ES2888498A1 - Translocacion inducida de bacterias modificadas geneticamente para su uso en terapia - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una composición o un kit de partes que comprende: a) un compuesto que favorece la pérdida transitoria de la barrera intestinal y la translocación bacteriana, y b) un vector bacteriano que incluye una molécula de ácidos nucleicos que codifican un agente terapéutico, y a sus usos médicos, en particular para el tratamiento del cáncer.

Description

DESCRIPCIÓN

Translocación inducida de bacterias modificadas genéticamente para su uso en terapia

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina, y más concretamente de la ingeniería genética y la inmunoterapia. Más específicamente se refiere a compuestos que favorece la pérdida de la barrera intestinal y la translocación bacteriana y un vector bacteriano que incluye ácidos nucleicos que codifican un agente terapéutico para su uso en terapia.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Ya en el siglo XVIII, se informó que ciertos procesos de enfermedades infecciosas podrían ejercer un efecto terapéutico beneficioso sobre el cáncer. Este vínculo entre el cáncer y las bacterias fue informado por primera vez por Busch & Fehleisen, donde se observó una reducción en el crecimiento tumoral con la infección por Streptococcus pyogenes (agente etiológico de la erisipela) en un paciente con cáncer. El más destacado entre los muchos esfuerzos realizados para aprovechar estas observaciones fue el de un cirujano pionero, William B. Coley (1891-1936). Usando una vacuna bacteriana para tratar principalmente sarcomas inoperables, Coley logró una tasa de curación superior al 10% (Loughlin, K.R. William B. Coley. Urol. Clin. North Am. 2020, 47, 413-417).

A principios del siglo XX, la tuberculosis (TB) seguía siendo un importante problema de salud pública. La tuberculosis es causada por Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium bovis, que se conocen colectivamente como bacilos de la tuberculosis. En 1908, Albert Calmette y Camille Guerin, que trabajaban en el Instituto Pasteur, comenzaron a intentar desarrollar una vacuna contra la tuberculosis. Aislaron una cepa virulenta de M. bovis de una vaca infectada y, después de someterla a múltiples cultivos, mostraron una pérdida gradual de virulencia. En 1921, después de 231 pases en subcultivo durante 13 años, demostraron atenuación a una forma no virulenta, pero genéticamente estable, en cobayas. Esta cepa única de M. bovis recibió el nombre de bacilo de Calmette-Guerin (BCG). Primero probaron BCG en un bebé cuya madre y abuela tenían tuberculosis. El bebé no tuvo efectos secundarios y no desarrolló tuberculosis. De 1921 a 1924, 217 niños parisinos fueron vacunados con BCG y fueron inmunizados con éxito contra la tuberculosis. La tuberculosis parece tener efectos antitumorales, ya que en 1929, Pearl, a través de un estudio de autopsias en el Hospital Johns Hopkins, informó una menor frecuencia de cáncer en pacientes con tuberculosis. Continuó demostrando que los supervivientes de cáncer tenían una mayor incidencia de tuberculosis activa o curada que las personas que murieron de cáncer y concluyó que existía algún tipo de protección contra el cáncer conferida por la tuberculosis, pero no podía explicar un mecanismo (Loughlin, K.R. William B. Coley. Urol. Clin. North Am. 2020, 47, 413-417).

En 1930, debido a un error de laboratorio, un gran número de bebés alemanes fueron vacunados con un lote contaminado de BCG y murieron. Este incidente se conoció como el desastre de Lubeck y disminuyó el entusiasmo por la vacuna BCG como terapia contra el cáncer durante décadas. En 1959, se produjo el siguiente gran avance en la comprensión del mecanismo de acción de BCG: Old y sus colegas informaron que los ratones infectados con BCG mostraron una mayor resistencia al desafío con tumores trasplantados. La BCG provocó un aumento general de la actividad inmunitaria y se descubrió que activaba a los macrófagos que inhiben o destruyen las células cancerosas. Este hallazgo fue la primera evidencia directa de los efectos antitumorales de la BCG, y que se conoció como TNF.

En la década de 1970, Zbar y sus colegas definieron los criterios para una terapia exitosa con la BCG, que incluía (1) contacto cercano entre la BCG y células tumorales, (2) un huésped capaz de generar una respuesta inmunitaria a antígenos micobacterianos, (3) una carga limitada y (4) cantidades adecuadas de organismos BCG viables. En 1972, Morales y sus colegas iniciaron el protocolo BCG original para el tratamiento del cáncer de vejiga, que consistía en 6 dosis semanales de 120 mg en 50 ml de solución salina instilada a través de un catéter uretral. Se realizó una inyección intradérmica de BCG para evaluar la inyección de hipersensibilidad retardada. El seguimiento inicial de 10 pacientes no mostró recurrencia del cáncer de vejiga en el seguimiento de 47 meses después del tratamiento con BCG. En 1975, de Kernion y sus colegas informaron que un melanoma aislado en la vejiga se trató con éxito con una inyección cistoscópica de la vacuna BCG. En 1978, Morales recibió la aprobación del Instituto Nacional del Cáncer para financiar 2 ensayos aleatorizados para probar la eficacia del régimen combinado de BCG contra el cáncer de vejiga superficial. Continuaron acumulándose más datos para respaldar la eficacia de BCG en el tratamiento del cáncer de vejiga superficial. Finalmente, en 1990, la FDA aprobó el uso generalizado de BCG intravesical para el tratamiento del cáncer de vejiga no invasivo (Loughlin, K.R. William B. Coley. Urol. Clin. North Am. 2020, 47, 413-417).

Sin embargo, dado el conocimiento limitado de los fundamentos de inmunología básica en ese momento, los mecanismos que explicarían la eficacia de esta estrategia no estaban claros, lo que limitaba el desarrollo continuo de la toxina de Coley. Finalmente, con la llegada de la radioterapia y la quimioterapia, que podrían estandarizarse más fácilmente, relegó a un segundo plano esta nueva estrategia terapéutica, compuesta por bacterias muertas o inactivadas. A medida que nuestra comprensión del sistema inmunológico ha ido madurando, ha despertado un interés renovado en el uso de bacterias atenuadas, inactivadas y muertas para estimular la inmunidad antitumoral.

A diferencia del enfoque adoptado por Coley, cuyas toxinas no dieron como resultado específicamente una respuesta antitumoral, los enfoques actuales se centran en lograr una inmunidad antitumoral completa y duradera mediante la inducción de respuestas inmunitarias específicas del tumor. Para obtener esta inmunidad específica del tumor, la estrategia empleada por la mayoría de las inmunoterapias tumorales es activar los linfocitos T citotóxicos (CTL) que reconocen los péptidos antigénicos específicos del tumor y / o asociados al tumor que se presentan en el MHC de clase I y se dirigen a las células tumorales para activar su lisis. De hecho, el mayor avance en el tratamiento de tumores sólidos de los últimos diez años ha sido precisamente el empleo de anticuerpos monoclonales que bloquean señales inmunosupresoras inducidas por la célula tumoral; principalmente las que implican las proteínas CTLA-4 y PD-1/PD-L1; siendo este descubrimiento merecedor del Nobel de Medicina de 2018. De este modo, la muerte de células tumorales mediada por CTL ocurre comúnmente en un proceso llamado inmunovigilancia, en el cual el sistema inmunológico reconoce y destruye las células malignas antes incluso de la detección clínica. Desafortunadamente, algunas células malignas pueden escapar de la destrucción inmunomediada y convertirse en un tumor clínicamente relevante. El grado de respuesta a estas terapias anti-inmunosupresoras depende, en gran medida, de la carga mutacional del tumor y de la inmunogenicidad de los neoantígenos que expresa. Los tumores que han escapado a la inmunovigilancia han podido lograr esto, en parte, al promover el desarrollo de un microambiente inmunosupresor que deteriora la función y supervivencia de los linfocitos que antitumorales, incluidos los linfocitos T citotóxicos. Además del uso de anticuerpos anti-CTLA4 o anti-PD-1/PD-L1, se han empleado otras estrategias para superar este microambiente inmunosupresor mediante la activación y movilización de CTL en el entorno tumoral, como el uso de virus oncolíticos, vacunas de células dendríticas, terapia de células adoptivas y vectores microbianos para atacar neoantígenos tumorales (TAA). Cada una de estas estrategias tiene sus propias ventajas y desventajas. Aparte de la importante consideración de la toxicidad en el uso de virus oncolíticos, la replicación viral fuera del tumor y el desarrollo de anticuerpos neutralizantes pueden prevenir el uso reiterado de esta estrategia. Los vectores bacterianos como Streptococcus pyogenes, Clostridium novyi, Salmonella entérica y Listeria monocytogenes son todos vectores que se han utilizado en la inmunoterapia del cáncer y no tienen este inconveniente de inmunidad neutralizante preexistente. Sin embargo, lo que diferencia a L. monocytogenes del resto de vacunas bacterianas y la convierte en un vector superior para la liberación de neoantígenos tumorales es su ciclo de vida único. Los macrófagos fagocitan fácilmente L. monocytogenes en el curso de la infección y, una vez dentro del fagolisosoma, expresan y secretan una citolisina, la listeriolisina O (LLO). LLO, junto con las fosfolipasas bacterianas, altera la integridad del fagosoma y permite que L. monocytogenes escape al citosol y evite la destrucción en el fagolisosoma. Una vez en el citosol, L. monocytogenes prolifera y secreta factores de virulencia adicionales que la impulsan al interior de la célula y a las células adyacentes para propagar la infección. Es este ciclo de vida lo que hace que L. monocytogenes sea un candidato ideal para administrar antígenos, pues estimula tanto las vías MHC I como II, activando las células T CD4+ y, lo que es más importante para las respuestas tumorales líticas, las células T CD8+ citotóxicas. De hecho, la infección por L. monocytogenes provoca una respuesta de memoria inmunitaria robusta y duradera que brinda protección contra la infección en caso de exposición futura al patógeno (Oladejo, M et al. Front. Immunol. 2021, 12, 642316).

Además de su ciclo de vida único, L. monocytogenes ofrece una serie de ventajas como vector para la inmunoterapia tumoral. Estudios anteriores encontraron que los antígenos codificados por las construcciones de L. monocytogenes se administran de forma más eficiente a la maquinaria de presentación y procesamiento de antígenos que los codificados por otros vectores bacterianos. Además, los vectores de L. monocytogenes tienen la capacidad de romper la tolerancia inmunológica, a través de la reducción de células supresoras derivadas de mieloides inmunosupresoras (MDSC) y células T reguladoras (Tregs) dentro del microambiente tumoral. Finalmente, además de la captación selectiva en el bazo y el hígado de los sujetos infectados, L. monocytogenes muestra un tropismo específico para los tumores primarios y metastásicos. Estas características atractivas, incluida la facilidad de manipulación y atenuación de este organismo, han sido aprovechadas por varios grupos en el desarrollo de cepas atenuadas de L. monocytogenes, que expresan una amplia variedad de antígenos tumorales (Oladejo, M et al. Front. Immunol. 2021, 12, 642316).

La translocación bacteriana es el paso de bacterias viables desde el tracto gastrointestinal (GI) a sitios extraintestinales, como el complejo de ganglios linfáticos mesentéricos (MLN), hígado, bazo, riñón y torrente sanguíneo. Los tres mecanismos principales que promueven la translocación bacteriana en modelos animales se identifican como: (1) alteración del equilibrio gastrointestinal ecológico para permitir el crecimiento excesivo de bacterias intestinales, (2) aumento de la permeabilidad de la barrera de la mucosa intestinal y (3) deficiencias en el sistema inmunológico del huésped. En modelos animales en los que la barrera intestinal no está físicamente dañada, las bacterias autóctonas viajan intracelularmente a través de las células epiteliales que recubren los intestinos y luego viajan a través de la linfa hasta el MLN. En modelos animales que muestran daño en el epitelio de la mucosa, las bacterias autóctonas se mueven intercelularmente entre las células epiteliales para acceder directamente a la sangre. Se han cultivado bacterias GI autóctonas directamente del MLN de varios tipos de pacientes.

Uno de los principales problemas asociados a la limitada eficacia de los agentes antineoplásicos es la evasión inmune que ejercen las células tumorales que las hacen pasar desapercibidas para el sistema inmunológico. Por tanto, la respuesta del sistema inmunológico sigue siendo insuficiente para reaccionar frente al cáncer, especialmente en aquellos tumores que presentan una carga mutacional baja (TMB). Una forma exitosa de superar la evasión inmunitaria tumoral ha sido el uso de inhibidores de puntos de control inmunitarios (ICI) que aumentan el nivel de activación contra la presencia de neoantígenos por parte del sistema inmunológico, inhibiendo así las señales anérgicas, como las impulsadas por PD-1 y CTLA-4. Aun así, la cantidad de pacientes que podrían beneficiarse de la ICI está limitada por la TMB relativamente baja que presentan la mayoría de los cánceres. Es necesario, por tanto, encontrar estrategias alternativas que contrarresten el efecto de la evasión inmune.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Representación esquemática del procedimiento llevado a cabo en el ejemplo de la invención. Brevemente, la secuenciación del RNA tumoral produce varios neoantígenos cuyas secuencias codificantes se pueden sintetizar y clonar en plásmidos de bacterias. Las bacterias comensales o atenuadas del intestino humano se transforman con estos plásmidos y se administran por vía oral al mismo paciente con cáncer. Una vez que las bacterias han encontrado un nicho adecuado en la mucosa del colon, se administran los compuestos químicos que inducen la translocación bacteriana. Esta inducción permitirá que las bacterias accedan a los vasos sanguíneos, los ganglios linfáticos y otros órganos inmunitarios provocando así, una vez que las células presentadoras de antígenos presentan los neoantígenos, una respuesta de las células T CD4 y CD8 contra las células tumorales que expresan los neoantígenos. Creado con biorender.com

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han combinado la inducción de la translocación bacteriana con el uso de bacterias manipuladas que codifican neoantígenos tumorales como inmunoterapia para el tratamiento del cáncer.

El objetivo es disminuir el umbral de activación inmunológica, alcanzando así una respuesta adecuada al inducir la translocación bacteriana, induciendo un estado de tipo autoinmune en un paciente con cáncer al que previamente se le ha administrado un vector bacteriano que incluye ácidos nucleicos que codifican neoantígenos inmunogénicos. Esta aproximación tiene la ventaja de que el desencadenante de este estado similar a una reacción autoinmune es, de hecho, el propio vehículo, mediante el cual los neoantígenos tumorales entran en contacto el sistema inmune. Este estado de tipo autoinmune debe ser transitorio, ya que debe provocar el efecto antitumoral y la inflamación aguda sin provocar inflamación crónica, asociada a efectos protumorales y asociada con el desarrollo del cáncer. Un estado agudo de este tipo ocurre después de una reacción inflamatoria local en el intestino, produciendo así una rotura transitoria en la barrera de la mucosa intestinal y el acceso de bacterias colónicas a sitios corporales estériles como la sangre.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a una composición o un kit de partes, de ahora en adelante composición de la invención o kit de partes de la invención, que comprende:

a) un compuesto que favorecen la pérdida transitoria de la barrera intestinal y la translocación bacteriana, y

b) un vector bacteriano que incluye una molécula de ácidos nucleicos que codifican un agente terapéutico.

Las condiciones que favorecen la pérdida transitoria de la barrera intestinal y la translocación bacteriana son ciertos compuestos que son conocidos en el estado de la técnica, como, por ejemplo, pero sin limitarnos, medicamentos como antibióticos, agentes quimioterápicos y sustancias irritantes como el dextrano-sulfato sódico (DSS) que han demostrado la inducción de la translocación bacteriana en modelos animales no autoinmunes. Uno de estos compuestos podría administrarse al mismo paciente con cáncer una vez que la bacteria transformada, que contiene DNA que codifica uno o varios agentes terapéuticos, preferiblemente neoantígenos tumorales específicos, haya encontrado un nicho en la mucosa del colon. El aumento de la permeabilidad de la barrera epitelial generada de esta manera favorecería una exposición sistémica de bacterias que expresan dichos agentes terapéuticos, preferiblemente neoantígenos tumorales al sistema inmunológico. Alternativamente, los plásmidos de bacterias modificados pueden transferirse in vivo a las células huésped (es decir, células presentadoras de antígenos (APC)) para la producción de neoantígenos. En cualquier caso, esta misma respuesta inmunitaria ejercida por la translocación bacteriana terapéutica inducida (ITBT) atacaría las células tumorales creando un infiltrado linfocítico peritumoral e intratumoral, generalmente asociado con un mejor pronóstico y supervivencia.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el compuesto que favorecen la pérdida de la barrera intestinal y la translocación bacteriana se selecciona de la lista que consiste en: un antibiótico, un agente quimioterápico, un compuesto irritante, o cualquiera de sus combinaciones. En una realización preferida es el IFN-y y TNF-a. En otra realización preferida son AGEs (compuestos avanzados de glicosilación). Más preferiblemente es un compuesto irritante, y más específicamente el dextrano-sulfato sódico (DSS)

La permeabilidad de la barrera intestinal es farmacológicamente moldeable con muchas sustancias utilizadas en la práctica clínica de gastroenterología, como esteroides, aminosalicilatos, biológicos (como anti-TNF-a), probióticos, protectores de las mucosas o sulfato de dextrano sódico (DSS), lo que permite que este proceso se realice de forma controlable e incluso detenible.

El término "probiótico" se utiliza para hacer referencia a microorganismos vivos no patógenos, por ejemplo, bacterias, que pueden conferir beneficios para la salud a un organismo huésped que contiene una cantidad apropiada del microorganismo. En algunas realizaciones, el organismo huésped es un mamífero. En algunas realizaciones, el organismo huésped es un ser humano. En algunas realizaciones, las bacterias probióticas son bacterias gramnegativas. En algunas realizaciones, las bacterias probióticas son bacterias grampositivas. Algunas especies, cepas y / o subtipos de bacterias no patógenas se reconocen actualmente como bacterias probióticas. Los ejemplos de bacterias probióticas incluyen, pero no se limitan a, ciertas cepas pertenecientes al género Bifidobacteria, Escherichia coli, Lactobacillus y Saccharomyces, por ejemplo, Bifidobacterium bifidum, Enterococcus faecium, Escherichia coli cepa Nissle, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum y Saccharomyces boulardii. El probiótico puede ser una cepa de bacteria variante o mutante. Las bacterias no patógenas pueden modificarse por ingeniería genética para potenciar o mejorar las propiedades biológicas deseadas, por ejemplo, la capacidad de supervivencia. Las bacterias no patógenas pueden modificarse genéticamente para proporcionar propiedades probióticas. Las bacterias probióticas pueden modificarse o programarse genéticamente para mejorar o mejorar las propiedades probióticas. Las bacterias no patógenas pueden modificarse genéticamente para proporcionar propiedades probióticas.

Se emplean bacterias pertenecientes a géneros de lactobacilos o enterococos como Enterococcus gallinarum, un patobionte que induce autoinmunidad, coloniza las venas mesentéricas y los ganglios linfáticos, el hígado y el bazo en ratones y humanos.

También se emplean vectores bacterianos atenuados como Salmonella enterica Typhimurium o Listeria monocytogenes, cepas diseñadas para retener plásmidos, expresar antígenos heterólogos sobre factores inducibles y mostrar neoantígenos en la superficie. Además, L. monocytogenes puede escapar de la degradación fagolisosómica a través de sus factores de virulencia, lo que da como resultado un ciclo de vida intracelular que permite que los neoantígenos se expresen tanto por HLA-I como HLA-II. Además, estas bacterias muestran tropismo por las condiciones tisulares asociadas con el crecimiento del cáncer, como microambientes hipóxicos y necróticos y vasos "con fugas” asociados con la angiogénesis tumoral. Otra posible bacteria candidata podría ser Escherichia coli.

Otras condiciones necesarias a tener en cuenta para favorecer la translocación bacteriana son la administración de antibióticos (ciclo de 2 días de ceftriaxona permite que E. faecalis y Lactobacillus spp se diseminen al hígado, el bazo y los ganglios linfáticos dentro de los 3-4 días tras la exposición y con posterior aclaramiento después de 14 días). Agonistas de TLR7 tales como imiquimod e inhibidores de la bomba de protones; agentes quimioterápicos como ciclofosfamida o fármacos antiinflamatorios no esteroides como indometacina.

Aparte de la forma particular de L. monocytogenes para estimular las células T CD8+ a través de HLA-I, las bacterias translocadas que expresan diferentes neoantígenos tumorales que comprenden de 11 a 20 aminoácidos de longitud cada uno pueden ser presentadas por moléculas de HLA-II en APC y ser reconocidas por células T CD4+. Estas respuestas CD4+ han demostrado ser eficaces en tratamientos antitumorales. De hecho, en pacientes con melanoma o glioblastoma se ha observado una buena respuesta frente a péptidos inmunizantes que favorecen a CD4+ frente a CD8+. El uso de la presentación de antígenos a través de HLA-II está respaldado por el hecho de que la mayoría de los mutanomas inmunogénicos son reconocidos por las células T CD4+ y que la vacunación con tales mutaciones reactivas a las células T CD4+ confiere una fuerte actividad antitumoral.

Sin embargo, es importante destacar que la ITBT no está exenta de los riesgos asociados con las reacciones inflamatorias sistémicas como las tormentas de citoquinas, pero tampoco lo está el uso de quimioterapia convencional que afecta gravemente a las células sanas en proliferación. Además, y a diferencia de la ITBT, la quimiorradioterapia no proporciona un efecto específico contra un tumor individual. Por otro lado, la ITBT puede mostrar una eficacia reducida debido a la pérdida de plásmido, a los neoantígenos inmunogénicos deficientes incluidos en la vacuna y a la aparición de mutaciones tumorales adicionales durante el desarrollo de la vacuna. Sin duda, la aplicación de ITBT requeriría un ajuste fino para obtener una inmunogenicidad máxima contra neoantígenos, con efectos secundarios mínimos, incluida también la posible conversión de bacterias atenuadas a un fenotipo patogénico silvestre, para el que antibióticos específicos podrían ser útiles ante esta situación.

Por tanto, todos los microorganismos que podrían usarse potencialmente en este entorno terapéutico deben ser sensibles a muchos antibióticos para prevenir algunos efectos secundarios no deseados de este tratamiento. Esto es fácil de conseguir en el laboratorio, tanto eligiendo microorganismos basalmente sensibles como generando sensibilidad in vitro, e incluso la generación de resistencias a los tratamientos podría ser en algunos casos prevenible.

En una realización preferida de este aspecto de la invención el vector bacteriano que incluye ácidos nucleicos que codifican un agente terapéutico se selecciona de la lista que consiste en: Streptococcus spp, Clostridium spp., Salmonella spp., Listeria spp., Escherichia spp, Enterococcus spp, Lactobacillus spp. o cualquiera de sus combinaciones. Más preferiblemente el vector bacteriano que incluye ácidos nucleicos que codifican un agente terapéutico se selecciona de la lista que consiste en: Streptococcus pyogenes, Clostridium novyi, Salmonella entérica, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Enterococcus gallinarum, Lactobacillus spp. o cualquiera de sus combinaciones. Más preferiblemente, el vector bacteriano que incluye ácidos nucleicos que codifican un agente terapéutico es Listeria monocytogenes.

En esta memoria “'ácidos nucleicos”, "molécula de ácidos nucleicos” o "Molécula de ácido nucleico aislada" significa un ADN o ARN de origen genómico, ARNm, ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos que no está asociado con la totalidad o una parte de un polinucleótido en el que el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza o está unido a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza. Para los propósitos de esta descripción, debe entenderse que "una molécula de ácido nucleico que comprende" una secuencia de nucleótidos particular no incluye cromosomas intactos. Las moléculas de ácido nucleico aisladas que "comprenden" secuencias de ácido nucleico especificadas pueden incluir, además de las secuencias especificadas, secuencias codificantes de hasta diez o incluso hasta veinte o más de otras proteínas o porciones o fragmentos de las mismas, o puede incluir secuencias reguladoras unidas operativamente que controlan la expresión de la región codificante de las secuencias de ácido nucleico enumeradas, y/o puede incluir secuencias de vector. La frase "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

Un ácido nucleico está "operativamente enlazado” cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretor está operativamente unido al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente ligado a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosoma está operativamente unido a una secuencia codificante si está posicionado para facilitar la traducción. Generalmente, "operativamente enlazado" significa que las secuencias de ADN que se enlazan son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué ser contiguos. La vinculación se logra mediante ligación en sitios de restricción convenientes.

El término "plásmido" significa el vehículo mediante el cual se puede introducir una secuencia de ADN o ARN (por ejemplo, un gen ajeno) en una célula huésped, para transformar al huésped y promover la expresión (por ejemplo, transcripción y traducción) de la secuencia introducida. Los plásmidos comprenden típicamente el ADN de un agente transmisible, en el que se inserta ADN ajeno. Una forma común de insertar un segmento de ADN en otro segmento de ADN implica el uso de enzimas llamadas enzimas de restricción que escinden el ADN en sitios específicos (grupos específicos de nucleótidos) llamados sitios de restricción. Un "casete" se refiere a una secuencia de codificación de ADN o segmento de ADN que codifica un producto de expresión que puede insertarse en un vector en sitios de restricción definidos. Los sitios de restricción del casete están diseñados para asegurar la inserción del casete en el marco de lectura adecuado. Generalmente, El ADN ajeno se inserta en uno o más sitios de restricción del ADN del vector y luego es transportado por el vector a una célula huésped junto con el ADN del vector transmisible. Un segmento o secuencia de ADN que tiene ADN insertado o agregado, como un vector de expresión, también puede denominarse "construcción de ADN". Un plásmido es generalmente una molécula autónoma de ADN de doble hebra, generalmente de origen bacteriano, que puede aceptar fácilmente ADN adicional (ajeno) y que puede introducirse fácilmente en una célula huésped adecuada. Un vector plásmido a menudo contiene ADN codificante y ADN promotor y tiene uno o más sitios de restricción adecuados para insertar ADN ajeno. El ADN codificante es una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos particular para una proteína o enzima en particular. El ADN promotor es una secuencia de ADN que inicia, regula, o media o controla de otro modo la expresión del ADN codificante. El ADN promotor y el ADN codificante pueden ser del mismo gen o de diferentes genes, y pueden ser del mismo organismo o de diferentes organismos. Los plásmidos incluirán a menudo uno o más sistemas de replicación para clonación o expresión, uno o más marcadores para la selección en el huésped, por ejemplo, resistencia a antibióticos, y uno o más casetes de expresión. Los plásmidos de la presente invención pueden estar introducidos en las bacterias que actúan como vectores, y llevan las moléculas de ácidos nucleicos que codifican el o los agentes terapéuticos.

Por tanto, las bacterias que actúan como vectores contienen uno o más plásmidos que producen un agente terapéutico, es decir, uno o más plásmidos que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica el agente terapéutico. Por ejemplo, las bacterias son capaces de administrar agentes terapéuticos locales y específicos de tumores, en particular agentes anticancerígenos, reduciendo así la citotoxicidad sistémica y/o la disfunción inmunológica asociada con la administración sistémica de dichos agentes.

Las bacterias descritas en este documento son capaces de administrar uno o más agentes terapéuticos. En algunas realizaciones de este aspecto de la invención, el agente terapéutico se produce mediante un plásmido que se introduce en las bacterias. En algunas realizaciones, el plásmido comprende un ácido nucleico que codifica un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el ácido nucleico está operativamente unido a un promotor. En algunas realizaciones, el promotor es constitutivo. En algunas realizaciones, el promotor es inducible.

Los ejemplos de plásmido incluyen, pero no se limitan a, pColE1, pl5A, rAH162 y pSClOl.

Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen, entre otros y sin limitarnos, un promotor de beta actina de pollo, un promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV) retroviral (opcionalmente con un potenciador del RSV), un promotor de citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con un potenciador del CMV), un promotor SV40, un promotor de dihidrofolato reductasa, un promotor de 13-actina, un promotor de fosfoglicerol quinasa (PGK) y un promotor de EFla (Invitrogen).

Los promotores inducibles permiten la regulación de la expresión génica y pueden regularse mediante compuestos suministrados de forma exógena, factores ambientales como la temperatura o la presencia de un estado fisiológico específico, por ejemplo, fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula o solo en células en replicación. Los promotores inducibles y los sistemas inducibles están disponibles en una variedad de fuentes comerciales, que incluyen, sin limitación, Invitrogen, Clontech y Ariad. Ejemplos de promotores inducibles regulados por promotores suministrados exógenamente incluyen un promotor de metalotionina de oveja (MT) inducible por zinc, un promotor de virus de tumor mamario de ratón inducible por dexametasona (Dex) (MMTV), un sistema promotor de polimerasa T7 (documento WO 98/10088), un promotor de insectos ecdisona (No et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3346-3351 (1996)), un sistema reprimible por tetraciclina (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992)), un sistema inducible por tetraciclina (Gossen et al., Science 268: 1766-1769 (1995), un sistema inducible por RU486 (Wang et al, Nat. Biotech. 15: 239- 243 (1997) y Wang y col., Gene Ther. 4: 432-441 (1997)) y un sistema inducible por rapamicina (Magari y col., J. Clin. Invest.

100: 2865-2872 (1997)).

Otros tipos más de promotores inducibles que pueden ser útiles en este contexto son aquellos que están regulados por un estado fisiológico específico, por ejemplo, temperatura, fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula o sólo en células replicantes. En algunas realizaciones, el agente terapéutico está operativamente unido a un promotor inducible directa o indirectamente que se induce en condiciones anaeróbicas o con poco oxígeno. En algunas realizaciones, el agente terapéutico está operativamente unido a un promotor inducible directa o indirectamente que se induce en condiciones inflamatorias (por ejemplo, en presencia de RNS, ROS). En algunas realizaciones, el agente terapéutico está operativamente unido a un promotor inducible directa o indirectamente que se induce en condiciones inmunosupresoras, por ejemplo, como se encuentra en el tumor.

En algunas realizaciones, el promotor inducible es un promotor dependiente del nivel de oxígeno y el agente terapéutico se expresa en condiciones de bajo oxígeno, microaeróbicas o anaeróbicas. Por ejemplo, en condiciones de bajo nivel de oxígeno, el promotor dependiente del nivel de oxígeno se activa mediante un factor de transcripción sensorial del nivel de oxígeno correspondiente, lo que impulsa la producción de una molécula anticancerígena. Los promotores inducibles para condiciones hipóxicas tales como FMR, AMR y DMR pueden usarse, así como aquellos para niveles elevados de especies reactivas de oxígeno (ROS).

En algunas realizaciones, el plásmido comprende además otros componentes que incluyen, pero no se limitan a, etiqueta de hemaglutinina C-terminal, elementos estabilizadores (para minimizar la pérdida de plásmido in vivo), genes de resistencia a antibióticos y terminadores. Los elementos estabilizadores incluyen, entre otros, el sistema hok/sok (Gerdes et al. 1986) y el sistema de partición alp7 (Derman et al.

2012). Los genes de resistencia a antibióticos incluyen, entre otros, la resistencia a ampicilina, tetraciclina y kanamicina. En algunas realizaciones, el plásmido tiene muchas copias. En algunas realizaciones, el plásmido es un número de copias medio. En algunas realizaciones, el plásmido tiene pocas copias.

En otra realización preferida, la composición o el kit de partes de la invención además comprende otro principio activo. En otra realización preferida, la composición o el kit de partes de la invención además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. Aún más preferiblemente la composición o el kit de partes de la invención es una composición farmacéutica.

El otro principio activo puede ser otro agente antitumoral, o, para controlar y detener la permeabilidad de la mucosa intestinal, por ejemplo, pero sin limitarnos, agentes protectores de la mucosa.

En otra realización preferida, el agente terapéutico se selecciona de entre: un inhibidor de una molécula inmunosupresora, una molécula inmunoestimuladora, una toxina, un antígeno tumoral, o cualquiera de sus combinaciones.

El término "agente", como se usa en este documento, significa una sustancia que produce o es capaz de producir un efecto e incluiría, entre otros, productos químicos, farmacéuticos, biológicos, moléculas orgánicas pequeñas, anticuerpos, ácidos nucleicos, péptidos y proteínas.

En esta memoria "agente terapéutico” o "principio activo", "substancia activa", "substancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" o "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto.

Como se usa en el presente documento, una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de bacterias de cualquiera de las realizaciones anteriores con otros componentes tales como un vehículo y/o excipiente adecuado farmacéuticamente aceptable.

El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa alérgica o similar cuando se administran a un huésped, tales como malestar gástrico, mareos y similares, cuando se administran a un ser humano, y aprobadas por un organismo regulador, como, por ejemplo, los incluidos en cualquier farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente en humanos.

El término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar aún más la administración de un ingrediente activo. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, bicarbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales, polietilenglicoles y tensioactivos, incluyendo, por ejemplo, polisorbato 20.

En algunas realizaciones, el agente terapéutico es un inhibidor de una molécula inmunosupresora, por ejemplo, un inhibidor de una molécula de control inmunológico. El sistema inmunológico está finamente regulado para proteger de los patógenos invasores, al tiempo que evita las respuestas inmunitarias contra las propias células del huésped. Las moléculas de los puntos de control inmunológico ayudan a prevenir el desarrollo de enfermedades autoinmunes. Varios medicamentos contra el cáncer tienen como objetivo inhibir estos puntos de control para activar el sistema inmunológico y estimular las respuestas antitumorales del paciente, permitiendo así que el sistema inmunológico monte respuestas inmunes contra los autoantígenos de las células cancerosas. Sin embargo, la inmunorregulación alterada puede provocar una disfunción inmunológica y conducir a trastornos autoinmunes. El problema de la disfunción inmunológica, por ejemplo, el desarrollo de una respuesta autoinmune no deseada, se puede abordar administrando un inhibidor del punto de control inmunológico o un inhibidor de otra molécula inmunosupresora localmente en el sitio del tumor.

Por tanto, en otra realización preferida el inhibidor de una molécula inmunosupresora es un inhibidor de una molécula de control inmunológico. En otra realización preferida la molécula de control inmunológico que se va a inhibir se selecciona de la lista que consiste en: TGF-b, CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIGIT, VISTA, LAG-3, TIM1, TIM3, CEACAM1, LAIR-l, HVEM, BTLA, CD160, CD200, CD200R, CD39, CD73, CD86, B7-H3, B7-H4, IDO, TDO, KIR, A2aR, o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización de este aspecto de la invención el inhibidor de una molécula inmunosupresora es un anticuerpo. En otra realización preferida el anticuerpo es un nanocuerpo. Los nanocuerpos son anticuerpos de un solo dominio que son de tamaño pequeño (aproximadamente 15 kDa), mantienen una fuerte afinidad de unión y pueden producirse de manera recombinante en bacterias. Estos nanocuerpos abordan los problemas de la mala penetración tumoral de algunos anticuerpos inhibidores de puntos de control grandes en algunas formas de cáncer, como el de pulmón. Los nanocuerpos también minimizarán los eventos adversos relacionados con el sistema inmunológico (IRAE).

En algunas realizaciones, los nanocuerpos se dirigen a inhibidores de puntos de control que incluyen, pero no se limitan a, PD-1, PD-L1 y CTLA-4, o cualquiera de sus combinaciones.

En ciertas realizaciones, las bacterias producen un nanocuerpo anti-PD-1 y un nanocuerpo contra uno o más puntos de control seleccionados de CTLA-4, PD-L1, PD-L2, TIGIT, VISTA, LAG-3, TIM1, TIM3, CEACAM1, LAIR-l, HVEM, BTLA, CD160, CD200, CD200R, CD39, CD73, B7-H3, B7-H4, IDO, TDO, KIR y A2aR.

En ciertas realizaciones, las bacterias producen un nanocuerpo anti-CTLA-4 y un nanocuerpo contra uno o más puntos de control seleccionados entre PD-1, PD-L1, PD-L2, TIGIT, VISTA, LAG-3, TIM1, TIM3, CEACAM1, LAIR-l, HVEM, BTLA, CD160, CD200, CD200R, CD39, CD73, B7-H3, B7-H4, IDO, TDO, KIR y A2aR.

En otra realización preferida de la invención la molécula inmunoestimuladora es una quimiocina o una citocina. Más preferiblemente la molécula inmunoestimuladora se selecciona de la lista que consiste en: CCL2, CXCL9, CXCL16, IL-18, IL-15, GM-CSF, IL-2, IL-15, IL-12, IL-7, IL-21, TNF, IFN-gamma, o cualquiera de sus combinaciones.

En algunas realizaciones, el agente terapéutico es un heterodímero que comprende subunidades de más de una quimiocina o citocina. Un ejemplo de tal heterodímero es ILl2p70, un heterodímero compuesto por ILl2p40 e ILl2p35.

En otras realizaciones, el agente terapéutico es una toxina. En algunas realizaciones, las toxinas derivan de bacterias. Estas toxinas incluirían, pero no se limitan a, hemolisina E, melitina, péptidos antimicrobianos, toxinas de difteria, toxinas de gelonina y toxinas de ántrax, o cualquiera de sus combinaciones.

En una realización adicional, el agente terapéutico es un antígeno tumoral. Tal como se usa en el presente documento, el término "antígeno tumoral" se refiere a antígenos específicos de tumores, antígenos asociados a tumores (TAA) y neoantígenos. Los antígenos tumorales son moléculas antigénicas producidas en las células tumorales que desencadenan una respuesta inmunitaria en el huésped. Estos antígenos específicos de tumores o antígenos asociados a tumores (TAA) pueden ser específicos de un tipo particular de célula cancerosa o célula tumoral y, por lo tanto, la respuesta inmune generada se dirigirá a ese tipo de célula cancerosa o tumoral. Ejemplos de antígenos tumorales son la ovoalbúmina y la citoqueratina 19 (CK19). CK19 es una citoqueratina de tipo I que se ha sugerido que es una diana antigénica adecuada para provocar inmunidad antitumoral. Los péptidos antigénicos del cáncer se enumeran en bases de datos, incluido el Instituto de Investigación del Cáncer.

Los antígenos tumorales se clasifican según su estructura molecular y su origen. Cualquier proteína producida en una célula tumoral que tenga una estructura anormal debido a una mutación puede actuar como antígeno tumoral. La mutación de los protooncogenes y los supresores de tumores que conducen a una producción anormal de proteínas son la causa del tumor y, por lo tanto, dichas proteínas anormales se denominan antígenos específicos del tumor. Los ejemplos de antígenos tumorales incluyen productos de oncogenes mutados y genes supresores de tumores. La mutación de los protooncogenes y los supresores de tumores que conducen a una producción anormal de proteínas son la causa del tumor y, por lo tanto, dichas proteínas anormales se denominan antígenos específicos del tumor. Los ejemplos de antígenos específicos de tumores incluyen los productos anormales de los genes ras y p53.

Por el contrario, la mutación de otros genes no relacionados con la formación del tumor puede conducir a la síntesis de proteínas anormales que se denominan antígenos asociados a tumores. Estos antígenos asociados a tumores son productos de otros genes mutados que están sobreexpresados o expresados de forma aberrante en proteínas celulares. Estos antígenos sobreexpresados / acumulados se expresan tanto en tejido normal como neoplásico, con un nivel de expresión muy elevado en la neoplasia. Cabe señalar que las clasificaciones de "antígeno específico de tumor" y "antígeno asociado a tumor" o de cualquiera de las "clases" descritas a continuación no pretenden ser mutuamente excluyentes, existe una superposición entre las diferentes "clases" con muchos antígenos tumorales. pertenecer a más de una "clase".

Los antígenos oncofetales son otra clase importante de antígenos tumorales que normalmente solo se expresan en tejidos fetales y en células somáticas cancerosas. Algunos ejemplos son la alfafetoproteína (AFP) y el antígeno carcinoembrionario (CEA). Estas proteínas se producen normalmente en las primeras etapas del desarrollo embrionario y desaparecen cuando el sistema inmunológico está completamente desarrollado. Por tanto, la auto-tolerancia no se desarrolla frente a estos antígenos.

Además de las proteínas, otras sustancias como los glicolípidos y las glicoproteínas de la superficie celular también pueden tener una estructura anormal en las células tumorales y, por lo tanto, podrían ser objetivos del sistema inmunológico. Por tanto, otros antígenos son glicolípidos de la superficie celular alterados y glicoproteínas que están alteradas postraduccionalmente, por ejemplo, tienen alteraciones asociadas a tumores en la glicosilación.

Otros ejemplos incluyen los antígenos de diferenciación de tejidos, que son antígenos específicos de un determinado tipo de tejido. Los antígenos de proteínas mutantes son más específicos de las células cancerosas porque las células normales no suelen contener estas proteínas. Las células normales mostrarán el antígeno proteico normal en sus moléculas MHC, mientras que las células cancerosas mostrarán la versión mutante. Los antígenos de diferenciación específicos del tipo celular están restringidos por linaje (expresados en gran parte por un único tipo histológico de cáncer). También existen antígenos específicos vasculares o estromales.

Los antígenos de cáncer de testículo se expresan solo por las células cancerosas y los tejidos reproductivos adultos como los testículos y la placenta. Los antígenos de cáncer de testículo son antígenos que se expresan principalmente en las células germinales de los testículos, pero también en los ovarios fetales y el trofoblasto. Algunas células cancerosas expresan de manera aberrante estas proteínas y, por lo tanto, presentan estos antígenos, lo que permite el ataque de las células T específicas de estos antígenos. Ejemplos de antígenos de este tipo son CTAG1B y MAGEA1.

Las proteínas que normalmente se producen en cantidades muy bajas, pero cuya producción aumenta drásticamente en las células tumorales, desencadenan una respuesta inmunitaria. Un ejemplo de dicha proteína es la enzima tirosinasa, necesaria para la producción de melanina. Normalmente, la tirosinasa se produce en cantidades mínimas, pero sus niveles están muy elevados en las células del melanoma.

Además de estos tipos de antígenos, también se conocen neoantígenos que pueden usarse para estimular una respuesta inmune. Estas células T antitumorales reconocen características antigénicas únicas de las células tumorales, caracterizadas por mutaciones que permiten el crecimiento descontrolado y/o dotan a estas células de la capacidad de hacer metástasis o sobrevivir dentro de ubicaciones fisiológicas fuera de donde se originó inicialmente el tumor. Dichos antígenos específicos de tumor (TSA) propios mutados, denominados "neoantígenos", representan el talón de Aquiles de un tumor en desarrollo. De hecho, datos recientes demuestran reactividades de células T inmunodominantes dirigidas contra neoantígenos mutados después del bloqueo de PD-1. Por tanto, la identificación del repertorio de neoantígenos único de un paciente proporciona una vía terapéutica a través de la cual promover una inmunidad antitumoral sistémica y duradera.

Por tanto, en otra realización preferida el antígeno tumoral se selecciona de la lista que consiste en: antígenos específicos de tumores, antígenos asociados a tumores (TAA), antígenos oncofetales, glicolípidos y glicoproteínas de la superficie celular alteradas y neoantígenos tumorales. Más preferiblemente el antígeno tumoral es un neoantígeno tumoral.

Otro aspecto se refiere a la composición o el kit de partes de la invención para su uso como medicamento.

El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales.

La administración de los compuestos, composiciones o formas farmacéuticas de la presente invención puede ser realizada mediante cualquier método adecuado, como la infusión intravenosa y las vías oral, tópica o parenteral. La administración oral es la preferida por la conveniencia de los pacientes.

La cantidad administrada de un compuesto o un kit de partes de la presente invención dependerá de la relativa eficacia del compuesto elegido, la severidad de la enfermedad a tratar y el peso del paciente. Sin embargo, los compuestos de esta invención serán administrados una o más veces al día, por ejemplo 1,2, 3 ó 4 veces diarias, con una dosis total entre 0.1 y 1000 mg/Kg/día. Es importante tener en cuenta que puede ser necesario introducir variaciones en la dosis, dependiendo de la edad y de la condición del paciente, así como modificaciones en la vía de administración.

Debe enfatizarse que el término "kit de partes” o también denominada "yuxtaposición”, en esta memoria, significa que los componentes de la preparación combinada no necesitan encontrarse presentes como unión, por ejemplo, en una composición verdadera, para poder encontrarse disponibles para su aplicación combinada, separada o secuencial. De esta manera, la expresión "yuxtapuesta" implica que no resulta necesariamente una combinación verdadera, a la vista de la separación física de los componentes

Así pues, en otra realización preferida, se administra inicialmente la composición que favorece la pérdida transitoria de la barrera intestinal y la translocación bacteriana y, posteriormente, la composición que comprende el vector bacteriano que incluye una molécula de ácidos nucleicos que codifican un agente terapéutico. En otra realización preferida se administra inicialmente la composición que comprende el vector bacteriano que incluye una molécula de ácidos nucleicos que codifican un agente terapéutico y, posteriormente, la composición que favorece la pérdida transitoria de la barrera intestinal y la translocación bacteriana.

En una realización preferida, se administra una dosis única de 4 g/día durante 5 días de DSS para favorecer la pérdida transitoria de la barrera intestinal y la translocación bacteriana, y se realiza la administración de las bacterias (vector bacteriano que incluye una molécula de ácidos nucleicos que codifican un agente terapéutico) en una concentración de 1 x 109 ufc por vía oral en dos dosis, los días 1 y 3 tras inicio del tratamiento con DSS.

Otro aspecto se refiere a la composición o el kit de partes de la invención para el tratamiento del cáncer.

Dado que los tumores con TMB alta suelen tener linfocitos infiltrantes en el tumor (TIL) abundantes y buena respuesta a la ICI (p. Ej., melanoma y adenocarcinomas de células escamosas y de pulmón), hipotéticamente la ITBT sería más apropiada para tratar tumores que no se caracterizan por TMB alta, como los de ovario, mama, próstata y cánceres colorrectales, por citar los más comunes.

Por tanto, más preferiblemente el cáncer se selecciona de la lista que consiste en: cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de próstata, cánceres colorrectales, o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida de la invención, la administración de la composición o el kit de partes de la invención es por vía oral.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN

1.- Aislamiento de DNA genómico del tumor primario y RNA total para realizar el perfil de expresión génica (RNA-seq) y secuenciación del exoma completo (WES).

Para seleccionar neoantígenos candidatos, el primer paso es el aislamiento y secuenciación masiva de ácidos nucleicos del tejido tumoral del paciente. Es muy útil utilizar RNA-seq preferentemente a la secuenciación del genoma/exoma completo (WGS/WES) porque examina todo el transcriptoma, incluidos los péptidos que surgen de la edición postranscripcional del RNA. Paralelamente, se lleva a cabo RNA-seq o WGS/WES sobre tejido normal para descartar alteraciones de RNA que no estén restringidas al tumor.

Identificación de neoantígenos tumorales con algoritmos para su detección (NeoPredPipe; TruNeo, otros...) con el fin de detectar la máxima cantidad posible de neoantígenos.

Existen varios enfoques para seleccionar neoantígenos de forma precisa que han jugado un papel fundamental en numerosos estudios. Algunos métodos bioinformáticos existentes, como MHCflurry y NetMHCpan, identifican neoantígenos principalmente a través de la predicción de la afinidad de unión péptido-MHC. Al considerar la producción de neoantígenos en bacterias, es conveniente usar algoritmos in silico para selección de péptidos que no estén especialmente sujetos a modificaciones postraduccionales como la glicosilación.

La selección de los mejores neoantígenos se basa en los siguientes criterios:

(1) alta expresión en el tumor, (2) afinidad de unión de péptido-MHC (pMHC) predicha (3) ubicada en dominios extracelulares de proteínas de membrana asociadas o integrales, (4) localizadas en dominios con modificaciones postraduccionales libres o bajas, (5) preferiblemente proteínas de marcado interés en CRC, (6) ubicadas preferiblemente en la región N-terminal y (7) neoantígenos que se describieron previamente en humanos.

Una vez que se han definido los neoantígenos, se deben realizar ensayos de cribado inmunológico para garantizar que estos antígenos serán procesados y presentados por APC y posteriormente reconocidos por las células T.

2 - Clonación o síntesis del DNA que codifica dichos neoantígenos en un vector de expresión bacteriano adecuado, para su expresión preferiblemente en superficie.

El siguiente paso implicaría la generación y transformación del constructo en las bacterias apropiadas, que se administrarían por vía oral. Los plásmidos que contienen DNA policistrónico o minigenes en tándem (TMG) que codifican un promedio de 10 neoantígenos diferentes (de 33 a 60 pares de bases de longitud cada uno) se generan y electroporan en especies de bacterias que forman parte de la microbiota del colon que son propensas a la translocación bacteriana y, naturalmente, tienen tropismo para las APC.

La liberación de neoantígenos en un entorno sistémico podría ser provocada por bacterias translocadas a través de diferentes medios. Uno de ellos, denominado bactofección, es mediante la entrega de un plásmido que se transferirá a la célula huésped para la producción de antígeno heterólogo, o la producción del antígeno heterólogo (a menudo seguido de secreción) por el propio vector bacteriano . El otro es expresando neoantígenos accesibles que pueden lograrse mediante algunas estrategias; por ejemplo, los genes que codifican los neoantígenos se pueden construir para que se sobreexpresen en la superficie de las bacterias o incluso se secreten en concentraciones extremadamente altas, para intentar el reconocimiento de ellos por parte del sistema inmunológico. Así, los genes heterólogos se pueden fusionar en el gen que codifica las proteínas de la membrana externa bacteriana, como OmpA, LamB o flagelina

3. - Transformación del microorganismo con el vector, expansión del cultivo bacteriano que contiene el plásmido hasta la dosis a administrar y control de calidad.

Encapsulación en comprimidos gastrorresistentes que permitan la llegada de las bacterias al intestino.

4. - Preparatorio del paciente con administración de DSS (dosis única, 4 g/día durante 5 días).

5. - Administración de las bacterias (1 x 109 ufc) por vía oral en dos dosis (días 1 y +3 tras inicio del tratamiento con DSS).

6. - Monitorización de la translocación bacteriana por seguimiento del gen del 16s rRNA en plasma de los pacientes mediante ddPCR.

7. - Hemograma (expansión de serie linfocitaria), bioquímica, inmunología (marcadores de inflamación, citoquinas, etc.), análisis de orina y heces (16s rRNA de la bacteria elegida para cuantificación).

8.- Análisis de la respuesta antitumoral y de supervivencia de los pacientes (seguimiento por imagen, consulta, marcadores específicos, etc.).

Claims (24)

REIVINDICACIONES

1. - Una composición o un kit de partes que comprende:

a) un compuesto que favorece la pérdida transitoria de la barrera intestinal y la translocación bacteriana, y

b) un vector bacteriano que incluye una molécula de ácidos nucleicos que codifican un agente terapéutico.

2. - La composición o el kit de partes según la reivindicación anterior, donde el compuesto que favorece la pérdida de la barrera intestinal y la translocación bacteriana se selecciona de la lista que consiste en: un antibiótico, un agente quimioterápico, un compuesto irritante, o cualquiera de sus combinaciones.

3. - La composición o el kit de partes según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el compuesto que favorece la pérdida de la barrera intestinal y la translocación bacteriana es un compuesto irritante.

4. - La composición o el kit de partes según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el compuesto irritante es el dextrano-sulfato sódico (DSS).

5. - La composición o el kit de partes según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el vector bacteriano que incluye ácidos nucleicos que codifican un agente terapéutico se selecciona de la lista que consiste en: Streptococcus spp, Clostridium spp., Salmonella spp., Listeria spp., Escherichia spp, Enterococcus spp, Lactobacillus spp. o cualquiera de sus combinaciones.

6. - La composición o el kit de partes según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el vector bacteriano que incluye ácidos nucleicos que codifican un agente terapéutico se selecciona de la lista que consiste en: Streptococcus pyogenes, Clostridium novyi, Salmonella entérica, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Enterococcus gallinarum, Lactobacillus spp. o cualquiera de sus combinaciones.

7.- La composición o el kit de partes según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el vector bacteriano que incluye ácidos nucleicos que codifican un agente terapéutico es Listeria monocytogenes.

8. - La composición o el kit de partes según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que además comprende otro principio activo.

9. - La composición o el kit de partes según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. - La composición o el kit de partes según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde el agente terapéutico se selecciona de entre: un inhibidor de una molécula inmunosupresora, una molécula inmunoestimuladora, una toxina, un antígeno tumoral, o cualquiera de sus combinaciones.

11. - La composición o el kit de partes según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde el inhibidor de una molécula inmunosupresora es un inhibidor de una molécula de control inmunológico.

12. - La composición o el kit de partes según la reivindicación anterior, donde la molécula de control inmunológico que se va a inhibir se selecciona de la lista que consiste en: TGF-b, CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIGIT, VISTA, LAG-3, TIM1 , TIM3, CEACAM1, LAIR-l, HVEM, BTLA, CD160, CD200, CD200R, CD39, CD73, CD86, B7-H3, B7-H4, IDO, TDO, KIR, A2aR, o cualquiera de sus combinaciones.

13. - La composición o el kit de partes según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde el inhibidor de una molécula inmunosupresora es un anticuerpo.

14. - La composición o el kit de partes según la reivindicación anterior, donde el anticuerpo es un nanocuerpo.

15. - La composición o el kit de partes según cualquiera de las reivindicaciones 13-14, donde el anticuerpo o nanocuerpo se dirige a inhibidores de puntos de control PD-1, PD-L1, CTLA-4, o cualquiera de sus combinaciones.

16. - La composición o el kit de partes según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde la molécula inmunoestimuladora es una quimiocina o una citocina.

17. - La composición o el kit de partes según la reivindicación anterior, donde la molécula inmunoestimuladora se selecciona de la lista que consiste en: CCL2, CXCL9, CXCL16, IL-18, IL-15, GM-CSF, IL-2, IL-15, IL-12, IL-7, IL-21, TNF, IFN-gamma, o cualquiera de sus combinaciones.

18. - La composición o el kit de partes según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde la toxina se selecciona de la lista que consiste en: hemolisina E, melitina, péptidos antimicrobianos, toxinas de la difteria, toxinas de gelonina, toxinas del ántrax, o cualquiera de sus combinaciones.

19. - La composición o el kit de partes según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde el antígeno tumoral se selecciona de la lista que consiste en: antígenos específicos de tumores, antígenos asociados a tumores (TAA), antígenos oncofetales, glicolípidos y glicoproteínas de la superficie celular alteradas y neoantígenos tumorales.

20. - La composición o el kit de partes según la reivindicación anterior, donde el antígeno tumoral es un neoantígeno tumoral.

21. - La composición o el kit de partes según cualquiera de las reivindicaciones 1-20, para su uso como medicamento.

22. - La composición o el kit de partes según cualquiera de las reivindicaciones 1-21, para el tratamiento del cáncer.

23. - La composición o el kit de partes según cualquiera de las reivindicaciones 1-22, para el tratamiento del cáncer donde el cáncer se selecciona de la lista que consiste en: cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de próstata, cánceres colorrectales, o cualquiera de sus combinaciones.

24.- La composición o el kit de partes para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 21-23, donde la administración es por vía oral.