＰＢＳＡ、ＰＢＳ、ＰＣＬエマルジョン培地を作製
する。このエマルジョン化したＰＢＳＡ、ＰＢＳ、ＰＣ
Ｌを唯一の炭素源とした集積培養培地に、土壌、コンポ
スト等を少量添加し、20℃〜40℃、静置条件または振と
う条件下で集積培養する。２日から10日後に微生物の増
殖による培養液の濁りまたはポリマーエマルジョンの分
解により培地の透明化が観察される試験管より、同じ組
成の集積培養培地に集積培養液を添加し、２日から10日
間20℃〜40℃で培養を行う。この集積培養を2回から5回
繰り返す。その後、集積培養液をPBSAをエマルジョン化
した栄養塩寒天培地へ移し、20℃〜40℃で4日から10日
菌を培養する。出現したコロニーの内、コロニーの周り
に透明なクリアーゾーンを形成した菌を分解菌とみな
し、その菌をもう一度同じ培地に植え継いで純化する。

【０００９】この様にして取得できる微生物としてバル
クフォーデリア属に属する微生物バルクフォーデリア・
エスピー（Burkhoderia）１−A株、バルクフォーデリア
・エスピー（Burkhoderia）２−B株、バルクフォーデリ
ア・エスピー（Burkhoderia）３−B株を例示できる。本
菌株は、以下の表１に示す菌学的性質を有している。

【００１０】

【表１】

【００１１】そして、この菌学的性質について、バージ
ェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテ
リオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacterio
logyVol.2,［P.H.A.Sneath, N.S.Mair, M.E.Sharpe and
J.G.Hol(1986) Williams &Wilkins］）に基づき検索し
た結果、これら菌株は、バルクフォーデリア（Burkhode
ria）に属する菌株であると認められたものである。し
かしながら、これら菌株は、生分解性ポリマーであるポ
リブチレンサクシネートアジペート（ＰＢＳＡ）、ポリ
ブチレンサクシネート（ＰＢＳ）及びポリカプロラクト
ンを分解する点で新規な微生物である。また、これら菌
株は、１−A株及び３−B株はオキシダーゼ：＋、である
のに対し２−B 株はオキシダーゼ：― 、２−B株及び３
−B株はゼラチン液化：＋、であるのに対し１−A株はゼ
ラチン液化：―であるという異なった生理学的性質を有
していた。

【００１２】尚、これら菌株は独立行政法人産業技術総
合研究所特許生物寄託センターに、１−A株は受託番
号：ＦＥＲＭＰ−１８８２２、２−B株は受託番号：Ｆ
ＥＲＭＰ−１８８２３、３−B株は受託番号：ＦＥＲＭ
Ｐ−１８８２４として寄託されている。

【００１３】これらＰＢＳＡ、ＰＢＳ、ＰＣＬを分解す
る微生物の培養は、炭素源、窒素源、無機塩、各種ビタ
ミン等を含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素源
としては、例えば、ブドウ糖、ショ糖、果糖、麦芽糖、
ガラクトース、キシロース等の糖類、エタノール、メタ
ノール等のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク
酸、マレイン酸、フマル酸等の有機酸類が用いられる。
窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそ
れぞれ単独もしくは混合して用いられる。また、無機塩
としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他に
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリ
カー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養
素を培地に添加することができる。更に、鉄、マンガ
ン、モリブデン、タングステン、カルシウム等の金属塩
を培地に添加してもよい。

【００１４】培養条件は、通常、通気撹拌、振とう等の
好気条件下に、ＰＢＳＡ、ＰＢＳ、ＰＣＬを分解する微
生物の生育し得る温度であれば特に制限はなく、また、
培養途中のｐＨについても該微生物が生育し得るｐＨで
あれば特に制限はない。培養中のｐＨ調整は、酸または
アルカリを添加して行うことができる。

【００１５】これら分解菌によるＰＢＳＡ、ＰＢＳ、Ｐ
ＣＬの分解には、上記炭素源、窒素源、無機塩、各種ビ
タミン等を含む培地に、ＰＢＳＡ、ＰＢＳ、ＰＣＬの各
フィルム、粉砕物、ペレット等を投入し、上記のような
培養条件で培養することにより分解が可能である。ま
た、培養液や培養上清にＰＢＳＡ、ＰＢＳ、ＰＣＬの各
フィルム、粉砕物、ペレット等を投入することにより分
解することも可能である。

【００１６】これら微生物のＰＢＳＡ、ＰＢＳ、ＰＣＬ
の分解機構としては、エステル結合の切断によりポリマ
ーを分解することが明らかとなっており、これら微生物
のＰＢＳＡ、ＰＢＳ、ＰＣＬの分解代謝物より、有機
酸、アルコール等の回収も可能である。

【００１７】

【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例により更に具体的に説明する。しかしながら、実施例
は本発明の具体的な認識を得る一助とみなすべきのもの
であり、本発明の範囲を何等限定するものではない

【００１８】実施例１ポリブチレンサクシネートアジペート（ＰＢＳＡ）分解
菌の分離生分解性ポリマー分解菌の分離生分解性ポリマー分解
菌集積培養培地は、以下のような組成からなる。ＰＢＳ
Ａ（ビオノーレ ♯３００１、昭和高分子社製）１ｇ
／ｌ、KH₂PO₄ ２．３４ｇ／ｌ、KH₂PO₄ １．３３ｇ／
ｌ、MgSO₄・7H₂O０．２０ｇ／ｌ、(NH₄)₂SO₄ １．０ｇ
／ｌ、NaCl ０．５ｇ／ｌ、酵母エキス０．２５ｇ／
ｌ、プライサーフ A210G（第一工業製薬製）０．１
ｇ／ｌ、微量元素溶液１．０ｍｌ（微量元素溶液 Co
Cl₂ (11.9mg/L) NiCl₂ (11.8g/L) CrCl₂ (6.3g/L) Cu
SO₄ (15.7g/L) FeCl₃ (0.97g/L) CaCl₂ (0.78g/L) Mn
Cl₂ (10.0g/L) ）。ＰＢＳＡを除く培地成分をビーカー
で作成し、ＰＢＳＡを試験管に入れ、そこに塩化メチレ
ンをＰＢＳＡ 1gに対して40mLの割合で加え溶解させ
る。この2つを混合し超音波で乳状にする。その後、加
熱して塩化メチレンを除去して、ＰＢＳＡエマルジョン
培地を作製した。エマルジョン化したＰＢＳＡを唯一の
炭素源とした集積培養培地を試験管に5mlずつ分けて滅
菌し、コンポストをマイクロスパチュラ約一杯分入れ、
30℃、静置条件下で集積培養した。1週間後に微生物の
増殖による培養液の濁りまたはポリマーエマルジョンの
分解により培地の透明化が観察される試験管より、50μ
lの集積培養液をＰＢＳＡをエマルジョン化した栄養塩
寒天培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス
５ｇ／ｌ、NaCl ５ｇ／ｌ、Plysurf A210G（第一工
業製薬製）０．１ｇ／ｌ、PBSA １ｇ／ｌ、寒天２
０ｇ／ｌ）へ植菌し３０℃で５日間培養した。培養後、
出現したコロニーの周りにＰＢＳＡエマルジョンを分解
して透明なクリアーゾーンを形成した菌を分解菌とみな
した。この分解菌を、さらに同じ組成のＰＢＳＡをエマ
ルジョン化した栄養塩寒天培地に植菌して、コロニーを
形成させて、6株の微生物の純化を行った。これら菌株
の内、ＰＢＳＡをエマルジョン化した栄養塩寒天培地上
にて特にＰＢＳＡエマルジョンを分解し、寒天培地の透
明化活性の強い１−Ａ株、２−Ｂ株、３−Ｂ株の３種の
微生物を単離した。これら分離菌株について、前記の如
く更に菌学的諸性質を調べた結果、全てバルクフォーデ
リアに属する菌株であると認められた。しかしながら、
１−A株及び３−B株はオキシダーゼ：＋、であるのに対
し２−B 株はオキシダーゼ：― 、２−B株及び３−B株
はゼラチン液化：＋、であるのに対し１−A株はゼラチ
ン液化：―であるという異なった生理学的性質を有して
おり、各々バルクフォーデリア・エスピー（Burkhoderi
a）１−A株、バルクフォーデリア・エスピー（Burkhode
ria）２−B株、バルクフォーデリア・エスピー（Burkho
deria）３−B株と命名した。

【００１９】実施例２各種生分解性ポリマーエマルジョンの分解生分解性ポリマーとしては、ＰＢＳＡ（ビオノーレ ♯
３００１、昭和高分子社製）、ＰＢＳ（ビオノーレ ♯
１００１、昭和高分子社製）、ＰＬＡ（４０３０Ｄ、カ
ーギル社製）、ポリエチレンサクシネート(ＰＥＳ)（ル
ナーレＳＥ、株式会社日本触媒社製）、ポリヒドロキ
シブチレート/バリレート(ＰＨＢ／ＰＨＶ)（バイオポ
ール、モンサント社製）、ポリ-ε-カプロラクトン(Ｐ
ＣＬ)（平均分子量10000、和光純薬工業社製）、セルグ
リーン（Ｐ（ＨＢ０２Ｂ）、ダイセル化学工業社製）、
マタービー（日本合成化学工業社製）を使用した。これ
ら生分解性ポリマー１ｇ／ｌ、KH₂PO₄ ２．３４ｇ／
ｌ、KH₂PO₄ １．３３ｇ／ｌ、MgSO₄・7H₂O ０．２０
ｇ／ｌ、(NH₄)₂SO₄ １．０ｇ／ｌ、NaCl０．５ｇ／
ｌ、酵母エキス１．０ｇ／ｌ、Plysurf A210G（第
一工業製薬製）０．１ｇ／ｌ、寒天２０ｇ／ｌ、微
量元素溶液１．０ｍｌ（微量元素溶液 CoCl₂ (11.9m
g/L) NiCl₂ (11.8g/L) CrCl₂ (6.3g/L) CuSO₄ (15.7g
/L) FeCl₃ (0.97g/L) CaCl₂ (0.78g/L) MnCl₂ (10.0g
/L)）を含む生分解性ポリマーエマルジョン寒天培地を
作製した。エマルジョン培地の作製方法は、生分解性ポ
リマーを除く培地成分をビーカーで作成し、生分解性ポ
リマーを試験管に入れ、そこに塩化メチレンを生分解性
ポリマー 1gに対して40mLの割合で加え溶解させ、この2
つを混合し超音波で乳状にし、その後、加熱して塩化メ
チレンを除去して、生分解性ポリマーエマルジョン培地
を作製した。その後、バルクフォーデリア・エスピー
（Burkhoderia）１−A株、バルクフォーデリア・エスピ
ー（Burkhoderia）２−B株、バルクフォーデリア・エス
ピー（Burkhoderia）３−B株を各種生分解性ポリマーエ
マルジョン培地に植菌し、３０℃で1週間培養を行っ
た。増殖したコロニー周辺のクリアーゾーンの有無を観
察して、各種生分解性ポリマーの分解性とした。結果を
表２に示す。

【００２０】

【表２】

【００２１】表２から明らかなようにすべての菌は、PB
SA、PBS、PES、PCL、セルグリーン、マタービーを分解
し、広い分解スペクトルを示した。しかし、バイオポー
ル、PLAを分解できなかった。

【００２２】実施例３各種生分解性ポリマーフィルムの分解生分解性ポリマーとしては、ＰＢＳＡ（ビオノーレ ♯
３００１、昭和高分子社製）、ＰＢＳ（ビオノーレ ♯
１００１、昭和高分子社製）、ＰＬＡ（４０３０Ｄ、カ
ーギル社製）、セルグリーン（Ｐ（ＨＢ０２Ｂ）、ダイ
セル工業社製）、エコフレックス（BASFジャパン社製）
を使用した。栄養塩液体培地（トリプトン, 5 g/l; 酵
母エキス, 2.5 g/l; NaCl, 0.50g/l）の入った試験管
に、エタノール殺菌をしたフィルム状の各種生分解性ポ
リマー(厚さ：50μm)を無菌的に投入した。そこに各種
分解菌を植菌し、30℃で2週間振盪培養を行った。その
後、フィルムを回収し洗浄、真空乾燥後重量を測定し
た。分解率＝{（分解試験前のフィルム乾燥重量）−（分解
試験後のフィルム乾燥重）}／（分解試験前のフィルム
乾燥重量）は、上記の式により計算した。結果を表３に示す。

【００２３】

【表３】

【００２４】表３からも明らかなようにPBSA、PBSで
は、完全にフィルムが消滅している実験区が観察され
た。セルグリーン（ポリカプロラクトン系）について
は、１−A株、３−B株でよく分解されていた。また、PL
A（ポリ乳酸）については、本実験条件ではほとんど分
解が認められなかった。エコフレックスについては、数
％の重量減少は観察され、分解速度は遅いが分解が進行
していることが明らかになった。

【００２５】実施例４ＰＢＳＡフィルム（ビオノーレ ♯３００１、昭和高分
子社製）をエマルジョン化した栄養塩液体培地（ＰＢＳ
Ａ, 1 ｇ/ｌ; トリプトン, 5 g/l; 酵母エキス, 2.5 g/
l; NaCl, 0.50g/l）を作製した。ＰＢＳＡエマルジョン
培地の作製方法は、ＰＢＳＡを除く培地成分をビーカー
で作成し、ＰＢＳＡを試験管に入れ、そこに塩化メチレ
ンをＰＢＳＡ 1gに対して40mlの割合で加え溶解させ、
この2つを混合し超音波で乳状にし、その後、加熱して
塩化メチレンを除去して、ＰＢＳＡエマルジョン培地を
作製した。このＰＢＳＡエマルジョン培地を坂口振とう
フラスコに200mL入れ、バルクフォーデリア・エスピー
（Burkhoderia）１−A株を植菌し、３０℃で２週間振盪
培養した。培養後、培養液を凍結乾燥し、凍結乾燥物中
のポリマーをクロロホルムで抽出した。この抽出物をＮ
ＭＲにより分析した。ＮＭＲスペクトルデータより、分
解様式を検討するために模式図（式１）に示したように
ＰＢＳＡを各ユニットに分けて、コハク酸ユニット（Ａ
_３）を基にしたアジピン酸ユニット、1,4-ブタンジオー
ルユニットの分解率を求めた結果を表４に示した。１−
Ａ株により分解したフィルムにおいては、コハク酸ユニ
ットを基にしたアジピン酸ユニット、1,4-ブタンジオー
ルユニットの存在率は減少しアジピン酸ユニットは77.3
%、1,4-ブタンジオールユニットは22.7%の分解が認めら
れ、１−Ａ株はアジピン酸ユニットが選択的に良く分解
されていると考えられる。

【００２６】

【式１】

【００２７】

【表４】

【００２８】

【発明の効果】本発明により、生分解性ポリマーである
ポリブチレンサクシネートアジペート（ＰＢＳＡ）、ポ
リブチレンサクシネート（ＰＢＳ）、ポリカプロラクト
ン（ＰＣＬ）を分解する微生物が提供され、これら微生
物を用いたポリブチレンサクシネートアジペート（ＰＢ
ＳＡ）、ポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）、ポリカ
プロラクトン（ＰＣＬ）の分解法が提供される。本発明
の生分解性ポリマー分解菌及び分解酵素を用いることに
より、あるポリブチレンサクシネートアジペート（ＰＢ
ＳＡ）、ポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）、ポリカ
プロラクトン（ＰＣＬ）を効率的に分解することがで
き、プラスチック廃棄物問題の解決に寄与するととも
に、リサイクル等、資源の有効利用が図れる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者田中一作香川県丸亀市中津町1515番地大倉工業株式会社内 (72)発明者田中住典香川県丸亀市中津町1515番地大倉工業株式会社内Ｆターム(参考） 4B065 AA01X AC12 AC20 BA23 CA55 4F301 AA25 CA09 CA38

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】バルクフォーデリア（Burkhoderia）属に
属する微生物であって生分解性ポリマーであるポリブチ
レンサクシネートアジペート（ＰＢＳＡ）、ポリブチレ
ンサクシネート（ＰＢＳ）及びポリカプロラクトンを分
解する微生物。
【請求項２】ＦＥＲＭＰ−１８８２２菌株である請求
項１記載の微生物。
【請求項３】ＦＥＲＭＰ−１８８２３菌株である請求
項１記載の微生物。
【請求項４】ＦＥＲＭＰ−１８８２４菌株である請求
項１記載の微生物。
【請求項５】バルクフォーデリア（Burkhoderia）属に
属する微生物を用いて生分解性ポリマーであるポリブチ
レンサクシネートアジペート（ＰＢＳＡ）、ポリブチレ
ンサクシネート（ＰＢＳ）、ポリカプロラクトン、ポリ
エチレンサクシネート（ＰＥＳ）及びそれらを主骨格と
するポリマーから選ばれる一種以上を分解処理する方
法。