DE3517656A1

DE3517656A1 - Verfahren zur herstellung von makromolekuelen durch dna-transformation

Info

Publication number: DE3517656A1
Application number: DE19853517656
Authority: DE
Inventors: Bertold Fridlender; Erna Jerusalem Meller
Original assignee: International Genetic Sciences Partnership
Current assignee: International Genetic Sciences Partnership
Priority date: 1984-05-18
Filing date: 1985-05-15
Publication date: 1985-11-21
Also published as: FR2564482B1; FR2564482A1; GB2159821B; GB2159821A; GB8512485D0; JPS60260599A

Description

Henkel, Feiler, Hänzel & Partner

351765S

Patentanwälte

E'jrooean Patent An Zugelassene -Jerjeiet Eurooaiscnen ^ateriai

Dr. pnil G Herkei Dr. rer nat. L. R^er Dip! -¹Pg. W. Hanzs' i -mg. D Kcnmarr,

a;3e 37 D-8000 Mur.cnen 30

Tel. 089/982085-87 Telex 529802 ηπκΙ α Tele^:ax (Gr 2-3; 089/981426
Telegramm

INTERNATIONAL GENETIC SCIENCES PARTNERSHIP, Research Triangle Park, N.C, USA

Verfahren zur Herstellung von Makromolekülen durch DNA-Transformation

Verfahren zur Herstellung von Makro molekülen durch DNA-Transformation

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Makromolekülen auf gentechnologischem Wege, insbesondere die Verwendung von Dictyostelium oder sonstiger niedriger eukaryotischer Zellen als Vehikel für die Herstellung von Fremdmakromolekülen im Rahmen gentechnologischer Methoden.

Erfindungsgemäß wird dem Fachmann ein Verfahren zur Herstellung von Makromolekülen, d.h. Proteinen, auf gentechnologischem Wege an die Hand gegeben. Das Verfahren gestattet eine DNA-Transformation einer ein-

25 fachen eukaryotischen Zelle, insbesondere von

Dictyostelium, durch "Füttern" von Amöben mit chloramphenicol-induziertem Plasmid in einem Bakteriumträger, z.B. E.coli. Das Plasmid transformiert den niedrigen Eukaryoten, z.B. Dictyostelium, mit hoher Frequenz und integriert sich in das Kerngenom. Das beschriebene Verfahren ist wirksam und einfach durchzuführen .

Erfindungsgemäß können Dictyostelium und andere niedrige eukaryotische Zellen als wirksamer Träger für die Her-

Stellung von Fremdmakromolekülen, d.h. Proteinen (auf gentechnologischem Wege) eingesetzt werden. Theoretisch läßt sich mit Hilfe des erfindungsgemäß eingesetzten "Zufuhrsystems" bzw. "Futtersystems" jeder Organismus, der Bakterien "fressen" kann, transformieren. Folglich stellt das "Nährsystem" für bakterienfressende Zellen eine wesentliche Vereinfachung für die Transformation dieser Organismusart dar. Der Organismus wird durch sein natürliches "Futtersystem" unter natürlichen Bedingungen transformiert, wobei keine neuen Parameter eingeführt werden müssen. Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Plasmid-DNA dauernd geschützt, da sie sich entweder im Inneren des Bakteriums oder im Inneren der Rezipientenzelle befindet. Aus diesem Grunde stellt die Zeit keinen kritischen Parameter dar, d.h. die Organismen können mit plasmidhaltigen Bakterien über eine Reihe von Tagen hinweg gefüttert werden (bei anderen Transformationssystemen befindet sich die DNA des Plasmids mit dem Organismus bei 4⁰C etwa 1 h lang in Kontakt), wodurch sich die Anzahl der Kopien der eingeführten Plasmid-DNA stark erhöhen läßt. Dies ist vermutlich einer der Gründe für die erhöhte Transformationsausbeute.

Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß ein Promotor, der in Säugetierzellen, jedoch nicht in Hefezellen, funktioniert (vgl. G.B.Kiss, R.E.Pearlman, K.V.Cornish, J.D.Friesen und V.L.Chan, in "J.Bacteriol.", 149, Seiten 542-547 (1982)), auch in niedrigen eukaryotisehen Zellen, wie Dictyostelium, funktioniert. Dieses Merkmal plus andere Eigenschaften von Dictyostelium Amöben und anderen niedrigen eukaryotischen Zellen ermöglicht eine zumindest vergleichbare und sogar bessere großtechnische in vitro-Produktion von menschlichen und sonstigen eukaryotischen Genprodukten

durch DNA-Rekombinationsmethoden als bei Verwendung von Hefe.

Erfindungsgemäß wurde ferner noch gefunden, daß im Falle, daß das in dem Bakteriumfutter enthaltene Plasmid eine zur DNA des Rezipientenorganismus homologe DNA enthält, infolge Integration der Plasmid-DNA in die Rezipientengenom-DNA eine noch stabilere und wirksamere Transformation erfolgt.

Dictyostelium oder sonstige niedrige eukaryotische Zellen stellen folglich eine wichtige Alternative zu prokaryotischen Systemen zur Behandlung und Herstellung von Makromolekülen eukaryotischen Ursprungs durch gentechnologische Verfahren dar. Diese Systeme vermeiden die bei prokaryotischen Systemen infolge fehlender Zusammenfügung von RNA und posttranskriptioneller Modifikationen des gebildeten Proteins (d.h. Glycosilierung, Phosphorylierung u.dgl.) beobachteten Probleme.

Das System läßt sich zur Herstellung von Vakzinen, Hormonen, Interferon, regulatorischen Proteinen, Enzymen u.dgl. heranziehen.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Zeichnungen näher erläutert. Im einzelnen zeigen:

Fig. 1 das Dictyostelium-DNA tragende Rekombinanten-Plasmid pBM 7.6. Dieses Plasmid ist bei der Transformation von Dictyostelium höchst wirksam und liefert nach dem Einbau in das Genom über

eine Homologenrekombination stabile Transformanten. Im Detail zeigt die Fig. 1 den Aufbau des zur "Futtertransformation" von Dictyostelium discoideum verwendeten Plasmids pBM 7.6. Die dicken Linien entsprechen Bereichen von pAG6O,

die zu pBR322 homolog sind. Die durch die

Pvu II-Stellen begrenzte gestrichelte Linie entspricht dem Bereich von pAG6O/ der den Herpes Simplex Virus TK-Promotor und das bakterielle kan-Gen besitzt. Die schmale Linie

zwischen Hind III und Bam HI bezeichnet die Dictyostelium-DNA-Einfügung.

Fig. 2 den Säugetierzellentransformationsvektor pSV^-neo, der keine Dictyostelium-Sequenzen

trägt. Dieses Plasmid transformiert (nur) mit geringerem Wirkungsgrad.

Fig. 3 eine graphische Darstellung des Einflusses von G-418 auf das Wachstum bei einem 6-tägigen

Fütterungsversuch mit mit Chloramphenicol amplifiziertem pBM 7.6. Im einzelnen zeigt die Fig. 3 den Einfluß von G-418 auf das Wachstum von durch Fütterung transformierten Amöben.

Sechs Tage lang mit LA102-haltigem, mit chloramphenicol-amplifiziertem pBM 7.6 gefütterte Amöben werden in zwei aliquote Teile geteilt. Ein Teil wird in Abwesenheit von G-418 (A), der andere in Gegenwart von 40 μg G-418 pro ml (B) wachsen gelassen. Zu Vergleichszwecken wer

den mit plasmidfreien Bakterien gefütterte wilde Zellen in entsprechender Weise (C) bzw. (D) wachsen gelassen.

Ausführungsbeispiel einer Dictyostelium Discoideum-Transformation

A. Verwendete Substanzen:

1. E.coli B/r, bis zur Sättigung in NZY-Brühe, NZ-Brühe bzw. L-Brühe gewachsen.

NZY-Brühe: 10 g N-Z-Amin A (Sheffield Products, POB 398,

Memphis, TN 38101); 5 g NaCl; 2 g MgCl₃-7H₂O; 5 g Hefeextrakt (Difco); mit Wasser aufgefüllt auf 1 Liter.

NZ-Brühe: Entspricht der NZY-Brühe ohne Hefeextrakt.

L-Brühe: 10 g Trypton (Difco), 5 g Hefeextrakt (Difco);

10 g NaCl; mit Wasser auf 1 Liter aufgefüllt.

2. Log-Phase-Amöben, gewachsen in einer Schüttelsuspension mit E.coli B/r. Die verwendeten Stämme bestehen aus DdB, ein Subklon von Sussman aus Raper'schein NC-4, und DdC, ein cycloheximid-resistentes Derivat von DdB von Sussman über Rieh Kessin.

²⁵ 3. KPM-Puffer: 2,25 g KH₃PO₄; 0,67 g K₃HPO₄;

0,50 g MgSO₄-7H₃O, mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt; pH-Wert: 6,1.

4. G-418 (Gibco, 3175 Staley Road, Grand Island, 30

New York 14072); 449 μg G-418/mg Feststoff. Hierbei

handelt es sich um ein unreines Fermentationsprodukt, das weiter gereinigt werden kann. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wird es ohne weitere Reinigung eingesetzt. Im folgenden wird die Wirkstoffkonzentration 35

in ug/ml Feststoff anstatt in μg aktiver Wirkstoff an-

gegeben. Es werden Vorratslösungen von G-418 mit 10 mg/ml in Wasser oder KPM zubereitet und als 1 ml Aliquote in Glas- oder Kunststoffröhrchen bei -10°C bis -20°C gelagert. Der Wirkstoff ist nach einigen Gefrier/Auftau-Zyklen inaktiviert. Ein aliquoter Teil kann drei- oder viermal verwendet werden, bevor ein merklicher Aktivitätsverlust eintritt. Es empfiehlt sich/ einen aliquoten Teil jeweils nur zweimal zu verwenden.
10

B. Präparation des Bakteriums:

Hierbei geht man wie folgt vor: 15

1. 50 ml L-Brühe in einem 250 ml-Kolben werden mit einer einzigen Kolonie von E.coli B/r beimpft. Danach wird die Kultur über Nacht bei 37⁰C unter Schütteln bis zur Sättigung wachsen gelassen.

2. Jeder von fünf 3000 ml fassenden Fernbach-Kolben mit 1500 ml NZY-/ NZ- bzw. L-Brühe wird mit 5,0 ml der gesättigten "Übernachtkultur" von E.coli B/r beimpft .

3. Wachstum bis zur Sättigung (oder etwa 14 h) bei 37⁰C unter Rütteln mit 300 Umdrehungen/min. Danach wird das Bakterium 24 h (bzw. über Nacht) bei 4⁰C absetzen gelassen. Nach dem Dekantieren der überstehenden Flüssigkeit wird das Bakterium durch Zentrifugieren (10 K, 5 min) abgetrennt, worauf die erhaltenen Pellets vollständig in insgesamt 1500 ml KPM (d.h. es werden 250 ml Puffer in jede der sechs Zentrifugenflaschen mit den Bakteriumpellets einge-

gosseri) resuspendiert werden. Nun wird erneut 5 min bei 10 K zentrifugiert. Nach vollständigem Dekantieren wird das Bakterium in KPM bis A595 = 60 resuspendiert. Die Lagerung erfolgt bei 4⁰C. Bei 4⁰C bleiben die Zellen mindestens 4 Wochen lang verwendbar. Es sei darauf hingewiesen, daß unzureichend (zur Entfernung von Kulturmedium) gewaschene Zellen offensichtlich einen Metaboliten produzieren, der sich während der Lagerung ansammelt und für Amöben toxisch ist.

C. Amplifikation des Plasmids pBM 7.6;

1. 5,0 ml der "Übernachtkultur" von pBM 7.6 oder den gewünschten Vektor enthaltendem E.coli werden unter Penicillin (100 \ig/ml) -Selektion in L-Brühe wachsen gelassen. Die "Übernachtkultur" wird in 1,5 1 steriler L-Brühe überführt und unter Selektion bis A595 von 0,25 - 0,30 (mid-log) wachsen gelassen. Wenn die Zellen mid-log erreicht haben, werden 375 mg Chloramphenicol (250 μg/ml) zugesetzt und das Ganze dann über Nacht bei 37⁰C geschüttelt. Die Gewinnung des Bakteriums erfolgt durch Zentrifugieren (10 K, 5 min). Das hierbei erhaltene Pellet wird vollständig in etwa 250 ml Puffer resuspendiert, worauf erneut bei 10 K 5 min lang zentrifugiert wird. Nach vollständigem Dekantieren wird das Bakterium in KPM-Puffer bis zu einem A595 von 10 resuspendiert. Diese amplifiziertes Plasmid enthaltenden Bakterien werden bei einem A595 von 10 zur Dictyostelium-Transformation verwendet.

-Al·

D. Transformation:

1. 20 ml KPM-Puffer mit E.coli B/r in einer A595-Kon zentration von 10 werden mit Dictyostelium-Amöben beimpft .

2. Es werden 5 - 6 χ 10 Amöben/ml geerntet, 5mal mit kaltem KPM-Puffer gewaschen und dabei jedesmal 5 min lang bei 1 K (Umdrehungen/min) zentrifugiert.

3. Das erhaltene Pellet wird in 2 ml KPM-Puffer resuspendiert. Nach einer Zellenzählung werden die Zellen auf 5 χ 10 bis 1 χ 10 Amöben/ml in die chloremphenicol-amplifiziertes Plasmid enthaltenden Bakterien verdünnt. Am nächsten Morgen werden die Zellen gezählt. Wenn die Kultur 5 χ 10 Amöben/ml erreicht, wird sie unter Verwendung der das chloramphenicol-amplifizierte Plasmid enthaltenden Bakterien

als Futterlieferant auf 1 χ 10⁵ Amöben/ml rückverdünnt. Diese Fütterung läßt sich einige Tage lang durchführen, wobei jeweils frische plasmidhaltige Bakterien als Futter zugesetzt werden. Am Ende einer Transformation werden die Amöben 5mal mit kaltem KPM-Puffer gewaschen (wobei jedesmal 15 min lang mit 1 K (Umdrehungen/min) zentrifugiert wird) und auf 10 ml Suspensionen von E.coli B/r in KPM-Puffer bei einem A595 von 15 in 250 ml-Kolben verdünnt.

4. Die Selektion erfolgt unter Verwendung von G-418 in einer Konzentration von 40 - 50 ug/ml. Die Kultur wird in der log-Phase (10 bis 5 χ 10 Amöben/ml) durch Verdünnen in KPM-Puffer mit G-418 (40 μg/ml) und E.coli B/r (A595 = 15) gehalten. Das Amöbenwachsturn wird durch direkte Bestimmung der Zellenzahl mit einem Hämazytometer überwacht.

Die während der gesamten Prozedur mit E.coli B/r gefütterten Kontrollzellen werden mit dem Wirkstoff behandelt und sterben nach 1- oder 2-tägigem Wachstum (wie sich aus einem Absinken der Zellenzahl in diesen

5 Kulturen unschwer erkennen läßt).

5. Bestimmung des Transformationsgrades: Die Fraktion der behandelten Zellen, die transformiert wurde, wird bestimmt. Die transformierten Zellen werden serienweise in eine Reihe von 10 ml-Kulturen von G-418 (40 μg/ml) und E.coli B/r (A595 = 15) enthaltendem KPM verdünnt. Die Kulturen werden, wie geschildert, bei 22⁰C mit 250 Umdrehungen/min geschüttelt und auf ihr Wachstum hin während der folgenden 7-15 Tage über- ° wacht. Die geringste Anzahl von Zellen, welche eine transformierte Kultur lieferten, wird notiert. Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tabelle. Es werden identische Kontrollversuche unter Fütterung

mit E.coli B/r durchgeführt. 20

TABELLE

	Tag 1	Wirkungsgradbestimmung durch Futtertransformation	Tag 3	Tag 4	Tag 5	Tag 6	Tag 7
O		Tag 2	Anzahl der	Zellen
	5xlO⁶		1,2x108	3,9xlO⁹	1,6XlO¹¹	5XlO¹²	l,5xlO¹⁴
lxlO⁷	l,5xlO⁶	2,5xlO⁷	6xlO⁸	l,5xlO¹⁰	4,5XlO¹¹	1»5xlO¹³	3xlO¹⁴
lxlO⁶	IxIO⁴	5,6xlO⁷	4xlO⁴	9xlO⁵	5xlO⁷	2,5xlO⁹	5xlO¹⁰
IxIO⁵	<10⁴*	2xlO⁴	2xlO⁴	5xlO⁴	2,5x106	5xlO⁷	IxIO⁹
IxIO⁴	<10⁴	IxIO⁴	2xlO⁵	2,5xlO⁶	7,5xlO⁶	2xlO⁸	4xlO⁹
IxIO³	<10⁴	IxIO⁴	<10⁴	IxIO⁴	3xlO⁴	1x106	2xlO⁷
IxIO²	<10⁴	<10⁴	<10⁴	<10⁴	<10⁴	2xlO⁴	6x105 ^.
IxIO	<10⁴	<10⁴	<10⁴	<10⁴	<10⁴	<10⁴	<10⁴
1	) 2xlO⁶	<10⁴	2xlO⁴	<10⁴	<10⁴	<10⁴	<10⁴
lxlO⁷(WT	7xlO⁵

Am Ende der 6-tägigen Fütterung mit chloramphenicol-amplifiziertem pBM 7.6 in LA1O2 E.coli werden die Dictyostelium-Zellen serienweise in 10 ml-Kulturen von 0-4^18 (40 μg/ml) enthaltendem KPM verdünnt. Die Lebensfähigkeit der Kulturen wird während der folgenden 7 Tage überwacht. Die geringste Anzahl von Anfangszellen, die eine G-418-resistente Kultur lieferten, wird notiert. In identischer Weise werden wilde Kontrollkulturen (WT) mit plasmidfreiern E.coli gefüttert.

*<1O bedeutet, daß in dem Hämozytometer bei 0,100 mm keine Zellen gesichtet werden.

cn cn cn

-Jf-

Der Einfluß von G-418 auf das Wachstum während des 6-tägigen Fütterungsversuchs mit chloramphenicolamplifiziertem pBM 7.6 ergibt sich aus Fig. 3. Zur Gewinnung der Ergebnisse von Fig. 3 wurden 6 Tage lang mit chloramphenicol-amplifiziertes pBM 7.6 enthaltendem LA102 gefütterte Dictyostelium-Amöben in zwei aliquote Teile geteilt. Ein Teil (nicht-transformiert) wurde in Suspensionskulturen mit E.coli b/r bei A595 =15 verdünnt. Der andere aliquote Teil wird in 40 μg/ml G-418 enthaltendem E.coli B/r (A595 = 15) verdünnt. Die Zellenzahl wurde während des folgenden Wachstums bei 22⁰C unter Schütteln mit 250 Umdrehungen/ min mittels eines Hämazytometers überwacht. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 graphisch dargestellt.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Plasmidamplifikation in üblicher bekannter Weise. Die Chloramphenicol-Amplifikation von Plasmiden ist beispielsweise von D.B. Clewell in "Nature of E.coli Plasmid Replication in the Presence of Chloramphenicol" in "J. Bacteriol.", 110, 667-676 (1972), beschrieben.

Die Art des im Rahmen des beschriebenen Verfahrens verwendeten Plasmids ist nicht kritisch. Es können die in Fig. 1 und 2 dargestellten Plasmide eingesetzt werden. Vorzugsweise sollte jedoch das Plasmid die eukaryotische Zeil-DNA, z.B. Dictyostelium-DNA (vgl. Fig. 1) tragen. Hierdurch läßt sich der Transformationsgrad steigern und ein stabileres System gewährleisten.

In dem vorliegenden System können als Träger des Plasmids zur Fütterung sämtliche Bakterien, die eukaryotische Zellen, z.B. Dictyostelium, fressen, verwendet werden. Für die Bakterien gibt es lediglich zwei Erfordernisse:

(a) Daß das Bakterium mit dem gewünschten Plasmid transformiert wird und

(b) daß das Bakterium genotypisch ein Minus-Rekombinant sein wird. Auf diese Weise kommt es zu keiner Wechselwirkung der Bakterien DNA mit dem Plasmid-DNA und zu keiner Änderung letzterer. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein vorher mit dem Plasmid pBM 7.6 transformierter E.coli-Stamm LA1O2 verwendet. Bei diesem Stamm handelt es sich um den bevorzugten Stamm.

Bei der bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bedient man sich der G-418-Resistenz als Marker. Bezüglich des Markers gibt es keine besonderen Beschränkungen (entweder selektierbar oder nicht-selektierbar), sofern der Marker an einen funktioneilen eukaryotisehen Promotor "angehängt" werden kann. Das Plasmid kann eine Reihe von an den Promotor "angehängten" Genen aufweisen, wobei eine Expression sämtlicher (dieser Gene) stattfindet. Die Grenze liegt in der Festigkeit des Promotors.

Wie sich aus den Ausführungen zu der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ergibt, erreicht man eine hohe Transformationsfrequenz durch bloße Zugabe von mit Plasmiden beladenen intakten Bakterien zu Dictyostelium-Amöben. Die Transformation ist wirksam und reproduzierbar. Die erhaltenen Transformanten sind stabil. Offensichtlich besteht ein Grund für die Einfachheit und Wirksamkeit des Verfahrens darin, daß die Dictyostelium-Amöben, bei denen es sich um niedrige Eukaryoten handelt, unter für Bakterien und Hefe seit langem festgelegten Fermentationsbedingun-

25 30

gen wachsen können. Anders als Bakterien und Hefe besitzt jedoch Dictyostelium keine Zellwände. So gestaltet sich die Gewinnung der durch Dictyostelium synthetisierten Genprodukte im Vergleich zu der zur Lyse von Bakterien und Hefe erforderlichen, schwierig durchzuführenden Verfahren sehr einfach (beispielsweise durch Netzmittellyse). Folglich ist es möglich/ in Dictyostelium zahlreiche Säugetiergene zur Herstellung von Säugetiergenprodukten zu züchten. Man erreicht hierbei einen hohen Produktionsgrad an menschlichen und tierischen Zellproteinen zur Verwendung in der Medizin und als Human- und Tiernahrung.

35

' fr'.

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Claims

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von Makromolekülen durch DNA-Transformation, dadurch gekennzeichnet, daß man einer einfachen eukaryotischen Zelle ein chloramphenicol-induziertes Plasmid in einem Bakteriumträger zuführt, wobei das Bakterium durch das Plasmid transformiert wurde und genotypisch aus einem Minus-Rekombinanten besteht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eukaryotische Zelle Dictyostelium discoideum

ist. ,»

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid Dictyostelium-DNA trägt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Bakterienträger E. coli ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem E. coli um einen mit dem Plasmid pBM 7.6 transformierten E. coli-Stamm LA102 handelt.

6. Verfahren zur Herstellung von Makromolekülen durch DNA-Transformation, dadurch gekennzeichnet, daß man Dictyostelium-DNA ein Plasmid in einem Bakterienträger zuführt, wobei das Bakterium durch das Plasmid transformiert wurde und genotypisch aus einem Minus-Rekombinanten besteht und wobei das in dem der

Dictyostelium-DNA zugeführten Bakterienträger vorhandene Plasmid eine zu der DNA eines Rezipientenorganismus homologe DNA enthält.

7. Makromolekül, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 6.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakterium E.coli ist.

9. Makromolekül, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1.

10. Makromolekül, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 8.