FR2564482A1 - Transformation de cellules eucaryotes inferieures par alimentation naturelle au moyen de bacteries contenant des plasmides induits par le chloramphenicol - Google Patents
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Abstract
L'INVENTION SE RAPPORTE AU GENIE GENETIQUE. ELLE CONCERNE UN PROCEDE DE PRODUCTION DE MACROMOLECULES PAR TRANSFORMATION D'ADN, CARACTERISE EN CE QUE L'ON ALIMENTE UNE CELLULE EUCARYOTE SIMPLE PAR DU PLASMIDE INDUIT PAR LE CHLORAMPHENICOL DANS UN VEHICULE BACTERIEN, LES BACTERIES AYANT ETE TRANSFORMEES PAR LE PLASMIDE ET ETANT DES MINUS RECOMBINANT GENOTYPIQUEMENT. UTILISATION POUR LA PRODUCTION DE SUBSTANCES DIVERSES TELLES QUE VACCINS, HORMONES, INTERFERON, PROTEINES REGULATRICES, ENZYMES, ETC.
Description
L'invention concerne un procédé pour la fabri-
cation de macromolécules par génie génétique. Plus parti-
culièrement, l'invention concerne l'utilisation de Dictyostelium, ou autre cellule eucaryote inférieure, comme véhicule pour la fabrication de macromolécules
étrangères par des procédés de génie génétique.
Selon l'invention, on propose un procédé pour la fabrication de macromolécules (protéines) par génie génétique. Le procédé permet de transformer l'ADN d'une cellule eucaryote simple, particulièrement de Dictyostelium, en alimentant des amibes au moyen de plasmide induit par le chloramphénicol dans un porteur bactérien tel qu'E. coli. Le plasmide transforme l'eucaryote inférieur, tel que Dictyostelium, à une haute fréquence et s'intègre au génome nucléaire. Le procédé décrit est efficace et
simple à mettre en oeuvre.
L'invention établit donc que Dictyostelium et d'autres cellules eucaryotes inférieures peuvent être utilisés comme véhicule efficace pour la fabrication de macromolécules étrangères (protéines) par des procédés de génie génétique. On suppose qu'en utilisant le système d'alimentation que l'on va décrire, on peut transformer
tout organisme qui est capable de "manger" des bactéries.
Ainsi, le système d'alimentation pour cellules capables de manger des bactéries représente une simplification
notable pour la transformation de ce type d'organisme.
L'organisme est transformé par son système naturel d'alimentation dans des conditions naturelles. On n'a pas besoin d'introduire de nouveaux paramètres. D'autre
part, par le procédé que l'on va décrire, l'ADN du plas-
mide est protégé à tous moments puisqu'il se trouve soit à l'intérieur des bactéries soit à l'intérieur de la cellule réceptrice. Pour cette raison, le temps n'est pas un paramètre critique et on peut alimenter les organismes avec des bactéries contenant du plasmide pendant un
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certain nombre de jours (dans d'autres systèmes de trans-
formation, l'ADN du plasmide est en contact avec l'orga-
nisme pendant environ 1 heure à 4 C), ce qui augmente
fortement le nombre de copies de l'ADN de plasmide intro-
duit. On croit que c'est l'une des raisons du rendement
accru de transformation.
Selon l'invention, on a aussi découvert qu'un activeur qui fonctionne dans des cellules de mammifères
mais non dans des cellules de levures (Kiss, G.B., R.E.
Pearlman, K.V. Cornish, J.D. Friesen et V.L. Chan, 1982, J. Bacteriol., 149:542-547) fonctionne dans les cellules eucaryotes inférieures telles que Dictyostelium. Cette particularité, plus d'autres propriétés des amibes du genre Dictyostelium et d'autres cellules eucaryotes inférieures, les rend comparables ou même supérieures à la levure pour la fabrication industrielle in vitro de produits de gènes eucaryotiques humains et autres
par des procédés à ADN recombinant.
Une autre découverte importante de l'invention
est que si le plasmide présent dans les bactéries admi-
nistrées contient un ADN homologue de l'ADN de l'organisme receveur, il se produira une transformation plus stable et plus efficace par suite de l'intégration de l'ADN
du plasmide à l'ADN génomique receveur.
Dictyostelium ou d'autres cellules euracyotes
inférieures sont, par conséquent, une alternative impor-
tante aux systèmes procaryotes pour le traitement et la fabrication de macromolécules d'origine eucaryote par des procédés de génie génétique. Ces systèmes éviteront les inconvénients observés dans les systèmes procaryotes par suite de leur absence de raccordement d'ARN et de modifications post-transcriptionnelles de la protéine
produite (c'est-à-dire glycosilation, phosphorylation, etc.).
Le système peut être utilisé pour la fabrication de vaccins,
d'hormones, d'interféron, de protéines régulatrices, d'en-
zymes, etc. La figure 1 illustre le plasmide recombinant
pBM 7,6, qui porte de l'ADN de Dictyostelium. Ce plas-
mide est très efficace dans la transformation de Dictyostelium et fournit des transformantes stables après insertion dans le génome par recombinaison d'homo- logues. En détail, la figure 1 montre la structure du
plasmide pBM 7,6 utilisé pour la transformation par ali-
mentation de Dictyostelium discoideum. Les traits épais représentent des régions de pAG60 qui sont homologues de pBR322. Le trait tireté terminé par des sites Pvu II correspond à la région de pAG60 qui a l'activeurTK de virus d'herpes simplex et le gène bactérien kan. Le trait
mince délimité par Hind III et Bam HI indique l'inser-
tion d'ADN de Dictyostelium.
La figure 2 illustre le vecteur de transfor-
mation de cellules de mammifères, pSV2-neo, qui ne porte pas de séquences de Dictyostelium. Ce plasmide transforme
avec un rendement inférieur.
La figure 3 est un graphique qui illustre l'effet de G-418 sur la croissance, dans une expérience d'alimentation de 6 jours, avec pBM 7,6 amplifié par le chloramphénicol. En détail, la figure 3 montre les effets de G-418 sur la croissance d'amibes transformées par alimentation. Des amibes que l'on a alimentées pendant 6 jours avec pBM 7,6 amplifié par le chloramphénicol et contenu dans du LA102 ont été divisées en deux portions, on a cultivé une portion en l'absence de G-418, (A), et l'autre en présence de 40 gg de G-418 par millilitre, (B). Comme témoin, on a traité de la même façon des cellules de type sauvage alimentées avec des bactéries
exemptes de plasmide, (C) et (D).
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Exemple pratique d'un mode opératoire pour la transformation de Dictyostelium Discoideum A. Matériaux utilisés dans le mode opératoire: (1) E.coli B/r cultivé jusqu'à saturation dans du bouillon NZY, du bouillon NZ, ou du bouillon L. Bouillon NZY: 10 g de N-Z-amine A (Sheffield Products, POB 398, Memphis, TN 38101); 5 g de NaCl; 2 g de MgCl2.7H2O; 5 g d'extrait de levure (Difco); et
H20 pour faire 1 litre.
Bouillon NZ: comme ci-dessus, sans extrait de levure.
Bouillon L: 10 g de tryptone (Difco); 5 g d'extrait
de-levure (Difco); 10 g de NaCl et H20 pour faire 1 litre.
(2) Amibes de phase logarit.mique cultivées dans une suspension secouée avec E.coli B/r. Les souches utilisées sont D.dB, un sous-clone obtenu par Sussman en partant de
NC-4 de Raper, et DdC, un dérivé, résistant au cyclo-
heximide, de DdB, à partir de Sussman via Rich Kessin.
(3) Tampon KPM: 2,25 g de KH2PO4; 0,67 g de K2HPO4;
0,50 g de MgSO4.7H20; et H20 pour faire 1000 ml; pH 6,1.
(4) G-418 (Gibco, 3175 Staley Road, Grand Island, New York 14072); 449 gg de G-418/mng de solide. C'est un
produit de fermentation impur que l'on peut encore puri-
fier. On l'utilise dans le présent mode opératoire sans
autre purification. Dans toute la présente description,
la concentration de médicaments est indiquée en gg/ml de solide, plutôt qu'en gG de médicament actif. On a préparé des réserves de G-418 à 10 mg/ml dans de l'eau ou du KPM et on les a conservées sous forme de portions de 1 ml, entre -10 et -20 C, dans des tubes en verre ou en matière plastique. Le médicament est inactivé après plusieurs cycles de gel-dégel. On peut utiliser une portion 3 ou 4 fois avant qu'une perte d'activité ne puisse être observée. Il est recommandé d'utiliser
seulement deux fois une portion.
B. Préparation des bactéries: Le mode opératoire utilisé est le suivant: (1) Inoculer 50 ml de bouillon L, dans un ballon de 250 ml, avec une seule colonie d'E.coli B/r. Cultiver jusqu'à saturation pendant une nuit à 37 C avec secouage. (2) Inoculer chacun de cinq ballons Fernbach de 3000 ml, contenant 1500 ml de bouillon NZY, NZ ou L,
avec 5,0 ml de la culture saturée d'une nuit d'E.coli B/r.
(3) Cultiver jusqu'à saturation (soit environ 14 heures) à 37 C avec agitation (300 tours/mn). Laisser les bactéries se déposer pendant 24 heures (ou une nuit) à 4 C. Décanter ce qui surnage, récupérer les bactéries par centrifugation (10000 tours/mn, 5 mn), remettre complètement en suspension les boulettes de bactéries dans un total de 1500 ml de KPM, c'est-à-dire 250 ml de tampon dans chacun de 6 flacons de centrifugeuse contenant des boulettes de bactéries et centrifuger à nouveau à 10000 tours/mn pendant 5 mn. Décanter complètement et remettre les bactéries en suspension dans KPM jusqu'à
A595 = 60. Conserver à 4 C. Les cellules restent utili-
sables pendant au moins 4 semaines à 4 C. On note que des cellules qui ne sont pas suffisamment lavées pour éliminer le milieu de culture semblent produire un métabolite qui s'accumule pendant la conservation et est
toxique pour les amibes.
C. Amplification du plasmide - pBM 7,6: (1) Cultiver 5,0 ml de culture d'une nuit d'E.coli contenant du pBM 7,6 ou le vecteur désiré, avec sélection
par pénicilline (100 gg/ml) dans du bouillon L. Transfé-
rer la culture d'une nuit dans 1,5 litre de bouillon L stérile et cultiver avec sélection jusqu'à un A595 de 0,25 à 0,30 (log moyen). Quand les cellules ont atteint le log moyen, ajouter 375 mg de chloramphénicol (250 yg/ml). Secouer à 37 C pendant une nuit. Récupérer
les bactéries par centrifugation(0000 tours/mn, 5 mn).
Remettre complètement la boulette en suspension dans environ 250 ml de tampon et centrifuger à nouveau à 10000 tours/mn pendant 5 mn. Décanter complètement et remettre les bactéries en suspension dans du tampon KPM jusqu'à un A595 de 10. Ces bactéries contenant du plas- mide amplifié seront utilisées à un A595 de 10 pour la
transformation de Dictyostelium.
D. Transformation: (1) Inoculer 20 ml de tampon KPM contenant E. coli B/r à une concentration de A595 de 10 avec des
amibes Dictyostelium.
(2) Récolter à 5-6 x 106 amibes/ml, laver 5 fois avec du tampon KPM froid, centrifuger chaque fois à
1000 tours/mn pendant 5 minutes.
(3) Remettre la boulette en suspension dans 2 ml
de tampon KPM. Compter les cellules et les diluer jus-
qu'à 5 x 104 à 1 x 105 amibes/ml dans les bactéries
contenant du plasmide amplifié par le chloramphénicol.
Le lendemain matin, compter les cellules. Quand la
culture approche de 5 x 106 amibes/ml, la diluer à nou-
veau à 1 x 105 amibes/ml en utilisant, comme source d'aliment, les bactéries contenant le plasmide amplifié
par le chloramphénicol. On peut effectuer cette alimenta-
tion pendant plusieurs jours, en ajoutant chaque fois, comme source d'aliments, des bactéries fraîches contenant du plasmide. A l'achèvement de la transformation, on a lavé les amibes à 5 reprises avec du tampon KPM froid (en centrifugeant chaque fois à 1000 tours/mn pendant mn) et on a dilué dans des suspensions de 10 ml d'E. coli B/r dans du tampon KPM à un A595 de 15,
contenues dans des ballons de 250 ml.
(4) On a fait la sélection en utilisant G-418 à une concentration de 4050 gg/ml. On a maintenu la culture à la phase logarithmique (104 à 5 x 106 amibes/ml) par dilution dans du tampon KPM contenant du G-418 (40 gg/ml) et E. coli B/r (A595 = 15). On a contrôlé la croissance des amibes en mesurant directement le nombre
de cellules avec un hémacytomètre.
Les cellules témoins que l'on a alimentées par E. coli B/r pendant tout le processus ont été traitées par le médicament et sont mortes après 1 ou 2 jours de culture, comme on l'a vu par une diminution du nombre de
cellules dans ces cultures.
(5) Détermination de l'efficacité de transformation.
On a déterminé la fraction des cellules traitées qui s'étaient transformées. On a dilué en série des cellules transformées dans une série de cultures de 10 ml de KPM
contenant du G-418 (40 gg/ml) et E. coli B/r (A595 = 15).
On a agité les cultures (250 tours/mn) à 22 C comme ci-
dessus et on a contrôlé leur croissance pendant les 7 à 15 jours suivants. On a noté le plus petit nombre de cellules qui donnait une culture transformée. Les données sont indiquées au tableau I. On a traité des témoins identiquement si ce n'est qu'on leur a administré
E. coli B/r.
TABLEAU I
Détermination du rendement par transformation par l'alimentation 0 Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4 Jour 5 Jour 6 Jour 7 Nombre de cellules lx107 5xl06 2,5x107 1,2x108 3,9x109 1,6x1011 5x 1012 1,5x1014 1x106 1,5x106 5,6x107 6xlO8 1,5x1010 4,5x10l 1,5x1013 3x1014 46 6x084, 711 9,510' lx105 lx104 2x104 4x104 9x105 5x107 2,5x109 5x10l0 lx104 <104* lx104 2x104 5x104 2, 5x106 5x107 lx109
3 4 495
lx103O <10 lx104 2x105 2,5x106 7,5x106 2x108 4x109 00 lx102 <104<104 <104 lx104 3x104 1x106 2x107 lx1O <104 <104 <104 <104 <104 2x104 6x105
7 6 4 4 14 4 <44
1 <104 <104 <104 <104 <104 <104 <104
lx107(WT) 2x106 7x105 2x104 <104 <104 <104 <104 A l'achèvement de l'alimentation de 6 jours par pBM 7,6 amplifié par le chloramphénicol dans E.coli LA102, on a dilué en série les cellules de Dictyostelium dans des cultures de 10 ml de KPM contenant du G-418 (40 ug/ml). On a contrôlé la viabilité des cultures pendant les 7 jours suivants. On a noté le plus petit nombre de cellules initiales qui donnaient une culture résistant à G-418. On a traité identiquement des cultures témoins de type sauvage (WT) alimentées par n
E. coli exempt de plasmide.
* <104 signifie qu'on n'a pas observé de cellules dans un hémocytomètre de 0,100 mm.
L'effet de G-418 sur la croissance dans une expérience d'alimentation de 6 jours avec le pBM 7,6 amplifié par le chloramphénicol est illustré par la figure 3. Pour obtenir les données de la figure 3, on a divisé en deux portions des amibes Dictyostelium, alimen- tées pendant 6 jours par LA102 contenant du pBM 7,6 amplifié par le chloramphénicol. On a dilué une portion
(non transformée) dans des cultures en suspension conte-
nant E.coli B/r à A595 = 15. On a dilué l'autre portion dans E.coli B/r (A595 = 15) contenant 40 gg de G-418 par millilitre. On a contrôlé les nombres de cellules avec un hémacytomètre pendant la croissance suivante à 22 C (250 tours/mn). Les résultats sont représentés par la
figure 3.
Dans le procédé de l'invention, on effectue
l'amplification des plasmides en utilisant des techni-
ques antérieurement connues. Une référence décrivant l'amplification de plasmides par le chloramphénicol est Clewell, D.B., "Nature of E.coli Plasmid Replication In The Presence Of Chloramphenicol", J. Bacteriol., 110
(1972), 667-676.
Le type de plasmide utilisé selon le procédé
ici décrit n'est pas critique. On peut utiliser les plas-
mides représentés par les figures 1 et 2. Toutefois, il est très préférable que le plasmide porte l'ADN de cellule eucaryote, tel que l'ADN de Dictyostelium, comme
indiqué sur la figure 1. Cela assure un plus grand rende-
ment de transformation et un système plus stable.
Dans le présent système, on peut utiliser comme porteur du plasmide pour l'alimentation toute bactérie
que la cellule eucaryote, telle que Dictyostelium, mange.
Il n'y a que deux conditions quant aux bactéries:
(a) que les bactéries se "transforment" avec le plas-
mide désiré; et (b) que les bactéries soient des minus recombinants
génotypiquement. De cette manière, l'ADN bactérien n'en-
trera pas en interaction avec l'ADN de plasmide et ne modifiera pas l'ADN de plasmide. Dans le mode de mise en oeuvre préféré, on a utilisé la souche d'E. coli LA102 que l'on avait précédemment transformée par le plasmide
pBM 7,6. C'est la souche actuellement préférée.
Dans le mode de mise en oeuvre préféré ci-
dessus, le marqueur utilisé était la résistance à G-418.
Toutefois, il n'y a pas de restriction au type de mar-
queur utilisé, apte à la sélection ou non, à condition
que le marqueur puisse être fixé à n'importe quel acti-
veur eucaryote fonctionnel. Le plasmide peut avoir un certain nombre de gènes fixés à l'activeur, tous étant
exprimés. La limitation est dans la puissance de l'ac-
tiveur.
Comme on le verra par le mode de mise en oeuvre préféré ci-dessus, on réalise une haute fréquence de transformation en ajoutant simplement à des amibes du genre Dictyostelium des bactéries intactes chargées de
plasmides. La transformation est efficace et reproduc-
tible. Les transformantes sont stables. Il apparaît qu'une raison de la simplicité et de l'efficacité du procédé est que les amibes du genre Dictyostelium qui sont des eucaryotes inférieurs peuvent croître dans des conditions de fermentation établies depuis longtemps
pour les bactéries et la levure. Toutefois, à la diffé-
rence des bactéries et de la levure, Dictyostelium n'a pas de parois cellulaires. Ainsi, la récupération de produits de gènes synthétisés par Dictyostelium est très facile, par exemple par lyse au moyen de détergents, en comparaison des procédés difficiles nécessaires pour lyser les bactéries et la levure. Il est donc possible de faire croître de nombreux gènes de mammifères dans Dictyostelium pour fabriquer des produits de gènes de mammifères avec un taux élevé de production des protéines cellulaires humaines et animales, pour l'utilisation en
médecine et dans l'alimentation humaine et animale.
Ainsi qu'il sera évident pour l'homme de l'art, on peut apporter diverses modifications dans le cadre de
la description ci-dessus. De telles modifications,
rentrant dans les aptitudes de l'homme de l'art, font
partie de l'invention.
- 12
Claims (10)
1. Procédé de production de macromolécules par transformation d'ADN, caractérisé en ce que l'on alimente une cellule eucaryote simple par du plasmide induit par le chloramphénicol dans un véhicule bactérien, les bactéries ayant été transformées par le plasmide et
étant des minus recombinant génotypiquement.
2. Procédé selon la revendication 1, caracté-
risé par le fait que la cellule eucaryotique est
Dictyostelium discoideum.
3. Procédé selon la revendication 2,caracté-
risé par le fait que le plasmide porte de l'ADN de Dictyostelium.
4. Procédé selon la revendication 3, caracté-
risé par le fait que le véhicule bactérien est E.coli.
5. Procédé selon la revendication 4, caracté-
risé par le fait que le E.coli est la souche LA102
transformée par du plasmide pBM 7,6.
6. Procédé de production de macromolécules par transformation d'ADN, caractérisé en ce que l'on amène à de l'ADN de Dictyostelium un plasmide dans un véhicule bactérien les bactéries ayant été transformées
par le plasmide et étant des minus recombinants génoty-
piquement, le plasmide présent dans le véhicule bacté-
rien amené à l'ADN de Dictyostelium contenant un ADN
homologue de l'ADN d'un organisme receveur.
7. Macromolécule fabriquée par le procédé
selon la revendication 6.
8. Procédé selon la revendication 6, dans
lequel la bactérie est E.coli.
9. Macromolécule fabriquée par le procédé
selon la revendication 1.
10. Macromolécule fabriquée par le procédé
selon la revendication 8.
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FR2564482B1 FR2564482B1 (fr) | 1988-10-14 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB2159821B (en) | 1988-10-05 |
GB8512485D0 (en) | 1985-06-19 |
DE3517656A1 (de) | 1985-11-21 |
JPS60260599A (ja) | 1985-12-23 |
GB2159821A (en) | 1985-12-11 |
FR2564482B1 (fr) | 1988-10-14 |
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