JP2003219877A

JP2003219877A - 動物細胞において遺伝子を導入および発現させるための方法

Info

Publication number: JP2003219877A
Application number: JP2003028933A
Authority: JP
Inventors: Robert J Powell; ジェイ．ポーウェルロバート; George K Lewis; ケイ．レウィスジョージ; David M Hone; エム．ホーンデイビッド
Original assignee: University of Maryland at Baltimore
Current assignee: University of Maryland at Baltimore
Priority date: 1995-05-03
Filing date: 2003-02-05
Publication date: 2003-08-05
Also published as: AU5552796A; JP2005006659A; WO1996034631A1; EP0827410B1; EP0827410A1; CA2219994A1; JPH11505219A; DE69637660D1; AU706104B2; EP0827410A4; US5877159A; ATE406453T1; JP3629274B2

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、生きた侵襲性細菌を使用して、１
つ以上の真核生物発現カセットを動物細胞または動物組
織に送達すること、生きた侵襲性細菌を使用して、ワク
チン抗原をコードする１つ以上の真核生物発現カセット
を動物細胞または動物組織に送達すること、生きた侵襲
性細菌を使用して、治療薬をコードする１つ以上の真核
生物発現カセットを動物細胞または動物組織に送達する
こと、生きた侵襲性細菌を使用して、生物学的に活性な
RNA種をコードする１つ以上の真核生物発現カセットを
動物細胞または動物組織に送達することを提供すること
を課題とする。【解決手段】動物細胞内に遺伝子を導入および発現さ
せる方法であって、該方法が、該動物細胞を生きた侵襲
性細菌で感染させる工程を包含し、該細菌が、該遺伝子
をコードする真核生物発現カセットを含有する、方法。

Description

【発明の詳細な説明】【０００１】【発明の属する技術分野】本発明の開発は、メリーラン
ド州バルチモアのメリーランド大学によって支援され
た。【０００２】発明の分野本発明は、生きた侵襲性細菌をベクターとして用いて内
生または外来遺伝子を動物細胞内に導入する方法に関す
る。この方法は、内生または外来遺伝子をコードする真
核生物発現カセットを動物細胞または動物組織に送達す
ることができ、そして動物細胞または動物組織内で、例
えばワクチン抗原、治療薬、免疫調整剤、アンチセンス
RNA、および触媒RNAを発現させるために有用である。【０００３】【従来の技術】発明の背景Ｉ．生きた細菌ベクターワクチン組換えDNA技術の進歩により、伝染性、風土性、および
汎流行性感染症を制御するワクチンの開発が大いに促進
された（Woodrowら編、NewGeneration Vaccines: The M
olecular Approach，Marcel Dekker，Inc.，New York，
NY(1989)；Cryz編、Vaccinesand Immunotherapy，Perga
mon Press，New York，NY(1991)；およびLevineら、Pe
d．Ann.，22:719-725(1993)）。特に、この技術によ
り、細菌ベクターワクチンと呼ばれる新しいクラスのワ
クチンの増殖が可能になった（Curtiss編、In:New Gene
ration Vaccines: The Molecular Approach，Marcel De
kker，Inc., New York,NY、161〜188頁および269〜288
頁(1989)；およびMimsら編、In: Medical Microbiolog
y，Mosby-Year BookEurope Ltd.，London(1993)）。こ
れらのワクチンは、経口、経鼻腔、または非経口により
宿主に入り得る。一旦宿主に入ると、細菌ベクターワク
チンは、その中に含まれる真核生物発現カセットを発現
し、このカセットは外来抗原をコードする。外来抗原
は、ワクチン特性を有する細菌病原体、ウィルス病原
体、または寄生病原体由来のタンパク質（またはタンパ
ク質の一部）もしくはそれらのタンパク質の組み合わせ
であり得る。（NewGeneration Vaccines: The Molecula
r Approach（前出）；Vaccines and Immunotherapy（前
出）；Hilleman、Dev．Biol．Stand.，82:3-20(1994)；
Formalら、Infect．Immun．34:746-751(1981)；Gonzale
zら、J．Infect．Dis.，169:927-931(1994)；Stevenson
ら、FEMSLett.，28:317-320(1985)；Aggarwalら、J．Ex
p．Med.，172:1083-1090(1990)；Honeら、Microbial．P
ath.，5:407-418(1988)；Flynnら、Mol．Microbiol.，
4:2111-2118(1990)；Walkerら、Infect．Immun.，60:42
60-4268(1992)；Cardenasら、Vacc.，11:126-135(199
3)；Curtissら、Dev．Biol．Stand.，82:23-33(1994)；
Simonetら、Infect．Immun.，62:863-867(1994)；Charb
itら、Vacc.，11:1221-1228(1993)；Turnerら、Infec
t．Immun.，61:5374-5380(1993)；Schodelら、Infect．
Immun.，62:1669-1676(1994)；Schodelら、J．Immuno
l.，145:4317-4321(1990)；Stabelら、Infect．Immu
n.，59:2941-2947(1991)；Brown、J．Infect．Dis.，15
5:86-92(1987)；Doggettら、Infect．Immun.，61:1859-
1866(1993)；Brettら、Immunol.，80:306-312(1993)；Y
angら、J．Immunol.，145:2281-2285(1990)；Gaoら、In
fect．Immun.，60:3780-3789(1992)；およびChatfield
ら、Bio/Technology，10:888-892(1992)）。細菌ベクタ
ーワクチンを用いる外来抗原の宿主組織への送達は、外
来抗原に対する宿主免疫応答を生じ、これは、外来抗原
起源である病原体に対する保護を提供する（Mims．TheP
athogenesis of Infectious Disease，Academic Pres
s，London(1987)；およびNewGeneration Vaccines: The
Molecular Approach（前出）。【０００４】細菌ベクターワクチンの中でも、生きた経
口Salmorellaベクターワクチンが最も広く研究されてい
る。Salmonellaベクターが細菌抗原、ウィルス抗原、お
よび寄生生物抗原に対する体液および細胞免疫を引き出
し得ることを示す例は数多くある（Formalら、Infect．
Immun.，34:746-751(1981)；Gonzalezら（前出）；Stev
ensonら（前出）；Aggarwalら（前出）；Honeら（前
出）；Flynnら（前出）；Walkerら（前出）；Cardenas
ら（前出）；Curtissら（前出）；Simonetら（前出）；
Charbitら（前出）；Turnerら（前出）；Schodelら（前
出）；Scholdeら(1990)（前出）；Stabelら（前出）；B
rown（前出）；Doggettら（前出）；Brettら（前出）；
Yangら（前出）；Gaoら（前出）；およびChatfieldら
（前出））。これらの体液応答は粘膜コンパートメント
で（Stevensonら（前出）；Cardenasら（前出）；Walke
rら（前出）および；Simonetら（前出））、ならびに全
身コンパートメントで（Gonzalezら（前出）；Stevenso
nら（前出）；Aggarwalら（前出）；Honeら（前出）；F
lynnら（前出），Walkerら（前出）；Cardenasら（前
出）；Curtissら（前出）；Simonetら（前出）；Charbi
tら（前出）；Turnerら（前出）；Schodelら（前出）；
Scholde1ら(1990)（前出）；Stabelら（前出）；Brown
（前出）；Doggettら（前出）；Brettら（前出）；Yang
ら（前出）；Gaoら（前出）；およびChatfieldら（前
出））で起こる。生きた経口Salmonellaベクターワクチ
ンはまた、外来抗原に対するＴ細胞応答を誘引する（Wi
ckら、Infect．Immun.，62:4542-4548(1994)）。これら
は、抗原特異的細胞障害性CD8^＋Ｔ細胞応答を含む（Gon
zalezら（前出）；Aggarwalら（前出）；Flynnら（前
出）；Turnerら（前出）；およびGaoら（前出））。【０００５】理想的には、細菌ベクターワクチンは、レ
シピエント動物またはヒトによって遺伝子的に定義さ
れ、弱毒化され、そして良好に寛容され、かつ免疫原性
を保持する(Honeら、Vaccine，9:810-816(1991)；Tacke
tら、Infect．Immun.，60:536-541(1992)；Honeら、J．
Clin．Invest.，90:412-420(1992)；Chatfieldら、Vacc
ine，10:8-11(1992)；Tacketら、Vaccine，10:443-446
(1992)；およびMims（前出））。近年、原核生物発現カ
セットの送達のための潜在的な細菌ベクターワクチンの
数が増加している。これらは現時点ではYerSiniaentero
colitica（van Dammeら、Gastroenterol.，103:520-531
(1992)）、Shigella spp．（Noriegaら、Infect．Immu
n.，62:5168-5172(1994)）、Vibriocholerae（Levine
ら、In: Vibrio cholerae，Molecular to Global Persp
ectives，Wachsmuthら編、ASMPress，Washington，D.
C.、395-414頁(1994)）、Mycobacterium BCG株（Lagran
derieら、Vaccine，11:1283-1290(1993)；Flynn、Cel
l．Molec．Biol.，40(補遺、1):31-36(1994)）、および
Listeriamonocytogenes（Schaferら、J．Immunol.，14
9:53-59(1992)）ベクターワクチンを含むが、これらに
限定されない。【０００６】II．真核生物および原核生物発現カセット通常は、発現カセットは、プロモーター領域、転写開始
部位、リボソーム結合部位(RBS)、タンパク質（または
そのフラグメント）をコードするオープンリーディング
フレーム(orf)を含み、これらはRNAスプライス部位（真
核生物のみ）、翻訳停止コドン、転写ターミネータ、お
よび転写後ポリアデノシンプロセシング部位（真核生物
のみ）を有するかまたは有さない（Wormington，Curr．
Opin．CellBiol.，5:950-954(1993)；Renznikoffら編、
Maximizing Gene Expression，Butterworths，Stoneha
m，Ma(1986)）。真核発現カセットにおけるプロモータ
ー領域、RBS、スプライス部位、転写ターミネータ、お
よび転写後ポリアデノシンプロセシング部位は、原核生
物発現カセットのものとは著しく異なる（Wasylyk、In:
Maximizing Gene Expression、（前出）、79-99頁；Rez
nikoffら、In: Maximizing GeneExpression、（前
出）、1-34頁；およびLewin、Genes V，Oxford Univers
ity Press，Oxford(1994)）。これらの相違は、真核生
物細胞内での原核生物発現カセットの発現を妨げ、そし
て組成物の逆もまた同様である（Millerら、Mol．Micr
o.，4:881-893(1990)；およびWilliamsonら、Appl．En
v．Micro.，60:771-776(1994)）。【０００７】原核生物プロモーターは真核生物細胞内で
は活性化せず、そして真核生物プロモーターは原核生物
細胞内では活性化しない（Eickら、Trends inGenetic
s，10:292-296(1994)）。真核生物のプロモーターと原
核生物プロモーターとの間に機能的相違があることの根
拠に、RNAポリメラーゼ、転写調節因子、およびプロモ
ーターのDNA構造が介在している（Eickら（前出））。【０００８】RNAポリメラーゼは、プロモーター領域のD
NAの特定の配列を認識するDNA結合タンパク質である。R
NAポリメラーゼは、DNAコード配列によって示される特
定の順序でヌクレオシド三リン酸を重合することによっ
てRNA分子の合成を触媒する（Libbyら、Mol．Micro.，
5:999-1004(1991)；Kerppolaら、FASEBJ.，5:2833-2842
(1991)；Albertsら編、Molecular Biology of the Cel
l，Garland PublishingInc.，New York，NY(1994)；Wat
sonら編、Molecular Biology of the Gene,第１巻，The
Benjamin/Cummings Publishing Comp．Inc.，Menlo Par
k CA（1987）；およびLewin（前出））。原核生物のRNA
ポリメラーゼは、代表的には、２つの同一のαサブユニ
ットおよび２つの類似するが同一ではないβおよびβ’
サブユニットよりなる（Ishihama、Mol．Micro.，6:328
3-3288(1992)；Watsonら（前出）；Albertsら（前
出）；およびLewin（前出））。所定のプロモーター領
域のための原核生物RNAポリメラーゼの特異性には、プ
ロモーター領域のDNAによってコードされるコア配列を
認識する特異的なσファクターにより媒介される（Libb
yら（前出）；およびLewin（前出））。【０００９】真核生物細胞内には３つのRNAポリメラー
ゼが存在する。各異なるRNAポリメラーセは、10〜15個
の異なるサブユニットを含み、そして各々が異なる機能
を担う（Kerppolaら（前出）；Larsonら、Biochem．Cel
l．Biol.，69:5-22(1991)；Archambaultら、Microbio
l．Rev.，57:703-724(1993)；Watsonら（前出）；Alber
tsら（前出）；およびLewin（前出））。さらに、真核
生物RNAポリメラーゼがプロモーター領域のDNAに結合す
るために、特定のDNA結合ファクターが必要となり得る
（Darnellら、MolecularCell Biology，Scientific Ame
rican Books，Inc.，W.H．Freeman and Co.，New Yor
k，NY(1990)；Horiら、Curr．Opin．Gen．Devel.，4:23
6-244(1994)；Lewin（前出）；Watsonら（前出）；およ
びAlbertsら（前出））。これらの結合ファクターはDNA
中の特定の配列を認識し、そしてまた真核生物RNAポリ
メラーゼと相互作用する。【００１０】原核生物プロモーターのDNA一次配列と真
核生物プロモーターのDNA一次配列との間には類似性は
ほとんどない。原核生物プロモーターのDNA構造は比較
的単純であり、-10および-35領域ならびに隣接する調節
配列よりなる（Darnellら（前出）；Lewin（前出）；Wa
tsonら（前出）；およびAlbertsら（前出））。原核生
物のプロモーターは転写開始部位より上流に位置する。
これに対して、真核生物プロモーターは、通常は転写開
始部位より50bp上流から20bp下流に位置するコアユニッ
ト（Darnellら（前出）；Lewin（前出）；Watsonら（前
出）；およびAlbertsら（前出））、および転写開始よ
り約100〜200bp上流に位置するが離れた場所にも位置し
得るエンハンサー配列（Sonenberg、Curr．Opin．Gen．
Devel.，4:310-315(1994)；Geballeら、TrendsBio．Sc
i.，1:159-164(1994)；およびLewin（前出））よりな
る。【００１１】RBSは、メッセンジャーRNA(mRNA)分子の5'
末端に結合するための、リボソームによって認識される
部位である。この結合は、mRNAをリボソームによってタ
ンパク質に翻訳するために必須である。原核生物では、
mRNA分子の5'末端中のRBSは、小さなリボソームRNA分子
(5SrRNA)の3'末端に相補的な配列である（Chatterji
ら、Ind．J．Biochem．Biophys.，29:128-134(1992)；
およびDarnellら（前出）；Lewin（前出）；Watsonら
（前出）；およびWatsonら（前出））。RBSの存在は、
発生期のmRNA分子の5'末端へのリボソームの結合を促進
する。次いで、スキャンしているリボソームが出会う最
初のAUGコドンで翻訳が開始される（Darnellら（前
出）；Lewin（前出）；Watsonら（前出）；およびAlber
tsら（前出））。現時点では、真核生物のmRNA−リボソ
ーム相互作用にはこのような認識パターンは観察されて
いない（Eickら（前出））。さらに、真核生物mRNAの翻
訳の開始前に、メチル化したグアニレートを最初のmRNA
ヌクレオチド残基に添加することによって、mRNA分子の
5'末端に「キャップ」が付けられる（Darnellら（前
出）；Lewin（前出）；Watsonら（前出）；およびAlber
tsら（前出））。真核生物リボソームによるmRNA内の翻
訳開始部位の認識は、このキャップの認識、その後のmR
NA上の開始コドンを取り囲む特定の配列への結合を含む
ということが提案されている。脳心筋炎ウィルス由来の
配列（Dukeら、J．Virol.，66:1602-1609(1992)）のよ
うなキャップ非依存性翻訳エンハンサー(CITE)配列が、
コード領域の前に含まれるかまたはコード領域の間に含
まれる場合は、キャップ非依存性翻訳開始を生じるか、
および／または、真核生物発現カセット内に複数の真核
生物コード配列を配置することが可能である。しかし、
開始AUGコドンは必ずしもリボソームが最初に出会うAUG
コドンというわけではない（Louisら、Molec．Biol．Re
p.，13:103-115(1988)；およびVoormaら、Molec．Bio
l．Rep.，19:1:39-145（1994）；Lewin（前出）；Watso
nら（前出）；およびAlbertsら（前出））。従って、真
核生物におけるRBS結合配列は原核生物RBS結合配列とは
かなり異なるので、これら２つは相互変換し得ない。【００１２】原核生物での転写の終了にはrho非依存型
およびrho依存型のステムループが介在する（Richardso
n、Crit．Rev．Biochem．Mol．Biol.，28:1-30(1993)；
Platt、Molec．Microbiol.，11:983-990(1994)；および
Lewin（前出））。これに対して、ターミネータループ
は、通常は、真核生物発現カセットの下流には見い出さ
れず、そして転写はオープンリーディングフレームの末
端を超えて伸長することが多い（Tuiteら、Mol．Biol．
Reps.，19:171-181(1994)）。しかし、通常は、過剰に
伸長したmRNAはエンドヌクレアーゼによって特異的に切
断され、そしてmRNAの3'末端はpoly-Aポリメラーゼによ
ってポリアデニル化される（Proudfoot、Cell，64:671-
674(1991)；Wahle，Bioassays，14:113-118(1992)；Lew
in（前出）；およびWatsonら（前出））。これらの翻訳
後修飾を生じさせるためには、エンドヌクレアーゼおよ
びpoly-Aポリメラーゼによって認識される配列がmRNA分
子の3'末端に含まれなければならない。mRNA分子の3'末
端のポリアデニル化は、真核生物細胞の細胞質にmRNAを
輸送し、そしてタンパタ質に翻訳する前の必要なステッ
プであると考えられる（Sachsら、J．Biol．Chem.，26
8:22955-22958(1993)；およびSachs、Cell，74:413-421
(1993)）。真核生物発現カセットは機能的な遺伝子産生
物をコードする必要はない。すなわち、真核生物発現カ
セットはまた、真核生物酵素（Warneら、Nature，364:3
52-355(1993)；およびWang、J．CellBiochem.，45:49-5
3(1991)）、アンチセンスRNA（Magrath、Ann．Oncol.，
5(補遺、1):67-70(1994)；Milliganら、Ann．NYAcad．S
ci.，716:228-241(1994)；およびSchreier、Pharma．Ac
ta Helv.，68:145-159(1994)）、触媒RNA（Cech、Bioch
em．Soc．Trans.，21:229-234(1993)；Cech、Gene，13
5:33-36(1993)；Longら、FASEJ.，7:25-30；およびRosi
ら、Pharm．Therap.，50:245-254(1991)）、またはRNA
に転写され得る他の任意の配列のインヒビターとして作
用する部分遺伝子産物をコードし得る。【００１３】真核生物細胞の生態学を研究するために真
核生物発現カセットが必要であるため、現在では多くの
真核生物発現プラスミドが容易に入手可能である。これ
らは、InvitrogenCorporation(San Diego，CA)、Strata
gene(La Jolla，CA)、ClonTech(Palo Alto，CA)、およ
びPromegaCorporation(Madison，WI)ような会社の商品
を含むが、これらに限定されない。これらのすべてのプ
ラスミドは、上記に列挙した真核生物発現カセットのエ
レメントを含み、そして多くはまた、プロモーター配列
より下流に位置する遺伝子が、原核生物細胞ならびに真
核生物細胞において発現されるような原核生物プロモー
ター配列を含む。例えば、プラスミドpSVβ-galは、真
核生物SV40プロモーターおよび原核生物細胞または真核
生物細胞のいずれかにおけるβガラクトシダーゼ遺伝子
の発現を可能にする原核生物gptプロモーター(PromegaC
orp.)を含む。【００１４】III．真核生物発現カセットの植物細胞へ
の送達 DNAを植物細胞に安定に送達するために、Agrobacterium
tumerfaciumTiプラスミドを使用することは、植物生物
工学におけるブームの基本的な要素であった。このシス
テムは、特定のレセプターを介して植物細胞に結合する
繊毛状構造体を使用し、そして次いで細菌接合に類似す
るプロセスを介してTiプラスミドに連結したDNAを植物
細胞に送達する点で独特である（Zambryski，Ann．Re
v．Genet.，22:1-30(1988)；Lesslら、Cell，77:321-32
4(1994)；およびWaldenら、Eur．J．Biochem.，192:563
-576(1990)）。しかし、この植物に対する送達システム
の特異性のため、このシステムはDNAの動物細胞への送
達にとっては効果的でない（Chilton，Proc．Natl．Aca
d．Sci.，USA，90:3119-3120(1993)；およびWaldenら
（前出））。【００１５】IV．真核生物発現カセットの動物細胞への
送達 DNAを、インビトロで培養された動物細胞に導入するい
くつかの技術がある。これらは、化学的な方法（Felgne
rら、Proc．Natl．Acad．Sci.，VSA，84:7413-7417(198
7)；Bothwellら、Methodsfor Cloning and Analysis of
Eukaryotic Genes,編 Jones and Bartlett Publishers
Inc.，Boston，MA(1990)；Ausubelら、Short Protocols
in Molecular Biology，John Wileyand Sons，New Yor
k，NY(1992)；およびFarhood、Annal．N.Y．Acad．Sc
i.，716:23-34(1994)）、プロトプラストの使用（Bothw
ell（前出））、または電気パルス（Vatteroniら、Mut
n．Res.，291:163-169(1993)；Sabelnikov、Prog．Biop
hys．Mol．Biol.，62:119-152(1994)；Brothwellら（前
出）；およびAusubelら（前出））、弱毒化ウィルスの
使用（Moss、Dev．Biol．Stan.，82:55-63(1994)；およ
びBrothwellら（前出））、ならびに物理的な方法（Fyn
anら（前出）；Johnstonら、Meth．CellBiol.，43(Pt
A):353-365(1994)；Brothwellら（前出）；およびAusub
elら（前出））が含まれる。【００１６】DNAの、動物組織への首尾良い送達は、カ
チオン性リポソーム（Watanabeら、Mol．Reprod．De
v.，38:268-274(1994)）、裸のDNAの動物筋肉組織への
直接注入（Robinsonら、Vacc.，11:957-960(1993)；Hof
fmanら、Vacc.，12:1529-1533(1994)、Xiangら、Viro
l.，199:132-140(1994)；Websterら、Vacc.，12:1495-1
498(1994)；Davisら、Vacc.，12:1503-1509(1994)；お
よびDavisら、Hum．Molec．Gen.，2:1847-1851(199
3)）、および胚（Naitoら、Mol．Reprod．Dev.，39:153
-161(1994)；およびBurdonら、Mol．Reprod．Dev.，33:
436-442(1992)）、または「遺伝子ガン」技術を用いたD
NAの皮内注入（Johnstonら（前出））によって達成され
ている。これらの技術の制限は、これらがDNAの腸管外
部位への送達においてのみ効率的であるということであ
る。現時点では、真核生物発現カセットを粘膜組織に効
果的に送達することは限られた成功しか治めていない。
これは、恐らく、これらの部位へのアクセスが困難であ
ること、送達媒体に毒性があること、または経口送達の
場合に送達媒体が不安定であることによる。【００１７】DNA送達技術を動物細胞に商業的に適用す
る範囲は広く、そしてワクチン抗原（Fynanら、Proc．N
atl．Acad．Sci.，USA，90:11478-11482(1993)）、免疫
治療薬、および遺伝子治療薬（Darrisら、Cancer，74(3
補遺):1021-1025(1994)；Magrath、Ann．Oncol.，5(補
遺１):67-70(1994)；Milliganら、Ann．NYAcad．Sci.，
716:228-241(1994)；Schreierら、Pharma．Acta Hel
v.，68:145-159(1994)；Cech、Biochem．Soc．Trans.，
21:229-234(1993)；Cech．Gene，135:33-36(1993)；Lon
gら、FASEBJ.，7:25-30(1993)；およびRosiら、Pharm．
Therap.，50:245-254(1991)）の送達を含む。【００１８】遺伝子治療のために内生および外来遺伝子
を動物組織に送達することは、実験動物およびボランテ
ィアに顕著な兆候を示した（Nabel、Circulation，91:5
41-548(1995)；Coovertら、Curr．Opin．Neuro.，7:463
-470(1994)；Foa、Bill．Clin．Haemat.，7:421-434(19
94)；Bowersら、J．Am．Diet．Assoc.，95:53-59(199
5)；Peralesら、Eur．J．Biochem.，226:255-266(199
4)；Dankoら、Vacc.，12:1499-1502(1994)；Conryら、C
anc．Res.，54:1168(1994)；およびSmith、J．Hemat.，
1:155-166(1992)）。近年、ニワトリ（Robinsonら（前
出））およびケナガイタチ（Websterら、Vacc.，12:149
5-1498(1994)）の両方におけるインフルエンザ；マウス
におけるPlasmodiumyoelii（Hoffmanら（前出））；マ
ウスにおける狂犬病（Xiangら（前出））；マウスにお
けるヒトガン胎児性抗原（Conryら（前出））；および
マウスにおけるＢ型肝炎(Davisら（前出）)に対して首
尾良く免疫化するために、裸のDNAワクチンを有する真
核生物発現カセットが用いられている。これらの観察に
より、内生および外来遺伝子の動物組織への送達を、予
防および治療への適用に使用し得るさらなる可能性が開
く。【００１９】従って、ワクチンまたは治療薬である内生
または外来遺伝子をコードする真核生物発現カセットを
動物細胞または組織に送達する必要性が存在する。特
に、真核生物発現カセットを粘膜表面に送達する方法が
大いに所望される。これまでに、原核生物発現カセット
上にコードされる外来抗原を動物組織の粘膜部位に送達
するために、細菌ベクターワクチンが使用されている。【００２０】本発明は、侵襲性細菌が真核生物発現カセ
ットを動物細胞および組織に送達し得るという新規のか
つ予期されなかった発見について記載する。真核生物発
現カセットを送達するために生きた侵襲性細菌を使用す
ることについての１つの重要な局面は、これらがDNAを
粘膜部位に送達し得るということである。【００２１】これまで、生きた細菌が動物細胞を侵襲し
て真核生物発現カセットを導入し、次いでこの真核生物
発現カセットが感染した細胞およびその子孫によって発
現されることについて述べた文献は存在しない。すなわ
ち、本発明は、生きた侵襲性細菌と動物細胞との間の遺
伝子交換についての最初の文献を提供する。これまで
は、生きた細菌ベクターワクチンによる外来抗原の送達
は、単に、原核生物発現カセットの動物細胞または組織
への送達、および細菌ワクチンベクターによる外来抗原
の動物細胞または組織内での発現を包含するだけであっ
た。これに対して、本発明は、生きた細菌株による真核
生物発現カセットのインビトロにおける動物細胞または
動物組織内の細胞への送達、および動物細胞または動物
組織内の細胞による真核生物発現カセットの発現を包含
する。【００２２】【発明が解決しようとする課題】発明の要旨本発明の１つの目的は、生きた侵襲性細菌を使用して、
１つ以上の真核生物発現カセットを動物細胞または動物
組織に送達することである。【００２３】本発明の別の目的は、生きた侵襲性細菌を
使用して、ワクチン抗原をコードする１つ以上の真核生
物発現カセットを動物細胞または動物組織に送達するこ
とである。【００２４】本発明の別の目的は、生きた侵襲性細菌を
使用して、治療薬をコードする１つ以上の真核生物発現
カセットを動物細胞または動物組織に送達することであ
る。【００２５】本発明のさらに別の目的は、生きた侵襲性
細菌を使用して、生物学的に活性なRNA種をコードする
１つ以上の真核生物発現カセットを動物細胞または動物
組織に送達することである。【００２６】本明細書で後述される本発明の詳細な説明
から明らかである本発明のこれらのおよび他の目的は、
１つの実施態様において、これらの動物細胞に生きた侵
襲性細菌を感染させることを包含する、遺伝子を動物細
胞に導入し、そして発現させる方法によって達成され
る。ここでこの細菌は、この遺伝子をコードする真核生
物発現カセットを含む。【００２７】別の実施態様では、本発明は、内生遺伝子
または外来遺伝子をコードする１つ以上の真核生物発現
カセットを含有する生きた侵襲性細菌に関する。【００２８】【課題を解決するための手段】発明の詳細な説明上述のように、１つの実施態様では、本発明は、遺伝子
を動物細胞に導入し、そして発現させる方法に関し、こ
の方法は、これらの動物細胞に生きた侵襲性細菌を感染
させる工程を包含し、ここでこの細菌は、この遺伝子を
コードする真核生物発現カセットを含有する。【００２９】動物細胞は、その分類学上の位置が動物界
内に存する多細胞生物体由来するか、またはこれら生物
体内に存在する核状の葉緑体非含有細胞として定義され
る。この細胞は、インタクトな動物、一次細胞培養物、
外植片培養物、または形質変換細胞株内に存在し得る。
細胞の特定の組織源は本発明にとっては重要ではない。【００３０】本発明で用いられるレシピエント動物細胞
は本発明にとっては重要ではなく、哺乳類、魚類、鳥
類、爬虫類の生物体のような動物界内のすべての生物体
に存在するかまたはこれら生物体に由来する細胞を含
む。【００３１】好適な動物細胞は、ヒト、ウシ、ヒツジ、
ブタ、ネコ、バッファロー、イヌ、ヤギ、ウマ、ロバ、
シカ、および霊長類の細胞のような哺乳動物の細胞であ
る。最も好ましい動物細胞はヒト細胞である。【００３２】ヒト細胞株の例としては、ATCC番号、CCL
62、CCL 159、HTB 151，HTB 22、CCL 2、CRL 1634、CRL
8155、HTB61、およびHTB 104が挙げられるが、これら
に限定されない。【００３３】ウシ細胞株の例としては、ATCC番号、CRL
6021、CRL 1733、CRL 6033、CRL 6023、CCL 44、および
CRL 1390が挙げられる。【００３４】ヒツジ細胞株の例としては、ATCC番号、CR
L 6540、CRL 6538、CRL 6548、およびCRL 6546が挙げら
れる。【００３５】ブタ細胞株の例としては、ATCC番号、CL 1
84、CRL 6492、およびCRL 1746が挙げられる。【００３６】ネコ細胞株の例としては、CRL 6077、CRL
6113、CRL 6140、CRL 6164、CCL 94、CCL 150、CRL 607
5、およびCRL6123が挙げられる。【００３７】バッファロー細胞株の例としては、CCL 40
およびCRL 6072が挙げられる。【００３８】イヌ細胞株の例としては、ATCC番号、CRL
6213、CCL 34、CRL 6202、CRL 6225、CRL 6215、CRL 62
03、およびCRL6575が挙げられる。【００３９】ヤギ由来細胞株の例としては、ATCC番号、
CCL 73およびATCC番号CRL 6270が挙げられる。【００４０】ウマ由来細胞株の例としては、ATCC番号、
CCL 57およびCRL 6583が挙げられる。【００４１】シカ細胞株の例としては、ATCC番号、CRL
6193〜6196が挙げられる。【００４２】霊長類由来の細胞株の例としては、ATCC番
号、CRL 6312、CRL 6304、およびCRL 1868のようなチン
パンジー由来の細胞株；ATCC番号、CRL1576、CCL 26、
およびCCL 161のようなサル由来の細胞株；オランウー
タン細胞株ATCC番号、CRL 1850；およびゴリラ細胞株AT
CC番号、CRL1854が挙げられる。【００４３】本明細書において、「侵襲性細菌」は、真
核生物発現カセットを動物細胞または動物組織に送達し
得る細菌である。「侵襲性細菌」は、動物細胞の細胞質
または核内に自然に侵入し得る細菌、および動物細胞ま
たは動物組織内の細胞の細胞質または核内に侵入するよ
うに遺伝子操作された細菌を含む。【００４４】本発明で用いられる特定の天然に存在する
侵襲性細菌は本発明にとって重要ではない。このような
天然に存在する侵襲性細菌の例としては、Shigella sp
p.、ListeriaSpp.、Rickettsia spp.、および腸内侵襲
性Escherichia coliが含まれるが、これらに限定されな
い。【００４５】用いられる特定のShigella株は本発明にと
って重要ではない。本発明で用いられ得るShigella株の
例としては、Shigella flexneri 2a（ATCC番号2990
3）、Shigellasonnei（ATCC番号29930）、およびShigel
la disenteriae（ATCC番号13313）が挙げられる。Shige
llaflexneri 2a 2457T ΔaroAΔvirG変異株CVD 1203（N
oriegaら、上記）、Shigella flexneri M90TΔicsA変異
株（Goldbergら、Infect．Immun.，62:5664-5668(199
4)）、Shigella flexneri YSFL114 aroD変異株（Karnel
lら、Vacc．10:167-174(1992)）、およびShilgella fle
xneriΔaroAΔaroD変異株(Vermaら、Vacc.，9:6-9(199
1))のような弱毒化Shigella株が、本発明で好適に用い
られる。あるいは、弱毒化した変異を単独で、または１
つ以上のさらなる弱毒化変異と組み合わせて導入するこ
とによって、新規の弱毒化したShigellaspp.株が構築さ
れ得る。【００４６】弱毒化変異は、化学的にN-メチル-N'-ニト
ロ-N-ニトロソグアニジンのような薬剤を用いるか、ま
たは組み換えDNA技術を用いるかのいずれかの非特異的
突然変異生成；Tn10変異誘発、P22-媒介形質導入、λフ
ァージ媒介クロスオーバー、および結合転移のような伝
統的な遺伝子技術；または組み換えDNA技術を用いる部
位特異的突然変異を用いて、細菌病原体に導入され得
る。組み換えDNA技術が好適である。何故なら、組み換
えDNA技術によって構築される株がはるかにより多く定
義されているからである。このような弱毒化変異の例と
しては以下のものが挙げられるが、これらに限定されな
い。 (i) aro（Hoisethら、Nature，291:238-239(1981)）、g
ua（McFarlandら、Microbiol．Path.，3:129-141(198
7)）、nad（Parkら、J．Bact.，170:3725-3730(198
8)）、thy（Nnalueら、Infect．Immun.，55:955-962(19
87)）、およびasd（Curtilss、上記）変異のような栄養
要求性変異； (ii) cya（Curtissら、Infect．Immun.，55:3035-3043
(1987)）、crp（Curtissら(1987)、上記）、phoP/phoQ
（Groismanら、Proc.Natl．Acad．Sci.，USA，86:7077-
7081(1989)；およびMillerら、Proc．Natl．Acad．Sc
i.，USA，86:5054-5058(1989)）、phoP^c（Millerら、
J．Bact.，172:2485-2490(1990)）、またはompR（Dorma
nら、Infect．Immun.，57:2136-2140（1989））変異の
ような、包括的調節機能を不活化する変異； (iii) recA（Buchmeierら、Mol．Micro.，7:933-936(19
93)）、htrA（Johnsonら、Mol．Micro.，5:401-407(199
1)）、htpR（Neidhardtら、Biochem．Biophys．Res．Co
m.，100:894-900(1981)）、hsp（Neidhardtら、Ann．Re
v．Genet.，18:295-329(1984)）、およびgroEL（Buchme
lerら、Sci.，248:730-732(1990)）変異のような、スト
レス応答を改変する変異； (iv) lsyA（Libbyら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，9
1:489-493(1994)、pagまたはprg（Millerら(1990)、上
記；およびMillerら(1989)、上記）、iscAまたはvirG
（d'Hautevilleら、Mol．Micro.，6:833-841(1992)）、
plcA（Mengaudら、Mol．Microbiol.，5:367-72(1991);C
amilliら、J．Exp．Med.，173:751-754(1991)）、およ
びact（Brundageら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，9
0:11890-11894(1993)）変異のような、特異的毒性ファ
クターの変異； (v) topA（Galanら、Infect．Immun.，58:1879-1885(19
90)）変異のような、DNAトポロジーに影響を与える変
異； (vi) rfb、galE（Honeら、J．Inrect．Dis.，156:164-1
67(1987)）またはvia（Popoffら、J．Gen．Microbio
l.，138:297-304(1992)）変異のような、表面多糖類の
生物発生をブロックする変異； (vii) sacB（Recorbetら、App．Environ．Micro.，59:1
361-1366(1993)；Quandtら、Gene，127:15-21(199
3)）、nuc（Ahrenholtzら、App．Environ．Micro.，60:
3746-3751(1994)）、hok、gef、kil、またはphlA（Moli
nら、Ann．Rev．Microbiol.，47:139-166(1993)）変異
のような、自殺システムを改変する変異； (viii) P22によってコードされるリソゲン（Rennell
ら、Virol.，143:280-289(1985)）、λムレイントラン
スグリコシラーゼ（Bienkowska-Szewczykら、Mol．Ge
n．Genet.，184:111-114(1981)）、またはＳ遺伝子（Re
aderら、Virol.，43:623-628(1971)）のような自殺シス
テムを導入する変異；および(ix) minB（de Boerら、Ce
ll，56:641-649(1989)）変異のような正しい細胞周期を
破壊するかまたは改変する変異。【００４７】弱毒化変異は、構成的に発現され得るか、
あるいはプロモーターの温度感受性熱ショックファミリ
ー（Neidhardtら、前出）、もしくは嫌気的に誘導され
るnirBプロモーター（Harborneら、Mol．Micro.、6:280
5-2813(1992)）のような誘導性プロモーター、またはua
pA（Gorfinkielら、J．Bjol．Chem.、268:23376-23381
(1993)）、もしくはgcv（Staufferら、J．Bact.、176:6
159-6164(1994)）のような抑制性プロモーターの制御下
のいずれにおいても発現され得る。【００４８】用いられる特定のListeria株は、本発明に
は重要ではない。本発明において用いられ得るListeria
株の例には、Listeriamonocytogenes（ATCC番号15313）
が挙げられる。好ましくは、L．monocytogenes ΔactA
変異株（Brundageら、前出）またはL．monocytogenesΔ
plcA（Camilliら、J．Exp．Med.、173:751-754(1991)）
のような弱毒化したListeria株が、本発明において用い
られる。あるいは、新規の弱毒化したListeria株は、上
記のShigellaspp.について記載のように、１つ以上の弱
毒化変異を導入することによって構築され得る。【００４９】用いられる特定のRickettsia株は、本発明
には重要ではない。本発明において用いられ得るRicket
tsia株の例には、Ricketsiarickettsiae（ATCC番号VR14
9およびVR891）、Ricketsia Prowaseckii（ATCC番号VR2
33）、Ricketsiatsutsugamuchi（ATCC番号VR312、VR150
およびVR609）、Ricketsia mooseri（ATCC番号VR14
4）、Ricketsiasibirica（ATCC番号VR151）、およびRoc
halimaea quitana（ATCC番号VR358）が挙げられる。弱
毒化したRicketsia株が、好ましくは本発明において用
いられ、そして上記のShigellaspp.について記載のよう
に、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって構築
され得る。【００５０】用いられる特定の腸内侵襲性Escherichia
株は、本発明には重要ではない。本発明において用いら
れ得る腸内侵襲性Escherichia株の例には、Escherichia
coli株4608-58、1184-68、53638-C-17、13-80、および6
-81（Sansonettiら、Ann．Microbiol．(Inst．Pasteu
r)、132A:351-355(1982)）が挙げられる。好ましくは、
弱毒化した腸内侵襲性Escherichia株が、本発明におい
て用いられ、そして上記のShigellaspp.について記載の
ように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって
構築され得る。【００５１】侵襲性になるように遺伝子操作され得る細
菌の例には、Yersinia spp.、Escherichia spp.、Klebs
iella spp.、Bordetellaspp.、Neisseria spp.、Aeromo
nasspp.、Franciesella spp.、Corynebacterium spp.、
Citrobacterspp.、Chlamydia spp.、Hemophilus spp.、
Brucella spp.、Mycobacterium spp.、Legionellasp
p.、Rhodococcus spp.、Pseudomonas spp.、Helicobact
er spp.、Salmonella spp.、Vibriospp.、Bacillus sp
p.、およびErysipelothrix spp.が挙げられるが、これ
らには限定されない。これらの生物体は、これらの生物
体が動物細胞の細胞質に接近することを可能にする遺伝
子を挿入することによって、Shigellaspp.、Listeria s
pp.、Rickettsia spp.、または腸内侵襲性E．coli spp.
の侵襲特性を模倣するように操作され得る。【００５２】このような遺伝子の例には、Shigellaの侵
襲性タンパク質、Escherichiaの溶血素もしくは侵襲性
プラスミド、またはListeriaのリステリオリシンＯが挙
げられる。なぜなら、このような技術によれば、感染さ
れた動物細胞の細胞質に入り得る株を結果として得られ
ることが知られているからである（Formalら、Infect．
Immun.、46:465(1984)；Bieleckeら、Nature、345:175-
176(1990)；Smallら、Microbiology-1986、121〜124
頁、Levineら編、AmericanSociety for Microbiology、
Washington，D.C．(1986)；およびZychlinskyら、Mole
c．Micro.、11:619-627(1994)）。動物細胞の細胞質へ
の侵入を仲介する１つ以上の供給源由来の任意の遺伝子
または遺伝子の組み合わせで十分である。従って、この
ような遺伝子は、細菌性遺伝子に限定されず、そしてエ
ンドソームの溶解を促進するインフルエンザウイルスの
ヘマグルチニンHA-2のようなウイルス性遺伝子を含む
（Plankら、J．Biol．Chem.、269:12918-12924(199
4)）。【００５３】上記侵襲性遺伝子は、染色体またはプラス
ミドの移動性（Miller、A Short Course in Bacterial
Genetics,．ColdSpring Harbor Laboratory Press、Col
d Spring Harbor、NY(1992)；Bothwellら、前出；およ
びAusubelら、前出）、バクテリオファージにより仲介
される形質導入（deBoer、前出； Miller、前出；およ
びAusubelら、前出）、または化学的（Bothwellら、前
出；Ausubelら、前出；Felgnerら、前出；およびFarhoo
d、前出）、エレクトロポレーション（Bothwelら、前
出；Ausubelら、前出；およびSambrook、MolecularClon
ing: A LaboratoryManual、Cold Spring Harbor Labora
tory Press、Cold SpringHarbor、NY）、および物理的
形質転換技術（Johnstonら、前出；およびBothwell、前
出）を用いて、標的株へと導入され得る。これらの遺伝
子は、バクテリオファージ（deBoerら、Cell、56:641-6
49(1989)）、プラスミドベクター（Curtissら、前出）
上に組み込まれるか、または標的株の染色体（Honeら、
前出）内にスプライシングされ得る。【００５４】用いられる特定のYersinia株は、本発明に
は重要ではない。本発明において用いられ得るYersinia
株の例には、Y．enterocolitica（ATCC番号9610）また
はY．pestis（ATCC番号19428）が挙げられる。Y．enter
ocoliticaYe03-R2（al-Hendyら、Infect．Immun.、60:8
70-875(1992)）またはY．enterocoliticaaroA（O'Gaora
ら、Micro．Path.、9:105-116(1990)）のような弱毒化
したYerinia株が、好ましくは本発明において用いられ
る。あるいは、上記のShigellaspp.について記載のよう
に、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって、新
規の弱毒化したYersinia株が構築され得る。【００５５】用いられる特定のEscherichia株は、本発
明には重要ではない。本発明において用いられ得るEsch
erichia株の例には、E．coli H10407（Elinghorstら、I
nfect．Immun.、60:2409-2417(1992)）、ならびにE．co
liEFC4、CFT325およびCPZ005（Donnenbergら、J．Infec
t．Dis.、169:831-838(1994)）が挙げられる。好ましく
は、弱毒化した七面鳥病原体（turkeypathogen）である
E．coli 02 carAB変異株（Kwagaら、Infect．Immun.、6
2:3766-3772(1994)）のような弱毒化したEscherichia株
が、本発明において用いられる。あるいは、上記のShig
ellaspp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異
を導入することによって、新規の弱毒化したEscherichi
a株が構築され得る。【００５６】用いられる特定のKlebsiella株は、本発明
には重要ではない。本発明において用いられ得るKlebsi
ella株の例には、K．pneuoniae（ATCC番号13884）が挙
げられる。好ましくは、弱毒化したKlebsiella株が、本
発明において用いられ、そして上記のShigellaspp.につ
いて記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入するこ
とによって構築され得る。【００５７】用いられる特定のBordetella株は、本発明
には重要ではない。本発明において用いられ得るBordet
ella株の例には、B．bronchiseptica（ATCC番号19395）
が挙げられる。好ましくは、弱毒化したBordetella株が
本発明において用いられ、そして上記のShigellaspp.に
ついて記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入する
ことによって構築され得る。【００５８】用いられる特定のNeisseria株は、本発明
には重要ではない。本発明において用いられ得るNeisse
ria株の例には、N．meningitidis（ATCC番号13077）お
よびN．gonorrhoeae（ATCC番号19424）が挙げられる。
好ましくは、N．gonorrhoeaeMSll aro変異株（Chamberl
ainら、Micro．Path.、15:51-63(1993)）のような弱毒
化したNeisseria株が本発明において用いられる。ある
いは、上記のShigellaspp.について記載のように、１つ
以上の弱毒化変異を導入することによって、新規の弱毒
化したNeisseria株が構築され得る。【００５９】用いられる特定のAeromonas株は、本発明
には重要ではない。本発明において用いられ得るAeromo
nas株の例には、A．eucrenophila（ATCC番号23309）が
挙げられる。あるいは、上記のShigellaspp.について記
載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによ
って、新規の弱毒化したAeromonas株が構築され得る。【００６０】用いられる特定のFranciesella株は、本発
明には重要ではない。本発明において用いられ得るFran
iesella株の例には、F．tularensis（ATCC番号15482）
が挙げられる。好ましくは、弱毒化したFranciesella株
が本発明において用いられ、そして上記のShigellaspp.
について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入す
ることによって構築され得る。【００６１】用いられる特定のCorynebacterium株は、
本発明には重要ではない。本発明において用いられ得る
Corynebacterium株の例には、C．pseudotuberculosis
（ATCC番号19410）が挙げられる。好ましくは、弱毒化
したCorynebacterium株が本発明において用いられ、そ
して上記のShigellaspp.について記載のように、１つ以
上の弱毒化変異を導入することによって構築され得る。【００６２】用いられる特定のCitrobacter株は、本発
明には重要ではない。本発明において用いられ得るCitr
obacter株の例には、C．freundii（ATCC番号8090）が挙
げられる。好ましくは、弱毒化したCitrobacter株が本
発明において用いられ、そして上記のShigellaspp.につ
いて記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入するこ
とによって構築され得る。【００６３】用いられる特定のChlamydia株は、本発明
には重要ではない。本発明において用いられ得るChlamy
dia株の例には、C．pneumoniae（ATCC番号VR1310）が挙
げられる。好ましくは、弱毒化したChlamydia株が本発
明において用いられ、そして上記のShigellaspp.につい
て記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入すること
によって構築され得る。【００６４】用いられる特定のHemophilus株は、本発明
には重要ではない。本発明において用いられ得るHemoph
ilus株の例には、H．sornnus（ATCC番号43625）が挙げ
られる。好ましくは、弱毒化したHemophilus株が、本発
明において用いられ、そして上記のShigellaspp.につい
て記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入すること
によって構築され得る。【００６５】用いられる特定のBrucella株は、本発明に
は重要ではない。本発明において用いられ得るBrucella
株の例には、B．abortus（ATCC番号23448）が挙げられ
る。好ましくは、弱毒化したBrucella株が本発明におい
て用いられ、そして上記のShigellaspp.について記載の
ように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって
構築され得る。【００６６】用いられる特定のMycobacterium株は、本
発明には重要ではない。本発明において用いられ得るMy
cobacterium株の例には、M．intracellulare（ATCC番号
13950）およびM．tuberculosis（ATCC番号27294）が挙
げられる。好ましくは、弱毒化したMycobacterium株が
本発明において用いられ、そして上記のShigellaspp.に
ついて記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入する
ことによって構築され得る。【００６７】用いられる特定のLegionella株は、本発明
には重要ではない。本発明において用いられ得るLegion
ella株の例には、L．pneumophila（ATCC番号33156）が
挙げられる。好ましくは、L．pneumophilamip変異株（O
tt、FEMS Micro．Rev.、14:161-176(1994)）のような弱
毒化したLegionella株が本発明において用いられる。あ
るいは、上記のShigellaspp.について記載のように、１
つ以上の弱毒化変異を導入することによって、新規の弱
毒化したLegionella株が構築され得る。【００６８】用いられる特定のRhodococcus株は、本発
明には重要ではない。本発明において用いられ得るRhod
ococcus株の例には、R．equi（ATCC番号6939）が挙げら
れる。好ましくは、弱毒化したRhodococcus株が本発明
において用いられ、そして上記のShigellaspp.について
記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することに
よって構築され得る。【００６９】用いられる特定のPseudomonas株は、本発
明には重要ではない。本発明において用いられ得るPseu
domonas株の例には、P．aeruginosa（ATCC番号23267）
が挙げられる。好ましくは、弱毒化したPseudomonas株
が本発明において用いられ、そして上記のShigellaspp.
について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入す
ることによって構築され得る。【００７０】用いられる特定のHelicobacter株は、本発
明には重要ではない。本発明において用いられ得るHeli
cobacter株の例には、H．mustelae（ATCC番号43772）が
挙げられる。好ましくは、弱毒化したHelicobacter株が
本発明において用いられ、そして上記のShigellaspp.に
ついて記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入する
ことによって構築され得る。【００７１】用いられる特定のSalmonella株は、本発明
には重要ではない。本発明において用いられ得るSalmon
ella株の例には、Salmonella typhi（ATCC番号7251）お
よびS．typhimurium（ATCC番号13311）が挙げられる。
好ましくは、弱毒化したSalmonella株が、本発明におい
て用いられ、そして例としてS．typhiaroAaroD（Hone
ら、Vacc.、9:810-816(1991)）およびS．typhimurium a
roA変異株（Mastroeniら、Mjcro．Pathol.、13:477-491
(1992)）が挙げられる。あるいは、上記のShigellaspp.
について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入す
ることによって、新規の弱毒化したSalmonella株が構築
され得る。【００７２】用いられる特定のVibrio株は、本発明には
重要ではない。本発明に、おいて用いられ得るVibrio株
の例には、Vibrio cholerae（ATCC番号14035）およびVi
briocincinnatiensis（ATCC番号35912）が挙げられる。
好ましくは、弱毒化したVibrio株が本発明において用い
られ、そして例としてV．choleraeRSI病原性変異株（Ta
ylorら、J．Infect．Dis.、170:1518-1523(1994)）およ
びV．cholerae ctxA．ace．zot．cep変異株（Waldor
ら、J．Infect．Dis.、170:278-283(1994)）が挙げられ
る。あるいは、上記のShigellaspp.について記載のよう
に、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって、新
規の弱毒化したVibrio株が構築され得る。【００７３】用いられる特定のBacillus株は、本発明に
は重要ではない。本発明において用いられ得るBacillus
株の例には、Bacillus subtilis（ATCC番号6051）が挙
げられる。好ましくは、弱毒化したBacillus株が本発明
において用いられ、そして例としてB．anthracis変異株
pX01（Welkosら、Micro．Pathol.、14:381-388(1993)）
および弱毒化したBCG株（Stoverら、Nat.、351:456-460
(1991)）が挙げられる。あるいは、上記のShigellaspp.
について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入す
ることによって、新規の弱毒化したBacillus株が構築さ
れ得る。【００７４】用いられる特定のErysipelothrix株は、本
発明には重要ではない。本発明において用いられ得るEr
ysipelothrix株の例には、Erysipelothrixrhusiopathia
e（ATCC番号19414）およびErysipelothrix tonsillarum
（ATCC番号43339）が挙げられる。好ましくは、弱毒化
したErysipelothrix株が本発明において用いられ、そし
て例としてE．rhusiopathiaeKg-1aおよびKg-2（Watarai
ら、J．Vct．Med．Sci.、55:595-600(1993)）ならびに
E．rhusiopathiaeORVAC変異株（Markowska-Danielら、I
nt．J．Med．Microb．Virol．Parisit．Infect．Dis.、
277:547-553(1992)）が挙げられる。あるいは、上記のS
higellaspp.について記載のように、１つ以上の弱毒化
変異を導入することによって、新規の弱毒化したErysip
elothrix株が構築され得る。【００７５】上述したように、細菌が真核生物発現カセ
ットを送達するレシピエント動物細胞は、魚類、鳥類、
または爬虫類由来の細胞であり得る。【００７６】魚類細胞の細胞質に生来接近し得る細菌の
例には、Aeromonas salminocida（ATCC番号33658）およ
びAeromonasschuberii（ATCC番号43700）が挙げられる
が、これらに限定されない。好ましくは、弱毒化した細
菌が、本発明において用いられ、そして例としてA．sal
monicidiavapA（Gustafsonら、J．Mol．Biol.、237:452
-463(1994)）またはA．Salmonicidia芳香族依存性変異
株（Vaughanら、Infect．Immun.、61:2172-2181(199
3)）が挙げられる。【００７７】鳥類細胞の細胞質に生来接近し得る細菌の
例には、Salmonella galinarum（ATCC番号9184）、Salm
onella enteridits（ATCC番号4931）およびSalmonellat
yphimurium（ATCC番号6994）が挙げられるが、これらに
限定されない。弱毒化した細菌が、本発明において好ま
しく、そして例としてS．galinarumcya crp変異株（Cur
tissら、(1987)、前出）またはS．enteritidis aroA芳
香族依存性変異株CVL30（Cooperら、Infect．Immun.、6
2:4739-4746(1994)）のような弱毒化したSalmonella株
が挙げられる。【００７８】爬虫類細胞の細胞質に生来接近し得る細菌
の例には、Salmonella typhimurium（ATCC番号6994）が
挙げられるが、これに限定されない。弱毒化した細菌
が、本発明において好ましく、そして例としてS．typhi
muirum芳香族依存性変異株（Hormaecheら、前出）のよ
うな弱毒化した株が挙げられる。【００７９】また、侵襲性細菌で感染させた特定の動物
細胞は、本発明には重要ではなく、用いられる侵襲性細
菌の宿主範囲に依存する。【００８０】例えば、Shigella flexneriは、ヒトおよ
び霊長類の細胞に感染するが、イヌおよびその他の動物
に感染することはまれである（Kreigら、Bergey'sManua
l ofSystematic Bacteriology、WilkinsおよびWilliams
編、Baltimore、MD(1984)）。一方、Aeromonassalminoc
idaは、サケの細胞に感染する（Austinら、Bacterial F
ish Pathogens: Diseases in Farmedand Wild Fishes、
Ellis Harwood Ltd.編、London(1987)）。【００８１】粘膜および全身の免疫システムは、分画さ
れる（Mesteky、J．Clin．Immunol.、7:265-270（1987
0;Newby,Local Immune Response of the Gut、Boca Rat
on、CRC Press、NewbyおよびStocks編、第143-160頁(19
84)；およびPascualら、Immuno．Methods.、5:56-72(19
94)）。従って、粘膜表面に送達された抗原は、粘膜お
よび全身の応答を誘発するが、親から送達された抗原
は、主として全身の応答は誘発するものの、わずかな粘
膜応答しか刺激しない（Mesteky、前出）。さらに、あ
る粘膜部位（例えば、腸）における粘膜刺激により、他
の粘膜表面（例えば、生殖器／尿道）における免疫の発
生を生じ得る（Mesteky、前出）。この現象は、共通粘
膜システム（commonmucosal system）と呼ばれ、多くの
文献に述べられている（Mesteky、前出；およびPascual
ら、前出）。【００８２】粘膜ワクチンの開発は、このような経路に
より送達された場合、抗原の貧弱な免疫原性によって妨
げられてきた。この文脈において、抗原は、以下の２つ
の類に分類され得る。すなわち、腸の表面に結合する抗
原および結合しない抗原との２つである。ここで、前者
は、後者よりも有意に免疫原性が高い（DeAizpuruaら、
J．Exp．Med.、176:440-451(1988)）。同様に、DNA分子
の粘膜表面への送達は、胃の障壁および胃腸管における
ヌクレアーゼならびに気道における厚い粘膜層のような
これらの表面に見られる生来の宿主防御のために有効で
はない。【００８３】宿主のこれら生来の障壁機能を回避し、そ
して粘膜画分への接近を可能にするための１つの方策と
しては、細菌ベクターの使用がある（Curtiss、NewGene
ration Vaccines: The Molecular Approach、Marcel De
kker，Inc.編、New York、NY、161-188頁および269-288
頁(1989)；およびMimsら、MedicalMicrobiology、Mosby
-Year Book Europe Ltd.編、London(1993)）。特定の腸
および呼吸器官の病原体、例えばE．coli、Shigella、L
isteria、BordetellaおよびSalmonellaは、生来このよ
うな応用に適応づけられている。なぜなら、これらの生
物体は、宿主の粘膜表面に付着し、それを侵襲する能力
を有しているからである（Kreigら、前出）。従って、
本発明では、真核生物発現カセットを宿主の粘膜画分へ
と送達するために、生体経口細菌ベクターが操作され得
る。【００８４】あるいは、上述したように、粘膜組織の屈
性および侵襲特性を模倣し、それにより細菌を粘膜組織
内へと侵襲させ、そして遺伝子をそれらの部位へと送達
するために、任意の細菌が遺伝的に操作され得る。【００８５】また、ある遺伝子産物を単独で、または組
み合わせにより発現させることにより、侵襲性細菌の組
織特異性を変化させ得る。例えば、Plasmodium vivax網
状赤血球結合タンパク質−１および−２は、ヒトおよび
霊長類における赤血球に特異的に結合し（Galinskiら、
Cell、69:1213-1226(1992)）；Yersiniaインベーシン
は、β１インテグリン受容体を認識し（Isbergら、Tren
dsMicrobiol.、2:10-14(1994)）；アシアロオロソムコ
イドは、肝細胞上のアシロジコプロテイン（asialooros
omucoid）に対するリガンドであり（Wuら、J．Biol．Ch
em.、263:14621-14624(1988)）；インシュリン−ポリ−
Ｌ−リシンの存在は、インシュリン受容体をもつ細胞へ
のプラスミド摂取を標的化することが示されており（Ro
senkranzら、Expt．CellRes.、199:323-329(1992)）；L
isteria monocytogenesのp60は、肝細胞への屈性を可能
にし（Hessら、Infect．Immun.、63:2047-2053(1995)）
そしてTrypanosomacruziは、ヘパリン、硫酸ヘパリンお
よびコラーゲンに結合することによって、哺乳動物の細
胞外マトリックスへの特異的結合をもたらす60 kDa表面
タンパク質を発現する（Ortega-Barriaら、Cell、67:41
1-421(1991)）。【００８６】本発明において用いられる特定の真核生物
カセットは、本発明には重要ではなく、そして例えば、
Invitrogen Corporation（San Diego、CA）から入手可
能なpCEP4あるいはpRc/RSV、Stratagene（LaJolla，C
A）から入手可能なpXT1、pSG5、pPbacあるいはpMbac、C
lonTech（Palo Alto、CA）から入手可能なpPURあるいは
pMAM、およびPromegaCorporatlon（Madison．WI）から
入手可能なpSVβ-galのような多数の市販されているカ
セットのいずれかから選択され得、または、デノボに、
あるいは公共のもしくは市販の真核生物発現システムを
適用することにより合成され得る。【００８７】真核生物発現カセット内の個々の因子は、
複数の供給源から導き出され得、そして作用部位におけ
る特異性を付与するように、あるいはレシピエント細胞
におけるカセットの長寿を付与するように選択され得
る。真核生物発現カセットのこのような操作は、任意の
標準的な分子生物学的アプローチによりなされ得る。こ
れらカセットは、通常、プラスミドの形態であり、そし
て例えば、ウイルス由来のSV40、CMV、ならびに、RSVプ
ロモーターあるいは真核生物由来のβ−カゼイン、ウテ
ログロビン、β−アクチンまたはチロシナーゼプロモー
ターのような動物細胞における遺伝子発現を駆動するの
に有用であることが周知のさまざまなプロモーターを含
む。特定のプロモーターは、選択的な細胞タイプに、お
いてのみ発現を得ることが目的である場合を除いて、本
発明には重要ではない。この場合、プロモーターは、選
択された細胞タイプにおいてのみ活性となるプロモータ
ーが選択される。組織特異的プロモーターの例には、乳
房組織に特異的であるαS1-およびβ−カゼインプロモ
ーター（Platenburgら、Trans．Res.、3:99-108(199
4)；およびMagaら、Trans．Res.、3:36-42(1994)）；肝
臓、腎臓、脂肪、空腸および乳房組織において活性であ
るホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼプロモ
ーター（McGraneら、J．Reprod．Fert.、41:17-23(199
0)）；肺および脾臓細胞においては活性であるが、睾
丸、脳、心臓、肝臓あるいは腎臓においては活性ではな
いチロシナーゼプロモーター（Vileら、Canc．Res.、5
4:6228-6234(1994)）；鱗状上皮の分化ケラチノサイト
においてのみ活性であるインボルセリンプロモーター
（Carrollら、J．CellSci.、103:925-930(1992)）；お
よび肺および子宮内膜において活性であるウテログロビ
ンプロモーター（Helftenbeinら、Annal．N.Y．Acad．S
ci.、622:69-79(1991)）が挙げられるが、これらに限定
されない。【００８８】あるいは、発現を制御するためには、細胞
特異的エンハンサー配列が用いられ得る。例えば、ヒト
の神経親和性パポウイルスJCVエンハンサーは、神経膠
細胞のみにおいてウイルスの転写を調節する（Remenick
ら、J．Virol.、65:5641-5646(1991)）。組織特異的発
現を制御するさらに別の方法は、どの細胞株においてプ
ロモーターが活性になるかを特定するためにホルモン応
答因子（HRE）を用いることである。例えば、MMTVプロ
モーターは、プロゲステロン受容体のようなホルモン受
容体を、それが活性化される前に、上流HREへと結合す
ることを必要とする（Beato、FASEBJ.、5:2044-2051(19
91)；およびTrussら、J．Steriod Biochem．Mol．Bio
l.、41:241-248(1992))。【００８９】レシピエント動物細胞内でのプラスミドの
ふるまいを改良するために、さらなる遺伝的因子をプラ
スミドに含有し得る（Hodgson、Bio/Technology、13:22
2-225(1995)）。このような因子は、哺乳動物の人工染
色体因子、あるいは、発現カセットの安定な非組み込み
保持を可能にする、DiFi結腸直腸癌細胞に見られるよう
な自律複製環状小染色体からの因子（Huxleyら、Bio/Te
chnology、12:586-590(1994)；およびUntawaleら、Can
c．Res.、53:1630-1636(1993)）レシピエント細胞染色
体への発現カセットの組み込みを指向するインターグラ
ーゼ（Bushman、Proc．Natl．Acad．Sci.、USA、91:923
3-9237(1994)）、レシピエント細胞染色体への非相同組
み込みを促進するアデノ関連ウイルスからの反転された
反復体（Goodmanら、Blood、84:1492-1500(1994)）、相
同組換えを促進するrecAまたは制限酵素（PCT国際特許
公開第WO9322443号(1993)；およびPCT国際特許公開第WO
9323534-A号(1993)）または真核生物発現カセットの核
標的化を指向する因子（Hodgson、前出;およびLewin、
前出）が挙げられるが、これらに限定されない。インタ
ーグラーゼ、recAおよび制限酵素のようなこれらの因子
のいくつかを、原核生物発現カセット内で、真核生物発
現カセットと同じ遺伝的因子上か、あるいは別の遺伝的
因子上にコードすることは、有効であり得る。このよう
な有毒または有害な因子を原核生物プロモーターの制御
下に置くことによって、細菌細胞が溶解する前の、原核
生物翻訳および転写機が機能している間に、これらの因
子をただ転写または翻訳することが確実にできる。よっ
て、有限な投与量のコードされた因子が、真核生物レシ
ピエントへと送達される。【００９０】本発明においては、生体侵襲性細菌が、遺
伝子をコードする真核生物発現カセットを動物細胞また
は動物組織内へと送達し得る。この遺伝子は、外来遺伝
子であり得るか、あるいは内因性遺伝子であり得る。本
明細書中で用いられるように、「外来遺伝子」とは、ワ
クチン抗原、免疫調節剤、あるいは治療剤のような、レ
シピエント動物細胞あるいは組織に対して外来である、
タンパク質をコードする遺伝子あるいはその断片、また
はアンチセンスRNA、または触媒RNAを意味する。「内因
性遺伝子」とは、レシピエント動物細胞または組織に生
来存在する、タンパク質をコードする遺伝子あるいはそ
の一部、またはアンチセンスRNA、または触媒RNAを意味
する。【００９１】ワクチン抗原は、ウイルス性病原体、細菌
性病原体および寄生病原体からのタンパク質であり得る
か、またはその抗原性断片であり得る。あるいは、ワク
チン抗原は、組換えDNA法を用いて構築され、ウイルス
性病原体、細菌性病原体、寄生病原体からの抗原または
その一部をコードする、合成遺伝子であってもよい。こ
れらの病原体は、ヒト、家畜動物または野生動物の宿主
において感染性であり得る。【００９２】抗原は、その動物宿主に入り、そこにコロ
ニーを形成するか、または複製する前またはその間に、
任意のウイルス性病原体、細菌性病原体または寄生病原
体により発現される任意の分子であり得る。【００９３】ウイルス性抗原、細菌性抗原、寄生抗原ま
たはウイルス性抗原、細菌性抗原または寄生抗原の全
部、一部または任意の組み合わせをコードする合成遺伝
子の任意の組み合わせを発現する複数の真核生物発現カ
セットが、送達され得る。【００９４】ウイルス性抗原が誘導されるウイルス性病
原体は、インフルエンザウイルスのようなオルトミクソ
ウイルス; RSVおよびSIVのようなレトロウイルス; EBV
のようなヘルペスウイルス;CMVまたは単純ヘルペスウイ
ルス; ヒト免疫不全ウイルスのようなレンチウイルス;
狂犬病のようなラブドウイルス; ポリオウイルスのよう
なピコルノウイルス; 痘疹のようなポックスウイルス;
ロタウイルス; およびパルボウイルスが挙げられるが、
これらに限定されない。【００９５】ウイルス性病原体の保護抗原の例には、ヒ
ト免疫不全ウイルス抗原Nef、p24、gp120、gp41、Tat、
Rev（Polら、Nature、313:277-280(1985)）ならびにgp1
20のT細胞およびB細胞エピトープ（Palkerら、J．Immun
ol.、142:3612-3619(1989)）；B型肝炎表面抗原（Wu
ら、Proc．Natl．Acad．Sci.、USA、86:4726-4730(198
9)）；VP4（Mackowら、Proc．Natl．Acad．Sci.、USA、
87:518-522(1990)）およびVP7（Greenら、J．Virol.、6
2:1819-1823(1988)）のようなロタウイルス抗原；赤血
球凝集素あるいは核タンパク質のようなインフルエンザ
ウイルス抗原（Robinsonら、前出；Websterら、前出）
および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Whitle
yら、NewGeneration Vaccines、825-854頁）が挙げられ
る。【００９６】細菌性抗原が誘導される細菌性病原体は、
Mycobacterium spp.、Helicobacterpylori、Salmonella
spp.、Shigellaspp.、E．coli、Rickettsia spp.、Lis
teria spp.、Legionella pneumoniae、Pseudomonas sp
p.、Vibriospp.およびBorellia burgdorferiが挙げられ
るが、これらに限定されない。【００９７】細菌性病原体の保護抗原の例には、Shigel
la sonnei １型抗原（Formalら、Infect．Immun.、34:7
46-750(1981)）；V．choleraeInaba株569BのＯ抗原（Fo
rrestら、J．Infect．Dis.、159:145-146(1989)）；CFA
/I采状抗原（Yamamotoら、Infect．Immun.、50:925-928
(1985)）および非耐熱性毒素の非毒性Bサブユニット（C
lementsら、46:564-569(1984)）のような腸毒素産生性
E．coliの保護抗原;Bordetella pertussisのパータクチ
ン（Robertsら、Vacc.、10:43-48(1992)）；B．pertuss
isのアデニル酸シクラーゼヘモリシン（Guisoら、Micr
o．Path.、11:423-431(1991)）；およびClostridium te
taniの破傷風毒素の断片C（Fairweatherら、Infect．Im
mun.、58:1323-1326(1990)）が挙げられる。【００９８】寄生抗原が誘導される寄生病原体は、Plas
modjum spp.、Trypanosome spp.、Giardia spp.、Booph
ilus spp.、Babesiaspp.、Entamoeba spp.、Eimeria sp
p.、Leishmania spp.、Schistosome spp.、Brugia sp
p.、Fascidaspp.、Dirofilariaspp.、Wuchereria sp
p.、およびOnchocerea spp.が挙げられるが、これらに
限定されない。【００９９】寄生病原体の保護抗原の例には、P．berge
riiの周囲スポロゾイト（circumsporozoite）抗原ある
いはP．falciparumの円形スポロゾイト抗原のようなPla
smodiumspp.の円形スポロゾイト抗原（Sadoffら、Scien
ce、240:336-337(1988)）；Plasmodium spp.のメロゾイ
ト表面抗原（Spetzlerら、Int．J．Pept．Prot．Res.、
43:351-358 (1994)）；Entamoebahistolyticaのガラク
トース特異的レクチン（Mannら、Proc．Natl．Acad．Sc
i.、USA、88:3248-3252(1991)）、Leishmaniaspp.のgp6
3（Russellら、J．Immunol.、140:1274-1278(1988)）、
Brugia malayiのパラミオシン（Liら、Mol．Biochem．P
arasitol.、49:315-323(1991)）、Schistosomamansoni
のトリオースリン酸イソメラーゼ（Shoemakerら、Pro
c．Natl．Acad．Sci.、USA、89:1842-1846(1992)）；Tr
ichostrongylus colubriformisの分泌されたグロビン様
タンパク質（Frenkelら、Mol．Biochem．Parasitol．5
0:27-36(1992)）；Frasciolahepaticaのグルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼ（Hillyerら、Exp．Parasito
l.、75:176-186(1992)）；SchistosomabovisおよびS．j
aponicum（Bashirら、Trop．Gcog．Med.、46:255-258(1
994)）；ならびに、SchistosomabovisおよびS．Japonic
umのKLH（Bashirら、前出）が挙げられる。【０１００】本発明においては、生体侵襲性細菌はま
た、治療剤をコードする真核生物発現カセットを動物細
胞または動物組織へ送達し得る。例えば、真核生物発現
カセットは、腫瘍特異的な、移植型の、あるいは自己免
疫性の抗原またはその一部をコードし得る。あるいは、
真核生物発現カセットは、腫瘍特異的な、移植型の、あ
るいは自己免疫性の抗原またはその一部をコードする合
成遺伝子をコードし得る。【０１０１】腫瘍特異的抗原の例には、前立腺特異的抗
原（Gattusoら、Human Pathol.、26:123-126(1995)）、
TAG-72およびCEA（Guadagniら、Int．J．Biol．Marker
s、9:53-60(1994)）、MAGE-1およびイロシナーゼ（Coul
ieら、J．Immunothera、14:104-109(1993)）が挙げられ
る。最近、腫瘍抗原を発現する非悪性細胞を用いた免疫
がワクチン効果を実現し、そして、動物が、同じ抗原を
示す悪性腫瘍細胞を除去する免疫応答を強化する助けに
なることが、マウスにおいて示された（Koeppenら、Ana
l．N.Y．Acad．Sci.、690:244-255(1993)）。【０１０２】移植型抗原の例には、Ｔ細胞のCD3受容体
が挙げられる（Alegreら、Djgest．Dis．Sci.、40:58-6
4(1995)）。CD3受容体に対する抗体を用いた処理は、循
環するＴ細胞を迅速に除去し、拒絶エピソードの大半を
逆にすることが示されている（Alegreら、前出）。【０１０３】自己免疫抗原の例としては、IASβ鎖（Top
hamら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，91:8005-8009(1
994)）が挙げられる。IASβ鎖からの18個のアミノ酸ペ
プチドをマウスに予防接種すると、実験的に自己免疫脳
脊髄炎を有するマウスに対して予防および処置を提供す
ることが示された（Tophamら、上述）。【０１０４】あるいは、本発明において、生きた侵襲性
細菌は、免疫調節分子をコードする真核生物発現カセッ
トを送達し得る。これらの免疫調節分子は、M-CSF、GM-
CFSのような増殖因子；ならびにIL-2、IL-4、IL-5、IL-
6、IL-10、IL-12またはIFN-γのようなサイトカインを
含むが、これらに限定されない。近年、サイトカイン発
現カセットの腫瘍組織への送達が、全身性のサイトカイ
ン毒性を生じることなく、強力な全身性免疫および増大
した腫瘍抗原の提示を刺激することが示された（Golumb
ekら、Canc．Res.、53:5841-5844(1993)；Golumbekら、
Immun．Rcs.、12:183-192(1993)；Pardoll、Curr．Opi
n．Oncol．4:1124-1129（1992)；およびPardoll、Cur
r．Opin．Immunol.、4:619-623(1992)）。【０１０５】動物細胞に送達されるアンチセンスRNAお
よび触媒RNA種は、受容細胞内に存在するかまたは受容
細胞内に存在し得る任意の分子に対して標的づけられ得
る。これらは、インターロイキン−６のような細胞調節
分子をコードするRNA種（Mahieuら、Blood、84:3758-37
65(1994)）、rasのような腫瘍遺伝子（Kashani-Sabet
ら、Antisen．Res．Devel.，2:3-15(1992)）、ヒトパピ
ローマウイルスのような癌の原因因子（Steeleら、Can
c．Res.、52:4706-4711(1992)）、酵素、HIV-1のような
ウイルスRNAおよび病原体由来のRNA（Meyerら、Gene、1
29:263-268(1993)；Chatterjeeら、Sci.、258:1485-148
8(1992)；およびYamadaら、Virol.、205:121-126(199
4)）を含むが、これらに限定されない。RNAはまた、プ
ロモーターまたはエンハンサー領域などの非転写DNA配
列において標的とされ得るか、または限定はされないが
DNA合成もしくはtRNA分子に関与する酵素のような受容
細胞に存在する他の任意の分子を標的とし得る（Scanlo
nら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、88:10591-10595(19
91)；およびBaierら、Mol．Immunol.、31:923-932(199
4)）。【０１０６】本発明において、生きた侵襲性細菌はま
た、タンパク質をコードする真核生物発現カセットを動
物組織に送達し得、後にこの動物組織からカセットを収
穫または精製し得る。一例としては、α₁−アンチトリ
プシンをコードするマウス乳腫瘍ウイルス(ATCC番号 VR
731)由来のような乳房特異的ウイルスプロモーターの制
御下での真核生物発現カセットのヤギまたはヒツジの乳
房組織への送達が挙げられる。【０１０７】あるいは、真核生物発現カセットを保有す
る侵襲性細菌は、組織部位から広がらないように組織部
位に導入され得る。これは、任意のいくつかの方法によ
り他姓され得る。これらの方法は、非常に制限された投
与量の送達、迅速に不活性化されるかまたは死滅する、
asd変異体のような高度に弱毒化された栄養要求性株(cy
rtissら、上述)の送達、またはanerobicnirBプロモータ
ー(Harborneら、上述)（これは、受容宿主組織内でスイ
ッチオンされる）のような、強力なプロモーターの制御
下での自殺系(Rennellら、上述；およびReaderら、上
述)のような弱毒化領域を含有する細菌株の送達を含
む。さらに、異なる種および／または侵襲性細菌の血清
型の多数投与量を用いることによって、目的の真核生物
発現カセットは、動物に与えられ、発現レベルまたは生
産型を操作し得る。このアプローチは、現在の場合のよ
うに、組織特異的プロモーターを含み、そして発現の厳
格な制御を有する特別に飼養されたトランスジェニック
動物を不必要にする（Janneら、Int．J．Biochem.、26:
859-870(1994)；Mullinsら、Hyperten.、22:630-633(19
93)；およびPersuyら、Eur．J．Bichem.、205:887-893
(1992)）。【０１０８】さらなる代替として、腫瘍特異的抗原、移
植抗原、および／または自己免疫抗原をコードする１つ
のまたは複数の真核生物発現カセットは、免疫調節分子
または他のタンパク質をコードする真核生物発現カセッ
トとの１つのまたは複数の任意の組合せで送達され得
る。【０１０９】なおさらに別のアプローチは、真核生物発
現カセットと組合せて原核生物発現カセットを送達する
ことである。【０１１０】真核生物発現カセットを含む侵襲性細菌
は、インビトロで培養される動物細胞を感染するために
用いられ得る。この動物細胞は、インビトロでさらに培
養され得、所望の遺伝的特徴を有する細胞は、細菌感染
（bactofection）時に受容細胞に導入される任意の選択
マーカーに対する選択によって富化され得る。このよう
なマーカーには、例えば、ハイグロマイシン、もしくは
ネオマイシンなどの抗生物質耐性遺伝子、選択細胞表面
マーカー、または細菌感染によって導入または改変され
る他の任意の表現型もしくは遺伝子型エレメントが含ま
れ得る。次いで、これらのインビトロで感染された細胞
またはインビトロで富化された細胞は、静脈注射、筋肉
注射、皮内注射、もしくは腹腔内注射、または細胞を宿
主組織に侵入させることが可能な任意の接種経路によっ
て、動物に導入され得る。【０１１１】あるいは、真核生物発現カセットを含む侵
襲性細菌は、静脈、筋肉、皮内、腹腔内、経口、鼻腔
内、眼内、直腸内、膣内、経口挿入および尿道内接種の
経路によって導入されて動物を感染し得る。【０１１２】投与される本発明の生きた侵襲性細菌の量
は、被験体の種、および処置されている疾病または健康
状態に応じて変化する。一般に、使用される投与量は、
約10 ³〜10¹¹の生存能力のある生物体、好ましくは約10⁵
〜10⁹の生存能力のある生物体である。あるいは、個々
の細胞を細菌感染する場合、投与される生存能力のある
生物体の投与量は、約0.1から10⁶、好ましくは約10²か
ら10⁴の範囲の感染多重度である。【０１１３】本発明の侵襲性細菌は、一般に、薬学的に
受容可能なキャリアまたは希釈液と共に投与される。【０１１４】用いられる特定の薬学的に受容可能なキャ
リアまたは希釈液は、本発明には重要ではない。希釈液
の例としては、リン酸緩衝化生理食塩水、スクロースを
含有するクエン酸緩衝液（pH7.0）のような胃中の胃酸
に対して緩衝する緩衝液、重炭酸緩衝液（pH 7.0）単独
（Levineら、J．Clin．Invest.、79:888-902(1987)；お
よびBlackら、J．Infect．Dis.、155:1260-1265(198
7)）、またはアスコルビン酸、ラクトース、および必要
に応じてアスパルテームを含有する重炭酸緩衝液（pH7.
0）（Levineら、Lancet、II:467-470(1988)）が挙げら
れる。キャリアの例としては、タンパク質（例えば、ス
キムミルク中に見出される）、糖（例えば、スクロー
ス）、またはポリビニルピロリドンが挙げられる。代表
的には、これらのキャリアは、約0.1〜90％（w/v）の濃
度で用いられるが、好ましくは１〜10％(w/v)の範囲の
濃度で用いられる。【０１１５】１つの局面において、本発明は、動物細胞
内に遺伝子を導入および発現させる方法であって、該方
法が、該動物細胞を生きた侵襲性細菌で感染させる工程
を包含し、該細菌が、該遺伝子をコードする真核生物発
現カセットを含有する、方法、を提供する。１つの実施
形態では、前記遺伝子が、ワクチン抗原、治療薬、免疫
調節剤、アンチセンスRNA、および触媒RNAをコードする
遺伝子からなる群から選択される。１つの実施形態で
は、前記動物細胞が哺乳動物細胞である。１つの実施形
態では、前記哺乳動物細胞が、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤ
ギ、ウマ、ロバ、霊長類、および水牛の細胞からなる群
から選択される。１つの実施形態では、前記哺乳動物細
胞がヒト細胞である。１つの実施形態では、前記侵襲性
細菌が、Shigellaspp.、Listeria spp.、Rickettsia sp
p.、および腸内侵襲性Eschericha coliからなる群から
選択される。１つの実施形態では、前記侵襲性細菌が弱
毒化される。１つの実施形態では、前記侵襲性細菌が、
Shigellaspp.、Bacteria spp.、Rickettsia spp.、また
は腸内侵襲性E．coli spp.の侵襲特性を模倣するように
遺伝子操作されている、Yersiniaspp.、Escherichia sp
p.、Klebsiella spp.、Bordetella spp.、Neisseria sp
p.、Aeromonasspp.、Franciesella spp.、Corynebacter
ium spp.、Citrobacter spp.、Chlamydia spp.、Hemoph
iphillusspp.、Brucella spp.、Mycobacterium spp.、L
egionella spp.、Rhodococcus spp.、Pseudomonassp
p.、Helicobacter spp.、Salmonella spp.、Vibrio sp
p.、Bacillus spp.、Leishmania spp.、およびErysipel
othrixspp.からなる群から選択される。好ましい実施形
態では、前記侵襲性細菌が弱毒化される。１つの実施形
態では、前記動物細胞が、約10³〜10¹¹個の生存能力の
ある侵襲性細菌で感染させられる。好ましい実施形態で
は、前記動物細胞が、約10⁵〜10⁹個の生存能力のある侵
襲性細菌で感染させられる。１つの実施形態では、前記
動物細胞が、約0.1から10⁶の範囲の感染多重度で感染さ
せられる。好ましい実施形態では、前記動物細胞が、約
10²から10⁴の範囲の感染多重度で感染させられる。１つ
の実施形態では、前記動物細胞がインビトロで培養され
る。１つの実施形態では、前記侵襲性細菌が動物に投与
される。好ましい実施形態では、前記侵襲性細菌が鼻腔
内投与される。好ましい実施形態では、前記動物が哺乳
動物である。より好ましい実施形態では、前記侵襲性細
菌が鼻腔内投与される。さらに好ましい実施形態では、
前記哺乳動物がヒトである。【０１１６】【発明の実施の形態】以下の実施例は、例示のみを目的
として提供され、本発明の範囲を限定することを意図し
ない。【０１１７】【実施例】実施例１真核生物発現カセットを必要とする細菌感染侵襲性細菌での感染は、動物細胞中に外来遺伝子を導入
し得、次いでこれが動物細胞によって発現されること
（以下、「細菌感染」と呼ぶ）を示すために、以下の実
験を行った。【０１１８】Ａ．真核生物発現カセット Promega Corp．（TB094、Promega Corp.）によって記載
されるように、ΔaroA弱毒化障害およびΔvirG弱毒化障
害のを両方を含有する弱毒化Shigellaflexneri株（Nori
egaら、上述）を、レポーター遺伝子β−ガラクトシダ
ーゼ(β-gal)を含有するpSVβ-gal（PromegaCorporatio
n、Madison、WI）（以後、「pβ-gal+SV」と呼ぶ）また
はウイルス由来のSV40真核生物プロモーター領域を欠失
するその誘導体（以後、「pβ-gal-SV」と呼ぶ）のいず
れかで形質転換した。両構築物はまた、S.flexneriによ
ってβ-galの発現を可能にする原核生物Escherichiacol
igptプロモーターを含有する。【０１１９】pβ-gal-SVを、SV40プロモーターを、Hind
IIIおよびNcoI制限エンドヌクレアーゼ消化によってpβ
-gal+SVから除去し、DNAオーバーハングを挿入し、次い
で、標準的な分子生物学技術（Sambrookら、上述）を用
いて再連結を行うことによって得た。SV40-プロモータ
ー領域の欠失を、制限消化分析によって確認した。【０１２０】従って、pβ-gal+SVは、機能的な真核生物
発現カセットを含有し、一方pβ-gal-SVは、機能的な原
核生物プロモーターのみを含有する。【０１２１】得られた形質転換細菌を、-70℃に維持し
た30％(w/v)グリセロールストックから100μg/mlのアン
ピシリン含有固形培地（Tryptic SoyAgar、DIFCO、Madi
son、WI）に蒔いてプラスミドを含有する細菌を選択
し、37℃で一晩増殖した。【０１２２】Ｂ．真核生物細胞 HeLa細胞（ATCC 番号 CCL-2）を、10％(v/v)のウシ胎児
血清、2.0mMのＬ−グルタミン、1.0mMのL−ピルビン
酸、50U/mlのペニシリン、および50μg/mlのストレプト
マイシンを補給したRPMI培地（以後、「RPMI/FBS」と呼
ぶ）中で５％(v/v)CO₂中37℃でプラスチック組織培養プ
レート上で増殖させた。細菌感染の24〜48時間前に、He
La細胞を1.0mMのEDTAを含有する0.25％(w/v)トリプシン
でトリプシン処理し、細胞が実験時に40〜60％コンフル
エントとなるように希釈を制限することによって分離し
た。【０１２３】細菌感染の前に、存在するHeLa細胞の数を
血球計でカウントすることによって確認した（Celis、C
ell Biology: A LaboratoryManual、Ed．Academic Pres
s、San Diego、CA(l994)）。【０１２４】Ｃ．真核生物細胞の細菌感染 5×10⁴個のHeLa細胞を、ウシ胎児血清およびペニシリン
／ストレプトマイシン欠失RPMI培地（以後、「SFM」と
呼ぶ）で一度洗浄し、次いでSFM中で細菌懸濁液を重層
し、そして５％のCO₂中37℃でインキューベートした。
細菌懸濁液は、一晩の寒天プレート、または新鮮なブロ
ース培養物由来であり、そして１個のHeLa細胞に対して
約10¹〜10³の生存能力のある形質転換細菌の感染比を与
えるように調製した。【０１２５】３時間後、細胞外細菌を含有するSFMを除
去し、HeLa細胞をRPMI/FBSで一度リンスし、次いで100
μg/mlのゲンタマイシンを含有する新鮮なRPMI/FBSを加
えた。５％のCO₂中で37℃でのさらなる一時間のインキ
ュベートに続いて、ゲンタマイシン溶液を除去し、HeLa
細胞をRPMI/FBSで一度リンスし、新鮮なRPMI/FBSを加
え、そして細胞を５％のCO₂中37℃に戻した。【０１２６】細菌感染の６時間、24時間、48時間、72時
間および92時間後に、HeLa細胞をリン酸緩衝化生理食塩
水（以後、「PBS」と呼ぶ）で２度洗浄し、Hawley-Nels
onら、Focus、15:73-79(1993)によって記載されるよう
にβ-gal活性について染色し、そして次いで写真を撮っ
た。分析前のインキュベーション時間が48時間よりも長
い場合には、RPMI/FBSを48時間で交換した。【０１２７】細胞質が均一に青色に染色されている細胞
は、pβ-gal+SVを含有するS.flexneriで細菌感染したHe
La細胞についてのみ観察され、そしてpβ-gal-SVを含有
するS.flexneriで細菌感染したHeLa細胞については観察
されなかった。コンフルエントな染色の平均的な程度
は、細菌感染と写真撮影との間の期間が長いほど大きか
った。これは、発現が細菌感染前にShigellaによって合
成されたβ-galのみに起因したのではなく、HeLa細胞内
で新たに合成されたβ-galの結果であったことを示して
いる。このことは、時間に関連して染色の程度が増加し
なかったpβ-gal-SV細菌感染細胞によって確認された。【０１２８】青色に染色されたサイトソル内細菌（E.co
ligptプロモーターのβ-galがオフのS.flexneri発現の
結果）および／または25％以下の青色に染色された細胞
質を有する細胞として定義されるような、形質転換はさ
れていないが細菌に関連するHeLa細胞（以後、「トラン
スフェクトされていない」と呼ぶ）に対する、25％より
多くの細胞形質が青色に染色された細胞として定義され
る、陽性β-gal染色細菌感染形質転換HeLa細胞（以後、
「トランスフェクトされた」と呼ぶ」の比を、各３ウェ
ルにおいて500個の細胞をカウントすることによって決
定した。両セットの細菌感染細胞において、少数（ウェ
ル当たり５以下）のHeLa細胞をS.flexneriに過剰感染さ
せた。これらの過剰感染細胞は、顕微鏡によって見られ
る個々の青色に染色された細菌のために、その「不調和
(patchy)」な外観および不均一な着色によって識別可能
であった。これらの過剰感染細胞は、25％より多いの青
色染色を有するものとしてはカウントされなかった。こ
の結果を以下の表１に示す。【０１２９】【表１】上記の表１に示されるように、β-gal構築物（pβ-gal+
SV）を含有する真核生物SV40プロモーターで細菌感染し
たHeLa細胞のみが、形質転換表現型であった。これは、
青色のβ-gal表現型が原核生物的に発現したβ-galによ
るものではなく、むしろ細菌感染したHeLa細胞による発
生期の合成によるものであったことを示している。【０１３０】HeLa細胞内部の弱毒化S.flexneriの生存
を、標準的な方法により細菌感染後の６時間、24時間、
48時間、72時間および92時間で各３ウェル中に存在する
生存能力のある細菌をカウントすることによって決定し
た（Celis、CellBilogy: A Laboratory Manual、Ed．Ac
ademic Press、San Diego CA(1994)）。すなわち、細菌
感染後のHeLa細胞を、1.0％(w/v)のデオキシコール酸で
溶解し、生存能力のある細菌を固形培地上で数えた。S.
flexneri::pβ-gal+SVに細菌感染したHeLa細胞に関する
結果を図1Aに、そしてS.flexneri::pβ-gal-SVに細菌感
染したHeLa細胞に関する結果を図1Bに示す。【０１３１】図1Aおよび1Bに示すように、S.flexneri
は、HeLa細胞内部で迅速に不活性化された。このこと
は、β-gal表現型の増加が新しい酵素合成によるもので
あることをさらに示している。すなわち、本実施例で用
いられるプラスミドは、pSVβ-gal由来のものであり、
そして真核生物オリジンの複製を欠失する。それゆえ、
これらのプラスミドは、受容HeLa細胞内では複製してい
ない。従って、プラスミドの隔絶は調節されず、そして
新しい娘細胞は、永久的に形質転換された表現型を発展
させるのに十分なプラスミドを含まない。【０１３２】細菌感染がHeLa細胞を殺傷していなかった
ことを確認するために、細菌感染したコントロールHeLa
細胞（S.flexneri::pβ-gal+SVを使用）を、Celis（上
述）によって記載されるトリプシン処理後の血球計によ
る規則的な間隔での方法でカウントした。その結果（各
時間ごとの２ウェルの平均）を図２に示す。【０１３３】図２に示すように、HeLa細胞の数は実験を
通じて増加し続け、細菌感染のプロセスが宿主細胞に対
する重篤な細胞毒性なしに成し遂げられ得ることを示し
た。【０１３４】実施例２種々の細胞型の細菌感染上皮様ヒト子宮頸HeLa細胞以外の細胞株を形質転換する
細菌感染の能力を確かめるために、さらに２つの上皮様
細胞株および１つの腎臓細胞株を細菌感染に供した。【０１３５】さらに詳細には、Int 407（ATCC 番号 CCL
-6）、ヒト胎児回腸／空腸細胞株；CaCo-2（ATCC 番号
HTB-37）、ヒト結腸細胞株；およびMDCK（ATCC番号 CCL
-34）、イヌ腎臓細胞株を培養し、そしてpβ-gal+SVま
たはpβ-gal-SVのいずれかを含有するS.flexneriで感染
し、HeLa細胞に関して上記の実施例１で記載したよう
に、細菌感染後24時間のβ-gal活性を評価した。【０１３６】pβ-gaI+SVを用いて、形質転換されたβ-g
al陽性染色細胞を、Int 407およびCaCo-2細胞について
得たが、予想通りMDCK細胞については得られなかった。
すなわち、細菌感染は、野生型のShigella種により見出
される天然の侵襲特性を反映しているようであり、この
ようなShigellaがイヌに感染するのは非常にまれで、そ
して通常は、上皮細胞においてのみ見いだされるからで
ある（Kreigら、上述）。【０１３７】従って、本発明の方法が、１つの動物細胞
型に限定されず、しかし種々の組織から得られる動物細
胞に適用可能であることは明白である。【０１３８】実施例３種々の外来抗原の細菌感染媒介性発現細菌感染が、HeLa細胞、およびヒト抹消血由来単核細胞
において種々の外来抗原の発現を媒介し得ることを示す
ために、以下の実験を行った。【０１３９】Ａ．真核生物発現カセット S.flexneriΔaroΔvirG株を、市販の真核生物レポータ
ープラスミドpGFP-C1（Stratagene、LaJolla、CA）で形
質転換した。このプラスミドは、Aequorea victoriaク
ラゲ緑色蛍光タンパク質（GFP）（Wangら、Nature、36
9:400-403(1994)）をコードする遺伝子の発現を駆動す
るウイルス由来のCMV真核生物プロモーターを含む。プ
ラスミドpGFP-C1は、原核生物宿主においてGFPを発現す
る正しい位置では原核生物プロモーターを含まない。す
なわち、GFP遺伝子は、機能的な原核生物発現カセット
内には位置しない。プラスミドが真核生物細胞に送達さ
れるのは、GFPが真核生物発現カセットから生成される
ときのみである。【０１４０】さらに、安定なエピソーム真核生物プラス
ミドpCEP4（Invitrogen Corporation、San Diego、CA）
上にHIV-1のgp160領域を含む真核生物発現カセットを構
築した。プラスミドを、HIV-1分子クローンpBH10から増
幅したtatのエクソン１からrevの最後のエクソンにわた
る3.5kbのPCR増幅XbaI::NotIフラグメントをクローニン
グすることによって作製した（Ratnerら、上述）。この
プラスミドをプラスミドpCEP4::gp160と称した。宿主プ
ラスミドpCEP4の設計のために、クローニングされたgp1
60配列は、真核生物細胞内でのみ発現される。すなわ
ち、この配列は、原核生物発現カセットではなく、真核
生物発現カセット内に存在する。【０１４１】Ｂ．真核生物細胞細菌感染前に24時間カバーガラス上で増殖させたこと以
外は上記の実施例１に記載するように、HeLa細胞を得、
そして調製した。【０１４２】単核細胞を、カバーガラスに付着する前に
５日間、テフロン（登録商標）ビーカー中で10％(v/v)
のヒト血清を補給したRPMI培地で培養することによっ
て、細菌感染前に24時間マクロファージを富化した。【０１４３】Ｃ．真核生物細胞の細菌感染上記の実施例１に記載するように、HeLa細胞およびマク
ロファージの両方を、pGFP-C1で形質転換したS．flexne
riΔaroΔvirG株に細菌感染させた。48時間の細菌感染
後、細菌感染した形質転換動物細胞によって合成された
GFPの存在を、蛍光顕微鏡によって緑色蛍光で可視化し
た。その結果、HeLa細胞およびマクロファージは両方と
も、細菌感染し、そのために、発現されたGFPによる蛍
光性を有する細胞と、細菌感染せず、そのために、蛍光
性を有さない細胞との２つの群に分かれた。細菌感染し
ていないHeLa細胞に対する細菌感染したHeLa細胞の比
は、pβ-gal+SVに関して見られるのと明らかに同様であ
ったが、細菌感染したマクロファージは少なかったよう
であった。【０１４４】さらに、pCEP4::gp160またはpCEP4のいず
れかで形質転換したShigella ΔaroΔvirGを用いて、上
記の実施例１に記載するように、カバーガラス上で増殖
したHeLa細胞を細菌感染させた。細菌感染の48時間およ
び72時間後に、カバーガラスをRPMI/FBSから取り出し、
PBSで２度リンスし、次いで、-20℃のメタノール中で２
時間より長く固定した。固定後、Harlowら、Antibodie
s、ColdSpring HarborLaboratory Press、Cold Spring
Harbor、NY(1988)によって記載されるように、抗gp160
モノクローナル抗体反応混液(Abaciogluら、AIDSRes.お
よびHuman Retroviruses、10(4):371-381(1994))、およ
びFITC標識検出抗体を用いて、gp160タンパク質を免疫
蛍光によって検出した。蛍光顕微鏡で明視化すると、２
つの細胞群、即ち、陽性の染色細菌感染し形質転換され
た、gp160を発現する細胞と、非形質転換細胞との両方
が可視化された。細菌感染していないHeLa細胞に対する
細菌感染したHeLa細胞の比は、pβ-gal+SVに関して見ら
れたのと明らかに同様であった。しかし、gp160の過剰
発現のために、形質転換された細胞は、変形しているよ
うであり、長期間は本質的に不安定であった。【０１４５】実施例４他の弱毒化した病斑での細菌感染実施例１で用いられるS．flexneri株におけるΔaroΔvi
rG弱毒化が細菌感染に必要でないことを示すために、Δ
asd弱毒化を有する第２のS．flexneri株を、pβ-gal+SV
およびpβ-gal-SVプラスミドで形質転換し、実施例１に
記載するように種々の細胞型の細菌感染実験に用いた。【０１４６】Δasd弱毒化(EC 1.2.1.11)は、原核生物に
おける細胞壁の合成に必要なペプチドグリカンの製造を
停止させる（Cohenら、EscherichiacoliおよびSalmonel
la typhimurium: Cellular and Molecular Biology、１
巻、429〜444頁、Ingrahamら編、AmericanSociety of M
icrobiology、Washington、D.C．(1987)）。増殖培地に
外部から添加されたDL-α、ε−ジアミノピメリン酸
（本明細書中以後、「DAP」と呼ぶ）が存在しないと、
Δasdが弱毒化された原核細胞は溶解する。この化合物
は、真核生物細胞内には存在しない。【０１４７】Δasd弱毒化が存在すると、ΔaroΔvirG菌
株と比較して、HeLa、Int-407、およびCaCo-2細胞に侵
襲する能力がわずかに低下する。この弱毒化菌株はま
た、MDCK細胞にも侵襲できないことが見いだされた。３
時間の侵襲インキュベーション中にDAP（50μl/ml）を
細菌細胞懸濁液に添加すると、侵襲レベルは、ΔaroΔv
irGが弱毒化された株に関して見られるレベルまで回復
した（以下の表２を参照のこと）。【０１４８】【表２】上記の表２は、DAPを添加したまたは添加しないS．flex
neri Δasd形質転換体による細菌感染の48時間後に形質
転換された表現型を示すHeLa細胞の数を示す。細胞をβ
-gal活性について一晩染色し、次いで、各３ウェルにお
いて500個の細胞を計数した。平均±標準エラーを示
す。pβ-gal+SVを含有するS．flexneriΔasdで細菌感染
させたHeLa細胞のみが、青色のβ-gal陽性表現型となっ
た。【０１４９】このように、弱毒化の性質は、細菌感染が
起こるためには重要ではないが、形質転換のレベルに影
響を与え得る。【０１５０】HeLa細胞内の弱毒化されたS．flexneri Δ
asd（+DAP）の生存は、実施例１で記載したように細菌
感染の６時間、24時間、48時間、および96時間後に３ウ
ェルのそれぞれに存在する生存能力のある細菌を計数す
ることによって決定した。S．flexneri::pβ-gal+SVで
細菌感染させたHeLa細胞についての結果を図3Aに、そし
てS．flexnerl::pβ-gal-SVで細菌感染させたHeLa細胞
についての結果を図3Bに示す。図3Aおよび3Bに示すよう
に、S．flexneriは、HeLa細胞内では複製していなかっ
た。従って、β-gal表現型の増加は、新規の酵素合成に
よるはずである。【０１５１】細菌感染がHeLa細胞を殺さないことを確認
するために、細菌感染したコントロールHeLa細胞（S．f
lexneri::pβ-gal+SVを用いる）を実施例１に記載する
ように計数した。その結果（即ち、各時点ごとの２ウェ
ルの平均）を図４に示す。【０１５２】図４に示すように、HeLa細胞の数は、実験
を通じて増加し続け、これは、細菌感染のプロセスが細
胞傷害性でなかったことを示す。【０１５３】実施例５インビボでのレポーター遺伝子の動物組織への送達細菌感染がインビボで起こり得ることを示すために、抑
制マウス(Balb/c)に、10μlのPBSの容量でpβ-gal+SVま
たはpβ-gal-SVのいずれかを含有する5×10⁶個の生存能
力のあるS．flexneriΔaroΔvirGを鼻腔内接種した。接
種の48時間後、マウスを屠殺し、肺組織を採取し、そし
て-70℃に凍結した。凍結切片（5.0μM）を調製し、固
定し、次いで上記（Hawley-Nelsonら、上述）のように
β-gal活性について一晩染色した。染色後、切片をPBS
で２度リンスし、次いでカバーガラス下に密封した。【０１５４】青色に染色したβ-gal-陽性細胞は、pβ-g
al+SVで感染させた肺部分ごとに見ることができたが、p
β-gal-SVで感染させた肺部分には見られなかった。【０１５５】このように、細菌感染は、インビトロにお
ける適用に限定される現象ではなく、インビボの使用に
もまた適切である。【０１５６】実施例６細菌感染は、生存能力および侵襲表現型の両方を必要と
する細菌感染が起こるために生存能力または活発な侵襲表現
型のいずれかが必要であるかどうかを決定するために、
非侵襲性（コンゴレッド陰性）S．flexneri ΔaroΔvir
G::pβ-gal+SVおよび紫外線致死性侵襲性（コンゴレッ
ド陽性）S．flexneriΔaroΔvirG::pβ-gal+SVを用い
て、実施例１に記載するようにHeLa細胞を細菌感染させ
た。侵襲性（コンゴレッド陽性）S．flexneriΔaroΔvi
rG::pβ-gal+SVの、紫外線非致死性複製培養物をコント
ロールとして用いた。【０１５７】コンゴレッド陰性も紫外線致死性細菌も、
HeLa細胞に付着も侵襲もできなかった。両方の場合にお
いて、陽性のβ-gal染色形質転換HeLa細胞は検出されな
かった（以下の表３を参照）。生存能力のあるコンゴレ
ッド陽性S．flexneriΔasd::pβ-gal+SV細胞（+DAP）ま
たは紫外線致死性細胞（+DAP）のいずれかを用いたさら
なる実験は、同様の結果を示した（以下の表３を参照の
こと）。【０１５８】【表３】上記の表３は、レポータープラスミドpβ-gal+SVを含有
するS．flexneri株による細菌感染の48時間後に形質転
換された表現型を示すHeLa細胞の数を示す。細胞をβ-g
al活性について一晩染色し、次いで、３ウェルのそれぞ
れにおける500個の細胞を計数した。平均±標準エラー
を示す。侵襲性の、生存能力のあるS．flexneriで細菌
感染させたHeLa細胞のみが、青色のβ-gal陽性表現型と
なった。【０１５９】従って、細菌感染で用いられる原核生物細
胞の真核生物標的細胞に侵襲するための生存能力および
能力は、細菌感染による動物細胞の形質転換のためには
必要なようである。【０１６０】実施例７インビボで送達された遺伝子に対する免疫応答の発達細菌感染のインビボでの使用の他の例を示すために、5
×10⁷個のpCEP4::gp160プラスミド構築物を含有するS．
flexneriΔaroΔvirGを抑制Balb/cマウスに鼻腔内投与
した。細菌感染の14日後、マウスを屠殺し、そして脾臓
を採取した。【０１６１】適合抗原としてgp120（Intracel、Cambrid
ge、MA）を、そしてコントロール抗原としてオボアルブ
ミン（Sigma Chemical Co.、StLouis、MO）を用いて、
標準方法（Kruisbeckら、Current Protocols in Immuno
lory、3.12.1〜3.12.4頁、currentProtocols、New Yor
k，NY(1991)）によって脾臓細胞の増殖アッセイを行っ
た。【０１６２】HIV-l gp160の遺伝子を含むプラスミドpCE
P4::gp160で細菌感染させたマウスから単離した脾臓細
胞は、７倍の刺激を示し、一方、コントロールの、細菌
感染させた（pCEP4）マウスからの脾臓細胞は応答を示
さなかった。従って、細菌感染は、免疫応答が高まって
きた抗原をコードする遺伝子の送達に適したシステムで
ある。【０１６３】本発明は、詳細に、かつその具体的な実施
態様を参照しながら記載したが、当業者には明らかなよ
うに、種々の変更および改変が本発明の精神および範囲
を逸脱することなく行われ得る。【０１６４】動物細胞内に遺伝子を導入および発現させ
る方法であって、この動物細胞を生きた侵襲性細菌で感
染させる工程を包含し、この細菌が、この遺伝子をコー
ドする真核生物発現カセットを含有する方法を開示す
る。この遺伝子は、例えば、ワクチン抗原、治療薬、お
よび免疫調節剤またはアンチセンスRNAもしくは触媒RNA
をコードし得る。【０１６５】【発明の効果】本発明は、生きた侵襲性細菌を使用し
て、１つ以上の真核生物発現カセットを動物細胞または
動物組織に送達することを提供する。別の局面では、本
発明は、生きた侵襲性細菌を使用して、ワクチン抗原を
コードする１つ以上の真核生物発現カセットを動物細胞
または動物組織に送達することを提供する。別の局面で
は、本発明は、生きた侵襲性細菌を使用して、治療薬を
コードする１つ以上の真核生物発現カセットを動物細胞
または動物組織に送達することを提供する。別の局面で
は、本発明は、生きた侵襲性細菌を使用して、生物学的
に活性なRNA種をコードする１つ以上の真核生物発現カ
セットを動物細胞または動物組織に送達することを提供
する。

【図面の簡単な説明】【図１Ａ】図１Ａおよび図１Ｂは、pβ-gal+SV40発現カ
セットを含有するか（図1A）、またはpβ-gal-SV40発現
カセットを含有する（図1B）S．flexneriΔaroAΔvirG
の、６時間、24時間、48時間、72時間、および92時間の
細菌感染後にHeLa細胞内に生存するウェル当たりのコロ
ニー形成単位を示す。【図１Ｂ】図１Ａおよび図１Ｂは、pβ-gal+SV40発現カ
セットを含有するか（図1A）、またはpβ-gal-SV40発現
カセットを含有する（図1B）S．flexneriΔaroAΔvirG
の、６時間、24時間、48時間、72時間、および92時間の
細菌感染後にHeLa細胞内に生存するウェル当たりのコロ
ニー形成単位を示す。【図２】図２は、pβ-gal+SV40発現カセットを含有する
S．flexnerjΔaroAΔvirGでの、６時間、24時間、48時
間、72時間、および92時間の細菌感染後に存在するHeLa
細胞のウェル当たりの細胞数を示す。【図３Ａ】図３Ａおよび図３Ｂは、pβ-gal+SV40発現カ
セットを含有する（図3A）か、またはpβ-gal-SV40発現
カセットを含有する（図3B）S．flexneriΔasdの、６時
間、24時間、48時間、および96時間の細菌感染後にHeLa
細胞内に生存するウェル当たりのコロニー形成単位を示
す。【図３Ｂ】図３Ａおよび図３Ｂは、pβ-gal+SV40発現カ
セットを含有する（図3A）か、またはpβ-gal-SV40発現
カセットを含有する（図3B）S．flexneriΔasdの、６時
間、24時間、48時間、および96時間の細菌感染後にHeLa
細胞内に生存するウェル当たりのコロニー形成単位を示
す。【図４】図４は、pβ-gal+SV40発現カセットを含有する
S．flexneri Δasdでの、６時間、24時間、48時間、お
よび96時間の細菌感染後に存在するHeLa細胞のウェル当
たりの細胞数を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ジョージケイ．レウィスアメリカ合衆国メリーランド 21218, ボルチモア，セントポールストリート 3802 (72)発明者デイビッドエム．ホーンアメリカ合衆国メリーランド 21043, エリオットシティ，ラスティングバークコート 7927 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA02 DA02 EA04 EA10 GA11 HA17 4C084 AA13 NA14 ZB352

Claims

【特許請求の範囲】【請求項１】動物細胞内に遺伝子を導入および発現さ
せる方法であって、該方法が、該動物細胞を生きた侵襲
性細菌で感染させる工程を包含し、該細菌が、該遺伝子
をコードする真核生物発現カセットを含有する、方法。