JP4940427B2 - ポリ乳酸の分解方法及び微生物 - Google Patents
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Description
ポリ乳酸分解能を有する微生物としては、例えば、土中から30℃で分離されたアミコラトプシス属放線菌、サッカロスリクス属放線菌、ストレプトマイセス属放線菌が知られている(例えば、特許文献1〜4)。また分子構造中にエステル結合を有するプラスチックの分解能を有するペニバチルス属細菌も、土中から30℃で分離されている(特許文献5)。これらの菌は、30℃4時間程度の処理でポリ乳酸を分解する。また、特許文献6〜7には、土中から50℃で分離されたバチルス・ズブチリス、バチルス・サーキュランス、バチルス・ステロサーモフィラス、アクチノマデュラ属放線菌、スタフィロコッカス属細菌が記載されている。これらの菌は、50℃における2週間程度の処理でポリ乳酸を分解する。
従って、本発明は、ポリ乳酸を効率よく分解可能なポリ乳酸分解方法及びこれに利用可能な微生物を提供することを目的とする。
また前記バチルス・リケニフォルミスが、バチルス・リケニフォルミスT7−2(FERM AP−20920)であることが好ましい。
本発明の微生物は、バチルス・リケニフォルミスT7−2(FERM AP−20920)である。
本発明によって分解可能ポリ乳酸の分子量には特に制限はないが、例えば数平均分子量10,000〜100,000、分解速度の観点から好ましくは50,000〜300,000とすることができる。
バチルス・リケニフォルミスT7−2は、後述するように、森林土壌から、50℃の温度条件下でポリ乳酸を分解可能な微生物として分離された菌であり、グラム陽性を示し、TSB(Trypticase Soy Broth, Becton Dickinson)寒天培地、50℃で培養した栄養細胞は0.8×2〜3 μmの桿菌であり、楕円形の内生胞子を有する。R型のコロニーを形成し、その表面にはしわがあり、光沢はなく、ポリ乳酸の分解について優れた能力を有する。
本発明に係る微生物を維持可能な培養用の基本培地(以下、単に「培地」という)としては、窒素源として例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムなど、その他無機塩類としては、例えばリン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸第一鉄、モリブデン酸ナトリウム、塩化マンガンなどを、それぞれ含むものであって、通常利用される固体又は液体培地であればいずれも好ましく使用できる。なお、培地には、上記成分の他、微生物の成育を促進させるための各種ビタミン、ミネラル、その他の栄養成分を含ませてもよい。
また、ポリ乳酸の分解処理を行う際のポリ乳酸の形態は、フィルム(シート)、成型体、破砕物、粉末、懸濁液などを挙げることができ、これらのいずれであってもよい。また分解処理時のポリ乳酸は、上述したようなポリ乳酸単独であってもよく、他のプラスチックとの混合物であってもよい。
処理は、培養槽に、基本培地、処理対象のポリ乳酸、分解能を有する微生物又はその破砕物を配合した粉末、錠剤、培養液を添加することによって行ってもよく、微生物を活性汚泥及びコンポストに組み込むことによって行ってもよい。
この他、ポリ乳酸の分解に適用可能な条件としては、本発明にかかる微生物の活性を損なわない限り、既知の条件をそのまま適用可能である。
[実施例1]
1. ポリ乳酸(PLA)を分解する微生物の分離
(1) 表1に示す組成のポリ乳酸(PLA)含有基本培地を400ml調製し、それを等量に分け、一つには寒天を6g添加し加熱滅菌(120℃、20分間)する。加熱滅菌後、寒天を添加していない培地に16mlのジククロロメタンで溶解したPLA(レイシアH400、住友化学)を加え、超音波破砕機を用いて十分に乳化(10分間)させた。この乳化したPLAを、寒天を添加した培地に加え十分攪拌後、シャーレに分注し、PLA乳化寒天培地を作製した。
分離菌株(T7−2)をTSB(Becton Dickinson)平板培地に画線し、50℃にて24時間培養した。コロニーを楊枝でピックアップし、20μlの滅菌蒸留水に懸濁した。楊枝の先で、押しつぶしながら混ぜ、180μlのInstaGene Matrix(BIO-RAD社製)を加えた。手で軽く攪拌し、100℃で15分間加熱した。加熱後、10秒間以上攪拌し、12,000rpm(13,000×g)で2〜3分間遠心した。上澄み20μlを50μlスケールのPCRテンプレートとして用いた。
(1)シーケンスサンプルの調製
シーケンスサンプルの調製は、専用キットBigGye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems社製)を使用し、シーケンスには、表4に記載した9F、785F(配列番号3)、802R(配列番号4)を使用した。サイクルシークエンス条件及びサンプル調製方法はマニュアルの方法を一部改変し、表3に示す反応液を用いて、PCR反応を行った。PCR条件は、96℃1分間を1サイクル、96℃10秒間、50℃5秒間、60℃4分間の一連の処理を25サイクルとした。
上記で得られたサンプルに、Clean SEQ(Agencourt社製)10μlを混ぜながら添加した。62μlの85%エタノールを添加して、ピペッティング後、磁気プレート上に置き、3分間静止した。透明になっていることを確認して溶液を廃棄した。85%エタノールを100μl添加し、30秒静置した。溶液を廃棄し、同操作を繰り返した。37℃で10分間インキュベートし、0.1mM EDTA(pH8.0)を40μl加えて、5分間静置した。
上記で得られたT7−2株のPLA分解能を調べた。上記1で使用したPLA乳化寒天培地に、T7−2株を移植し、50℃で5日間培養した。結果を図2に示す。50℃5日間後の培地には、T7−2株による直径約3.1センチのクリアゾーンが形成された。
また、50℃3日間の培養では、T7−2株はPLA乳化寒天培地上に直径約2センチのクリアゾーンが形成した。従来のPLA分解活性性微生物(ストレプトアロテイカス・ヒンズスタヌス、サッカロモノスポラ・アズレア、キブデロスポランギウム・アリズム、サッカロポリスポラ・エリスラエ、サッカロポリスポラ・ホルデイ、ストレプトアロテイカス・ヒンズスタヌス、レントゼア・アルビドカピラタ、アクチノキネオスポラ・リパリア、アクチノポリスポラ・ハロフィラ、アクチノポリスポラ・モルチバリス、アクチノマデュラ・ビィリディス、ストレプトマイセス・ビオァセウスニガー、ストレプトマイセス・シアネス、アミコラトプシス・メディテラネイ)が同程度のクリアゾーンを形成するのに2週間かかることから、T7−2株によるPLA分解活性は従来の菌株よりも優れていることがわかる。
Claims (2)
- ポリ乳酸分解能を有する微生物バチルス・リケニフォルミスT7−2(FERM P−20920)又はその破砕物を用いて、ポリ乳酸を分解することを特徴とするポリ乳酸の分解方法。
- バチルス・リケニフォルミスT7−2(FERM P−20920)。
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