WO2004078952A1

WO2004078952A1 - 新規ウレタン結合分解菌

Info

Publication number: WO2004078952A1
Application number: PCT/JP2004/002691
Authority: WO
Inventors: Toshiaki Kambe; Yukie Shigeno
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2003-03-03
Filing date: 2004-03-03
Publication date: 2004-09-16
Also published as: JP4062520B2; EP1621608A1; CA2517520C; US20070099285A1; DE602004030438D1; EP1621608A4; CA2517520A1; JP2004261103A; CN100338210C; EP1621608B1; CN1723276A; US7547537B2

Abstract

　プラスチックの処理方法として自然環境の点から好ましいものに微生物を利用した生分解法があるが、プラスチックは一般に生分解性ではないという問題を有する。本発明は、ウレタン化合物を分解することのできる微生物、および該微生物を用いたウレタン化合物の分解方法を提供する。特に、ポリウレタンの原料となるウレタン化合物を分解することのできる微生物および該微生物を用いたポリウレタンの分解方法を提供することを目的とする。

Description

明細書

新規ウレタン結合分解菌技術分野

本発明は、新規な微生物、および該微生物を用いる生物学的処理法によるポリウレタンの分解方法に関する。背景技術

近年、プラスチック廃棄物の処理が問題になっている。プラスチック廃棄物の処理方法としては焼却や埋め立てが主であるが、焼却は地球温暖化の促進、埋め立ては埋立地の減少等の問題を抱えている。例えばポリウレタンは、全世界で年間約 600万 t, 国内では約 55万 tが消費されている。このうち、その発泡緩衝体は断熱性に優れることから冷蔵庫等の断熱材として大量に利用されている。現在、このポリゥレ夕ン廃棄物は不燃ゴミとして埋め立て処分される場合が多いが処分場の不足ならびに環境汚染の問題が生じている。一方、自然環境の点から好ましいものに微生物を利用した生分解法があるが、ポリウレ夕ンは生分解性ではないという問題を有する。

ポリウレ夕ンは分子内にウレタン結合及びエステル結合またはエーテル結合を含み、それらの結合が切断されることによつて分解が進む。ポリオ一ル部分のェステル結合は力ビゃ細菌によって切断されるという報告が数例ある。 Da r by (Da r by R. T. and Kap l an A. M. ： App l. Mi c r ob i o l. ， 16, 900 - 905 (1968) ) らはカビによる種々のポリゥレタン分解試験を行い、エーテル系よりもエステル系ポリゥレ夕ンの方が分解を受け易いことや、ィソシァネートゃポリオールの種類によつて分解特性が異なることを報告している。 Kay (Kay, M. J. , Mc C a b e, R. W. ， Mo r t on, L. H. G. ： I n t. B i od e t e r i o. B i od e g r ad. ， 31， 209 - 225 (1991) . ) らはエステル系ポリウレタン分解菌として 15種類の菌を単離し、分解力の強かったコリネパクテリゥム（Co ryn e b a c t e r i um) 属菌について分解特性を検討した結果について報告している。

しかし、ポリウレタン中のウレタン結合の分解に関する知見はほとんどない。微生物分解に伴って、ウレタン結合が加水分解を受けているという報告は幾つかあるが、ウレタン結合の切断と微生物との因果関係は明らかでない（B. J an s e n e t a l. , Z en t r a l b l B ak t e r i o l. , 276, 36 (1991) , Da r by R. T. and Kap l an A. M. ： A pp l. M i c r ob i o l . , 16, 900— 905 (1968) ) 。

一方、低分子のウレタン化合物が微生物によつて分解されることはすでに報告されており、その分解はエステラーゼによるものであることが知られている。しかし、そのほとんどは酒類の品種改良や力ルバメート系農薬の分解浄化に関するものであり（特開平 01— 300892、特開平 01— 240179、特開平' 0 2— 128689、特開平 03— 175985、特開平 04—104784、特開平 04 - 325079 ) 、ポリウレ夕ンの分解に利用できる技術ではない。ポリゥレ夕ン原料となりうる物質の分解菌としては力ビによるものが報告されているが (特開平 09- 192633) 、大量培養が容易な細菌によるものはない。固体ポリゥレタンの分解菌としては、ポリエステル型のポリゥレタン分解菌としてぺニバチルスアミロリチカス TB— 13株（特願平 2002-334162) およびコマモナスァシドホランス (C omamo n a s a c i dovo r an s ) TB— 35株 (T. N a k a j ima-Kamb e, F. On uma, N. K i mp a r a and T. Nak aha r a, I s o 1 a t i on and c h a r a c t e r i z a t i on o f a b a c t e r i um w i c h u t i l i z e s po l ye s t e r p o l yu r e t ane a s a s o l e c a r b on and n i t r oge n s ou r c e. F E MS Mi c r ob i o l o gy L e t t e r s, Vo l. 129, 39 -42， 1995) が知られているが、これらの分解菌はウレタン中のエステル結合は分解するが、ウレタン結合はほとんど分解しない。従って、ポリウレタンの細菌による完全分解のために、ウレタン結合を分解する細菌の取得が望まれている。発明の開示

本発明は、ウレタン化合物を分解することのできる新規微生物、および該微生物を用いたウレタン化合物の分解方法を提供することを目的とする。特に、ポリウレタンの原料となるウレタン化合物を分解することのできる微生物および該微生物を用いたポリウレタンの分解方法を提供することを目的とする。

この問題を解決するため、我々はポリウレタン合成原料として用いられる低分子量ウレタン化合物を分解する微生物のスクリ一ングを行い、ロドコッカス (R h o d o c o c c u s ) 属に属する微生物が該ゥレタン化合物を分解できることを見出した。尚、口ドコッカス属に厲する微生物がゥレ夕ン化合物の分解能を有することはこれまで知られていなかった。また、本発明者らは口ドコッカス厲に属する微生物を用いるポリゥレ夕ンの分解方法を見出した。

即ち、本発明はウレタン化合物、特にポリウレ夕ン合成原料として用いられる低分子量ウレタン化合物を分解する能力を有する口ドコッカス属に属する微生物を提供するものであり、また、口ドコッカス属に属する微生物を用いたポリウレ夕ンの分解方法を提供するものである。図面の簡単な説明

図 1は、ゥレタン結合分解菌のスクリ一エングに使用した合成ゥレ夕ン化合物の構造を示す。

図 2は、 r D N A塩基配列に基づいて求めた既知の菌種との系統樹を示す。図 3は、各培養条件におけるゥレ夕ン化合物 I残存量の測定結果を示す。図 4は、各培養条件におけるジァミン生成量の測定結果を示す。

図 5は、各培養条件における菌体生育量測定結果を示す。発明を実施するための最良の形態

上述のように本発明は、ウレタン化合物、特にポリウレ夕ン合成原料として用いられる低分子量ウレタン化合物を分解する能力を有するロドコッカス属に属する微生物を提供するものであり、また、ロドコッカス属に属する微生物を用いたポリウレ夕ンの分解方法を提供するものである。ロドコッカス属に属し、ウレタン化合物分解能を有する微生物は、既に公知の微生物であってもよく、新たにスクリーニングされた微生物であってもよい。微生物のスクリーニングの一例を示せば、各地より採取した土壌をポリウレタン合成原料として用いられる低分子量ゥレ夕ン化合物を含む培地の入つた試験管に入れ、 30°Cにて振とう培養し、一週間ごとに植え継ぎを繰り返した後、培養液中に白濁や変色が認められたサンプルについて、培養上清を N B乎板に希釈塗布し、 3 Otで 1〜3日培養後、生育してきたコロニーをピックアップし、ウレタン結合分翠菌の候補菌株とする。それから、得られた候補株を、トルエンジイソシァネー卜とブタノ—ルを反応させて得た低分子量ゥレタン化合物 (ゥレタン化合物 I) を炭素源として含んだ液体培地にて培養し、培養液中にウレタン化合物 Iのゥレタン結合加水分解産物であるトルエンジァミンの生成が確認された菌を取得することにより行うことができる。

本発明の微生物は、ウレタン結合を有する化合物を分解する能力を有する口ドコッカス属菌であればよい。具体的には、代表例として、 2003年 2月 26日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託申請し、寄託を ί巨否されたロドコッカスェクイ（Rhodo c o c c u s e q u i ) T B— 60株であって、 2004年 1月 24日付けでドィッの特許生物寄託機関である DSMZドイツ微生物 *細胞培養収集所（ドイツ連邦共和国 D— 38124 ブラウンシュワイクマツシエロ一デルウェッグ 1 b) に国際寄託されたロドコッカスェクイ TB-60-DSMZ 16175が挙げられる。口ドコッカス属菌の菌学的性質は、パージーズ ·マニュアル ·ォブ ·システマティック · バクテリオロジ一（BERGEY' S MANUAL OF Sy s t ema t i c B a c t e r i o l ogy) (第 1巻 1984年、第 2巻 1986年、第 3巻 1989年、第 4巻 1989年）'に記載されている。

更に本発明の微生物は、ウレタン結合を分解する能力を有するロドコッカス属菌であれば、野生株、変異株のいずれでも.良い。

変異株は、従来からよく用いられている変異剤であるェチルメタンスルホン酸による変異処理、ニトロソグァ二ジン、メチルメタンスルホン酸などの他の化学物質処理、紫外線照射、或いは変異剤処理なしで得られる、いわゆる自然突然変異によつて取得することも可能である。

口ドコッカス属に属する微生物の培養に用いる培地としては、口ドコッカス属に属する微生物が生育できる培地であれば特に制限なく用いることができ、例えば、 L B培埤（ 1 %トリプトン、 0 . 5 %酵母エキス、 1 % N a C 1 ) が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の微生物の生育に使用する培地は、具体的には、本発明の微生物が資化し得る炭素源、例えばグルコース等、及び本発明の微生物が資化し得る窒素源を含有し、窒素源としては有機窒素源、例えばぺプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン 'スチープ'リカー等、無機窒素源、例えば硫酸アンモニゥム、塩化アンモニゥム等を含有することができる。さらに所望により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムィオン等の陽イオンと硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン等の陰イオンとからなる塩類を含んでもよい。さらに、ビタミン類、核酸類等の微量要素を含有することもできる。炭素源の濃度は、例えば 0 . 1〜1 0 %程度であり、窒素源の濃度は、種類により異るが、例えば 0 . 0 1〜5 %程度である。また、無機塩類の濃度は、例えば 0 . 0 0 1〜 1 %程度である。

本発明において分解できるウレタン化合 rは、分子構造中にウレタン結合を有するものであればよい。制限的でない例としては、トルエン一 2， 4一力ルパミン酸ジブチルエステル、トルエン— 2 , 6ージカルバミン酸ジプチルエステル、メチレンビスフエ二ルジカルバミン酸ジプチルエステル、へキサメチレンージカルバミン酸ジブチルエステル、ノルポルネンジカルパミン酸ジブチルエステルおよびそれらを合成原料とするポリゥレ夕ンが挙げられる。

ポリウレタンとは、分子中にウレタン結合 (- NH C O O - ) を有する高分子化合物の総称で、多官能ィソシァネ一トとヒドロキル基含有化合物との反応により得られ、エステル、ェ一テル、アミド、ゥレア、カルバメートなどの基を有するポリマーである。ヒドロキシル基もしくはイソシァネート基の官能性数を変化させることで多種多様の分岐あるいは架橋ポリマーを調製することができる。用いるポリオールの種類によってエステル系とエーテル系に大別できる。ポリウレタンは、易加工性、耐腐敗性、耐変質性、低比重等の優れた特性により、弾性体、発泡体、接着剤、塗料、繊維、合成皮革など幅広い用途を持っており、自動車部品としても広く使用されている。本発明の分解方法において適用し得るポリウレタン樹脂の数平均分子量は、特に制限はない。

更に本発明は、ウレタン結合を有する化合物を微生物の作用により分解処理する方法を提供する。該方法は、微生物の増殖過程でウレタン結合が分解され栄養源として消費されることを利用する、あるいは微生物の有する酵素の作用によりウレタン結合を分解する作用を利用するもの、すなわち増殖した後の微生物菌体、例えば休止菌体を利用するものである。あるいは、菌体を常法により凍結乾燥した粉末状の、あるいはその粉末と各種ビタミンやミネラル、必要な栄養源、例えば酵母エキス、カザミノ酸、ペプトン等を配合した後に打錠した錠剤等固形状の形態の調製物としてウレ夕ン化合物の処理に提供しても良い。また、菌株を活性汚泥およびコンポストの成分として利用することもできる。

分解に供されるゥレタン化合物は、例えば液体の培地中にェマルジョンとして、あるいは粉体の形で加えても良いし、フィルム、ペレツト等の塊として加えても良い。なお、培地に対するウレ夕ン化合物の投入量は、 0 . 0 1〜1 0重量％が望ましい。添加する微生物量は極少量であってもよいが、分解効率を考慮してゥレタン化合物に対して 0 . 1重量％以上（湿重量）が好ましい。また、分解に供するウレタン化合物は、 1種類であっても複数種類であっても良い。

微生物の増殖過程でゥレタン結合が分解され栄養源として消費されることを利用する態様では、ゥレ夕ン化合物を単一の炭素源として、あるいは単一の炭素' 窒素源として与えることも、他の炭素源、窒素源とともに与えることもできる。使用し得る培地としては、炭素源としては、ウレタン化合物あるいはグルコース等、及び本発明の微生物が資化し得る窒素源を含有し、窒素源としては有機窒素源、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン ·スチープ · リカー等、無機窒素源、例えば硫酸アンモニゥム、塩化アンモニゥム等を含有することができる。さらに所望により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオンと硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン等の陰イオンとからなる無類を含んでもよい。さらに、ビタミン類、核酸類等の微量要素を含有することもできる。炭素源の濃度は、例えば 0 . ：!〜 1 0 %程度であり、窒素源の濃度は、種類により異るが、例えば 0 . 0 1〜5 %程度である。また、無機塩類の濃度は、例えば 0. 001〜1%程度である。

微生物の有する酵素のウレタン結合を分解する作用を利用する態様、すわち増殖した後の微生物菌体、例えば休止菌体を利用する態様では、ウレタン結合の分解に際し、該微生物の増殖を伴わないため、緩衝液にウレタン化合物を添加し 'た培地などであっても良いが、その他に窒素源、無機塩、ビタミンなどを添加しても良い。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液が挙げられる。

ウレタン化合物の分解に要する時間は、分解に供するゥレタン化合物め種類、組成、形状及び量、使用した微生物の種類及びウレタン化合物に対する相対量、その他種々の培養条件等に応じて変化しうる。

本発明において、上記微生物に対し、好気条件で、静置培養、振盪培養あるいは通気培養を行えばウレタン化合物の分解がみられる。好ましくは回転振盪培養が良く、回転数は 30〜250回転/分の範囲であるのが良い。培養条件としては、培養温度は 10〜50°C、特に 30°C付近が好ましい。また、培地の pHは 4〜10の範囲、好ましくは 7付近であるのが良い。

培地中のゥレタン化合物の分解の確認は、例えば、分解に供したウレタン化合物の重量減少の測定、残存ウレタン化合物量の高速液体クロマトグラフィ（HP LC) による測定、あるいはゥレ夕ン結合加水分解産物であるジァミン化合物の生成の測定により確認することができる。ジアミン化合物の生成の確認は、例えば薄層クロマトグラフィにて生成が予想されるジァミン化合物を標準物質として用いることにより、またはガスクロマトグラフィにより行うことができる。固体ポリウレタンの分解方法の一態様として、ポリエステル型のポリウレタンのエステル結合分解菌として知られるぺニバチルスアミロリチカス TB— 13株 (受託番号 F ERM P— 19104、特願平 2002— 334162参照）および Zまたはコマモナスァシドボランス TB— 35株と、ウレタン結合分解能を有する本発明の菌を用いることにより、ポリウレタンの完全分解を行うことができる。

実施例

本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。実施例 1 ウレ夕ン結合分解菌のスクリ一二ング

ウレタン化合物の合成方法

分解菌のスクリーニングには、合成したウレタン化合物を使用した（図 1 ) 。これらの化合物は、トルエンジイソシァネート（TD I ) 、メチレンビスフエ二ルジイソシァネート（MD I ) 、へキサメチレンジイソシァネート（HD I ) 、ノルポルネンジイソシァネート（NB D 1 ) などポリウレタンの工業原料として用いられる代表的な 5種類のィソシァネートとブタノールを反応させ、ウレタン化したものである。これらの化合物 (ウレタン化合物 I〜V、図 1参照) はいずれも分子内にウレタン結合を有する物質で、常温では固体で、水に対して不溶で-' あった。

培地 .

分解菌のスクリーニングには、内径 2 2 mmの大型試験管に、表 1に示した無機塩培地を各 1 0 m l分注し、炭素源としてウレタン化合物 I〜 Vのウレ夕ン化合物をそれぞれ約 0 . 1 g添加した後、 1 2 1でで 2 0分間滅菌したものをスクリ一二ング培地とした。培地調製に使用した試薬類はいずれも和光純薬工業社製の特級又はそれに準ずるものを用いた。

表 1 スクリング用培地

組成

KH₂P0₄ 0.6

K₂HP0₄ 1.6

NH₄N0₃ 1.0

MgS0₄ · 7H₂0 0.2

CaClg · 2H₂0 0.01

FeCl₃ · 6H₂0 0.01

ZnS0₄ · 7H₂0 0.01

MnS0₄ · 4H₂0 0.01

ビタミン混合物

H 7.0 «ビタミン混合物終濃度

mg/I

ニコチンアミド 10

Ca-パントテン酸 2.5

チアミン HC1 2.5

リボフラビン 1.25

組ピリドキシン 0.75

P-ァ成ミノペンゾエー卜 0.6

0.5

ピオチン 0.1 スクリーニング

日本各地から収集した土壌 350サンプルをスクリーニング源とした。ウレタン化合物 I〜Vそれぞれに対して 50本、計 250本の試験管を用いた。土壌 2 0サンプルずつを混合して得た土壌サンプルを、上述のスクリーニング培地の入つた試験管 1本につき 0. 2 g添加した。これを 30°C、 125os c/mi n で振盪培養し、 1週間毎に上清 0. 5mlを新たなスクリーニング用培地に移した。この操作を 3回繰り返した後、培養液中に白濁や変色が認められた 26本の試験管サンプルについて、培養上清を生理食塩水で希釈して NB平板培地上に塗布し、 30 で 1〜3日培養後-. 生育してきたコロニーを一つずつピックアップした。これらをウレ夕ン結合分解菌の候補菌株とし、 NB平板培地 0°Cにて培養後、菌体を 20 %グリセ口ール溶液に懸濁し、一 80 °Cで凍結保存した。得られた候補株を、ウレ夕ン化合物 Iを炭素源として含んだスクリ一二ング用液体培地で 30 °C、 125o s c/mi nにて培養し、ゥレタン化合物 Iのウレ夕ン結合加水分解産物であるトルエンジァミンの培養液中における生成を薄層ク口マトグラフィにて確認した。培養上清 0. 5mlに等量の酢酸ェチルを加えて抽出し、酢酸ェチル層を薄層プレート（Me r c k社製 K i e s e 1 g e 16 0 F ₂₅₄) に 60 1スポットした。展開溶媒には酢酸ェチル、メタノール、水を 80 ： 35 ： 3の比率で混合したものを使用した。標準物質としてトルエンジアミンを同様にスポットし、 Rf値、および UV照射下においての吸収による黒色スポットの生成で確認した。その結果、ウレタン結合加水分解産物であるトル

'を生成レた菌株が 1株得られた。これを TB— 60株として— 8 0°Cにて凍結保存した。尚、本菌株は、化合物 Iを用いたスクリーニング系より得られたものである。

実施例 2 ウレタン結合分解菌 TB— 60株の同定

生理学的試験は一般的な方法に従って行った。同定には B e r g ey ' s M a n u a 1 o f Sy s t ema t i c B a c t e r i o l o gy, B a l t imo r e : WI LL I AMS&WI LK I NS Co. , (1984) を参考にした。また、米国 B I OLOG社製の微生物同定システム（M i c r o 1 o g 3) も使用した。 16 s rDNAの配列決定と解析はダイレクト PCR法を用い、プライマーには真正細菌 16S rDNAのほぼ全長を増幅することのできる 27 Fおよび 1492 Rのプライマーセットを使用した。

形態学的，生理学的諸性質試験 ' 好陰陽陰

TB-60株に関する形態学的 ·生理学的諸性質試気験性性の結果は表 2に示した。

勺

本菌株はグラム陽性のコリネ型細菌で、運動性はなく、胞子形成も見られなかつた。また、本菌は非常に水分量の多い白色の半液体状コロニーを形成した。ォキシダ一ゼ試験は陰性で、カタラーゼ試験は陽性、 OF試では陰性を示した。表 2 ウレタン分解菌 TB-60株の菌学的諸性質

形態学的諸性質

形状コリネ型

グラム染色陽性

胞子形成形成しない

運動性なし

コロニーの形態白色、半透明、半液体状, 不定形、拡散性生理学的諸性質

酸素に対する態度

チトクロームォキシダ一ゼ活性

力タラ一ゼ活性

0-F試験 B I OLOG同定システムによる同定

B I OLOG細菌同定システムを用いた同定試験の結果、本菌株は 95%の確率でロドコッカスェクイと同定された。また、そのほかに 50%以上の類似性を持つ菌種は見つからなかった。

表 3 TB— 60株の BIOLOGによる同定結果

可能性

Rhodococcus equi 95

Corynebacterium hoagii 4

Brevibacterium mcbrellneri 0

Corynebacterium lipophiloflavum 0

Corynebacterium jeikeium 0

16 S r DNA塩基配列

コロニーダイレクト PCRによって本菌株の 16 S r DNAのほぼ全長を増幅し-. そのうちの上流領域 535 b p (配列番号 1 ) と下流領域 497 b p (配列番号 2) の塩基配列を決定した。

この配列に基づいて B LASTにより相同性検索を行つたところ、上流領域で

98%、下流領域で 100 %の一致率で口ドコッカスェクイと認められた。配列より求めた既知の菌種との系統樹を図 2に示した。

以上の結果から、本菌株は口ドコッカスェクイであると同定した。

実施例 3 ロドコッカスェクイ TB— 60株によるウレタン化合物分解試供試菌株

ウレタン化合物分解菌として得られた、ロドコッカスェクイ TB—60株を用いた。

培地および試薬実験には前述のスクリーニング用培地の他に、それから窒素源を除いた培地を使用し、ウレタン化合物 Iを炭素源または炭素 ·窒素源として培養を行った。実験に用いた試薬類はすべて和光純薬製特級かそれに準ずるものを使用した。内径 16 mmの小型試験管に、ジェチルエーテルに溶解した 2 %ウレタン化合物 Iを 0. lmlずつ分注し、ドラフト内でジェチルェ一タルを十分に揮発させた後、培地 2 m 1を加え、オートクレーブで 120 °Cで 20分間滅菌した。口ドコッカスェクイ TB— 60株を滅菌済み生理食塩水に 0. D. ₆₆₀= 0. 2 となるように懸濁したものを各試験管に 100 ^ 1植菌し、 30°C、 300 r p mで 0〜10日間回転振盪培養を行った。実験は各 3連で行い、無植菌のものをコントロールとした。

菌体生育量の測定

菌体生育量は、培養液の 0. D. ₆₆。を吸光度計で測定した。吸光度の測定にはジヤスコエンジニアリング社製の吸光度計 V— 550を用いた。

ウレタン分解量の測定

ウレタン化合物 I残存量の測定は、高速液体クロマトグラフィ（HPLC) にて行った。培養液にァセトニトリル 2 mlを加え、よく攪拌した後 20分間静置し、上清をマイクロチューブに移して 12， 000 r p m、 4°Cで違心し、さらにその上清を 2 m 1容のバイアル瓶に移し、各 10 1を試料として HP LCに供した。カラムには東ソ一社製 TSK— GEL ODS-80 TM 4. 6 mm X 15 cmを用い、移動相には 70%ァセトニトリル、流速 0. 6 m 1 /m i n で分析を行った。検出器には UV (240 nm) を用いた。

ジァミン生成量の測定

ウレタン結合の分解に伴って生成するトルエンジァミン量は、ガスクロマトグラフィ（GC) にて定量した。培養終了後、培養上清 0. 5mlをマイクロチューブに移し、内部標準物質としてジフエニルァミン 100 ppmを含む酢酸ェチル溶液 0. 5m 1を加え 10分間よく攪拌した。これを 12, 000 r pm、 4°C で遠心した後、上層を新しいマイクロチューブに移し、約 80mgの無水硫酸ナトリウムを加えて水分を除去したものを試料として各 2 1を GCに供した。 G C分析には島津製作所製の G C— 2 0 1 0を使用し、ジフエニルァミンを内部標準として濃度を算出した。カラムには J &W社製 D B— 1 ( 0 . 2 5 mmX 3 0 m) を用い、カラム温度 1 8 0 °C、インジェクター温度 3 0 0 °C、検出には F I Dを用いた。各培養条件におけるゥレ夕ン化合物 I残存量の測定結果を図 3に示した。ゥレタン化合物 Iを炭素源として与えた系では培養開始 1 0日でウレタン化合物 Iの約 6割が減少した。一方、炭素 ·窒素源として与えた培地においては、ウレタン化合物 Iの減少は観察されたものの、その減少量は少なかった。

ジァミン生成量

ジァミン生成量の測定結果を図 4に示した。ゥレタン化合物 Iを炭素源として与えた系では 1 0日間の培養で約 1 5 0 p p mのトルエンジァミンの生成が認められた。一方、炭素 ·窒素源として与えた培地においては培養初期に顕著なジァミンが生成は認められたものの、その後の生成量はわずかであった。菌体生育量の測定結果を図 5に示した。ゥレタン化合物 Iを炭素源として与えた系では培養初期に顕著な生育が認められた。一方で炭素 ·窒素源として与えた培地においては 3日目以降も緩やかな増殖が認められた。

産業上の利用可能性

本菌株の純粋培養系を用いたウレタン化合物、特にポリゥレタンの集約的分解処理、土壌中やコンポスト中に添加することによる分解処理や肥料として再資源化等への応用が期待される。また、本菌株は細菌であり、一般的に細菌のほうが大量培養が容易であるため、微生物分解処理にはコスト面で有利である点からも有用である。ウレタン中のエステル結合分解菌であるベニバチルスアミロリチカス T B— 1 3株またはコマモナスァシドボランス T B— 3 5株と本発明の微生物を共存させることにより、ポリウレタンの細菌による完全分解が可能となる。

Claims

請求の範囲

1 . ロドコッカス属に属し、ウレタン結合分解能を有する微生物、またはその変異株。

2 . ロドコッカス属に属する微生物がロドコッカスェクイである、請求項 1記載の微生物。

3 . ロドコッカスェクイに属する微生物がロドコッカスェクイ T B - 6 0 株である、請求項 2記載の微生物。

4. 請求項 1〜 3の何れか一項に記載の微生物をウレ夕ン化合物と接触させるェ程を含む、ウレタン化合物の分解方法。

5 . ゥレタン化合物がポリウレタンの製造原料となる化合物である、請求項 4記載の分解方法。

6 . ウレ夕ン化合物がポリウレ夕ンである、請求項 4記載の分解方法。

7 . ポリウレタンの分解方法であって、

ポリウレタンと請求項 1〜 3の何れか一項に記載の微生物を接触させる工程、おょぴ

ポリウレタンとポリウレタンのエステル結合分解能を有する微生物を接触させる工程、

を含む、前記ポリウレタンの分解方法。

8 . ポリウレタンのエステル結合分解能を有する微生物が、ベニバチルスアミ口リチカス T B— 1 3株またはコマモナスァシドボランス T B— 3 5株である、請求項 7記載の方法。