ES2720659T3 - Composiciones terapéuticas y métodos para la administración dirigida, mediante minicélulas bacterianas, de moléculas bioactivas basadas en moléculas dirigidas que contienen Fc y anticuerpos - Google Patents

Abstract

Una minicelula bacteriana completamente intacta, que comprende: (i) una proteina de fusion de union a Fc mostrada en la superficie de la minicelula, en donde la proteina de fusion de union a Fc comprende (a) una senal de exportacion (secrecion) de membrana externa, (b) un dominio de anclaje de membrana externa y (c) una porcion de union a Fc de la proteina G o una porcion de union a Fc de la proteina A; (ii) una o mas moleculas bioactivas que comprenden acidos nucleicos, proteinas, farmacos de molecula pequena, radioisotopos, lipidos o cualquier combinacion de los mismos; y (iii) una o mas moleculas de direccionamiento que contienen Fc unidas a dicha porcion de union a Fc, en donde la molecula de direccionamiento que contiene Fc es una molecula que es capaz de unirse a una molecula de union a Fc y contiene un sitio de reconocimiento para una molecula diana, en donde dicha una o mas moleculas de direccionamiento que contienen Fc reconocen un antigeno o un receptor eucarioticos.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones terapéuticas y métodos para la administración dirigida, mediante minicélulas bacterianas, de moléculas bioactivas basadas en moléculas dirigidas que contienen Fc y anticuerpos

Campo de la invención

La presente solicitud se refiere a minicélulas bacterianas totalmente intactas como se define en las reivindicaciones adjuntas adecuadas como vehículos de administración dirigida para ácidos nucleicos in vivo e in vitro, proteínas, radionúclidos y la administración de fármacos de moléculas pequeñas para la inhibición o la prevención de enfermedades, así como una tecnología de diagnóstico e imagen dirigida in vivo.

Además, la presente invención se refiere a una composición que comprende dichas minicélulas y la provisión de dichas minicélulas o dicha composición para el tratamiento de una enfermedad o para la inmunización de un sujeto.

El alcance de la presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. La siguiente descripción está destinada a apoyar la comprensión, sin embargo, si alguna de las realizaciones descritas en el mismo no cae bajo la definición de las reivindicaciones, dicha realización debe considerarse como un ejemplo, no incluido en el ámbito de protección.

Descripción de la técnica relacionada

La siguiente descripción de los antecedentes de la invención se proporciona para ayudar a entender la invención, pero no se admite describir o constituir el estado de la técnica de la invención. El contenido de los artículos, patentes y solicitudes de patentes, y todos los demás documentos e información disponible electrónicamente mencionados o citados en la presente solicitud, por la presente se incorporan por referencia en su totalidad en la misma medida que si cada publicación individual fuera específica e individualmente indicada para su incorporación por referencia. Los solicitantes se reservan el derecho de incorporar físicamente en la presente solicitud todos los materiales e información de dichos artículos, patentes, solicitudes de patente u otros documentos.

La necesidad de un vehículo de administración robusto capaz de encapsular una amplia gama de especies de moléculas bioactivas que también sean capaces de dirigirse selectivamente a células específicas, tipos de órganos y tejidos es significativa. Muchas terapias moleculares se ven obstaculizadas por una o más limitaciones in vivo que incluyen (i) efectos secundarios tóxicos adversos debido a los efectos dentro del objetivo o fuera del objetivo en células sanas, órganos y tejidos, (ii) farmacocinética deficiente (PK) y (iii) mala captación en las células. La administración dirigida de fármacos citotóxicos, agentes de imagen, ácidos nucleicos terapéuticos y otras moléculas terapéuticas biológicamente activas directamente en el sitio o sitios y células que causan la enfermedad podrían aliviar muchas de estas deficiencias disminuyendo los efectos tóxicos dentro o fuera del objetivo ejercidos sobre el tejido no afectado por la enfermedad, mejorando la farmacocinética de los agentes terapéuticos que permiten una administración más eficaz y mejorando la captación en las células. Por consiguiente, es bien sabido que el desarrollo de terapias dirigidas a células específicas, los tipos de órganos y tejidos representan una nueva frontera importante para tecnologías terapéuticas, diagnósticas, teranósticas y de imagen clínicamente relevantes.

En el caso de agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, fármacos citotóxicos de molécula pequeña) y toxinas proteicas utilizadas en el tratamiento de la mayoría de los cánceres, la eficacia del agente quimioterapéutico o toxina proteica está significativamente limitada por la toxicidad para los tejidos normales. Además, los parámetros farmacocinéticos (PK) de los fármacos que contribuyen a los niveles de exposición sistémica con frecuencia no están ni pueden optimizarse por completo para maximizar simultáneamente la actividad antitumoral y minimizar los efectos secundarios, particularmente cuando las mismas dianas o mecanismos celulares son responsables de la actividad antitumoral y la toxicidad del tejido normal. Esto da lugar a un índice terapéutico muy estrecho, común para la mayoría de los quimioterapéuticos citotóxicos y toxinas proteicas.

Una forma de mejorar el índice terapéutico de los fármacos existentes es unir, conjugarlos, o empaquetarlos para que un mayor porcentaje de la dosis administrada termine cerca del tumor (orientación pasiva) y/o dentro de las células tumorales (orientación activa). Hasta la fecha, se han adoptado muchos enfoques diferentes para la administración dirigida, aunque hay pocos productos en el mercado. Los enfoques populares incluyen el uso de formulaciones liposómicas, formulaciones inmunoliposómicas, diversas nanotecnologías poliméricas, fusiones/conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC), fusiones/conjugados de anticuerpos o toxinas de proteínaligando y dendrímeros. Las formulaciones liposómicas, incluidos los enfoques “ocultos" son limitadas porque (i) solo funcionan mediante la orientación pasiva y (ii) son difíciles de fabricar a gran escala. Las formulaciones inmunoliposómicas superan las deficiencias de direccionamiento de las formulaciones liposómicas añadiendo un componente de direccionamiento (normalmente un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo). Sin embargo, las formulaciones inmunoliposómicas son aún más difíciles de fabricar que las formulaciones liposómicas, incluida la incorporación de tecnologías “stealth”. Las nanotecnologías poliméricas dirigidas están limitadas porque requieren un enlace covalente de la carga útil y el resto de orientación. Esto complica la fabricación, limita el tamaño y la variedad de la carga útil, y también expone la carga útil a la degradación durante la circulación en la sangre. Las fusiones/conjugados de fármaco-anticuerpo están limitadas principalmente por la capacidad de carga útil y el metabolismo de la carga útil. Los conjugados/fusiones de toxina proteica-ligando o anticuerpo también están limitados por la toxicidad fuera del objetivo y por su insuficiente eficacia, principalmente debido a la incapacidad de la carga útil de la toxina proteica para escapar del compartimento endosómico y alcanzar eficazmente su objetivo citosólico después de la internalización por parte de la célula diana. Los dendrímeros tienen una mayor capacidad de carga útil que los anticuerpos/conjugados de fusión del fármaco y también pueden unirse y mostrar restos dirigidos, que incluyen anticuerpos. Sin embargo, los dendrímeros también son extremadamente difíciles de fabricar debido a la compleja química y manipulación química involucrada en el proceso de construcción. Por tanto, existe la necesidad de un sistema de administración al cual cualquier anticuerpo (u otro resto de direccionamiento, como un ligando de receptor soluble como el VEGF-A) pueda unirse o acoplarse de una manera simple no covalente, que también puede encapsular cantidades significativas y combinaciones de cargas bioactivas, y es susceptible de fabricación a gran escala.

Sumario de la invención

La invención desvelada en el presente documento proporciona una minicélula bacteriana completamente intacta, en la que la minicélula comprende:

(i) una proteína de fusión de unión a Fc mostrada en la superficie de la minicélula, en la que la proteína de fusión de unión a Fc comprende (a) una señal de exportación (secreción) de membrana externa, (b) un dominio de anclaje de membrana externa y (c) una porción de unión a Fc de la proteína G o una porción de unión a Fc de la proteína A;

(ii) una o más moléculas bioactivas que comprenden ácidos nucleicos, proteínas, fármacos de molécula pequeña, radioisótopos, lípidos o cualquier combinación de los mismos; y

(iii) una o más moléculas de direccionamiento que contienen Fc unidas a dicha porción de unión a Fc,

en la que la molécula de direccionamiento que contiene Fc es una molécula que es capaz de unirse a una molécula de unión a Fc y contiene un sitio de reconocimiento para una molécula diana, en la que dicha una o más moléculas de direccionamiento que contienen Fc reconocen un antígeno o receptor eucariótico. Además, la invención se refiere a una composición que comprende dichas minicélulas y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En algunas realizaciones, la minicélula comprende una porción de unión a Fc de la proteína G. En algunas realizaciones, la minicélula comprende una porción de unión a Fc de la proteína A.

En algunas realizaciones, al menos una de las una o más moléculas bioactivas es una toxina proteica. En algunas realizaciones, la toxina proteica se selecciona del grupo que consiste en gelonina, fragmento A de la toxina diftérica, fragmento A/B de la toxina diftérica, toxina del tétanos, toxina termolábil de E. coli (LTI y/o LTII), la toxina del cólera, toxina iota de C. perfringes, exotoxina A de Pseudomonas, toxina shiga, toxina del ántrax, MTX (toxina mosquilicida de B. sphaericus), perfringolisina O, estreptolisina, toxina de la cebada, melitina, las toxinas LF y EF del ántrax, la toxina de la adenilato ciclasa, botulinolisina B, botulinolisina E3, botulinolisina C, toxina botulínica A, la toxina del cólera, toxinas A, B y alfa de Clostridium, ricina, la toxina A de shiga, la toxina A similar a shiga, la toxina A del cólera, la toxina S1 de pertussis, toxina termolábil (LT) de E. coli (LTB), variantes estables al pH de la listeriolisina O (independiente del pH; sustitución de aminoácidos L461T), variantes termoestables de listeriolisina O (sustituciones de aminoácidos E247M, D320K), variantes estables al pH y termoestables de la listeriolisina O (sustituciones de aminoácidos E247M, D320K y L461T), estreptolisina O, estreptolisina O c, estreptolisina O e, esfericolisina, antrolisina O, cereolisina, thuringiensilisina O, weihenstefanensilisina, alveolisina, brevilisina, butiriculisina, tetanolisina O, novilisina, lectinolisina, neumolisina, mitilisina, pseudoneumolisina, suilisina, intermedilisina, ivanolisina, seeligeriolisina O, vaginolisina, pirolisina, y cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, al menos una de las una o más moléculas bioactivas es un fármaco terapéutico de molécula pequeña. En algunas realizaciones, el fármaco terapéutico de molécula pequeña se selecciona del grupo que consiste en agentes que dañan el ADN, agentes que inhiben la síntesis de ADN, microtúbulos y agentes de unión a tubulina, antimetabolitos, inductores de daño oxidativo, antiangiogénicos, terapias endocrinas, antiestrógenos, inmunomoduladores, tales como los agonistas o antagonistas de los receptores de tipo Toll, inhibidores de la histona deacetilasa, inhibidores de la transducción de señales, tales como inhibidores de quinasas, inhibidores de las proteínas de choque térmico, retinoides, inhibidores de los receptores del factor de crecimiento, compuestos anti-mitóticos, antiinflamatorios, reguladores del ciclo celular, inhibidores del factor de transcripción e inductores de apoptosis y cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, al menos una de las una o más moléculas bioactivas es un ácido nucleico terapéutico. En algunas realizaciones, al menos una de las una o más moléculas bioactivas es un polipéptido terapéutico. En algunas realizaciones, al menos una de las una o más moléculas bioactivas es una combinación de un fármaco de molécula pequeña y un ácido nucleico terapéutico.

En algunas realizaciones, al menos una de las una o más moléculas de direccionamiento que contienen Fc es específica para una molécula de superficie celular tumoral. En algunas realizaciones, al menos una de las una o más moléculas de direccionamiento que contienen Fc es específica para una molécula de superficie de células endoteliales. En algunas realizaciones, al menos una de las una o más moléculas de direccionamiento que contienen Fc es específica para un objetivo común tanto para una célula tumoral como para una célula endotelial.

En algunas realizaciones, la minicélula comprende además un agente de escape endosómico.

Algunas realizaciones adjuntas en el presente documento proporcionan una composición que comprende cualquiera de las minicélulas desveladas en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En algunas realizaciones, al menos una de la una o más moléculas bioactivas es una proteína de un agente infeccioso.

En algunas realizaciones, al menos una de las una o más moléculas de direccionamiento que contienen Fc es específica para una célula presentadora de antígenos profesional. En algunas realizaciones, la célula presentadora de antígeno profesional es una célula dendrítica eucariota, eosinófilo, neutrófilo, basófilo, linfocito T, linfocito B, mastocito o macrófago.

En algunas realizaciones, al menos una de las una o más moléculas bioactivas es un antígeno proteico de un tumor. En algunas realizaciones, al menos una de las una o más moléculas de direccionamiento que contienen Fc es específica para una célula dendrítica eucariótica o macrófago.

En algunas realizaciones, dicha minicélula comprende además un agente de escape endosómico. En algunas realizaciones, dicha minicélula comprende además un adyuvante inmunomodulador.

Algunas realizaciones desveladas en el presente documento proporcionan la composición que comprende dichas minicélulas para inmunización, que comprende administrar cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento a un sujeto que lo necesite.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una presentación esquemática de una realización ilustrativa de un inmunoensayo de flujo lateral basado en minicélulas.

La Figura 2 es un gráfico que muestra el nivel de expresión de la superficie de las minicélulas y la visualización de la región de unión a Fc de la Proteína A o la Proteína G medida por ELISA.

La Figura 3 es una transferencia de tipo Western que muestra la unión y la presentación del anticuerpo VEGFR2 a la superficie de las minicélulas que expresan y muestran la porción de unión a Fc de la proteína A o la proteína G.

La Figura 4 es una transferencia de tipo Western que muestra la unión y la presentación del anticuerpo EGFR1 a la superficie de las minicélulas que expresan y muestran la porción de unión a Fc de la proteína A o la proteína G.

La figura 5 son imágenes que muestran minicélulas dirigidas a EGFR1 teñidas con fluorescencia se internalizan mediante células de NSCLC humano H460 que expresan EGFR1 de una manera dependiente de anticuerpos usando minicélulas de unión a Fc que expresan y muestran la proteína G.

La figura 6A-D son imágenes que muestran minicélulas dirigidas a EGFR1 teñidas con fluorescencia se internalizan mediante células de NSCLC humano H460 que expresan EGFR1 de una manera dependiente de anticuerpos usando minicélulas de unión a Fc que expresan y muestran la proteína A.

La Figura 7 es un histograma que muestra los niveles relativos de internalización de células tumorales de NSCLC humano H460 dirigidas a EGFR1 de minicélulas fluorescentes que expresan y muestran la Proteína A medida por análisis FACS de células digeridas con tripsiniza.

Descripción detallada

Definiciones

Como se usa en el presente documento, la expresión "minicélulas de unión a Fc" se refiere a una composición de minicélulas en la que las minicélulas y la cepa bacteriana productora de minicélulas a partir de las cuales se derivan las minicélulas se expresan y muestran en su superficie celular, una proteína de fusión que comprende (i) una señal de exportación (secreción) de membrana externa, (ii) un dominio de anclaje a la membrana externa o cualquiera de sus equivalentes funcionales, y (iii) uno o más de los dominios de unión a Fc de la Proteína A o la Proteína G en el que las minicélulas son capaces de unirse a anticuerpos exógenos, derivados de anticuerpos que contienen Fc o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc a través de la interacción con las regiones Fc de los anticuerpos y/o moléculas de fusión/conjugados. En algunas realizaciones, las minicélulas expresan y muestran una proteína de fusión de unión a Fc que comprende (i) una señal de exportación (secreción) a la membrana externa, (ii) un dominio de anclaje a la membrana externa o cualquiera de sus equivalentes funcionales, y (iii) el dominio de unión a Fc de un receptor de Fc de mamífero (y cualquiera de sus equivalentes funcionales) en el que las minicélulas son capaces de unirse a anticuerpos exógenos o moléculas de fusión/conjugados que contienen Fc a través de la interacción con las regiones Fc de los anticuerpos y/o moléculas de conjugación/fusión.

Como se usa en el presente documento, la expresión "minicélulas terapéuticas dirigidas" se refiere a las minicélulas bacterianas que encapsulan la o las moléculas bioactivas de elección, muestran anticuerpos de direccionamiento y/u otras moléculas de direccionamiento de fusión/conjugados que contienen Fc en la superficie externa de las minicélulas mediante la interacción con regiones de unión a Fc localizadas en la superficie expresadas de forma recombinante de manera que los anticuerpos y/o moléculas de direccionamiento de fusión/conjugados que contienen Fc se muestran de tal forma que pueden unirse específicamente a, están unidos por, o de alguna otra manera reconocen específicamente y, por lo tanto, administran, localizan o agregan en o dentro de una célula específica, órgano o tipo de tejido involucrado en la génesis, progresión, y/o mantenimiento de la enfermedad, para liberar los contenidos moleculares de dicha minicélula en la célula diana, tejido y tipo de órgano in vitro o in vivo. Esta orientación específica está destinada a utilizar minicélulas para liberar una carga útil terapéutica a la célula diana, órgano y tipo de tejido en los que es deseable un enfoque terapéutico para el tratamiento de un tipo de enfermedad enumerado en el presente documento. Las minicélulas terapéuticas diana también pueden contener un agente de alteración endosómico incluyendo, pero sin limitación, citolisinas bacterianas (tales como listeriolisina O (LLO) y perfingolisina O (PFO)) y cualquier variante funcional o equivalente de las mismas. Las fosfolipasas, tales como PC-PLC o PI-PLC, también se pueden utilizar como agentes de rotura endosómicos.

Como se usa en el presente documento, la expresión "minicélulas diagnósticas dianas" se refiere a minicélulas bacterianas que encapsulan una o más moléculas de imagen de elección, muestran anticuerpos dirigidos y/o moléculas de direccionamiento de fusión/conjugado que contienen Fc en la superficie externa de las minicélulas a través de la interacción con regiones de unión a Fc localizadas en la superficie expresadas de forma recombinante de la proteína G o proteína A, de manera que los anticuerpos se muestran de tal manera que son capaces de unirse específicamente, están unidos por, o de alguna otra manera reconocen específicamente y, por lo tanto, administran, localizan o agregan en o dentro de una célula específica, órgano o tipo de tejido involucrado en la génesis, progresión, y/o mantenimiento de la enfermedad, para liberar los contenidos de imagen molecular de la minicélula a la célula diana, tejido y tipo de órgano in vitro o in vivo. Este direccionamiento específico, en algunas realizaciones, está destinado a utilizar minicélulas para concentrar los agentes de imágenes moleculares en la célula diana, órgano y tipo de tejido en el que es deseable un enfoque diagnóstico en todo o en parte de un tipo de enfermedad.

Como se usa en el presente documento, la expresión "vacuna de minicélulas dirigida" se refiere a minicélulas bacterianas que encapsulan un antígeno proteico y/o una vacuna basada en ácido nucleico (por ejemplo, una vacuna basada en ADN o ARN) derivada de un agente de enfermedad infecciosa o de una célula tumoral de elección, en el que la minicélula muestra además anticuerpos dirigidos y/o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc específicas para las células presentadoras de antígenos del sistema inmunitario en la superficie externa de las minicélulas mediante la interacción con regiones de unión a Fc localizadas en la superficie expresadas de forma recombinante de la proteína G o proteína A, tal que los anticuerpos se muestren de tal manera que puedan unirse específicamente a, están unidos por, o de alguna otra manera reconocen específicamente y, por lo tanto, administran, localizar o añadir dentro de las células presentadoras de antígeno, órganos o tipos de tejidos implicados en la génesis, progresión y/o mantenimiento de la respuesta inmune del huésped receptor, para liberar los contenidos antigénicos de la minicélula a la célula diana presentadora de antígeno, tejido y tipo de órgano in vitro o in vivo. El direccionamiento específico a la célula presentadora de antígeno, en algunas realizaciones, está destinado a utilizar vacunas de minicélulas dirigidas contra minicélulas para concentrar antígeno o antígenos proteicos y/o vacunas de ADN y/o adyuvantes contra células presentadoras de antígeno, órganos y tipos de tejidos en los que se obtiene una respuesta inmune del huésped receptor protectora contra un tipo de enfermedad infecciosa o autóloga particular enumerada en el presente documento son deseables. La vacuna de minicélulas dirigida puede incluir un agente de alteración endosómica que incluye, pero sin limitación, citolisinas bacterianas (como LLO y PFO) y cualquier variante funcional o equivalentes de las mismas fosfolipasas, tales como PC-PLC o PI-PLC, también se pueden utilizar como agentes de rotura endosómicos.

Como se usa en el presente documento, el término "competente para el direccionamiento" se refiere a las minicélulas que expresan y muestran uno o más dominios de unión a Fc de la Proteína G o Proteína A y se unen además y muestran una molécula de interés dirigida de fusión/conjugado que contiene Fc y/o anticuerpo dirigido.

Como se usa en el presente documento, la expresión "minicélulas dirigidas a la integrina" se refiere a las minicélulas que expresan y muestran la molécula de la superficie celular dirigida a pan-Betal-integrina Invasina de Yersinia pseudotuberculosis y cualquier equivalente funcional de la misma.

Como se usa en el presente documento, la expresión "minicélulas terapéuticas dirigidas a la integrina" se refiere a las minicélulas que expresan y muestran la molécula de la superficie celular dirigida a pan-Betal-integrina Invasina de Yersinia pseudotuberculosis y cualquiera de sus equivalentes funcionales, en los que las minicélulas que comprenden una o varias moléculas bioactivas que incluyen, pero no se limitan a los mismos, polipéptidos terapéuticos, fármacos de molécula pequeña, ácidos nucleicos terapéuticos, y cualquier combinación de los anteriores. Las minicélulas terapéuticas dirigidas a la integrina pueden contener un agente de alteración endosómica que incluye, aunque sin limitaciones, citolisinas bacterianas (como LLO y PFO) y cualquier variante funcional o equivalente de las mismas. Las fosfolipasas, tales como PC-PLC o PI-PLC, también se pueden utilizar como agentes de rotura endosómicos.

Como se usa en el presente documento, la expresión "antígeno de superficie específico de la célula" se refiere a cualquier proteína, péptido, carbohidrato o ácido nucleico que se expresa, preferentemente, en la superficie o es secretado por cualquier tejido, órgano o tipo celular.

Como se usa en el presente documento, la expresión "gen de la división celular procariótica" se refiere a un gen que codifica un producto génico que participa en el proceso de división celular procariótica. En la técnica se han descubierto y caracterizado muchos genes de división celular. Ejemplos de genes de división celular incluyen, aunque no de forma limitativa, zipA, sulA, secA, dicA, dicB, dicC, dicF ,ftsA,ftsI,ftsN,ftsK,ftsL, ftsQ,ftsW,ftsZ, minC, minD, minE, seqA, ccdB, sfiC y ddlB.

Como se usa en el presente documento, el término "transgén" se refiere a un gen o material genético que se ha transferido de forma natural o por cualquiera de varias técnicas de ingeniería genética de un organismo a otro. En algunas realizaciones, el transgén es un segmento de ADN que contiene una secuencia de genes que se ha aislado de un organismo y se introduce en un organismo diferente. Este segmento de ADN no nativo puede retener la capacidad de producir ARN o proteína en el organismo transgénico o puede alterar la función normal del código genético del organismo transgénico. En algunas realizaciones, el transgén es una secuencia de ADN construida artificialmente, independientemente de si contiene una secuencia de codificación de genes, que se introduce en un organismo en el que el transgén no estaba previamente.

Como se usa en el presente documento, se dice que un agente se ha "purificado" si su concentración aumenta y/o si la concentración de uno o más contaminantes indeseables disminuye, en una composición relativa a la composición a partir de la cual se ha purificado el agente. En algunas realizaciones, la purificación incluye el enriquecimiento de un agente en una composición y/o el aislamiento de un agente del mismo.

La expresión "suficientemente desprovisto de células parentales", sinónimo de "suficientemente desprovisto", como se usa en el presente documento se refiere a una composición de minicélulas purificadas que tienen un nivel de contaminación de las células parentales que tiene poco o ningún efecto sobre el perfil de toxicidad y/o el efecto terapéutico de las minicélulas terapéuticas dirigidas.

El término "dominio" o "dominio proteico" utilizado en el presente documento se refiere a una región de una molécula o estructura que comparte características físicas y/o químicas comunes. Ejemplos no limitativos de dominios proteicos incluyen regiones transmembrana hidrofóbicas o de unión a membrana periféricas, regiones enzimáticas globulares o receptoras, dominios de interacción proteína-proteína y/o dominios de unión a ácido nucleico.

Los términos "Eubacteria" y "procariota" se usan en el presente documento, ya que estos términos son utilizados por los expertos en la materia. Los términos "eubacteriano/a" y "procariótico/a" utilizados en el presente documento incluyen Eubacterias, incluyendo bacterias gramnegativas y grampositivas, virus procarióticos (por ejemplo, bacteriófagos) y parásitos intracelulares obligados (por ejemplo, Richettsia, Chlamydia, etc.).

La expresión "ácido nucleico terapéutico" utilizado en el presente documento se refiere a cualquier colección de diversas moléculas de ácido nucleico que tienen un efecto terapéutico cuando se introducen en un organismo eucariótico (por ejemplo, un mamífero, tal como el ser humano). Un ácido nucleico terapéutico puede ser un ADNmc, un ADNbc, un ARNmc (incluyendo un ARNsh), un ADNbc (incluyendo ARNip), un ARNt (incluido un ARNt de uso de codones raros), un ARNm, un micro ARN (miARN), un ARN ribosómico (ARNr), un ácido peptidonucleico (ANP), un híbrido de ADN:ARN, un oligonucleótido antisentido, una ribozima, un aptámero, o cualquier combinación de los mismos.

La expresión "polipéptido terapéutico" utilizado en el presente documento se refiere a cualquier colección de diversos tipos de moléculas de proteínas que tienen un efecto terapéutico cuando se introducen en un organismo eucariótico (por ejemplo, un mamífero, tal como el ser humano). Un polipéptido terapéutico puede ser una toxina proteica, una citolisina dependiente del colesterol, una enzima funcional, una caspasa activada, una pro-caspasa, una citocina, una quimiocina, un péptido que penetra en la célula o cualquier combinación y/o pluralidad del procedimiento.

El término "sobreexpresión" utilizado en el presente documento se refiere a la expresión de un ácido nucleico funcional, polipéptido o proteína codificada por el ADN en una célula huésped, en el que el acido nucleico, el polipéptido o la proteína no está presente normalmente en la célula huésped o en el que el ácido nucleico, el polipéptido o proteína está presente en la célula huésped a un nivel más alto que el expresado normalmente a partir del gen endógeno que codifica el ácido nucleico, polipéptido o proteína.

El término "modular" como se usa en el presente documento significa interaccionar con un diana directa o indirectamente para alterar la actividad del objetivo para regular un proceso biológico. El modo de "modular" incluye, pero sin limitación, potenciar la actividad de la diana, inhibir la actividad de la diana, limitar la actividad de la diana y extender la actividad de la diana.

El término "heterólogo" como se usa en el presente documento se refiere a una proteína, gen, ácido nucleico, agente de imagen, componente tampón, o cualquier otro material biológicamente activo o inactivo que no se encuentre naturalmente en una cepa bacteriana que produce minicélulas o minicélulas y se expresa, transcribe, traduce, amplifica o genera de otro modo por cepas bacterianas productoras de minicélulas que albergan material genético recombinante que codifica dicho material heterólogo o que codifica genes que son capaces de producir dicho material heterólogo (por ejemplo, un metabolito bioactivo no nativo de la célula madre).

El término "exógeno" como se usa en el presente documento se refiere a una proteína (incluidos anticuerpos), gen, ácido nucleico, fármaco de molécula pequeña, agente de imagen, un tampón, radionúclido o cualquier otro material biológicamente activo o inactivo que no sea nativo de una célula, o en el caso de una minicélula, no nativo de la célula madre de la minicélula. El material exógeno difiere del material heterólogo en virtud del hecho de que se genera, puirifica y añade por separado.

El término "terapéutico" como se usa en el presente documento significa tener un efecto biológico o una combinación de efectos biológicos que previene, inhibe, elimina o evita la progresión de una enfermedad u otros procesos biológicos aberrantes en un animal.

El término "diagnóstico" como se usa en el presente documento significa tener la capacidad de detectar, controlar, seguir y/o identificar una enfermedad o afección en un animal (incluidos seres humanos) o de una muestra biológica que incluya, entre otros, sangre, orina, saliva, sudor y materias fecales.

El término "teranóstico" como se usa en el presente documento significa tener los efectos combinados de una composición terapéutica y diagnóstica.

La expresión "expresado de forma recombinante" como se usa en el presente documento significa la expresión de uno o más ácidos nucleicos y/o proteínas de una molécula de ácido nucleico que se construye artificialmente utilizando técnicas modernas de ingeniería genética en las que la molécula de ácido nucleico artificialmente construida no ocurre de forma natural en minicélulas y/o cepas bacterianas productoras de minicélulas en las que la molécula de ácido nucleico artificial está presente como una molécula de ácido nucleico episómica o como parte del cromosoma bacteriano productor de minicélulas.

El término "episómico/a", como se usa en el presente documento, significa una molécula de ácido nucleico que es independiente del cromosoma o cromosomas de un organismo o célula dado.

El término "destoxificado" como se usa en el presente documento se refiere a una modificación hecha a una composición o componente de la misma que da como resultado una reducción significativa en la toxicidad aguda para la composición modificada o componente de la misma, independientemente de cuáles sean las bases biológicas causales de la toxicidad para la composición o componente de la misma.

La expresión "silenciamiento génico", como se usa en el presente documento, se refiere a una reducción específica del grupo intracelular de ARNm para una proteína dada en comparación con el nivel normal del ARNm como resultado de la administración de un ácido nucleico terapéutico administrado por minicélulas dirigidas. Los ácidos nucleicos terapéuticos incluyen, aunque no de forma limitativa, ARN bicatenarios (por ejemplo, ARNip) así como ARN monocatenarios (por ejemplo, ARNsh y miARN) y cualquier plásmido de expresión eucariótico que los codifique.

La expresión "plásmido de expresión eucariótica", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ADN de doble cadena circular que codifica uno o más productos génicos unidos operativamente a secuencias de control de la expresión eucariótica, de modo que el producto o los productos génicos pueden transcribirse y traducirse por una célula eucariótica de la molécula de ADN de doble cadena.

Como se usa en el presente documento, la expresión "molécula bioactiva" se refiere a una molécula que tiene un efecto biológico en un organismo eucariota (por ejemplo, un mamífero, tal como ser humano) cuando se introduce en el organismo o célula eucariótica. Las moléculas bioactivas incluyen, aunque no de forma limitativa, ácidos nucleicos terapéuticos, polipéptidos terapéuticos (incluidas las toxinas proteicas) y fármacos terapéuticos de molécula pequeña.

Como se usa en el presente documento, la expresión "molécula de direccionamiento que contiene Fc" se refiere a una molécula que es capaz de unirse a una molécula de unión a Fc (por ejemplo, la parte de unión a Fc de la proteína A o proteína G) y contiene un sitio de reconocimiento para una molécula diana (por ejemplo, un antígeno o un receptor). Las moléculas de direccionamiento que contienen Fc incluyen, aunque no de forma limitativa, anticuerpos que tienen una región Fc y ligandos de a receptor soluble diseñados para contener una región Fc. Como se usa en el presente documento, la expresión "antígeno eucariótico" se refiere a un antígeno que tiene un origen eucariótico, por ejemplo, un antígeno mostrado en la superficie de una célula eucariota.

Como se usa en el presente documento, la expresión "toxina proteica" se refiere a una proteína que tiene un efecto tóxico en las células eucarióticas.

Como se usa en el presente documento, la expresión "molécula pequeña" se refiere a una molécula que tiene un efecto biológico y que tiene un peso molecular de menos de 5000 Dalton. En algunas realizaciones, las moléculas pequeñas tienen un peso molecular de menos de 2500 Dalton. En algunas realizaciones, las moléculas pequeñas tienen un peso molecular de menos de 1000 Dalton. En algunas realizaciones, las moléculas pequeñas tienen un peso molecular de menos de 800 Dalton. En algunas realizaciones, las moléculas pequeñas tienen un peso molecular de menos de 500 Dalton.

Como se usa en el presente documento, la expresión "fármaco de molécula pequeña terapéutica" o "fármaco de molécula pequeña" se refiere a una molécula pequeña que tiene un efecto terapéutico cuando se introduce en un organismo eucariótico (por ejemplo, un mamífero, tal como un ser humano).

Descripción

La presente solicitud se refiere al uso de minicélulas bacterianas como agentes de vacunación y administración de moléculas bioactivas dirigidas in vitro e in vivo. Las minicélulas eubacterianas tienen una clara ventaja como vehículos de administración, en el sentido de que pueden diseñarse para apuntar y liberar grandes números y una gran variedad de moléculas bioactivas a tipos celulares específicos in vivo. Las minicélulas bacterianas están diseñadas para mostrar anticuerpos y/u otras fusiones/conjugados que contienen Fc en sus superficies que dirigen específicamente la minicélula a los tipos de células o tejidos involucrados en el inicio, promoción, apoyo y mantenimiento de enfermedades u otros procesos biológicos aberrantes en un animal.

Las minicélulas son acromosómicas, nanopartículas biológicas encapsuladas en membrana (aproximadamente de 250 a 500 nm de diámetro) que son formadas por bacterias después de una interrupción en el aparato de división normal de las células bacterianas. Esencialmente, las minicélulas son réplicas pequeñas metabólicamente activas de células bacterianas normales con la excepción de que no contienen ADN cromosómico y, como tales, no se dividen y no son viables. Aunque las minicélulas no contienen cromosomas bacterianos, se ha demostrado que moléculas de ADN plasmídico (más pequeñas que los cromosomas), moléculas de ARN (de todos los subtipos), proteínas nativas y/o expresadas de forma recombinante y otros metabolitos segregan en las minicélulas. Las minicélulas son especialmente adecuadas como vehículos terapéuticos de administración in vivo, diagnósticos, teranósticos y de magen porque combinan muchas de las ventajas individuales de otras tecnologías de administración en un solo vehículo de administración versátil. Las minicélulas pueden ser "diseñadas" para, preferentemente, encapsularse, acoplarse a o absorber moléculas biológicamente activas, incluyendo varios ácidos nucleicos, proteínas, fármacos de molécula pequeña y cualquier combinación de los mismos para la administración posterior en aplicaciones medicinales tanto profilácticas como terapéuticas, donde la detección, prevención, mantenimiento y/o la inhibición de la enfermedad es deseable. Tal como se describe en el presente documento, las minicélulas tienen la ventaja de que pueden diseñarse para dirigirse selectivamente a tipos de células específicos responsables de la enfermedad mediante el uso de un nuevo sistema de visualización de superficie capaz de mostrar cualquier anticuerpo que contenga la región Fc o un derivado del anticuerpo que contenga la región Fc, así como las fusiones o conjugados que contienen la región Fc que incluyen, pero no se limitan a los mismos, polipéptidos, ácidos nucleicos, DARPin, radionúclidos, hidratos de carbono, moléculas pequeñas y agentes de imagen.

Otra ventaja del uso de minicélulas como vehículos de administración (independientemente de si están dirigidos o no) es que las moléculas bioactivas pueden administrarse en combinación como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 7.183.105, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. Por ejemplo, se ha demostrado que las minicélulas pueden generar con éxito respuestas inmunes humorales contra un antígeno heterólogo cuando se utilizan como vehículo de administración para vacunas de ADN plasmídico. Cuando se utilizan minicélulas para administrar simultáneamente una vacuna de ADN y el antígeno proteico correspondiente, las respuestas humorales han mejorado mucho, ilustrando los beneficios de la flexibilidad de minicélulas con respecto a las opciones de administración. Tal como se describe en el presente documento, las minicélulas tienen características únicas que permiten la carga de fármacos de moléculas pequeñas y agentes de imagen, así como la capacidad distintiva de expresar y encapsular de forma recombinante moléculas terapéuticas de administración de ácido nucleico, péptidos y proteínas para la administración. Estas características únicas permiten un sistema de liberación altamente flexible que puede liberar múltiples cargas útiles de diferentes orígenes moleculares en concierto.

Los enfoques para dirigir minicélulas a células eucariotas in vitro e in vivo incluyen (i) acoplamiento químico aleatorio de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos u otros derivados de anticuerpos a las superficies de minicélulas utilizando innumerables técnicas de acoplamiento químico conocidas en la técnica, (ii) utilizando anticuerpos biespecíficos, fragmentos de anticuerpos biespecíficos, o derivados de anticuerpos biespecíficos para unir de forma no covalente los anticuerpos dirigidos a las superficies de las minicélulas, y (iii) expresar un anticuerpo de cadena única u otro fragmento de anticuerpo en la superficie de las minicélulas en el contexto de una fusión contigua con una proteína de anclaje a la membrana de la minicélula, tal como una proteína de membrana externa bacteriana. La presente solicitud describe un enfoque novedoso que proporciona ventajas significativas con respecto a la fabricación, inmunogenicidad y direccionamiento de minicélulas terapéuticas.

En los casos en que los anticuerpos exógenos existentes libres en solución están reticulados a las superficies de las minicélulas, existe una falta de control sobre la orientación del anticuerpo o conjugado/fusión de Fc porque estas moléculas se entrecruzarán aleatoriamente con la superficie de las minicélulas en muchas orientaciones diferentes. Esto tiene dos efectos potenciales sobre el producto final que se añadirían a la complejidad de la fabricación y podrían disminuir la eficacia. El primer efecto perjudicial solo se aplica a la reticulación de anticuerpos de longitud completa y su exposición de las regiones Fc en lugar de las regiones de unión, dependiendo de qué extremo del anticuerpo u otra fusión/conjugado que contiene la región Fc se acopla a la superficie de minicélulas. La región Fc tiene el potencial de estimular el sistema inmunológico en virtud de la interacción de la región Fc con varios componentes del sistema inmunitario (por ejemplo, el receptor Fc en la superficie de las células asesinas naturales). El segundo efecto perjudicial es que habrá una heterogeneidad inherente con respecto a la orientación del anticuerpo (u otra fusión/conjugado que contiene la región Fc) en la superficie, de modo que no todas las regiones de unión están expuestas. La exposición de la porción de unión variable tiene el potencial de dar como resultado una eficacia disminuida y/o variable como resultado de menos restos de unión funcional en la superficie de la minicélula. Cualquiera o ambas de estas limitaciones tienen el potencial de aumentar la inmunogenicidad y/o eliminación de minicélulas, haciéndolos vehículos de administración terapéutica menos eficaces. Sin embargo, cuando se utiliza en el contexto de la presente divulgación, la reticulación química de los anticuerpos a la superficie de las minicélulas evita los problemas descritos anteriormente porque las minicélulas de unión a Fc de la presente divulgación ayudan a orientar los anticuerpos de manera que (i) las regiones Fc de los anticuerpos están ocultas y (ii) los sitios de unión a antógeno de los anticuerpos unidos y reticulados se muestran de manera óptima (es decir, apuntados hacia afuera desde la minicélula frente a una orientación aleatoria). Como se usa en el presente documento, los reactivos de reticulación pueden ser "homobifuncionales" o "heterobifuncionales" (que tienen el mismo o diferentes grupos reactivos, respectivamente). Ejemplos de reactivos de reticulación incluyen, aunque no de forma limitativa, los que figuran en la tabla 1. En este contexto, un método preferido con respecto a la reticulación incluye la generación y purificación de minicélulas de unión a Fc como se describe en el presente documento, incubar las minicélulas en una solución que contenga los anticuerpos dirigidos de elección, permitir que se produzca la unión, lavar el exceso de anticuerpo no unido, realizar la reacción de reticulación y luego eliminar el exceso de reactivo de reticulación utilizando métodos estándar conocidos en la técnica.

Las composiciones y los métodos desvelados en el presente documento son ventajosos sobre algunas de las composiciones y métodos en los que los anticuerpos biespecíficos, se utilizan fragmentos de anticuerpos biespecíficos y derivados de anticuerpos biespecíficos. Por ejemplo, puede ser costoso producir anticuerpos biespecíficos que tengan especificidad para un componente nativo de la superficie de minicélulas en un brazo de anticuerpo y especificidad para un objetivo de superficie de células eucariotas en el otro. Además, los anticuerpos biespecíficos, al igual que los anticuerpos químicamente conjugados a la superficie de las minicélulas, expondrían la región Fc, potencialmente activando el complemento y/o haciendo que la región Fc sea accesible para las células que se unen a Fc del sistema inmune in vivo. Los fragmentos de anticuerpos biespecíficos que no incluyen la región Fc pueden eludir los problemas relacionados con la exposición de la región Fc in vivo, excepto que estos tipos de moléculas requieren incluso más ingeniería genética que la de un anticuerpo biespecífico. En el caso de la construcción de complejos de anticuerpos biespecíficos, hay varios inconvenientes. Si el complejo de anticuerpos biespecífico se fabrica utilizando métodos de reticulación covalente conocidos en la técnica, se aplican las mismas limitaciones que en el caso en el que los anticuerpos se entrecruzan directamente con minicélulas con respecto a tener que purificar el exceso de agente químico de reticulación. Como los complejos de anticuerpos bioespecíficos se forman mezclando cantidades equimolares de anticuerpo seguidas de la adición de un agente de reticulación químico exógeno para catalizar la reacción, se requiere una purificación adicional para eliminar las especies dualmente monoespecíficas no deseadas. Si no se eliminan las especies dualmente monoespecíficas no deseadas se produciría reticulación de las minicélulas a otras minicélulas como resultado de la presencia de anticuerpos monoespecíficos con afinidades por las minicélulas. En un enfoque relacionado obviado por las enseñanzas del documento de Estados Unidos 7.183.105, se usa una molécula híbrida de Proteína A/G como un armazón no covalente por el cual se unen dos anticuerpos monoespecíficos diferentes para formar un "ligando biespecífico" como se describe en las Publicaciones de Patente de Estados Unidos números 20080051469, 20070298056 y 20070237744, cada uno de los cuales se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. El problema de agregación se amplifica con el uso de este enfoque porque la molécula de Proteína A/G utilizada como armazón se une indiscriminadamente a seis (6) anticuerpos diferentes por molécula de Proteína A/G. De nuevo, dos tipos de anticuerpos separados se mezclan juntos en cantidades equimolares seguidas de la adición de Proteína A/G para unirse de forma no covalente y enlazar los dos anticuerpos diferentes entre sí. En este enfoque, se hacen 720 diferentes permutaciones de complejos de anticuerpos, la mayoría de los cuales tienen afinidad por dos (2) a seis (6) minicélulas. Esta limitación requiere que se implementen procedimientos de fabricación costosos y complejos para cumplir con las normas de la GMP. Esto se suma al coste de todos los diferentes componentes necesarios para fabricar este tipo de producto de minicélulas. Un problema adicional es el potencial significativo de toxicidad asociada con la administración de un producto agregado a un paciente. Al igual que con la reticulación química, estas limitaciones también tienen el potencial de aumentar la inmunogenicidad y/o el aclaramiento de las minicélulas, haciéndolos vehículos de administración terapéutica menos eficaces. Las minicélulas de unión a Fc descritas en el presente documento reducen la inmunogenicidad cuando el anticuerpo se deriva de las especies a las que se administran como modalidad de tratamiento. Debido a que las minicélulas de unión a Fc se unen a las regiones Fc de los anticuerpos o fusiones/conjugados que contienen Fc, las regiones Fc están enmascaradas de las células que expresan el receptor Fc del sistema inmune (por ejemplo, macrófagos y células NK). Además, cuando el anticuerpo utilizado se deriva de la especie a partir de la cual se administrará la minicélula como modalidad de tratamiento, las minicélulas se vuelven "sigilosas" porque la superficie ahora está cubierta por las proteínas "propias" (anticuerpos). Los organismos inmunocompetentes no reconocen fácilmente las proteínas "propias". Las minicélulas que se han unido y muestran proteínas "propias" (por ejemplo, anticuerpos) se enmascaran aún más del sistema inmunológico. Enmascarar minicélulas terapéuticas dirigidas del sistema inmunológico es ventajoso porque puede aumentar la semivida in vivo de las minicélulas, lo que proporciona una ventana más larga para que las minicélulas alcancen su objetivo previsto.

En el caso de la expresión y visualización de un anticuerpo de cadena única en la superficie de la minicélula en el contexto de una proteína de fusión contigua al dominio extracelular de una proteína de membrana externa bacteriana, hay dos limitaciones. La primera es que no todas las secuencias de anticuerpos monoclonales se pueden convertir en un fragmento de anticuerpo de cadena única y mantener las mismas propiedades de unión que la molécula de anticuerpo monoclonal original. La segunda limitación es que incluso en los casos en que un anticuerpo monoclonal se puede convertir en un fragmento de anticuerpo de cadena única, la capacidad de unión a veces tiene que optimizarse mediante la generación de diversas secuencias de fusión y construcciones de enlazadores. Por tanto, el enfoque de visualización de anticuerpos de cadena única se limita solo a los anticuerpos de cadena única que mantienen la actividad, en su totalidad o en gran parte, de la molécula de anticuerpo parental. Si bien existen muchos anticuerpos de cadena única y pueden incorporarse en composiciones de minicélulas que expresan y muestran anticuerpos de cadena única o fragmentos de anticuerpos, todavía es ventajoso poder mostrar anticuerpos monoclonales de longitud completa, como se enseña en el presente documento, porque expande aún más el repertorio de anticuerpos entre los cuales el experto puede elegir y acelera significativamente el proceso de selección de candidatos para el desarrollo de fármacos potencialmente exitosos. En algunas realizaciones, las minicélulas de unión a Fc desveladas en el presente documento pueden usarse para "seleccionar" una biblioteca de anticuerpos completos exógenos para seleccionar candidatos de anticuerpos útiles cuando se convierten en una sola cadena para la expresión y visualización en la superficie de las minicélulas. En otras realizaciones, las minicélulas de unión a Fc desveladas en el presente documento pueden emplearse para seleccionar una biblioteca de anticuerpos de cadena única como un proceso de selección primario para determinar qué anticuerpos de cadena única mantendrán sus propiedades de unión e internalización si se convierten en una proteína de fusión diseñada para expresarse y se muestra en la superficie de las minicélulas. En otro ejemplo más, las minicélulas de unión a Fc pueden usarse para seleccionar proteínas de fusión o conjugadas que contienen Fc. Dichas fusiones y conjugados que contienen Fc se describen con más detalle en el presente documento.

Un nuevo enfoque para superar muchas de las limitaciones descritas anteriormente se desvela en el presente documento, en el que los anticuerpos u otras fusiones/conjugados que contienen la región Fc se acoplan de forma no covalente directamente a la superficie de las minicélulas que expresan y muestran una proteína de fusión que comprende (i) una secuencia de exportación (secreción) de membrana externa, (ii) una proteína de membrana externa o parte de anclaje de membrana de la misma, y (iii) la parte o porciones de unión a Fc de la proteína A o proteína G en la superficie de las minicélulas. Las minicélulas que muestran una o más de las regiones de unión a Fc de la proteína A o la proteína G pueden unirse a anticuerpos de longitud completa y/u otras fusiones/conjugados que contienen la región Fc a través de la región Fc de los anticuerpos o fusiones/conjugados, sin modificación ni manipulación de las minicélulas, anticuerpos, o fusiones/conjugados que contienen la región Fc mediante coincubación de las minicélulas con los anticuerpos o fusiones/conjugados que contienen la región Fc.

Las composiciones y métodos desvelados en el presente documento son ventajosos sobre los enfoques de acoplamiento enumerados anteriormente, por ejemplo, están diseñados para mostrar anticuerpos u otros fusiones/conjugados que contienen Fc de manera que (i) la región Fc del anticuerpo esté oculta y (ii) el dominio de unión/efector antígeno de los anticuerpos y/o las fusiones/conjugados estén expuestos de manera óptima en virtud de la unión del anticuerpo o fusión/conjugado que contiene Fc a la molécula de fusión de unión a FC de la proteína A o la proteína G sobre la superficie de la minicélula. Las minicélulas pueden luego cargarse con una o más especies de carga útil bioactiva, ya sea mediante la adición exógena de la carga útil a minicélulas purificadas o mediante la expresión recombinante de la carga útil de la bacteria parental productora de minicélulas antes o durante la formación de minicélulas. Las cargas útiles bioactivas que se expresan o cargan en minicélulas incluyen, entre otras, fármacos de moléculas pequeñas y/o un radionúclido, un ARN de horquilla corta de cadena sencilla terapéutica (ARNss, también conocido como ARNsh), una molécula de ARN bicatenario terapéutica (por ejemplo, un ARNip), una ribozima, un aptámero, un polipéptido terapéutico (por ejemplo, una toxina proteica), un plásmido de expresión eucariota que codifica un polipéptido terapéutico o ácido nucleico terapéutico, y cualquier combinación de las cargas útiles bioactivas precedentes. En algunas realizaciones, las minicélulas cargadas con una carga útil bioactiva o una combinación de las mismas y que también muestran anticuerpos u otras fusiones/conjugados que reconocen moléculas de superficie celular eucarióticas están compuestas por moléculas de lipopolisacáridos destoxificados mutantes (LPS) como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, las minicélulas dirigidas que comprenden carga(s) bioactiva(s) diana y enganchan su molécula de superficie celular eucariótica relacionada in vivo o in vitro, estimular la endocitosis de la minicélula o minicélulas y se degradan, liberando así sus contenidos directamente en la célula eucariota objetivo. En algunas realizaciones más, las minicélulas que comprenden carga o cargas útiles bioactivas se dirigen y enganchan su molécula de superficie celular eucariótica afín in vivo o in vitro pero no estimulan la endocitosis de la minicélula o minicélulas. Estas se denominan minicélulas "localizadas" y eventualmente se degradan en o cerca de la superficie de la célula diana, liberando así su contenido directamente en las proximidades de la célula eucariota objetivo, por lo que la carga útil puede ejercer su efecto terapéutico en la célula diana. Las minicélulas y las cepas bacterianas productoras de minicélulas desveladas en el presente documento han sido modificadas genéticamente para expresar y mostrar una o más de las porciones de unión a Fc de la proteína G o la proteína A, de modo que sean capaces de reconocer y unirse a la región Fc de anticuerpos y/u otras fusiones/conjugados que contienen Fc. Los anticuerpos y/o fusiones/conjugados que contienen Fc unidos por minicélulas que muestran una o más de las regiones de unión a Fc de la Proteína G o Proteína A constituyen el componente de direccionamiento de las minicélulas dirigidas desveladas en el presente documento.

La proteína G es una proteína de la superficie celular expresada por el grupo G de bacterias grampositivas Streptococcus. Su función biológica natural es prevenir la opsonización del estreptococo del Grupo G durante el proceso de infección mediante la unión de la región Fc de los anticuerpos, de manera que la región Fc esté enmascarada del sistema inmunológico. Normalmente, los anticuerpos de antígeno de superficie celular antibacterianos se unen a la superficie de las células bacterianas e inducen la opsonización y/o la activación del complemento dependiendo de la exposición externa de las regiones Fc de los anticuerpos unidos a la superficie de las células bacterianas. La proteína G sirve para prevenir esto en el estreptococo del Grupo G al unirse a la región Fc de los anticuerpos, ocultando así la región Fc expuesta del sistema inmune. La proteína G es una proteína de 51 kilodalton que consta de 13 dominios distintos que habitualmente se consolidan para incluir los dominios A/B, el dominio S, los dominios C/D, y el dominio W/M. Los dominios A/B de la proteína G consisten en tres repeticiones altamente relacionadas (A1-B1; A2-B2; A3) que tienen sitios de unión superpuestos para la región Fab de los anticuerpos (afinidad moderada) y para albúmina sérica (afinidad alta). El dominio S es el dominio espaciador entre los dominios A/B y C/D. El dominio C/D consiste en tres repeticiones más altamente relacionadas (C1 -D1; C2-D2; D3) y constituye la región de unión a Fc de la molécula. El dominio C/D es capaz de unirse a dos (2) anticuerpos separados por la región Fc del anticuerpo. Por tanto, la proteína G contiene dos dominios de unión a Fc, cualquiera o ambos de los cuales se pueden utilizar en las realizaciones desveladas en el presente documento. La región C/D se usa habitualmente para purificar por afinidad los anticuerpos del suero (u otras fuentes). Los dominios W/M funcionan para interactuar con la pared celular grampositiva y para facilitar la exportación a la valva externa de la membrana celular, respectivamente. La proteína o proteínas de fusión de proteína G desveladas en el presente documento incluyen, por lo tanto, aunque no de forma limitativa, las regiones S y C/D de la proteína G. En algunas realizaciones, es ventajoso incluir solo las regiones S y C/D en el diseño de las proteínas de fusión recombinantes desveladas en el presente documento para evitar la unión no deseada de las regiones Fab de los anticuerpos (expone la región Fc) o a la albúmina sérica. En algunas realizaciones, el dominio de unión a la albúmina sérica de la Proteína G se incluye de manera que las minicélulas pueden convertirse en "minicélulas ocultas mejoradas" mediante la unión de la albúmina sérica a la superficie de la minicélula además de un anticuerpo. La albúmina sérica unida a la superficie de las minicélulas, además del anticuerpo, ayuda a enmascarar la minicélula del sistema inmune del receptor. En estos casos, es preferible relacionar ambas especies de origen tanto del anticuerpo como de la albúmina sérica con la del receptor.

La proteína A es una proteína de la superficie celular expresada por la bacteria grampositiva Staphylococcus aureus. Al igual que la proteína G, su función biológica natural también es prevenir la opsonización de Staphylococcus aureus durante el proceso de infección. Staphylococcus aureus usa la proteína A para unirse a la región Fc de los anticuerpos. Dependiendo de la orientación o exposición externa, las regiones Fc de los anticuerpos unidos a la superficie son capaces de activar el complemento o la unión a los receptores Fc en células fagocíticas como los neutrófilos. La proteína A es una proteína de 58 kilodalton que consiste en 7 dominios distintos que habitualmente se conocen como dominios S, E, D, A, B, C y X. El dominio S constituye la señal de secreción. El dominio E no está bien caracterizado y no tiene actividad de unión a inmunoglobulina. Los dominios D, A, B, y C, a menudo agrupados y referidos como el dominio Z, contienen cuatro (4) dominios de unión a inmunoglobulina consecutivos, se cree que han evolucionado como resultado de duplicaciones de genes en S. aureus. Los dominios D, A, B y C pueden estar desacoplados y cada uno mantiene sus propiedades de unión a inmunoglobulina con poco o ningún efecto sobre la afinidad/especificidad. La proteína A contiene cuatro dominios de unión a Fc discretos, cualquiera de los cuales puede usarse en singular o en combinación en el presente documento. Por tanto, las proteínas de fusión de unión a Fc derivadas de proteína A diferentes pueden contener 1,2, 3 o 4 dominios de unión a Fc y pueden incorporarse en las composiciones y métodos desvelados en el presente documento a discreción de un experto en la técnica. El dominio X no tiene actividad de unión a inmunoglobulina y es responsable de anclar el extremo C de nuevo en la pared de peptidoglicano en el entorno grampositivo. El dominio X es prescindible y no tiene efecto en las propiedades de unión de los dominios D, A, B y C. La proteína o proteínas de fusión de la proteína A desveladas en el presente documento incluyen, por lo tanto, aunque no de forma limitativa, los dominios D, A, B y C de la proteína A o los derivados de uno o más de estos dominios que retienen la capacidad de unión a Fc. Los derivados preferidos incluyen dominios en los que la glicina 29 se sustituye por alanina, eliminando la unión de F(ab')² , y/o los derivados en los que los sitios de escisión putativos por la proteasa OmpT se han eliminado mediante sustitución con residuos de aminoácidos conservados funcionalmente.

Las minicélulas de unión a Fc que expresan la región de unión a Fc de la Proteína G o la de la Proteína A se pueden usar para mostrar correctamente los anticuerpos y/u otras fusiones/conjugados que contienen Fc en las superficies de las minicélulas, lo que sirve para facilitar el direccionamiento de las minicélulas a células específicas, tejido, y tipos de órganos in vivo. Los anticuerpos, o cualquier porción de los mismos que contiene Fc, destinados a ayudar en el direccionamiento de minicélulas a un tejido específico, órgano y tipo de célula implicados en la causa, progresión, mantenimiento o manifestación de la enfermedad pueden derivarse de o ser parte de cualquier inmunoglobulina o subclase de inmunoglobulina, incluyendo, pero sin limitaciones, IgA, IgM, IgD, IgG e IgE. Los anticuerpos de cualquier subclase destinados a facilitar la función de direccionamiento de minicélulas pueden ser "humanizados", aunque cualquier anticuerpo de cualquier subclase contra un antígeno específico de la célula se puede producir en cualquier animal que se sepa que genera respuestas de anticuerpos a través de la inmunidad adaptativa para lograr el mismo objetivo. En la naturaleza, los anticuerpos se generan de tal manera que contienen dos brazos separados (Fab), cada uno de los cuales reconoce el mismo epítopo de un antígeno particular. Sin embargo, tal como se describe más adelante, los avances en biología molecular han permitido a los investigadores modificar la especificidad de cada brazo (o, en algunos casos, la región Fc de la molécula) para reconocer epítopos claramente diferentes que pueden o no aparecer en los mismos o diferentes antígenos. Estos derivados de anticuerpos se conocen como anticuerpos "biespecíficos" o grupos de direccionamiento "biespecíficos".

En el laboratorio, los anticuerpos pueden diseñarse para que sean independientemente específicos para diferentes antígenos, de tal manera que un solo anticuerpo apunta a dos antígenos separados simultáneamente. A modo de ejemplo no limitante, los anticuerpos pueden diseñarse para reconocer los componentes putativos de la superficie de una minicélula eubacteriana dada (por ejemplo, antígenos O LPS) en un Fab' y el otro Fab' del anticuerpo biespecífico pueden diseñarse para reconocer un antígeno de superficie específico de células eucarióticas. En otra variación no limitativa sobre este tema, la región Fc de las cadenas pesadas del anticuerpo puede modificarse por ingeniería genética para unirse específicamente a un epítope particular dentro de un antígeno dado (por ejemplo, LPS), mientras que las porciones Fab' de la molécula reconocen un epítopo diferente en una superficie específica de célula eucariótica separada antígeno o viceversa.

Adicionalmente, los expertos en la técnica reconocerán fácilmente que dos anticuerpos separados, con especificidades separadas, se pueden unir de forma no covalente mediante su acoplamiento a la proteína A soluble, Proteína G, o Proteína A/G (o cualquier otra molécula de unión que reconocerá y se unirá a dos o más anticuerpos) para formar un derivado de anticuerpo biespecífico capaz de adherirse a la superficie de minicélulas en donde un anticuerpo dentro del complejo se adhiere específicamente a la superficie de la minicélula y el otro anticuerpo se muestran para reconocer específicamente y, por lo tanto, "apuntar" a una célula específica, tejido o tipo de órgano que expresa un antígeno de superficie específico de células eucariotas in vivo. De manera similar, un experto en la materia reconocerá que dos anticuerpos separados, con especificidades separadas, se puede unir covalentemente utilizando innumerables técnicas de reticulación para lograr el mismo efecto.

Otros enfoques de direccionamiento no basados en anticuerpos desvelados en la presente solicitud se basan colectivamente en fusiones o conjugados que contienen Fc. Tal como se describe en el presente documento, ejemplos de restos de direccionamiento molecular incluyen, aunque no de forma limitativa, ligandos del receptor, polipéptidos, hormonas, hidratos de carbono, aptámeros, moléculas similares a anticuerpos, nanocuerpos, aficuerpos, receptores de antígeno de linfocitos T monocatenarios similares a anticuerpos (STAR), mTCR, transcuerpos, XmAbs y DARPins. La conjugación con Fc se puede lograr utilizando varios enfoques conocidos en la técnica. A modo de ejemplo no limitante, los ligandos solubles de EGF o VEGF pueden fusionarse genéticamente o conjugarse con un polipéptido que contiene Fc (región Fc) y unirse a la superficie de la minicélula de unión a Fc, de tal manera que las minicélulas de unión a Fc se dirijan a la competencia y puedan localizarse y internalizarse selectivamente por las células que expresan el receptor EGFR o VEGFR2, respectivamente. Como otro ejemplo no limitante, la carga útil terapéutica en sí puede fusionarse genéticamente o acoplarse a un polipéptido que contiene Fc y unirse a la superficie de las minicélulas de unión a Fc. Por ejemplo, las moléculas de ARNip conjugadas con Fc pueden unirse a la superficie de las minicélulas de unión a Fc además de los anticuerpos que contienen Fc, derivados de anticuerpos que contienen Fc y/o moléculas de direccionamiento de fusión/conjugado que contienen Fc. Las fusiones de polipéptidos que contienen Fc incluyen, aunque no de forma limitativa, ligando de receptor/fusiones de Fc, fusiones de péptidos que contienen Fc y DARPins que contienen Fc. La expresión recombinante de la fusión es un método de construcción preferido. En el contexto de la expresión recombinante, las regiones Fc pueden fusionarse con el extremo amino o carboxi de una fusión recombinante dada a discreción de los expertos en la técnica, de modo que la fusión con la región Fc no afecte a la actividad del ligando con respecto a la unión al receptor y la estimulación de la endocitosis mediada por el receptor. Otro enfoque de ejemplo para hacer polipéptidos que contienen Fc, péptidos y DARPins es por conjugación química (también conocido como reticulación) de moléculas de la región Fc recombinantes purificadas a polipéptidos recombinantes, péptidos y/o moléculas DARPin que utilizan cualquiera de las técnicas de reticulación conocidas en la técnica. En el contexto de la reticulación química, es ventajoso incluir grupos de aminoácidos "reactivos" en cualquiera o ambos de la región Fc recombinante purificada o el polipéptido, péptido y/o molécula DARPin a conjugar. Ejemplos de aminoácidos reactivos incluyen, aunque no de forma limitativa, los que contienen grupos sulfhidrilo, preferentemente un resto de cisteína. En algunas realizaciones, para usar con reactivos de reticulación heterobifuncionales populares, es preferible incluir un residuo de lisina en el sitio de enlace del conjugado opuesto (por ejemplo, la región Fc contiene un residuo de cisteína, mientras que el polipéptido dirigido o de carga útil contiene una lisina o viceversa). En los casos en que las regiones Fc recombinantes purificadas se reticulan con hormonas, hidratos de carbono, aptámeros, y otras moléculas basadas en aminoácidos y/o péptidos, los expertos en la técnica reconocerían que se pueden emplear muchos otros reactivos de reticulación para lograr el mismo. Los reactivos de reticulación pueden ser "homobifuncionales" o "heterobifuncionales" (que tienen el mismo o diferentes grupos reactivos, respectivamente). Ejemplos de reactivos de reticulación incluyen, aunque no de forma limitativa, los que figuran en la tabla 1. La Tabla 1 también ilustra ejemplos no limitativos de reactivos de reticulación que pueden usarse para cada tipo/enfoque de molécula conjugada.

En algunas realizaciones preferentes, las minicélulas y las cepas bacterianas productoras de minicélulas están "diseñadas" para expresar y mostrar una porción recombinante de unión a Fc de Proteína G o Proteína A en sus superficies. La localización de la superficie de polipéptidos recombinantes se ha logrado con éxito en Salmonella entérica mediante el uso de proteínas de fusión que contienen un dominio de anclaje a la membrana externa Antígeno 43-a fusionado a un fragmento de anticuerpo de cadena única FcV con especificidad para Chlam 12 o CTP3. En un estudio similar, se demostró que las células de E. coli que expresan y muestran fragmentos de anticuerpos de FcV de una sola cadena dirigidos hacia epítopos de Coronavirus fusionados con la proteasa de IgA localizada en la membrana externa de Neisseria gonnorhoeae neutralizan el Coronavirus y previenen la infección in vitro. La localización en la superficie también se puede lograr fusionando las secuencias codificantes de la proteína de unión a Fc deseada con el autotransportador de adherencia involucrada en difusión difusa (AIDA-I) de E. coli. Esto también se puede lograr con el sistema de visualización de células completas Lpp-OmpA descrito en la patente de Estados Unidos 5.348.867, que se incorpora en el presente documento por referencia. En algunas realizaciones, Lpp-OmpA se usa para expresar y mostrar los restos de unión a Fc del anticuerpo, que incluyen, pero sin limitaciones, la región de unión a Fc de la proteína A o la proteína G en las superficies de las minicélulas. Otras proteínas nativas de la membrana externa que pueden servir como la pareja de fusión de la membrana externa incluyen, aunque no de forma limitativa, LamB, OmpF, OmpC, OmpD, PhoE, PAL, proteínas pilus y diversas flagelinas en miembros de la familia Enterobacteriacea gramnegativos. Este enfoque se utiliza para expresar y mostrar los fragmentos de la proteína A o proteína G que se unen a Fc en la superficie de las minicélulas derivadas de cualquier miembro de la familia Enterobacteriacea o Bacillaceae, de modo que las minicélulas sean capaces de unirse y mostrar anticuerpos contra los antígenos de la superficie celular, por lo que se vuelven de administración dirigidos específicos para las células que expresan antígeno en la superficie celular, tejidos u órganos. Un experto en la materia reconocerá que lograr este objetivo es una cuestión de (i) crear una secuencia de ácido nucleico que codifique una proteína de fusión entre una proteína de membrana externa putativa o predicha o una secuencia de localización de membrana externa y el dominio o los dominios de unión a Fc de la Proteína A o la Proteína G, (ii) producir y purificar minicélulas que expresan la proteína de fusión (también conocidas como minicélulas de unión a Fc), (iii) cargar minicélulas con un fármaco de molécula pequeña u otra carga útil bioactiva (no se requiere cuando las minicélulas encapsulan una combinación de carga útil o carga útil expresada de forma recombinante); por ejemplo, una toxina proteica o una toxina proteica y una combinación de ARNsh), (iv) incubar minicélulas con carga útil con el anticuerpo de direccionamiento u otro conjugado/fusión que contiene Fc para hacer minicélulas terapéuticas dirigidas, (v) lavar la preparación para eliminar el exceso de carga útil (cuando corresponda) y el anticuerpo o las moléculas de fusión/conjugada que contienen Fc, y (vi) preparar las minicélulas como una composición farmacéutica según la vía prevista de administración al paciente.

Las minicélulas bacterianas tienen distintas ventajas de carga de fármacos de imágenes y fármacos de moléculas pequeñas en comparación con otras tecnologías de administración. Similar a las células bacterianas desenergizadas, las minicélulas dirigidas pueden cargarse fácilmente con altas concentraciones de fármacos de molécula pequeña y agentes de imagen mediante una simple incubación de minicélulas purificadas con una alta concentración de fármaco de molécula pequeña o agente de imagen. De manera óptima, el fármaco o fármacos de molécula pequeña y/o el agente o agentes de imagen se incuban con minicélulas en un tampón de carga que carece de cualquier fuente de energía exógena para mantener el estado inactivo de las bombas de salida de múltiples fármacos conservadas. Las bombas de salida de múltiples fármacos dependen en gran medida de la fuerza motriz de protones (PMF) y los expertos en la técnica reconocen que la p Mf y, por lo tanto, las bombas de salida, dependen de una fuente de energía exógena. Por tanto, la carga de minicélulas en un búfer sin fuente de energía garantiza la inactividad del sistema o sistemas de bombeo de salida de las minicélulas y sirve para disminuir el flujo de salida de las minicélulas, incluso cuando las minicélulas cargadas con el fármaco se restauran a un medio que invierte el gradiente de concentración del fármaco ( es decir, medio sin fármaco). Las minicélulas dirigidas también se pueden usar para administrar dos o más fármacos de molécula pequeña o agentes de imagen de manera simultánea, de manera que se aborden varios objetivos intracelulares en un solo evento de administración. Además, las minicélulas dirigidas también se pueden usar para administrar uno o más fármacos de molécula pequeña en concierto con uno o más ácidos nucleicos terapéuticos.

La administración eficaz de moléculas pequeñas por medio de endocitosis mediada por receptor puede limitarse si la molécula o moléculas pequeñas liberadas están expuestas al ambiente hostil de los compartimentos endosómico o lisosómico durante demasiado tiempo antes de ser liberadas al citosol de la célula eucariótica objetivo. Por tanto, los expertos en la técnica apreciarán que el escape endosómico mejorado de moléculas pequeñas administradas por minicélulas dirigidas por esta vía puede ser deseable. Sin embargo, esto no siempre es necesario y puede estar sujeto a la discreción de los expertos en la técnica y también puede emplearse en la administración de otras cargas útiles dirigidas a minicélulas específicas, que incluyen, pero sin limitaciones, ácidos nucleicos, péptidos, proteínas y radionucleótidos y cualquier combinación de los anteriores. Los patógenos intracelulares se enfrentan al mismo problema y, como resultado, han desarrollado mecanismos sofisticados para modular el entorno del endosoma para que sea hospitalario o para que se escape completamente del endosoma. En el caso de este último, esto es normalmente mediado por un componente de proteína o complejo de proteína creado por el organismo invasor. Por ejemplo, la listeriolisina O (LLO; SEQ ID NO: 29) proteína de la bacteria patógena grampositiva intracelular Listeria monocytogenes se puede usar en los métodos y composiciones desvelados en el presente documento. La listeriolisina O es una proteína dependiente de colesterol y pH de 58 kilodalton codificada por el gen hlyA de Listeria monocytogenes que forma poros oligoméricos en la membrana endosómica, facilitando el escape del organismo invasor en el citosol de la célula infectada. En algunas realizaciones, se usa LLO de longitud completa (que contiene la secuencia de secreción de señal) como agente de rotura de la membrana endosómica. Como expertos en la técnica apreciarán que otras variantes útiles de LLO que se han descrito también pueden usarse en la presente solicitud. Por ejemplo, en la naturaleza, la secreción de LLO por Listeria monocytogenes (y otras especies de bacterias grampositivas) implica la escisión de la secuencia de secreción de señal de 24 aminoácidos por proteasas de membrana para formar LLO "madura". La eliminación de la señal de secreción de 24 aminoácidos de longitud de LLO mediante métodos recombinantes da como resultado el secuestro de LLO truncada (cLLO; SEQ ID NO 30) en el citosol bacteriano cuando se expresa. Aunque la cLLO no es secretada, mantiene todas las propiedades de la forma secretada, incluyendo su pH y la capacidad de formación de poros de la membrana endosomal dependiente del colesterol. En algunas realizaciones, la secuencia señal de LLO se elimina a nivel genético utilizando técnicas recombinantes conocidas en la técnica. Se ha demostrado que la LLO es una proteína lábil al calor que experimenta un cambio conformacional irreversible que anula la actividad a pH neutro y temperaturas superiores a 30 °C. La termoestabilidad de LLO puede aumentarse cuando se realiza una combinación de sustituciones de aminoácidos (E247M y D320K; SEQ ID NO 31). En algunas realizaciones, se utiliza una versión termoestable de LLO. Al dirigir la minicélula o minicélulas, la endocitosis mediada por receptores transporta la minicélula al endosoma. El ambiente hostil del endosoma comienza a degradar la minicélula engullida, coliberando la pequeña carga útil de la molécula junto con LLO. El componente de LLO liberada ayuda a facilitar la liberación de la molécula pequeña del endosoma al citosol, donde la molécula pequeña puede ejercer su efecto o efectos biológicos. Tal como se desvela en el presente documento, ciertas variantes estabilizadas a temperatura y degradación (sLLO) y estabilizadas con pH (independiente de pH; sLLOpH) de LLO (SEQ ID NO:32) pueden servir como carga útil del polipéptido terapéutico, así como un agente de rotura endosómica. Como se usa en el presente documento, la proteína listeriolisina O (LLO) incluye la LLO de longitud total, así como la LLO truncada (cLLO). Se han indicado varias mutaciones, que modulan la citotoxicidad de PFO, sin comprometer significativamente la actividad de rotura endosómica. PFO y dichas variantes mutacionales se pueden usar en lugar de LLO con el fin de romper la membrana endosómica.

Las minicélulas tienen distintos mecanismos y ventajas de cargar ácidos nucleicos terapéuticos y polipéptidos terapéuticos (por ejemplo, toxinas proteicas) en oposición a otras tecnologías de administración dirigida. Por ejemplo, las células parentales productoras de minicélulas pueden usarse para expresar/producir de forma recombinante una o más moléculas de ácido nucleico terapéutico y/o polipéptidos terapéuticos antes o al mismo tiempo que se producen las minicélulas. Se expresan ácidos nucleicos terapéuticos recombinantes y/o polipéptidos terapéuticos, se segregan y encapsulan en minicélulas, y luego se administran a las células eucariotas por minicélulas dirigidas in vivo o in vitro.

Los ejemplos de ácidos nucleicos terapéuticos expresados / producidos recombinantemente para ser administrados por minicélulas incluyen, aunque no de forma limitativa, molécula o moléculas de interferencia de ARN, o ribozima o ribozimas, ARN terapéutico de doble cadena (por ejemplo, ARNbc o ARNip), ARN terapéutico monocatenario (por ejemplo, ARNsh), aptámeros, ribozimas, plásmidos de expresión eucariótica que codifican polipéptidos o polipéptidos terapéuticos y/o ácidos nucleicos terapéuticos, y cualquier combinación de los anteriores. La expresión recombinante de ácidos nucleicos terapéuticos puede ser el resultado de la expresión de cualquiera de los diversos vectores de expresión procarióticos recombinantes episómicos conocidos en la técnica, que incluyen, pero sin limitación, plásmidos, cósmidos, fagemidos y cromosomas artificiales bacterianos (BAC), y cualquier combinación de los anteriores. La expresión recombinante también se puede lograr mediante un casete de expresión procariótico localizado en el cromosoma presente en una o más copias del cromosoma de la célula parental productor de minicélulas. En los casos en que la molécula o moléculas terapéuticas de ácido nucleico que deben administrarse ejerzan sus efectos terapéuticos a través de un mecanismo de acción de "silenciamiento génico", los ácidos nucleicos terapéuticos son específicos para una o más transcripciones de ARNm eucarióticas diferentes. Los ácidos nucleicos terapéuticos pueden administrarse mediante la misma minicélula, de manera que uno o más genes son silenciados por un solo evento de administración. Las minicélulas dirigidas también se utilizan para administrar cualquiera de estos ácidos nucleicos terapéuticos en combinación. Además, las minicélulas dirigidas se utilizan para administrar uno o más fármacos de molécula pequeña en concierto con uno o más ácidos nucleicos terapéuticos.

La administración eficaz de ácidos nucleicos terapéuticos mediante endocitosis mediada por receptor puede limitarse si el ácido o los ácidos nucleicos liberados están expuestos a la nucleasa y al entorno rico en proteasa del compartimento endosómico durante demasiado tiempo antes de ser liberados al citosol de la célula eucariótica diana. Por tanto, los expertos en la técnica apreciarán que el escape endosómio mejorado de los ácidos nucleicos terapéuticos administrados por esta vía puede ser deseable. Sin embargo, esto no siempre es necesario y se incluye a discreción del experto en la materia y también puede emplearse en la entrega de otras cargas útiles dirigidas a minicélulas específicas, que incluyen, pero sin limitación, moléculas pequeñas, péptidos, proteínas, y radionúclidos y cualquier combinación de los anteriores. Los patógenos intracelulares se enfrentan al mismo problema y, como resultado, han desarrollado mecanismos sofisticados para modular el entorno del endosoma para que sea hospitalario o para que se escape completamente del endosoma. En el caso de este último, esto es normalmente mediado por un componente de proteína o complejo de proteína creado por el organismo invasor. La listeriolisina O (LLO; SEQ ID NO: 29) la proteína de la bacteria patógena grampositiva intracelular Listeria monocytogenes es de interés y está incorporada en aquellas realizaciones de la presente solicitud que incluyen, pero no se limitan a, un componente terapéutico de carga útil de ácido nucleico. Cuando se expresa en una cepa bacteriana productora de minicélulas de unión a Fc que también expresa el ácido o ácidos nucleicos terapéuticos, la LLO se puede coencapsular con el ácido o ácidos nucleicos terapéuticos mediante las minicélulas de unión a FC que después se hacen competentes dirigidos mediante la adición de un anticuerpo o molécula de fusión/conjugado que contiene Fc a la superficie de las minicélulas de unión a Fc. Al dirigir la minicélula o minicélulas, la endocitosis mediada por receptores transporta la minicélula al endosoma. El ambiente hostil del endosoma comienza a degradar la minicélula engullida, coliberando la pequeña carga útil del ácido nucléico terapéutico junto con LLO. El componente de LLO liberado ayuda a facilitar la liberación del ácido nucleico terapéutico del endosoma en el citosol, donde el ácido nucleico puede ejercer su efecto o efectos biológicos.

En los casos en que la molécula o moléculas de ácido nucleico terapéutico está preformada por la célula parental mediante expresión recombinante de un casete de expresión procariótica (cromosómica o episomal en su ubicación) y luego se empaqueta dentro de las minicélulas como ARN bicatenarios ( por ejemplo, ARNip) o ARN monocatenarios capaces de plegarse sobre sí mismos para formar estructuras de horquilla (por ejemplo, ARNsh), la semivida del o los ARN terapéuticos dentro de la minicélula aumenta con el uso de cepas bacterianas productoras de minicélulas de unión a FC que albergan una deleción u otra mutación no funcional en los genes de ARNasa (por ejemplo, ARNasa III procariota) responsable para ladegradación de moléculas de ARN bicatenarios y/o en horquilla intracelulares. En ausencia de la ARNasa, las moléculas de ARN terapéutico se acumulan a un nivel más alto, de modo que aumentan la potencia de las minicélulas dirigidas que suministran las moléculas terapéuticas de ácido nucleico. En el caso de las cepas productoras de minicélulas de Escherichia coli, se introducen mutaciones o deleciones en el gen rnc, que codifica la única ARNasanI somática conocida en esta especie.

Los polipéptidos terapéuticos expresados / producidos de forma recombinante para su liberación por minicélulas dirigidas incluyen, pero no se limitan a las mismas, toxinas proteicas, citolisinas dependientes de colesterol, enzimas funcionales, caspasas activadas, procaspasas, citocinas, quimiocinas, péptidos que penetran en las células y cualquier combinación de los ejemplos anteriores. La expresión recombinante de uno o más polipéptidos terapéuticos puede ser el resultado de la expresión de cualquiera de los diversos vectores de expresión procarióticos recombinantes episómicos conocidos en la técnica, incluidos, pero sin limitaciones, plásmidos, cósmidos, fagemidos y cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y cualquier combinación de los ejemplos anteriores. De forma similar, la expresión recombinante se puede lograr mediante un casete de expresión procariótico localizado cromosómicamente presente en una o más copias del cromosoma de la célula madre productora de minicélulas. La liberación de toxinas proteicas utilizando las minicélulas dirigidas de la presente solicitud es un enfoque ventajoso en aplicaciones en las que es deseable la eliminación selectiva de células in vivo. Las toxinas proteicas que pueden facilitar la liberación endosómica de cargas útiles y/o funcionar como cargas tóxicas incluyen, aunque no de forma limitativa, los fragmentos A/B de la toxina diftérica, el fragmento A de la toxina diftérica, las toxinas LF y EF del ántrax, la toxina de la adenilato ciclasa, gelonina, botulinolisina B, botulinolisina E3, botulinolisina C, la toxina botulínica, la toxina del cólera, las toxinas A, B y alfa de clostrídium, ricina, la toxina A de shiga, la toxina A similar a shiga, la toxina A del cólera, la toxina S1 de pertussis, perfringolisina O, la exotoxina A de Pseudomonas, la toxina termolábil de E. coli (LTB), melitina, variantes estables al pH de la listeriolisina O (independiente del pH; sustitución de aminoácidos L461T), variantes termoestables de listeriolisina O (sustituciones de aminoácidos E247M, D320K), variantes estables al pH y termoestables de la listeriolisina O (sustituciones de aminoácidos E247M, D320K y L461T), estreptolisina O, estreptolisina O c, estreptolisina O e, esfericolisina, antrolisina O, cereolisina, thuringiensilisina O, weihenstefanensilisina, alveolisina, brevilisina, butiriculisina, tetanolisina O, novilisina, lectinolisina, neumolisina, mitilisina, pseudoneumolisina, suilisina, intermedilisina, ivanolisina, seeligeriolisina O, vaginolisina y pirolisina. Los polipéptidos terapéuticos pueden localizarse en diferentes compartimentos subcelulares de la minicélula a discreción de los expertos en la técnica. Cuando las minicélulas dirigidas desveladas en el presente documento derivan de una cepa parental gramnegativa productora de minicélulas, los polipéptidos terapéuticos expresados de forma recombinante producidos a partir de ellos pueden localizarse en el citosol, la capa interna de la membrana interna, la capa externa de la membrana interna, el periplasma, la capa interna de la membrana externa, la membrana externa de las minicélulas y cualquier combinación del procedimiento. Cuando las minicélulas dirigidas desveladas en el presente documento derivan de una cepa parental grampositiva productora de minicélulas, los polipéptidos terapéuticos expresados de forma recombinante producidos a partir de ellos pueden localizarse en el citosol, la pared celular, la capa interna de la membrana, la membrana de las minicélulas y cualquier combinación del procedimiento.

La liberación eficaz de polipéptidos terapéuticos por medio de endocitosis mediada por receptor puede limitarse si el o los polipéptidos liberados se exponen al entorno rico en proteasas del compartimento endosómico durante demasiado tiempo antes de ser liberados al citosol de la célula eucariota objetivo. De hecho, la mayoría de los polipéptidos terapéuticos no tienen capacidad intrínseca para escapar del compartimento endosómico, la excepción son las citolisinas/toxinas dependientes de colesterol (por ejemplo, LLO, perfringolisina O (PFO) y estreptolisina O (SLO)), así como el fragmento A/B de la toxina diftérica (escape mediado por el fragmento B), ricina y exotoxina A de Pseudomonas. Las toxinas proteicas que sí contienen propiedades de escape endosómico intrínsecas no requieren necesariamente la presencia a la vez de un componente separado de rotura endosómica en la minicélula objetivo para que sea eficaz, y la decisión de incluir un agente que rompe el endosoma queda a criterio de los expertos en la técnica. Otras toxinas proteicas, tales como gelonina y fragmento A de la toxina diftérica, no tienen capacidad intrínseca para escapar del compartimento endosómico. Por tanto, los expertos en la técnica reconocerían que es deseable un mejor escape endosómico de muchos polipéptidos terapéuticos diferentes liberados por la ruta endosómica. Tal como se ha descrito anteriormente, la proteína listeriolisina O (LLO) de la bacteria patógena grampositiva intracelular Listeria monocytogenes es de interés y está incorporada en las realizaciones de la presente solicitud que incluyen, pero no se limitan a los mismos, un componente de carga útil del polipéptido terapéutico u otra carga útil terapéutica que requiere escape endosómico para conferir mejor actividad. En algunas realizaciones, la llo DE LONGItuD COMPLETA (que contiene la secuencia de secreción señal) se usa como agente de ritura endosómica. En algunas realizaciones, la secuencia señal de LLO (que hace cLLO; SEQ ID NO: 30) se elimina a nivel genético utilizando técnicas recombinantes conocidas en la técnica y la cLLO se usa como el agente de rotura endosómica. En algunas realizaciones, se usan versiones termoestables y/o independientes de pH de LLO (que albergan mutaciones E247M, D320K y/o L461T, sLLOpH; SEQ ID NO: 31 y 32, respectivamente). Cuando se expresa en una cepa bacteriana productora de minicélulas de unión a Fc que también expresa polipéptido o polipéptidos terapéuticos, LLO (o cualquiera de las variantes de LLO u otros facilitadores de escape endosómico) pueden coencapsularse con el o los polipéptidos terapéuticos dentro de las minicélulas de unión a Fc, que posteriormente se convierten en competentes de direccionamiento mediante la adición de un anticuerpo y/o una molécula de direccionamiento de fusión/conjugado que contiene Fc a la superficie de las minicélulas de unión a Fc. Al dirigir la minicélula o minicélulas, la endocitosis mediada por receptores transporta la minicélula al endosoma. El ambiente hostil del endosoma comienza a degradar la minicélula engullida, liberando a la vez la carga útil terapéutica junto con el agente de rotura endosómica (por ejemplo, LLO, cualquiera de sus variantes u otro agente de rotura endosómica). El componente de agente de rotura endosómica liberado facilita a continuación la liberación de la carga útil terapéutica desde el endosoma al citosol donde la carga útil puede ejercer su efecto o efectos biológicos. Además de LLO, los agentes de rotura endosómica preferidos incluyen otras citolisinas, tales como PFO y SLO y derivados de las mismas, y fosfolipasas, tales como PI-PLC o PC-PLC.

En los casos en que el polipéptido o polipéptidos terapéuticos están preformados por la célula parental por medio de la expresión recombinante de un casete de expresión procariótica (ya sea en su ubicación cromosómica o episómical) y luego se empaquetan dentro de las minicélulas como la carga útil terapéutica, la semivida del polipéptido o polipéptidos terapéuticos dentro de la minicélula aumenta con el uso de cepas bacterianas productoras de minicélulas de unión a Fc que albergan una deleción u otra mutación no funcional en los genes de la proteasa (por ejemplo, la proteasa lon de E. coli) responsable de la proteolisis. En ausencia de la proteasa o proteasas, la molécula de polipéptido o polipéptidos terapéuticos se acumula a un nivel superior, aumentando la potencia de las minicélulas dirigidas que liberan las moléculas polipeptídicas terapéuticas. En el caso de las cepas productoras de minicélulas de Escherichia coli, se pueden introducir mutaciones o deleciones en una o más de los genes lon, tonB, abgA, ampA, ampM, pepP, clpP, dcp, ddpX/vanX, elaD,frvX, gcp/b3064, hslV, hchA/b1967, hyaD, hybD, hycH, hycl, iadA, ldcA, ycbZ, pepD, pepE, pepQ, pepT, pmbA, pqqL, prlC, ptrB, sgcX, sprT, tldD, ycaL, yeaZ, yegQ, ygeY, yggG, yhbO, yibG, ydpF, degS, ftsHMlB, glpG, hofD/hopD, lepB, lspA, pppA, sohB, spa, yaeL, yfbL, dacA, dacB, dacC, degP/htrA, degQ, iap, mepA, nlpC, pbpG, tsp, ptrA, teas, umuD, ydcP, ydgD, ydhO, yebA, yhbU, yhjJ y nlpD.

Además de usar como un fármaco de molécula pequeña dirigido y vehículos terapéuticos de ácido nucleico, las minicélulas desveladas en el presente documento también se pueden usar como vacunas de minicélulas dirigidas. Como se describe con mayor detalle a continuación, las minicélulas cargadas con la vacuna de antígeno proteico y/o ADN se dirigen directamente a las células presentadoras de antígeno del sistema inmunológico utilizando anticuerpos o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc que son específicas para los marcadores de superficie de células eucariotas expresados por células presentadoras de antígeno específicas. En algunas realizaciones, también puede ser deseable, pero no necesario, incluir LLO o una de sus variantes (descritas anteriormente) para facilitar la transferencia de antígeno o vacuna de ADN al citosol de células eucarióticas para promover la carga de MHC de clase I, lo que estimula la inmunidad celular. También puede ser deseable promover la carga de MHC de clase II para estimular la inmunidad humoral (mediada por anticuerpos) manteniendo antígenos dentro de los compartimentos endosómicos donde se produce la gran mayoría de la unión del MHC de clase II. Esto se puede lograr eliminando o disminuyendo el componente LLO de la vacuna de minicélulas dirigida. Además, las minicélulas de vacunas dirigidas están diseñadas para expresar o cargarse con adyuvante exógeno según lo considere apropiado el experto en la materia. Los adyuvantes pueden ser adyuvantes generales (tales como hemocianina de lapa californiana o adyuvante completo de Freud) o pueden ser adyuvantes moleculares dirigidos. Los adyuvantes moleculares dirigidos incluyen aquellos que son antagonistas o agonistas de los receptores de tipo Toll, así como otros constituyentes celulares que tienen propiedades inmunomoduladoras. Las vacunas dirigidas confieren inmunidad al receptor contra agentes de enfermedades infecciosas, incluidos, entre otros, los agentes de enfermedades infecciosas bacterianas, víricas y parasitarias. Las vacunas dirigidas también proporcionaron inmunidad al receptor contra tumores y otras enfermedades aberrantes de naturaleza autóloga.

Además de ser utilizadas como vehículos de liberación dirigida in vivo e in vitro, las minicélulas de unión a Fc desveladas en el presente documento también se utilizan como reactivos de detección de analitos para ensayos de diagnóstico, incluyendo, pero sin limitaciones, inmunoensayos de flujo lateral (LFIA). En algunas realizaciones, las minicélulas de unión a Fc de detección de analito pueden estar compuestas por (i) minicélulas de unión a Fc, (ii) un anticuerpo específico de analito u otra molécula de fusión/conjugado que contiene Fc específica de analito unida a las minicélulas que contienen Fc y (iii) un reactivo de detección que incluye, pero sin limitación, un fluoróforo de molécula pequeña, una proteína fluorescente, una enzima, una partícula magnética y oro coloidal en el que el reactivo de detección está encapsulado, expresado o asociado de otra manera con las minicélulas. En una permutación relacionada, las minicélulas de unión a Fc se utilizan como un reactivo de detección de lectura negativa para su uso en un LFIA competitivo. En algunas realizaciones, las minicélulas de unión a Fc de lectura negativa están compuestas por (i) minicélulas de unión a Fc, (ii) un conjugado/fusión de analito/Fc unido a las minicélulas que contienen Fc y (iii) un reactivo de detección que incluye, pero sin limitaciones, uun fluoróforo de molécula pequeña, una proteína fluorescente, una enzima, una partícula magnética y oro coloidal en el que el reactivo de detección está encapsulado, expresado o asociado de otra manera con las minicélulas. Las minicélulas se pueden usar como reactivos de detección en kits que se utilizan productos alimenticios clínicos, veterinarios, ambientales, sólidos y líquidos, productos farmacéuticos y agua potable para la presencia o ausencia de un analito relevante en solución. Los inmunoensayos de flujo lateral se construyen de modo que contengan (i) base del producto, (ii) una almohadilla de muestra, (iii) una almohadilla de conjugado de partículas, (iv) una membrana porosa (por ejemplo, nitrocelulosa), (v) una linea de prueba, (vi) una línea de control y (vii) un material de mecha. Los LFIA se utilizan como diagnósticos rápidos en el punto de atención, así como para uso en el hogar (por ejemplo, pruebas de embarazo) y varias pruebas de campo (por ejemplo, la determinación de los niveles de toxinas en el agua potable o el suelo). Los reactivos de detección de LFIA actualmente están limitados a conjugados de oro coloidal (10 nm), perlas de látex (coloreadas o fluorescentes); tamaños variables), y perlas cubiertas de látex paramagnético (coloreadas o fluorescentes; diferentes tamaños). Cada uno tiene sus limitaciones y la necesidad de nuevos y mejores reactivos de detección es un obstáculo clave en el campo en la actualidad. Los conjugados de oro coloidal están limitados por su sensibilidad y coste, las perlas de látex por su falta de sensibilidad y las perlas paramagnéticas de látex por su coste. Por tanto, hay una necesidad de una clase rentable y muy sensible de reactivos de detección basados en partículas en el campo de diagnóstico que permita ensayos más cuantitativos y fiables, y/o una reducción en el coste de fabricación. Debido a que las minicélulas se pueden cargar con una amplia variedad de diferentes modalidades de detección, incluyendo enzimas funcionales que pueden amplificar las señales de detección y aumentar la sensibilidad (no es una opción con las partículas de detección disponibles actualmente), ofrecen ventajas significativas sobre los sistemas de detección utilizados actualmente.

Para que las minicélulas seleccionadas sean utilizadas como agentes terapéuticos y de diagnóstico en seres humanos, las minicélulas deben contener pocos o ningún contaminante, tales como células bacterianas parentales viables. Los niveles de células contaminantes viables y otros contaminantes deben ser lo suficientemente bajos para no causar efectos secundarios adversos en los pacientes o interferir con la actividad de las minicélulas. La expresión inducible de un gen de endonucleasa doméstica, denominado mecanismo de suicidio genético, es un mecanismo preferido por el cual se eliminan las células parentales vivas contaminantes, especialmente cuando se usan en combinación con métodos de filtración convencionales. Debido a que las minicélulas derivan de algunas bacterias que son patogénicas o patogénicas oportunistas, es importante que cualquier célula parental contaminante se elimine funcionalmente de una población dada antes de la administración sistémica y, en particular, intravenosa. Como consecuencia, la formulación de minicélulas deseada sería una en la que el recuento de células parentales vivas residuales fuera tan bajo como sea posible, de modo que no cause efectos secundarios adversos o interfiera con la actividad deseada de las minicélulas. Para minimizar las preocupaciones de seguridad, las minicélulas desveladas en el presente documento derivan de cepas productoras de minicélulas que comprenden características de seguridad, por ejemplo, una o más de las tres características de seguridad desveladas a continuación. En algunas realizaciones, las cepas productoras de minicélulas comprenden al menos estas tres características de seguridad sinérgica. El primero es un mecanismo de suicidio genético que mata las células parentales vivas residuales sin lisarlas (y expulsar el lipopolisacárido libre) después de que se haya completado la etapa de formación de minicélulas. La presente solicitud incorpora el uso de un mecanismo de suicidio genético regulado que, al exponerse al inductor apropiado, introduce un daño irreparable a los cromosomas de las células parentales productoras de minicélulas, como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos número 20100112670, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. El mecanismo suicida opera introduciendo cortes irreparables en la doble carena del cromosoma de las células parentales y se utiliza como un complemento de las técnicas de separación convencionales para mejorar la purificación de las minicélulas. La segunda característica de seguridad es una auxotrofia definida, preferentemente, pero no necesariamente, en la ruta de biosíntesis del ácido diaminopimélico (DAP) y, más preferentemente, en el gen dapA de una cepa productora de minicélulas de E. coli. Las cepas productoras de minicélulas de E. coli que exhiben auxotrofia DAP (dapA-) no pueden sobrevivir fuera del laboratorio sin la suplementación de DAP. Además, DAP no se encuentra en mamíferos, incluidos los seres humanos, y como tal, cualquier célula parental productora de minicélulas que escape al mecanismo de suicidio genético no podrá sobrevivir en el medio ambiente o in vivo. Existen muchas variaciones sobre este tema para diferentes bacterias gramnegativas y grampositivas. Por ejemplo en Salmonella, spp., las auxotrofias en las vías de biosíntesis de aminoácidos aromáticos (los genes aro) producen, en efecto, el mismo resultado. En el caso de las auxotrofias de Shigella spp. en la ruta de la biosíntesis de guanina producirán, en efecto, el mismo resultado. La tercera característica de seguridad es opcional y conlleva una deleción del gen lpxM en cepas productoras de minicélulas de E. coli. La deleción del gen lpxM puede dar como resultado la producción de moléculas de lipopolisacáridos destoxificados (LPS). El gen lpxM (también conocido como el gen msbB) funciona añadiendo un grupo terminal de ácido miristólico a la porción del lípido A de la molécula de LPS y la eliminación de este grupo (mediante la eliminación del gen lpxM) da como resultado una marcada destoxificación de LPS. Específicamente, la destoxificación se caracteriza por una disminución en la producción de citocinas proinflamatorias en respuesta a la exposición al LPS. Esta deleción se puede introducir en cualquier gen funcionalmente equivalente de cualquier cepa gramnegativa o grampositiva productora de minicélulas para lograr el mismo efecto. El perfil de seguridad mejorado puede reducir el riesgo de infección y la posibilidad de desarrollar sepsis, disminuir la posibilidad de inversión genética a través de eventos de recombinación con otras bacterias y minimizar el riesgo de eventos de inserción en el huésped. Desde una perspectiva regulatoria y de fabricación, también se prefiere que los marcadores de resistencia a antibióticos se eliminen del cromosoma bacteriano de la cepa de células parentales productoras de minicélulas. El uso de la mayoría de los marcadores genéticos de resistencia a antibióticos en cepas de bacterias productoras de minicélulas es indeseable para cumplir los requisitos reglamentarios impuestos por la U.S. Food and Drug Administration (FDA) para su uso en seres humanos. La FDA solo tolerará el uso del marcador del gen de resistencia a kanamicina para fines de selección de bacterias o cepas de producción bacteriana en las que el producto final está destinado para su uso en seres humanos.

Tal como se describe en el presente documento, se puede hacer que las minicélulas eubacterianas que se unen a Fc sean competentes en el direccionamiento y liberen varias clases de carga útil bioactiva solas o combinadas en las que la preparación final de las minicélulas está compuesta por LPS destoxificado y está lo suficientemente desprovista de cualquier célula parental contaminante viable en virtud de los efectos combinados de un nuevo mecanismo de suicidio genético inducible utilizado junto con técnicas de separación convencionales.

Tal como se describe en el presente documento, las minicélulas bacterianas pueden usarse como agentes de administración in vivo terapéuticos, diagnósticos, teranósticos y de imagen. En algunas realizaciones, las minicélulas bacterianas están diseñadas para incorporar una carga útil bioactiva y, por medio de un nuevo mecanismo, mostrar fácilmente anticuerpos y/u otras fusiones/conjugados de direccionamiento molecular que contienen Fc en sus superficies que dirigen específicament la minicélula a los tipos de células involucrados en el inicio, promoción, apoyo y mantenimiento de la enfermedad en un animal. Algunas realizaciones proporcionan minicélulas que expresan y muestran la región de unión a Fc de la proteína G en la superficie de la minicélula, en la que la minicélula comprende además un anticuerpo y/o una molécula diana de fusión/conjugada que contiene Fc específica para un receptor de superficie celular eucariota unido por su región Fc a la parte de unión a Fc de la proteína G en la superficie de la minicélula en la que el anticuerpo y/o la fusión/conjugado que contiene Fc dirigido a la minicélula recubierta con la molécula comprende además una o más cargas útiles bioactivas que incluye, pero sin limitación, un fármaco de molécula pequeña, un ácido nucleico terapéutico, un radionúclido, un agente de imagen, una proteína y cualquier combinación de las cargas útiles bioactivas precedentes. Algunas realizaciones proporcionan minicélulas que expresan y muestran la región de unión a Fc de la proteína A en la superficie de la minicélula, en la que la minicélula comprende además un anticuerpo y/o una molécula de direccionamiento de fusión/conjugado que contiene Fc específico para un receptor de superficie celular eucariota, en el que el anticuerpo o molécula de direccionamiento de fusión/conjugado que contiene Fc está unido por su región Fc a la porción de unión a Fc de la Proteína A en la superficie de la minicélula, en la que el anticuerpo y/o la molécula de direccionamiento de fusión/conjugado que contiene el Fc comprende además una o más cargas bioactivas que incluyen, pero sin limitaciones, un fármaco de molécula pequeña, un ácido nucleico terapéutico, un radionúclido, un agente de imagen, una proteína y cualquier combinación de las cargas útiles bioactivas precedentes.

Algunas realizaciones proporcionan minicélulas que expresan y muestran la región de unión a Fc de la Proteína G en la superficie de la minicélula, en la que la minicélula comprende además un anticuerpo y/o molécula de direccionamiento de fusión/conjugado que contiene Fc específico para un receptor de superficie celular eucariota, en el que el anticuerpo o molécula de direccionamiento de fusión/conjugado que contiene Fc está unido por su región Fc a la porción de unión a Fc de la Proteína G en la superficie de la minicélula, en el que la minicélula recubierta con el anticuerpo y/o la molécula de direccionamiento de fusión/conjugado que contiene Fc comprende además una o más carga útiles bioactivas que incluyen, pero sin limitaciones, un fármaco de molécula pequeña, un ácido nucleico terapéutico, un radionúclido, un agente de imagen, una proteína y cualquier combinación de las cargas útiles bioactivas precedentes.

Tal como se describe en el presente documento, las minicélulas bacterianas se pueden usar como reactivos de detección de pruebas de diagnóstico. Dichos reactivos se pueden utilizar como reactivo de detección en una amplia variedad de tipos de productos de diagnóstico en el punto de atención/punto de necesidad incluyendo, pero sin limitaciones, inmunoensayos de flujo lateral. En algunas realizaciones, las minicélulas bacterianas pueden diseñarse para incorporar un reactivo de detección y mediante un enfoque novedoso, mostrar fácilmente anticuerpos y/o moléculas de direccionamiento de fusión/conjugado que contienen Fc en sus superficies que confieren especificidad del reactivo de detección de minicélulas para un analito en particular o una serie de analitos que se van a analizar. Algunas realizaciones proporcionan minicélulas que expresan y muestran la región de unión a Fc de la proteína A en la superficie de la minicélula, en la que la minicélula comprende además un anticuerpo específico para un receptor de la superficie de la célula eucariótica, en las que el anticuerpo o molécula de direccionamiento de fusión/conjugado que contiene Fc está unida por su región Fc a la porción de unión a Fc de la Proteína A en la superficie de la minicélula en la que el anticuerpo y/o la molécula de direccionamiento de fusión/conjugado que contiene Fc comprende además unao o más reactivos detectables, incluyendo, pero sin limitaciones, un fluoróforo de molécula pequeña, una o más partículas magnéticas, una o más partículas de oro coloidal, una enzima activa, una proteína fluorescente y cualquier combinación de los reactivos de detección anteriores.

Tal como se describe en el presente documento, las minicélulas bacterianas se pueden usar como reactivos de detección de pruebas de diagnóstico. Dichos reactivos se pueden utilizar como reactivo de detección en una amplia variedad de tipos de productos de diagnóstico en el punto de atención/punto de necesidad incluyendo, pero sin limitaciones, inmunoensayos de flujo lateral. En algunas realizaciones, las minicélulas bacterianas están diseñadas para incorporar un reactivo de detección y, mediante un enfoque novedoso, mostrar fácilmente anticuerpos y/o moléculas de direccionamiento de fusión/conjugado que contienen Fc en sus superficies que confieren especificidad del reactivo de detección de minicélulas para un analito en particular o una serie de analitos que se van a analizar. Algunas realizaciones proporcionan minicélulas que expresan y muestran la región de unión a Fc de la proteína G en la superficie de la minicélula, en la que la minicélula comprende además un anticuerpo específico para un receptor de superficie celular eucariótica, en el que el anticuerpo o la molécula de direccionamiento de fusión/conjugado que contiene Fc está unido por su región Fc a la porción de unión a Fc de la Proteína G en la superficie de la minicélula, en la que la minicélula recubierta por el anticuerpo y/o la molécula de direccionamiento de fusión/conjugado que contiene Fc comprende además uno o más reactivos detectables, incluyendo, pero sin limitaciones, un fluoróforo de molécula pequeña, una o más partículas magnéticas, una o más partículas de oro coloidal, una enzima activa, una proteína fluorescente y cualquier combinación de los reactivos de detección anteriores.

En algunas realizaciones preferentes, las minicélulas bacterianas se utilizan como vehículos de administración de moléculas bioactivas dirigidas in vivo. En algunas realizaciones, las minicélulas terapéuticas dirigidas comprenden una carga útil bioactiva (sinónimo de biológicamente activa) que tiene un efecto negativo y/o terapéutico en una célula que está involucrada en una enfermedad u otro proceso aberrante en un animal. En algunas realizaciones, la carga útil bioactiva incluye, pero sin limitaciones, fármacos de molécula pequeña, ácidos nucleicos bioactivos, proteínas bioactivas, radionúclidos bioactivos, agentes de imagen y lipopolisacáridos bioactivos, y cualquier combinación del procedimiento para producir un "efecto biológico" (sinónimo de respuesta biológica) que impacta negativamente a las células, tejidos, órganos enfermos o afecta de forma positiva a la producción de señales que mitigan indirectamente las células, tejidos u órganos enfermos en un animal. En algunas realizaciones, las minicélulas dirigidas tienen efectos biológicos que afectan negativamente a la enfermedad, incluido, aunque sin limitaciones, un efecto que destruye las células responsables del inicio, promoción o mantenimiento de la enfermedad; un efecto que impacta positivamente en la producción de señales que mitigan la enfermedad en un animal; un efecto que impacta negativamente en un proceso biológico responsable de la activación de la enfermedad en un animal; un efecto que provoca una respuesta inmune innata en un animal que afecta negativamente a la enfermedad y un efecto que provoca una respuesta adaptativa (humoral y/o celular) que afecta negativamente a la enfermedad en un animal, para tratar o prevenir una enfermedad en el animal. En algunas realizaciones, las minicélulas dirigidas tienen efectos biológicos que afectan de manera sinérgicamente negativa a la enfermedad en un animal al ejercer una combinación de cualquiera de los efectos biológicos mencionados anteriormente. En algunas realizaciones, el resto dirigido es un anticuerpo, derivado de anticuerpo que contiene Fc, y/o molécula de direccionamiento de fusión/conjugado que contiene Fc que se une a la región de unión a Fc de la Proteína A o la Proteína G que se expresa y se muestra en la superficie de las minicélulas en el contexto de un contiguo proteína de fusión contigua que comprende (i) una secuencia de exportación (secreción) de membrana externa (ii) una proteína de membrana externa o parte de anclaje a la membrana de la misma, y (iii) la o las porciones de unión a Fc de la proteína A o proteína G en la superficie de la minicélula. Las minicélulas que muestran la región o regiones de unión a Fc de la proteína A o la proteína G pueden unirse a los anticuerpos de longitud completa, derivados de anticuerpos que contienen Fc y/o moléculas de direccionamiento de fusión/conjugado que contienen Fc mediante la interacción con la región Fc de las moléculas. En algunas realizaciones, la porción o porciones de unión de la proteína A o la proteína G es parte de una proteína de fusión diseñada para expresarse y mostrarse en las superficies de las minicélulas. En algunas realizaciones, la porción o porciones de unión de la proteína A o la proteína G es una proteína de fusión con la proteína autotransportadora IgAP de Neisseria gonnorehae. En algunas realizaciones, la porción o porciones de unión de la Proteína A o la Proteína G es una fusión con una proteína de membrana externa putativa o predicha que se encuentra en bacterias gramnegativas como se describe con más detalle en el presente documento. En algunas realizaciones, la porción o porciones de unión de la Proteína A o la Proteína G es una fusión con el sistema de expresión de Lpp-OmpA que se describe en la patente de Estados Unidos 5,348,867 y se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad (SEQ ID NO.22 y SEQ ID ⁿ O:23, respectivamente). El anticuerpo, derivado de anticuerpo que contiene Fc, y/o molécula de direccionamiento de fusión/conjugado que contiene Fc en la superficie de las minicélulas pueden reconocer preferentemente, pero sin limitaciones, reconocer antígenos de superficie específicos de la célula, incluyendo a3p1 integrina, a4p1 integrina, a5p1 integrina, avp3 integrina, avpl integrina, p1 integrina, 5T4, CAIX, CD4, CD13, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD31, CD33, CD34, CD40, CD44v6, CD45, CD51, CD52, CD54, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD105, CD117, CD123, CD133, CD138, CD144, CD146, CD152, CD174, CD205, CD227, CD326, CD340, Cripto, ED-B, GD2, TMEFF2, VEGFR1, VEGFR2, FGFR, PDGFR, ANGPT1, TIE1, TIE2, NRP1, TEK (CD202B), TGFpR, receptor 5 de muerte (Trail-R2), DLL4, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6, FAP, GPNMB, ICAM, VCAM, PSMA, HER-2/neu, IL-13R alfa 2, MUC-1, MUC16, EGFR1 (HER-1), EGFR2 (HER-2/neu), EGFR3 (HER-3), IGF-1R, IGF-2R, c-Met (HGFR), Mesotelina, PDGFR, ED^g R, TAG-72, receptor de transferrina, EpCAM, CTLA-4, PSMA, tenascina C, alfafetoproteína, vimentina, al antígeno C242, T^rA ⁱL-R1, TRAIL-R2, CA-l25, GPNMB, CA-IX, gangliósido GD3, RANKL, BAFF, IL-6R, TAG-72, HAMA y CD166. En algunas realizaciones, se selecciona el resto de direccionamiento, en parte, debido a que la unión del resto de direccionamiento de anticuerpo mostrado en la superficie de la minicélula, los derivados de anticuerpo que contienen Fc y/o las moléculas de direccionamiento de fusión/conjugado que contienen Fc específicas para el antígeno inducen la intemalización de la minicélula dirigida, facilitando la liberación de la carga útil intracelular. Los anticuerpos específicos del objetivo descritos anteriormente que se utilizan como el componente de direccionamiento, en algunas realizaciones, incluyen, pero sin limitaciones, mAb 3F8, mAb CSL362, mAb CSL360, mAb J591, abagovomab, abciximab, adalimumab, afelimomab, afutuzumab, alacizumab, ALD518, alemtuzumab, altumomab, anatumomab, anrukinzumab, apolizumab, arcitumomab, aselizumab, atlizumab, atorolimumab, bapineuzmab, basiliximab, bavituximab, bectumomab, belimumab, benralizumab, bertilimumab, besilesomab, bevacizumab, biciromab, bivatuzumab, blinatumomab, brentuximab, briakinumab, canakinumab, cantuzumab, capromab, catumaxomab, CC49, cedelizumab, certolizumab, Cetuximab, mAb528, citatuzumab, cixutumumab, clenoliximab, clivatuzumab, conatumumab, CR6261, dacetuzumab, Daclizumab, daratumumab, denosumab, detumomab, dorlimomab, dorlixizumab, ecromeximab, eculizumab, edobacomab, edrecolomab, efalizumab, efungumab, elotuzumab, elsilimomab, enlimomab, epitumomab, epratuzumab, erlizumab, ertumaxomab, etaracizumab, exbivirumab, fanolesomab, faralimomab, farletuzumab, felvizumab, fezakinumab, figitumumab, fontolizumab, foravirumab, fresolimumab, galiximab, gantenerumab, gavilimomab, gemtuzumab, girentuximab, glembatumumab, golimumab, gomiliximab, ibalizumab, irbitumomab, igovomab, imciromab, infliximab, intetumumab, inolimomab, inotuzumab, ipilimumab, iratumumab, J591, keliximab, labetuzumab, lebrikizumab, lemalesomab, lerdelimumab, lexatumumab, libivirumab, lintuzumab, lorvotuzumab, lucatumumab, lumiliximab, mapatumumab, maslimomab, matuzumab, mepolizomab, metelimumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, morolimumab, motavizumab, muromonab, nacolomab, naptumomab, natalizumab, nebacumab, necitutumab, nerelimomab, nimotuzumab, nofetumomab, ocrelizumab, odulimomab, ofatumumab, olaratumab, omalizumab, oportuzumab, oregovomab, otelixizumab, pagibaximab, palivizumab, panitumumab, panobacumab, pascolizumab, pemtumomab, pertuzumab, pexelizumab, pintumomab, priliximab, pritumumab, PRO 140, rafivirumab, ramucirumab, ranibizumab, raxibacumab, regavirumab, resilizumab, rilotumumab, rituximab, robatumumab, rontalizumab, rovelizumab, ruplizumab, satumomab, sevirumab, sibrotuzumab, sifalimumab, siltuximab, siplizumab, solanezumab, sonepcizumab, sontuzumab, stamulumab, sulesomab, tacatuzumab, tadocizumab, talizumab, tanezumab, taplitumomab, tefibazumab, telimomab, tenatumomab, teplizumab, TGN1412, ticilimumab, tigatuzumab, TNX-650, tocilizumab, toralizumab, tositumomab, trastuzumab, tremelimumab, tucotuzumab, tuvirumab, urtoxazumab, ustekinumab, vapaliximab, vedolizumab, veltuzumab, vepalimomab, visilizumab, volociximab, votumumab, zalutumumab, zanolimumab, ziralimumab, zolimomab, y cualquier combinación de los anteriores.

En algunas realizaciones preferentes, las minicélulas terapéuticas dirigidas se utilizan como vehículos de administración de molécula pequeña dirigidas in vivo y se utilizan para prevenir, inhibir y/o limitar la progresión de la enfermedad en un animal. En algunas realizaciones, las minicélulas dirigidas (i) derivan de minicélulas de unión a Fc en las que las minicélulas de unión a Fc muestran la porción de unión a Fc de la proteína G en sus superficies, (ii) están cargadas con una o más especies de fármacos de molécula pequeña, (iii) comprenden además anticuerpos localizados en la superficie y/o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc que están unidas a la porción de unión a Fc de la región de unión a Fc mostrada en la superficie de la proteína G en el que los anticuerpos y/o las moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc que reconocen un antígeno de superficie específico de la célula eucariótica y son capaces de estimular la endocitosis mediada por el receptor tras la unión de la minicélula dirigida al antígeno de superficie específico de la célula eucariótica y (iv) comprenden además un vehículo farmacéuticamente aceptable para administración intravenosa. Las especies de fármaco o fármacos de molécula pequeña se seleccionan de, pero sin limitaciones, (1) agentes que dañan el ADN y agentes que inhiben la síntesis de ADN, tales como antracidinas (doxorubicina, daunorubicina, epirubicina), agentes alquilantes (bendamustina, busulfán, carboplatino, carmustina, cisplatino, clorambucilo, ciclofosfamida, dacarbazina, hexametilmelamina, ifosfamida, lomustina, mecloretamina, melfalán, mitotano, mitomicina, pipobromano, procarbazina, estreptozocina, tiotepa y trietilenemelamina), derivados de platino (cisplatino, carboplatino, cis diaminadicloroplatino), inhibidores de la telomerasa y topoisomerasa (Camptosar), (2) Agentes de unión a microtúbulos y tubulina, incluidos, pero sin limitaciones, taxanos y derivados de taxanos (paclitaxel, docetaxel, BAY 59-8862), (3) anti-metabolitos, tales como capecitabina, clorodeoxiadenosina, citarabina (y su forma activada, ara-CMP), arabinósido de citosina, dacarbazina, floxuridina, fludarabina, 5-fluorouracilo, 5-DFUR, gemcitabina, hidroxiurea, 6-mercaptopurina, metotrexato, pentostatina, trimetrexato y 6-tioguanina (4) antiangiogénicos (talidomida, sunitinib, lenalidomida), agentes de rotura vascular (flavonoides/flavonas, DMXAA, derivados de combretastatina, tales como CA4DP, ZD6126, AVE8062A, etc.), (5) terapia endocrina, tales como los inhibidores de la aromatasa (4-hidroandrostendiona, exemestano, aminoglutetimida, anastrozol, letrozol), (6) antiestrógenos (tamoxifeno, Toremifeno, raloxifeno, faslodex), esteroides, tales como dexametasona, (7) inmunomoduladores, tales como agonistas o antagonistas de los receptores tipo Toll, (8) inhibidores de las integrinas, otras proteínas de adhesión y metaloproteinasas de matriz), (9) inhibidores de histona desacetilasa, (10) inhibidores de la transducción de señal, tales como inhibidores de tirosina quinasas, tal como imatinib (Gleevec), (11) inhibidores de las proteínas del choque térmico, (12) retinoides, tales como ácido todo transretinoico, (13) inhibidores de los receptores del factor de crecimiento o los propios factores de crecimiento, (14) compuestos antimitóticos, tales como navelbina, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina, (15) antiinflamatorios, tales como inhibidores de la COX y (16) reguladores del ciclo celular, tales como los reguladores del punto de control y los inhibidores de la telomerasa, (17) inhibidores del factor de transcripción e inductores de la apoptosis, tales como inhibidores de Bcl-2, Bcl-x y XIAP, y cualquier combinación de los anteriores (1-17). El anticuerpo y/o las moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc en la superficie de las minicélulas pueden reconocer, preferentemente, pero sin limitaciones, antígenos de superficie específicos de la célula, incluyendo a3p1 integrina, a4p1 integrina, a5p1 integrina, avp3 integrina, avp1 integrina, p1 integrina, 5T4, CAIX, CD4, CD13, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD31, CD33, CD34, CD40, CD44v6, CD45, CD51, CD52, CD54, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD105, CD117, CD123, CD133, CD138, CD144, CD146, CD152, CD174, CD205, CD227, CD326, CD340, Cripto, ED-B, GD2, TMEFF2, VEGFR1, VEGFR2, FGFR, PDGFR, ANGPT1, TIE1, TIE2, NRP1, TEK (CD202B), TGFpR, receptor 5 de muerte (Trail-R2), DLL4, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6, FAP, GPNMB, ICAM, VCAM, PSMA, HER-2/neu, IL-13R alfa 2, MUC-1, MUC16, EGFR1 (HER-1), EGFR2 (HER-2/neu), EGFR3 (HER-3), IGF-1R, IGF-2R, c-Met (HGFR), Mesotelina, PDGFR, EDGR, TAG-72, receptor de transferrina, EpCAM, CTLA-4, PSMA, tenascina C, alfa-fetoproteína, vimentina, al antígeno C242, T^rA ⁱL-R1, TRAIL-R2, ^c A-125, GPNMB, CA-IX, gangliósido GD3, RANKL, BAFF, IL-6R, TAG-72, HAMA y CD166.

En algunas realizaciones preferentes, las minicélulas terapéuticas dirigidas se utilizan como vehículos de administración de molécula pequeña dirigidas in vivo y se utilizan para prevenir, inhibir y/o limitar la progresión de la enfermedad en un animal. En algunas realizaciones, las minicélulas dirigidas (i) derivan de minicélulas de unión a Fc en las que las minicélulas de unión a Fc muestran la porción de unión a Fc de la proteína A en sus superficies, (ii) están cargadas con una o más especies de fármacos de molécula pequeña, (iii) comprenden además anticuerpos localizados en la superficie y/o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc que están unidas a la parte de unión a Fc de la región de unión a Fc mostrada en la superficie de la Proteína A, en los que los anticuerpos y moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc reconocen un antígeno de superficie específico de células eucariotas y son capaces de estimular la endocitosis mediada por el receptor tras la unión de la minicélula objetivo al antígeno de superficie específico de células eucariotas y (iv) comprenden además un vehículo farmacéuticamente aceptable para administración intravenosa. La especie de fármaco o fármacos de molécula pequeña se seleccionan, pero sin limitaciones, (1) agentes que dañan el ADN y agentes que inhiben la síntesis de ADN, tales como antraciclinas (doxorrubicina, daunorubicina, epirubicina), agentes alquilantes (bendamustina, busulfán, carboplatino, carmustina, cisplatino, clorambucilo, ciclofosfamida, dacarbazina, hexametilmelamina, ifosfamida, lomustina, mecloretamina, melfalán, mitotano, mitomicina, pipobromano, procarbazina, estreptozocina, tiotepa y trietilenemelamina), derivados de platino (cisplatino, carboplatino, cis diaminadicloroplatino), inhibidores de la telomerasa y topoisomerasa (Camptosar), (2) Agentes de unión a microtúbulos y tubulina, incluidos, pero sin limitaciones, taxanos y derivados de taxanos (paclitaxel, docetaxel, BAY 59-8862), (3) anti-metabolitos, tales como capecitabina, clorodeoxiadenosina, citarabina (y su forma activada, ara-CMP), arabinósido de citosina, dacarbazina, floxuridina, fludarabina, 5-fluorouracilo, 5-DFUR, gemcitabina, hidroxiurea, 6-mercaptopurina, metotrexato, pentostatina, trimetrexato y 6-tioguanina (4) antiangiogénicos (talidomida, sunitinib, lenalidomida), agentes de rotura vascular (flavonoides/flavonas, DMXAA, derivados de combretastatina, tales como CA4DP, ZD6126, AVE8062A, etc.), (5) terapia endocrina, tales como los inhibidores de la aromatasa (4-hidroandrostendiona, exemestano, aminoglutetimida, anastrozol, letrozol), (6) antiestrógenos (tamoxifeno, Toremifeno, raloxifeno, faslodex), esteroides, tales como dexametasona, (7) inmunomoduladores, tales como agonistas o antagonistas de los receptores tipo Toll, (8) inhibidores de las integrinas, otras proteínas de adhesión y metaloproteinasas de matriz), (9) inhibidores de histona desacetilasa, (10) inhibidores de la transducción de señal, tales como inhibidores de tirosina quinasas, tal como imatinib (Gleevec), (11) inhibidores de las proteínas del choque térmico, (12) retinoides, tales como ácido todo transretinoico, (13) inhibidores de los receptores del factor de crecimiento o los propios factores de crecimiento, (14) compuestos antimitóticos, tales como navelbina, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina, (15) antiinflamatorios, tales como inhibidores de la COX y (16) reguladores del ciclo celular, tales como los reguladores del punto de control y los inhibidores de la telomerasa, (17) inhibidores del factor de transcripción e inductores de la apoptosis, tales como inhibidores de Bcl-2, Bcl-x y XIAP, y cualquier combinación de los anteriores (1-17). El anticuerpo y/o las moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc en la superficie de las minicélulas pueden reconocer, preferentemente, pero sin limitaciones, reconocer antígenos de superficie específicos de la célula, incluyendo a3p1 integrina, a4p1 integrina, a5p1 integrina, avp3 integrina, avp1 integrina, p1 integrina, 5T4, CAIX, CD4, CD13, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD31, CD33, CD34, CD40, CD44v6, CD45, CD51, CD52, CD54, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD105, CD117, CD123, CD133, CD138, CD144, CD146, CD152, CD174, CD205, CD227, CD326, CD340, Cripto, ED-B, GD2, TMEFF2, VEGFR1, VEGFR2, FGFR, PDGFR, ANGPT1, TIE1, TIE2, NRP1, TEK (CD202B), TGFpR, receptor 5 de muerte (Trail-R2), DLL4, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6, FAP, GPNMB, ICAM, VCAM, PSMA, HER-2/neu, IL-13R alfa 2, MUC-1, MUC16, EGFR1 (HER-1), EGFR2 (HER-2/neu), EGFR3 (HER-3), IGF-1R, IGF-2R, c-Met (HGFR), Mesotelina, PDGFR, EDGR, TAG-72, receptor de transferrina, EpCAM, C^t LA-4, PSMA, tenascina C, alfa-fetoproteína, vimentina, al antígeno C242, TRAIL-R1, TRAIL-R2, CA-125, GPNMB, CA-IX, gangliósido GD3, RANKL, BAFF, IL-6R, TAG-72, HAMA y CD166.

En algunas realizaciones preferentes, las minicélulas terapéuticas dirigidas se utilizan como vehículos terapéuticos dirigidos para la administración de ácidos nucleicos in vivo y se utilizan para prevenir, inhibir y/o limitar la progresión de la enfermedad en un animal. En algunas realizaciones, las minicélulas dirigidas (i) derivan de minicélulas de unión a Fc en las que las minicélulas de unión a Fc muestran la porción de unión a Fc de la proteína G en sus superficies, (ii) están cargados con una o más moléculas de ácido nucleico terapéutico, (iii) comprenden además anticuerpos localizados en la superficie y/o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc que están unidas a la porción de unión a Fc de la región de unión a Fc mostrada en la superficie de la proteína G en la que los anticuerpos y/o las moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc reconocen un antígeno de superficie específico de células eucariotas y son capaces de estimular la endocitosis mediada por el receptor tras la unión del minicelda objetivo al antígeno de superficie específico de células eucariotas, (iv) comprenden además un agente de rotura endosómica y (v) comprenden además un vehículo farmacéuticamente aceptable para administración intravenosa. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos terapéuticos que ejercen sus efectos a través del silenciamiento génico (ARNip y ARNsh o un plásmido de expresión de ADN eucariótico que codifica para el mismo) incluyen, pero sin limitaciones, comprender una o más secuencias de nucleótidos contiguas que tienen homología con secuencias de genes de tipo salvaje y/o a una o más secuencias contiguas que contienen mutaciones somáticas y de la línea germinal que se sabe que están involucradas en la enfermedad, tal como cáncer. Se prefiere que las secuencias de ácido nucleico terapéutico tengan veintidós (22) nucleótidos de homología con el gen diana de interés. Las moléculas terapéuticas de ácido nucleico pueden dirigirse contra los transcritos de ARNm de genes, incluyendo, entre otros, el receptor de andrógenos (AR), ABCB1/MDR1/PGY1 (P-glicoproteína; Pgp), CHK-1, HIF-1, Mcl-1, PDGFR, Tie-2, ABL1, ABL2, AKT2, ALK, BCL2, BCL3, BCL5, BCL6, BLC7A, BCL9, BCL10, BCL11A, BCL11B, Bcl-x, Bcr-Abl, BRAF, CCND1, CDK4, CHK-1, c-Met, c-myc, CTNNB1, DKC1, EGFR1, EGFR2, ERBB2, ERCC-1, EZH2, FES, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR-4, FLT1 (VEGFR1), FLT2, FLT3, FLT4, HER2, HER3, HRAS, IGFR, Interleucina 8 (IL-8), JAK, JAK2, KDR/Flk-1 (VEGFR-2), KIT, KRAS2, MET, MRP, mTOR, MYC, MYCL1, MYCN, NRAS, p53, PARP1, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PI3KCA, PPAR, Rad51, Rad52, Rad53, RalA, REL, RET, RRM1, RRM2, STAT3, survivina, telomerasa, TEP1, TERC, TERT, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, Wnt-1 y XIAP. El anticuerpo y/o las moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc en la superficie de las minicélulas pueden reconocer, preferentemente, pero sin limitaciones, reconocer antígenos de superficie específicos de la célula, incluyendo a3p1 integrina, a4p1 integrina, a5p1 integrina, avp3 integrina, avpl integrina, p1 integrina, 5T4, CAIX, CD4, CD13, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD31, CD33, CD34, CD40, CD44v6, CD45, CD51, CD52, CD54, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD105, CD117, CD123, CD133, CD138, CD144, CD146, CD152, CD174, CD205, CD227, CD326, CD340, Cripto, ED-B, GD2, TMEFF2, VEGFR1, VEGFR2, FGFR, PDGFR, ANGPT1, TIE1, TIE2, NRP1, TEK (CD202B), TGFpR, receptor 5 de muerte (Trail-R2), DLL4, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6, FAP, GPNMB, ICAM, VCAM, PSMA, HER-2/neu, IL-13R alfa 2, MUC-1, MUC16, EGFR1 (HER-1), EGFR2 (HER-2/neu), EGFR3 (HER-3), IGF-1R, IGF-2R, c-Met (HGFR), Mesotelina, PDGFR, EDGR, TAG-72, receptor de transferrina, EpCAM, CTLA-4, PSMA, tenascina C, alfa-fetoproteína, vimentina, al antígeno C242, TRAlL-R1, TRAIL-R2, ^c A-125, GPNMB, CA-IX, gangliósido GD3, RANKL, BAFF, IL-6R, TAG-72, HAMA y CD166.

En algunas realizaciones preferentes, las minicélulas terapéuticas dirigidas se utilizan como vehículos terapéuticos dirigidos para la administración de ácidos nucleicos in vivo y se utilizan para prevenir, inhibir y/o limitar la progresión de la enfermedad en un animal. En algunas realizaciones, las minicélulas dirigidas (i) derivan de minicélulas de unión a Fc en las que las minicélulas de unión a Fc muestran la porción de unión a Fc de la proteína A en sus superficies, (ii) están cargados con uno o más ácidos nucleicos terapéuticos, (iii) comprenden además anticuerpos localizados en la superficie y/o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc que están unidas a la porción de unión a Fc de la región de unión a Fc mostrada en la superficie de la proteína A en la que los anticuerpos y/o las moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc reconocen un antígeno de superficie específico de célula eucariota y son capaces de estimular la endocitosis mediada por receptores tras la unión de la minicélula dirigida al antígeno de superficie específico de células eucariotas, (iv) comprenden además un agente de rotura endosómica y (v) comprenden además un vehículo farmacéuticamente aceptable para administración intravenosa. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos terapéuticos que ejercen sus efectos a través del silenciamiento génico (ARNip y ARNsh o un plásmido de expresión de ADN eucariótico que codifica para el mismo) incluyen, pero sin limitaciones, comprender una o más secuencias de nucleótidos contiguas que tienen homología con secuencias de genes de tipo salvaje y/o a una o más secuencias contiguas que contienen mutaciones somáticas y de la línea germinal que se sabe que están involucradas en la enfermedad, tal como cáncer. Se prefiere que las secuencias de ácido nucleico terapéutico tengan veintidós (22) nucleótidos de homología con el gen diana de interés. Las moléculas terapéuticas de ácido nucleico pueden dirigirse contra los transcritos de ARNm de genes que incluyen, pero sin limitaciones, el receptor de andrógenos (AR), ABCB1/MDR1/PGY1 (P-glicoproteína; Pgp), Ch K-1, HiF-1, Mcl-1, PDGFR, Tie-2, ABL1, ABL2, AKT2, ALK, BCL2, BCL3, BCL5, BCL6, BLC7A, BCL9, BCL10, BCL11A, BCL11B, Bcl-x, Bcr-Abl, BRAF, CCND1, CDK4, CHK-1, c-Met, c-myc, CTNNB1, DKC1, EGFR1, EGFR2, ERBB2, ERCC-1, EZH2, FES, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR-4, FLT1 (VEGFR1), FLT2, FLT3, FLT4, HER2, HER3, HRAS, IGFR, Interleucina 8 (IL-8), JAK, JAK2, KDR/Flk-1 (VEGFR-2), KIT, KRAS2, MET, MRP, mTOR, MYC, MYCL1, MYCN, NRAS, p53, PARP1, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PI3KCA, PPAR, Rad51, Rad52, Rad53, RalA, REL, RET, RRM1, RRM2, STAT3, survivina, telomerasa, TEP1, TERC, TERT, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, Wnt-1 y XIAP. El anticuerpo y/o las moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc en la superficie de las minicélulas pueden reconocer, preferentemente, pero sin limitaciones, reconocer antígenos de superficie específicos de la célula, incluyendo a3p1 integrina, a4p1 integrina, a5p1 integrina, avp3 integrina, avpl integrina, p1 integrina, 5T4, CAIX, CD4, CD13, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD31, CD33, CD34, CD40, CD44v6, CD45, CD51, CD52, CD54, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD105, CD117, CD123, CD133, CD138, CD144, CD146, CD152, CD174, CD205, CD227, CD326, CD340, Cripto, ED-B, GD2, TMEFF2, VEGFR1, VEGFR2, FGFR, PDGFR, ANGPT1, TIE1, TIE2, NRP1, TEK (CD202B), TGFpR, receptor 5 de muerte (Trail-R2), DLL4, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6, FAP, GPNMB, ICAM, VCAM, PSMA, HER-2/neu, IL-13R alfa 2, MUC-1, MUC16, EGFR1 (HER-1), EGFR2 (HER-2/neu), EGFR3 (HER-3), IGF-1R, IGF-2R, c-Met (HGFR), Mesotelina, PDGFR, EDGR, TAG-72, receptor de transferrina, EpCAM, C^t LA-4, PSMA, tenascina C, alfa-fetoproteína, vimentina, al antígeno C242, TRAIL-R1, TRAIL-R2, CA-125, GPNMB, CA-IX, gangliósido GD3, RANKL, BAFF, IL-6R, TAG-72, HAMA y CD166.

En algunas realizaciones preferentes, las minicélulas terapéuticas dirigidas se utilizan como vehículos de liberación de polipéptidos terapéuticos dirigidos in vivo y se utilizan para prevenir, inhibir y/o limitar la progresión de la enfermedad en un animal. En algunas realizaciones, las minicélulas dirigidas (i) derivan de minicélulas de unión a Fc en las que las minicélulas de unión a Fc muestran la porción de unión a Fc de la proteína A en sus superficies, (ii) están cargadas con uno o más polipéptidos terapéuticos, (iii) comprenden además anticuerpos localizados en la superficie y/o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc que están unidas a la porción de unión a Fc de la región de unión a Fc mostrada en la superficie de la proteína A en la que los anticuerpos y/o las moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc reconocen un antígeno de superficie específico de célula eucariota y son capaces de estimular la endocitosis mediada por receptores tras la unión de la minicélula dirigida al antígeno de superficie específico de células eucariotas, (iv) comprenden además un agente de rotura endosómica y (v) comprenden además un vehículo farmacéuticamente aceptable para administración intravenosa. En algunas realizaciones, los polipéptidos terapéuticos que ejercen sus efectos a través de toxicidad celular (toxinas proteicas) incluyen, pero sin limitaciones, citolisinas dependientes de colesterol, toxinas de ribosilación de ADP, toxinas vegetales, toxinas bacterianas, toxinas víricas, toxinas formadoras de poros y péptidos que penetran en las células. Los polipéptidos terapéuticos pueden seleccionarse del grupo que incluye, pero sin limitaciones, gelonina, fragmento A de la toxina diftérica, fragmento A/B de la toxina diftérica, toxina del tétanos, toxina termolábil de E. coli (LTI y/o LTII), la toxina del cólera, toxina iota de C. perfringes, la exotoxina A de Pseudomonas, toxina shiga, toxina del ántrax, MTX (toxina mosquilicida de B. sphaericus), perfringolisina O, estreptolisina, toxina de la cebada, melitina, las toxinas LF y Ef del ántrax, la toxina de la adenilato ciclasa, botulinolisina B, botulinolisina E3, botulinolisina C, toxina botulínica A, la toxina del cólera, toxinas A, B, y alfa de Clostridium, ricina, la toxina A de shiga, la toxina A similar a shiga, la toxina A del cólera, la toxina S1 de pertussis, la toxina termolábil de E. coli (LTB), variantes estables al pH de la listeriolisina O (independiente del pH; sustitución de aminoácidos L461T), variantes termoestables de listeriolisina O (sustituciones de aminoácidos E247M, D320K), variantes estables al pH y termoestables de la listeriolisina O (sustituciones de aminoácidos E247M, D320K y L461T), estreptolisina O, estreptolisina O c, estreptolisina O e, esfericolisina, antrolisina O, cereolisina, thuringiensilisina O, weihenstefanensilisina, alveolisina, brevilisina, butiriculisina, tetanolisina O, novilisina, lectinolisina, neumolisina, mitilisina, pseudoneumolisina, suilisina, intermedilisina, ivanolisina, seeligeriolisina O, vaginolisina y pirolisina El anticuerpo y/o las moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc en la superficie de las minicélulas pueden reconocer, preferentemente, pero sin limitaciones,a ntígenos de superficie específicos de las células, incluidas a3p1 integrina, a4p1 integrina, a5p1 integrina, avp3 integrina, avpl integrina, p1 integrina, 5T4, CAIX, CD4, CD13, CD19, CD20, CD22, CD25, Cd3o, CD31, CD33, CD34, CD40, CD44v6, CD45, CD51, CD52, CD54, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD105, CD117, CD123, CD133, CD138, CD144, CD146, CD152, CD174, CD205, CD227, CD326, CD340, Cripto, ED-B, GD2, TMEFF2, VEGFR1, VEGFR2, FGFR, PDGFR, ANGPT1, TIE1, TIE2, NRP1, TEK (CD202B), TGFpR, receptor 5 de muerte (Trail-R2), DLL4, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6, FAP, GPNMB, ICAM, VCAM, PSMA, HER-2/neu, IL-13R alfa 2, MUC-1, MUC16, EGFR1 (HER-1), EGFR2 (HER-2/neu), EGFR3 (HER-3), IGF-1R, IGF-2R, c-Met (HGFR), Mesotelina, PDGFR, ED^g R, TAG-72, receptor de transferrina, EpCAM, CTLA-4, PSMA, tenascina C, alfafetoproteína, vimentina, al antígeno C242, TrA iL-R1, TRAIL-R2, CA-l25, GPNMB, CA-IX, gangliósido GD3, RANKL, BAFF, IL-6R, TAG-72, HAMA y CD166.

En algunas realizaciones preferentes, las minicélulas terapéuticas dirigidas se utilizan como vehículos de liberación de polipéptidos terapéuticos dirigidos in vivo y se utilizan para prevenir, inhibir y/o limitar la progresión de la enfermedad en un animal. En algunas realizaciones, las minicélulas dirigidas (i) derivan de minicélulas de unión a Fc en las que las minicélulas de unión a Fc muestran la porción de unión a Fc de la proteína G en sus superficies, (ii) están cargadas con uno o más polipéptidos terapéuticos, (iii) comprenden además anticuerpos localizados en la superficie y/o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc que están unidas a la porción de unión a Fc de la región de unión a Fc mostrada en la superficie de la proteína G en la que los anticuerpos y/o las moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc reconocen un antígeno de superficie específico de células eucariotas y son capaces de estimular la endocitosis mediada por el receptor tras la unión del minicelda objetivo al antígeno de superficie específico de células eucariotas, (iv) comprenden además un agente de rotura endosómica y (v) comprenden además un vehículo farmacéuticamente aceptable para administración intravenosa. En algunas realizaciones, los polipéptidos terapéuticos que ejercen sus efectos a través de toxicidad celular (toxinas proteicas) incluyen, pero sin limitaciones, citolisinas dependientes de colesterol, toxinas de ribosilación de ADP, toxinas vegetales, toxinas bacterianas, toxinas víricas, toxinas formadoras de poros y péptidos que penetran en las células. Los polipéptidos terapéuticos pueden seleccionarse del grupo que incluye, pero sin limitaciones, gelonina, fragmento A de la toxina diftérica, fragmento A/B de la toxina diftérica, toxina del tétanos, toxina termolábil de E. coli (LTI y/o LTII), la toxina del cólera, toxina iota de C. perfringes, la exotoxina A de Pseudomonas, toxina shiga, toxina del ántrax, MTX (toxina mosquilicida de B. sphaericus), perfringolisina O, estreptolisina, toxina de la cebada, melitina, las toxinas LF y EF del ántrax, la toxina de la adenilato ciclasa, botulinolisina B, botulinolisina E3, botulinolisina C, toxina botulínica A, la toxina del cólera, toxinas A, B, y alfa de Clostridium, ricina, la toxina A de shiga, la toxina A similar a shiga, la toxina A del cólera, la toxina S1 de pertussis, la toxina termolábil de E. coli (LTB), variantes estables al pH de la listeriolisina O (independiente del pH; sustitución de aminoácidos L461T), variantes termoestables de listeriolisina O (sustituciones de aminoácidos E247M, D320K), variantes estables al pH y termoestables de la listeriolisina O (sustituciones de aminoácidos E247M, D320K y L461T), estreptolisina O, estreptolisina O c, estreptolisina O e, esfericolisina, antrolisina O, cereolisina, thuringiensilisina O, weihenstefanensilisina, alveolisina, brevilisina, butiriculisina, tetanolisina O, novilisina, lectinolisina, neumolisina, mitilisina, pseudoneumolisina, suilisina, intermedilisina, ivanolisina, seeligeriolisina O, vaginolisina y pirolisina. El anticuerpo y/o la molécula de fusión/conjugado que contienen Fc en la superficie de las minicélulas pueden reconocer, preferentemente, pero sin limitaciones, antígenos de superficie específicos de la célula, incluyendo a3p1 integrina, a4p1 integrina, a5p1 integrina, avp3 integrina, avpl integrina, p1 integrina, 5T4, CAIX, CD4, CD13, CD19, CD20, CD22, CD25, C^d 3^o, CD31, CD33, CD34, CD40, CD44v6, CD45, CD51, CD52, CD54, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD105, CD117, CD123, CD133, CD138, CD144, CD146, CD152, CD174, CD205, CD227, CD326, CD340, Cripto, ED-B, GD2, TMEFF2, VEGFR1, VEGFR2, FGFR, PDGFR, ANGPT1, TIE1, TIE2, NRP1, TEK (CD202B), TGFpR, receptor 5 de muerte (Trail-R2), DLL4, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6, FAP, GPNMB, ICAM, VCAM, PSMA, HER-2/neu, IL-13R alfa 2, MUC-1, MUC16, EGFR1 (HER-1), EGFR2 (HER-2/neu), EGFR3 (HER-3), IGF-1R, IGF-2R, c-Met (HGFR), Mesotelina, PDGFR, ED^g R, TAG-72, receptor de transferrina, EpCAM, CTLA-4, PSMA, tenascina C, alfafetoproteína, vimentina, al antígeno C242, T^rA ⁱL-R1, TRAIL-R2, CA-l25, GPNMB, CA-IX, gangliósido GD3, RANKL, BAFF, IL-6R, TAG-72, HAMA y CD166.

En algunas realizaciones preferentes, las minicélulas de diagnóstico dirigidas se utilizan como agentes de imagen de diagnóstico in vivo y se utilizan para diagnosticar, detectar y/o controlar enfermedades en un animal. En algunas realizaciones, las minicélulas dirigidas (i) derivan de minicélulas de unión a Fc en las que las minicélulas de unión a Fc muestran la porción de unión a Fc de la proteína G en sus superficies, (ii) están cargadas con uno o más agentes de imagen molecular, (iii) comprenden además anticuerpos localizados en la superficie y/o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc que están unidas a la porción de unión a Fc de la región de unión a Fc mostrada en la superficie de la proteína G en la que los anticuerpos y/o las moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc reconocen un antígeno de superficie específico de células eucariotas y son capaces de estimular la endocitosis mediada por el receptor tras la unión de la minicélula objetivo al antígeno de superficie específico de células eucariotas y (iv) comprenden además un vehículo farmacéuticamente aceptable para administración intravenosa. El anticuerpo y/o la molécula o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc en la superficie de las minicélulas pueden reconocer, preferentemente, pero sin limitaciones, antígenos de superficie específicos de la célula, incluyendo a3p1 integrina, a4p1 integrina, a5p1 integrina, avp3 integrina, avpl integrina, p1 integrina, 5T4, CAIX, CD4, CD13, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD31, CD33, CD34, CD40, CD44v6, CD45, CD51, CD52, CD54, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD105, CD117, CD123, CD133, CD138, CD144, CD146, CD152, CD174, CD205, CD227, CD326, CD340, Cripto, ED-B, GD2, TMEFF2, VEGFR1, VEGFR2, FGFR, PDGFR, ANGPT1, TIE1, TIE2, NRP1, TEK (CD202B), TGFpR, receptor 5 de muerte (Trail-R2), DFF4, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6, FAP, GPNMB, ICAM, VCAM, PSMA, HER-2/neu, IL-13R alfa 2, MUC-1, MUC16, EGFR1 (HER-1), EGFR2 (HER-2/neu), EGFR3 (HER-3), IGF-1R, IGF-2R, c-Met (HGFR), Mesotelina, PDGFR, EDGR, TAG-72, receptor de transferrina, EpCAM, C^t FA-4, PSMA, tenascina C, alfa-fetoproteína, vimentina, al antígeno C242, TRAIL-R1, TRAIL-R2, CA-125, GPNMB, CA-IX, gangliósido GD3, RANKE, BAFF, IL-6R, TAG-72, HAMA y CD166.

En algunas realizaciones preferentes, las minicélulas de diagnóstico dirigidas se utilizan como agentes de imagen de diagnóstico in vivo y se utilizan para diagnosticar, detectar y/o controlar enfermedades en un animal. En algunas realizaciones, las minicélulas dirigidas (i) derivan de minicélulas de unión a Fc en las que las minicélulas de unión a Fc muestran la porción de unión a Fc de la proteína G en sus superficies, (ii) están cargadas con uno o más agentes de imagen molecular, (iii) comprenden además anticuerpos localizados en la superficie y/o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc que están unidas a la porción de unión a Fc de la región de unión a Fc mostrada en la superficie de la proteína G en la que los anticuerpos y/o las moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc reconocen un antígeno de superficie específico de células eucariotas y no estimulan la endocitosis mediada por el receptor tras la unión de la minicélula objetivo al antígeno de superficie específico de células eucariotas y (iv) comprenden además un vehículo farmacéuticamente aceptable para administración intravenosa. El anticuerpo y/o la molécula o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc en la superficie de las minicélulas pueden reconocer, preferentemente, pero sin limitaciones, antígenos de superficie específicos de la célula, incluyendo a3p1 integrina, a4p1 integrina, a5p1 integrina, avp3 integrina, avpl integrina, p1 integrina, 5T4, CAIX, CD4, CD13, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD31, CD33, CD34, CD40, CD44v6, CD45, CD51, CD52, CD54, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD105, CD117, CD123, CD133, CD138, CD144, CD146, CD152, CD174, CD205, CD227, CD326, CD340, Cripto, ED-B, GD2, TMEFF2, VEGFR1, VEGFR2, FGFR, PDGFR, ANGPT1, TIE1, TIE2, NRP1, TEK (CD202B), TGFpR, receptor 5 de muerte (Trail-R2), DLL4, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6, FAP, GPNMB, ICAM, VCAM, PSMA, HER-2/neu, IL-13R alfa 2, MUC-1, MUC16, EGFR1 (HER-1), EGFR2 (HER-2/neu), EGFR3 (HER-3), IGF-1R, IGF-2R, c-Met (HGFR), Mesotelina, PDGFR, EDGR, TAG-72, receptor de transferrina, EpCAM, C^t LA-4, PSMA, tenascina C, alfa-fetoproteína, vimentina, al antígeno C242, TRAIL-R1, TRAIL-R2, CA-125, GPNMB, CA-IX, gangliósido GD3, RANKL, BAFF, IL-6R, TAG-72, HAMA y CD166. Los ejemplos no limitantes de los agentes de imagen moleculares incluyen gadolinio, 64Cu diacetil-bis(N4-metiltiosemicarbazona), 18F-flourodesoxiglucosa, 18F-flúor, 3'-desoxi-3'-[l8]fluorotimidina, 18F-fluoromisonidazol, galio, tecnecio-99, talio, bario, gastrografina, agentes de contraste de yodo, óxido de hierro, la proteína verde fluorescente, luciferasa, beta-galactosidasa y cualquier combinación de las anteriores.

En algunas realizaciones preferentes, las minicélulas de diagnóstico dirigidas se utilizan como agentes de imagen de diagnóstico in vivo y se utilizan para diagnosticar, detectar y/o controlar enfermedades en un animal. En algunas realizaciones, las minicélulas dirigidas (i) derivan de minicélulas de unión a Fc en las que las minicélulas de unión a Fc muestran la porción de unión a Fc de la proteína A en sus superficies, (ii) están cargadas con uno o más agentes de imagen molecular, (iii) comprenden además anticuerpos localizados en la superficie y/o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc que están unidas a la parte de unión a Fc de la región de unión a Fc mostrada en la superficie de la Proteína A, en los que los anticuerpos y moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc reconocen un antígeno de superficie específico de células eucariotas y son capaces de estimular la endocitosis mediada por el receptor tras la unión de la minicélula objetivo al antígeno de superficie específico de células eucariotas y (iv) comprenden además un vehículo farmacéuticamente aceptable para administración intravenosa. El anticuerpo y/o la molécula o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc en la superficie de las minicélulas pueden reconocer, preferentemente, pero sin limitaciones, antígenos de superficie específicos de la célula, incluyendo a3p1 integrina, a4p1 integrina, a5p1 integrina, a^vp3 integrina, a^vpl integrina, p1 integrina, 5T4, CAIX, CD4, CD13, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD31, CD33, CD34, CD40, CD44v6, CD45, CD51, CD52, CD54, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD105, CD117, CD123, CD133, CD138, CD144, CD146, CD152, CD174, CD205, CD227, CD326, CD340, Cripto, ED-B, GD2, TMEFF2, VEGFR1, VEGFR2, FGFR, PDGFR, ANGPT1, TIE1, TIE2, NRP1, TEK (CD202B), TGFpR, receptor 5 de muerte (Trail-R2), DLL4, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6, FAP, GPNMB, ICAM, VCAM, PSMA, HER-2/neu, IL-13R alfa 2, MUC-1, MUC16, EGFR1 (HER-1), EGFR2 (HER-2/neu), EGFR3 (HER-3), IGF-1R, IGF-2R, c-Met (HGFR), Mesotelina, PDGFR, EDGR, TAG-72, receptor de transferrina, EpCAM, C^t LA-4, PSMA, tenascina C, alfa-fetoproteína, vimentina, al antígeno C242, TRAIL-R1, TRAIL-R2, CA-125, GPNMB, CA-IX, gangliósido GD3, RANKL, BAFF, IL-6R, TAG-72, HAMA y CD166.

Los ejemplos del agente de imagen molecular incluyen, aunque no de forma limitativa, gadolinio, 64Cu diacetil-bis(N4-metiltiosemicarbazona), 18F-flourodesoxiglucosa, 18F-flúor, 3'-desoxi-3'- [l8]fluorotimidina, 18F-fluoromisonidazol, galio, tecnecio-99, talio, bario, gastrografina, agentes de contraste de yodo, óxido de hierro, la proteína verde fluorescente, luciferasa, beta-galactosidasa y cualquier combinación de las anteriores.

En algunas realizaciones preferentes, las minicélulas terapéuticas dirigidas se utilizan como vacunas de minicélulas dirigidas contra agentes de enfermedades infecciosas in vivo, ex vivo y/o in vitro y se utilizan para prevenir, inhibir y/o ralentizar la progresión de los agentes de enfermedades infecciosas en un animal al generar una respuesta inmune del huésped animal receptor que afecta negativamente al agente de la enfermedad. En algunas realizaciones, las minicélulas dirigidas (i) derivan de minicélulas de unión a Fc en las que las minicélulas de unión a Fc muestran la porción de unión a Fc de la proteína G en sus superficies, (ii) están cargadas con uno o más carbohidratos antigénicos, antígenos proteicos y/o vacunas de ADN cualquiera de los cuales derivan de un agente infeccioso de la enfermedad (iii) comprenden además anticuerpos localizados en la superficie y/o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc que están unidas a la porción de unión a Fc de la región de unión a Fc mostrada en la superficie de la proteína A, en la que los anticuerpos y/o las moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc reconocen un antígeno de superficie específico de células presentadoras de antígeno eucarióticas y son capaces de estimular la endocitosis mediada por receptor tras la unión de la minicélula dirigida al antígeno de superficie específico de la célula presentadora de antígeno, (iv) comprenden además un agente de rotura endosómica, incluyendo, pero sin limitación, LLO, (v) comprenden además un adyuvante molecular general y/o dirigido, y (vi) comprenden además un vehículo farmacéuticamente aceptable para una vía de administración in vivo que incluye, pero sin limitaciones, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, oral y/o nasal. En algunas realizaciones, las vacunas de minicélulas dirigidas provocan respuestas inmunes humorales protectoras (mediadas por anticuerpos) y/o celulares (mediadas por linfocitos T citotóxicos) en un animal. En un aspecto, las respuestas inmunitarias protegen contra agentes de enfermedades infecciosas, incluidos, pero sin limitaciones, agentes bacterianos, víricos y parasitarios. En algunas realizaciones, el anticuerpo y/o la molécula o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc en la superficie de la vacuna de minicélulas reconocen, pero sin limitaciones, reconocer uno o más de CD11b, CD11c, DC-SIGN, CD8, DEC-205, CD105, Flt3, Flt3L, CD103, CD115, CD45, CX³CRI, CCR7, SIRPa, CD205, DCIR2, CD40, M-CSFR, F4/80, CD123 y CD68. En algunas realizaciones, el adyuvante molecular dirigido estimula TRL1, TRL2, TRL3, TRL4, TRL5, TRL6, TRL7, TRL8, TRL9, TRL10, M-CSFR, y cualquier combinación de los anteriores.

En algunas realizaciones preferentes, las minicélulas terapéuticas dirigidas se utilizan como vacunas de minicélulas dirigidas contra agentes de enfermedades infecciosas in vivo, ex vivo y/o in vitro y se utilizan para prevenir, inhibir y/o ralentizar la progresión de los agentes de enfermedades infecciosas en un animal al generar una respuesta inmune del huésped animal receptor que afecta negativamente al agente de la enfermedad. En esta realización preferida, las minicélulas dirigidas son (i) derivadas de minicélulas de unión a Fc en las que las minicélulas de unión a Fc muestran la porción de unión de Fc de la proteína A en sus superficies, (ii) están cargadas con uno o más carbohidratos antigénicos, antígenos proteicos y/o vacunas de ADN cualquiera de los cuales derivan de un agente infeccioso de la enfermedad (iii) comprenden además anticuerpos localizados en la superficie y/o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc que están unidas a la porción de unión a Fc de la región de unión a Fc mostrada en la superficie de la proteína A, en la que los anticuerpos y/o las moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc reconocen un antígeno de superficie específico de células presentadoras de antígeno eucarióticas y son capaces de estimular la endocitosis mediada por receptor tras la unión de la minicélula dirigida al antígeno de superficie específico de la célula presentadora de antígeno, (iv) comprenden además un agente de rotura endosómica, incluyendo, pero sin limitación, LLO, (v) comprenden además un adyuvante molecular general y/o dirigido, y (vi) comprenden además un vehículo farmacéuticamente aceptable para una vía de administración in vivo que incluye, pero sin limitaciones, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, oral y/o nasal. En algunas realizaciones, las vacunas de minicélulas dirigidas provocan respuestas inmunes humorales protectoras (mediadas por anticuerpos) y/o celulares (mediadas por linfocitos T citotóxicos) en un animal. En algunas realizaciones, las respuestas inmunitarias protegen contra agentes de enfermedades infecciosas, incluidos, pero sin limitaciones, agentes bacterianos, víricos y parasitarios. En algunas realizaciones, el anticuerpo y/o las moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc en la superficie de la vacuna de minicélulas reconocen, pero sin limitaciones, reconocer uno o más de CD11b, CD11c, DC-SIGN, CD8, DEC-205, CD105, Flt3, Flt3L, CD103, CD115, CD45, CX³CR1 , CCR7, SIRPa, CD205, DCIR2, CD40, M-CSFR, F4/80, CD123 y CD68. En algunas realizaciones, el adyuvante molecular dirigido estimula TRL1, TRL2, TRL3, TRL4, TRL5, TRL6, TRL7, TRL8, TRL9, TRL10, M-CSFR, y cualquier combinación de los anteriores.

En algunas realizaciones preferentes, las minicélulas terapéuticas dirigidas se utilizan como vacunas de minicélulas dirigidas contra tumores in vivo, ex vivo y/o in vitro y se utilizan para prevenir, inhibir y/o ralentizar la progresión de los tumores en un animal al generar una respuesta inmune del huésped del animal receptor que afecta negativamente al tumor o tumores. En esta realización preferida, las minicélulas dirigidas son (i) derivadas de minicélulas de unión a Fc en las que las minicélulas de unión a Fc muestran la porción de unión de Fc de la proteína G en sus superficies, (ii) están cargadas con uno o más carbohidratos antigénicos, antígenos proteicos y/o vacunas de ADN cualquiera de los cuales se derivan de una célula tumoral (iii) además comprenden anticuerpos localizados en la superficie y/o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc que están unidas a la porción de unión a Fc de la región de unión a Fc mostrada en la superficie de la proteína A en la que los anticuerpos y/o las moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc reconocen un antígeno de superficie específico de células presentadoras de antígenos eucarióticas y son capaces de estimular la endocitosis mediada por el receptor tras la unión de la minicélula objetivo al antígeno eucariótico de superficie específico de la célula presentadora de antígeno eucariótica, (iv) comprenden además un agente de rotura endosómica, incluyendo, pero sin limitaciones, cLLO, (v) comprenden además un adyuvante molecular general y/o dirigido, y (vi) comprenden además un vehículo farmacéuticamente aceptable para una vía de administración in vivo que incluye, pero sin limitaciones, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, oral y/o nasal. En algunas realizaciones, las vacunas de minicélulas dirigidas provocan respuestas inmunes humorales protectoras (mediadas por anticuerpos) y/o celulares (mediadas por linfocitos T citotóxicos) en un animal. En un aspecto, las respuestas inmunitarias protegen contra tumores malignos y/o benignos de origen autólogo. En algunas realizaciones, el anticuerpo y/o la molécula o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc en la superficie de la vacuna de minicélulas reconocen, pero sin limitaciones, reconocer uno o más de CD11b, CD11c, DC-SIGN, CD8, DEC-205, CD105, Flt3, Flt3L, CD103, CD115, CD45, CX³CR1 , CCR7, SIRPa, CD205, DCIR2, CD40, M-CSFR, F4/80, CD123 y CD68. En algunas realizaciones, el adyuvante molecular dirigido estimula TRL1, TRL2, TRL3, TRL4, TRL5, TRL6, TRL7, TRL8, TRL9, TRL10, M-CSFR, y cualquier combinación de los anteriores.

En algunas realizaciones preferentes, las minicélulas terapéuticas dirigidas se utilizan como vacunas de minicélulas dirigidas contra tumores in vivo, ex vivo y/o in vitro y se utilizan para prevenir, inhibir y/o ralentizar la progresión de los tumores en un animal al generar una respuesta inmune del huésped del animal receptor que afecta negativamente al tumor o tumores. En esta realización preferida, las minicélulas dirigidas son (i) derivadas de minicélulas de unión a Fc en las que las minicélulas de unión a Fc muestran la porción de unión de Fc de la proteína A en sus superficies, (ii) están cargadas con uno o más carbohidratos antigénicos, antígenos proteicos y/o vacunas de ADN cualquiera de los cuales se derivan de una célula tumoral (iii) comprenden además anticuerpos localizados en la superficie y/o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc que están unidas a la porción de unión a Fc de la región de unión a Fc mostrada en la superficie de la proteína A, en la que los anticuerpos y/o las moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc reconocen un antígeno de superficie específico de células presentadoras de antígeno eucarióticas y son capaces de estimular la endocitosis mediada por el receptor tras la unión de la minicélula objetivo al antígeno de superficie específico de células presentadoras de antígenos eucarióticas, (iv) comprenden además un agente de rotura endosómica, incluyendo, pero sin limitación, LLO, (v) comprenden además un adyuvante molecular general y/o dirigido, y (vi) comprenden además un vehículo farmacéuticamente aceptable para una vía de administración in vivo que incluye, pero sin limitaciones, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, oral y/o nasal. En algunas realizaciones, las vacunas de minicélulas dirigidas provocan respuestas inmunes humorales protectoras (mediadas por anticuerpos) y/o celulares (mediadas por linfocitos T citotóxicos) en un animal. En un aspecto, las respuestas inmunitarias protegen contra tumores malignos y/o benignos. En algunas realizaciones, el anticuerpo y/o la molécula o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc en la superficie de la vacuna de minicélulas reconocen, pero sin limitaciones, reconocer uno o más de CD11b, CD11c, DC-SIGN, CD8, DEC-205, CD105, Flt3, Flt3L, CD103, CD115, CD45, CX³CR1 , CCR7, SIRPa, CD205, DCIR2, CD40, M-CSFR, F4/80, CD123 y CD68. En algunas realizaciones, el adyuvante molecular dirigido estimula TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, M-CSFR, y cualquier combinación de los anteriores.

En algunas realizaciones preferentes, las minicélulas terapéuticas dirigidas se utilizan como vacunas de minicélulas dirigidas contra tumores in vivo, ex vivo y/o in vitro y se utilizan para prevenir, inhibir y/o ralentizar la progresión de los tumores en un animal al generar una respuesta inmune del huésped del animal receptor que afecta negativamente al tumor o tumores. En algunas realizaciones, las minicélulas dirigidas (i) derivan de minicélulas de unión a Fc en las que las minicélulas de unión a Fc muestran la porción de unión a Fc de la proteína G en sus superficies, (ii) están cargadas con uno o más carbohidratos antigénicos, los antígenos proteicos y/o las vacunas de ADN cualquiera de los cuales se derivan de una célula tumoral (iii) además comprenden anticuerpos localizados en la superficie y/o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc que están unidas a la porción de unión a Fc de la región de unión a Fc mostrada en la superficie de la proteína G, en la que los anticuerpos y/o las moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc reconocen un antígeno de superficie específico de células presentadoras de antígeno eucarióticas y son capaces de estimular la endocitosis mediada por el receptor tras la unión de la minicélula objetivo al antígeno de superficie específico de células presentadoras de antígenos eucarióticas, (iv) comprenden además un agente de rotura endosómica, incluyendo, pero sin limitación, LLO, (v) comprenden además un adyuvante molecular general y/o dirigido, y (vi) comprenden además un vehículo farmacéuticamente aceptable para una vía de administración in vivo que incluye, pero sin limitaciones, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, oral y/o nasal. En algunas realizaciones, las vacunas de minicélulas dirigidas provocan respuestas inmunes humorales protectoras (mediadas por anticuerpos) y/o celulares (mediadas por linfocitos T citotóxicos) en un animal. En un aspecto, las respuestas inmunitarias protegen contra tumores malignos y/o benignos. En algunas realizaciones, el anticuerpo y/o la molécula o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc en la superficie de la vacuna de minicélulas reconocen, pero sin limitaciones, reconocer uno o más de CD11b, CD11c, DC-SIGN, CD8, DEC-205, CD105, Flt3, Flt3L, CD103, CD115, CD45, CX3CR1 , CCR7, SIRPa, CD205, DCIR2, CD40, M-CSFR, F4/80, CD123 y CD68. En algunas realizaciones, el adyuvante molecular dirigido estimula TRL1, TRL2, TRL3, TRL4, TRL5, TRL6, TRL7, TRL8, TRL9, TRL10, M-CSFR, y cualquier combinación de los anteriores.

En algunas realizaciones preferentes, las minicélulas de unión a Fc descritas en el presente documento pueden usarse como reactivos de detección de analitos para ensayos de diagnóstico incluyendo, pero sin limitaciones, inmunoensayos de flujo lateral (LFIA). En algunas realizaciones, las minicélulas de unión a Fc que detectan analitos están compuestas por (i) minicélulas de unión a Fc que expresan y muestran la región de unión a Fc de la proteína A, (ii) un anticuerpo específico de analito u otra molécula de fusión/conjugada que contiene Fc específica de analito unida a las minicélulas que contienen Fc y (iii) un reactivo de detección que incluye, pero sin limitaciones, un fluoróforo de molécula pequeña, una proteína fluorescente, una enzima, una partícula magnética y oro coloidal en el que el reactivo de detección está encapsulado, expresado o asociado de otra manera con las minicélulas. En una permutación relacionada, las minicélulas de unión a Fc se utilizan como un reactivo de detección de lectura negativa para su uso en un LFIA competitivo. En algunas realizaciones, las minicélulas de unión a Fc de lectura negativa están compuestas por (i) minicélulas de unión a Fc, (ii) un conjugado/fusión de analito/Fc unido a las minicélulas que contienen Fc y (iii) un reactivo de detección que incluye, pero sin limitaciones, uun fluoróforo de molécula pequeña, una proteína fluorescente, una enzima, una partícula magnética y oro coloidal en el que el reactivo de detección está encapsulado, expresado o asociado de otra manera con las minicélulas. Las minicélulas se utilizan como reactivos de detección en los kits que se utilizan para analizar productos clínicos, veterinarios, ambientales y alimentarios líquidos y sólidos, productos farmacéuticos y agua potable para la presencia o ausencia de un analito relevante en solución. Los inmunoensayos de flujo lateral se construyen de modo que contengan (i) base del producto, (ii) una almohadilla de muestra, (iii) una almohadilla de conjugado de partículas, (iv) una membrana porosa (por ejemplo, nitrocelulosa), (v) una linea de prueba, (vi) una línea de control y (vii) un material de mecha. Los LFIA se utilizan como diagnósticos rápidos en el punto de atención, así como para uso en el hogar (por ejemplo, pruebas de embarazo) y varias pruebas de campo (por ejemplo, la determinación de los niveles de toxinas en el agua potable o el suelo). La base del producto se selecciona del grupo que incluye, pero sin limitaciones, poliestireno y/u otro polímero plástico, y se puede recubrir con adhesivo de pegado medio a alto según el criterio del experto. La almohadilla de muestra se selecciona de los tipos de materiales, incluidos, pero sin limitaciones, celulosa, fibra de vidrio, rayón, polipropileno y/u otros medios de filtración de uso común conocidos en la técnica y a discreción del experto. La almohadilla de conjugado de partículas se selecciona de los tipos de materiales que incluyen, pero sin limitaciones, fibra de vidrio, poliésteres, poliestireno, polipropileno, rayones y otros medios de filtración conocidos en la técnica a discreción del experto en la técnica. Además, el componente de la almohadilla de conjugado se puede "bloquear" mediante la adición mediante inmersión en una solución que contiene proteínas, polímeros, tensioactivos y cualquier combinación de los anteriores. La membrana de prueba analítica porosa se selecciona de los tipos de materiales que incluyen nitrocelulosa, nailon, fluoruro de polivinilideno (PVDF), matriz Fusion 5 (Whatman), matriz 4CastChip (Amic, Uppsala, Suecia), y cualquier combinación de los anteriores. Además, el componente de la membrana de prueba analítica porosa se puede "bloquear" mediante la adición mediante inmersión en una solución que contiene proteínas, polímeros, tensioactivos y cualquier combinación de los anteriores. El bloqueo de la membrana analítica porosa se produce después de incorporar las líneas de prueba y de control en la membrana analítica porosa. Las líneas de prueba y control se incorporan a la membrana analítica porosa mediante el uso de equipos de fabricación que incluyen, pero sin limitaciones, dispensadores de solenoide accionados por bomba sin contacto, dispensadores de punta de contacto, dispensadores cuantitativos de aerógrafo y cualquier combinación de los anteriores. Las tiras reactivas están compuestas por un anticuerpo u otro compañero de unión específico del analito de prueba que está covalentemente o no covalentemente unido a la membrana de prueba analítica porosa. Las tiras de control están compuestas por un anticuerpo u otro compañero de unión específico de la partícula de detección (por ejemplo, un anticuerpo antiminicelular) de manera que la partícula de detección (es decir, la minicélula) puede unirse por la tira de control independiente de la unión de la partícula de detección al analito de prueba. El componente de mecha puede seleccionarse de tipos de materiales que incluyen, pero sin limitaciones, celulosa de alta densidad. Muchos componentes de mecha son conocidos por el experto en la técnica y pueden usarse en el producto final a discreción del experto en la técnica. En la Figura 1 se representa una realización ilustrativa de un inmunoensayo de flujo lateral basado en minicélulas. En algunas realizaciones, las soluciones de prueba se adquieren o se preparan en solución líquida, aplicadas a la almohadilla de muestra, mezclar con el reactivo de detección de analito (minicélulas), y luego atravesar la membrana analítica porosa hacia la mecha. El reactivo de detección unido al analito se acumula en la línea de prueba positiva y puede detectarse utilizando cualquier número de métodos conocidos en la técnica, incluyendo fotométricos, cámara de dispositivo acoplado cargado, análisis fluorimétrico (por ejemplo, excitación LED), análisis radiométrico y mediante lector de ensayo magnético.

En algunas realizaciones preferentes, las minicélulas de unión a Fc descritas en el presente documento se utilizan como reactivos de detección de analitos para ensayos de diagnóstico, incluyendo, sin limitaciones, inmunoensayos de flujo lateral (LFIA). En algunas realizaciones, las minicélulas de unión a Fc que detectan el analito están compuestas por (i) minicélulas de unión a Fc que expresan y muestran la región de unión a Fc de la proteína G, (ii) un anticuerpo específico de analito u otra molécula de fusión/conjugada que contiene Fc específica de analito unida a las minicélulas que contienen Fc y (iii) un reactivo de detección que incluye, pero sin limitaciones, un fluoróforo de molécula pequeña, una proteína fluorescente, una enzima, una partícula magnética y oro coloidal en el que el reactivo de detección está encapsulado, expresado o asociado de otra manera con las minicélulas. En una permutación relacionada, las minicélulas de unión a Fc se utilizan como un reactivo de detección de lectura negativa para su uso en un LFIA competitivo. En algunas realizaciones, las minicélulas de unión a Fc de lectura negativa están compuestas por (i) minicélulas de unión a Fc, (ii) un conjugado/fusión de analito/Fc unido a las minicélulas que contienen Fc y (iii) un reactivo de detección que incluye, pero sin limitaciones, uun fluoróforo de molécula pequeña, una proteína fluorescente, una enzima, una partícula magnética y oro coloidal en el que el reactivo de detección está encapsulado, expresado o asociado de otra manera con las minicélulas. Las minicélulas se utilizan como reactivos de detección en los kits que se utilizan para analizar productos clínicos, veterinarios, ambientales y alimentarios líquidos y sólidos, productos farmacéuticos y agua potable para la presencia o ausencia de un analito relevante en solución. Los inmunoensayos de flujo lateral se construyen de modo que contengan (i) base del producto, (ii) una almohadilla de muestra, (iii) una almohadilla de conjugado de partículas, (iv) una membrana porosa (por ejemplo, nitrocelulosa), (v) una linea de prueba, (vi) una línea de control y (vii) un material de mecha. Los LFIA se utilizan como diagnósticos rápidos en el punto de atención, así como para uso en el hogar (por ejemplo, pruebas de embarazo) y varias pruebas de campo (por ejemplo, la determinación de los niveles de toxinas en el agua potable o el suelo). La base del producto se selecciona del grupo que incluye, pero sin limitaciones, poliestireno y/u otro polímero plástico, y se puede recubrir con adhesivo de pegado medio a alto según el criterio del experto. La almohadilla de muestra se selecciona de los tipos de materiales, incluidos, pero sin limitaciones, celulosa, fibra de vidrio, rayón, polipropileno y/u otros medios de filtración de uso común conocidos en la técnica y a discreción del experto. La almohadilla de conjugado de partículas se selecciona de los tipos de materiales que incluyen, pero sin limitaciones, fibra de vidrio, poliésteres, poliestireno, polipropileno, rayones y otros medios de filtración conocidos en la técnica a discreción del experto en la técnica. Además, el componente de la almohadilla de conjugado se puede "bloquear" mediante la adición mediante inmersión en una solución que contiene proteínas, polímeros, tensioactivos y cualquier combinación de los anteriores. La membrana de prueba analítica porosa se selecciona de los tipos de materiales que incluyen nitrocelulosa, nailon, fluoruro de polivinilideno (PVDF), matriz Fusion 5 (Whatman), matriz 4CastChip (Amic, Uppsala, Suecia), y cualquier combinación de los anteriores. Además, el componente de la membrana de prueba analítica porosa se puede "bloquear" mediante la adición mediante inmersión en una solución que contiene proteínas, polímeros, tensioactivos y cualquier combinación de los anteriores. El bloqueo de la membrana analítica porosa se produce después de incorporar las líneas de prueba y de control en la membrana analítica porosa. Las líneas de prueba y control se incorporan a la membrana analítica porosa mediante el uso de equipos de fabricación que incluyen, pero sin limitaciones, dispensadores de solenoide accionados por bomba sin contacto, dispensadores de punta de contacto, dispensadores cuantitativos de aerógrafo y cualquier combinación de los anteriores. Las tiras reactivas están compuestas por un anticuerpo u otro compañero de unión específico del analito de prueba que está covalentemente o no covalentemente unido a la membrana de prueba analítica porosa. Las tiras de control están compuestas por un anticuerpo u otro compañero de unión específico de la partícula de detección (por ejemplo, un anticuerpo antiminicelular) de manera que la partícula de detección (es decir, la minicélula) puede unirse por la tira de control independiente de la unión de la partícula de detección al analito de prueba. El componente de mecha puede seleccionarse de tipos de materiales que incluyen, pero sin limitaciones, celulosa de alta densidad. Muchos componentes de mecha son conocidos por el experto en la técnica y pueden usarse en el producto final a discreción del experto en la técnica. En la Figura 1 se muestra un diagrama completo de un inmunoensayo de flujo lateral basado en minicélulas. En algunas realizaciones, las soluciones de prueba se adquieren o se preparan en solución líquida, aplicadas a la almohadilla de muestra, mezclar con el reactivo de detección de analito (minicélulas), y luego atravesar la membrana analítica porosa hacia la mecha. El reactivo de detección unido al analito se acumula en la línea de prueba positiva y puede detectarse utilizando cualquier número de métodos conocidos en la técnica, incluyendo fotométricos, cámara de dispositivo acoplado cargado, análisis flourimétrico (por ejemplo, excitación LED), análisis radiométrico y mediante lector de ensayo magnético.

Una bacteria productora de minicélulas de unión a Fc puede comprender: (i) un gen expresable que codifica un producto génico productor de minicélulas que modula uno o más de la formación de tabique, fisión binaria y segregación de cromosomas; (ii) un gen de "suicidio genético" expresable que codifica una endonucleasa heteróloga, donde el cromosoma de la bacteria productora de minicélulas comprende uno o más sitios de reconocimiento de la endonucleasa; (iii) una auxotrofia definida; (iv) una deleción o mutación en el gen IpxM/msbB (u otro equivalente funcional); y (v) un casete de expresión recombinante capaz de la expresión funcional y la visualización de la superficie de la región de unión a Fc de la proteína G. En algunas realizaciones, el gen productor de minicélulas es un gen de división celular. El gen de división celular incluye, pero sin limitaciones, ftsZ, sulA, ccdB y sfiC. En algunas realizaciones, el gen productor de minicélulas se expresa bajo el control de un promotor inducible. En algunas realizaciones, el gen suicida de la endonucleasa se encuentra en el cromosoma de las bacterias productoras de minicélulas. En algunas realizaciones, la endonucleasa es una endonucleasa doméstica. La endonucleasa doméstica incluye, pero sin limitación, I-CeuI, Pl-SceI, I-ChuI, I-CpaI, 1-SceIII, I-CreI, I-MsoI, I-SceII, I-SceIV, I-CsmI, I-DmoI, I-PorI, PI-TliI, PI-TliII y PI-ScpI. En algunas realizaciones, la endonucleasa se expresa bajo el control de un promotor inducible. En algunas realizaciones, la auxotrofia se debe a una deleción o mutación inactivante en un gen metabólico esencial. En algunas realizaciones, la deleción o mutación inactivadora está en el gen dapA o su homólogo funcional. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélulas comprende además una deleción o una mutación inactivadora en un gen que codifica un producto génico que está involucrado en la síntesis de lipopolisacáridos, en el que el gen está genéticamente modificado en comparación con un gen de tipo salvaje correspondiente. En algunas realizaciones, el gen inactivado es IpxM/msbB, que codifica un producto génico que hace que las bacterias produzcan una molécula de lípido A alterada en comparación con las moléculas de lípido A en una bacteria de tipo salvaje correspondiente. En algunas realizaciones, la molécula de lípido A alterada es deficiente con respecto a la adición de ácido miristólico a la porción de lípido A de la molécula de lipopolisacárido en comparación con las moléculas de lípido A en una bacteria de tipo salvaje correspondiente. En algunas realizaciones, las bacterias productoras de minicélulas comprenden además una mutación por eliminación o inactivación en un gen que está involucrado en la recombinación homóloga, en el que el gen está genéticamente modificado en comparación con un gen de tipo salvaje correspondiente, en el que las bacterias productoras de minicélulas son deficientes en la reparación del daño del ADN. En algunas realizaciones, las bacterias productoras de minicélulas comprenden además una mutación o carecen del gen que codifica la ribonucleasa III (por ejemplo, el gen rnc de E. coli; degrada los ARN bicatenarios en E. coli) de modo que las minicélulas resultantes son deficientes en esta ribonucleasa, lo que aumenta la semivida de las moléculas de ARN bicatenario, incluyendo ARNip y ARNsh en minicélulas. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana productora de minicélulas comprende además una proteína cLLO recombinante de modo que las minicélulas resultantes comprenden además la proteína cLLO. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélulas de unión a Fc es una bacteria gramnegativa que incluye, entre otras, Campylobacter jejuni, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Brucella spp., Francisularla tularemia, Legionella pneumophilia, Neisseria meningitidis, Kliebsella, Yersinia spp., Helicobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae, Legionella pneumophila, Salmonella spp., Shigella spp., Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélulas de unión a Fc es una bacteria grampositiva que incluye, pero sin limitaciones, Staphylococcus spp., Lactobacillus spp., Streptococcus spp., Bacillus subtilis, Clostridium difficile y Bacillus cereus.

Una bacteria productora de minicélulas de unión a Fc puede comprender: (i) un gen expresable que codifica un producto génico productor de minicélulas que modula uno o más de la formación de tabique, fisión binaria y segregación de cromosomas; (ii) un gen de "suicidio genético" expresable que codifica una endonucleasa heteróloga, donde el cromosoma de la bacteria productora de minicélulas comprende uno o más sitios de reconocimiento de la endonucleasa; (iii) una auxotrofia definida; (iv) una deleción o mutación en el gen lpxM/msbB (u otro equivalente funcional); y (v) un casete de expresión recombinante capaz de la expresión funcional y la visualización de la superficie de la región de unión a Fc de la proteína A. En algunas realizaciones, el gen productor de minicélulas es un gen de división celular. El gen de división celular incluye, pero sin limitaciones, ftsZ, sulA, ccdB y sfiC. En algunas realizaciones, el gen productor de minicélulas se expresa bajo el control de un promotor inducible. En algunas realizaciones, el gen suicida de la endonucleasa se encuentra en el cromosoma de las bacterias productoras de minicélulas. En algunas realizaciones, la endonucleasa es una endonucleasa doméstica. La endonucleasa doméstica incluye, pero sin limitación, I-CeuI, Pl-SceI, I-ChuI, I-CpaI, I-SceIII, I-CreI, I-MsoI, I-SceII, I-SceIV, I-CsmI, I-DmoI, I-PorI, PI-TliI, PI-TliII y PI-ScpI. En algunas realizaciones, la endonucleasa se expresa bajo el control de un promotor inducible. En algunas realizaciones, la auxotrofia se debe a una deleción o mutación inactivante en un gen metabólico esencial. En algunas realizaciones, la deleción o mutación inactivadora está en el gen dapA o su homólogo funcional. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélulas comprende además una deleción o una mutación inactivadora en un gen que codifica un producto génico que está involucrado en la síntesis de lipopolisacáridos, en el que el gen está genéticamente modificado en comparación con un gen de tipo salvaje correspondiente. En algunas realizaciones, el gen inactivado es lpxM/msbB, que codifica un producto génico que hace que las bacterias produzcan una molécula de lípido A alterada en comparación con las moléculas de lípido A en una bacteria de tipo salvaje correspondiente. En algunas realizaciones, la molécula de lípido A alterada es deficiente con respecto a la adición de ácido miristólico a la porción de lípido A de la molécula de lipopolisacárido en comparación con las moléculas de lípido A en una bacteria de tipo salvaje correspondiente. En algunas realizaciones, las bacterias productoras de minicélulas comprenden además una mutación por eliminación o inactivación en un gen que está involucrado en la recombinación homóloga, en el que el gen está genéticamente modificado en comparación con un gen de tipo salvaje correspondiente, en el que las bacterias productoras de minicélulas son deficientes en la reparación del daño del ADN. En algunas realizaciones, las bacterias productoras de minicélulas comprenden además una mutación o carecen del gen que codifica la ribonucleasa III (por ejemplo, el gen rnc de E. coli; degrada los ARN bicatenarios en E. coli) de modo que las minicélulas resultantes son deficientes en esta ribonucleasa, lo que aumenta la semivida de las moléculas de ARN bicatenario, incluyendo ARNip y ARNsh en minicélulas. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana productora de minicélulas comprende además una proteína cLLO recombinante de modo que las minicélulas resultantes comprenden además la proteína cLLO. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélulas de unión a Fc es una bacteria gramnegativa que incluye, entre otras, Campylobacter jejuni, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Brucella spp., Francisularla tularemia, Legionella pneumophilia, Neisseria meningitidis, Kliebsella, Yersinia spp., Helicobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae, Legionella pneumophila, Salmonella spp., Shigella spp., Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélulas de unión a Fc es una bacteria grampositiva que incluye, pero sin limitaciones, Staphylococcus spp., Lactobacillus spp., Streptococcus spp., Bacillus subtilis, Clostridium difficile y Bacillus cereus.

Un método para fabricar minicélulas de unión a Fc puede comprender cultivar las bacterias productoras de minicélulas de unión a Fc desveladas en el presente documento y separar sustancialmente minicélulas de las células parentales productoras de minicélulas, generando de este modo una composición que comprende minicélulas de unión a Fc. En algunas realizaciones, el método comprende además inducir la formación de minicélulas a partir de la célula parental productora de minicélulas. En algunas realizaciones, el método comprende además inducir la expresión del gen que codifica la endonucleasa de suicido genético. En algunas realizaciones, la formación de minicélulas se induce por la presencia de uno o más compuestos químicos seleccionados de isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG), ramnosa, arabinosa, xilosa, fructosa, melibiosa y tetraciclina. En algunas realizaciones, la expresión del gen que codifica la endonucleasa del suicidio genético es inducida por un cambio en la temperatura. En algunas realizaciones, el método comprende además purificar las minicélulas de unión a Fc de la composición. En algunas realizaciones, las minicélulas se separan sustancialmente de las células parentales mediante un proceso seleccionado del grupo que incluye,pero sin limitaciones, centrifugación, filtración, ultrafiltración, ultracentrifugación, gradación de densidad, inmunoafinidad, inmunoprecipitación y cualquier combinación de los métodos de purificación anteriores.

Una minicélula eubacteriana puede comprender una membrana externa, en la que los constituyentes lipopolisacáridos de la membrana externa comprenden moléculas de lípido A que no tienen un resto de ácido miristólico ("lipopolisacárido destoxificado" o "LPS destoxificado"). El LPS destoxificado da como resultado la reducción de las respuestas inmunes proinflamatorias en un huésped mamífero en comparación con la respuesta inflamatoria inducida por la membrana externa de minicélulas eubacterianas que se derivan de una bacteria de tipo salvaje correspondiente.

En algunas realizaciones, la minicélula terapéutica dirigida comprende además uno o más compuestos biológicamente activos. En algunas realizaciones, al menos uno de los compuestos biológicamente activos se selecciona del grupo que consiste en un radioisótopo, un polipéptido, un ácido nucleico y un fármaco de molécula pequeña. El compuesto o compuestos biológicamente activos se seleccionan del grupo que incluye, pero sin limitaciones, ácidos nucleicos terapéuticos, fármaco(s) de molécula pequeña, profármaco(s), polipéptido(s) terapéutico(s), agente(s) de imagen de molécula pequeña, agente(s) de imagen basados en proteínas, un plásmido de expresión eucariota que codifica para uno o más agentes de imagen basados en proteínas, enzima o enzimas de conversión de profármaco y cualquier combinación de las anteriores. El compuesto biológicamente activo también puede ser una combinación de un ácido nucleico y una molécula pequeña; una combinación de un agente de imagen de molécula pequeña y un fármaco de molécula pequeña; una combinación de un fármaco de molécula pequeña, un agente de imagen de molécula pequeña y un ácido nucleico; o una combinación de un ácido nucleico y un polipéptido.

La presente solicitud describe una composición que comprende minicélulas eubacterianas de unión a Fc capaces de unirse y mostrar anticuerpos y/o moléculas de fusión/conjugado que contienen Fc para facilitar la liberación dirigida basado en minicélulas de varias clases de carga útil de bioactivo en combinación o en solitario, en el que la preparación final de las minicélulas dirigidas está lo suficientemente desprovista de células parentales contaminantes viables restantes. Las minicélulas pueden o no comprender además una forma destoxificada de lipopolisacárido a elección y discreción del experto.

1. Producción de minicélulas

Las minicélulas son nanopartículas biológicas acromosómicas encapsuladas en membrana (de aproximadamente 250-500 nm de diámetro según el tipo de cepa y las condiciones de crecimiento utilizadas) que son formadas por bacterias después de una interrupción en el aparato de división celular normal. Esencialmente, las minicélulas son pequeñas réplicas metabólicamente activas de células bacterianas normales con la excepción de que no contienen ADN cromosómico y, como tales, no se dividen y no son viables. Aunque las minicélulas no contienen ADN cromosómico, ADN plasmídico, ARN, se ha demostrado que las proteínas nativas y/o recombinantes y otros metabolitos se segregan en minicélulas.

Las interrupciones en la coordinación entre la replicación del cromosoma y la división celular conducen a la formación de minicélulas de la región polar de la mayoría de los procariotas en forma de bastón. La interrupción de la coordinación entre la replicación de cromosomas y la división celular se puede facilitar mediante la sobreexpresión de algunos de los genes implicados en la formación del tabique y la fisión binaria. Como alternativa, las minicélulas se pueden producir en cepas que albergan mutaciones en los genes implicados en la formación del tabique y la fisión binaria. Los mecanismos de segregación cromosómica alterados también pueden conducir a la formación de minicélulas, como se ha demostrado en muchos procariotas diferentes.

De manera similar, la producción de minicélulas se puede lograr mediante la sobreexpresión o mutación de los genes implicados en la segregación de los cromosomas nacientes en células hijas. Por ejemplo, se ha demostrado que las mutaciones en los loci parC o mukB de E. coli producen minicélulas. Ambos afectan a las etapas requeridas por separado en el proceso de segregación de cromosomas en Enterobacteríacea. Se puede suponer que, al igual que los genes de división celular descritos anteriormente, la manipulación de los niveles de tipo salvaje de cualquier gen dado involucrado en el proceso de segregación de cromosomas que da lugar a la producción de minicélulas tendrá efectos similares en otros miembros de la familia.

Debido a que la división celular y los procesos de replicación de cromosomas son tan críticos para la supervivencia, existe un alto nivel de conservación genética y funcional entre los miembros de la familia procarióticos con respecto a los genes responsables de estos procesos. Como resultado, la sobreexpresión o mutación de un gen de división celular capaz de impulsar la producción de minicélulas en un miembro de la familia, se pueden utilizar para producir minicélulas en otro. Por ejemplo, se ha demostrado que la sobreexpresión del gen de ftsZ de E. coli en otros miembros de la familia Enterobacteríacea, como Salmonella spp. y Shigella spp, así como otros miembros de la clase como Pseudomonas spp. dará como resultado niveles similares de producción de minicélulas.

Lo mismo se puede demostrar en las cepas productoras de minicélulas basadas en mutaciones de la familia Enterobacteriacea. Por ejemplo, la deleción del locus min en cualquiera de los miembros de la familia Enterobacteriacea da como resultado la producción de minicélulas. Los genes de división celular de las Enterobacteriacea en los cuales la mutación puede conducir a la formación de minicélulas incluyen, pero sin limitaciones, los genes min (MinCDE). Si bien es posible la producción de minicélulas a partir de las cepas mutantes min, estas cepas tienen un valor comercial limitado en términos de ser cepas de producción. La razón de esto es que las cepas con deleciones o mutaciones dentro de los genes min producen minicélulas a niveles constitutivamente bajos. Esto presenta dos problemas en términos de comercialización y economías de escala. La primera es que los rendimientos de minicélulas de estas cepas son bajos, lo que aumenta el coste de producción. La segunda es que los rendimientos de minicélulas son altamente variables con las cepas mutantes y la variabilidad de un lote a otro tiene un impacto enorme en el coste de producción, control de calidad de fabricación y cumplimiento normativo. El uso de cepas mutantes de la división celular para producir minicélulas que encapsulan moléculas biológicamente activas, tales como proteínas, ARN, ADN y otros catabolitos para la liberación diagnóstica o terapéutica son problemático. El inicio de la producción de minicélulas en las cepas mutantes no se puede controlar y ocurre a un nivel bajo, por lo que el resultado final es que algunas minicélulas no contendrán moléculas biológicamente activas, mientras que otras contendrán cantidades muy variables de moléculas biológicamente activas. Estas deficiencias, cuando se toman juntas o por separado, restringen en gran medida la utilidad de estas cepas mutantes con fines comerciales.

Las cepas productoras de minicélulas que sobreexpresan los genes de división celular ("sobreexpresores") se prefieren a las cepas basadas en mutaciones porque el fenotipo de producción de minicélulas es controlable siempre que los genes de división celular que se sobreexpresen se coloquen bajo el control de un sistema de promotor eubacteriano inducible u otro condicionalmente activo. La producción de minicélulas a partir de cepas que sobreexpresan el gen de división celular ftsZ fue descubierta por investigadores que identificaron genes de división celular esenciales en E. coli utilizando estudios de complementación basados en plásmidos. En estos estudios, el gen ftsZ estaba presente en más de 10 copias por célula. Se demostró que la presencia de múltiples copias genéticas de ftsZ produce minicélulas y células filamentosas extremadamente largas. En última instancia, esta transición al fenotipo filamentoso irreversible tiene un impacto negativo en los rendimientos de minicélulas de las cepas que sobreexpresan ftsZ de plásmidos de copia múltiple, aunque el número de minicélulas producidas es aún mayor que el de cualquier cepa mutante. Desde entonces, se ha demostrado que al reducir el número de copias del gen ftsZ a una sola, la duplicación cromosómica, el número de minicélulas producidas aumenta en las cepas en las que ftsZ se encuentra en plásmidos de copias múltiples y que el fenotipo filamentoso es menos profundo. Por tanto, la composición o composiciones preferidas son cepas productoras de minicélulas que sobreexpresan de forma inductiva el gen ftsZ de una copia duplicada cromosómicamente integrada de ftsZ. El gen ftsZ duplicado utilizado puede derivarse directamente de la especie de bacteria en la que se está diseñando el fenotipo de minicélulas y también puede derivarse de la secuencia del gen ftsZ de otras especies de bacterias. A modo de ejemplo no limitante, la sobreexpresión del gen ftsZ de Escherichia coli se puede usar para generar minicélulas a partir de Escherichia coli y Salmonella typhimuríum. Las cepas resultantes están compuestas por el gen ftsZ de tipo salvaje y una copia duplicada separada e inducible del gen ftsZ en el cromosoma y el mecanismo o mecanismos de suicidio genético inducible descritos en la publicación de patente de Estados Unidos n.° 2010/0112670, que se incorpora en el presente documento en su totalidad. A modo de ejemplo no limitante, los genes de división que se pueden sobreexpresar para producir minicélulas en la familia Enterobacteriaceae incluyen, pero sin limitaciones, ftsZ, minE, sulA, ccdB y sfiC. La composición preferida es tener una copia o copias duplicadas de uno o más genes de la división celular bajo el control de un promotor inducible que esté integrado de manera estable en el cromosoma de una cepa eubacteriana dada. Un experto en la técnica puede reconocer fácilmente que esta misma estrategia podría impartirse si el casete génico de división celular inducible estuviera presente en un plásmido, cósmido, cromosoma artificial bacteriano (BAC), bacteriófago recombinante u otra molécula de ADN episómico presente en la célula.

Este enfoque de fenotipo inducible para la producción de minicélulas tiene varias ventajas distintas sobre los sistemas mutantes. La primera es que debido a que no hay mutaciones genéticas constitutivas en estas cepas, no existe presión selectiva durante el crecimiento normal y las células del cultivo mantienen una fisiología muy estable y normal hasta que se induce el fenotipo de las minicélulas. El resultado final es que las cepas inducibles que producen minicélulas son más sanas y más estables, lo que finalmente da como resultado mayores rendimientos de minicélulas. Otra ventaja distintiva del uso del enfoque de fenotipo inducible para la producción de minicélulas está en los casos en que se deben usar minicélulas para administrar moléculas biológicamente activas, tales como proteínas, ARN terapéuticos, ADN plasmídicos y otros catabolitos bioactivos que pueden ser producidos por las células parentales productoras de minicélulas, de manera que las minicélulas que se producen encapsulan dichas moléculas biológicamente activas. En estos casos, el método preferido es inducir la formación de la molécula o moléculas biológicamente activas dentro de las células parentales antes de inducir el fenotipo de las minicélulas, de modo que todas las minicélulas producidas contendrán la cantidad deseada de la molécula o moléculas biológicamente activas. Como alternativa, las propias minicélulas son capaces de producir la molécula bioactiva después de ser separadas de las células parentales. Esto incluye, pero sin limitaciones, formar la molécula bioactiva a partir de un ácido nucleico episómico o ARN que codifica la molécula bioactiva localizada dentro de la minicélula o por los constituyentes proteicos preexistentes de las minicélulas después de separarse de las células parentales. Cualquiera de estas estrategias de expresión puede emplearse para expresar y mostrar restos de unión en las superficies de las minicélulas. Estas ventajas, cuando se usan en combinación, dan como resultado una mayor calidad y cantidad de minicélulas. Además, estas minicélulas pueden comprender además fármacos de molécula pequeña que pueden cargarse en minicélulas como se describe con más detalle a continuación.

2. Purificación de las minicélulas

Debido a que las minicélulas derivan de algunas bacterias que son patogénicas o patogénicas oportunistas, es de suma importancia que cualquier célula parental contaminante se elimine funcionalmente de una población dada antes de la administración. Convencionalmente, las células parentales vivas han sido eliminadas por medios físicos o biológicos o ambos.

Los medios físicos incluyen el uso de procedimientos de separación basados en centrifugación, metodologías de filtración, metodologías de cromatografía o cualquier combinación de los mismos.

La eliminación biológica se logra, pero sin limitaciones, mediante lisis preferencial de las células parentales, el uso de cepas parentales auxotróficas, tratamiento con antibióticos, tratamiento con radiación UV, privación de ácido diaminopimélico (DAP), adsorción selectiva de células parentales, tratamiento con otros agentes que dañan el ADN e inducción de un gen suicida.

La lisis preferencial de las células parentales suele estar mediada por la inducción del ciclo lítico de un profago lisogénico. En el caso de las cepas productoras de minicélulas, es más útil usar un profago que sea competente en lisis pero defectuoso en la reinfección, de manera que las minicélulas no se infectan y se lisan posteriormente durante la activación del fenotipo lítico. Como alternativa a modo de ejemplo no limitativo, los genes individuales, tales como los clasificados como miembros de la familia del gen holin, se pueden expresar para lograr niveles similares de lisis sin las preocupaciones sobre la reinfección inherente al uso de profagos lisogénicos. Ambos enfoques están limitados por el hecho de que el evento de lisis, independientemente del método utilizado para lograrlo, expulsa cantidades inaceptables de endotoxinas libres al medio. La eliminación de cantidades tan grandes de endotoxina libre lleva mucho tiempo, sufre variabilidad de un lote a otro y, en última instancia, tiene un coste prohibitivo.

El uso de cepas auxotróficas genera preocupación por la reversión y, como tal, solo se puede usar en casos en que las minicélulas se produzcan a partir de cepas de bacterias comensales o no patógenas. Por tanto, su aplicación es limitada con respecto al uso como método para la eliminación de células parentales no patógenas vivas utilizadas en la producción de minicélulas.

El uso de antibióticos puede ser beneficioso en la producción de minicélulas cuando se usa en muestras que se han enriquecido para minicélulas (por centrifugación diferencial o filtración preliminar, por ejemplo). Con muchas menos células parentales presentes, el potencial para el desarrollo de resistencia a los antibióticos se reduce a casi cero. El uso de antibióticos en cultivos primarios de producción de minicélulas que aún contienen altos números de células parentales viables no es deseable, ya que las posibilidades de desarrollar resistencia a los antibióticos aumentan proporcionalmente al número de células parentales viables.

El tratamiento con irradiación UV puede ser útil en la eliminación de células parentales vivas en una producción de minicélulas, con la excepción del hecho de que la irradiación UV es aleatoria con respecto a sus efectos sobre los ácidos nucleicos y los resultados son muy variables de un lote a otro. Además, este método no es preferido cuando se utilizan minicélulas para administrar ácidos nucleicos terapéuticos o profilácticos, ya que la radiación UV daña al azar a todos los ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN plasmídico también sería altamente susceptible al daño en el ADN producido por la radiación UV y podría volverse ineficaz aunque aún sea eficazmente liberado por minicélulas.

La privación de ácido diaminopimélico (DAP) puede ser útil en la eliminación de células parentales vivas, con la excepción de que este enfoque está limitado por el número de especies para las que se puede usar. En otras palabras, no todas las especies de células parentales capaces de producir minicélulas requieren DAP para sobrevivir. Los mutantes ^dA^p en cepas productoras de minicélulas de E. coli son de gran interés y, en algunos casos, son preferentes sobre el tipo salvaje. La ventaja de usar DAP es que este compuesto (ácido diaminopimélico, un constituyente de la pared celular de E. coli) es crítico para el crecimiento de E. coli y no está presente ni producido en animales. Por tanto, en caso de que se administre una célula parental productora de minicélulas de E. coli "viable" junto con minicélulas dirigidas, la célula parental no podrá crecer y, por lo tanto, será inerte para el animal y con respecto a la actividad de las minicélulas. Se puede utilizar un enfoque similar con cepas parentales productoras de minicélulas basadas en Salmonella spp., excepto en ese caso los genes aro, preferentemente se eliminan los aroB.

Las metodologías de adsorción selectiva aún no se han explorado con respecto a la purificación de minicélulas a partir de células parentales viables. La adsorción selectiva se define como cualquier proceso mediante el cual las células o minicélulas parentales se adsorben preferentemente a un sustrato en virtud de su afinidad por el sustrato. A modo de ejemplo no limitante, las interacciones proteína-proteína de alta afinidad podrían explotarse para este uso. A modo de ejemplo no limitante, la proteína de la membrana externa Invasina de la especie gramnegativa Yersinia pseudotuberculosis tiene una alta afinidad por las integrinas de mamíferos. El gen que codifica la invasina bajo el control de un promotor inducible podría introducirse fácilmente en el cromosoma de una cepa productora de minicélulas. Las minicélulas podrían producirse a partir de esta cepa antes de la activación de la expresión del gen de la invasina, de modo que las minicélulas producidas no expresen o muestren la invasina en su superficie celular. Una vez que la cantidad deseada de minicélulas se produce a partir de la cepa, a las células viables dentro del cultivo se les podría dar la señal para producir la proteína invasina de manera que la invasina solo se exprese y muestre sobre las células viables. Una vez que la invasina se expresa preferentemente en la superficie de las células parentales viables, se pueden adsorber fácilmente a un sustrato recubierto con integrinas u otros motivos de unión a proteínas específicos de invasina incrustados en un polipéptido sintético u otra proteína recombinante. Una vez absorbido, las minicélulas se pueden purificar selectivamente de las células parentales viables mediante una serie de medios diferentes que dependen del tipo de sustrato utilizado. Los sustratos incluyen, pero sin limitaciones, columnas cromatográficas en fase sólida utilizadas en aplicaciones de filtración por gravedad, perlas magnéticas, columnas de intercambio iónico o columnas de HPLC. Este enfoque está limitado por la desventaja de que ninguna interacción proteína-proteína individual funcionará para todas las especies de células parentales productoras de minicélulas. Por ejemplo, el enfoque de invasina-integrina descrito anteriormente sería útil para la mayoría de los miembros de la familia de las enterobacterias gramnegativas, pero no para el uso con minicélulas que producen miembros de la familia de las Bacillaceae grampositivas.

En algunas realizaciones, las minicélulas están sustancialmente separadas de las células parentales productoras de minicélulas en una composición que comprende minicélulas. Por ejemplo, tras la separación, la composición que comprende las minicélulas es inferior a aproximadamente el 99,9 %, 99,5 %, 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 %, 93 %, 92 %, 91 %, 90 %, 89 %, 88 %, 87 %, 86 %, 85 %, 84 %, 83 %, 82 %, 81 %, 80 %, 79 %, 78 %, 77 %, 76 %, 75 %, 74 %, 73 %, 72 %, 71 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 % o 30 % libre de células parentales productoras de minicélulas. En algunas realizaciones, la composición contiene menos de aproximadamente 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 % o 30 % de células parentales productoras de minicélulas.

Preferentemente, la composición final contiene pocas células parentales que contaminan lo suficiente, viables o no, para no ser demasiado tóxica o interferir con la actividad de las minicélulas dirigidas cuando se administra in vivo con fines terapéuticos.

Algún método preferido para eliminar suficientemente las células bacterianas parentales viables contaminantes es a través de la incorporación y activación de un mecanismo de suicidio genético inducible, incluyendo, pero sin limitaciones, la activación y expresión de una endonucleasa doméstica o equivalente funcional de la misma como se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos N.° 20100112670 antes de metodologías de separación física adicionales tales como técnicas de filtración estándar conocidas en la técnica.

3. Minicélulas de direccionamiento a células, tejidos y órganos específicos

Tras la producción, activación del mecanismo genético de suicidio y la posterior purificación, las minicélulas se utilizan como vehículos de liberación dirigidos. Las minicélulas que expresan la región de unión a Fc de la Proteína G o Proteína A y que además muestran anticuerpos, los derivados de anticuerpos que contienen Fc y/o las moléculas de direccionamiento de fusión/conjugado que contienen Fc en sus superficies se usan para dirigir a tipos de células específicos involucrados en la enfermedad in vivo para liberar de manera preferente sus cargas útiles bioactivas al tejido objetivo, órgano y tipo de célula.

Los anticuerpos, o cualquier porción de los mismos, destinados a ayudar en el direccionamiento de minicélulas a un tejido específico, órgano y el tipo de célula involucradas en la enfermedad pueden derivarse de o ser parte de cualquier subclase de inmunoglobulina, incluyendo, pero sin limitaciones, IgA, IgM, IgD, IgG, o IgE. Los anticuerpos de cualquier subclase destinados a facilitar la función de focalización de las minicélulas pueden ser "humanizados", aunque cualquier anticuerpo de cualquier subclase contra un antígeno específico de la célula se puede producir en cualquier animal que se sepa que genera respuestas de anticuerpos a través de la inmunidad adaptativa para lograr el mismo objetivo. En la naturaleza, los anticuerpos se generan de tal manera que contienen dos brazos separados (Fab), cada uno de los cuales reconoce el mismo epítopo de un antígeno particular.

En el laboratorio, los anticuerpos pueden diseñarse para que sean independientemente específicos para diferentes antígenos, de tal manera que un solo anticuerpo apunta a dos antígenos separados simultáneamente. A modo de ejemplo no limitante, los anticuerpos pueden diseñarse para reconocer los componentes putativos de la superficie de una minicélula eubacteriana dada (por ejemplo, antígenos LPS O) en un brazo y el otro brazo debe diseñarse para reconocer un antígeno de superficie específico de células eucarióticas, como los enumerados anteriormente. Adicionalmente, los expertos en la técnica reconocen fácilmente que se pueden implementar otros enfoques de anticuerpos biespecíficos para lograr el mismo efecto. A modo de ejemplo no limitante, un experto en la materia reconocería fácilmente que dos anticuerpos separados, con especificidades separadas, pueden unirse de forma no covalente al acoplarlos a la Proteína A/G para formar un derivado de anticuerpo "biespecífico" en bruto capaz de adherirse a la superficie de las minicélulas, en las que un anticuerpo dentro del complejo se adhiere específicamente a la superficie de la minicélula y el otro el anticuerpo se muestra para reconocer específicamente y, por lo tanto, "apuntar" a una célula específica, tejido, o tipo de órgano involucrado en la enfermedad in vivo. De manera similar, un experto en la materia reconocerá que dos anticuerpos separados, con especificidades separadas, podría unirse covalentemente utilizando diversas técnicas de reticulación para lograr el mismo efecto. Todos estos enfoques potenciales de focalización son reconocidos fácilmente por los expertos en la técnica.

En algunas realizaciones, se pueden usar otros enfoques de direccionamiento no basados en anticuerpos que se basan colectivamente en fusiones/conjugados que contienen Fc. Ejemplos de restos de direccionamiento molecular que pueden usarse, incluyen, pero sin limitaciones, a los ligandos del receptor, polipéptidos, hormonas, hidratos de carbono, aptámeros, moléculas similares a anticuerpos y DARPin. La conjugación con Fc se puede lograr utilizando varios enfoques conocidos en la técnica. En el caso de las fusiones de polipéptidos que contienen Fc, incluyen, pero sin limitaciones, fusiones de ligando del receptor/Fc, fusiones de péptidos que contienen Fc y DARPin que contienen Fc, la expresión recombinante de la fusión es el método de construcción preferido. En el contexto de la expresión recombinante, las regiones Fc pueden fusionarse con el extremo amino o carboxi de una fusión recombinante dada a discreción del experto, de modo que la fusión con la región Fc no afecte a la actividad del ligando con respecto a la unión al receptor y la estimulación de la endocitosis mediada por el receptor. Otro enfoque para hacer polipéptidos que contienen Fc, péptidos y DARPins es por conjugación química (también conocido como reticulación) de moléculas de la región Fc recombinantes purificadas a polipéptidos recombinantes, péptido y/o moléculas DARPin que utilizan cualquiera de las técnicas de reticulación bien conocidas en la técnica. En el contexto de la reticulación química, es ventajoso incluir grupos de aminoácidos "reactivos" en cualquiera o ambos de la región Fc recombinante purificada o el polipéptido, péptido y/o molécula DARPin a conjugar. Los aminoácidos reactivos normalmente incluyen, pero no se limitan a aquellos que contienen grupos sulfhidrilo, preferentemente un resto de cisteína. Para usar con reactivos de reticulación heterobifuncionales populares, es preferible incluir un residuo de lisina en el sitio de enlace del conjugado opuesto (por ejemplo, la región Fc contiene un residuo de cisteína mientras que el polipéptido contiene una lisina o viceversa). En los casos en que las regiones Fc recombinantes purificadas se reticulan con hormonas, hidratos de carbono, aptámeros y otras moléculas basadas en aminoácidos y/o péptidos, el experto en la materia reconocerá que se pueden emplear muchos otros reactivos de reticulación para lograr el mismo. Los reactivos de reticulación pueden ser "homobifuncionales" o "heterobifuncionales" (que tienen el mismo o diferentes grupos reactivos, respectivamente). Los ejemplos de reactivos de reticulación incluyen, aunque no de forma limitativa, los que figuran en la tabla 1. La Tabla 1 también ilustra qué reactivos de reticulación son apropiados y preferibles para cada tipo/enfoque de molécula conjugada. Al utilizar este enfoque, la construcción y administración de las minicélulas terapéuticas dirigidas se puede lograr (i) produciendo o comprando la región Fc recombinante, (ii) producir o comprar la molécula de direccionamiento para conjugarse con la región Fc, (iii) mezclar la región Fc recombinante con la molécula de direccionamiento en presencia del reactivo de reticulación apropiado (consulte la Tabla 1) e incubar la mezcla en condiciones que permitan que se produzca la reticulación, (iv) purificar los conjugados que contienen Fc resultantes de la mezcla de reacción, seguido de la cuantificación de los conjugados que contienen Fc, (v) incubar minicélulas que contienen carga útil con una cantidad de conjugado que contiene Fc suficiente para ocupar todos los sitios de unión a Fc en la superficie de las minicélulas en el tampón de unión apropiado, (vi) eliminar cualquier conjugado no unido por uno o más medios convencionales (por ejemplo, filtración de flujo tangencial), (vii) concentrar y/o liofilizar minicélulas terapéuticas dirigidas, (v) formular para la administración del producto las minicélulas terapéuticas diana mediante la reconstitución en un volumen apropiado de un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Las minicélulas descritas en el presente documento están diseñadas genéticamente para expresar y mostrar la región de unión a Fc de la proteína G o proteína A en sus superficies. Un método preferido para lograr la expresión y visualización en superficie de la región Fc de la Proteína G o Proteína A es mediante la fusión de la región de unión de Fc con una membrana externa de la familia de "autotransportadores". Los autotransportadores monoméricos que pertenecen al sistema de secreción de subclase de tipo 5 de autotransportadores (habitualmente clasificados como tipo 5a) son los más preferidos. Incluido en esa familia de autotransportadores clasificados como tipo 5a, es la proteasa IgA (IgAP) de Neisseria gonorrhoeae. El dominio pasajero autotransportador de IgAP se reemplaza fácilmente por la región de unión a Fc de la proteína G o proteína A. Se han mostrado y caracterizado varios fragmentos de anticuerpos diferentes y tipos de fragmentos de anticuerpos utilizando el sistema IgAP en E. coli, aunque este enfoque es completamente nuevo con respecto a su uso para expresar y mostrar la región de unión a Fc de la proteína G o la proteína A para producir minicélulas de unión a Fc. El autotransportador de adherencia involucrada en difusión difusa (AIDA-I) de E. coli también se puede usar para mostrar las regiones de unión a Fc de la proteína G o la proteína A. Una vez que las minicélulas de unión a Fc se unen al anticuerpo y o molécula de direccionamiento de fusión/conjugado que contiene Fc, se vuelven competentes para apuntar y son capaces de localizarse y acumularse preferentemente en tejidos diana, órganos o tipos de células.

Algunas realizaciones preferidas para mostrar la región Fc de la Proteína G o la Proteína A en la superficie de las minicélulas incluyen el uso de la fusión con Lpp-OmpA (SEC ID NO 22 y SEC ID NO: 23, respectivamente). OmpA es una proteína de membrana externa de Escherichia coli que cuando se fusiona con una secuencia líder de lipoproteínas y una proteína de exhibición de interés, se puede exportar a la superficie de E. coli. Debido a que las minicélulas de E. coli se derivan de E. coli parental, Las proteínas de fusión Lpp-OmpA también se localizarán en la superficie de las minicélulas. Varios fragmentos de anticuerpos y tipos de fragmentos de anticuerpos diferentes se han mostrado y caracterizado utilizando el sistema Lpp-OmpA en E. coli, aunque este enfoque es completamente nuevo con respecto a su uso para expresar y mostrar la región de unión a Fc de la proteína G o la proteína A para producir minicélulas de unión a Fc. Una vez que las minicélulas de unión a Fc se unen a la molécula que se dirige a la fusión/conjugado que contiene Fc y/o anticuerpo, se vuelven competentes para apuntar y son capaces de localizarse y acumularse preferentemente en tejidos diana, órganos o tipos de células.

Otras proteínas nativas de la membrana externa que se pueden usar como parejas de fusión para expresar y mostrar una o más de las regiones de unión a Fc de la Proteína G o Proteína A en la superficie de las minicélulas incluyen, entre otras, LamB, OmpF, OmpC, OmpD, PhoE, PAL, sistemas de secreción dl tipo III, proteínas del pilus, miembros de la familia de proteínas de autotransportadores bacterianos, y varias proteínas de flagelina. En general, el mismo enfoque podría usarse para expresar y mostrar una o más de las regiones de unión a Fc de la proteína G o la proteína A en la superficie de las minicélulas derivadas de cualquier miembro de la familia de Enterobacteriacea o Bacillaceae de modo que las minicélulas se conviertan en minicélulas de unión a Fc capaces de unirse adicionalmente a anticuerpos y/o moléculas de direccionamiento de fusión/conjugado que contienen Fc específicas para antígenos de superficie específicos de células eucarióticas, convirtiéndose así en minicélulas competentes para la detección de dianas capaces de localizarse y acumularse preferentemente en tejidos diana, órganos, o tipos de células implicadas en la enfermedad. Un experto en la materia reconocerá que lograr este objetivo es una cuestión de crear una secuencia de ácido nucleico que codifique una proteína de fusión entre una proteína de membrana externa putativa o predicha o una secuencia de localización de membrana externa y una o más de las regiones de unión a Fc de la proteína G o Proteína A.

Las minicélulas que se unen a Fc se unen a los anticuerpos y/o las moléculas de direccionamiento de fusión/conjugado que contienen Fc que son específicas para que los antígenos de superficie específicos de la célula se conviertan en minicélulas competentes para el direccionamiento. Las minicélulas competentes para el direccionamiento se cargan aún más con y/o expresan y encapsulan de forma recombinante una carga útil bioactiva que incluye, pero sin limitaciones, fármacos de molécula pequeña, ácidos nucleicos bioactivos, proteínas bioactivas, radionúclidos bioactivos, agentes de imagen, y cualquier combinación del procedimiento para producir un "efecto biológico" (sinónimo de respuesta biológica) que afecta negativamente a las células enfermas, tejidos, órganos o efectos positivos en la producción de señales que mitigan indirectamente la enfermedad, células, tejidos u órganos en un animal. Las minicélulas competentes para el direccionamiento se hacen para atacar los antígenos de superficie específicos de células eucariotas de elección, que incluyen, pero sin limitaciones, a3p1 integrina, a4p1 integrina, a5p1 integrina, avp3 integrina, avpl integrina, p1 integrina, 5T4, CAIX, CD4, CD13, cD l9, CD20, CD22, CD25, CD30, CD31, CD33, CD34, CD40, CD44v6, CD45, CD51, CD52, CD54, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD105, CD117, CD123, CD133, CD138, CD144, CD146, CD152, CD174, CD205, CD227, CD326, CD340, Cripto, ED-B, GD2, TMEFF2, VEGFR1, VEGFR2, FGFR, PDGFR, ANGPT1, TIE1, TIE2, NRP1, TEK (CD202B), TGFpR, receptor 5 de muerte (Trail-R2), DLL4, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6, FAP, GPNMB, ICAM, VCAM, PSMA, HER-2/neu, IL-13R alfa 2, MUC-1, MUC16, EGFR1 (HER-1), EGFR2 (HER-2/neu), EGFR3 (HER-3), IGF-1R, IGF-2R, c-Met (HGFR), Mesotelina, PDGFR, EDGR, ^tA^g -72, receptor de transferrina, EpCAM, C^t LA-4, PSMA, tenascina C, alfafetoproteína, vimentina, al antígeno C242, TRAIL-R1, TRAIL-R2, CA-125, G^p NMB, CA-IX, gangliósido GD3, RANKL, BAFF, IL-6R, TAG-72, HAMA y CD166. Los anticuerpos específicos del objetivo descritos anteriormente que se utilizan como el componente de direccionamiento, en algunas realizaciones, incluyen, pero sin limitaciones, mAb 3F8, mAb CSL362, mAb 360, mAb J591, abagovomab, abciximab, adalimumab, afelimomab, afutuzumab, alacizumab, ALD518, alemtuzumab, altumomab, anatumomab, anrukinzumab, apolizumab, arcitumomab, aselizumab, atlizumab, atorolimumab, bapineuzmab, basiliximab, bavituximab, bectumomab, belimumab, benralizumab, bertilimumab, besilesomab, bevacizumab, biciromab, bivatuzumab, blinatumomab, brentuximab, briakinumab, canakinumab, cantuzumab, capromab, catumaxomab, CC49, cedelizumab, certolizumab, Cetuximab, mAb528, citatuzumab, cixutumumab, clenoliximab, clivatuzumab, conatumumab, CR6261, dacetuzumab, Daclizumab, daratumumab, denosumab, detumomab, dorlimomab, dorlixizumab, ecromeximab, eculizumab, edobacomab, edrecolomab, efalizumab, efungumab, elotuzumab, elsilimomab, enlimomab, epitumomab, epratuzumab, erlizumab, ertumaxomab, etaracizumab, exbivirumab, fanolesomab, faralimomab, farletuzumab, felvizumab, fezakinumab, figitumumab, fontolizumab, foravirumab, fresolimumab, galiximab, gantenerumab, gavilimomab, gemtuzumab, girentuximab, glembatumumab, golimumab, gomiliximab, ibalizumab, irbitumomab, igovomab, imciromab, infliximab, intetumumab, inolimomab, inotuzumab, ipilimumab, iratumumab, J591, keliximab, labetuzumab, lebrikizumab, lemalesomab, lerdelimumab, lexatumumab, libivirumab, lintuzumab, lorvotuzumab, lucatumumab, lumiliximab, mapatumumab, maslimomab, matuzumab, mepolizomab, metelimumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, morolimumab, motavizumab, muromonab, nacolomab, naptumomab, natalizumab, nebacumab, necitutumab, nerelimomab, nimotuzumab, nofetumomab, ocrelizumab, odulimomab, ofatumumab, olaratumab, omalizumab, oportuzumab, oregovomab, otelixizumab, pagibaximab, palivizumab, panitumumab, panobacumab, pascolizumab, pemtumomab, pertuzumab, pexelizumab, pintumomab, priliximab, pritumumab, PROMO, rafivirumab, ramucirumab, ranibizumab, raxibacumab, regavirumab, resilizumab, rilotumumab, rituximab, robatumumab, rontalizumab, rovelizumab, ruplizumab, satumomab, sevirumab, sibrotuzumab, sifalimumab, siltuximab, siplizumab, solanezumab, sonepcizumab, sontuzumab, stamulumab, sulesomab, tacatuzumab, tadocizumab, talizumab, tanezumab, taplitumomab, tefibazumab, telimomab, tenatumomab, teplizumab, TGN1412, ticilimumab, tigatuzumab, TNX-650, tocilizumab, toralizumab, tositumomab, trastuzumab, tremelimumab, tucotuzumab, tuvirumab, urtoxazumab, ustekinumab, vapaliximab, vedolizumab, veltuzumab, vepalimomab, visilizumab, volociximab, votumumab, zalutumumab, zanolimumab, ziralimumab, zolimomab, y cualquier combinación de los anteriores.

4. Carga de cargas útiles en minicélulas

Las minicélulas eubacterianas son capaces de encapsular y administrar varias clases de compuestos biológicamente activos que tienen beneficios terapéuticos, profilácticos o diagnósticos para un animal. Los tipos de compuestos biológicamente activos (cargas útiles) que pueden ser administrados por minicélulas incluyen, pero sin limitaciones, moléculas pequeñas (incluyendo fármacos de molécula pequeña), ácidos nucleicos, polipéptidos, radioisótopo, lípidos, y cualquier combinación de los mismos.

Las moléculas pequeñas pueden incluir cualquier número de agentes terapéuticos actualmente conocidos y usados, o pueden ser moléculas pequeñas sintetizadas en una biblioteca de tales moléculas con el propósito de detectar funciones biológicas.

Algunas realizaciones se refieren a la inducción del fenotipo de producción de minicélulas a partir de una cepa productora de minicélulas eubacteriana optimizada de, pero sin limitación, la familia Enterobacteriaceae, de manera que pueda “cargarse" con una o más moléculas pequeñas que incluyen, entre otras, un fármaco, un profármaco o una hormona incorporada después de la purificación de las minicélulas de unión a Fc de las células parentales. Después de la producción de la cantidad deseada de minicélulas de unión a Fc "vacías" a partir de un cultivo y condición dados, la activación del mecanismo de suicidio genético se llevaría a cabo mediante la exposición del cultivo o las células a una señal conocida. Tras la purificación, las minicélulas de unión a Fc se “cargan” con la molécula o moléculas pequeñas mediante una simple incubación con una alta concentración de la molécula pequeña a una temperatura que oscila entre 4 °C y 65 °C. Más detalles sobre la carga de pequeñas moléculas, incluyendo muchos de los enumerados en el presente documento, se conocen en la materia.

Las moléculas pequeñas incluyen, sin limitación, compuestos orgánicos, peptidomiméticos y fusión/conjugados de los mismos. Como se usa en el presente documento, la expresión "compuesto orgánico" se refiere a cualquier compuesto a base de carbono distinto de los ácidos nucleicos y polipéptidos de las macromoléculas. Además del carbono, los compuestos orgánicos pueden contener calcio, cloro, flúor, cobre, hidrógeno, hierro, potasio, nitrógeno, oxígeno, azufre y otros elementos. Un compuesto orgánico puede estar en forma aromática o alifática. Ejemplos no limitantes de compuestos orgánicos incluyen acetonas, alcoholes, anilinas, hidratos de carbono, monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, aminoácidos, nucleósidos, nucleótidos, lípidos, retinoides, esteroides, proteoglicanos, cetonas, aldehídos, saturado, grasas insaturadas y poliinsaturadas, aceites y ceras, alquenos, ésteres, éteres, tioles, sulfuros, compuestos cíclicos, compuestos heterocíclicos, imidizoles, y fenoles. Un compuesto orgánico como se usa en el presente documento también incluye compuestos orgánicos nitrados y compuestos orgánicos halogenados (por ejemplo, clorados).

Las moléculas pequeñas pueden ser sintéticas, de origen natural y purificadas de una fuente natural. Ejemplos de pequeñas moléculas incluyen, aunque no de forma limitativa, fármacos de molécula pequeña, toxinas, radionúclidos, y agentes de imagen de molécula pequeña. Los tipos de fármacos de moléculas pequeñas incluyen aquellos que previenen, inhiben, estimulan, imitan o modifican un proceso biológico o bioquímico dentro de una célula, tipo de tejido, u órgano en beneficio de un animal que padece una enfermedad, ya sea somática, germinal, infecciosa o de otro tipo. Ejemplos de fármacos incluyen agentes quimioterapéuticos (fármacos contra el cáncer), antibióticos, antivíricos, antidepresivos, antihistamínicos, anticoagulantes, y cualquier otra clase o subclase de los mismos como se indica en el Physicians' Desk Reference. Las moléculas pequeñas también incluyen la clase de moléculas conocidas colectivamente como fluoróforos. Las minicélulas que encapsulan fluoróforos y muestran restos de diana específicos de la célula pueden usarse para obtener imágenes in vivo de los tipos de células, tejidos, órganos, o tumores en un animal. Los fluoróforos de molécula pequeña incluyen, pero sin limitaciones, DAPI, Cybr Gold, Cybr Green, bromuro de etidio, Alexa Flour, Texas Red, CfSe , y similares. Otros tipos de agentes de imagen molecular se seleccionan del grupo que incluye, pero sin limitaciones, gadolinio, 64Cu diacetil-bis(N4-metiltiosemicarbazona), 18F-flourodesoxiglucosa, 18F-flúor, 3'-desoxi-3'- [18]fluorotimidina, 18F-fluoromisonidazol, galio, tecnecio-99, talio, bario, gastrografina, agentes de contraste de yodo, óxido de hierro, la proteína verde fluorescente, luciferasa, betagalactosidasa y cualquier combinación de las anteriores.

Los agentes quimioterapéuticos de molécula pequeña pueden dirigirse y administrarse a los tejidos, células y órganos que utilizan minicélulas que muestran moléculas dirigidas. La expresión "agente quimioterapéutico" usado en el presente documento se refiere a agentes anticancerosos, anti-metastásicos, anti-angiogénicos y otros agentes antiproliferativos. En algunas realizaciones, un agente quimioterapéutico es un agente químico destinado a inhibir la proliferación o la destrucción de células. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen, aunque no de forma limitativa: (1) Agentes que dañan el ADN y agentes que inhiben la síntesis de ADN, como las antraciclinas (doxorrubicina, daunorubicina, epirubicina), agentes alquilantes (bendamustina, busulfán, carboplatino, carmustina, cisplatino, clorambucilo, ciclofosfamida, dacarbazina, hexametilmelamina, ifosfamida, lomustina, mecloretamina, melfalán, mitotano, mitomicina, pipobromano, procarbazina, estreptozocina, tiotepa y trietilenemelamina), derivados de platino (cisplatino, carboplatino, cis diaminadicloroplatino), inhibidores de la telomerasa y topoisomerasa (Camptosar), (2) Agentes de unión a microtúbulos y tubulina, incluidos, pero sin limitaciones, taxanos y derivados de taxanos (paclitaxel, docetaxel, BAY 59-8862), (3) antimetabolitos tales como capecitabina, clorodeoxiadenosina, citarabina (y su forma activada, ara-CMP), arabinósido de citosina, dacarbazina, floxuridina, fludarabina, 5-fluorouracilo, 5-DFUR, gemcitabina, hidroxiurea, 6-mercaptopurina, metotrexato, pentostatina, trimetrexato y 6-tioguanina (4) antiangiogénicos (talidomida, sunitinib, lenalidomida), agentes de rotura vascular (flavonoides/flavonas, DMXAA, derivados de combretastatina, tales como CA4DP, ZD6126, AVE8062A, etc.), (5) terapia endocrina, tales como los inhibidores de la aromatasa (4-hidroandrostendiona, exemestano, aminoglutetimida, anastrozol, letrozol), (6) antiestrógenos (tamoxifeno, Toremifeno, raloxifeno, faslodex), esteroides, tales como dexametasona, (7) inmunomoduladores, tales como agonistas o antagonistas de los receptores tipo Toll, (8) inhibidores de las integrinas, otras proteínas de adhesión y metaloproteinasas de matriz), (9) inhibidores de histona desacetilasa, (10) inhibidores de la transducción de señal, tales como inhibidores de tirosina quinasas, tal como imatinib (Gleevec), (11) inhibidores de las proteínas del choque térmico, (12) retinoides, tales como ácido todo transretinoico, (13) inhibidores de los receptores del factor de crecimiento o los propios factores de crecimiento, (14) compuestos antimitóticos, tales como navelbina, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina, (15) antiinflamatorios, tales como inhibidores de la COX y (16) reguladores del ciclo celular, tales como los reguladores del punto de control y los inhibidores de la telomerasa, (17) inhibidores del factor de transcripción e inductores de la apoptosis, tales como inhibidores de Bcl-2, Bcl-x y XIAP.

Los ácidos nucleicos incluyen ADN y ARN y sus equivalentes estructurales tales como moléculas de ARN o moléculas de ADN que utilizan esqueletos de fosforotioato en oposición a los esqueletos de fosfodiéster naturales. Las moléculas de ADN incluyen el ADN episómico (que no se encuentra en o parte del cromosoma de la célula huésped), que incluye además el ADN plasmídico, a Dn de cósmido, ADN de bacteriófago y cromosomas artificiales bacterianos (BAC), y similares. Las moléculas de ADN codifican para proteínas como lo describe el dogma central de la biología molecular. Así, el ADN puede codificar para proteínas de cualquier origen, de origen natural o sintético. Asimismo, el ADN puede ser diseñado para contener "secuencias promotoras" que son reconocidas por la maquinaria de la célula huésped para activar la expresión de las proteínas codificadas. Las secuencias promotoras pueden ser específicas de la célula, específicas de tejido o específicas del inductor. Los inductores son señales aplicadas exógenamente que ayudan a activar los promotores para producir las proteínas. Los inductores pueden ser de naturaleza química o física. Los expertos en la técnica conocen muchos sistemas promotores, al igual que las secuencias que los hacen funcionales. Las secuencias de expresión procarióticas preferidas incluyen, entre otras, el sistema pRHA, el sistema pBAD, el sistema de polimerasa T7, el sistema pLac y sus innumerables derivados, el sistema pTet y el sistema CI857ts. Los sistemas de promotores eucariotas preferidos incluyen, pero no se limitan a, el promotor de CMV, el sistema promotor SV40 y el sistema promotor BGH. Ejemplos de ARN incluyen: aunque no de forma limitativa, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt) y ARN pequeños nucleares. Muchos ARNA, clasificados como ARN antisentido, incluyen, pero no se limitan a, ARN pequeño de interferencia (ARNip), ARN de horquilla corta (shRNA) y ARN antisentido de longitud completa. También se incluyen micro ARNA. Los objetivos preferidos de siRNA o shRNA incluyen, pero no se limitan a, receptor de andrógenos (AR), ABCB1/MDR1/PGY1 (P-glicoproteína; Pgp), CHK-1, HIF-1, Mcl-1, PDGFR, Tie-2, ABL1, ABL2, AKT2, ALK, BCL2, BCL3, BCL5, BCL6, BLC7A, BCL9, BCL10, BCL11A, BCL11B, Bcl-x, Bcr-Abl, BRAF, CCND1, CDK4, CHK-1, c-Met, c-myc, CTNNB1, DKC1, EGFR1, EGFR2, ERBB2, ERCC-1, EZH2, FES, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR-4, FLT1 (VEGFR1), FLT2, FLT3, FLT4, HER2, HER3, HRAS, IGFR, Interleucina 8 (IL-8), JAK, JAK2, KDR/Flk-1 (VEGFR-2), KIT, KRAS2, MET, MRP, mTOR, MYC, MYCL1, MYCN, NRAS, p53, PARP1, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PI3KCA, PPAR, Rad51, Rad52, Rad53, RalA, REL, RET, RRM1, RRM2, STAT3, survivina, telomerasa, TEP1, TERC, TERT, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, Wnt-1, XIAP, y cualquiera contra cualquier secuencia de nucleótidos de la lista de genes anterior que contiene mutaciones somáticas o de línea germinal en comparación con la secuencia del gen de tipo salvaje.

Las proteínas están compuestas por polipéptidos y están codificadas por el ADN. Las proteínas pueden ser biológicamente funcionales, tales como enzimas, Las toxinas, o proteínas de señalización. Las proteínas pueden ser estructurales, Tal como es el caso de la actina y similares. Las proteínas pueden proporcionar señales de localización al ser fluorescentes o bioluminiscentes. Las proteínas pueden servir como inmunógenos o para otros fines terapéuticos (como suministrar o restaurar una enzima en una célula diana, tejido, órgano o animal). Las proteínas pueden ayudar en la transferencia intracelular posterior a la endocitosis de otros tipos de carga útil. Por ejemplo, se pueden emplear proteínas como la listeriolisina O de Listeria monocytogenes para facilitar la transferencia de la (s) carga (s) de minicélulas desde el (los) compartimento (s) endocitosis de una célula diana al citosol de una célula diana. Las proteínas también pueden ser enzimas convertidoras de fármacos. Las proteínas preferidas incluyen listeriolisina O, proteína verde fluorescente, proteína fluorescente roja y cualquier miembro de la familia de proteínas luciferasa. Los polipéptidos terapéuticos expresados / producidos de forma recombinante para su liberación por minicélulas dirigidas incluyen, pero no se limitan a las mismas, toxinas proteicas, citolisinas dependientes de colesterol, enzimas funcionales, caspasas activadas, procaspasas, citocinas, quimiocinas, péptidos que penetran en las células, y cualquier combinación del procedimiento. La expresión recombinante de uno o más polipéptidos terapéuticos puede ser el resultado de la expresión de cualquiera de los diversos vectores de expresión procarióticos recombinantes episómicos conocidos en la técnica, incluidos, pero sin limitaciones, plásmidos, cósmidos, fagemidos y cromosomas artificiales bacterianos (BAC), y cualquier combinación de los anteriores. De forma similar, la expresión recombinante se puede lograr mediante un casete de expresión procariótico localizado cromosómicamente presente en una o más copias del cromosoma de la célula madre productora de minicélulas. La liberación de toxinas proteicas utilizando las minicélulas dirigidas desveladas del presente documento es un enfoque ventajoso en aplicaciones en las que es deseable la eliminación selectiva de células in vivo. Las toxinas proteicas incluyen, pero no se limitan a, gelonina, fragmento A de la toxina diftérica, fragmento A/B de la toxina diftérica, toxina del tétanos, toxina termolábil de E. coli (LTI y/o LTII), la toxina del cólera, toxina iota de C. perfnnges, la exotoxina A de Pseudomonas, toxina shiga, toxina del ántrax, MTX (toxina mosquilicida de B. sphaencus), perfringolisina O, estreptolisina, toxina de la cebada, melitina, las toxinas LF y EF del ántrax, la toxina de la adenilato ciclasa, botulinolisina B, botulinolisina E3, botulinolisina C, toxina botulínica A, la toxina del cólera, toxinas A, B, y alfa de Clostridium, ricina, la toxina A de shiga, la toxina A similar a shiga, la toxina A del cólera, la toxina S1 de pertussis, la toxina termolábil de E. coli (LTB), variantes estables al pH de la listeriolisina O (independiente del pH; sustitución de aminoácidos L461T), variantes termoestables de listeriolisina O (sustituciones de aminoácidos E247M, D320K), variantes estables al pH y termoestables de la listeriolisina O (sustituciones de aminoácidos E247M, D320K y L461T), estreptolisina O, estreptolisina O c, estreptolisina O e, esfericolisina, antrolisina O, cereolisina, thuringiensilisina O, weihenstefanensilisina, alveolisina, brevilisina, butiriculisina, tetanolisina O, novilisina, lectinolisina, neumolisina, mitilisina, pseudoneumolisina, suilisina, intermedilisina, ivanolisina, seeligeriolisina O, vaginolisina y pirolisina. Los polipéptidos terapéuticos pueden localizarse en diferentes compartimentos subcelulares de la minicélula a discreción del experto. Cuando las minicélulas dirigidas desveladas en el presente documento derivan de una cepa parental gramnegativa productora de minicélulas, los polipéptidos terapéuticos expresados de forma recombinante producidos a partir de ellos pueden localizarse en el citosol, la capa interna de la membrana interna, la capa externa de la membrana interna, el periplasma, la capa interna de la membrana externa, la membrana externa de las minicélulas y cualquier combinación del procedimiento. Cuando las minicélulas dirigidas desveladas en el presente documento derivan de una cepa parental grampositiva productora de minicélulas, los polipéptidos terapéuticos expresados de forma recombinante producidos a partir de ellos pueden localizarse en el citosol, la pared celular, la capa interna de la membrana, la membrana de las minicélulas y cualquier combinación del procedimiento.

Cualquiera y todos los tipos de carga útil descritos en el presente documento se pueden usar en combinación o en singular, a discreción del usuario. Un experto en la materia apreciará y reconocerá qué combinaciones se utilizarán para qué fines terapéuticos (por ejemplo, la combinación de un fármaco de cáncer citotóxico de molécula pequeña y un si/shRNA contra un producto genético que confiere resistencia al fármaco).

5. Composiciones farmacéuticas

La presente solicitud también se refiere a composiciones, incluyendo, pero sin limitaciones, composiciones farmacéuticas. El término "composición" utilizado en el presente documento se refiere a una mezcla que comprende al menos un vehículo, preferentemente un vehículo fisiológicamente aceptable y una o más composiciones de minicélulas. El término "vehículo" utilizado en el presente documento se refiere a un compuesto químico que no inhibe ni impide la incorporación del péptido o péptidos biológicamente activos en células o tejidos. Un vehículo normalmente es una sustancia inerte que permite que un ingrediente activo sea formulado o compuesto en una forma de dosificación adecuada (por ejemplo, una píldora, una cápsula, un gel, una película, un comprimido, una micropartícula (por ejemplo, una microesfera), una solución; un ungüento; una pasta, un aerosol, una gota, un coloide o una emulsión etc.). Un "vehículo fisiológicamente aceptable" es un vehículo adecuado para su uso en condiciones fisiológicas que no anula (reduce, inhibe o previene) la actividad biológica y las propiedades del compuesto. Por ejemplo, el dimetilsulfóxido (DMSO) es un vehículo ya que facilita la captación de muchos compuestos orgánicos en las células o tejidos de un organismo. Preferentemente, el vehículo es un vehículo fisiológicamente aceptable, preferentemente un vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, en el que se desecha la composición de minicélulas.

Una "composición farmacéutica" se refiere a una composición en la que el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable, mientras que una "composición veterinaria" es aquella en la que el vehículo es un vehículo veterinariamente aceptable. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "vehículo veterinariamente aceptable" usado en el presente documento incluye cualquier medio o material que no sea biológicamente o por lo demás indeseable, es decir, el vehículo puede administrarse a un organismo junto con una composición de minicélulas sin causar ningún efecto biológico indeseable o interactuar de manera perjudicial con el complejo o cualquiera de sus componentes o el organismo. En la Farmacopea de Estados Unidos se proporcionan ejemplos de reactivos farmacéuticamente aceptables The National Formulary, United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Md. 1990, se incorpora en el presente documento por referencia en la presente solicitud. Las expresiones "cantidad terapéuticamente eficaz" y "cantidad farmacéuticamente eficaz" se refieren a una cantidad suficiente para inducir o efectuar una respuesta medible en la célula diana, tejido o cuerpo de un organismo. Lo que constituye una cantidad terapéuticamente eficaz dependerá de diversos factores, que el profesional experto tendrá en cuenta al llegar al régimen de dosificación deseado.

Las composiciones también pueden comprender otros componentes químicos, tales como diluyentes y excipientes. Un "diluyente" es un compuesto químico diluido en un disolvente, preferentemente un disolvente acuoso, que facilita la disolución de la composición en el disolvente, y también puede servir para estabilizar la forma biológicamente activa de la composición o uno o más de sus componentes. Las sales disueltas en soluciones tamponadas se utilizan como diluyentes en la materia. Por ejemplo, los diluyentes preferidos son soluciones tamponadas que contienen una o más sales diferentes. Un ejemplo ilimitado de solución tamponada preferida es la solución salina tamponada con fosfato (particularmente en combinación con composiciones destinadas a la administración farmacéutica), ya que imita las condiciones de sal de la sangre humana. Dado que las sales tampón pueden controlar el pH de una solución a bajas concentraciones, un diluyente tamponado rara vez modifica la actividad biológica de un compuesto o composición farmacéutica dada.

Un "excipiente" es una sustancia más o menos inerte que se puede añadir a una composición para conferir una propiedad adecuada, por ejemplo, una consistencia adecuada o para producir una formulación de fármaco. Los excipientes y vehículos adecuados incluyen, en particular, cargas tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol, o preparaciones de celulosa con sorbitol, tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, agar, pectina, goma xantana, goma guar, goma garrofín, ácido hialurónico, caseína de almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, poliacrilato, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, también se pueden incluir agentes disgregrantes, tal como polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato de sodio. Otros excipientes y vehículos adecuados incluyen hidrogeles, hidrocoloides gelificables y quitosano. Se pueden usar microesferas y microcápsulas de quitosano como vehículos. Véase, por ejemplo, el documento WO 98/52547 (que describe formulaciones de microesferas para dirigir compuestos al estómago, las formulaciones que comprenden un núcleo interno (que incluye opcionalmente un hidrocoloide gelificado) que contiene uno o más ingredientes activos, una membrana compuesta por un polímero insoluble en agua (por ejemplo, etilcelulosa) para controlar la velocidad de liberación del ingrediente o ingredientes activos, y una capa externa compuesta por un polímero catiónico bioadhesivo, por ejemplo, un polisacárido catiónico, una proteína catiónica y/o un polímero catiónico sintético; patente de Estados Unidos n.° 4.895.724. Normalmente, el quitosano se reticula utilizando un agente adecuado, por ejemplo, glutaraldehído, glioxal, epiclorhidrina y succinaldehído. Las composiciones que emplean quitosano como vehículo pueden formularse en diversas formas de dosificación, incluyendo pastillas, comprimidos, micropartículas y microesferas, incluyendo aquellas que proporcionan la liberación controlada del ingrediente o ingredientes activos. Otros polímeros catiónicos bioadhesivos adecuados incluyen gelatina ácida, poligalactosamina, poliaminoácidos tales como polilisina, polihistidina, poliornitina, compuestos policuaternarios, prolamina, poliimina, dietilaminoetildextrano (DEAE), DEAE-imina, DEAE-metacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE-dextrano, DEAE-celulosa, poli-p-aminoestireno, polioxetano, copolimetacrilatos, poliamidoaminas, almidones catiónicos, polivinilpiridina y politiodietilaminometiletileno.

Las composiciones pueden formularse de cualquier manera adecuada. Las composiciones de minicélulas pueden dispersarse uniformemente (homogéneamente) o no uniformemente (heterogéneamente) en el vehículo. Las formulaciones adecuadas incluyen formulaciones secas y líquidas. Las formulaciones secas incluyen polvos desecados por congelación y liofilizados, que son particularmente adecuados para el suministro de aerosol a los senos o pulmones, o para el almacenamiento a largo plazo seguido de la reconstitución en un diluyente adecuado antes de la administración. Otras formulaciones secas preferidas incluyen aquellas en las que una composición descrita en el presente documento se comprime en forma de comprimido o píldora adecuada para administración oral o se mezcla en una formulación de liberación sostenida. Cuando la composición está destinada a la administración oral para ser administrada al epitelio en los intestinos, se prefiere que la formulación esté encapsulada con un recubrimiento entérico para proteger la formulación y evitar la liberación prematura de las composiciones de minicélulas incluidas en la misma. Como apreciarán los expertos en la técnica, las composiciones descritas en el presente documento pueden colocarse en cualquier forma de dosificación adecuada. Las píldoras y comprmidos representan algunas de estas formas de dosificación. Las composiciones también se pueden encapsular en cualquier cápsula u otro material de recubrimiento adecuado, por ejemplo, por compresión, inmersión, recubrimiento en cubeta, secado por pulverización, etc. Las cápsulas adecuadas incluyen las hechas de gelatina y almidón. A su vez, dichas cápsulas se pueden recubrir con uno o más materiales adicionales, por ejemplo, y recubrimiento entérico, si se desea. Las formulaciones líquidas incluyen formulaciones acuosas, geles, y emulsiones.

Algunas realizaciones preferidas proporcionan composiciones que comprenden un recubrimiento bioadhesivo, preferentemente un mucoadhesivo. Un "recubrimiento bioadhesivo" es un recubrimiento que permite que una sustancia (por ejemplo, una composición de minicélulas) se adhiera a una superficie o sustancia biológica mejor que la que se produce sin el recubrimiento. Un "recubrimiento mucoadhesivo" es un recubrimiento bioadhesivo preferido que permite una sustancia, por ejemplo, una composición para adherirse mejor a la mucosa se produce sin el recubrimiento. Por ejemplo, las minicélulas se pueden recubrir con un mucoadhesivo. Las partículas recubiertas se pueden ensamblar luego en una forma de dosificación adecuada para ser administrada a un organismo. Preferentemente, y dependiendo de la ubicación donde se exprese el resto de transporte de superficie celular a ser dirigido, la forma de dosificación se recubre con otro recubrimiento para proteger la formulación hasta que alcance la ubicación deseada, donde el mucoadhesivo permite retener la formulación mientras la composición interactúa con el resto de transporte de la superficie de la célula diana.

Las composiciones desveladas en el presente documento pueden administrarse a cualquier organismo, preferentemente un animal, preferentemente un mamífero, pájaro, pez, insecto, o arácnido. Los mamíferos preferidos incluyen animales bovinos, caninos, caballos, felinos, ovinos y porcinos, y primates no humanos. Los seres humanos son particularmente preferidos. Existen múltiples técnicas de administración o administración de un compuesto en la técnica, que incluyen, pero sin limitación, oral, aerosol rectal (por ejemplo, un enema o supositorio) (por ejemplo, para la administración nasal o pulmonar), administración parenteral y tópica. Preferentemente, se suministran cantidades suficientes del péptido biológicamente activo para lograr el efecto deseado. La cantidad particular de composición a entregar dependerá de muchos factores, incluyendo el efecto a lograr, el tipo de organismo al que se administra la composición, la ruta de administración, el régimen de dosificación y la edad, la salud y el sexo del organismo. Como tal, la dosificación particular de una composición incorporada en una formulación dada se deja a la discreción del experto ordinario.

Los expertos en la materia apreciarán que cuando las composiciones descritas en el presente documento se administran como agentes para lograr un resultado biológico deseado particular, que puede incluir un efecto o efectos terapéuticos, de diagnóstico o de protección (incluida la vacunación), Puede ser posible combinar la composición de minicélulas con un vehículo farmacéutico adecuado. La elección del vehículo farmacéutico y la preparación de las minicélulas como agente terapéutico o protector dependerá del uso previsto y el modo de administración. Las formulaciones y los métodos de administración de agentes terapéuticos adecuados incluyen aquellos para administración oral, pulmonar, nasal, bucal, ocular, vía dérmica, rectal, intravenosa o vaginal.

Dependiendo del modo de administración empleado, la entidad funcional dependiente del contexto se puede administrar en varias formas farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, la entidad funcional dependiente del contexto se puede administrar en forma de un sólido, solución, emulsión, dispersión, y similares, incorporada en una pastilla, cápsula, comprimido, supositorio, aerosol, gotita o aerosol. Las pastillas, comprimidos, supositorios, aerosoles, polvos, gotitas y aerosoles pueden tener complejas, estructuras multicapa y tienen una gran gama de tamaños. Los aerosoles, polvos, gotas y pulverizadores pueden variar desde pequeños (1 micrómetro) hasta grandes (200 micrómetros).

Las composiciones farmacéuticas desveladas en el presente documento se pueden usar en forma de un sólido, un polvo liofilizado, una solución, una emulsión, una dispersión, y similares, en las que la composición resultante contiene uno o más de los compuestos desvelados en el presente documento, como principio activo, en mezcla con un vehículo o excipiente orgánico o inorgánico adecuado para aplicaciones enterales o parenterales. El ingrediente activo puede combinarse, por ejemplo, con los vehículos farmacéuticamente aceptables no tóxicos habituales para comprimidos, gránulos, cápsulas, supositorios, soluciones, emulsiones, suspensiones, y cualquier otra forma adecuada para su uso. Los vehículos que pueden usarse incluyen glucosa, lactosa, manosa, goma de acacia, gelatina, manitol, pasta de almidón, trisilicato de magnesio, talco, almidón de maíz, queratina, sílice coloidal, almidón de patata, urea, triglicéridos de cadena de longitud media, dextranos y otros vehículos adecuados para su uso en ña fabricación de preparaciones, en forma sólida, semisólida o líquida. Además se pueden usar agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes y colorantes y perfumes. Los ejemplos de un agente seco estabilizante incluyen triulosa, preferentemente a concentraciones de 0,1 % o mayores (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5.314.695). El compuesto activo se incluye en la composición farmacéutica en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado sobre el proceso o el estado de las enfermedades.

6. Indicaciones terapéuticas

La presente solicitud se refiere a la imagen diagnóstica y la terapia del cáncer o los cánceres, incluidos, pero sin limitaciones, tumores sólidos, tumores metastásicos y tumores líquidos. Los tumores sólidos y metastásicos incluyen los de origen epitelial e incluyen, pero sin limitaciones, cáncer de mama, de pulmón, pancreático, prostática, testicular, de ovarios, gástrico, intestino, boca, lengua, faringe, hepático, anal, rectal, colónico, esofágico, vejiga urinaria, vesícula biliar, piel, uterino, vaginal, de pene y renal. Otros tipos de cáncer sólido que pueden tratarse con las minicélulas dirigidas desveladas en el presente documento incluyen, pero sin limitaciones, adenocarcinomas, sarcomas, fibrosarcomas y cánceres de ojo, cerebro y huesos. Los tumores líquidos que pueden tratarse con las minicélulas dirigidas descritas en el presente documento incluyen, pero sin limitaciones, linfoma no Hodgkin, mieloma, linfoma de Hodgkin, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica y otras leucemias. Las minicélulas dirigidas desveladas en el presente documento están dirigidas a antígenos de superficie específicos de células de cáncer eucarióticos que incluyen, pero no se limitan a, a3p1 integrina, a4p1 integrina, a5p1 integrina, avp3 integrina, avpl integrina, p1 integrina, 5T4, CAIX, CD4, CD13, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD31, CD33, CD34, CD40, CD44v6, CD45, CD51, CD52, CD54, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD105, CD117, CD123, CD133, CD138, CD144, CD146, CD152, CD174, CD205, CD227, CD326, CD340, Cripto, ED-B, GD2, TMEFF2, VEGFR1, VEGFR2, FGFR, PDGFR, ANGPT1, TIE1, TIE2, NRP1, TEK (CD202B), TGFpR, receptor 5 de muerte (Trail-R2), DLL4, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6, FAP, GPNMB, ICAM, VCAM, PSMA, HER-2/neu, IL-13R alfa 2, MUC-1, MUC16, EGFR1 (HER-1), EGFR2 (HER-2/neu), EGFR3 (HER-3), IGF-1R, IGF-2R, c-Met (HGFR), Mesotelina, PDGFR, EDGR, TAG-72, receptor de transferrina, EpCAM, CTLA-4, PSMA, tenascina C, alfa-fetoproteína, vimentina, al antígeno C242, T^rA ⁱL-R1, TRAIL-R2, ^cA-125, GPNMB, CA-IX, gangliósido GD3, RANKL, BAFF, IL-6R, TAG-72, HAMA y CD166.

La presente solicitud también se relaciona con el diagnóstico por imágenes y la terapia de afecciones y enfermedades en un animal causadas, al menos en parte, por vasculogénesis o angiogénesis aberrantes. Tales condiciones y enfermedades incluyen, pero sin limitaciones, cáncer, afecciones inflamatorias, incluyendo, pero sin limitación, artritis reumatoide, psoriasis y enfermedad inflamatoria del intestino, trastornos metabólicos, incluyendo retinopatía diabética y nefropatía diabética y afecciones oculares, incluyendo, pero sin limitación, DMAE neovascular (húmeda) y edema macular. Se ha establecido un papel para la vasculogénesis o angiogénesis en cada una de estas enfermedades o afecciones como resultado de estudios genéticos, mecánicos, histopatológicos, preclínicos y/o clínicos. Por ejemplo, los tumores no pueden crecer más allá de 1 a 2 mm de diámetro en ausencia de neovascularización. El importante papel de la neovascularización en el cáncer y ciertas enfermedades oculares se ha validado clínicamente a través de la aprobación de varias terapias antiangiogénicas, incluyendo bevacizumab para el cáncer y ranibizumab para la DMAE. Además, la remodelación vascular aberrante y la angiogénesis juegan un papel importante en varias etapas de la inflamación. La primera fase aguda de la inflamación implica cambios funcionales en la vasculatura, tal como dilatacion, mayor permeabilidad y activación de células endoteliales. La segunda fase subaguda de la inflamación involucra remodelación capilar y venular, con una extensa actividad mitótica endotelial. En el contexto crónico, se observa neovascularización y/o expansión de la microvasculatura, incluso en la artritis reumatoide, psoriasis, retinopatía diabética y nefropatía diabética. Todos estos cambios vasculares promueven y sostienen respuestas inflamatorias al mejorar la infiltración y/o la liberación de nutrientes, citocinas, quimiocinas, proteasas y leucocitos inflamatorios. Por tanto, las minicélulas dirigidas descritas en el presente documento pueden usarse como agentes terapéuticos antiangiogénicos incorporando anticuerpos que reconocen antígenos de la superficie celular de tipos celulares que contribuyen a la regulación errónea de la angiogénesis en un contexto de enfermedad determinado. A modo de ejemplo no limitante, las células endoteliales, células endoteliales circulantes, angioblastos, hemangioblastos, pericitos, miofibroblastos y células progenitoras endoteliales son todos objetivos para la prevención de la vasculogénesis o la angiogénesis. Las células endoteliales y sus progenitores, en particular, son tipos celulares vasculogénicos y angiogénicos críticos que pueden ser atacados usando minicélulas antiangiogénicas. Muchas células endoteliales sobreexpresan, expresan preferentemente y/o expresan diferencialmente distintas proteínas de la superficie celular en sitios de vasculogénesis y angiogénesis. Adicionalmente, las células endoteliales circulantes y las células progenitoras endoteliales circulantes (presentes en la sangre y la linfa) son objetivos para las minicélulas antiangiogénicas. Las células endoteliales circulantes y los progenitores endoteliales también expresan antígenos de la superficie celular que los distinguen de otros tipos de células, sirviendo como base para la focalización preferencial de minicélulas antiangiogénicas. En conjunto, estas moléculas de la superficie celular se denominan antígenos específicos de la angiogénesis. Muchos anticuerpos que reconocen específicamente los antígenos específicos de la angiogénesis y las secuencias de ácido nucleico de las regiones variables de los mismos, ya son conocidos en la técnica. Cualquiera de estos anticuerpos puede usarse de manera exógena con la presente solicitud. Se han identificado muchos antígenos específicos de la angiogénesis para los cuales no se han notificado anticuerpos. Sin embargo, los métodos para producir anticuerpos contra estos antígenos son bien conocidos en la técnica y cualquiera y todos los anticuerpos contra antígenos específicos de la angiogénesis, o cualquier otro antígeno de superficie relacionado con la angiogénesis, pueden incorporarse a la composición como se ha descrito. Los antígenos específicos de la angiogénesis de elección incluyen, pero sin limitaciones, a4p1 integrina, a5p1 integrina, avp3 integrina, avpl integrina, p1 integrina, CD13, CD31, CD34, CD45, CD54, CD105, CD117, CD133, CD144, CD146, VEGFR1, VEGFR2, FGFR, PDGFR, ANGPT1, TIE1, TIE2, NRP1, TEK (CD202B), TGFpR, DLL4, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10 EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6, ICAM, VCAM y PSMA.

7. Preparaciones de minicélulas

Algunas realizaciones se relacionan con la creación de una cepa optimizada y la preparación de minicélulas de unión a Fc a partir de, pero sin limitación, la familia Enterobacteríaceae que contiene o produce cualquier subclase de ARN terapéutico, incluyen, pero sin limitaciones, a ARN antisentido (ARNip y ARNsh como ejemplo), ribozimas, y miARN, de modo que las minicélulas resultantes comprenden una cantidad enriquecida de las moléculas de ARN terapéutico mediante encapsulación después de la expresión de la molécula de ARN terapéutico por la célula parental o las minicélulas en sí mismas. Tras la producción de la cantidad deseada de minicélulas a partir del cultivo y la condición, la activación del mecanismo de suicidio genético se llevaría a cabo mediante la exposición del cultivo o las células a una señal conocida. Como alternativa, la carga de cualquiera de las moléculas de ARN anteriores en minicélulas de unión a Fc también se puede lograr mediante la incubación de minicélulas con altas concentraciones de moléculas de ARN exógenas (a diferencia de, o en combinación con, expresión del mismo o diferente ARN terapéutico por la cepa parental productora de minicélulas, de manera que las minicélulas resultantes comprenden el ARN terapéutico).

Algunas realizaciones se relacionan con la creación de una cepa optimizada y la preparación de minicélulas de unión a Fc a partir de, pero sin limitación, la familia Enterobacteriaceae que contienen o producen una molécula de proteína, de modo que las minicélulas resultantes contienen la molécula de proteína mediante encapsulación después de la expresión de la molécula de proteína por la célula parental o por las minicélulas en sí mismas. Después de la producción de la cantidad deseada de minicélulas a partir de un cultivo y condición dados, la activación del mecanismo de suicidio genético se llevaría a cabo mediante la exposición del cultivo o las células a una señal conocida.

Algunas realizaciones se relacionan con la creación de una cepa optimizada y la preparación de minicélulas de unión a Fc a partir de, pero sin limitación, la familia Enterobacteriaceae que contiene o produce moléculas de ADN (por ejemplo, un plásmido de expresión eucariótico) que codifica un gen o producto génico terapéutico o nocivo, cualquier subclase de ARN, y/o proteínas, de tal manera que las minicélulas resultantes contienen la combinación de moléculas mediante encapsulación. Después de la producción de la cantidad deseada de minicélulas a partir de un cultivo y condición dados, la activación del mecanismo de suicidio genético se llevaría a cabo mediante la exposición del cultivo o las células a una señal conocida.

Algunas realizaciones se relacionan con la creación de una cepa optimizada y la preparación de minicélulas de unión a Fc a partir de, pero sin limitación, la familia Enterobacteriaceae, de manera que puedan "cargarse" las minicélulas con moléculas pequeñas que comprenden, pero sin limitaciones, un fármaco, un profármaco o una hormona después de la purificación. Después de la producción de la cantidad deseada de minicélulas a partir de un cultivo y condición dados, la activación del mecanismo de suicidio genético se llevaría a cabo mediante la exposición del cultivo o las células a una señal conocida. Tras la purificación, las minicélulas se “cargarían" con molécula o moléculas pequeñas por incubación con una alta concentración de la molécula pequeña a una temperatura que oscila entre 0 °C y 65 °C. Este procedimiento se realiza con minicélulas con minicélulas de unión a Fc "vacías", de modo que la molécula pequeña es la única molécula terapéutica exógena en las minicélulas dirigidas resultantes. Este procedimiento también puede realizarse con minicélulas que comprenden además cualquier combinación de ADN terapéutico, ARN terapéutico o proteína terapéutica, de modo que la composición final contenga la molécula pequeña y cualquier combinación del ADN terapéutico, ARN terapéutico, y/o proteína terapéutica. Las minicélulas de unión a Fc son las competentes para la selección de dianas mediante la adición de anticuerpos y/o moléculas de direccionamiento de fusión/conjugadas a Fc en sus superficies.

Algunas realizaciones se relacionan con la creación de una cepa optimizada y la preparación de minicélulas de unión a Fc a partir de, pero sin limitación, la familia Bacillaceae que contiene o produce una molécula de ADN que codifica un gen o producto genético terapéutico o perjudicial, de modo que la minicélula resultante contenga la molécula de ADN mediante encapsulación. Después de la producción de la cantidad deseada de minicélulas a partir de un cultivo y condición dados, la activación del mecanismo de suicidio genético se llevaría a cabo mediante la exposición del cultivo o las células a una señal conocida.

Algunas realizaciones se relacionan con la creación de una cepa optimizada y la preparación de minicélulas de unión a Fc a partir de, pero sin limitación, la familia Bacillaceae que contiene o produce cualquier subclase de ARN terapéutico, incluyen, pero sin limitaciones, a ARN antisentido (ARNip y ARNsh como ejemplo), ribozimas, y miARN, de modo que las minicélulas resultantes comprenden una cantidad enriquecida de las moléculas de ARN terapéutico mediante encapsulación después de la expresión de la molécula de ARN terapéutico por la célula parental o las minicélulas en sí mismas. Tras la producción de la cantidad deseada de minicélulas a partir del cultivo y la condición, la activación del mecanismo de suicidio genético se llevaría a cabo mediante la exposición del cultivo o las células a una señal conocida. Como alternativa, la carga de cualquiera de las moléculas de ARN anteriores en minicélulas de unión a Fc también se puede lograr mediante la incubación de minicélulas con altas concentraciones de moléculas de ARN exógenas (a diferencia de, o en combinación con, expresión del mismo o diferente ARN terapéutico por la cepa parental productora de minicélulas, de manera que las minicélulas resultantes comprenden el ARN terapéutico).

Algunas realizaciones se relacionan con la creación de una cepa optimizada y la preparación de minicélulas de unión a Fc a partir de, pero sin limitación, la familia Bacillaceae que contiene o produce una molécula de proteína, de tal manera que la minicélula resultante contiene la molécula de proteína mediante encapsulación después de la expresión de la molécula de proteína por la célula parental o por la propia minicélula. Después de la producción de la cantidad deseada de minicélulas a partir de un cultivo y condición dados, la activación del mecanismo de suicidio genético se llevaría a cabo mediante la exposición del cultivo o las células a una señal conocida.

Algunas realizaciones se relacionan con la creación de una cepa optimizada y la preparación de minicélulas de unión a Fc a partir de, pero sin limitación, la familia Bacillaceae que contiene o produce una combinación predeterminada y deliberada de moléculas de ADN que codifican un gen o producto genético terapéutico o perjudicial, cualquier subclase de ARN, y/o proteínas, de tal forma que la minicélula resultante contiene la combinación de moléculas mediante encapsulación. Después de la producción de la cantidad deseada de minicélulas a partir de un cultivo y condición dados, la activación del mecanismo de suicidio genético se llevaría a cabo mediante la exposición del cultivo o las células a una señal conocida. La señal se aplicaría en cada paso del proceso de purificación para garantizar la destrucción máxima de las células viables en la preparación final.

Algunas realizaciones se relacionan con la creación de una cepa optimizada y la preparación de minicélulas de unión a Fc a partir de, pero sin limitación, la familia Bacillaceae, de modo que las minicélulas pueden "cargarse" con pequeñas moléculas que comprenden pero no se limitan a un fármaco, un profármaco o una hormona después de la purificación. Después de la producción de la cantidad deseada de minicélulas a partir de un cultivo y condición dados, la activación del mecanismo de suicidio genético se llevaría a cabo mediante la exposición del cultivo o las células a una señal conocida. Tras la purificación, las minicélulas se “cargarían" con molécula o moléculas pequeñas por incubación con una alta concentración de la molécula pequeña a una temperatura que oscila entre 0 °C y 65 °C. Este procedimiento se realiza con minicélulas con minicélulas de unión a Fc "vacías", de modo que la molécula pequeña es la única especie de molécula terapéutica exógena en las minicélulas dirigidas resultantes. Este procedimiento también puede realizarse con minicélulas que comprenden además cualquier combinación de ADN terapéutico, ARN terapéutico o proteína terapéutica, de modo que la composición final contenga la molécula pequeña y cualquier combinación del ADN terapéutico, ARN terapéutico, y/o proteína terapéutica. Las minicélulas de unión a Fc son las competentes para la selección de dianas mediante la adición de anticuerpos y/o moléculas de direccionamiento de fusión/conjugadas a Fc en sus superficies.

En algunas realizaciones, el nivel de minicélulas que producen la contaminación celular parental es inferior a 1 de cada 107 minicélulas terapéuticas dirigidas.

En algunas realizaciones, el nivel de minicélulas que producen la contaminación celular parental es inferior a 1 de cada 108 minicélulas terapéuticas dirigidas.

En algunas realizaciones, el nivel de minicélulas que producen la contaminación celular parental es inferior a 1 de cada 109 minicélulas terapéuticas dirigidas.

En algunas realizaciones, el nivel de minicélulas que producen la contaminación celular parental es inferior a 1 de cada 1010 minicélulas terapéuticas dirigidas.

En algunas realizaciones, el nivel de minicélulas que producen la contaminación celular parental es inferior a 1 de cada 1011 minicélulas terapéuticas dirigidas.

En algunas realizaciones, el nivel de minicélulas que producen la contaminación celular parental es inferior a 1 de cada 1012 minicélulas terapéuticas dirigidas.

En algunas realizaciones, el nivel de minicélulas que producen la contaminación celular parental es inferior a 1 de cada 1013 minicélulas terapéuticas dirigidas.

En algunas realizaciones, el nivel de minicélulas que producen la contaminación celular parental es inferior a 1 de cada 1014 minicélulas terapéuticas dirigidas.

En algunas realizaciones, el nivel de minicélulas que producen la contaminación celular parental es inferior a 1 de cada 1015 minicélulas terapéuticas dirigidas.

En algunas realizaciones, el nivel de minicélulas que producen la contaminación celular parental es inferior a 1 de cada 1016 minicélulas terapéuticas dirigidas.

Salvo que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en el presente documento tienen el mismo significado que el normalmente entendido por alguien con una habilidad habitual en la técnica. Aunque la presente solicitud se ha descrito con referencia a realizaciones y ejemplos, se debe entender que se pueden hacer varias modificaciones sin apartarse del espíritu de la invención. Todas las referencias en el presente documento citadas se incorporan expresamente en el presente documento como referencia en su totalidad.

Las realizaciones de la presente solicitud se describen con más detalle en los siguientes ejemplos, que de ninguna manera tienen la intención de limitar el alcance de la presente solicitud.

Ejemplos

Ejemplo 1

Expresión y visualización de la región de unión a Fc de la Proteína A o Proteína G en la superficie de las minicélulas demostrada por el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). La cepa VAX12B4 de E. coli productora de minicélulas se transformó con (i) el plásmido de expresión inducible por L-ramnosa pVX-119 (codifica la proteína A de Lpp-OmpAQ; SEQ ID NO:1), (ii) el plásmido de expresión inducible por L-ramnosa pVX-120 (códigos para Lpp-OmpAQProteína G; SEQ ID NO: 2) o (iii) con un plásmido de control de vector vacío, para crear cepas de minicélulas VAX13B7 (Proteína A), VAX13C4 (Proteína G) y VAX12C4 (control de vectores), respectivamente. Cada uno de VAX13B7, VAX13C4 y v Ax 12C4 se cultivaron durante la noche en 20 ml de caldo Luria-Bertani (LB) que contenía glucosa al 0,2 %, 10 mg/ml de ácido diaminopimélico (DAP), 11 mg/ml de lisina y 50 mg/ml de kanamicina. Al día siguiente, cada cepa se subcultivó de forma independiente mediante una dilución 1/100 del cultivo durante la noche en 700 ml de caldo LB fresco que contenía DAP, lisina y kanamicina, como anteriormente. Los cultivos se hicieron crecer hasta una densidad óptica (O.D.600) de 0,1, momento en el que se añadió L-ramnosa a una concentración final de 10 micromolar para inducir la expresión de la proteína de fusión. Cuando los cultivos alcanzaron un DO600 de 1.0, se añadió Isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 20 micromolar para inducir la formación de minicélulas. Ocho horas después de la inducción de L-ramnosa, los cultivos se transfirieron a 42 °C y se incubaron durante la noche para inducir el suicidio de las células parentales. Las minicélulas se purificaron luego del cultivo mediante fraccionamiento de densidad de sacarosa y se analizaron para determinar la superficie de la Proteína A o la Proteína G mediante ELISA. Los ELISA se realizaron incubando 1e07 minicélulas derivadas de VAX13B7, VAX13C4, o VAX12C4 en tampón de bicarbonato de sodio (pH 9.5) en una placa de poliestireno de 96 pocillos durante la noche para permitir que las minicélulas se unan a la placa. Al día siguiente, los pocillos de las placas se lavaron tres veces, cada uno con solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 (PBS) que contiene 0,05 % de Tween-20, y luego se bloquea usando PBS que contiene 1 % de gelatina durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, los pocillos se lavaron tres veces con PBS que contenía Tween-20 al 0,05 % y luego se incubaron con un anticuerpo IgY de pollo conjugado con HRP contra la Proteína A o la Proteína G durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, las placas se lavaron cinco veces cada una con PBS que contenía un 0,5 % de Tween-20, y luego se añadió TMB a cada pocillo. Las reacciones se detuvieron antes de que la señal estándar (proteína recombinante A/G) estuviera saturada, mediante la adición de ácido sulfúrico 1 M y las placas se analizaron en un lector de placas SpectraMax M3 (Molecular Devices, Inc.). El nivel de presentación de la proteína de fusión superficial se determinó comparando la señal experimental de ELISA con una curva estándar creada por la titulación de la proteína A/G recombinante (Pierce, Inc.) y se muestra en la Figura 2.

Como se muestra en la Figura 2, Las minicélulas que exhiben la proteína A solo se detectaron cuando se usó un anticuerpo secundario IgY de pollo anti-proteína A conjugado con HRP. Las minicélulas que muestran la proteína G solo se detectaron cuando se usó un anticuerpo secundario IgY de pollo anti-proteína G conjugado con HRP. Estos resultados confirmaron la expresión, la identidad y la expresión en la superficie de las minicélulas de las proteínas de fusión.

Ejemplo 2

Unión y presentación del anticuerpo VEGFR2 por medio de miniciells que expresan la porción de unión a Fc de la proteína A o la proteína G. Minicélulas (1e09) purificadas a partir de la cepa VAX13B7 (presentación de la proteína A), Se incubaron VAX13C4 (presentación de proteína G) y VAX12B5 (control negativo) con 1 microgramo cada uno sin (-) o con (+) un anticuerpo IgG monoclonal de ratón contra VEGFR2 humano durante 1 hora a temperatura ambiente para permitir que los anticuerpos se unieran a la minicélulas. Después de la incubación, las minicélulas se lavaron tres veces cada una con 1 ml de PBS (pH 7,4) para eliminar cualquier anticuerpo no unido. Luego se analizaron las minicélulas (1e08) mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo policlonal de conejo anti­ ratón conjugado con HRP como el anticuerpo secundario. La transferencia de tipo Western se muestra en la figura 3. La unión específica del anticuerpo secundario se visualizó utilizando un kit de detección ECL de Amersham (GE Healthcare). El anticuerpo anti-VEGFR2 de ratón (100 ng) se cargó como control positivo (carril después de 12B5).

La Figura 3 muestra que la región Fc del anticuerpo secundario de conejo anti-ratón conjugado con HRP estaba unida por las proteínas de fusión Proteína A y Proteína G en las minicélulas 13B7 y 13C4 (49,1 kDa y 38,5 kDa, respectivamente), Independiente del anticuerpo VEGFR2. Además, la región Fab del anticuerpo secundario se une y detecta el anticuerpo VEGFR2 intacto (~ 150 kDa) unido a las minicélulas 13B7 y 13C4.

Ejemplo 3

Unión y presentación del anticuerpo EGFR1 por medio de miniciells que expresan la porción de unión a Fc de la proteína A o la proteína G. Minicélulas (1e09) purificadas a partir de la cepa VAX13B7 (presentación de la proteína A), se incubaron VAX13C4 (presentación de proteína G) y VAX12B5 (control negativo) con 1 microgramo cada uno sin (-) o con (+) un anticuerpo IgG monoclonal de ratón contra EGFR1(mAb528 humano durante 1 hora a temperatura ambiente para permitir que los anticuerpos se unieran a la minicélulas. Después de la incubación, las minicélulas se lavaron tres veces cada una con 1 ml de PBS (pH 7,4) para eliminar cualquier anticuerpo no unido. Luego se analizaron las minicélulas (1e08) mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo policlonal de conejo anti-ratón conjugado con HRP como el anticuerpo secundario. La transferencia de tipo Western se muestra en la figura 4. La unión específica del anticuerpo secundario se visualizó utilizando un kit de detección ECL de Amersham (GE Healthcare). El anticuerpo anti-EGFR de ratón (100 ng) se cargó como control positivo (carril después de 12B5).

Como se muestra en la Figura 4, la región Fc del anticuerpo secundario de conejo anti-ratón conjugado con HRP estaba unida por las proteínas de fusión Proteína A y Proteína G en las minicélulas 13B7 y 13C4 (49,1 kDa y 38,5 kDa, respectivamente), Independiente del anticuerpo EGFR1. Además, la región Fab del anticuerpo secundario se une y detecta el anticuerpo EGFR1 intacto (~ 150 kDa) unido a las minicélulas 13B7 y 13C4.

Ejemplo 4

Las minicélulas que se unen y muestran el anticuerpo anti-EGFR1 humano mAb528 se dirigen selectivamente a la línea celular H460 de carcinoma de pulmón no microcítico humano que expresa EGFR1 in vitro. Las minicélulas que expresan y muestran Lpp-OmpA-Proteína G (13C4) y la Lpp-OmpA-Proteína G control de minicélulas deficientes (12B4) se tiñeron con el agente de imagen fluorescente FM-143 específico de la membrana durante 1 hora y luego se lavaron 3 veces cada una en un volumen igual de IX PBS. Después de la tinción, las minicélulas 13C4 (que expresan la fusión Lpp-OmpA-Proteína G) se incubaron conjuntamente con un exceso de mAb528 o un anticuerpo de control de especie/isotipo compatible contra la hemocianina de lapa californiana (KLH; no presente en células de mamíferos) para permitir la unión de anticuerpos a la superficie de minicélulas 13C4. Como control adicional, las minicélulas 12B4, que no expresan la fusión Lpp-OmpA-Proteína G, también se incubaron conjuntamente con una concentración igual de mAb528. Después de la unión del anticuerpo, las muestras se lavaron tres veces cada una y luego se dejaron incubar con células H460 cultivadas en una proporción de minicélulas a células H460 de 5000:1 durante 2 horas. Tras la incubación de 2 horas, las células se lavaron tres veces cada una en medio de cultivo celular y luego se visualizaron para la captación de minicélulas fluorescentes utilizando microscopía de fluorescencia. Los resultados de la microscopía de fluorescencia se muestran en la Figura 5.

Como se muestra en el panel de la izquierda de la figura 5, las minicélulas que no expresaron Lpp-OmpA-Proteína G (12B4) no se unieron al anticuerpo dirigido contra EGFR1 y no fueron internalizadas eficientemente por las células H460 que expresan EGFR1. El panel central de la Figura 5 muestra que las minicélulas que expresan Lpp-OmpA-Proteína G (13C4) se unieron al anticuerpo dirigido contra EGFR1 y fueron internalizadas fácilmente por las células H460 que expresan EGFR1, demostrando la captación dependiente de la orientación. El panel derecho de la Figura 5 muestra que las minicélulas que expresan Lpp-OmpA-Proteína G (13C4) y que muestran un anticuerpo de control de isotipo no específico (el anticuerpo se dirige a KLH; no expresadas en células H460) no fueron internalizadas eficientemente por las células H460 que expresan EGFR1, demostrando una necesidad de focalización específica.

Ejemplo 5

Las minicélulas Lpp-OmpA-Proteína A 2 Fc (Proteína A) con una proteína de fusión se purificaron después del crecimiento de las bacterias a 30 ° C usando un filtro de corte de 1.0 micras en lugar de una centrifugación a baja velocidad para enriquecer las minicélulas, y luego usando un gradiente de densidad de Ficoll en lugar de sacarosa. La porción de proteína A de la proteína de fusión es capaz de unirse a los anticuerpos a través de sus regiones Fc pero es defectuosa en la unión de F(ab')2 y es resistente a la proteasa OmpT. Tras la purificación, Las minicélulas de proteína A (que expresan Lpp-OmpA-Proteína A 2 Fc) se tiñeron con el agente de imagen fluorescente CFSE (diacetato de carboxifluoresceína, éster de succinimidilo) y luego se decoraron con un receptor de EGF antihumano, anti-KLH o anti-CD123 humano (receptor de IL-3; no expresados por H460) anticuerpos como se describe en el Ejemplo 4. Tras la eliminación del exceso de anticuerpo no unido, las minicélulas se incubaron con células H460 (línea celular de carcinoma de pulmón de células no pequeñas humanas que expresan EGFR1) durante 40 minutos y se lavaron. La internalización de células tumorales de minicélulas fluorescentes se determinó mediante microscopía de fluorescencia. La Figura 6 muestra imágenes de microscopio de fluorescencia de monocapas de células H460 incubadas con minicélulas decoradas con diversos anticuerpos con una captación de minicélulas dirigida a EGFR1 prominente demostrada en la Figura 6A frente a minicélulas dirigidas anti-KLH (Figura 6B) o anti-CD123 (Figura 6C). El control sin anticuerpos también demostró que no había captación como se esperaba (Figura 6D). En el mismo experimento descrito para la Figura 6, Los resultados de la captación relativa de minicélulas medidos cuantitativamente mediante análisis FACS de células tripsinizadas se muestran en la Figura 7.

TABLAS

(continuación)

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una minicélula bacteriana completamente intacta, que comprende:

(i) una proteína de fusión de unión a Fc mostrada en la superficie de la minicélula, en donde la proteína de fusión de unión a Fc comprende (a) una señal de exportación (secreción) de membrana externa, (b) un dominio de anclaje de membrana externa y (c) una porción de unión a Fc de la proteína G o una porción de unión a Fc de la proteína A;

(ii) una o más moléculas bioactivas que comprenden ácidos nucleicos, proteínas, fármacos de molécula pequeña, radioisótopos, lípidos o cualquier combinación de los mismos; y

(iii) una o más moléculas de direccionamiento que contienen Fc unidas a dicha porción de unión a Fc, en donde la molécula de direccionamiento que contiene Fc es una molécula que es capaz de unirse a una molécula de unión a Fc y contiene un sitio de reconocimiento para una molécula diana,

en donde dicha una o más moléculas de direccionamiento que contienen Fc reconocen un antígeno o un receptor eucarióticos.

2. La minicélula de la reivindicación 1, en la que al menos una de las una o más moléculas bioactivas es una toxina proteica, en donde, preferentemente, dicha toxina proteica se selecciona del grupo que consiste en gelonina, fragmento A de la toxina diftérica, fragmento A/B de la toxina diftérica, toxina del tétanos, toxina termolábil de E. coli (LTI y/o LTII), toxina del cólera, toxina iota de C. perfringes, exotoxina A de Pseudomonas, toxina shiga, toxina del ántrax, MTX (toxina mosquilicida de B. sphaencus), perfringolisina O, estreptolisina, toxina de la cebada, melitina, toxinas LF y EF del ántrax, toxina de la adenilato ciclasa, botulinolisina B, botulinolisina E3, botulinolisina C, toxina botulínica A, toxina del cólera, toxinas A, B y alfa de Clostndium, ricina, toxina A de shiga, toxina A similar a shiga, toxina A del cólera, toxina S1 de pertussis, toxina termolábil de E. coli (LTB), variantes estables al pH de la listeriolisina O (independiente del pH; sustitución de aminoácidos L461T), variantes termoestables de listeriolisina O (sustituciones de aminoácidos E247M, D320K), variantes estables al pH y termoestables de la listeriolisina O (sustituciones de aminoácidos E247M, D320K y L461T), estreptolisina O, estreptolisina O c, estreptolisina O e, esfericolisina, antrolisina O, cereolisina, thuringiensilisina O, weihenstefanensilisina, alveolisina, brevilisina, butiriculisina, tetanolisina O, novilisina, lectinolisina, neumolisina, mitilisina, pseudoneumolisina, suilisina, intermedilisina, ivanolisina, seeligeriolisina O, vaginolisina, pirolisina y cualquier combinación de los mismos.

3. La minicélula de la reivindicación 1, en la que al menos una de las una o más moléculas bioactivas es un fármaco terapéutico de molécula pequeña, en donde, preferentemente, dicho fármaco terapéutico de molécula pequeña se selecciona del grupo que consiste en agentes que dañan el ADN, agentes que inhiben la síntesis de ADN, microtúbulos y agentes de unión a tubulina, antimetabolitos, inductores de daño oxidativo, antiangiogénicos, terapias endocrinas, antiestrógenos, inmunomoduladores, tales como los agonistas o antagonistas de los receptores de tipo Toll, inhibidores de la histona deacetilasa, inhibidores de la transducción de señales, tales como inhibidores de quinasas, inhibidores de las proteínas de choque térmico, retinoides, inhibidores de los receptores del factor de crecimiento, compuestos antimitóticos, antiinflamatorios, reguladores del ciclo celular, inhibidores del factor de transcripción e inductores de apoptosis y cualquier combinación de los mismos.

4. La minicélula de la reivindicación 1, en la que al menos una de las una o más moléculas bioactivas es un ácido nucleico terapéutico, un polipéptido terapéutico o una combinación de un fármaco de molécula pequeña y un ácido nucleico terapéutico.

5. La minicélula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en la que al menos una de las una o más moléculas de direccionamiento que contienen Fc es específica para una molécula de superficie celular tumoral, una molécula de superficie celular endotelial o una diana común tanto para una célula tumoral como para una célula endotelial.

6. La minicélula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en donde dicha minicélula comprende además un agente de escape endosómico.

7. Una composición, que comprende la minicélula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. Una composición de la reivindicación 7 para uso en el tratamiento de una enfermedad en un sujeto.

9. La minicélula de la reivindicación 1, en la que al menos una de la una o más moléculas bioactivas es una proteína de un agente infeccioso, y preferentemente al menos una de las moléculas de direccionamiento que contienen Fc es específica para una célula presentadora de antígeno profesional, en donde, preferentemente, dicha célula presentadora de antígeno profesional es una célula dendrítica eucariota o un macrófago.

10. La minicélula de la reivindicación 1, en la que al menos una de las una o más moléculas bioactivas es un antígeno proteico de un tumor.

11. La minicélula de reivindicación 10, en la que al menos una de las una o más moléculas de direccionamiento que contienen Fc es específica para una célula dendrítica eucariótica, un eosinófilo, un neutrófilo, un basófilo, un linfocito T, un linfocito B, un mastocito o un macrófago.

12. La minicélula de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde dicha minicélula comprende además un agente de escape endosómico, en donde, preferentemente, dicha minicélula comprende además un adyuvante inmunomodulador.

13. Una composición, que comprende la minicélula de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Una composición de la reivindicación 13, para su uso en la inmunización de un sujeto.