KR20220042564A

KR20220042564A - 아피오트리쿰 포로섬을 이용한 폴리카프로락톤 고분자의 분해 방법

Info

Publication number: KR20220042564A
Application number: KR1020200125524A
Authority: KR
Inventors: 유영현; 정희영; 이승열; 김순옥
Original assignee: 대한민국(환경부 국립생물자원관장)
Priority date: 2020-09-28
Filing date: 2020-09-28
Publication date: 2022-04-05
Also published as: KR102404872B1

Abstract

본 발명은 아피오트리쿰 포로섬(Apiotrichum porosum) 특히 아피오트리쿰 포로섬 NIBR-WAE-1241 균주(수탁번호: KACC 83034BP)를 이용한 폴리카프로락톤 고분자의 분해 방법을 개시한다.

Description

아피오트리쿰 포로섬을 이용한 폴리카프로락톤 고분자의 분해 방법{Degradation method for polycaprolactone polymer using Apiotrichum porosum}

본 발명은 아피오트리쿰 포로섬(Apiotrichum porosum)을 이용한 폴리카프로락톤 고분자의 분해 방법에 관한 것이다.

전 세계적으로 널리 이용되고 있는 플라스틱은 뛰어난 편의성을 가지고 있는 반면, 사용 후 만들어지는 폐기물 등으로 인해 환경오염의 심각한 원인이 되고 있다.

이러한 고분자 폴리머를 대체하기 위한 여러 가지 대안들이 나오고 있으며, 그 중 하나가 친환경 플라스틱으로 불리는 바이오 플라스틱이다.

바이오 플라스틱이란 재생 가능한 물질인 바이오매스를 원료로 사용하여 제조된 고분자 폴리머로, 일반적으로 바이오매스의 함량에 따라 생분해성 플라스틱(Biodegradable plastic)과 바이오매스 기반 플라스틱(Biomass-based plastics)으로 나뉘어 지는데, 생분해성 플라스틱은 다시 바이오매스를 원료로 하는지 또는 석유계를 기반으로 하는지에 따라 폴리락트산(Polylactic acid, PLA), 폴리글리콜산(Polyglycolic acid, PGA) 등과 같은 생분해성 바이오매스 플라스틱과 폴리카프로락톤(Polycaprolactone, PCL) 등과 같은 생분해성 석유계 플라스틱으로 나뉘어진다.

대표적인 생분해성 고분자 폴리머로 알려진 PCL 및 PLA는 제작된 제품의 함량 및 처리조건에 따라 다르나 자연 상태에서 분해되기까지 오랜 시간이 걸리는 것으로 알려져 있다. 특히 PLA의 경우, 토양 내에서 분해가 시작되기까지 많은 시간이 걸리는 것으로 알려져 있다.

국외에서는 PCL과 PLA를 분해하는데 관여하는 여러 미생물이 보고되어 있는 반면, 국내에서는 담자균문에 속하는 효모인 슈도지마 제주엔시스(Pseudozyma jejuensis)가 PCL을 분해하는 것으로 보고되어 있으나(Seo et al., 2007), 기타 PCL나 PLA을 분해할 수 있는 것으로 알려진 기타 곰팡이에 대한 연구는 전무한 실정이다.

본 발명은 국내 토양에 분리·동정한 아피오트리쿰 포로섬 균주의 폴리카프로락톤 고분자의 분해능을 개시한다.

본 발명의 목적은 아피오트리쿰 포로섬 균주를 이용한 폴리카프로락톤 고분자의 분해 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 국내 토양에서 효모(yeast)인 아피오트리쿰 포로섬 NIBR-WAE-1241 균주를 분리·동정하고, 이 분리·동정된 균주가 폴리카프로락톤(Polycaprolactone, PCL) 고분자의 분해능을 가짐을 확인함으로서 완성된 것이다.

전술한 바를 고려할 때, 본 발명의 폴리카프로락톤 고분자의 분해 방법은 폴리카프로락톤 고분자에 아피오트리쿰 포로섬을 접촉시켜 배양하는 단계를 포함하는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 폴리카프로락톤 고분자는 카프로락톤(carprolactone)의 개환 중합 반응(Ring-opening polymerization)에 의하여 얻어지는 폴리카프로락톤 이외에도 개환 중합 반응의 개시제로서 글리콜류를 사용하여 얻어지는 폴리카프로락톤 디올, 폴리카프로락톤 트리올, 폴라카프로락톤 테트라올 등의 폴리카프로락톤 폴리올을 포함하는 의미이다. 따라서 본 발명의 방법은 폴리카프로락톤의 분해에 적용되는 이외에도 폴리카프로락톤 디올 등의 폴라카르포락톤 폴리올의 분해에도 유용하게 적용될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 아피오트리쿰 포로섬의 배양과 증식을 촉진시킴으로써 아피오트리쿰 포로섬에 의한 폴리카프로락톤 고분자의 분해능을 높이기 위하여, 아피오트리쿰 포로섬을 배지에서 배양하여 얻은 배양액 형태로 폴리카프로락톤 고분자와 접촉시키거나, 폴리카프로락톤 고분자 접촉 전후에 아피오트리쿰 포로섬의 배양과 증식을 촉진하기 위한 배지가 폴리카프로락톤 고분자에 첨가되어 혼합될 수 있다.

그러한 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원, 미량원소, 성장 촉진제 등을 포함한다.

탄소원은 바람직하게는 단당류, 이당류 또는 다당류와 같은 당이다. 예컨대 글루코오스, 프럭토오스, 만노오스, 갈락토오스, 리보오스, 소르보오스, 리불로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 전분, 전분 가수분해물 등이 사용할 수 있다. 당밀이나 당 정제 과정의 부산물 등 복합 화합물이 또한 사용될 수 있다. 경우에 따라서는 대두유, 해바라기유 등 오일이나 아세트산 등의 유기산, 글리세롤 등이 탄소원으로서 바람직할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 또는 2종 이상의 혼합물로 상기 배지에 포함될 수 있으며, 단독으로 배지에 포함되든, 2종 이상의 혼합물로 배지에 포함되든 2%(w/w) 내지 40%(w/w)의 범위로 배지에 포함될 수 있다. 전분이나 전분 가수분해물 등 천연물 또는 천연물 가공물을 탄소원으로 사용할 경우 타 미생물에 의한 원치 않는 발효를 방지하기 위해서 이들 탄소원을 멸균하여 사용할 수 있다. 멸균은 고온·고압 멸균법, 자외선 조사 등 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.

질소원으로서는 통상적으로 무기 질소 화합물, 유기 질소 화합물 또는 이들 화합물들을 포함하는 복합 화합물일 수 있다. 예컨대 무기 질소 화합물로서는 암모니아, 암모늄염(예컨대, 암모늄 술페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 포스페이트, 암모늄 카르보네이트, 암모늄 니트레이트 등), 니트레이트 등을 들 수 있고, 유기 질소 화합물로서는 우레아, 아미노산 등을 들 수 있으며, 복합 화합물로서는 효모 추출물(yeast extract), 소이톤(soytone), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 맥아 추출물(malt extract), 육즙, 콩 분말, 콩 비지 분말, 청국장 분말, 된장 분말 등의 천연 질소원 등을 들 수 있다. 이들 질소원도 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있으며, 배지에 0.1%(w/w) 내지 8.0%(w/w)의 범위로 포함될 수 있다. 천연 질소원을 사용할 경우 천연 탄소원을 사용할 경우와 관련하여 설명한 바와 같은 이유에서 멸균하여 사용하는 것이 바람직하다.

미량원소로서는 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브덴, 칼륨, 망간, 아연, 구리, 철, 인, 황 등을 포함하며 이들 미량원소는 염 화합물 형태로 배지에 첨가될 수 있으며, 이들 미량 원소의 배지에서의 용해도를 높이고 용액 상태를 유지하도록 하기 위해 킬레이트제 예컨대 카테콜, 시트르산 등이 함께 첨가될 수 있다. 상기 염 화합물 형태로서는 인산수소나트륨, 황산마그네슘, 염화철, 칼슘염, 망간염, 코발트염, 몰리브텐산염, 킬레이트금속염 등을 들 수 있다. 이들 미량원소는 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있으며, 0.001%(w/w) 내지 3.0%(w/w)의 범위로 배지에 포함될 수 있다.

성장 촉진제로서는 비오틴, 리보플라빈, 티아민, 폴산, 니코틴산, 판토테네이트, 피리독신 등이 사용될 수 있으며, 0.0001%(w/w) 내지 1.0%(w/w)의 범위로 배지에 포함될 수 있다.

배지는 전술한 바의 탄소원, 질소원, 미량원소, 성장 촉진제 등을 혼합하여 제조하여 사용할 수 있느나, 당업계에서 효모 배양에 일반적으로 이용되는 공지된 조성의 배지, 예컨대 YPD 배지(Yeast Extract-Peptone-Dextrose Medium), SD 배지(Sabouraud Dextrose Medium), SM 배지(Sabouraud Maltose Medium) 등을 사용할 수도 있다. 배지 조성의 최적화에 대해서는 문헌(Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach (Editors P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)을 포함하여 당업계에 많은 문헌이 공지되어 있으며, 이들 공지된 문헌을 참조할 수 있다.

배지는 불필요한 미생물의 증식을 방지하기 위하여 멸균하여 사용하는 것이 바람직한데, 배지의 멸균 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 공지된 멸균 방법 중 적합한 방법을 선택하여 사용할 수 있다. 예컨대 고압 증기 멸균, 자외선을 이용한 멸균 방법 등이 적합할 수 있다.

배양 온도는 일반적으로 15℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃, 더 바람직하게는 25℃ 내지 30℃이다. 배지의 pH는 4 내지 8.5, 바람직하게는 4.0 내지 7.0이다. 배지 pH는 배양이 진행되는 동안 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수성 암모니아 등의 염기성 화합물이나, 인산, 황산 등의 산성 화합물을 첨가하여 조절될 수 있다.

배양 중 형성되는 거품의 제거를 위해서 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제가 첨가될 수 있다.

배양은 증식 특성에 따라 호기 조건 또는 혐기 조건을 만들어 주는 것이 유리할 수 있다.

배양은 회분식(batchwise), 반-회분식(semi-batchwise) 또는 연속식으로 이루어질 수 있다. 적합한 구체적인 배양법은 예컨대 문헌(Bioprozeβtechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess technology 1. Introduction to Bioprocess technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991), 문헌(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and peripheral equipment] (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994), 미국세균학회(the American Society for Bacteriology)가 발행한 문헌(Manual of Methods for General Bacteriology"(Washington D.C., USA, 1981) 등을 참조할 수 있다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 아피오트리쿰 포로섬 NIBR-WAE-1241 균주(수탁번호: KACC 83034BP)에 관한 것이다.

본 발명에 따른 아피오트리쿰 포로섬 NIBR-WAE-1241 균주는 그 28S rRNA 유전자가 서열번호 3의 서열을 갖는 균주로 이해될 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 아피오트리쿰 포로섬을 이용한 폴리카프로락톤 고분자의 분해 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 방법은 자연상태에서 분해되기 어려운 폴리카프로락톤 고분자의 분해에 유용하게 적용될 수 있다.

도 1은 아피오트리쿰 포로섬 NIBR-WAE-1241 균주를 PDA 배지에서 7일간 배양한 사진이다.
도 2는 아피오트리쿰 포로섬 NIBR-WAE-1241 균주의 계통수이다.
도 3은 아피오트리쿰 포로섬 NIBR-WAE-1241 균주의 폴리카프로락톤 고분자 분해능을 보여주는 결과이다.
도 4는 아피오트리쿰 포로섬 NIBR-WAE-1241 균주의 폴리카프로락톤 고분자 함유 최소 배지에서의 투명환 주변을 광학현미경으로 관찰한 결과이다.

이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 아피오트리쿰 포로섬 NIBR-WAE-1241 균주의 분리

아피오트리쿰 포로섬(Apiotrichum porosum) NIBR-WAE-1241 균주의 분리를 위하여, 국내 인천 옹진군 대청도 정향풀 근권에서 채취한 토양 1 g을 멸균수 10 mL를 넣고 진탕배양기에서 30분간 150 rpm으로 진탕하였다. 이후 진탕한 현탁액을 멸균수에 10배씩 희석하여 희석액을 만들고, 감자한천배지(Potato dextrose agar; PDA, Difco, USA)에 희석액 100 μL를 도말하여 25℃에서 암배양였다. 배양 1-2일 후 관찰되는 균사를 새로운 PDA 배지에 계대배양하여 NIBR-WAE-1241라 명명하고 공시균주로 이용하였다.

NIBR-WAE-1241 균주를 PDA 배지에서 7일간 배양한 결과를 도 1에 나타내었는데, 주름진 크림색의 균총을 형성하였으며, 균총의 가장자리에서는 생장하고 있는 균사가 관찰되었다(좌측 앞면 사진, 우측 뒷면 사진).

<실시예 2> 아피오트리쿰 포로섬 NIBR-WAE-1241 균주의 동정

아피오트리쿰 포로섬(Apiotrichum porosum) NIBR-WAE-1241 균주의 분자생물학적 동정을 위하여 28S rRNA 유전자 서열을 분석하였다.

공시균주의 지놈 DNA를, HiGene^TM Genomic DNA prep kit (BIOFACT, Daejeon, Korea)를 이용하여 추출하고 28S rRNA 유전자의 증폭을 위해 정방향 프라이머(서열번호 1, 5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3')와 역방향 프라이머(서열번호 2, 5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3')를 이용하여 PCR를 수행하고 증폭된 PCR 산물은 EXOSAP-IT(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 솔젠트 사(Daejeon, Korea)에 염기서열 분석을 의뢰하고 이후 수령한 데이터는 SeqMan Lasergene software (DNAStar Inc., Madison, Wisconsin, USA)를 이용하여 염기서열을 확보하였다(28S rRNA 유전자 서열은 서열번호 3).

공시균주에서 확보된 염기서열을 기반으로 하여, 계통학적 유연관계를 분석하기 위해 미국국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)의 Blast 프로그램(Basic Local Alignment Search Tool)을 사용하여 기존 보고된 균주와 서열 상동성 비교하였다. 계통학적 유연관계는 MEGA7.0 소프트웨어를 이용하여 작성하였고, 작성한 계통수를 도 2에 나타내었다.

분리된 NIBR-WAE-1241 균주는 아피오트리쿰 포로섬 CBS 2040 균주(Apiotrichum porosum CBS 2040) 및 아피오트리쿰 포로섬 CBS 8397 균주(Apiotrichum porosum CBS 8397)와 100%의 상동성을 보여 아피오트리쿰 포로섬(Apiotrichum porosum)로 동정하였으며, 국립농업과학원 농업미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 기탁하고 수탁번호 KACC 83034BP를 부여받았다.

<실시예 3> 아피오트리쿰 포로섬 NIBR-WAE-1241 균주의 폴리카프로락톤의 분해능

실험에 사용한 고분자는 폴리카프로락톤 디올(Polycaprolactone diol, PCL)(M.W. ~530, Sigma-Aldrich, USA)과 폴리락트산 필름(Polylactic acid film)(PLA)(0.05mm Thickness, ME331050, GFM, Korea)이다.

배양 배지는 Mao 등의 방법을 이용하여 다음과 같이 제작하였다(Mao et al., 2015). 탄소원이 없는 최소배지(MgSO4·7H₂O 0.5 g/L, NH₄Cl 1.0 g/L, KH₂PO₄ 5.54 g/L, Na₂HPO₄ 4.78 g/L, CaCl₂·7H₂O 0.005 g/L, Agar powder 15 g/L)에, 디클로로메탄(Dichloromethane)에 유화제인 Plysurf 1 mL와 함께 녹인 PCL 10 g 또는 PLA 필름 4 g을 혼합하여 제작하였으며, 제작된 배지 상에 공시균주를 치상하여 25℃ 인큐베이터에 배양하면서 분해능을 관찰하였다.

관찰 결과를 도 3에 나타내었는데, PCL 함유 배지는 PCL이 균일하게 녹아 모두 불투명하게 관찰되었으며, 아피오트리쿰 포로섬 NIBR-WAE-1241 균주를 치상하여 배양한 경우, 배양 7일차에 균총 주변에 투명환(clear zone)이 명확하게 관찰되었다. 또 7일 간격으로 관찰한 결과, 배양 일수가 경과되면서 균총의 크기가 커지고, 이에 따라 투명환의 크기가 커지는 것이 관찰되었다. 하지만 PLA 함유 배지에서는 분해능이 관찰되지 않았다(결과 미제시). 도 3에서 붉은화살표로 표시된 부분이 PCL가 분해된 투명환의 모습이다.

또 투명환 주변을 광학현미경으로 관찰한 결과를 도 4에 나타내었는데, 아피오트리쿰 포로섬 NIBR-WAE-1241 균주의 균사가 관찰되었으며, 또 균주에 의해 분해된 PCL과의 경계가 명확하게 관찰되었다. 도 4에서 붉은화살표로 표시된 부분이 균사체이다.

<110> Republic of Korea(National Institute of Biological Resources) <120> Degradation method for polycaprolactone polymer using Apiotrichum porosum <130> PP20-000-NIBR-WAE-1241 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gcatatcaat aagcggagga aaag 24 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggtccgtgtt tcaagacgg 19 <210> 3 <211> 534 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Apiotrichum porosum NIBR-WAE-1241 <400> 3 aaaagaaact aacaaggatt cccctagtaa cggcgagtga accgggaaga gctcaaattt 60 gaaatctggc agtcttcgat tgtccgagtt gtaatctata gaagcgtttt ccgtgctgaa 120 ctgtgtataa gtcccttgga acagggtatc aaagagggtg acaatcccgt actttacaca 180 atcatcagtg ctctgtgata cgttctctac gagtcgagtt gtttgggaat gcagctcaaa 240 atgggtggta aattccatct aaagctaaat attggcgaga gaccgatagc gaacaagtac 300 cgtgagggaa agatgaaaag cactttggaa agagagttaa acagtacgtg aaattgttga 360 aagggaaacg aaattcatga atcatgttta ttggactcag ccgttcttcg gtgtacttcc 420 tttaaacggg tcaacatcag ttttgtccga tggataaagg tagtaggaag gtggctctct 480 cgggagtgtt atagcctatt gctgcataca ttggatgaga ctgaggactg cagc 534

Claims

폴리카프로락톤 고분자에 아피오트리쿰 포로섬(Apiotrichum porosum)을 접촉시켜 배양하는 단계를 포함하는 폴리카프로락톤 고분자의 분해 방법.
제1항에 있어서,
상기 아피오트리쿰 포로섬은 그 28S rRNA 유전자가 서열번호 3의 서열을 갖는 아피오트리쿰 포로섬 NIBR-WAE-1241 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 폴리카프로락톤 고분자와의 접촉은 아피오트리쿰 포로섬을 배지에서 배양하여 얻은 배양액 형태로 폴리카프로락톤 고분자와 접촉시켜 이루어지고,
상기 배지는 탄소원, 질소원, 미량원소 및 성장 촉진제 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 폴리카프로락톤 고분자와의 접촉 전후에 아피오트리쿰 포로섬의 배양과 증식을 촉진하기 위한 배지가 폴리카프로락톤 고분자에 첨가되어 혼합되고,
상기 배지는 탄소원, 질소원, 미량원소 및 성장 촉진제 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
아피오트리쿰 포로섬 NIBR-WAE-1241 균주(수탁번호: KACC 83034BP).