JP4982738B2

JP4982738B2 - プラスチックの分解方法及び微生物

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Publication number: JP4982738B2
Application number: JP2006152728A
Authority: JP
Inventors: 真治徳山
Original assignee: Shizuoka University NUC
Current assignee: Shizuoka University NUC
Priority date: 2006-05-31
Filing date: 2006-05-31
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2026-05-31
Also published as: JP2007319077A

Description

本発明は、プラスチックの分解方法及び微生物に関する。

近年、プラスチックの使用量が増加するにつれて、環境への配慮から天然環境下で分解可能な生分解性プラスチックの開発が進められている。例えばポリ乳酸は、水系環境下で加水分解可能な高分子であり、その分解には酵素が用いられることもある。またポリ乳酸を直接分解する微生物についてもいくつか同定されている。
ポリ乳酸分解能を有する微生物としては、例えば、土中から３０℃で分離されたアミコラトプシス属放線菌、サッカロスリクス属放線菌、ストレプトマイセス属放線菌が知られている（例えば、特許文献１〜４）。また分子構造中にエステル結合を有するプラスチックの分解能を有するペニバチルス属細菌も、土中から３０℃で分離されている（特許文献５）。これらの菌は、３０℃２週間程度の処理でポリ乳酸を分解する。また、特許文献６〜７には、土中から５０℃で分離されたバチルス属細菌、アクチノマデュラ属放線菌、スタフィロコッカス属細菌が記載されている。これらの菌は、５０℃における２週間程度の処理でポリ乳酸を分解する。
特開平９−３７７７６号公報特開２０００−６０５４０号公報特開２００１−１２８６９３号公報特開平１０−１０８６６９号公報特開２００４−１６６５４２号公報特開平１１−４６８０号公報特開平１１−４６７５５号公報

しかしながら、プラスチックの分解処理速度は一般に温度に依存して速くなるが、微生物の生育適温を超えると微生物による分解活性が低下する。一方、微生物のプラスチック分解能は、その微生物種によって異なる。
従って、本発明は、生分解性プラスチックを効率よく分解可能なプラスチック分解方法及びこれに利用可能な微生物を提供することを目的とする。

本発明のプラスチックの分解方法は、プラスチック分解能を有するサーモアクチノマイセス属に属する微生物又はその破砕物を用いて、生分解性プラスチックを分解することを特徴としている。
ここで、前記生分解性プラスチックが、分子構造中にエステル結合を有する生分解性プラスチックであることが好ましい。
上記発明において、前記サーモアクチノマイセス属に属する微生物は、サーモアクチノマイセス・ブルガリス、サーモアクチノマイセス・ディコトミカス、サーモアクチノマイセス・インターメディウス、サーモアクチノマイセス・プチダス、サーモアクチノマイセス・サッカリからなる群より選択された少なくとも一つであることが好ましく、サーモアクチノマイセス・ブルガリスＴ７−１（ＦＥＲＭＰ−２０９１９）であることがより好ましい。
本発明の微生物は、サーモアクチノマイセス・ブルガリスＴ７−１（ＦＥＲＭＰ−２０９１９）である。
なお、本発明において、「生分解性プラスチック」を単に「プラスチック」と称する場合がある。

本発明によれば、生分解性プラスチックを効率よく分解可能なプラスチック分解方法及びこれに利用可能な微生物を提供することができる。

本発明のプラスチックの分解方法は、プラスチック分解能を有するサーモアクチノマイセス属に属する微生物又はその破砕物を用いて、プラスチックを分解することを特徴としている。
本発明におけるプラスチックとしては、プラスチックの分子構造中にエステル結合を有するものが挙げられ、例えば、ポリヒドロキシカルボン酸系などが含まれる。ポリヒドロキシカルボン酸系としては、ポリグリコール酸、ポリ乳酸などの分岐ヒドロキシカルボン酸系、ポリグリコリド系、ポリラクチド系およびラクチド共重合体系、ポリε−カプロラクトン系、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）、ＰＢＳＡ（ポリブチレンサクシネート・アジペート）、ＰＥＳ（ポリエチレンサクシネート）、ＰＢＳＣ（ポリブチレンサクシネート・カーボネート）、ＰＥＳＴ（ポリエチレンサクシネート・テレフタレート）などのＰＢＳ系、乳酸−ジカルボン酸−ジオール系などが該当する。これらのうちの少なくとも一種であることが好ましく、中でも分解活性の観点からポリ乳酸、ポリブチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート・アジペートであることが特に好ましい。

ポリ乳酸としては、乳酸を主成分とする重合体であればよく、ポリＬ−乳酸及びポリＤ−乳酸のようなホモポリマー、ポリＬ／Ｄ−乳酸、これらと他の成分から構成される共重合を挙げることができる。共重合体である場合には、乳酸成分は重量比率が１０％以上のものであることが好ましい。また共重合体を構成する他の成分としては、ε−カプロラクトン、グリコリド、デプシペプチド等を挙げることができる。これらの他の成分は１種であっても、２種以上であってもよい。
ポリブチレンサクシネートとしては、その主鎖中に１，４−ブタンジオールとコハク酸とで形成されるエステル結合（ブチレンサクシート結合）を含む樹脂を意味し、そのブチレンサクシネート結合の主鎖中の割合は、８５モル％以上、好ましくは９５モル％以上である。このようなポリブチレンサクシネートには、１，４−ブタンジオール／コハク酸からなるポリエステルの他、１，４−ブタンジオール及びコハク酸成分以外のモノマー成分として例えばアジピン酸等の脂肪族二塩基酸やエチレングリコール等のジオールを更に含むモノマー混合物から形成された脂肪族共重合ポリエステル、ポリブチレンサクシネートと他の脂肪族ポリエステルや芳香族ポリエステルとをブロック共重合させたポリエステル、これらのポリブチレンサクシネートのブレンド体、並びにこれらのポリブチレンサクシネートと他のポリマーとのブレンド体等が包含される。また、上記ポリブチレンサクシネートには、カーボネート結合をその主鎖中に５〜１５モル％程度含有するものも包含される。前記ブロック共重合及びブレンド体において、そのポリブチレンサクシネート系樹脂の割合は、重量比率で４０〜９５％、好ましくは５０〜８５％である。ポリブチレンサクシネート・アジペートとしては、上記ポリブチレンサクシネートとアジピン酸との共重合体を意味する。共重合体中のアジピン酸成分の割合は、特に制限されない。

本発明によって分解可能なプラスチックの分子量には特に制限はないが、例えばポリ乳酸の場合には、数平均分子量１０，０００〜３００，０００、分解速度の観点から好ましくは５０，０００〜１００，０００、ポリブチレンサクシネート及びポリブチレンサクシネート・アジペートの場合には、数平均分子量３０，０００〜３００，０００、分解速度の観点から好ましくは１００，０００〜２５０，０００とすることができる。

本発明のプラスチックの分解方法に用いられる微生物は、サーモアクチノマイセス属に属する微生物である。サーモアクチノマイセス属に属する微生物は、好気性、グラム陽性、高温性（５０〜６０℃）の細菌で、気菌糸及び栄養菌糸上に単胞子の高度耐熱性内生胞子を形成するものであり、本発明には、そのうちの１種又は２種以上を用いることができる。サーモアクチノマイセス属に属する微生物のうち、分解活性の高さからサーモアクチノマイセス・ブルガリス、サーモアクチノマイセス・ディコトミカス、サーモアクチノマイセス・インターメディウス、サーモアクチノマイセス・プチダス、サーモアクチノマイセス・サッカリを挙げることができ、特に、サーモアクチノマイセス・ブルガリスであることが分解能の観点から好ましい。

サーモアクリノマイセス・ブルガリスとしては、この種に属する微生物であればプラスチックを分解可能であるが、Ｔ７−１株（茨城県つくば市東１−１−１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、受領番号ＦＥＲＭＡＰ−２０９１９、２００６年５月２２日付受領にて寄託）であることが分解活性の高さから好ましい。
サーモアクチノマイセス・ブルガリスＴ７−１は、後述するように、森林土壌から、５０℃の温度条件下でポリ乳酸を分解可能な微生物として分離された菌であり、形態的特徴は放線菌に類似しているが、内生胞子を有し、プラスチックの分解について優れた能力を有する。

本発明に用いられる微生物は、通常用いられる条件下で培養して、維持・増殖させることができる。このような培養条件としては、ｐＨ４〜１０、生育速度の観点から好ましくはｐＨ６．０〜８．０のｐＨ、また４０〜６０℃、生育速度の観点から好ましくは５０〜５５℃の培養温度とすることができる。
本発明に係る微生物を維持可能な培養培地（以下、単に「培地」という）としては、窒素源として例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムなど、その他無機塩類としては、例えばリン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸第一鉄、モリブデン酸ナトリウム、塩化マンガンなどを、それぞれ含むものであって、通常利用される固体又は液体培地であればいずれも好ましく使用できる。なお、培地には、上記成分の他、微生物の成育を促進させるための各種ビタミン、ミネラル、その他の栄養成分を含ませてもよい。

本微生物は、種々の形態でプラスチックの分解に用いられる。このような形態としては、微生物菌体、菌体の破砕物及び微生物の培養上清などの各形態から適宜選択することができる。菌体の場合には、その培養物から遠心分離等の集菌操作によって得られる生菌体、菌体を凍結乾燥した乾燥粉末、微生物を含む培養液のいずれであってもよい。破砕物としては、物理的手段又は化学的手段によって破砕されたものであればよく、物理的手段としては、超音波粉砕機、グラスビーズを用いた細胞破砕機などを挙げることができ、化学的手段としては、リゾチームなどの溶菌酵素を挙げることができる。物理的手段又は化学的手段を用いて菌体を破砕する場合には、それぞれ破砕物の分解活性を損なわない穏和な条件下で行うことが好ましい。培養上清としては、前述した液体培地中で微生物を培養したものであればよく、培養上清における分解活性の強さから、好ましくは培養２日目以降、更に好ましくは培養３日以降の培養上清を使用することができる。

プラスチックの分解処理は、適当な形態に調製された上記微生物を、好気条件下、処理されるべきプラスチックと接触させることによって行われる。分解処理時のｐＨは、ｐＨ４〜１０、分解速度の観点から好ましくはｐＨ６．０〜８．０とすることができる。また分解処理時の温度は、４０〜６０℃、分解速度の観点から好ましくは５０〜５５℃とすることができる。処理時間は、５日間〜１５日間、処理効率の観点から好ましくは７〜１０日間とすることができる。
また、プラスチックの分解処理を行う際のプラスチックの形態は、フィルム（シート）、成型体、破砕物、粉末、懸濁液などを挙げることができ、これらのいずれであってもよい。

分解処理におけるプラスチックの量は、対象となるプラスチックの形態及び処理に用いる微生物の形態によって異なるが、例えばポリ乳酸の場合、本菌培養液１００ｍｌに対して、０．１〜５．０グラムとすることができ、分解速度の観点から０．５〜１．０グラムとすることができる。
処理は、培養槽に、基本培地、処理対象のプラスチック、分解能を有する微生物又はその破砕物を配合した粉末、錠剤、培養液を添加することによって行ってもよく、微生物を活性汚泥及びコンポストに組み込むことによって行ってもよい。
この他、プラスチックの分解に適用可能な条件としては、本発明にかかる微生物の活性を損なわない限り、既知の条件をそのまま適用可能である。

以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。
［実施例１］
微生物の分離
１．ポリ乳酸（ＰＬＡ）を分解する微生物の分離
（１）表１に示す組成のポリ乳酸（ＰＬＡ）含有基本培地を４００ｍｌ調製し、それを等量に分け、一つには寒天を６ｇ添加し加熱滅菌（１２０℃、２０分間）する。加熱滅菌後、寒天を添加していない培地に１６ｍｌのジクロロメタンで溶解したＰＬＡ（レイシアＨ４００、住友化学社製）を加え、超音波破砕機を用いて十分に乳化（１０分間）させた。この乳化したＰＬＡを、寒天を添加した培地に加え十分攪拌後、シャーレに分注し、ＰＬＡ乳化寒天培地を作製した。

（２）森林土壌から、マイクロスパーテルを用いて少量の土壌サンプルを採取し、試験管に分注してある３ｍｌの滅菌水に懸濁する。次に超音波洗浄機で試験管を３０秒間処理して、さらに攪拌機を用いて十分（３分間）に懸濁する。この懸濁液０．１ｍｌを、上記ＰＬＡ乳化寒天培地に塗抹し、５０℃で培養した。この結果、寒天培地上にＰＬＡ分解によるクリアゾーンを形成する微生物Ｔ７−１を得た。

２．微生物の同定
分離菌株（Ｔ７−１）をＴＳＢ（Trypticase Soy Broth, Becton Dickinson）平板培地に画線し、５０℃にて２４時間培養した。コロニーを楊枝でピックアップし、２０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。楊枝の先で、押しつぶしながら混ぜ、１８０μｌのInstaGene Matrix（BIO-RAD社製）を加えた。手で軽く攪拌し、１００℃で１５分間加熱した。加熱後、１０秒間以上攪拌し、１２，０００ｒｐｍ（１３，０００×ｇ）で２〜３分間遠心した。上澄み２０μｌを５０μｌスケールのＰＣＲテンプレートとして用いた。
Ｔ７−１株の１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の増幅は、後述の表４に記載した９Ｆ（配列番号１）及び１５４１Ｒ（配列番号２）をプライマーとして使用して行った。
サーマルサイクラーは、TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Standard（タカラバイオ株式会社）を使用した。ポリメラーゼには、Hot Star Taq DNA polymerase（株式会社キアゲン）を使用した。反応液の組成は以下のとおりとし、ＰＣＲ反応を、９６℃５分間を１サイクル、９７℃４５秒間、５０℃３０秒間、７４℃１分間の一連の処理を５サイクル、９６℃４５秒間、５０℃３０秒間、７４℃１分間の一連の処理を２５サイクルとして行い、ＰＣＲ産物は、PCR Purification Kit -Spin Type- （BIONEX社製）を用いて精製した。

ＤＮＡシークエンスはダイターミネーター法により行った。塩基配列の決定には、ABI PRISM 3100 DNA Sequencer（Applied Biosystems社）を使用した。サイクルシークエンス、シークエンシング産物の生成、シークエンス条件は、マニュアルの方法に従い、以下の方法で行った。
（１）シーケンスサンプルの調製
シーケンスサンプルの調製は、専用キットBigGye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社製）を使用し、シーケンスには、表４に記載した９Ｆ、８０２Ｒ（配列番号３）を使用した。サイクルシークエンス条件及びサンプル調製方法はマニュアルの方法を一部改変し、表３に示す反応液を用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は、９６℃１分間を１サイクル、９６℃１０秒間、５０℃５秒間、６０℃４分間の一連の処理を２５サイクルとした。

（２）シークエンシングサンプルの精製
上記で得られたサンプルに、Clean SEQ（Agencourt社製）１０μｌを混ぜながら添加した。６２μｌの８５％エタノールを添加して、ピペッティング後、磁気プレート上に置き、３分間静止した。透明になっていることを確認して溶液を廃棄した。８５％エタノールを１００μｌ添加し、３０秒静置した。溶液を廃棄し、同操作を繰り返した。３７℃で１０分間インキュベートし、０．１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を４０μｌ加えて、５分間静置した。

１６ＳｒＤＮＡ部分塩基配列の決定および系統解析は以下のとおりに行った。
各プライマーから得られた塩基配列は、Genetix-ATGC ver.10.1（Software development 社製）で編集し、１６ＳｒＤＮＡ部分塩基配列を決定した（図１）。決定された塩基配列を、大学共同利用機関法人情報・システム研究機構国立遺伝学研究所日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ：http://www.ddbj.nig.ac.jp/）よりＢＬＡＳＴ検索を行った。ＢＬＡＳＴ検索の結果から、Ｔ７−１株はサーモアクチノマイセス・ブルガリス（Thermoactinomycetes vulgaris）と推定した。

３．Ｔ７−１株によるＰＬＡ分解
上記で得られたＴ７−１株のＰＬＡ分解能を調べた。上記１で使用したＰＬＡ乳化寒天培地に、Ｔ７−１株を移植し、５０℃で５日間培養した。結果を図２に示す。Ｔ−１株により５０℃培養５日間の培地には、直径約３．２センチのクリアゾーンが形成された。
また、５０℃３日間の培養では、Ｔ７−１株による直径約２センチのクリアゾーンが形成された。従来のＰＬＡ分解活性性微生物（ストプトアロテイカス・ヒンズスタヌス、サッカロモノスポラ・アズレア、キブデロスポランギウム・アリズム、サッカロポリスポラ・エリスラエ、サッカロポリスポラ・ホルデイ、ストレプトアロテイカス・ヒンズスタヌス、レントゼア・アルビドカピラタ、アクチノキネオスポラ・リバリア、アクチノポリスポラ・ハロフィラ、アクチノポリスポラ・モルチバリス、アクチノマデュラ・ビィリディス、ストレプトマイセス・ビオァセウスニガー、ストレプトマイセス・シアネス、アミコラトプシス・メディテラネイ）が同程度のクリアゾーンを形成するのに２週間かかることから、Ｔ７−１株によるＰＬＡ分解活性は従来の菌株よりも優れていることがわかる。

［実施例２］
Ｔ７−１株によるポリブチレンサクシネート・アジペート（ＰＢＳＡ）の分解
ＰＢＳＡ（ビオノーレ、昭和高分子社製）を含むＰＢＳＡ乳化寒天培地を、実施例１のＰＬＡ乳化寒天培地と同様に作製した。このＰＢＳＡ乳化寒天培地にＴ７−１株を移植し、５０℃で７日間培養した。結果を図３に示す。
Ｔ７−１株により５０℃７日間培養の培地には、直径約３．０センチ以上のクリアゾーンが形成された。従来のＰＬＡ分解活性微生物（アミコラトプシス・メディテラネイ、ペニバシラス・アミロリチカス）が同様のクリアゾーンを形成するのに２週間かかることから、Ｔ７−１株によるＰＢＳＡ分解活性は従来の菌株よりも優れていることがわかる。

本発明のＴ７−１株の１６ＳｒＤＮＡ部分塩基配列である。本発明のＴ７−１株によるＰＬＡ分解活性を示す写真である。本発明のＴ７−１株によるＰＢＳＡ分解活性を示す写真である。

Claims

プラスチック分解能を有するサーモアクチノマイセス属に属する微生物又はその破砕物を用いて、生分解性プラスチックを分解することを特徴とするプラスチックの分解方法。
前記生分解性プラスチックが、分子構造中にエステル結合を有する生分解性プラスチックであることを特徴とする請求項１記載のプラスチックの分解方法。
前記サーモアクチノマイセス属に属する微生物が、サーモアクチノマイセス・ブルガリス、サーモアクチノマイセス・ディコトミカス、サーモアクチノマイセス・インターメディウス、サーモアクチノマイセス・プチダス、サーモアクチノマイセス・サッカリからなる群より選択された少なくとも一つであることを特徴とする請求項１又は２記載のプラスチックの分解方法。
前記サーモアクチノマイセス属に属する微生物が、サーモアクチノマイセス・ブルガリスＴ７−１（ＦＥＲＭＰ−２０９１９）であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載のプラスチックの分解方法。
サーモアクチノマイセス・ブルガリスＴ７−１（ＦＥＲＭＰ−２０９１９）。