JP2014506893A - 抗体およびFc含有標的化分子に基づく生理活性分子の標的送達のための細菌ミニ細胞による治療用組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、米国特許法第119条(e)の定めにより、2011年2月15日に出願された米国特許仮出願第61/442,999号および2011年8月22日に出願された米国特許仮出願第61/526,219号の優先権を主張する。これらの関連出願の内容は、それらの全体の参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
本願は電子形式の配列表と共に出願されている。その配列表は、2012年2月14日に作成された「SEQLISTING.TXT」という表題のファイルとして提出されており、そのサイズは248Kbである。その配列表の電子形式の情報はその全体の参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、疾患の阻害または予防ならびに標的化インビボ画像化診断技術のために核酸、タンパク質、放射性核種および小分子薬をインビボ送達およびインビトロ送達するための標的送達媒体として真正細菌ミニ細胞を作製、精製、製剤および使用するための組成物および方法に関する。
本発明の理解の補助のために本発明の背景を以下に説明するが、それは本発明の先行技術を説明または構成するものと認めるわけではない。本願で言及または引用される論文、特許および特許出願、および他の全ての文献および電子的に入手可能な情報の内容は、それぞれ個々の公開物が具体的および個々に参照により組み込まれると示された場合と同じ程度で、その全体の参照により本明細書に組み込まれる。出願者はそのような任意の論文、特許、特許出願、または他の文献のあらゆる情報資料を本願に物理的に組み込む権利を保持する。
、特定の細胞、器官および組織タイプを標的とした治療法の開発が、臨床的に重要な治療技術、診断技術、治療診断(theranostic)技術およびイメージング技術にとって重要な新境地を意味することが良く理解されている。
ンパク毒素である。いくつかの実施形態では、そのタンパク毒素は、ゲロニン、ジフテリア毒素A断片、ジフテリア毒素A/B断片、破傷風毒素、大腸菌熱不安定性毒素(LTIおよび/またはLTII)、コレラ毒素、ウエルシュ菌のイオタ毒素、シュードモナス外毒素A、志賀毒素、炭疽菌毒素、MTX(バチルス・スフェリカス(B.sphaericus)の殺虫毒素)、ペルフリンゴリシンO、ストレプトリシン、オオムギ毒素、メリチン、炭疽菌毒素LFおよびEF、アデニル酸シクラーゼ毒素、ボツリノリシンB、ボツリノリシンE3、ボツリノリシンC、ボツリヌス毒素A、コレラ毒素、クロストリジウム毒素A、Bおよびα、リシン、志賀A毒素、志賀様A毒素、コレラA毒素、百日咳SI毒素、大腸菌熱不安定性毒素(LTB)、リステリオリシンOのpH安定性異型体(pH非依存性;L461Tのアミノ酸置換)、リステリオリシンOの熱安定性異型体(E247MおよびD320Kのアミノ酸置換)、リステリオリシンOのpHおよび熱安定性異型体(E247M、D320KおよびL461Tのアミノ酸置換)、ストレプトリシンO、ストレプトリシンO c、ストレプトリシンO e、スフェリコリシン(sphaericolysin)、アントロリシン(anthrolysin)O、セレオリシン(cereolysin)、チューリンゲンシリシン(thuringiensilysin)O、ワイヘンステファネンシリシン(weihenstephanensilysin)、アルベオリシン(alveolysin)、ブレビリシン(brevilysin)、ブチリクリシン(butyriculysin)、テタノリジンO、ノビリシン(novyilysin)、レクチノリシン(lectinolysin)、ニューモリシン、ミチリシン(mitilysin)、シュードニューモリシン、スイリシン(suilysin)、インターメジリシン(intermedilysin)、イバノリシン(ivanolysin)、ゼーリゲリオリシン(seeligeriolysin)O、バジノリシン(vaginolysin)、ピオリシン(pyolysin)、ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択される。
本明細書で使用される場合、「Fc結合性ミニ細胞」という用語は、ミニ細胞組成物であって、そのミニ細胞組成物では、ミニ細胞およびそのミニ細胞が由来するミニ細胞産生細菌株は、(i)外膜輸出(分泌)シグナル、(ii)外膜アンカードメインまたは任意のその機能性同等物、および(iii)プロテインAまたはプロテインGのどちらかのFc結合ドメインのうちの1つ以上から構成される融合タンパク質をその細胞表面に発現および提示し、そのミニ細胞が抗体および/または融合体/複合体分子のFc領域との相互作用を介して外来性の抗体、Fc含有抗体派生物またはFc含有融合体/複合体分子に結合することができる、そのミニ細胞組成物を指す。いくつかの実施形態では、ミニ細胞は、(i)外膜輸出(分泌)シグナル、(ii)外膜アンカードメインまたは任意のその機能性同等物、および(iii)哺乳類Fc受容体のFc結合ドメイン(および任意のその機能性同等物)から構成されるFc結合性融合タンパク質を発現および提示し、そのミニ細胞は抗体および/または融合体/複合体分子のFc領域との相互作用を介して外来性の抗体またはFc含有融合体/複合体分子に結合することができる。
当技術分野で発見および特性解析されている。細胞分裂遺伝子の例にはzipA、sulA、secA、dicA、dicB、dicC、dicF、ftsA、ftsI、ftsN、ftsK、ftsL、ftsQ、ftsW、ftsZ、minC、minD、minE、seqA、ccdB、sfiC、およびddlBが挙げられるが、これらに限定されない。
性酵素、活性型カスパーゼ、プロカスパーゼ、サイトカイン、ケモカイン、細胞透過性ペプチド、または前述のものの任意の組合せおよび/または前述のもののうちの複数のものであり得る。
本願はインビトロおよびインビボ標的化生理活性分子送達剤およびワクチン剤としての細菌ミニ細胞の使用法に関連する。真正細菌ミニ細胞は、インビボで特定の細胞タイプを標的とし、多種多様な生理活性分子を送達するようにそれらを設計することができるという点で送達媒体として明白な利点を有する。細菌ミニ細胞は、動物で疾患または他の異常な生物学的プロセスの発生、進行、維持および持続に関与する細胞タイプまたは組織に対
してミニ細胞を特異的に標的化する抗体および/または他のFc含有融合体/複合体をそのミニ細胞の表面に提示するように設計されている。
c領域は、免疫系の様々な構成要素(例えば、ナチュラルキラー細胞の表面上のFc受容体)とのFc領域の相互作用によって免疫系を刺激する能力を有する。第二の有害な効果は、表面上の抗体(または他のFc領域含有融合体/複合体)の配向に関して固有の不均一性が存在し、その結果、全ての結合領域が露出するわけではないことである。可変結合部分の露出は、ミニ細胞表面上の機能性結合部分の数が少なくなることの結果として効力が消失する、および/または多様になる可能性を有する。これらの制限のどちらか、または両方がミニ細胞の免疫原性および/またはクリアランスを上昇させる可能性があり、それらを効果が弱い治療用送達媒体とする。しかしながら、本開示の背景で使用されるとき、本開示のFc結合性ミニ細胞は抗体の方向付けに役立ち、(i)抗体のFc領域が覆い隠され、ならびに(ii)結合した抗体および架橋した抗体の抗原結合部位が適切に提示される(すなわち、無作為方向付けと反対の、ミニ細胞から外側への方向付け)ので、ミニ細胞表面への抗体の化学架橋は上記の問題を回避する。本明細書で使用される場合、架橋試薬は「ホモ二官能性」または「ヘテロ二官能性」であり得る(それぞれ、同一または異なる反応性基を有する)。架橋試薬の例には表1に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。この点では、架橋に関する好ましい方法には、当技術分野において公知の標準的方法を用いて本明細書に記載されるようなFc結合性ミニ細胞を産生および精製すること、選択された標的化抗体を含有する溶液中でミニ細胞をインキュベートすること、結合を発生させること、過剰な未結合の抗体を洗い流すこと、架橋反応を実行すること、および、引き続いて過剰な架橋試薬を除去することが含まれる。
いるときのように、これらの制限もミニ細胞の免疫原性および/またはクリアランスを上昇させる可能性があり、それらを効果が弱い治療用送達媒体とする。本明細書に開示されるFc結合性ミニ細胞は、治療法としてそれらが投与される種に抗体が由来するとき、免疫原性を低下させる。Fc結合性ミニ細胞は抗体またはFc含有融合体/複合体のFc領域に結合するので、それによってFc領域が免疫系のFc受容体発現細胞(例えば、マクロファージおよびNK細胞)から隠匿される。さらに、利用する抗体が、治療法としてミニ細胞が投与される予定の種に由来するとき、そのミニ細胞は、その時には「自己」タンパク質(抗体)によって表面が覆われているという点で「ステルス性」になる。免疫能を有する生物は「自己」タンパク質を容易に認識することはない。「自己」タンパク質(例えば、抗体)に結合し、それらを提示するミニ細胞はそれによって免疫系からさらに隠匿される。標的化治療用ミニ細胞を免疫系から隠匿することは、ミニ細胞のインビボ半減期を長くすることができ、そのミニ細胞の企図されている標的に到達するより長いウインドウを提供するので、利点がある。
性融合分子への抗体またはFc含有融合体/複合体の結合により、(i)抗体のFc領域を覆い隠し、および(ii)抗体および/または融合体/複合体の抗原結合/エフェクタードメインを最適に露出するように、抗体または他のFc含有融合体/複合体を提示する。次に、生理活性積載物のうちの1つ以上の種をミニ細胞にさらに負荷することができるが、それは、精製されたミニ細胞へその積載物を外部から添加するか、ミニ細胞の形成前または形成中にミニ細胞産生親細菌からその積載物を組換え発現するかのどちらかによるものである。ミニ細胞で発現する、またはミニ細胞に負荷される生理活性積載物には、小分子薬および/または放射性核種、治療用一本鎖短ヘアピンRNA(shRNAとしても知られるssRNA)、治療用二本鎖RNA分子(例えば、siRNA)、リボザイム、アプタマー、治療用ポリペプチド(例えば、タンパク毒素)、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする真核生物の発現プラスミド、および前述の生理活性積載物の任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、生理活性積載物またはその組合せが負荷され、また、真核細胞表面分子を認識する抗体または他の融合体/複合体を提示するミニ細胞は、本明細書に記載される変異型無害化リポ多糖(LPS)分子から構成される。
胞膜の外葉への輸出を促進するようにそれぞれ機能する。したがって、本明細書に開示されるプロテインG融合タンパク質にはプロテインGのS領域およびC/D領域が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組換え融合タンパク質の設計において、S領域およびC/D領域のみを含むことが、(Fc領域を露出する)抗体のFab領域の、または血清アルブミンへの望まない結合を避けるために有利である。いくつかの実施形態では、抗体に加えて血清アルブミンをミニ細胞表面に結合させることにより、ミニ細胞を「増強型ステルスミニ細胞」にすることができるようにプロテインGの血清アルブミン結合ドメインが含まれる。ミニ細胞表面結合性血清アルブミンは、抗体に加えて、受容者の免疫系からミニ細胞を隠匿するのに役に立つ。これらの場合では、抗体と血清アルブミンの両方が起源とする種と受容側の種の両方が合致することが好ましい。
意のサブクラスの任意の抗体を産生することができるが、ミニ細胞の標的化機能を促進することが企図されている任意のサブクラスの抗体を「ヒト化」することができる。自然では、抗体は、それぞれが特定の抗原の同一のエピトープを認識する2つの異なる腕(Fab’)を含むように産生される。しかしながら、下記のように、分子生物学の発展により、研究者が、同一または異なる抗原に存在しても存在しなくてもよい、明確に異なるエピトープを認識するように各腕(または、いくつかの場合では、前記分子のFc領域)の特異性を改変することが可能になった。これらの抗体派生物は「二特異性」抗体または「二特異性」標的化部分と呼ばれる。
組換えポリペプチド、ペプチド、および/またはDARPin分子への、当技術分野において公知の架橋技術のいずれかを用いる化学的結合(架橋とも呼ばれる)によるものである。化学架橋の環境では、精製された組換えFc領域か複合体化されるポリペプチド、ペプチドおよび/もしくはDARPin分子のどちらか、または両方に「反応性」アミノ酸基を含むことが有利である。反応性アミノ酸の例にはスルフヒドリル基を含むもの、好ましくはシステイン残基が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、一般的なヘテロ二官能性架橋試薬と共に使用するには、対応するコンジュゲートの連結部にリシン残基を含むことが好ましい(例えば、Fc領域がシステイン残基を含み、標的化ポリペプチドまたは積載物ポリペプチドがリシンを含む、または、その逆も同様)。精製された組換えFc領域がホルモン、炭水化物、アプタマー、ならびに他の非アミノ酸および/またはペプチド系の分子に架橋する例では、当業者は、同じことを達成するために他の多くの架橋試薬を使用することができることを理解する。架橋試薬は「ホモ二官能性」または「ヘテロ二官能性」であり得る(それぞれ、同一または異なる反応性基を有する)。架橋試薬の例には表1に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。表1は各複合体化分子種/アプローチに使用され得る架橋試薬の非限定的な例も示す。
を分解し始め、LLOと共に小分子積載物を共放出する。次に、放出されたLLOコンポーネントは小分子のエンドソームからその小分子がその生物学的効果を及ぼすことができる細胞質への放出を促進するように補助する。本明細書に開示されるように、特定の温度および分解安定化異型体(sLLO)およびpH安定化異型体(pH非依存性;sLLOpH)のLLO(配列番号32)は治療用ポリペプチド積載物ならびにエンドソーム破壊剤として働くことができる。本明細書で使用される場合、リステリオリシンO(LLO)タンパク質には全長型LLOならびに短縮型LLO(cLLO)が含まれる。様々な変異が報告されており、その変異がエンドソーム破壊活性を著しく損なうことなくPFOの細胞傷害性を調節する。エンドソーム膜を破壊する目的にPFOおよび前記変異型異型体をLLOの代わりに使用することができる。
の実施形態に組み込まれる。治療用核酸も発現するFc結合性ミニ細胞産生細菌株で発現すると、LLOは治療用核酸と共にFc結合性ミニ細胞によって共封入され得るが、その後、Fc結合性ミニ細胞の表面への抗体またはFc含有融合体/複合体分子の付加によりそのミニ細胞が標的化能を得る。ミニ細胞の標的化を受けて、受容体介在性エンドサイトーシスがそのミニ細胞をエンドソームに輸送する。エンドソームの厳しい環境が貪食したミニ細胞を分解し始め、LLOと共に治療用核酸積載物を共放出する。次に、放出されたLLOは治療用核酸のエンドソームからその核酸がその生物学的効果を及ぼすことができる細胞質への放出を促進する。
)、ゼーリゲリオリシン(seeligeriolysin)O、バジノリシン(vaginolysin)およびピオリシン(pyolysin)が挙げられるが、これらに限定されない。当業者の自由裁量でミニ細胞の様々な細胞内コンパートメントに治療用ポリペプチドを局在させることができる。本明細書に開示される標的化ミニ細胞がグラム陰性ミニ細胞産生親株に由来するとき、それから産生された組換え発現治療用ポリペプチドはミニ細胞の細胞質、内膜の内葉、内膜の外葉、ペリプラズム、外膜の内葉、外膜、および前述の場所の任意の組合せに局在することができる。本明細書に開示される標的化ミニ細胞がグラム陽性ミニ細胞産生親株に由来するとき、それから産生された組換え発現治療用ポリペプチドはミニ細胞の細胞質、細胞壁、膜の内葉、膜、および前述の場所の任意の組合せに局在することができる。
原因であるプロテアーゼ遺伝子(例えば、大腸菌のlonプロテアーゼ)に欠失または他の機能欠損性変異を有するFc結合性ミニ細胞産生細菌株を使用することにより、ミニ細胞内のその治療用ポリペプチドの半減期が増加する。プロテアーゼが存在しないと、治療用ポリペプチド分子がより高いレベルまで蓄積し、治療用ポリペプチド分子を送達する標的化ミニ細胞の効力が上昇する。大腸菌ミニ細胞産生株の場合では、lon遺伝子、tonB遺伝子、abgA遺伝子、ampA遺伝子、ampM遺伝子、pepP遺伝子、clpP遺伝子、dcp遺伝子、ddpX/vanX遺伝子、elaD遺伝子、frvX遺伝子、gcp/b3064遺伝子、hslV遺伝子、hchA/bl967遺伝子、hyaD遺伝子、hybD遺伝子、hycH遺伝子、hycl遺伝子、iadA遺伝子、ldcA遺伝子、ycbZ遺伝子、pepD遺伝子、pepE遺伝子、pepQ遺伝子、pepT遺伝子、pmbA遺伝子、pqqL遺伝子、prlC遺伝子、ptrB遺伝子、sgcX遺伝子、sprT遺伝子、tldD遺伝子、yeah遺伝子、yeaZ遺伝子、yegQ遺伝子、ygeY遺伝子、yggG遺伝子、yhbO遺伝子、yibG遺伝子、ydpF遺伝子、degS遺伝子、ftsH/hflB遺伝子、glpG遺伝子、hofD/hopD遺伝子、lepB遺伝子、lspA遺伝子、pppA遺伝子、sohB遺伝子、spa遺伝子、yaeL遺伝子、yfbL遺伝子、dacA遺伝子、dacB遺伝子、dacC遺伝子、degP/htrA遺伝子、degQ遺伝子、iap遺伝子、mepA遺伝子、nlpC遺伝子、pbpG遺伝子、tsp遺伝子、ptrA遺伝子、teas遺伝子、umuD遺伝子、ydcP遺伝子、ydgD遺伝子、ydhO遺伝子、yebA遺伝子、yhbU遺伝子、yhjJ遺伝子およびnlpD遺伝子のうちの1つ以上に変異または欠失を導入することができる。
薬はミニ細胞によって封入され、提示され、またはそうでない場合は、ミニ細胞と結合する。関連の置換では、競合性LFIAで使用する負のリードアウト検出試薬としてFc結合性ミニ細胞を使用する。いくつかの実施形態では、負のリードアウト検出試薬としてのFc結合性ミニ細胞は、(i)Fc結合性ミニ細胞、(ii)Fc含有ミニ細胞に結合したFc/分析物融合体/複合体、ならびに(iii)小分子フルオロフォア、蛍光タンパク質、酵素、磁性粒子、および金コロイドを含むが、これらに限定されない検出試薬から構成され、その検出試薬はミニ細胞によって封入され、提示され、またはそうでない場合は、ミニ細胞と結合する。溶解している所与の関連する分析物の存在または非存在について臨床の、獣医学の、環境の、固形および液体の食品、医薬品、および飲料水を分析するために使用されるキットの検出試薬としてミニ細胞を使用することができる。(i)製品支持体、(ii)試料パッド、(iii)粒子コンジュゲートパッド、(iv)多孔性膜(例えば、ニトロセルロース)、(v)試験ライン、(vi)対照ライン、および(vii)ウィック材を含むように側方流動免疫アッセイを構成する。LFIAは短時間のポイント・オブ・ケア診断として、ならびに家庭内での使用(例えば、妊娠検査)、および様々なフィールド検査(例えば、飲料水または土壌中の毒物レベルの測定)に用いられる。LFIA検出試薬は現在のところ金コロイドコンジュゲート(10nm)、ラテックスビーズ(着色された、または蛍光性のもの;様々なサイズのもの)、および常磁性ラテックス被覆ビーズ(着色された、または蛍光性のもの;様々なサイズのもの)に限定される。それぞれにそれぞれの制限が有り、現時点では新しい改善型の検出試薬が必要であることがその分野の重大なハードルである。金コロイドコンジュゲートはその感受性とコストのため制限があり、ラテックスビーズはその感受性の無さのため制限があり、そして、常磁性ラテックスビーズはそのコストのため制限がある。したがって、より定量的で信頼できる検定を可能にする、および/または製造コストの低減を可能にする、費用効果があり、非常に感受性が高い種類の粒子ベースの検出試薬が診断分野に必要である。検出シグナルを増幅し、感受性を上昇させることができる機能性酵素を含む多種多様な検出法(現在利用できる検出粒子を用いるオプションではない)をミニ細胞に負荷することができるので、それらは、現在利用されている検出システムよりもかなりの利点を提供する。
成経路に、そして最も好ましくはdapA遺伝子に限定された栄養要求性である。DAP栄養要求性(dapA−)を示す大腸菌のミニ細胞産生株はDAPを添加しないと研究室の外では生き残ることができない。さらに、DAPはヒトを含む哺乳類では見つかっておらず、したがって、偶然に遺伝的自殺機構を逃れたいかなるミニ細胞産生親細胞もその環境または生体内では生き残ることができない。様々なグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌について、この主題について多数のバリエーションが存在する。例えば、サルモネラ属の種では、芳香族アミノ酸生合成経路(aro遺伝子)の栄養要求性が事実上同じ結果をもたらす。シゲラ属の種の場合では、グアニン生合成経路の栄養要求性が事実上同じ効果をもたらす。第三の安全性特性は任意であり、大腸菌ミニ細胞産生株のlpxM遺伝子の欠失を必要とする。lpxM遺伝子の欠失の結果、無害化したリポ多糖(LPS)分子を産生することができる。lpxM遺伝子(msbB遺伝子とも称される)はLPS分子のリピドA部分に末端ミリストレイン酸基を付加するように機能し、そして、(lpxM遺伝子の除去による)この基の除去はLPSの著しい無害化をもたらす。具体的に、無害化はLPSへの曝露に反応する炎症誘発性サイトカインの産生の低下を特徴とする。任意のグラム陰性またはグラム陽性のミニ細胞産生株の任意の機能的に同等な遺伝子にこの欠失を導入して同じ効果を達成することができる。向上した安全性プロファイルが感染のリスクと敗血症発生の可能性を低下させ、他の細菌との組換え事象を介した遺伝的復帰の可能性を低下させ、そして、宿主での挿入事象のリスクを最小化することができる。規制面および製造面から、抗生物質耐性マーカーをミニ細胞産生親細胞株の細菌染色体から除去することも好ましい。ヒトでの使用について米国食品医薬品局(FDA)により課された規制事項に従うためには、大半の抗生物質耐性遺伝子マーカーを細菌のミニ細胞産生株で使用することは好ましくない。FDAは、ヒトで使用することが最終製品で企図されている細菌または細菌性産生株の選択目的にカナマイシン耐性遺伝子マーカーを使用することだけを許す。
始、進行または持続の原因である細胞を殺滅する効果;動物において疾患を軽減するシグナルの生成に正の影響を与える効果;動物において疾患の活性化の原因である生物学的プロセスに負の影響を与える効果;疾患に負の影響を与える先天的免疫応答を動物において誘発する効果、および動物において疾患に負の影響を与える(液性および/または細胞性)適応免疫応答を誘発する効果を含むが、これらに限定されない疾患に負の影響を与える生物学的効果を有する。いくつかの実施形態では、標的化ミニ細胞は、上記の生物学的効果のうちのいずれかからなる組合せの生物学的効果を及ぼすことにより動物において疾患に相乗的に負の影響を与える生物学的効果を有する。いくつかの実施形態では、標的化部分は、(i)外膜輸出(分泌)配列、(ii)外膜タンパク質またはその膜アンカー部分、および(iii)ミニ細胞表面上のプロテインAまたはプロテインGのFc結合部分を含む連続的な融合タンパク質の形状でミニ細胞の表面に発現および提示されるプロテインAまたはプロテインGのどちらかのFc結合領域に結合する抗体、Fc含有抗体派生物、および/またはFc含有融合体/複合体標的化分子である。プロテインAまたはプロテインGのFc結合領域を提示するミニ細胞は、全長型抗体、Fc含有抗体派生物、および/またはFc含有融合体/複合体標的化分子にその分子のFc領域との相互作用を介して結合することができる。いくつかの実施形態では、プロテインAまたはプロテインGの結合部分は、ミニ細胞表面上で発現および提示されるように企図されている融合タンパク質の一部である。いくつかの実施形態では、プロテインAまたはプロテインGの結合部分はナイセリア・ゴノレエ(Neisseria gonnorehae)のIgAPオートトランスポータータンパク質との融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、プロテインAまたはプロテインGの結合部分は、本明細書にさらに詳細が記載されるグラム陰性細菌で見いだされる推定上または予想上の外膜タンパク質との融合体である。いくつかの実施形態では、プロテインAまたはプロテインGの結合部分は、米国特許第5,348,867号に記載され、その全体の参照により本明細書に組み込まれるLpp‐OmpA提示システムとの融合体である(それぞれ、配列番号22および配列番号23)。ミニ細胞表面上の抗体、Fc含有抗体派生物、および/またはFc含有融合体/複合体標的化分子は、α3β1インテグリン、α4β1インテグリン、α5β1インテグリン、αvβ3インテグリン、αvβ1インテグリン、β1インテグリン、5T4、CAIX、CD4、CD13、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD31、CD33、CD34、CD40、CD44v6、CD45、CD51、CD52、CD54、CD56、CD64、CD70、CD74、CD79、CD105、CD117、CD123、CD133、CD138、CD144、CD146、CD152、CD174、CD205、CD227、CD326、CD340、Cripto、ED‐B、GD2、TMEFF2、VEGFR1、VEGFR2、FGFR、PDGFR、ANGPT1、TIE1、TIE2、NRP1、TEK(CD202B)、TGFβR、デスレセプター5(Trail‐R2)、DLL4、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHA10、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、FAP、GPNMB、ICAM、VCAM、PSMA、HER‐2/neu、IL‐13Rα2、MUC‐1、MUC16、EGFR1(HER‐1)、EGFR2(HER‐2/neu)、EGFR3(HER‐3)、IGF‐1R、IGF‐2R、c‐Met(HGFR)、メソテリン、PDGFR、EDGR、TAG‐72、トランスフェリン受容体、EpCAM、CTLA‐4、PSMA、テネイシンC、α‐フェトプロテイン、ビメンチン、C242抗原、TRAIL‐R1、TRAIL‐R2、CA‐125、GPNMB、CA‐IX、GD3ガングリオシド、RANKL、BAFF、IL‐6R、TAG‐72、HAMAおよびCD166を含む細胞特異的表面抗原を優先的に認識することができるが、これらを含む細胞特異的表面抗原を認識することに限定されない。いくつかの実施形態では、部分的には、ミニ細胞表面が提示する、抗原に特異的な抗体標的化部分、Fc含有抗体派生物、および/またはFc含有融合体/複合体標的化分子が標的化ミニ細胞の細胞内取込を誘導し、細胞内積載物送達を促進するので、標的化部分が選択される。いくつかの実施形態では、標的
化コンポーネントとして使用される、これまでに記載された標的特異的抗体にはmAb3F8、mAbCSL362、mAbCSL360、mAbJ591、アバゴボマブ(Abagovomab)、アブシキシマブ、アダリムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシツマブ(Alacizumab)、ALD518、アレムツズマブ、アルツモマブ(Altumomab)、アナツモマブ(Anatumomab)、アンルキンズマブ(Anrukinzumab)、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ(Aselizumab)、アトリツマブ(Atlizumab)、アトロリムマブ(Atorolimumab)、バピネオズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ(Bavituximab)、ベクツモマブ(Bectumomab)、ベリムマブ(Belimumab)、ベンラリズマブ(Benralizumab)、ベルチリムマブ(Bertilimumab)、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ビシロマブ(Biciromab)、ビバツズマブ(Bivatuzumab)、ブリナツモマブ(Blinatumomab)、ブレンツキシマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、カンツズマブ、カプロマブ(Capromab)、カツマキソマブ、CC49、セデリズマブ(Cedelizumab)、セルトリズマブ、セツキシマブ、mAb528、シタツズマブ(Citatuzumab)、シクスツムマブ(Cixutumumab)、クレノリキシマブ、クリバツズマブ(Clivatuzumab)、コナツムマブ(Conatumumab)、CR6261、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダラツムマブ(Daratumumab)、デノスマブ、デツモマブ(Detumomab)、ドルリモマブ(Dorlimomab)、ドルリキシズマブ(Dorlixizumab)、エクロメキシマブ(Ecromeximab)、エクリズマブ、エドバコマブ(Edobacomab)、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ(Efungumab)、エロツズマブ(Elotuzumab)、エルシリモマブ(Elsilimomab)、エンリモマブ(Enlimomab)、エピツモマブ(Epitumomab)、エプラツズマブ、エルリズマブ(Erlizumab)、エルツマクソマブ(Ertumaxomab)、エタラシズマブ、エクシビビルマブ(Exbivirumab)、ファノレソマブ(Fanolesomab)、ファラリモマブ(Faralimomab)、ファルレツズマブ(Farletuzumab)、フェルビズマブ(Felvizumab)、フェザキヌマブ(Fezakinumab)、フィギツムマブ、フォントリズマブ、フォラビルマブ(Foravirumab)、フレソリムマブ(Fresolimumab)、ガリキシマブ、ガンテネルマブ(Gantenerumab)、ガビリモマブ(Gavilimomab)、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ(Girentuximab)、グレムバツムマブ(Glembatumumab)、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ(Gomiliximab)、イバリズマブ(Ibalizumab)、イルビツモマブ(Irbitumomab)、イゴボマブ(Igovomab)、イムシロマブ(Imciromab)、インフリキシマブ、インテツムマブ(Intetumumab)、イノリモマブ(Inolimomab)、イノツズマブ(Inotuzumab)、イピリムマブ(Ipilimumab)、イラツムマブ(Iratumumab)、J591、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レブリキズマブ(Lebrikizumab)、レマレソマブ(Lemalesomab)、レルデリムマブ(Lerdelimumab)、レクサツムマブ、リビビルマブ(Libivirumab)、リンツズマブ、ロルボツズマブ(Lorvotuzumab)、ルカツムマブ(Lucatumumab)、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マスリモマブ(Maslimomab)、マツズマブ、メポリゾマブ(Mepolizomab)、メテリムマブ(Metelimumab)、ミラツズマブ、ミンレツモマブ(Minretumomab)、ミツモマブ、モロリムマブ(Morolimumab)、モタビズマブ、ムロモナブ、ナコロマブ(Nacolomab)、ナプツモマブ(Naptumomab)、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツツマブ(Necitutumab)、ネレリモマブ(Nerelimomab)、ニモツズマブ、ノフェツモマブ(Nofetumomab)、オクレリズマブ、オヅリモマブ(Odulimomab)、オファツムマブ(Ofatumumab)、オララツマブ(Olaratumab)、オマリズマブ、オポルツズマブ(Opo
rtuzumab)、オレゴボマブ、オテリキシズマブ(Otelixizumab)、パギバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パノバクマブ(Panobacumab)、パスコリズマブ(Pascolizumab)、ペムツモマブ(Pemtumomab)、ペルツズマブ、パキセリズマブ、ピンツモマブ(Pintumomab)、プリリキシマブ(Priliximab)、プリツムマブ(Pritumumab)、PRO140、ラフィビルマブ(Rafivirumab)、ラムシルマブ(Ramucirumab)、ラニビズマブ、ラキシバクマブ(Raxibacumab)、レガビルマブ、レシリズマブ(Resilizumab)、リロツムマブ(Rilotumumab)、リツキシマブ、ロバツムマブ(Robatumumab)、ロンタリズマブ(Rontalizumab)、ロベリズマブ(Rovelizumab)、ルプリズマブ(Ruplizumab)、サツモマブ(Satumomab)、セビルマブ(Sevirumab)、シブロツズマブ(Sibrotuzumab)、シファリムマブ(Sifalimumab)、シルツキシマブ(Siltuximab)、シプリズマブ、ソラネズマブ(Solanezumab)、ソネプシズマブ(Sonepcizumab)、ソンツズマブ(Sontuzumab)、スタムルマブ(Stamulumab)、スレソマブ(Sulesomab)、タカツズマブ(Tacatuzumab)、タドシズマブ(Tadocizumab)、タリズマブ、タネズマブ(Tanezumab)、タプリツモマブ(Taplitumomab)、
テフィバズマブ(Tefibazumab)、テリモマブ(Telimomab)、テナツモマブ(Tenatumomab)、テプリズマブ、TGN1412、チシリムマブ、ティガツズマブ、TNX‐650、トシリズマブ、トラリズマブ(Toralizumab)、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブ(Tucotuzumab)、ツビルマブ(Tuvirumab)、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バパリキシマブ(Vapaliximab)、ベドリズマブ(Vedolizumab)、ベルツズマブ、ベパリモマブ(Vepalimomab)、ビジリズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ(Zanolimumab)、ジラリムマブ(Ziralimumab)、ゾリモマブ(Zolimomab)、および前述のものの任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。
ara‐CMP)、シトシンアラビノシド、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、5‐フルオロウラシル、5‐DFUR、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、6‐メルカプトプリン、メトトレキサート、ペントスタチン、トリメトレキサート、および6‐チオグアニン(4)抗血管新生剤(サリドマイド、スニチニブ、レナリドミド)、血管破壊剤(フラボノイド/フラボン類、DMXAA、CA4DP、ZD6126、AVE8062Aのようなコンブレスタチン派生物、など)、(5)アロマターゼ阻害剤(4‐ヒドロアンドロステンジオン(4‐hydroandrostendione)、エキセメスタン、アミノグルテチミド、アナストロゾール、レトロゾール)などの内分泌療法、(6)抗エストロゲン剤(タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ファスロデックス(Faslodex))、デキサメタゾンなどのステロイド、(7)Toll様受容体のアゴニストまたはアンタゴニストなどの免疫調節因子、(8)インテグリン、他の接着タンパク質およびマトリックスメタロプロテアーゼに対する阻害剤、(9)ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、(10)シグナル伝達の阻害剤、例えば、イマチニブ(グリベック)のようなチロシンキナーゼの阻害剤、(11)ヒートショックタンパク質の阻害剤、(12)トランスレチノイン酸などのレチノイド、(13)成長因子受容体または成長因子自体の阻害剤、(14)ナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンなどの抗有糸分裂化合物、(15)COX阻害剤などの抗炎症剤、および(16)チェックポイント調節因子などの細胞周期調節因子およびテロメラーゼ阻害剤、(17)転写因子阻害剤、およびBcl‐2、Bcl‐xおよびXIAPの阻害剤などのアポトーシス誘導剤、ならびに前述の(1〜17)の任意の組合せから選択されるが、これらに限定されない。ミニ細胞表面上の抗体および/またはFc含有融合体/複合体分子は、α3β1インテグリン、α4β1インテグリン、α5β1インテグリン、αvβ3インテグリン、αvβ1インテグリン、β1インテグリン、5T4、CAIX、CD4、CD13、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD31、CD33、CD34、CD40、CD44v6、CD45、CD51、CD52、CD54、CD56、CD64、CD70、CD74、CD79、CD105、CD117、CD123、CD133、CD138、CD144、CD146、CD152、CD174、CD205、CD227、CD326、CD340、Cripto、ED‐B、GD2、TMEFF2、VEGFR1、VEGFR2、FGFR、PDGFR、ANGPT1、TIE1、TIE2、NRP1、TEK(CD202B)、TGFβR、デスレセプター5(Trail‐R2)、DLL4、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHA10、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、FAP、GPNMB、ICAM、VCAM、PSMA、HER‐2/neu、IL‐13Rα2、MUC‐1、MUC16、EGFR1(HER‐1)、EGFR2(HER‐2/neu)、EGFR3(HER‐3)、IGF‐1R、IGF‐2R、c‐Met(HGFR)、メソテリン、PDGFR、EDGR、TAG‐72、トランスフェリン受容体、EpCAM、CTLA‐4、PSMA、テネイシンC、α‐フェトプロテイン、ビメンチン、C242抗原、TRAIL‐R1、TRAIL‐R2、CA‐125、GPNMB、CA‐IX、GD3ガングリオシド、RANKL、BAFF、IL‐6R、TAG‐72、HAMA、およびCD166を含む細胞特異的表面抗原を優先的に認識することができるが、これらを含む細胞特異的表面抗原を認識することに限定されない。
表面抗原に標的化ミニ細胞が結合すると受容体介在性エンドサイトーシスを促進することができる抗体および/またはFc含有融合体/複合体分子をさらに含み、ならびに(iv)静脈内投与に適した薬学的に許容可能な担体をさらに含む。小分子薬の種類は、(1)DNA損傷剤およびDNA合成阻害剤、例えば、アントラサイクリン類(ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン)、アルキル化剤類(ベンダムスチン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、シスプラチン、クロラムブチル、シクロホスファミド、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、ミトタン、マイトマイシン、ピポブロマン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、チオテパおよびトリエチレンメラミン)、プラチナ誘導体(シスプラチン、カルボプラチン、cis‐ジアミンジクロロプラチナ)、テロメラーゼ阻害剤およびトポイソメラーゼ阻害剤(カンプトサル(Camptosar))、(2)タキサン類およびタキサン派生物(パクリタキセル、ドセタキセルクロラムブシル、BAY59‐8862)を含むが、これらに限定されない微小管およびチューブリン結合剤、(3)抗代謝剤、例えば、カペシタビン、クロロデオキシアデノシン、シタラビン(およびその活性化型であるara‐CMP)、シトシンアラビノシド、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、5‐フルオロウラシル、5‐DFUR、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、6‐メルカプトプリン、メトトレキサート、ペントスタチン、トリメトレキサート、および6‐チオグアニン(4)抗血管新生剤(サリドマイド、スニチニブ、レナリドミド)、血管破壊剤(フラボノイド/フラボン類、DMXAA、CA4DP、ZD6126、AVE8062Aのようなコンブレスタチン派生物、など)、(5)アロマターゼ阻害剤(4‐ヒドロアンドロステンジオン(4‐hydroandrostendione)、エキセメスタン、アミノグルテチミド、アナストロゾール、レトロゾール)などの内分泌療法、(6)抗エストロゲン剤(タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ファスロデックス(Faslodex))、デキサメタゾンなどのステロイド、(7)Toll様受容体のアゴニストまたはアンタゴニストなどの免疫調節因子、(8)インテグリン、他の接着タンパク質およびマトリックスメタロプロテアーゼに対する阻害剤、(9)ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、(10)シグナル伝達の阻害剤、例えば、イマチニブ(グリベック)のようなチロシンキナーゼの阻害剤、(11)ヒートショックタンパク質の阻害剤、(12)トランスレチノイン酸などのレチノイド、(13)成長因子受容体または成長因子自体の阻害剤、(14)ナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンなどの抗有糸分裂化合物、(15)COX阻害剤などの抗炎症剤、および(16)チェックポイント調節因子などの細胞周期調節因子およびテロメラーゼ阻害剤、(17)転写因子阻害剤、およびBcl‐2、Bcl‐xおよびXIAPの阻害剤などのアポトーシス誘導剤、ならびに前述の(1〜17)の任意の組合せから選択されるが、これらに限定されない。ミニ細胞表面上の抗体および/またはFc含有融合体/複合体分子は、α3β1インテグリン、α4β1インテグリン、α5β1インテグリン、αvβ3インテグリン、αvβ1インテグリン、β1インテグリン、5T4、CAIX、CD4、CD13、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD31、CD33、CD34、CD40、CD44v6、CD45、CD51、CD52、CD54、CD56、CD64、CD70、CD74、CD79、CD105、CD117、CD123、CD133、CD138、CD144、CD146、CD152、CD174、CD205、CD227、CD326、CD340、Cripto、ED‐B、GD2、TMEFF2、VEGFR1、VEGFR2、FGFR、PDGFR、ANGPT1、TIE1、TIE2、NRP1、TEK(CD202B)、TGFpR、デスレセプター5(Trail‐R2)、DLL4、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHA10、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、FAP、GPNMB、ICAM、VCAM、PSMA、HER‐2/neu、IL‐13Rα2、MUC‐1、MUC16、EGFR1(HER‐1)、EGFR2(HER‐2/neu)、EGFR3(HER‐3)、IGF‐1R、IGF‐2R、c‐Met(HGFR)、メソテリン、P
DGFR、EDGR、TAG‐72、トランスフェリン受容体、EpCAM、CTLA‐4、PSMA、テネイシンC、α‐フェトプロテイン、ビメンチン、C242抗原、TRAIL‐R1、TRAIL‐R2、CA‐125、GPNMB、CA‐IX、GD3ガングリオシド、RANKL、BAFF、IL‐6R、TAG‐72、HAMA、およびCD166を含む細胞特異的表面抗原を優先的に認識することができるが、これらを含む細胞特異的表面抗原を認識することに限定されない。
10、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、FAP、GPNMB、ICAM、VCAM、PSMA、HER‐2/neu、IL‐13Rα2、MUC‐1、MUC16、EGFR1(HER‐1)、EGFR2(HER‐2/new)、EGFR3(HER‐3)、IGF‐1R、IGF‐2R、c‐Met(HGFR)、メソテリン、PDGFR、EDGR、TAG‐72、トランスフェリン受容体、EpCAM、CTLA‐4、PSMA、テネイシンC、α‐フェトプロテイン、ビメンチン、C242抗原、TRAIL‐R1、TRAIL‐R2、CA‐125、GPNMB、CA‐IX、GD3ガングリオシド、RANKL、BAFF、IL‐6R、TAG‐72、HAMA、およびCD166を含む細胞特異的表面抗原を優先的に認識することができるが、これらを含む細胞特異的表面抗原を認識することに限定されない。
、GD2、TMEFF2、VEGFR1、VEGFR2、FGFR、PDGFR、ANGPT1、TIE1、TIE2、NRP1、TEK(CD202B)、TGFβR、デスレセプター5(Trail‐R2)、DLL4、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHA10、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、FAP、GPNMB、ICAM、VCAM、PSMA、HER‐2/neu、IL‐13Rα2、MUC‐1、MUC16、EGFR1(HER‐1)、EGFR2(HER‐2/new)、EGFR3(HER‐3)、IGF‐1R、IGF‐2R、c‐Met(HGFR)、メソテリン、PDGFR、EDGR、TAG‐72、トランスフェリン受容体、EpCAM、CTLA‐4、PSMA、テネイシンC、α‐フェトプロテイン、ビメンチン、C242抗原、TRAIL‐R1、TRAIL‐R2、CA‐125、GPNMB、CAIX、GD3ガングリオシド、RANKL、BAFF、IL‐6R、TAG‐72、HAMA、およびCD166を含む細胞特異的表面抗原を優先的に認識することができるが、これらを含む細胞特異的表面抗原を認識することに限定されない。
バジノリシン(vaginolysin)およびピオリシン(pyolysin)を含むが、これらに限定されない群より選択され得る。ミニ細胞表面上の抗体および/またはFc含有融合体/複合体分子は、α3β1インテグリン、α4β1インテグリン、α5β1インテグリン、αvβ3インテグリン、αvβ1インテグリン、β1インテグリン、5T4、CAIX、CD4、CD13、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD31、CD33、CD34、CD40、CD44v6、CD45、CD51、CD52、CD54、CD56、CD64、CD70、CD74、CD79、CD105、CD117、CD123、CD133、CD138、CD144、CD146、CD152、CD174、CD205、CD227、CD326、CD340、Cripto、ED‐B、GD2、TMEFF2、VEGFR1、VEGFR2、FGFR、PDGFR、ANGPT1、TIE1、TIE2、NRP1、TEK(CD202B)、TGFβR、デスレセプター5(Trail‐R2)、DLL4、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHA10、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、FAP、GPNMB、ICAM、VCAM、PSMA、HER‐2/neu、IL‐13Rα2、MUC‐1、MUC16、EGFR1(HER‐1)、EGFR2(HER‐2/new)、EGFR3(HER‐3)、IGF‐1R、IGF‐2R、c‐Met(HGFR)、メソテリン、PDGFR、EDGR、TAG‐72、トランスフェリン受容体、EpCAM、CTLA‐4、PSMA、テネイシンC、α‐フェトプロテイン、ビメンチン、C242抗原、TRAIL‐R1、TRAIL‐R2、CA‐125、GPNMB、CA‐IX、GD3ガングリオシド、RANKL、BAFF、IL‐6R、TAG‐72、HAMA、およびCD166を含む細胞特異的表面抗原を優先的に認識することができるが、これらを含む細胞特異的表面抗原を認識することに限定されない。
ericolysin)、アントロリシン(anthrolysin)O、セレオリシン(cereolysin)、チューリンゲンシリシン(thuringiensilysin)O、ワイヘンステファネンシリシン(weihenstephanensilysin)、アルベオリシン(alveolysin)、ブレビリシン(brevilysin)、ブチリクリシン(butyriculysin)、テタノリジンO、ノビリシン(novyilysin)、レクチノリシン(lectinolysin)、ニューモリシン、ミチリシン(mitilysin)、シュードニューモリシン、スイリシン(suilysin)、インターメジリシン(intermedilysin)、イバノリシン(ivanolysin)、ゼーリゲリオリシン(seeligeriolysin)O、バジノリシン(vaginolysin)およびピオリシン(pyolysin)を含むが、これらに限定されない群より選択され得る。ミニ細胞表面上の抗体および/またはFc含有融合体/複合体分子は、α3β1インテグリン、α4β1インテグリン、α5β1インテグリン、αvβ3インテグリン、αvβ1インテグリン、β1インテグリン、5T4、CAIX、CD4、CD13、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD31、CD33、CD34、CD40、CD44v6、CD45、CD51、CD52、CD54、CD56、CD64、CD70、CD74、CD79、CD105、CD117、CD123、CD133、CD138、CD144、CD146、CD152、CD174、CD205、CD227、CD326、CD340、Cripto、ED‐B、GD2、TMEFF2、VEGFR1、VEGFR2、FGFR、PDGFR、ANGPT1、TIE1、TIE2、NRP1、TEK(CD202B)、TGFpR、デスレセプター5(Trail‐R2)、DLL4、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHA10、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、FAP、GPNMB、ICAM、VCAM、PSMA、HER‐2/neu、IL‐13Rα2、MUC‐1、MUC16、EGFR1(HER‐1)、EGFR2(HER‐2/neu)、EGFR3(HER‐3)、IGF‐1R、IGF‐2R、c‐Met(HGFR)、メソテリン、PDGFR、EDGR、TAG‐72、トランスフェリン受容体、EpCAM、CTLA‐4、PSMA、テネイシンC、α‐フェトプロテイン、ビメンチン、C242抗原、TRAIL‐R1、TRAIL‐R2、CA‐125、GPNMB、CA‐IX、GD3ガングリオシド、RANKL、BAFF、IL‐6R、TAG‐72、HAMA、およびCD166を含む細胞特異的表面抗原を優先的に認識することができるが、これらを含む細胞特異的表面抗原を認識することに限定されない。
、Cripto、ED‐B、GD2、TMEFF2、VEGFR1、VEGFR2、FGFR、PDGFR、ANGPT1、TIE1、TIE2、NRP1、TEK(CD202B)、TGFβR、デスレセプター5(Trail‐R2)、DLL4、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHA10、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、FAP、GPNMB、ICAM、VCAM、PSMA、HER‐2/neu、IL‐13Rα2、MUC‐1、MUC16、EGFR1(HER‐1)、EGFR2(HER‐2/neu)、EGFR3(HER‐3)、IGF‐1R、IGF‐2R、c‐Met(HGFR)、メソテリン、PDGFR、EDGR、TAG‐72、トランスフェリン受容体、EpCAM、CTLA‐4、PSMA、テネイシンC、α‐フェトプロテイン、ビメンチン、C242抗原、TRAIL‐R1、TRAIL‐R2、CA‐125、GPNMB、CAIX、GD3ガングリオシド、RANKL、BAFF、IL‐6R、TAG‐72、HAMA、およびCD166を含む細胞特異的表面抗原を優先的に認識することができるが、これらを含む細胞特異的表面抗原を認識することに限定されない。
リウム、テクネチウム‐99、タリウム、バリウム、ガストログラフィン、ヨード造影剤、酸化鉄、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、および前述のものの任意の組合せが挙げられる。
れも感染性疾患因子に由来する、1つ以上の抗原性炭水化物、タンパク質抗原および/またはDNAワクチンを負荷されており、(iii)表面に提示されたプロテインAのFc結合領域のFc結合部分に結合する表面局在性の抗体および/またはFc含有融合体/複合体分子であって、真核生物の抗原提示細胞に特異的な表面抗原を認識し、そして、真核生物の抗原提示細胞に特異的な表面抗原に標的化ミニ細胞が結合すると受容体介在性エンドサイトーシスを促進することができる抗体および/またはFc含有融合体/複合体分子をさらに含み、(iv)LLOを含むが、これに限定されないエンドソーム破壊剤をさらに含み、(v)一般的なアジュバントおよび/または標的化分子アジュバントをさらに含み、ならびに(vi)静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、経口投与および/または経鼻投与を含むが、これらに限定されないインビボ投与経路に適した薬学的に許容可能な担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、標的化ミニ細胞ワクチンは動物において液性(抗体介在性)および/または細胞性(細胞傷害性T細胞介在性)の防御免疫応答を誘発する。1つの態様では、免疫応答は、細菌、ウイルスおよび寄生生物に起源がある因子を含むが、これらに限定されない感染性疾患因子に対する防御である。いくつかの実施形態では、ミニ細胞ワクチンの表面上の抗体および/またはFc含有融合体/複合体分子は、CD11b、CD11c、DC‐SIGN、CD8、DEC‐205、CD105、Flt3、Flt3L、CD103、CD115、CD45、CX3CR1、CCR7、SIRPa、CD205、DCIR2、CD40、M‐CSFR、F4/80、CD123、およびCD68のうちの1つ以上を認識するが、それらのうちの1つ以上を認識することに限定されない。いくつかの実施形態では、標的化分子アジュバントはTLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、M‐CSFR、および前述のものの任意の組合せを刺激する。
8、TLR9、TLR10、M‐CSFR、および前述のものの任意の組合せを刺激する。
チンの表面上の抗体および/またはFc含有融合体/複合体分子は、CD11b、CD11c、DC‐SIGN、CD8、DEC‐205、CD105、Flt3、Flt3L、CD103、CD115、CD45、CX3CRI、CCR7、SIRPa、CD205、DCIR2、CD40、M‐CSFR、F4/80、CD123、およびCD68のうちの1つ以上を認識するが、それらのうちの1つ以上を認識することに限定されない。いくつかの実施形態では、標的化分子アジュバントはTLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、M‐CSFR、および前述のものの任意の組合せを刺激する。
れない検出試薬から構成され、その検出試薬はミニ細胞によって封入され、提示され、またはそうでない場合は、ミニ細胞と結合する。溶解している所与の関連する分析物の存在または非存在について臨床の、獣医学の、環境の、固形および液体の食品、医薬品、および飲料水を分析するために使用されるキットの検出試薬としてミニ細胞を使用する。(i)製品支持体、(ii)試料パッド、(iii)粒子コンジュゲートパッド、(iv)多孔性膜(例えば、ニトロセルロース)、(v)試験ライン、(vi)対照ライン、および(vii)ウィック材を含むように側方流動免疫アッセイを構成する。LFIAは短時間のポイント・オブ・ケア診断として、ならびに家庭内での使用(例えば、妊娠検査)、および様々なフィールド検査(例えば、飲料水または土壌中の毒物レベルの測定)に使用される。製品支持体は、ポリスチレンおよび/または別のプラスチックポリマーを含むが、これらに限定されない群より選択され、そして、当業者の自由裁量で製品支持体を抗粘着性媒体で被覆することができる。試料パッドは、セルロース、グラスファイバー、レーヨン、ポリプロピレン、および/または当技術分野において公知の他の一般的に使用される濾材を含むが、これらに限定されない材種から当業者の自由裁量で選択される。粒子コンジュゲートパッドは、グラスファイバー、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、レーヨン、および当技術分野において公知の他の濾材を含むが、これらに限定されない材種から当業者の自由裁量で選択される。さらに、タンパク質、高分子、界面活性剤、および前述のものの任意の組合せを含有する溶液に浸漬して付加することによりコンジュゲートパッドコンポーネントを「ブロック」することができる。多孔性分析試験膜は、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンフルオリド(PVDF)、ヒュージョン5マトリックス(Whatman)、4キャストチップマトリックス(Amic、ウプサラ、スウェーデン)、および前述のものの任意の組合せを含む材種から選択される。さらに、タンパク質、高分子、界面活性剤、および前述のものの任意の組合せを含有する溶液に浸漬して付加することにより多孔性分析試験膜コンポーネントを「ブロック」することができる。試験ラインおよび対照ラインを多孔性分析膜に組み込んだ後に多孔性分析膜のブロッキングを行う。非接触ポンプ駆動性ソレノイド型分注器、接触チップ型分注器、定量性エアブラシ型分注器、および前述のものの任意の組合せを含むが、これらに限定されない製造装置を使用して多孔性分析膜に試験ラインと対照ラインを組み込む。試験ストリップは多孔性分析試験膜に共有結合または非共有結合している抗体または他の試験分析物特異的結合パートナーから構成される。対照ストリップは、検出粒子(すなわち、ミニ細胞)の試験分析物への結合と無関係にその検出粒子が対照ストリップと結合することができるように、抗体または他の検出粒子特異的結合パートナー(例えば、抗ミニ細胞抗体)から構成される。ウィックコンポーネントは、高密度セルロースを含むが、これらに限定されない材種から選択され得る。多くのウィックコンポーネントが当業者に知られており、そして、当業者の自由裁量でそれらを最終製品に利用することができる。図1にミニ細胞ベースの側方流動免疫アッセイの例示的実施形態が示されている。いくつかの実施形態では、試験溶液を液体の溶液の状態で得る、または調製し、それを試料パッドにアプライし、分析物検出試薬(ミニ細胞)と混合し、その後、試験溶液がウィックに向かって多孔性分析膜を通過する。分析物が結合した検出試薬は正の試験ラインに蓄積し、測光性電荷結合素子カメラ、蛍光測定分析(例えば、LED励起)、放射測定分析を含む、当技術分野において公知の方法のうちの任意の数の方法を用いて、および磁性アッセイリーダーによりそれを検出することができる。
試薬はミニ細胞によって封入され、提示され、またはそうでない場合は、ミニ細胞と結合する。関連の置換では、競合性LFIAで使用する負のリードアウト検出試薬としてFc結合性ミニ細胞を使用する。いくつかの実施形態では、負のリードアウト検出試薬としてのFc結合性ミニ細胞は、(i)Fc結合性ミニ細胞、(ii)Fc含有ミニ細胞に結合したFc/分析物融合体/複合体、ならびに(iii)小分子フルオロフォア、蛍光タンパク質、酵素、磁性粒子、および金コロイドを含むが、これらに限定されない検出試薬から構成され、その検出試薬はミニ細胞によって封入され、提示され、またはそうでない場合は、ミニ細胞と結合する。溶解している所与の関連する分析物の存在または非存在について臨床の、獣医学の、環境の、固形および液体の食品、医薬品、および飲料水を分析するために使用されるキットの検出試薬としてミニ細胞を使用する。(i)製品支持体、(ii)試料パッド、(iii)粒子コンジュゲートパッド、(iv)多孔性膜(例えば、ニトロセルロース)、(v)試験ライン、(vi)対照ライン、および(vii)ウィック材を含むように側方流動免疫アッセイを構成する。LFIAは短時間のポイント・オブ・ケア診断として、ならびに家庭内での使用(例えば、妊娠検査)、および様々なフィールド検査(例えば、飲料水または土壌中の毒物レベルの測定)に使用される。製品支持体は、ポリスチレンおよび/または別のプラスチックポリマーを含むが、これらに限定されない群より選択され、そして、当業者の自由裁量で製品支持体を抗粘着性媒体で被覆することができる。試料パッドは、セルロース、グラスファイバー、レーヨン、ポリプロピレン、および/または当技術分野において公知の他の一般的に使用される濾材を含むが、これらに限定されない材種から当業者の自由裁量で選択される。粒子コンジュゲートパッドは、グラスファイバー、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、レーヨン、および当技術分野において公知の他の濾材を含むが、これらに限定されない材種から当業者の自由裁量で選択される。さらに、タンパク質、高分子、界面活性剤、および前述のものの任意の組合せを含有する溶液に浸漬して付加することによりコンジュゲートパッドコンポーネントを「ブロック」することができる。多孔性分析試験膜は、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンフルオリド(PVDF)、ヒュージョン5マトリックス(Whatman)、4キャストチップマトリックス(Amic、ウプサラ、スウェーデン)、および前述のものの任意の組合せを含む材種から選択される。さらに、タンパク質、高分子、界面活性剤、および前述のものの任意の組合せを含有する溶液に浸漬して付加することにより多孔性分析試験膜コンポーネントを「ブロック」することができる。試験ラインおよび対照ラインを多孔性分析膜に組み込んだ後に多孔性分析膜のブロッキングを行う。非接触ポンプ駆動性ソレノイド型分注器、接触チップ型分注器、定量性エアブラシ型分注器、および前述のものの任意の組合せを含むが、これらに限定されない製造装置を使用して多孔性分析膜に試験ラインと対照ラインを組み込む。試験ストリップは多孔性分析試験膜に共有結合または非共有結合している抗体または他の試験分析物特異的結合パートナーから構成される。対照ストリップは、検出粒子(すなわち、ミニ細胞)の試験分析物への結合と無関係にその検出粒子が対照ストリップと結合することができるように、抗体または他の検出粒子特異的結合パートナー(例えば、抗ミニ細胞抗体)から構成される。ウィックコンポーネントは、高密度セルロースを含むが、これらに限定されない材種から選択され得る。多くのウィックコンポーネントが当業者に知られており、そして、当業者の自由裁量でそれらを最終製品に利用することができる。図1にミニ細胞ベースの側方流動免疫アッセイの完全な略図が示されている。いくつかの実施形態では、試験溶液を液体の溶液の状態で得る、または調製し、それを試料パッドにアプライし、分析物検出試薬(ミニ細胞)と混合し、その後、試験溶液がウィックに向かって多孔性分析膜を通過する。分析物が結合した検出試薬は正の試験ラインに蓄積し、測光性電荷結合素子カメラ、蛍光測定分析(例えば、LED励起)、放射測定分析を含む、当技術分野において公知の方法のうちの任意の数の方法を用いて、および磁性アッセイリーダーによりそれを検出することができる。
調節するミニ細胞産生遺伝子産物をコードする発現可能遺伝子、(ii)ミニ細胞産生細菌の染色体にその認識部位が1つ以上含まれる異種性のエンドヌクレアーゼをコードする発現可能な「遺伝的自殺」遺伝子、(iii)限定的な栄養要求性;(iv)lpxM/msbB遺伝子(または他の機能上の同等物)の欠失または変異、ならびに(v)プロテインGのFc結合領域の機能発現と表面提示が可能である組換え発現カセットを含むFc結合性ミニ細胞産生細菌を提供する。いくつかの実施形態では、前記ミニ細胞産生遺伝子は細胞分裂遺伝子である。細胞分裂遺伝子にはftsZ、sulA、ccdBおよびsfiCが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターの制御下で前記ミニ細胞産生遺伝子が発現する。いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生細菌の染色体上にエンドヌクレアーゼ自殺遺伝子が位置する。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼはホーミングエンドヌクレアーゼである。ホーミングエンドヌクレアーゼにはI‐CeuI、PI‐SceI、I‐ChuI、I‐CpaI、I‐SceIII、I‐CreI、I‐MsoI、I‐SceII、I‐SceIV、I‐CsmI、I‐DmoI、I‐PorI、PI‐TliI、PI‐TliIIおよびPI‐ScpIが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターの制御下で前記エンドヌクレアーゼが発現する。いくつかの実施形態では、栄養要求性の原因は必須代謝遺伝子の欠失または不活性化変異である。いくつかの実施形態では、dapA遺伝子またはその機能的ホモログに欠失または不活性化変異が存在する。いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生細菌は、リポ多糖合成に関わる遺伝子産物をコードする遺伝子の欠失または不活性化変異をさらに含み、その遺伝子は対応する野生型遺伝子と比較して遺伝的に改変されている。いくつかの実施形態では、前記の不活性型遺伝子はlpxM/msbBであり、それは、対応する野生型細菌のリピドA分子と比較して変化したリピドA分子を前記細菌が産生する原因になる遺伝子産物をコードする。いくつかの実施形態では、その変異型リピドA分子は、対応する野生型細菌のリピドA分子と比較して、リポ多糖分子のリピドA部分へのミリストレイン酸の付加に関して欠陥がある。いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生細菌は、相同組換えに関わる遺伝子の欠失または不活性化変異をさらに含み、その遺伝子は対応する野生型遺伝子と比較して遺伝的に改変されており、そのミニ細胞産生細菌はDNA損傷修復に欠陥がある。いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生細菌は、リボヌクレアーゼIIIをコードする遺伝子(例えば、大腸菌のrnc遺伝子;大腸菌で二本鎖RNAを分解する)に変異をさらに含む、またはその遺伝子を欠き、その結果生じるミニ細胞がこのリボヌクレアーゼに欠陥を持ち、それによりsiRNAおよびshRNAを含む二本鎖RNA分子の半減期をミニ細胞において上昇させる。いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生細菌株は組換えcLLOタンパク質をさらに含み、その結果生じるミニ細胞がcLLOタンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態では、Fc結合性ミニ細胞産生細菌は、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルセラ属の種、フランシセラ・ツラレミア(Franciscella tularemia)、レジオネラ・ニューモフィリア(Legionella pneumophilia)、ナイセリア・メニンギチジス(Neisseria meningitidis)、クリーブセラ(Kliebsella)、エルシニア属の種、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ナイセリア・ゴノレエ(Neisseria gonorrhoeae)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、サルモネラ属の種、シゲラ属の種、緑膿菌、および大腸菌を含むが、これらに限定されないグラム陰性細菌である。いくつかの実施形態では、Fc結合性ミニ細胞産生細菌は、ブドウ球菌属の種、ラクトバシラス属の種、ストレプトコッカス属の種、枯草菌(Bacillus subtilis)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、およびセレウス菌(Bacillus cereus)を含むが、これらに限定されないグラム陽性細菌である。
ミニ細胞は、正常な細胞分裂装置の破壊後に細菌によって形成される、染色体が無い、膜で被包された生物的ナノ粒子(使用する株の種類と培養条件に応じて、直径約250〜500nm)である。本質的に、ミニ細胞は、染色体DNAを含まず、したがって、分裂せず、生育不能であることを除いて、正常な細菌細胞の小型で代謝的に活性が有る複製物である。ミニ細胞は染色体DNAを含まないが、プラスミドDNA、RNA、天然および/または組換え発現したタンパク質、ならびに他の代謝物が全てミニ細胞に分配されることが示されている。
る。その後、ftsZ遺伝子のコピー数を染色体上に2コピーまで減少させることにより、ftsZがマルチコピープラスミド上に位置する株よりも産生されるミニ細胞の数が増え、繊維状表現型が顕著ではなくなることが示されている。したがって、2コピーの染色体に挿入されたftsZコピーからftsZ遺伝子を誘導的に過剰発現するミニ細胞産生株が好ましい組成物である。その使用される2コピーのftsZ遺伝子は、ミニ細胞産生表現型が設計されている細菌種に直接由来してよく、および、他の種の細菌のftsZ遺伝子配列に由来してもよい。非限定的な例として、大腸菌およびサルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)からミニ細胞を生成するために大腸菌ftsZ遺伝子の過剰発現を用いることができる。結果として生じる株は、染色体上に存在する野生型ftsZ遺伝子およびそれとは別の重複性で誘導性コピーのftsZ遺伝子、ならびにその全体の参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2010/0112670号に記載される誘導性遺伝的自殺機構から構成される。非限定的な例として、腸内細菌科でミニ細胞を産生するために過剰発現され得る分裂遺伝子にはftsZ、minE、sulA、ccdBおよびsfiCが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい組成物は、誘導性プロモーターの制御下にある重複コピーの細胞分裂遺伝子を持ち、それが所与の真正細菌株の染色体に安定的に組み込まれているべきである。当業者は、誘導性細胞分裂遺伝子カセットがプラスミド、コスミド、細菌人工染色体(BAC)、組換えバクテリオファージまたは細胞に存在する他のエピソーム性DNA分子に存在する場合は、この同じ戦略をとることができることを容易に理解する。
病原性である、または日和見的に病原性であるいくつかの細菌からミニ細胞を得るので、投与前に所与の集団からいかなる汚染混入親細胞をも機能的に排除することが最も重要である。従来、物理的方法か生物学的方法のどちらか、またはその両方により生存している親細胞を排除してきた。
種であるエルシニア・シュードツベルクロシス(Yersinia pesudotuberculosis)の外膜タンパク質であるインベイシンは哺乳類のインテグリンに対して高親和性を有する。誘導性プロモーターの制御下にあるインベイシンをコードする遺伝子は、ミニ細胞産生株の染色体に容易に導入され得る。産生されるミニ細胞がその細胞表面にインベイシンを発現および提示しないように、インベイシン遺伝子の発現を活性化する前にこの株からミニ細胞を産生することができる。その株から所望の量のミニ細胞が産生されると、生存可能な細胞にのみインベイシンが発現および提示されるように、インベイシンタンパク質を産生するためのシグナルが培養物中の生存可能な細胞に与えられ得る。インベイシンが生存可能な親細胞の表面に優先的に発現すると、それらは、インテグリンまたは他のインベイシン特異的タンパク質結合モチーフが埋め込まれた合成ポリペプチドもしくは他の組換えタンパク質で被覆されている基材に容易に吸着され得る。一旦、吸着されると、使用した基材の種類に応じて多種多様な方法により生存可能な親細胞からミニ細胞を選択的に精製することができる。基材には、重力式濾過用途に使用される固相クロマトグラフィーカラム、磁性ビーズ、イオン交換カラムまたはHPLCカラムが含まれるが、これらに限定されない。単一のタンパク質間相互作用が全ての種類のミニ細胞産生親細胞に機能することはないという欠点によりこのアプローチは制限される。例えば、上記のインベイシンインテグリン間アプローチはほとんどのグラム陰性腸内細菌科メンバーには有用であるが、ミニ細胞産生グラム陽性バシラス科メンバーとの使用については有用ではないだろう。
ミニ細胞の産生、遺伝的自殺機構の活性化、およびその後のミニ細胞の精製の後に、標的送達媒体としてミニ細胞を使用する。プロテインGまたはプロテインAのFc結合領域を発現し、さらに抗体、Fc含有抗体派生物、および/またはFc含有融合体/複合体標的化分子をそれらの表面に提示するミニ細胞を使用して、インビボで疾患に関係する特定の細胞タイプを標的として、標的にされた組織、器官および細胞タイプにそれらの生理活性積載物を優先的に送達する。
らに限定されない。表1は、どの架橋試薬が各複合体化分子種/アプローチにとって適切および好適であるかも示す。このアプローチの利用では、(i)組換えFc領域の作製または購入、(ii)Fc領域に結合される標的化分子の作製または購入、(iii)適切な架橋試薬(表1を参照のこと)の存在下での組換えFc領域の標的化分子との混合と架橋を生じさせる条件下でのその混合物のインキュベーション、(iv)結果生じるFc含有複合体の反応混合物からの精製とその後のFc含有複合体の定量、(v)ミニ細胞の表面上にある全てのFc結合部位を占めるのに十分な量のFc含有複合体と積載物含有ミニ細胞の適切な結合緩衝液中でのインキュベーション、(vi)任意の1つ以上の従来法(例えば、接線流濾過)によるあらゆる未結合の複合体の除去、(vii)標的化治療用ミニ細胞の濃縮および/または凍結乾燥、(v)適切な容量の薬学的に許容可能な担体中での再構成による標的化治療用ミニ細胞の製品投与用の製剤によって、標的化治療用ミニ細胞の構築と投与を達成することができる。
GまたはプロテインAのFc結合領域のうちの1つ以上を腸内細菌科またはバシラス科の任意のメンバーに由来するミニ細胞の表面に発現および提示するために同じアプローチを用いることができ、その結果、ミニ細胞は、真核細胞特異的表面抗原に特異的な抗体および/またはFc含有融合体/複合体標的化分子をさらに結合することができるFc結合性ミニ細胞になり、それによって疾患に関係する標的組織、器官または細胞タイプに優先的に局在し、蓄積することができる、標的化能を有するミニ細胞になる。当業者は、この目標の達成では、推定上または予想上の外膜タンパク質または外膜局在化配列とプロテインGまたはプロテインAのFc結合領域のうちの1つ以上との間の融合タンパク質をコードする核酸配列の作製が問題であることを理解する。
ivatuzumab)、ブリナツモマブ(Blinatumomab)、ブレンツキシマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、カンツズマブ、カプロマブ(Capromab)、カツマキソマブ、CC49、セデリズマブ(Cedelizumab)、セルトリズマブ、セツキシマブ、mAb528、シタツズマブ(Citatuzumab)、シクスツムマブ(Cixutumumab)、クレノリキシマブ、クリバツズマブ(Clivatuzumab)、コナツムマブ(Conatumumab)、CR6261、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダラツムマブ(Daratumumab)、デノスマブ、デツモマブ(Detumomab)、ドルリモマブ(Dorlimomab)、ドルリキシズマブ(Dorlixizumab)、エクロメキシマブ(Ecromeximab)、エクリズマブ、エドバコマブ(Edobacomab)、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ(Efungumab)、エロツズマブ(Elotuzumab)、エルシリモマブ(Elsilimomab)、エンリモマブ(Enlimomab)、エピツモマブ(Epitumomab)、エプラツズマブ、エルリズマブ(Erlizumab)、エルツマクソマブ(Ertumaxomab)、エタラシズマブ、エクシビビルマブ(Exbivirumab)、ファノレソマブ(Fanolesomab)、ファラリモマブ(Faralimomab)、ファルレツズマブ(Farletuzumab)、フェルビズマブ(Felvizumab)、フェザキヌマブ(Fezakinumab)、フィギツムマブ、フォントリズマブ、フォラビルマブ(Foravirumab)、フレソリムマブ(Fresolimumab)、ガリキシマブ、ガンテネルマブ(Gantenerumab)、ガビリモマブ(Gavilimomab)、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ(Girentuximab)、グレムバツムマブ(Glembatumumab)、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ(Gomiliximab)、イバリズマブ(Ibalizumab)、イルビツモマブ(Irbitumomab)、イゴボマブ(Igovomab)、イムシロマブ(Imciromab)、インフリキシマブ、インテツムマブ(Intetumumab)、イノリモマブ(Inolimomab)、イノツズマブ(Inotuzumab)、イピリムマブ(Ipilimumab)、イラツムマブ(Iratumumab)、J591、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レブリキズマブ(Lebrikizumab)、レマレソマブ(Lemalesomab)、レルデリムマブ(Lerdelimumab)、レクサツムマブ、リビビルマブ(Libivirumab)、リンツズマブ、ロルボツズマブ(Lorvotuzumab)、ルカツムマブ(Lucatumumab)、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マスリモマブ(Maslimomab)、マツズマブ、メポリゾマブ(Mepolizomab)、メテリムマブ(Metelimumab)、ミラツズマブ、ミンレツモマブ(Minretumomab)、ミツモマブ、モロリムマブ(Morolimumab)、モタビズマブ、ムロモナブ、ナコロマブ(Nacolomab)、ナプツモマブ(Naptumomab)、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツツマブ(Necitutumab)、ネレリモマブ(Nerelimomab)、ニモツズマブ、ノフェツモマブ(Nofetumomab)、オクレリズマブ、オヅリモマブ(Odulimomab)、オファツムマブ(Ofatumumab)、オララツマブ(Olaratumab)、オマリズマブ、オポルツズマブ(Oportuzumab)、オレゴボマブ、オテリキシズマブ(Otelixizumab)、パギバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パノバクマブ(Panobacumab)、パスコリズマブ(Pascolizumab)、ペムツモマブ(Pemtumomab)、ペルツズマブ、パキセリズマブ、ピンツモマブ(Pintumomab)、プリリキシマブ(Priliximab)、プリツムマブ(Pritumumab)、PRO140、ラフィビルマブ(Rafivirumab)、ラムシルマブ(Ramucirumab)、ラニビズマブ、ラキシバクマブ(Raxibacumab)、レガビルマブ、レシリズマブ(Resilizumab)、リロツムマブ(Rilotumumab)、リツキシマブ、ロバツムマブ(Robatumumab)、ロンタリズマブ(Ronタリズマブ)、ロベリズマブ(Rovelizumab)、ルプリズマブ(Ruplizumab)、サツモマブ(Satumomab)、セビルマブ(Sevirumab)、シブロツズマブ
(Sibrotuzumab)、シファリムマブ(Sifalimumab)、シルツキシマブ(Siltuximab)、シプリズマブ、ソラネズマブ(Solanezumab)、ソネプシズマブ(Sonepcizumab)、ソンツズマブ(Sontuzumab)、スタムルマブ(Stamulumab)、スレソマブ(Sulesomab)、タカツズマブ(Tacatuzumab)、タドシズマブ(Tadocizumab)、タリズマブ、タネズマブ(Tanezumab)、タプリツモマブ(Taplitumomab)、テフィバズマブ(Tefibazumab)、テリモマブ(Telimomab)、テナツモマブ(Tenatumomab)、テプリズマブ、TGN1412、チシリムマブ、ティガツズマブ、TNX‐650、トシリズマブ、トラリズマブ(Toralizumab)、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブ(Tucotuzumab)、ツビルマブ(Tuvirumab)、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バパリキシマブ(Vapaliximab)、ベドリズマブ(Vedolizumab)、ベルツズマブ、ベパリモマブ(Vepalimomab)、ビジリズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ(Zanolimumab)、ジラリムマブ(Ziralimumab)、ゾリモマブ(Zolimomab)、および前述のものの任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。
真正細菌ミニ細胞は、動物にとって治療的、予防的、または診断的利益がある数種類の生物学的活性がある化合物を封入し、送達することができる。ミニ細胞が送達することができる生物学的活性がある化合物(積載物)の種類には小分子(小分子薬を含む)、核酸、ポリペプチド、放射性同位体、脂質、リポ多糖、およびそれらの任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。
1)ヒートショックタンパク質の阻害剤、(12)トランスレチノイン酸などのレチノイド、(13)成長因子受容体または成長因子自体の阻害剤、(14)ナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンなどの抗有糸分裂化合物、(15)COX阻害剤などの抗炎症剤、および(16)チェックポイント調節因子などの細胞周期調節因子およびテロメラーゼ阻害剤、(17)転写因子阻害剤、およびBcl‐2、Bcl‐xおよびXIAPの阻害剤などのアポトーシス誘導剤が挙げられるが、これらに限定されない。
。タンパク質は、アクチンなどの場合のように、構造的であり得る。タンパク質は蛍光性または生物発光性であることで局在を示すシグナルを提供することができる。タンパク質は免疫原として働くことができ、または他の治療目的を果たすことができる(例えば、標的細胞、組織、器官または動物において酵素を供給または回復する)。タンパク質はエンドサイトーシス後に他の種類の積載物の細胞内輸送を補助することができる。例えば、標的細胞のエンドサイトーシスコンパートメントから標的細胞の細胞質へのミニ細胞積載物の輸送を促進するためにリステリア・モノサイトジェネス(Listeria monocytogenes)のリステリオリシンOなどのタンパク質を使用することができる。タンパク質はまたプロドラッグ転換酵素であり得る。好ましいタンパク質にはリステリオリシンO、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質プロテインおよびルシフェラーゼファミリータンパク質のあらゆるメンバーが含まれる。標的化ミニ細胞が送達する組換え発現した/産生した治療用ポリペプチドにはタンパク毒素、コレステロール依存性細胞溶解素、機能性酵素、活性型カスパーゼ、プロカスパーゼ、サイトカイン、ケモカイン、細胞透過性ペプチド、および前述のものの任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。治療用ポリペプチドの組換え発現は、プラスミド、コスミド、ファージミド、および細菌人工染色体(BAC)、および前述のものの任意の組合せを含むが、これらに限定されない、当技術分野において公知の様々な原核生物性エピソーム性組換え発現ベクターのうちのいずれかからの発現の結果であり得る。同様に、組換え発現は、1コピー以上のミニ細胞産生親細胞の染色体に存在する染色体局在型の原核生物性発現カセットによって達成され得る。本明細書に開示される標的化ミニ細胞を使用するタンパク毒素の送達は、インビボでの細胞の選択的排除が望ましい応用例で特に魅力的なアプローチである。タンパク毒素にはゲロニン、ジフテリア毒素A断片、ジフテリア毒素A/B断片、破傷風毒素、大腸菌熱不安定性毒素(LTIおよび/またはLTII)、コレラ毒素、ウエルシュ菌のイオタ毒素、シュードモナス外毒素A、志賀毒素、炭疽菌毒素、MTX(バチルス・スフェリカス(B.sphaericus)の殺虫毒素)、ペルフリンゴリシンO、ストレプトリシン、オオムギ毒素、メリチン、炭疽菌毒素LFおよびEF、アデニル酸シクラーゼ毒素、ボツリノリシンB、ボツリノリシンE3、ボツリノリシンC、ボツリヌス毒素A、コレラ毒素、クロストリジウム毒素A、Bおよびα、リシン、志賀A毒素、志賀様A毒素、コレラA毒素、百日咳SI毒素、大腸菌熱不安定性毒素(LTB)、リステリオリシンOのpH安定性異型体(pH非依存性;L461Tのアミノ酸置換)、リステリオリシンOの熱安定性異型体(E247MおよびD320Kのアミノ酸置換)、リステリオリシンOのpHおよび熱安定性異型体(E247M、D320KおよびL461Tのアミノ酸置換)、ストレプトリシンO、ストレプトリシンO c、ストレプトリシンO e、スフェリコリシン(sphaericolysin)、アントロリシン(anthrolysin)O、セレオリシン(cereolysin)、チューリンゲンシリシン(thuringiensilysin)O、ワイヘンステファネンシリシン(weihenstephanensilysin)、アルベオリシン(alveolysin)、ブレビリシン(brevilysin)、ブチリクリシン(butyriculysin)、テタノリジンO、ノビリシン(novyilysin)、レクチノリシン(lectinolysin)、ニューモリシン、ミチリシン(mitilysin)、シュードニューモリシン、スイリシン(suilysin)、インターメジリシン(intermedilysin)、イバノリシン(ivanolysin)、ゼーリゲリオリシン(seeligeriolysin)O、バジノリシン(vaginolysin)およびピオリシン(pyolysin)が含まれるが、これらに限定されない。当業者の自由裁量でミニ細胞の様々な細胞内コンパートメントに治療用ポリペプチドを局在させることができる。本明細書に開示される標的化ミニ細胞がグラム陰性ミニ細胞産生親株に由来するとき、それから産生された組換え発現治療用ポリペプチドはミニ細胞の細胞質、内膜の内葉、内膜の外葉、ペリプラズム、外膜の内葉、外膜、および前述の場所の任意の組合せに局在することができる。本明細書に開示される標的化ミニ細胞がグラム陽性ミニ細胞産生親株に由来するとき、それから産生された組換え発現治療用ポリペプチドはミニ細胞の細胞質、細胞壁、膜の
内葉、膜、および前述の場所の任意の組合せに局在することができる。
本願は、医薬組成物を含むが、これに限定されない組成物にも関連する。本明細書で使用される「組成物」という用語は、少なくとも1つの担体、好ましくは生理的に許容可能な担体、および1つ以上のミニ細胞組成物を含む混合物を指す。本明細書で使用される「担体」という用語は、細胞または組織への生物学的活性があるペプチドの取込を阻害または妨害しない化学化合物を指す。担体は通常は有効成分の適切な剤形(例えば、丸剤、カプセル剤、ゲル剤、フィルム剤、錠剤、微粒子剤(例えば、細粒剤)、液剤、軟膏、ペースト剤、エアロゾル剤、滴剤、コロイド剤または乳剤など)への製剤または調合を可能にする不活性物質である。「生理学的に許容可能な担体」は生理条件下での使用に適した担体であって、化合物の生物活性および特性を抑制(低下、阻害または妨害)しない担体である。例えば、ジメチルスルフオキシド(DMSO)は、多数の有機化合物の生物の細胞または組織への取込を促進するような担体である。好ましくは、前記担体は生理学的に許容可能な担体であり、好ましくは薬学または獣医学的に許容可能な担体であり、その担体の中にミニ細胞組成物が配置される。
クチン、キサンタンガム、グアーガム、ローカストビーンガム、ヒアルロン酸、カゼインジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル‐セルロース、ポリアクリレート、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリドン(PVP)などの充填剤が特に含まれる。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩などの崩壊剤を含むこともできる。他の適切な添加剤および担体にはヒドロゲル、ゲル化ヒドロコロイドおよびキトサンが含まれる。キトサンの細粒およびマイクロカプセルを担体として使用することができる。例えば、国際公開第98/52547号を参照のこと(それは、胃を標的とする化合物の細粒製剤について記載しており、その製剤は、1つ以上の有効成分を含有する内核(ゲル化ヒドロコロイドを含んでもよい)、有効成分の放出速度を制御するための非水溶性高分子(例えば、エチルセルロース)から構成される膜、および生体付着性陽イオン性高分子、例えば、陽イオン性ポリサッカリド、陽イオン性タンパク質および/または合成陽イオン性高分子から構成される外被層を含む;米国特許第4,895,724号)。通常、キトサンは適切な薬剤、例えば、グルタルアルデヒド、グリオキサール、エピクロルヒドリンおよびスクシンアルデヒドを使用して架橋される。担体としてキトサンを使用する組成物は、有効成分の制御放出をもたらす剤形を含む、丸剤、錠剤、微粒子剤および細粒剤を含む様々な剤形に製剤され得る。他の適切な生体付着性陽イオン性高分子には酸性ゼラチン、ポリガラクトサミン、ポリリシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチンなどのポリアミノ酸、高分子量四級化合物、プロラミン、ポリイミン、ジエチルアミノエチルデキストラン(DEAE)、DEAE‐イミン、DEAE‐メタクリレート、DEAE‐アクリルアミド、DEAE‐デキストラン、DEAE‐セルロース、ポリ‐p‐アミノスチレン、ポリオキセタン(polyoxethane)、メタクリレート共重合体、ポリアミドアミン、陽イオン性デンプン、ポリビニルピリジン、およびポリチオジエチルアミノメチルエチレンが含まれる。
が発現する場所に応じて、粘膜付着性により製剤を保持することができ、標的細胞表面輸送部分と組成物が相互作用する所望の場所に到達するまで製剤を保護するために剤形を別のコーティングで被覆する。
本願は、固形腫瘍、転移性腫瘍および液性腫瘍を含むが、これらに限定されない癌の診断イメージングおよび治療に関連する。固形腫瘍および転移性腫瘍には上皮起源の腫瘍が
含まれ、ならびに、乳腺、肺、膵臓、前立腺、精巣、卵巣、胃部、腸部、口腔、舌、咽頭、肝臓、肛門、直腸、結腸、食道、膀胱、胆嚢、皮膚、子宮、膣、刑事および腎臓の癌が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に開示される標的化ミニ細胞を用いて治療することができる他の種類の固形癌には腺癌、肉腫、線維肉腫ならびに眼、脳および骨の癌が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に開示される標的化ミニ細胞が治療することができる液性腫瘍には非ホジキンリンパ腫、骨髄腫、ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、および他の白血病が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に開示される標的化ミニ細胞は、α3β1インテグリン、α4β1インテグリン、α5β1インテグリン、αvβ3インテグリン、αvβ1インテグリン、β1インテグリン、5T4、CAIX、CD4、CD13、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD31、CD33、CD34、CD40、CD44v6、CD45、CD51、CD52、CD54、CD56、CD64、CD70、CD74、CD79、CD105、CD117、CD123、CD133、CD138、CD144、CD146、CD152、CD174、CD205、CD227、CD326、CD340、Cripto、ED‐B、GD2、TMEFF2、VEGFR1、VEGFR2、FGFR、PDGFR、ANGPT1、TIE1、TIE2、NRP1、TEK(CD202B)、TGFβR、デスレセプター5(Trail‐R2)、DLL4、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHA10、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、FAP、GPNMB、ICAM、VCAM、PSMA、HER‐2/neu、IL‐13Rα2、MUC‐1、MUC16、EGFR1(HER‐1)、EGFR2(HER‐2/neu)、EGFR3(HER‐3)、IGF‐1R、IGF‐2R、c‐Met(HGFR)、メソテリン、PDGFR、EDGR、TAG‐72、トランスフェリン受容体、EpCAM、CTLA‐4、PSMA、テネイシンC、α‐フェトプロテイン、ビメンチン、C242抗原、TRAIL‐R1、TRAIL‐R2、CA‐125、GPNMB、CA‐IX、GD3ガングリオシド、RANKL、BAFF、IL‐6R、TAG‐72、HAMA、およびCD166を含むが、これらに限定されない真核生物の癌細胞特異的表面抗原を標的とする。
ンジオブラスト、周皮細胞、筋線維芽細胞および内皮前駆細胞は全て脈管形成または血管新生を防止するための標的である。内皮細胞およびそれらの前駆細胞は、抗血管新生性ミニ細胞を使用して標的とすることができる、特に重要な脈管形成性および血管新生性細胞タイプである。多くの内皮細胞が脈管形成部位および血管新生部位で特徴的な細胞表面タンパク質を過剰発現する、優先的に発現する、および/または差次的に発現する。さらに、循環内皮細胞および循環内皮前駆細胞(血液およびリンパ液に存在する)は抗血管新生性ミニ細胞の標的である。循環内皮細胞および内皮前駆細胞は、それらを他の細胞タイプから区別し、抗血管新生性ミニ細胞の優先的標的化の基盤として機能する細胞表面抗原も発現する。集合的に、これらの細胞表面分子は血管新生特異的抗原と呼称される。血管新生特異的抗原を特異的に認識する多くの抗体およびそれらの可変領域の核酸配列は既に当技術分野において公知である。本願に関連して、これらの抗体のいずれも生体外より使用することができる。報告された抗体が存在しない血管新生特異的抗原が数多く特定されている。しかしながら、これらの抗原に対する抗体を作製する方法は当技術分野において周知であり、血管新生特異的抗原または他の任意の血管新生関連表面抗原に対するありとあらゆる抗体を、説明されたように前記組成物に組み込むことができる。選択される血管新生特異的抗原にはα4β1インテグリン、α5β1インテグリン、αvβ3インテグリン、αvβ1インテグリン、β1インテグリン、CD13、CD31、CD34、CD45、CD54、CD105、CD117、CD133、CD144、CD146、VEGFR1、VEGFR2、FGFR、PDGFR、ANGPT1、TIE1、TIE2、NRP1、TEK(CD202B)、TGFβR、DLL4、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHA10、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、ICAM、VCAMおよびPSMAが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態は、生じるミニ細胞が親細胞またはミニ細胞自体による治療用RNA分子の発現の後の封入により大量の治療用RNA分子を含むように、アンチセンスRNA(例えば、siRNAおよびshRNA)、リボザイムおよびmiRNAを含むが、これらに限定されない任意のサブクラスの治療用RNAを含有または産生する、非限定的だが、腸内細菌科から最適化された株を作製すること、およびFc結合性ミニ細胞を調製することに関連する。前記の培養および条件から所望の量のミニ細胞を産生した後、培養物または細胞を既知のシグナルに曝露すると遺伝的自殺機構の活性化が達成される。あるいは、(生じるミニ細胞が治療用RNAを含むように、ミニ細胞産生親株が同一または異なる治療用RNAを発現するのと別に、またはそれと共に)ミニ細胞を高濃度の外来性RNA分子とインキュベートすることによって、上記のRNA分子のいずれかのFc結合性ミニ細胞への負荷を達成することもできる。
機構の活性化が達成される。
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)により示される、プロテインAまたはプロテインGのFc結合領域のミニ細胞表面上での発現および提示。ミニ細胞産生大腸菌株VAX12B4を(i)L‐ラムノース誘導性発現プラスミドpVX‐119(Lpp‐OmpAΩプロテインAをコードする;配列番号1)、(ii)L‐ラムノース誘導性発現プラスミドpVX‐120(Lpp‐OmpAΩプロテインGをコードする;配列番号2)または(iii)空ベクター対照プラスミドのいずれかで形質転換し、それぞれ、ミニ細胞産生株VAX13B7(プロテインA)、VAX13C4(プロテインG)およびVAX12C4(ベクター対照)を作製した。VAX13B7、VAX13C4およびVAX12C4のそれぞれを、0.2%グルコース、10mg/mLジアミノピメリン酸(DAP)、11mg/mLリシンおよび50mg/mLカナマイシンを含有する20mLのルリア・ベルターニ(LB)培地中で一晩培養した。翌日、上記のようにDAP、リシンおよびカナマイシンを含有する700mLの新しいLB培地に一晩培養物を1/100に希釈して加えることによりそれぞれの株を別々に継代した。培養物を0.1の光学密度(O.D.600)まで培養し、融合タンパク質の発現を誘導するために、その時点で10μMの終濃度までL‐ラムノースを添加した。培養物が1.0のO.D.600に到達したときに、20μMのイソプロピルβ‐D‐1‐チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加してミニ細胞の形成を誘導した。L‐ラムノースによる誘導から8時間後に培養物を42℃に移し、一晩培養して親細胞の自殺を誘導した。次に、ショ糖密度分画により培養物からミニ細胞を精製し、ELISAによりプロテインAかプロテインGのどちらかの表面提示についてそれらを分析した。96ウェルポリスチレンプレートの炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH9.5)中でVAX13B7、VAX13C4またはVAX12C4由来の1×1007個のミニ細胞を一晩インキュベートしてそのプレートにミニ細胞を結合させることによりELISAを実行した。翌日、0.05%のツイーン20を含有するリン酸緩衝生理食塩水、pH7.4(PBS)でプレートのウェルを3回ずつ洗浄し、次に、1%のゼラチンを含有するPBSを室温で1時間使用してプレートのウェルをブロックした。その後、0.05%のツイーン20を含有するPBSでウェルを3回ずつ洗浄し、次に、プロテインAまたはプロテインGのどちらかに対するHRP複合体化ニワトリIgY抗体と室温で1時間インキュベートした。インキュベーションの後、0.5%のツイーン20を含有するPBSでプレートを5回ずつ洗浄し、次に、各ウェルにTMBを添加した。標準品(組換えプロテインA/G)のシグナルが飽和する前に1Mの硫酸を添加して反応を停止し、その後、SpectraMaxM3プレートリーダー(Molecular Devices,Inc.)でプレートを分析した。組換えプロテインA/G(Pierce,Inc.)のタイトレーションにより作成された検量線に対して実験区のELISAシグナルを比較することにより表面融合タンパク質の提示の程度が決定され、図2にそれが示されている。
プロテインAまたはプロテインGのFc結合部分を発現するミニ細胞によるVEGFR
2抗体の結合と提示。VAX13B7株(プロテインA提示型)、VAX13C4株(プロテインG提示型)およびVAX12B5株(陰性対照)から精製されたミニ細胞(1×1009個)を、ヒトVEGFR2に対するマウスモノクローナルIgG抗体を使用せずに(−)、または使用して(+)、1μgずつのその抗体と室温で1時間インキュベートして抗体をミニ細胞に結合させた。インキュベーションの後、1mLのPBS(pH7.4)でミニ細胞を3回ずつ洗浄してあらゆる未結合の抗体を除去した。その後、HRP複合体化ウサギ抗マウスポリクローナル抗体を二次抗体として使用するウエスタンブロットによりミニ細胞(1×1008個)を分析した。図3にそのウエスタンブロットが示されている。Amersham ECL検出キット(GE Healthcare)を使用して二次抗体の特異的結合を可視化した。マウス抗VEGFR2抗体(100ng)を陽性対照として負荷した(12B5の次のレーン)。
プロテインAまたはプロテインGのFc結合部分を発現するミニ細胞によるEGFR1抗体の結合と提示。VAX13B7株(プロテインA提示型)、VAX13C4株(プロテインG提示型)およびVAX12B5株(陰性対照)から精製されたミニ細胞(1×1009個)を、ヒトEGFR1に対するマウスモノクローナルIgG抗体(mAb528)を使用せずに(−)、または使用して(+)、1μgずつのその抗体と室温で1時間インキュベートして抗体をミニ細胞に結合させた。インキュベーションの後、1mLのPBS(pH7.4)でミニ細胞を3回ずつ洗浄してあらゆる未結合の抗体を除去した。その後、HRP複合体化ウサギ抗マウスポリクローナル抗体を二次抗体として使用するウエスタンブロットによりミニ細胞(1×1008個)を分析した。図4にそのウエスタンブロットが示されている。Amersham ECL検出キット(GE Healthcare)を使用して二次抗体の特異的結合を可視化した。マウス抗EGFR抗体(100ng)を陽性対照として負荷した(12B5の次のレーン)。
抗ヒトEGFR1抗体mAb528と結合し、それを提示するミニ細胞はインビトロでEGFR1発現ヒト非小細胞性肺癌細胞株H460に対して選択的に標的化される。Lpp‐OmpA‐プロテインGを発現および提示するミニ細胞(13C4)と適切なLpp‐OmpA‐プロテインG欠損ミニ細胞対照(12B4)を膜特異的蛍光イメージング剤であるFM‐143で1時間染色し、その後、等量の1×PBSで3回ずつ洗浄した。染色後、13C4ミニ細胞(Lpp‐OmpA‐プロテインG融合体を発現する)を過剰なmAb528またはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH;哺乳類細胞に存在しない)に対する種/アイソタイプ適合対照抗体と共インキュベートして13C4ミニ細胞の表面へ抗体を結合させた。さらなる対照として、Lpp‐OmpA‐プロテインG融合体
を発現しない12B4ミニ細胞も等濃度のmAb528と共インキュベートした。抗体の結合後、試料を3回ずつ洗浄し、その後、5000:1のミニ細胞対H460の比率でH460培養細胞と2時間インキュベートさせた。2時間のインキュベーション後、細胞培養培地中で細胞を3回ずつ洗浄し、その後、蛍光顕微鏡観察を用いて蛍光性ミニ細胞の取込について細胞を視覚化した。図5に蛍光顕微鏡観察の結果が示されている。
細菌を30℃で培養した後、ミニ細胞を濃縮するために低速遠心分離の代わりに1.0ミクロンカットフィルターを使用し、次にショ糖の代わりにフィコールを使用することにより、融合タンパク質を有するLpp‐OmpA‐プロテインA2Fc(プロテインA)ミニ細胞を精製した。融合タンパク質のプロテインA部分は抗体のFc領域を介して抗体に結合することができるが、F(ab’)2とは結合できず、そして、OmpTプロテアーゼに対して耐性である。精製後、プロテインAミニ細胞(Lpp‐OmpA‐プロテインA2Fc発現型)を蛍光イメージング剤CFSE(カルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル)で染色し、その後、実施例4に記載されるように抗ヒトEGF受容体抗体、抗KLH抗体または抗ヒトCD123(IL‐3受容体;H460は発現しない)抗体でそれらを修飾した。過剰な未結合抗体の除去後、ミニ細胞をH460細胞(EGFR1を発現するヒト非小細胞性肺癌細胞株)と40分間インキュベートし、そして、洗浄した。蛍光顕微鏡観察により蛍光性ミニ細胞の腫瘍細胞による取込を判定した。図6は様々な抗体で修飾されているミニ細胞とインキュベートしたH460細胞単層の蛍光顕微鏡像を示し、抗KLH標的化ミニ細胞(図6B)または抗CD123標的化ミニ細胞(図6C)と対照的にEGFR1標的化ミニ細胞の顕著な取込が図6Aで示されている。予想したように、無抗体対照も取込を示さなかった(図6D)。図6に概説される同じ実験で、トリプシン処理された細胞のFACS分析により定量的に測定された相対的ミニ細胞取込の結果が図7に示されている。
Claims (25)
- 完全にインタクトな細菌ミニ細胞であって、
(i)前記ミニ細胞の表面に提示されるプロテインGのFc結合部分またはプロテインAのFc結合部分、
(ii)1つ以上の生理活性分子、および
(iii)前記Fc結合部分に結合した1つ以上のFc含有標的化分子
を含み、前記の1つ以上のFc含有標的化分子が真核生物性抗原を認識する、前記細菌ミニ細胞。 - プロテインGのFc結合部分を含む、請求項1に記載のミニ細胞。
- プロテインAのFc結合部分を含む、請求項1に記載のミニ細胞。
- 前記の1つ以上の生理活性分子のうちの少なくとも1つがタンパク毒素である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のミニ細胞。
- 前記タンパク毒素が、ゲロニン、ジフテリア毒素A断片、ジフテリア毒素A/B断片、破傷風毒素、大腸菌熱不安定性毒素(LTIおよび/またはLTII)、コレラ毒素、ウエルシュ菌のイオタ毒素、シュードモナス外毒素A、志賀毒素、炭疽菌毒素、MTX(バチルス・スフェリカス(B.sphaericus)の殺虫毒素)、ペルフリンゴリシンO、ストレプトリシン、オオムギ毒素、メリチン、炭疽菌毒素LFおよびEF、アデニル酸シクラーゼ毒素、ボツリノリシンB、ボツリノリシンE3、ボツリノリシンC、ボツリヌス毒素A、コレラ毒素、クロストリジウム毒素A、Bおよびα、リシン、志賀A毒素、志賀様A毒素、コレラA毒素、百日咳SI毒素、大腸菌熱不安定性毒素(LTB)、リステリオリシンOのpH安定性異型体(pH非依存性;L461Tのアミノ酸置換)、リステリオリシンOの熱安定性異型体(E247MおよびD320Kのアミノ酸置換)、リス
テリオリシンOのpHおよび熱安定性異型体(E247M、D320KおよびL461Tのアミノ酸置換)、ストレプトリシンO、ストレプトリシンO c、ストレプトリシンO
e、スフェリコリシン(sphaericolysin)、アントロリシン(anthrolysin)O、セレオリシン(cereolysin)、チューリンゲンシリシン(thuringiensilysin)O、ワイヘンステファネンシリシン(weihenstephanensilysin)、アルベオリシン(alveolysin)、ブレビリシン(brevilysin)、ブチリクリシン(butyriculysin)、テタノリジンO、ノビリシン(novyilysin)、レクチノリシン(lectinolysin)、ニューモリシン、ミチリシン(mitilysin)、シュードニューモリシン、スイリシン(suilysin)、インターメジリシン(intermedilysin)、イバノリシン(ivanolysin)、ゼーリゲリオリシン(seeligeriolysin)O、バジノリシン(vaginolysin)、ピオリシン(pyolysin)、ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項4に記載のミニ細胞。 - 前記の1つ以上の生理活性分子のうちの少なくとも1つが小分子治療薬である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のミニ細胞。
- 前記小分子治療薬が、DNA損傷剤、DNA合成阻害剤、微小管およびチューブリン結合剤、抗代謝剤、酸化損傷誘導剤、抗血管新生剤、内分泌治療剤、抗エストロゲン剤、Toll様受容体のアゴニストまたはアンタゴニストなどの免疫調節因子、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、キナーゼ阻害剤などのシグナル伝達系の阻害剤、ヒートショックタンパク質の阻害剤、レチノイド、成長因子受容体の阻害剤、抗有糸分裂化合物、抗炎症剤、細胞周期調節因子、転写因子阻害剤およびアポトーシス誘導剤、ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項6に記載のミニ細胞。
- 前記の1つ以上の生理活性分子のうちの少なくとも1つが治療用核酸である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のミニ細胞。
- 前記の1つ以上の生理活性分子のうちの少なくとも1つが治療用ポリペプチドである、請求項1〜3のいずれか1項に記載のミニ細胞。
- 前記の1つ以上の生理活性分子のうちの少なくとも1つが小分子薬と治療用核酸の組合せである、請求項1〜3のいずれか1項に記載のミニ細胞。
- 前記の1つ以上のFc含有標的化分子のうちの少なくとも1つが腫瘍細胞表面分子に特異的である、請求項1〜10のいずれか1項に記載のミニ細胞。
- 前記の1つ以上のFc含有標的化分子のうちの少なくとも1つが内皮細胞表面分子に特異的である、請求項1〜10のいずれか1項に記載のミニ細胞。
- 前記の1つ以上のFc含有標的化分子のうちの少なくとも1つが腫瘍細胞と内皮細胞の両方に共通の標的に特異的である、請求項1〜10のいずれか1項に記載のミニ細胞。
- エンドソーム脱出剤をさらに含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載のミニ細胞。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載のミニ細胞および薬学的に許容可能な担体を含む組成物。
- 対象の疾患を治療する方法であって、請求項15に記載の組成物を前記対象に投与し、
それにより前記疾患を治療することを含む方法。 - 前記の1つ以上の生理活性分子のうちの少なくとも1つが感染性因子由来のタンパク質である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のミニ細胞。
- 前記の1つ以上のFc含有標的化分子のうちの少なくとも1つがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的である、請求項17に記載のミニ細胞。
- 前記プロフェッショナル抗原提示細胞が真核生物の樹状細胞またはマクロファージである、請求項18に記載のミニ細胞。
- 前記の1つ以上の生理活性分子のうちの少なくとも1つが腫瘍由来のタンパク質抗原である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のミニ細胞。
- 前記の1つ以上のFc含有標的化分子のうちの少なくとも1つが真核生物の樹状細胞、好酸球、好中球、好塩基球、T細胞、B細胞、マスト細胞またはマクロファージに特異的である、請求項20に記載のミニ細胞。
- エンドソーム脱出剤をさらに含む、請求項17〜21のいずれか1項に記載のミニ細胞。
- 免疫調節性アジュバントをさらに含む、請求項22に記載のミニ細胞。
- 請求項17〜23のいずれか1項に記載のミニ細胞および薬学的に許容可能な担体を含む組成物。
- 免疫の方法であって、それを必要とする対象に請求項24に記載の組成物を投与することを含む免疫の方法。
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