DE3517656A1 - Verfahren zur herstellung von makromolekuelen durch dna-transformation - Google Patents
Verfahren zur herstellung von makromolekuelen durch dna-transformationInfo
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Dr. pnil G Herkei
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Verfahren zur Herstellung von Makromolekülen durch DNA-Transformation
Verfahren zur Herstellung von Makro molekülen durch DNA-Transformation
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Makromolekülen auf gentechnologischem Wege, insbesondere
die Verwendung von Dictyostelium oder sonstiger niedriger eukaryotischer Zellen als Vehikel für die
Herstellung von Fremdmakromolekülen im Rahmen gentechnologischer Methoden.
Erfindungsgemäß wird dem Fachmann ein Verfahren zur Herstellung von Makromolekülen, d.h. Proteinen, auf
gentechnologischem Wege an die Hand gegeben. Das Verfahren gestattet eine DNA-Transformation einer ein-
25 fachen eukaryotischen Zelle, insbesondere von
Dictyostelium, durch "Füttern" von Amöben mit chloramphenicol-induziertem
Plasmid in einem Bakteriumträger, z.B. E.coli. Das Plasmid transformiert den niedrigen Eukaryoten, z.B. Dictyostelium, mit hoher
Frequenz und integriert sich in das Kerngenom. Das beschriebene Verfahren ist wirksam und einfach durchzuführen
.
Erfindungsgemäß können Dictyostelium und andere niedrige eukaryotische Zellen als wirksamer Träger für die Her-
Stellung von Fremdmakromolekülen, d.h. Proteinen (auf gentechnologischem
Wege) eingesetzt werden. Theoretisch läßt sich mit Hilfe des erfindungsgemäß eingesetzten
"Zufuhrsystems" bzw. "Futtersystems" jeder Organismus,
der Bakterien "fressen" kann, transformieren. Folglich stellt das "Nährsystem" für bakterienfressende Zellen
eine wesentliche Vereinfachung für die Transformation dieser Organismusart dar. Der Organismus wird durch
sein natürliches "Futtersystem" unter natürlichen Bedingungen transformiert, wobei keine neuen Parameter
eingeführt werden müssen. Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Plasmid-DNA dauernd geschützt,
da sie sich entweder im Inneren des Bakteriums oder im Inneren der Rezipientenzelle befindet. Aus diesem Grunde
stellt die Zeit keinen kritischen Parameter dar, d.h. die Organismen können mit plasmidhaltigen Bakterien
über eine Reihe von Tagen hinweg gefüttert werden (bei anderen Transformationssystemen befindet sich die DNA
des Plasmids mit dem Organismus bei 40C etwa 1 h lang
in Kontakt), wodurch sich die Anzahl der Kopien der eingeführten Plasmid-DNA stark erhöhen läßt. Dies ist vermutlich
einer der Gründe für die erhöhte Transformationsausbeute.
Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß ein Promotor, der
in Säugetierzellen, jedoch nicht in Hefezellen, funktioniert (vgl. G.B.Kiss, R.E.Pearlman, K.V.Cornish,
J.D.Friesen und V.L.Chan, in "J.Bacteriol.", 149, Seiten 542-547 (1982)), auch in niedrigen eukaryotisehen
Zellen, wie Dictyostelium, funktioniert. Dieses Merkmal plus andere Eigenschaften von Dictyostelium
Amöben und anderen niedrigen eukaryotischen Zellen ermöglicht eine zumindest vergleichbare und sogar bessere
großtechnische in vitro-Produktion von menschlichen und sonstigen eukaryotischen Genprodukten
durch DNA-Rekombinationsmethoden als bei Verwendung von Hefe.
Erfindungsgemäß wurde ferner noch gefunden, daß im Falle,
daß das in dem Bakteriumfutter enthaltene Plasmid eine zur DNA des Rezipientenorganismus homologe DNA enthält,
infolge Integration der Plasmid-DNA in die Rezipientengenom-DNA
eine noch stabilere und wirksamere Transformation erfolgt.
Dictyostelium oder sonstige niedrige eukaryotische Zellen stellen folglich eine wichtige Alternative zu
prokaryotischen Systemen zur Behandlung und Herstellung von Makromolekülen eukaryotischen Ursprungs durch
gentechnologische Verfahren dar. Diese Systeme vermeiden die bei prokaryotischen Systemen infolge fehlender
Zusammenfügung von RNA und posttranskriptioneller Modifikationen des gebildeten Proteins (d.h. Glycosilierung,
Phosphorylierung u.dgl.) beobachteten Probleme.
Das System läßt sich zur Herstellung von Vakzinen, Hormonen, Interferon, regulatorischen Proteinen, Enzymen
u.dgl. heranziehen.
Die Erfindung wird im folgenden anhand der Zeichnungen näher erläutert. Im einzelnen zeigen:
Fig. 1 das Dictyostelium-DNA tragende Rekombinanten-Plasmid
pBM 7.6. Dieses Plasmid ist bei der Transformation von Dictyostelium höchst wirksam
und liefert nach dem Einbau in das Genom über
eine Homologenrekombination stabile Transformanten. Im Detail zeigt die Fig. 1 den Aufbau des
zur "Futtertransformation" von Dictyostelium discoideum verwendeten Plasmids pBM 7.6. Die
dicken Linien entsprechen Bereichen von pAG6O,
die zu pBR322 homolog sind. Die durch die
Pvu II-Stellen begrenzte gestrichelte Linie entspricht dem Bereich von pAG6O/ der den
Herpes Simplex Virus TK-Promotor und das bakterielle kan-Gen besitzt. Die schmale Linie
zwischen Hind III und Bam HI bezeichnet die Dictyostelium-DNA-Einfügung.
Fig. 2 den Säugetierzellentransformationsvektor
pSV^-neo, der keine Dictyostelium-Sequenzen
trägt. Dieses Plasmid transformiert (nur) mit geringerem Wirkungsgrad.
Fig. 3 eine graphische Darstellung des Einflusses von G-418 auf das Wachstum bei einem 6-tägigen
Fütterungsversuch mit mit Chloramphenicol amplifiziertem pBM 7.6. Im einzelnen zeigt die
Fig. 3 den Einfluß von G-418 auf das Wachstum von durch Fütterung transformierten Amöben.
Sechs Tage lang mit LA102-haltigem, mit chloramphenicol-amplifiziertem
pBM 7.6 gefütterte Amöben werden in zwei aliquote Teile geteilt. Ein Teil wird in Abwesenheit von G-418 (A),
der andere in Gegenwart von 40 μg G-418 pro ml
(B) wachsen gelassen. Zu Vergleichszwecken wer
den mit plasmidfreien Bakterien gefütterte wilde Zellen in entsprechender Weise (C) bzw.
(D) wachsen gelassen.
Ausführungsbeispiel einer Dictyostelium Discoideum-Transformation
A. Verwendete Substanzen:
1. E.coli B/r, bis zur Sättigung in NZY-Brühe, NZ-Brühe bzw. L-Brühe gewachsen.
NZY-Brühe: 10 g N-Z-Amin A (Sheffield Products, POB 398,
Memphis, TN 38101); 5 g NaCl; 2 g MgCl3-7H2O; 5 g Hefeextrakt
(Difco); mit Wasser aufgefüllt auf 1 Liter.
NZ-Brühe: Entspricht der NZY-Brühe ohne Hefeextrakt.
L-Brühe: 10 g Trypton (Difco), 5 g Hefeextrakt (Difco);
10 g NaCl; mit Wasser auf 1 Liter aufgefüllt.
2. Log-Phase-Amöben, gewachsen in einer Schüttelsuspension
mit E.coli B/r. Die verwendeten Stämme bestehen aus DdB, ein Subklon von Sussman aus Raper'schein NC-4,
und DdC, ein cycloheximid-resistentes Derivat von DdB von Sussman über Rieh Kessin.
25 3. KPM-Puffer: 2,25 g KH3PO4; 0,67 g K3HPO4;
0,50 g MgSO4-7H3O, mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt;
pH-Wert: 6,1.
4. G-418 (Gibco, 3175 Staley Road, Grand Island,
30
New York 14072); 449 μg G-418/mg Feststoff. Hierbei
handelt es sich um ein unreines Fermentationsprodukt, das weiter gereinigt werden kann. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel
wird es ohne weitere Reinigung eingesetzt. Im folgenden wird die Wirkstoffkonzentration
35
in ug/ml Feststoff anstatt in μg aktiver Wirkstoff an-
gegeben. Es werden Vorratslösungen von G-418 mit
10 mg/ml in Wasser oder KPM zubereitet und als 1 ml Aliquote in Glas- oder Kunststoffröhrchen bei -10°C
bis -20°C gelagert. Der Wirkstoff ist nach einigen Gefrier/Auftau-Zyklen inaktiviert. Ein aliquoter Teil
kann drei- oder viermal verwendet werden, bevor ein merklicher Aktivitätsverlust eintritt. Es empfiehlt
sich/ einen aliquoten Teil jeweils nur zweimal zu verwenden.
10
10
B. Präparation des Bakteriums:
Hierbei geht man wie folgt vor: 15
1. 50 ml L-Brühe in einem 250 ml-Kolben werden mit
einer einzigen Kolonie von E.coli B/r beimpft. Danach wird die Kultur über Nacht bei 370C unter
Schütteln bis zur Sättigung wachsen gelassen.
2. Jeder von fünf 3000 ml fassenden Fernbach-Kolben mit 1500 ml NZY-/ NZ- bzw. L-Brühe wird mit 5,0 ml
der gesättigten "Übernachtkultur" von E.coli B/r beimpft .
3. Wachstum bis zur Sättigung (oder etwa 14 h) bei 370C unter Rütteln mit 300 Umdrehungen/min. Danach
wird das Bakterium 24 h (bzw. über Nacht) bei 40C
absetzen gelassen. Nach dem Dekantieren der überstehenden Flüssigkeit wird das Bakterium durch Zentrifugieren
(10 K, 5 min) abgetrennt, worauf die erhaltenen Pellets vollständig in insgesamt 1500 ml KPM
(d.h. es werden 250 ml Puffer in jede der sechs Zentrifugenflaschen mit den Bakteriumpellets einge-
gosseri) resuspendiert werden. Nun wird erneut 5 min bei
10 K zentrifugiert. Nach vollständigem Dekantieren wird das Bakterium in KPM bis A595 = 60 resuspendiert.
Die Lagerung erfolgt bei 40C. Bei 40C bleiben die
Zellen mindestens 4 Wochen lang verwendbar. Es sei darauf hingewiesen, daß unzureichend (zur Entfernung
von Kulturmedium) gewaschene Zellen offensichtlich einen Metaboliten produzieren, der sich während der
Lagerung ansammelt und für Amöben toxisch ist.
C. Amplifikation des Plasmids pBM 7.6;
1. 5,0 ml der "Übernachtkultur" von pBM 7.6 oder den
gewünschten Vektor enthaltendem E.coli werden unter Penicillin (100 \ig/ml) -Selektion in L-Brühe wachsen
gelassen. Die "Übernachtkultur" wird in 1,5 1 steriler L-Brühe überführt und unter Selektion bis A595 von
0,25 - 0,30 (mid-log) wachsen gelassen. Wenn die Zellen mid-log erreicht haben, werden 375 mg Chloramphenicol
(250 μg/ml) zugesetzt und das Ganze dann über Nacht
bei 370C geschüttelt. Die Gewinnung des Bakteriums erfolgt durch Zentrifugieren (10 K, 5 min). Das hierbei
erhaltene Pellet wird vollständig in etwa 250 ml Puffer resuspendiert, worauf erneut bei 10 K 5 min
lang zentrifugiert wird. Nach vollständigem Dekantieren wird das Bakterium in KPM-Puffer bis zu einem
A595 von 10 resuspendiert. Diese amplifiziertes Plasmid enthaltenden Bakterien werden bei einem A595
von 10 zur Dictyostelium-Transformation verwendet.
-Al·
D. Transformation:
1. 20 ml KPM-Puffer mit E.coli B/r in einer A595-Kon
zentration von 10 werden mit Dictyostelium-Amöben beimpft .
2. Es werden 5 - 6 χ 10 Amöben/ml geerntet, 5mal
mit kaltem KPM-Puffer gewaschen und dabei jedesmal 5 min lang bei 1 K (Umdrehungen/min) zentrifugiert.
3. Das erhaltene Pellet wird in 2 ml KPM-Puffer resuspendiert.
Nach einer Zellenzählung werden die Zellen auf 5 χ 10 bis 1 χ 10 Amöben/ml in die
chloremphenicol-amplifiziertes Plasmid enthaltenden Bakterien verdünnt. Am nächsten Morgen werden die
Zellen gezählt. Wenn die Kultur 5 χ 10 Amöben/ml erreicht, wird sie unter Verwendung der das chloramphenicol-amplifizierte
Plasmid enthaltenden Bakterien
als Futterlieferant auf 1 χ 105 Amöben/ml rückverdünnt.
Diese Fütterung läßt sich einige Tage lang durchführen, wobei jeweils frische plasmidhaltige
Bakterien als Futter zugesetzt werden. Am Ende einer Transformation werden die Amöben 5mal mit kaltem KPM-Puffer
gewaschen (wobei jedesmal 15 min lang mit 1 K (Umdrehungen/min) zentrifugiert wird) und auf 10 ml
Suspensionen von E.coli B/r in KPM-Puffer bei einem A595 von 15 in 250 ml-Kolben verdünnt.
4. Die Selektion erfolgt unter Verwendung von G-418 in einer Konzentration von 40 - 50 ug/ml. Die Kultur
wird in der log-Phase (10 bis 5 χ 10 Amöben/ml) durch Verdünnen in KPM-Puffer mit G-418 (40 μg/ml)
und E.coli B/r (A595 = 15) gehalten. Das Amöbenwachsturn wird durch direkte Bestimmung der Zellenzahl mit
einem Hämazytometer überwacht.
Die während der gesamten Prozedur mit E.coli B/r gefütterten Kontrollzellen werden mit dem Wirkstoff
behandelt und sterben nach 1- oder 2-tägigem Wachstum (wie sich aus einem Absinken der Zellenzahl in diesen
5 Kulturen unschwer erkennen läßt).
5. Bestimmung des Transformationsgrades: Die Fraktion der behandelten Zellen, die transformiert wurde, wird
bestimmt. Die transformierten Zellen werden serienweise in eine Reihe von 10 ml-Kulturen von G-418 (40
μg/ml) und E.coli B/r (A595 = 15) enthaltendem KPM
verdünnt. Die Kulturen werden, wie geschildert, bei 220C mit 250 Umdrehungen/min geschüttelt und auf ihr
Wachstum hin während der folgenden 7-15 Tage über- ° wacht. Die geringste Anzahl von Zellen, welche eine
transformierte Kultur lieferten, wird notiert. Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tabelle. Es
werden identische Kontrollversuche unter Fütterung
mit E.coli B/r durchgeführt. 20
Tag 1 | Wirkungsgradbestimmung durch Futtertransformation | Tag 3 | Tag 4 | Tag 5 | Tag 6 | Tag 7 | |
O | Tag 2 | Anzahl der | Zellen | ||||
5xlO6 | 1,2x108 | 3,9xlO9 | 1,6XlO11 | 5XlO12 | l,5xlO14 | ||
lxlO7 | l,5xlO6 | 2,5xlO7 | 6xlO8 | l,5xlO10 | 4,5XlO11 | 1»5xlO13 | 3xlO14 |
lxlO6 | IxIO4 | 5,6xlO7 | 4xlO4 | 9xlO5 | 5xlO7 | 2,5xlO9 | 5xlO10 |
IxIO5 | <104* | 2xlO4 | 2xlO4 | 5xlO4 | 2,5x106 | 5xlO7 | IxIO9 |
IxIO4 | <104 | IxIO4 | 2xlO5 | 2,5xlO6 | 7,5xlO6 | 2xlO8 | 4xlO9 |
IxIO3 | <104 | IxIO4 | <104 | IxIO4 | 3xlO4 | 1x106 | 2xlO7 |
IxIO2 | <104 | <104 | <104 | <104 | <104 | 2xlO4 | 6x105 ^. |
IxIO | <104 | <104 | <104 | <104 | <104 | <104 | <104 |
1 | ) 2xlO6 | <104 | 2xlO4 | <104 | <104 | <104 | <104 |
lxlO7(WT | 7xlO5 | ||||||
Am Ende der 6-tägigen Fütterung mit chloramphenicol-amplifiziertem pBM 7.6 in LA1O2 E.coli
werden die Dictyostelium-Zellen serienweise in 10 ml-Kulturen von 0-4^18 (40 μg/ml) enthaltendem
KPM verdünnt. Die Lebensfähigkeit der Kulturen wird während der folgenden 7 Tage überwacht.
Die geringste Anzahl von Anfangszellen, die eine G-418-resistente Kultur lieferten,
wird notiert. In identischer Weise werden wilde Kontrollkulturen (WT) mit plasmidfreiern
E.coli gefüttert.
*<1O bedeutet, daß in dem Hämozytometer bei 0,100 mm keine Zellen gesichtet werden.
cn cn cn
-Jf-
Der Einfluß von G-418 auf das Wachstum während des 6-tägigen Fütterungsversuchs mit chloramphenicolamplifiziertem
pBM 7.6 ergibt sich aus Fig. 3. Zur Gewinnung der Ergebnisse von Fig. 3 wurden 6 Tage
lang mit chloramphenicol-amplifiziertes pBM 7.6 enthaltendem LA102 gefütterte Dictyostelium-Amöben in
zwei aliquote Teile geteilt. Ein Teil (nicht-transformiert) wurde in Suspensionskulturen mit E.coli b/r
bei A595 =15 verdünnt. Der andere aliquote Teil wird in 40 μg/ml G-418 enthaltendem E.coli B/r (A595 = 15)
verdünnt. Die Zellenzahl wurde während des folgenden Wachstums bei 220C unter Schütteln mit 250 Umdrehungen/
min mittels eines Hämazytometers überwacht. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 graphisch dargestellt.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Plasmidamplifikation in üblicher bekannter Weise. Die
Chloramphenicol-Amplifikation von Plasmiden ist beispielsweise von D.B. Clewell in "Nature of E.coli
Plasmid Replication in the Presence of Chloramphenicol" in "J. Bacteriol.", 110, 667-676 (1972), beschrieben.
Die Art des im Rahmen des beschriebenen Verfahrens verwendeten Plasmids ist nicht kritisch. Es können
die in Fig. 1 und 2 dargestellten Plasmide eingesetzt werden. Vorzugsweise sollte jedoch das Plasmid die
eukaryotische Zeil-DNA, z.B. Dictyostelium-DNA (vgl. Fig. 1) tragen. Hierdurch läßt sich der Transformationsgrad steigern und ein stabileres System gewährleisten.
In dem vorliegenden System können als Träger des Plasmids zur Fütterung sämtliche Bakterien, die eukaryotische
Zellen, z.B. Dictyostelium, fressen, verwendet werden. Für die Bakterien gibt es lediglich zwei Erfordernisse:
(a) Daß das Bakterium mit dem gewünschten Plasmid transformiert wird und
(b) daß das Bakterium genotypisch ein Minus-Rekombinant
sein wird. Auf diese Weise kommt es zu keiner Wechselwirkung der Bakterien DNA mit dem Plasmid-DNA
und zu keiner Änderung letzterer. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird ein vorher mit dem Plasmid pBM 7.6 transformierter E.coli-Stamm LA1O2 verwendet. Bei
diesem Stamm handelt es sich um den bevorzugten Stamm.
Bei der bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens bedient man sich der G-418-Resistenz
als Marker. Bezüglich des Markers gibt es keine besonderen Beschränkungen (entweder selektierbar oder
nicht-selektierbar), sofern der Marker an einen funktioneilen eukaryotisehen Promotor "angehängt"
werden kann. Das Plasmid kann eine Reihe von an den Promotor "angehängten" Genen aufweisen, wobei eine
Expression sämtlicher (dieser Gene) stattfindet. Die Grenze liegt in der Festigkeit des Promotors.
Wie sich aus den Ausführungen zu der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ergibt,
erreicht man eine hohe Transformationsfrequenz durch bloße Zugabe von mit Plasmiden beladenen intakten
Bakterien zu Dictyostelium-Amöben. Die Transformation ist wirksam und reproduzierbar. Die erhaltenen Transformanten
sind stabil. Offensichtlich besteht ein Grund für die Einfachheit und Wirksamkeit des Verfahrens
darin, daß die Dictyostelium-Amöben, bei denen es sich um niedrige Eukaryoten handelt, unter für Bakterien
und Hefe seit langem festgelegten Fermentationsbedingun-
25
30
gen wachsen können. Anders als Bakterien und Hefe besitzt jedoch Dictyostelium keine Zellwände. So gestaltet
sich die Gewinnung der durch Dictyostelium synthetisierten Genprodukte im Vergleich zu der zur
Lyse von Bakterien und Hefe erforderlichen, schwierig durchzuführenden Verfahren sehr einfach (beispielsweise
durch Netzmittellyse). Folglich ist es möglich/ in Dictyostelium zahlreiche Säugetiergene zur Herstellung
von Säugetiergenprodukten zu züchten. Man erreicht hierbei einen hohen Produktionsgrad an
menschlichen und tierischen Zellproteinen zur Verwendung in der Medizin und als Human- und Tiernahrung.
35
' fr'.
Leerseite -
Claims (10)
1. Verfahren zur Herstellung von Makromolekülen durch
DNA-Transformation, dadurch gekennzeichnet, daß man einer einfachen eukaryotischen Zelle ein chloramphenicol-induziertes
Plasmid in einem Bakteriumträger zuführt, wobei das Bakterium durch das
Plasmid transformiert wurde und genotypisch aus einem Minus-Rekombinanten besteht.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eukaryotische Zelle Dictyostelium discoideum
ist. ,»
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid Dictyostelium-DNA trägt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Bakterienträger E. coli ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem E. coli um einen mit dem Plasmid
pBM 7.6 transformierten E. coli-Stamm LA102 handelt.
6. Verfahren zur Herstellung von Makromolekülen durch DNA-Transformation, dadurch gekennzeichnet, daß man
Dictyostelium-DNA ein Plasmid in einem Bakterienträger zuführt, wobei das Bakterium durch das Plasmid
transformiert wurde und genotypisch aus einem Minus-Rekombinanten besteht und wobei das in dem der
Dictyostelium-DNA zugeführten Bakterienträger vorhandene
Plasmid eine zu der DNA eines Rezipientenorganismus homologe DNA enthält.
7. Makromolekül, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 6.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakterium E.coli ist.
9. Makromolekül, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1.
10. Makromolekül, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 8.
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