JP2002543396A - 化学毒素用バイオセンサとしての固定化酵素 - Google Patents
化学毒素用バイオセンサとしての固定化酵素Info
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
- G01N33/5438—Electrodes
Abstract
(57)【要約】
有機リン化合物及び有機硫黄化合物の検出に有用な方法、組成物および物質が開示される。特に、固定化された酵素をその表面又はその中に有する多孔性又は非多孔性支持体であるバイオセンサが開示される。これらのバイオセンサは極端な温度及び／又は変性条件で酵素安定性並びに利用される酵素の溶液状態と同様の運動特性を示す。この酵素は多孔性又は非多孔性支持体からしみ出ず、この物質は延長保存後にも酵素活性を維持する。区別的バイオセンサが開示される。
Description
【０００１】 発明の分野 本発明は、一般的には危険化学物質を検出する分野に関する。更に詳細には、
化学兵器試薬及び殺虫剤の検出に有用な方法、組成物、装置及びそのキットに関
する。
化学兵器試薬及び殺虫剤の検出に有用な方法、組成物、装置及びそのキットに関
する。
【０００２】 発明の背景 有機リン及び有機硫黄（これら両方をＯＰという）化合物は広く殺虫剤で用い
られ、人間を含む多くの組織に高い毒性を有する。殺虫剤残留物は土壌及び地下
水中に見出され、これらの残留物の検出は環境からのこれらの除去及び人類及び
動物の健康を保護する為に重要である。ＯＰ化合物は、化学的軍事行動の目的で
、サリン、フォスファイン、ソマン、タバンのような神経試薬中にも使用される
。
られ、人間を含む多くの組織に高い毒性を有する。殺虫剤残留物は土壌及び地下
水中に見出され、これらの残留物の検出は環境からのこれらの除去及び人類及び
動物の健康を保護する為に重要である。ＯＰ化合物は、化学的軍事行動の目的で
、サリン、フォスファイン、ソマン、タバンのような神経試薬中にも使用される
。
【０００３】 これらの試薬は最も毒性の強い試薬であり、アセチルコリンエステラーゼ（Ａ
ＣｈＥ）の特異的阻害剤である。ＡＣｈＥ中毒の後遺症はコリン作動性発症であ
る。臨床的影響は直接アセチルコリンの蓄積に関連する。神経試薬はＧ試薬（Ｇ
Ｄ、ソマン；ＧＢ，サリン；ＧＡ，タバン）及びＶ試薬（ＶＸ）に分類される。
これらの試薬は物性が異なり、例えばＶＸはＧ試薬より遥かに低い蒸気圧を有す
る。しかしながら、これらの試薬の毒性及び主な効果は非常に類似するアセチル
コリンエステラーゼ阻害とその後の自動的中央神経組織の正常動作の破壊である
。このように有機りん化合物の検出は、ＯＰに曝されることによる惨事を阻止す
るために最重要である。
ＣｈＥ）の特異的阻害剤である。ＡＣｈＥ中毒の後遺症はコリン作動性発症であ
る。臨床的影響は直接アセチルコリンの蓄積に関連する。神経試薬はＧ試薬（Ｇ
Ｄ、ソマン；ＧＢ，サリン；ＧＡ，タバン）及びＶ試薬（ＶＸ）に分類される。
これらの試薬は物性が異なり、例えばＶＸはＧ試薬より遥かに低い蒸気圧を有す
る。しかしながら、これらの試薬の毒性及び主な効果は非常に類似するアセチル
コリンエステラーゼ阻害とその後の自動的中央神経組織の正常動作の破壊である
。このように有機りん化合物の検出は、ＯＰに曝されることによる惨事を阻止す
るために最重要である。
【０００４】 これらのコリンエステラーゼ阻害剤の信頼性決定に対する要求は、殆どが気体
及び液体クロマトグラフィーと質量分光計の使用を含む、多くの巧妙な器具によ
る方法の開発を促した。また、殆どがルミノール及びペルオキシオクサレート反
応を利用した、無機及び有機の種のための多くの液相化学ルミネセンス工程も開
発された。Robards K.及びWorsfold P. J.(1992) Aal. Chem.Acta, 266:147参照
。
及び液体クロマトグラフィーと質量分光計の使用を含む、多くの巧妙な器具によ
る方法の開発を促した。また、殆どがルミノール及びペルオキシオクサレート反
応を利用した、無機及び有機の種のための多くの液相化学ルミネセンス工程も開
発された。Robards K.及びWorsfold P. J.(1992) Aal. Chem.Acta, 266:147参照
。
【０００５】 これらの伝統的な方法は、時間がかかり、複雑で、使用される器具は高価で持
ち運び不可、高度のメンテナンスを要するため、個人的な使用には不向きである
。また、これらの伝統的方法で混合物中の神経剤を測定するには、煩雑な抽出と
手作業が要求される。
ち運び不可、高度のメンテナンスを要するため、個人的な使用には不向きである
。また、これらの伝統的方法で混合物中の神経剤を測定するには、煩雑な抽出と
手作業が要求される。
【０００６】 そこで、従来の気体及び液体クロマトグラフィーと質量分光計による技術に代
わるものとして、バイオセンサが開発された。一般に、バイオセンサは、酵素を
ベースとするものと、生化学的親和性をベースとするものとがある。酵素による
バイオセンサは、入ってくる基質と固定化された酵素との間に生じる反応物を検
出するために、酵素あるいは代謝プロセスを使用する。生化学的親和性によるバ
イオセンサは、ターゲットの物質の生物学的結合現象に依存する。
わるものとして、バイオセンサが開発された。一般に、バイオセンサは、酵素を
ベースとするものと、生化学的親和性をベースとするものとがある。酵素による
バイオセンサは、入ってくる基質と固定化された酵素との間に生じる反応物を検
出するために、酵素あるいは代謝プロセスを使用する。生化学的親和性によるバ
イオセンサは、ターゲットの物質の生物学的結合現象に依存する。
【０００７】 従来技術のバイオセンサは、生物学的な相互作用の結果として電極信号を生成
する電極装置である。このバイオセンサは、生化学的活動が電気的活動に変換さ
れるように電子的変換器に接続された生物学的レセプタを備えている。バイオセ
ンサの電気的構成部品は、電圧、アンペア、波長、温度、或いは質量を測定する
。Lowe. C. R.(1984) Biosensors 1:3-16参照。
する電極装置である。このバイオセンサは、生化学的活動が電気的活動に変換さ
れるように電子的変換器に接続された生物学的レセプタを備えている。バイオセ
ンサの電気的構成部品は、電圧、アンペア、波長、温度、或いは質量を測定する
。Lowe. C. R.(1984) Biosensors 1:3-16参照。
【０００８】 バイオセンサは、生物学、薬学或いは臨床上重要な化合物を検出するのに広く
使用されている。一般に、酵素バイオセンサは、選択的で敏感且つ特別なもので
ある。これらは形態可能かつ簡易で、使用が容易である。酵素バイオセンサは、
目標の物質のみ検出でき、他の環境や生物学的干渉は全て無視する。
使用されている。一般に、酵素バイオセンサは、選択的で敏感且つ特別なもので
ある。これらは形態可能かつ簡易で、使用が容易である。酵素バイオセンサは、
目標の物質のみ検出でき、他の環境や生物学的干渉は全て無視する。
【０００９】 種々のコリンエステラーゼ（ＣｈＥ）バイオセンサが開発されている。これら
のバイオセンサは、支持体に非共有結合で固定されたＣｈＥを備えている。コリ
ンエステラーゼは、ガラス、シリカ、イオン交換樹脂、アガロースないしナイロ
ン製の支持体等、全ての固体又はゲル状の支持体の上に固定されている。理想的
には、固体の支持体上に酵素を固定するための好ましい方法は、結合速度が高く
、好ましいバイオセンサは、酵素活性を維持しかつ安定である。しかしながら、
非共有結合の酵素を有するバイオセンサは、環境及び／又は変性条件で酵素が不
安定で、非共有結合の表面から浸出し、溶液では寿命が短い等、望ましくない性
質を有する。
のバイオセンサは、支持体に非共有結合で固定されたＣｈＥを備えている。コリ
ンエステラーゼは、ガラス、シリカ、イオン交換樹脂、アガロースないしナイロ
ン製の支持体等、全ての固体又はゲル状の支持体の上に固定されている。理想的
には、固体の支持体上に酵素を固定するための好ましい方法は、結合速度が高く
、好ましいバイオセンサは、酵素活性を維持しかつ安定である。しかしながら、
非共有結合の酵素を有するバイオセンサは、環境及び／又は変性条件で酵素が不
安定で、非共有結合の表面から浸出し、溶液では寿命が短い等、望ましくない性
質を有する。
【００１０】 一般に、酵素をポリマーに共有結合する方法の殆どは、酵素の活性と安定性を
減ずるハーシュ又はプロテインによる不都合な条件を使用している。米国特許第
4,342,834号は、イソシアネートをベースとするポリウレタン発泡体を製造する
方法を開示しており、ここでは種々の活性度を持つ酵素を共有結合するが、ＯＰ
化合物の検出に有用な材料やそのような材料を使用する方法については何ら開示
されていない。
減ずるハーシュ又はプロテインによる不都合な条件を使用している。米国特許第
4,342,834号は、イソシアネートをベースとするポリウレタン発泡体を製造する
方法を開示しており、ここでは種々の活性度を持つ酵素を共有結合するが、ＯＰ
化合物の検出に有用な材料やそのような材料を使用する方法については何ら開示
されていない。
【００１１】 また、この特許では、多孔性の支持体に酵素を固定化することで、空気で誘発
されるせん断力を減らし酵素活性を維持するような方法も、開示されていない。
されるせん断力を減らし酵素活性を維持するような方法も、開示されていない。
【００１２】 発明の概要 一実施態様において、本発明は、酵素がその表面又はその中で固定化されてい
る多孔性支持体からなる物質に関し、その物質はＯＰ化合物のような危険化合物
の検出及び測定のためのバイオセンサとしての使用に適している。
る多孔性支持体からなる物質に関し、その物質はＯＰ化合物のような危険化合物
の検出及び測定のためのバイオセンサとしての使用に適している。
【００１３】 好ましい実施態様において、この物質は多孔性支持体と共有結合している酵素
を含み、この固定化された酵素は極端な温度及び／又は変性条件で酵素安定性及
び可溶形態の同様の動的特性を示す。この酵素は多孔性又は非多孔性支持体から
しみ出ず、この物質は延長保存後にも酵素活性を維持する。
を含み、この固定化された酵素は極端な温度及び／又は変性条件で酵素安定性及
び可溶形態の同様の動的特性を示す。この酵素は多孔性又は非多孔性支持体から
しみ出ず、この物質は延長保存後にも酵素活性を維持する。
【００１４】 もう一つの実施態様において、複数の酵素がその表面又はその中で固定化され
ている多孔性支持体を含む複数の物質であって、その複数の物質は特異的ＯＰ化
合物の存在を検出する為の複数のゾーンを有する差別的バイオセンサとしての使
用に適している。好ましい実施態様において、バイオセンサの寸法は約０．２５
インチｘ０．２５インチｘ０．０３１２５インチから約６インチｘ４インチｘ０
．２５インチである。
ている多孔性支持体を含む複数の物質であって、その複数の物質は特異的ＯＰ化
合物の存在を検出する為の複数のゾーンを有する差別的バイオセンサとしての使
用に適している。好ましい実施態様において、バイオセンサの寸法は約０．２５
インチｘ０．２５インチｘ０．０３１２５インチから約６インチｘ４インチｘ０
．２５インチである。
【００１５】 更に、もう一つの実施態様において、本発明は複数の酵素が固定化されている
多孔性支持体を含む物質であってＯＰ化合物のような危険な化合物の検出の為の
バイオセンサとしての使用に適する物質の製造方法に関する。この多孔性支持体
の合成はポリエステルのようなプレポリマー及びＰ−６５のような界面活性剤の
使用を含む。好ましい実施態様において、この物質の製造方法は酵素活性を減少
させる空気誘導せん断力又はせん断応力を減少させる。従来技術の方法例えば混
合ドリルによるこの物質の合成において、用いられる酵素は流力又はせん断応力
に委ねられる。各構成物を穏やかに互いに包む装置の使用は流力又はせん断応力
を大いに減少させ、酵素、特にドリル混合機の高せん断応力に敏感な酵素にとっ
て好ましい装置である。この低せん断混合機は、高せん断装置で調製された同じ
混合物と比較すると結果として得られるＡＣｈＥ又はＢＣｈＥ固定化酵素活性を
２倍以上にする。加えて、表面活性ポリマー，例えばＰ−６５などの添加物又は
低濃度グリセロールの使用はせん断力により誘導される酵素変性に対する保護に
なる。
多孔性支持体を含む物質であってＯＰ化合物のような危険な化合物の検出の為の
バイオセンサとしての使用に適する物質の製造方法に関する。この多孔性支持体
の合成はポリエステルのようなプレポリマー及びＰ−６５のような界面活性剤の
使用を含む。好ましい実施態様において、この物質の製造方法は酵素活性を減少
させる空気誘導せん断力又はせん断応力を減少させる。従来技術の方法例えば混
合ドリルによるこの物質の合成において、用いられる酵素は流力又はせん断応力
に委ねられる。各構成物を穏やかに互いに包む装置の使用は流力又はせん断応力
を大いに減少させ、酵素、特にドリル混合機の高せん断応力に敏感な酵素にとっ
て好ましい装置である。この低せん断混合機は、高せん断装置で調製された同じ
混合物と比較すると結果として得られるＡＣｈＥ又はＢＣｈＥ固定化酵素活性を
２倍以上にする。加えて、表面活性ポリマー，例えばＰ−６５などの添加物又は
低濃度グリセロールの使用はせん断力により誘導される酵素変性に対する保護に
なる。
【００１６】 ここに述べるように、当業者は入手可能な種々のプレポリマー及び界面活性剤
で多様な多孔性支持体を合成し得る。
で多様な多孔性支持体を合成し得る。
【００１７】 固定化されるとき、バイオセンサのこれら酵素は極端な温度及び／又は変性条
件で安定である。これらの酵素はコリンエステラーゼ、コリンオキシラーゼ、ハ
イドロジェンパーオキシダーゼ、有機リン酸ハイドロラ−ゼ，ラッカーゼ、及び
その誘導体を含む。
件で安定である。これらの酵素はコリンエステラーゼ、コリンオキシラーゼ、ハ
イドロジェンパーオキシダーゼ、有機リン酸ハイドロラ−ゼ，ラッカーゼ、及び
その誘導体を含む。
【００１８】 このバイオセンサは、気体及び液体中及び固体のＯＰ薬品の検出及び定量に適
している。例えば、このバイオセンサは、水中及び／又は土壌中のＯＰ化合物を
検出するのに用いられ得る。また、このバイオセンサは、木材、プラスチック、
スキンのような、天然、合成及び／又は生物の表面上のＯＰ化合物を検出するの
に用いられる。ウナギのコリンエステラーゼ以外のＦＢＳ−ＡＣｈＥ又はＥｑ−
ＢＣｈＥのようなマンマリアンコリンエステラーゼを用いることにより、Ｍ２７
２チケット（現在、有機リン化合物を検出する為に使用されている。Truetech,I
nc.から入手できる）中に見出されるように、この固定化センサは、人が影響を
受ける現在の、又は、将来人に対して製造される如何なる新しい新規なＯＰ化合
物に同じ感度を示すだろう。
している。例えば、このバイオセンサは、水中及び／又は土壌中のＯＰ化合物を
検出するのに用いられ得る。また、このバイオセンサは、木材、プラスチック、
スキンのような、天然、合成及び／又は生物の表面上のＯＰ化合物を検出するの
に用いられる。ウナギのコリンエステラーゼ以外のＦＢＳ−ＡＣｈＥ又はＥｑ−
ＢＣｈＥのようなマンマリアンコリンエステラーゼを用いることにより、Ｍ２７
２チケット（現在、有機リン化合物を検出する為に使用されている。Truetech,I
nc.から入手できる）中に見出されるように、この固定化センサは、人が影響を
受ける現在の、又は、将来人に対して製造される如何なる新しい新規なＯＰ化合
物に同じ感度を示すだろう。
【００１９】 一実施態様において、このバイオセンサは蛍光測定、発色測定、化学発光測定
によりＯＰ化合物の存在を示す少なくとも１つのインジケータを含む。
によりＯＰ化合物の存在を示す少なくとも１つのインジケータを含む。
【００２０】 もう一つの実施態様において、このバイオセンサはコリンエステラーゼ活性を
測定することにより、ＯＰ化合物を検出する為の炭素電極を含む。
測定することにより、ＯＰ化合物を検出する為の炭素電極を含む。
【００２１】 もう一つの実施態様において、種々のＯＰ化合物の量及び種類が決定され得る
。
。
【００２２】 更にもう一つの実施態様はキットに関する。このキットは、バイオセンサに従
い、ＯＰ化合物の量及び質の両方の検出の為のインディケータと、検出結果を中
央の収集ポイント、例えばコンピュータ、アップリンクのサテライト、無線中継
所、携帯型の電池駆動計測装置などへ送信するための手段とを備えている。例え
ば、携帯型の電池駆動計測装置を用いてコンピュータに接続し、反応速度を計算
して中央の収集ポイントに伝送することにより、ＯＰ化合物の量を分析すること
ができる。このキットには、装置の使用を容易にするアイテム、例えば、指示書
、容器、試験管などを備えることができる。
い、ＯＰ化合物の量及び質の両方の検出の為のインディケータと、検出結果を中
央の収集ポイント、例えばコンピュータ、アップリンクのサテライト、無線中継
所、携帯型の電池駆動計測装置などへ送信するための手段とを備えている。例え
ば、携帯型の電池駆動計測装置を用いてコンピュータに接続し、反応速度を計算
して中央の収集ポイントに伝送することにより、ＯＰ化合物の量を分析すること
ができる。このキットには、装置の使用を容易にするアイテム、例えば、指示書
、容器、試験管などを備えることができる。
【００２３】 他の実施態様は、ＯＰ化合物のような有害な化合物の量及び質を測定するため
にインスタントなバイオセンサを使用する方法を含む。
にインスタントなバイオセンサを使用する方法を含む。
【００２４】 発明の詳細な記述 酵素はポリマー合成中にハイポベースのポリウレタンに取りこまれている。米
国特許第４，３４２，８３４号参照。ハイポプレポリマーはポリエーテル（又は
ポリエステル）ポリオールを架橋剤の存在下にイソシアネートと反応させること
により合成される。havens, P.L., 他、Ind Eng Chem Res (1992) 32:2254-2258; 米国特許第４，１３７，２００号；LeJeun
e, K.El, 他、Biotechnology and Bioengineering (1999) 20; 62(6):659-665を
参照。合成はこのポリウレタンプレポリマー中で存在するイソシアネートに水分
子を接触させることにより開始される。
国特許第４，３４２，８３４号参照。ハイポプレポリマーはポリエーテル（又は
ポリエステル）ポリオールを架橋剤の存在下にイソシアネートと反応させること
により合成される。havens, P.L., 他、Ind Eng Chem Res (1992) 32:2254-2258; 米国特許第４，１３７，２００号；LeJeun
e, K.El, 他、Biotechnology and Bioengineering (1999) 20; 62(6):659-665を
参照。合成はこのポリウレタンプレポリマー中で存在するイソシアネートに水分
子を接触させることにより開始される。
【００２５】 ２段工程がこの時点から生ずる。イソシアネートが水と反応して不安定なカル
ボン酸が形成し、次にＣＯ２を生成してアミンに分解する。ＣＯ２は多孔性支持
体を持ち上げそれが起ち上がるのを可能にする。このアミンは直ちにイソシアネ
ートと反応して尿素結合が生成する。酵素はイソシアネートと反応しうるアミン
類やハイドロキシル類などの多機能基を有しているので、合成中に酵素は多孔性
支持体の一部として一体化する。かなりの量の酵素がポリマー合成の進行を混乱
させることなく多孔性支持体に結合できる。このポリマー合成中に生ずる反応を
以下に示す。
ボン酸が形成し、次にＣＯ２を生成してアミンに分解する。ＣＯ２は多孔性支持
体を持ち上げそれが起ち上がるのを可能にする。このアミンは直ちにイソシアネ
ートと反応して尿素結合が生成する。酵素はイソシアネートと反応しうるアミン
類やハイドロキシル類などの多機能基を有しているので、合成中に酵素は多孔性
支持体の一部として一体化する。かなりの量の酵素がポリマー合成の進行を混乱
させることなく多孔性支持体に結合できる。このポリマー合成中に生ずる反応を
以下に示す。
【００２６】
【化１】
【００２７】 以下のリストの酵素（これらの酵素は種々のソース、例えば、セルフリー、組
み換え、その他）及び化学物質はこの発明においての使用に適するものの例であ
る： ＯＰ感応酵素類 アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）； ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）； プソイドコリンエステラーゼ； 測定酵素類 コリンオキシダーゼ； パーオキシダーゼ； ＯＰ区別検出 有機リン酸ハイドロラーゼ（ＯＰＨ）； リン酸トリエステラーゼ； プソイドモナスヂミヌタバクテリアＯＰＨ（パラオキソナーゼ）； ラッカーゼ（laccase）； 他の試薬 ＡＢＴＳ及びそのアナローグ類； ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）； ７−（メトキシフォスフィニオキシ）−１−メトキシキノリウムアイオダイド
（ＭＥＰＱ）； アセチルチオコリンアイオダイド（ＡＴＣ）； Ｓ−ブチリルチオコリンアイオダイド（ＢＴＣ）； ５，５‘−ジチオ−ビス（２−ニトロベンゾイックアシッド）（ＤＴＮＢ）； Ｎ，Ｎ‘−トリメチレンビス（ピリジニウム−４‐アルドキシム）ジブロマイ
ド（ＴＭＢ４）；及び １−（２−ヒドロキシイミノメチル−１−（４−カルボキシアミノピリジニウ
ム）−ジメチルエステルハイドロクロライド（ＨＩ−６）。
み換え、その他）及び化学物質はこの発明においての使用に適するものの例であ
る： ＯＰ感応酵素類 アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）； ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）； プソイドコリンエステラーゼ； 測定酵素類 コリンオキシダーゼ； パーオキシダーゼ； ＯＰ区別検出 有機リン酸ハイドロラーゼ（ＯＰＨ）； リン酸トリエステラーゼ； プソイドモナスヂミヌタバクテリアＯＰＨ（パラオキソナーゼ）； ラッカーゼ（laccase）； 他の試薬 ＡＢＴＳ及びそのアナローグ類； ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）； ７−（メトキシフォスフィニオキシ）−１−メトキシキノリウムアイオダイド
（ＭＥＰＱ）； アセチルチオコリンアイオダイド（ＡＴＣ）； Ｓ−ブチリルチオコリンアイオダイド（ＢＴＣ）； ５，５‘−ジチオ−ビス（２−ニトロベンゾイックアシッド）（ＤＴＮＢ）； Ｎ，Ｎ‘−トリメチレンビス（ピリジニウム−４‐アルドキシム）ジブロマイ
ド（ＴＭＢ４）；及び １−（２−ヒドロキシイミノメチル−１−（４−カルボキシアミノピリジニウ
ム）−ジメチルエステルハイドロクロライド（ＨＩ−６）。
【００２８】 一般に、ＯＰ化合物に対する最も単純なバイオセンサはプラスチック、ガラス
、布，ナイロン、ラバーなどの担体の上にしっかり固定された多孔性支持体の表
面又は内部に固定化されたＣｈＥ類を有する物質からなる。ＯＰ化合物の検出は
色により定性測定され得る。ＯＰ化合物をテストするために、バイオセンサはテ
ストされるべき試料に曝される。ＯＰ化合物による固定化ＣｈＥの阻害が定性的
に溶液形態で観察される阻害と同様であるので、試料への暴露はほんの短時間で
よい。表１参照。
、布，ナイロン、ラバーなどの担体の上にしっかり固定された多孔性支持体の表
面又は内部に固定化されたＣｈＥ類を有する物質からなる。ＯＰ化合物の検出は
色により定性測定され得る。ＯＰ化合物をテストするために、バイオセンサはテ
ストされるべき試料に曝される。ＯＰ化合物による固定化ＣｈＥの阻害が定性的
に溶液形態で観察される阻害と同様であるので、試料への暴露はほんの短時間で
よい。表１参照。
【００２９】
【表１】
【００３０】 この物質は、固定化酵素はしみ出ず、ＯＰ化合物は固定化酵素と不可逆的に結
合しているので、妨害を引き起こす化合物や組成物を除去する為に洗浄され、絞
られ、又は他の方法で綺麗にされても良い。基質がこの多孔性支持体の上又は中
に埋め込まれ、又は試料に曝された後にこの物質にあてがわれても良い。この物
質においてその基質は溶液のままであり、可動性を維持している。適切なバッフ
ァがこの物質にあてがわれても良い。物質の色又は発色の変化はＯＰ化合物の存
在を示す。
合しているので、妨害を引き起こす化合物や組成物を除去する為に洗浄され、絞
られ、又は他の方法で綺麗にされても良い。基質がこの多孔性支持体の上又は中
に埋め込まれ、又は試料に曝された後にこの物質にあてがわれても良い。この物
質においてその基質は溶液のままであり、可動性を維持している。適切なバッフ
ァがこの物質にあてがわれても良い。物質の色又は発色の変化はＯＰ化合物の存
在を示す。
【００３１】 これらのバイオセンサは１回の使用後に処分され又は再使用されてもよい。こ
のバイオセンサを再使用することにより、この物質はそのＯＰ化合物を蓄積し、
それにより、定義された時間を超えてＯＰ化合物の集積量を示す。このバイオセ
ンサは、このＯＰ化合物を取り除く試薬、例えばフルオライド塩を使用して再生
されても良い。このバイオセンサの精度は使用に先立って再度キャリブレートさ
れるならば確かめられる。
のバイオセンサを再使用することにより、この物質はそのＯＰ化合物を蓄積し、
それにより、定義された時間を超えてＯＰ化合物の集積量を示す。このバイオセ
ンサは、このＯＰ化合物を取り除く試薬、例えばフルオライド塩を使用して再生
されても良い。このバイオセンサの精度は使用に先立って再度キャリブレートさ
れるならば確かめられる。
【００３２】 ＯＰ化合物の存在の為のこれらの定性テストは外部のエネルギー源又は他の装
置を必要としない。しかし、このバイオセンサは、Ｈ２Ｏ２により表示されるよ
うなコリンエステラーゼ活性を測定することによりＯＰ化合物の検出の為の炭素
電極を具備する。この実施態様において、ＣｈＥがその表面又は内部に固定化さ
れる物質は炭素電極にしっかり固定される。本発明において、このバイオセンサ
は極端な温度で長期間保存されて良い。また、何度も繰返し使用されても良い。
置を必要としない。しかし、このバイオセンサは、Ｈ２Ｏ２により表示されるよ
うなコリンエステラーゼ活性を測定することによりＯＰ化合物の検出の為の炭素
電極を具備する。この実施態様において、ＣｈＥがその表面又は内部に固定化さ
れる物質は炭素電極にしっかり固定される。本発明において、このバイオセンサ
は極端な温度で長期間保存されて良い。また、何度も繰返し使用されても良い。
【００３３】 バイオセンサの幾つかのれいはテストストリップ、バッジ及びパッチを含む。
【００３４】 以下の実施例は本発明を説明するものであって制限するものではない。実施例１ 可能な酵素妨害の測定 トリルジイソシアネート（ＴＤＩ）から誘導されたポリエーテルプレポリマー
は非常によくこのＣｈＥ類（又は全てのたんぱく質）の表面に存在するリジンや
アルギニンのような遊離アリファチックアミンと反応してこの物質の永久架橋部
になるので、この物質のコンピュータ企画分子モデルは、各酵素の表面で手に入
るアミノ基に的を絞って遂行され、多孔性支持体にこれらの基をカップリングさ
せることが酵素の機能を妨害するか否か測定された。これはその結晶構造が既に
知られている全ての酵素又はホモロジーによりモデル化され得る酵素について行
われ得る。
は非常によくこのＣｈＥ類（又は全てのたんぱく質）の表面に存在するリジンや
アルギニンのような遊離アリファチックアミンと反応してこの物質の永久架橋部
になるので、この物質のコンピュータ企画分子モデルは、各酵素の表面で手に入
るアミノ基に的を絞って遂行され、多孔性支持体にこれらの基をカップリングさ
せることが酵素の機能を妨害するか否か測定された。これはその結晶構造が既に
知られている全ての酵素又はホモロジーによりモデル化され得る酵素について行
われ得る。
【００３５】 図１Ａはアセチルコリンエステラーゼ、ブチルコリンエステラーゼ及びフォス
フォトリエステラーゼのモデル化表面を説明し、このプレポリマーにカップリン
グする為に入手できるＣｈＥ類の表面のリジン及びアルギニン残基を示す。これ
は、Biosym Technologiesによる分子モデル作成ソフトウエアであるInsight II
により生成された。この分子モデルに基きこの多孔性支持体にカップルするＦＢ
Ｓ−ＡＣｈＥの表面に少なくとも１個のリジンと２９個のアルギニンの水に影響
されやすい残基があり、一方、エキン−ＢＣｈＥには２６個のリジンと２６個の
アルギニン残基がモデル化された。大抵のリジン及びアルギニン残基はこのＣｈ
Ｅ類の後ろ側で発見され、ほんの少しが酵素の触媒作用位置の谷間が位置する側
に見出された。ＡＣｈＥ及びＢＣｈＥの両方の縁及び触媒作用位置の谷間の開口
は必然的にリジンとアルギニンを欠いていると思われた。従ってこの多孔性支持
体にこれらの酵素をカップリングすることは基質、ＯＰ類などの阻害剤、又はモ
ノジスクオタナリオキシムを含むオキシム類などの再活性剤の入り込み、触媒生
成物の活性位置へ及びからの放出及び酵素の動的速度に及ぼす影響が最小となる
はずである。同様に、ラッカーゼの表面のモデル（図１Ｂ）はこのプレポリマー
に共有結合できる残基を示している。実施例２ 酵素結合ポリウレタン物質の合成 この物質の典型的合成は、１％（最終濃度）の界面活性剤を含むリン酸バッフ
ァ中で酵素をプレポリマーと混合することからなる。トリルジイソシアネート（
ＴＤＩ）から誘導されたポリエーテルプレポリマー、ハイポールプレポリマーＴ
ＤＩ３０００(Hampshire Chemical, Lxington, MA),及びプルロニックＰ−６５
界面活性剤（BASF Specialty Chemicals, Parsippany, NJ）が用いられた。この
２層システムは混合され、適切な型に注がれ、硬化のため放置された。図２は、
スポンジ状多孔性支持体からなる硬化した物質を示す。図１２は固定化されたＡ
ＣｈＥを含む小さな物質を示す。
フォトリエステラーゼのモデル化表面を説明し、このプレポリマーにカップリン
グする為に入手できるＣｈＥ類の表面のリジン及びアルギニン残基を示す。これ
は、Biosym Technologiesによる分子モデル作成ソフトウエアであるInsight II
により生成された。この分子モデルに基きこの多孔性支持体にカップルするＦＢ
Ｓ−ＡＣｈＥの表面に少なくとも１個のリジンと２９個のアルギニンの水に影響
されやすい残基があり、一方、エキン−ＢＣｈＥには２６個のリジンと２６個の
アルギニン残基がモデル化された。大抵のリジン及びアルギニン残基はこのＣｈ
Ｅ類の後ろ側で発見され、ほんの少しが酵素の触媒作用位置の谷間が位置する側
に見出された。ＡＣｈＥ及びＢＣｈＥの両方の縁及び触媒作用位置の谷間の開口
は必然的にリジンとアルギニンを欠いていると思われた。従ってこの多孔性支持
体にこれらの酵素をカップリングすることは基質、ＯＰ類などの阻害剤、又はモ
ノジスクオタナリオキシムを含むオキシム類などの再活性剤の入り込み、触媒生
成物の活性位置へ及びからの放出及び酵素の動的速度に及ぼす影響が最小となる
はずである。同様に、ラッカーゼの表面のモデル（図１Ｂ）はこのプレポリマー
に共有結合できる残基を示している。実施例２ 酵素結合ポリウレタン物質の合成 この物質の典型的合成は、１％（最終濃度）の界面活性剤を含むリン酸バッフ
ァ中で酵素をプレポリマーと混合することからなる。トリルジイソシアネート（
ＴＤＩ）から誘導されたポリエーテルプレポリマー、ハイポールプレポリマーＴ
ＤＩ３０００(Hampshire Chemical, Lxington, MA),及びプルロニックＰ−６５
界面活性剤（BASF Specialty Chemicals, Parsippany, NJ）が用いられた。この
２層システムは混合され、適切な型に注がれ、硬化のため放置された。図２は、
スポンジ状多孔性支持体からなる硬化した物質を示す。図１２は固定化されたＡ
ＣｈＥを含む小さな物質を示す。
【００３６】 図３は、プレポリマーと酵素の特異反応を説明する図である。合成はＨ２Ｏ分
子がポリウレタンプレポリマー中に存在するイソシアネート基と反応するとき開
始する。イソシアネートは水と反応して不安定なカルボン酸を生成し、これはＣ
Ｏ２を生成しながらアミンに分解する。このＣＯ２はこのポリマーを膨らませ多
孔性にする。同時に、このアミンは直ちにイソシアネート基と反応して尿素結合
を生成する。
子がポリウレタンプレポリマー中に存在するイソシアネート基と反応するとき開
始する。イソシアネートは水と反応して不安定なカルボン酸を生成し、これはＣ
Ｏ２を生成しながらアミンに分解する。このＣＯ２はこのポリマーを膨らませ多
孔性にする。同時に、このアミンは直ちにイソシアネート基と反応して尿素結合
を生成する。
【００３７】 ＣｈＥはその表面にアミンを有し、イソシアネートと反応することができるの
で、合成中にポリウレタン支持体の一部になり一体化できる。この物質にはシク
ロデキストリンで見られるような酵素の深刻な罠又は活性化炭素に見られるよう
な酵素の物理的吸着はない。Pluronic P-65のような界面活性剤を約１％最終濃
度で含ませることはこの物質の最終構造及び吸着ポテンシャルを制御する。
で、合成中にポリウレタン支持体の一部になり一体化できる。この物質にはシク
ロデキストリンで見られるような酵素の深刻な罠又は活性化炭素に見られるよう
な酵素の物理的吸着はない。Pluronic P-65のような界面活性剤を約１％最終濃
度で含ませることはこの物質の最終構造及び吸着ポテンシャルを制御する。
【００３８】 多孔性ポリウレタン支持体からなる物質を製造する為に、Ｐ−６５界面活性剤
バッファを含みｐＨ８．０の５０ｍＭリン酸バッファ約３０ｍＬを６００ｍＬの
プラスチックビーカに入れた。精製ＦＢＳ−ＡＣｈＥ（７５００単位）又は精製
Ｅｑ−ＢＣｈＥ（５０００単位）の３から５ｍＬを加え、次にハイポ３０００プ
レポリマー（トリルジイソシアネート）を加えた。この２層システムは混合され
、１０分間膨らむままにされ、容器から押し出された。この物質はｐＨ８．０の
５０ｍＭリン酸バッファ約５０ｍＬで十分に洗浄され、乾燥され、将来の使用の
為にジッパー付きバッグ中に保存された。実施例３ 合成された物質の特性 約２０−９０％の酵素が遊離のアミノ基又は水酸基により多孔性支持体と共有
結合していた。これはこの物質の第１洗浄液及び第２洗浄液中の酵素の惣菜によ
り測定された。
バッファを含みｐＨ８．０の５０ｍＭリン酸バッファ約３０ｍＬを６００ｍＬの
プラスチックビーカに入れた。精製ＦＢＳ−ＡＣｈＥ（７５００単位）又は精製
Ｅｑ−ＢＣｈＥ（５０００単位）の３から５ｍＬを加え、次にハイポ３０００プ
レポリマー（トリルジイソシアネート）を加えた。この２層システムは混合され
、１０分間膨らむままにされ、容器から押し出された。この物質はｐＨ８．０の
５０ｍＭリン酸バッファ約５０ｍＬで十分に洗浄され、乾燥され、将来の使用の
為にジッパー付きバッグ中に保存された。実施例３ 合成された物質の特性 約２０−９０％の酵素が遊離のアミノ基又は水酸基により多孔性支持体と共有
結合していた。これはこの物質の第１洗浄液及び第２洗浄液中の酵素の惣菜によ
り測定された。
【００３９】 これらの酵素は多くのいちで結合され得るので、架橋したポリマー支持体の一
部となっている。この架橋したポリマー支持体は結合酵素に対して大きな安定性
を与える。大量の酵素が小さなポリウレタン支持体中に取り込まれているので、
架橋ポリマー支持体はＯＰ化合物の検出のための高安定且つ高感度物質になって
いる。
部となっている。この架橋したポリマー支持体は結合酵素に対して大きな安定性
を与える。大量の酵素が小さなポリウレタン支持体中に取り込まれているので、
架橋ポリマー支持体はＯＰ化合物の検出のための高安定且つ高感度物質になって
いる。
【００４０】 Ａ．酵素活性 １から４０ｍｇの重量範囲のＦＢＳ‐ＡＣｈＥを含む物質の５つの試料とＥｑ
−ＢＣｈＥを含む物質の５つの試料がｐＨ８．０の５０ｍＭリン酸バッファ２．
８ｍＬ中に懸濁され、エルマン法で分析された。Ellman,G.L.他（1961）Biochm
Phamacol.7:88-95参照。ＦＢＳ‐ＡＣｈＥの固定化及びＥｑ−ＢＣｈＥの固定化
の両方において、スポンジの重量と酵素活性の間には直線関係が見出された。図
１６ＡおよびＢ参照。スポンジの重量と酵素活性の間には直線関係は、物質全体
に渡って均一なＦＢＳ‐ＡＣｈＥ又はＥｑ−ＢＣｈＥの固定化を示す。
−ＢＣｈＥを含む物質の５つの試料がｐＨ８．０の５０ｍＭリン酸バッファ２．
８ｍＬ中に懸濁され、エルマン法で分析された。Ellman,G.L.他（1961）Biochm
Phamacol.7:88-95参照。ＦＢＳ‐ＡＣｈＥの固定化及びＥｑ−ＢＣｈＥの固定化
の両方において、スポンジの重量と酵素活性の間には直線関係が見出された。図
１６ＡおよびＢ参照。スポンジの重量と酵素活性の間には直線関係は、物質全体
に渡って均一なＦＢＳ‐ＡＣｈＥ又はＥｑ−ＢＣｈＥの固定化を示す。
【００４１】 この物質は５０ｍＭリン酸バッファ、蒸留水，又は基質の加水分解に影響を与
えない１０ｍＭアンモニウムビカーボネートで洗浄された。従って、プレポリマ
ー、界面活性剤及び酵素をそのままで２２°Ｃで混合することで溶液ＣｈＥの初
期活性の約５０％を保持する有用な効果のある物質が得られた。
えない１０ｍＭアンモニウムビカーボネートで洗浄された。従って、プレポリマ
ー、界面活性剤及び酵素をそのままで２２°Ｃで混合することで溶液ＣｈＥの初
期活性の約５０％を保持する有用な効果のある物質が得られた。
【００４２】 Ｂ．蛋白質積込み許容量 この物質はＡＣｈＥ又はＢＣｈＥなどのＣｈＥ類のためのかなり高い積込み許
容量を有する。この物質に固定化されたＢＣｈＥの最終活性は合成中の酵素の量
をより高くすることにより増大されうる。図４参照。非特異性蛋白質（うし血清
アルブミン、ＢＳＡ）に精製ＡＣｈＥを一定量加えたが、ＣｈＥ活性は減少しな
かった。図５参照。このように、より高い効果のある物質を蛋白質、酵素類、他
のＣｈＥ類を追加して合成することができる。加えて、多種の酵素又は複数の酵
素の組合せにより、多種類のＯＰ化合物の組合せを検出するのに効果のある物質
を速やかに合成できる。
容量を有する。この物質に固定化されたＢＣｈＥの最終活性は合成中の酵素の量
をより高くすることにより増大されうる。図４参照。非特異性蛋白質（うし血清
アルブミン、ＢＳＡ）に精製ＡＣｈＥを一定量加えたが、ＣｈＥ活性は減少しな
かった。図５参照。このように、より高い効果のある物質を蛋白質、酵素類、他
のＣｈＥ類を追加して合成することができる。加えて、多種の酵素又は複数の酵
素の組合せにより、多種類のＯＰ化合物の組合せを検出するのに効果のある物質
を速やかに合成できる。
【００４３】 Ｃ．酵素の安定性 図６で示されるように固定化ＣｈＥ及びＯＰハイドロラーゼは４°Ｃで３年よ
り長い間、２５°Ｃ及び４５°Ｃでそれぞれ１２ヶ月より長い間、酵素安定性を
維持した。この物質が液体窒素で凍結されたなら、殆どの初期活性を保持する。
ＴＤＩは固定化ＣｈＥに顕著な安定性を与える。即ち、固定化ＡＣｈＥｎｏ初期
活性の約５０％及び固定化ＢＣｈＥの活性の２０％が、溶液酵素では活性が示さ
れない８０°Ｃで１６時間後にも維持された。このＣｈＥ物質は２２°Ｃで徹底
的に真空乾燥されることができ、その後、再水和されても酵素活性の損失がない
。ＡＣｈＥ又はＢＣｈＥ物質が徹底的に洗浄され、活性の分析が行われたとき、
洗浄、分析サイクルは３日にわたって２０回より多く繰りかえらせたが、活性の
減少は生じなかった。図７参照。これはこの物質が繰返し使用され得ることを示
している。
り長い間、２５°Ｃ及び４５°Ｃでそれぞれ１２ヶ月より長い間、酵素安定性を
維持した。この物質が液体窒素で凍結されたなら、殆どの初期活性を保持する。
ＴＤＩは固定化ＣｈＥに顕著な安定性を与える。即ち、固定化ＡＣｈＥｎｏ初期
活性の約５０％及び固定化ＢＣｈＥの活性の２０％が、溶液酵素では活性が示さ
れない８０°Ｃで１６時間後にも維持された。このＣｈＥ物質は２２°Ｃで徹底
的に真空乾燥されることができ、その後、再水和されても酵素活性の損失がない
。ＡＣｈＥ又はＢＣｈＥ物質が徹底的に洗浄され、活性の分析が行われたとき、
洗浄、分析サイクルは３日にわたって２０回より多く繰りかえらせたが、活性の
減少は生じなかった。図７参照。これはこの物質が繰返し使用され得ることを示
している。
【００４４】 これらの結果はＣｈＥ類が多孔性支持体中に共有架橋結合し手いること及びＣ
ｈＥ類が皮膚、水又は装置にしみ出てこないことを示している。従って、固定化
された酵素がＯＰ化合物と結合すると、そのＯＰ化合物をその表面から除去する
には脱不純物処理を必要とする。
ｈＥ類が皮膚、水又は装置にしみ出てこないことを示している。従って、固定化
された酵素がＯＰ化合物と結合すると、そのＯＰ化合物をその表面から除去する
には脱不純物処理を必要とする。
【００４５】 Ｄ．運動常数 固定化又は溶液ＣｈＥ類はいずれも活性位置の数が有機リン化合物ＭＥＰＱ，
７−（メチルエトキシフォスフィニルオキシ）−１−メチルキノリニウムアイオ
ダイドを用いた滴定により測定された。このＡＣｈＥ物質及びＢＣｈＥ物質とそ
れぞれの溶液酵素の２５°ＣにおけるＭＥＰＱによる阻害の２分子速度常数は溶
液酵素と共有結合した酵素の間には大きな差が無いことを示した。表１参照。こ
れらの結果はＣｈＥ類の固定化形態と溶液形態は同じようにＯＰ化合物と相互作
用することを示している。従って、通常入手し得る業界公知の酵素活性分析法が
用いられうる。
７−（メチルエトキシフォスフィニルオキシ）−１−メチルキノリニウムアイオ
ダイドを用いた滴定により測定された。このＡＣｈＥ物質及びＢＣｈＥ物質とそ
れぞれの溶液酵素の２５°ＣにおけるＭＥＰＱによる阻害の２分子速度常数は溶
液酵素と共有結合した酵素の間には大きな差が無いことを示した。表１参照。こ
れらの結果はＣｈＥ類の固定化形態と溶液形態は同じようにＯＰ化合物と相互作
用することを示している。従って、通常入手し得る業界公知の酵素活性分析法が
用いられうる。
【００４６】 改良エルマン分析を用いた初期速度法は固定化及び溶液ＡＣｈＥ及びＢＣｈＥ
のパラメータＫｍ、ｋｃａｔ，及びｋｃａｔ／Ｋｍを決定する為に用いられた。
結合又は溶液ＣｈＥ類の活性位置の数はＭＥＰＱでの滴定により測定された。表
１２及びＡＣｈＥのための図８に示すように、固定化ＣｈＥ類のＫｍ値は対応す
る溶液酵素より約１０倍であった。ｋｃａｔ値は劇的に影響されより低くかった
。基質の親和性とｋcatの組み合わされた効果はアセチル化（ｋｃａｔ／Ｋｍ）
における約２０から５０倍の減少をもたらした。興味深いことに、溶液ＢＣｈＥ
は基質阻害を欠いたが、固定化ＢＣｈＥは基質阻害を生じた。これらの結果はＣ
ｈＥ類の表面の残基の多孔性支持体への共有結合が結合酵素の活性位置領域の何
らかの性質を直接的又は間接的に変えたことを示唆する。
のパラメータＫｍ、ｋｃａｔ，及びｋｃａｔ／Ｋｍを決定する為に用いられた。
結合又は溶液ＣｈＥ類の活性位置の数はＭＥＰＱでの滴定により測定された。表
１２及びＡＣｈＥのための図８に示すように、固定化ＣｈＥ類のＫｍ値は対応す
る溶液酵素より約１０倍であった。ｋｃａｔ値は劇的に影響されより低くかった
。基質の親和性とｋcatの組み合わされた効果はアセチル化（ｋｃａｔ／Ｋｍ）
における約２０から５０倍の減少をもたらした。興味深いことに、溶液ＢＣｈＥ
は基質阻害を欠いたが、固定化ＢＣｈＥは基質阻害を生じた。これらの結果はＣ
ｈＥ類の表面の残基の多孔性支持体への共有結合が結合酵素の活性位置領域の何
らかの性質を直接的又は間接的に変えたことを示唆する。
【００４７】
【表２】
【００４８】固定化及び溶液コリンオキシダーゼのＫm決定： コリンオキシダーゼの溶液形態及び固定化形態（スポンジ）のＫmは図Ｂに示
されるように基質カーブに殆どシフトがないことから同じであると観察された。
この基質カーブはこの酵素が固定化に非常に適しているばかりでなく、コリンエ
ステラーゼとの共固定化に非常に適していることご示している。溶液及びスポン
ジの観察されたＫmはそれぞれ２．５ｍＭ及び６．７ｍＭである。図１９Ｂ参照
。
されるように基質カーブに殆どシフトがないことから同じであると観察された。
この基質カーブはこの酵素が固定化に非常に適しているばかりでなく、コリンエ
ステラーゼとの共固定化に非常に適していることご示している。溶液及びスポン
ジの観察されたＫmはそれぞれ２．５ｍＭ及び６．７ｍＭである。図１９Ｂ参照
。
【００４９】 Ｅ．溶液及び固定化酵素のｐＨ 固定化および溶液ＡＣｈＥのｐＨ曲線は同一であり、これらの酵素は広いｐＨ
範囲７−８．５で活性を示す。溶液コリンエステラーゼ、コリンオキシダーゼ，
及びＯＰハイドロラーゼのｐＨ曲線がこの同じｐＨ範囲で至適活性を有するので
、多孔性支持体の表面又は内部に固定化されたこれら多種類の酵素の複数個を用
いてこの物質を至適化及び多様化することができる。
範囲７−８．５で活性を示す。溶液コリンエステラーゼ、コリンオキシダーゼ，
及びＯＰハイドロラーゼのｐＨ曲線がこの同じｐＨ範囲で至適活性を有するので
、多孔性支持体の表面又は内部に固定化されたこれら多種類の酵素の複数個を用
いてこの物質を至適化及び多様化することができる。
【００５０】 更に支持する証拠としての溶液及び固定化酵素のｐＨ 図１９Ａ：溶液及び固定化コリンオキシダーゼのｐＨ曲線。図９の溶液及び固
定化アセチルコリンエステラーゼのｐＨ曲線と比較してください。 Ｆ．溶液コリンエステラーゼとセンサ（固定化）コリンエステラーゼの温度依存 活性 固定化ＡＣｈＥ及びＢＣｈＥを含むセンサは、それらの溶液相補体と比較して
殆ど同一の温度依存活性を示した。しかし、図６に示すように、固定化酵素は長
時間、高温での変性条件に更に耐性があるが、溶液酵素は耐性がない。固定化酵
素は液体窒素中での凍結にも耐性がある。これらのグラフは低温において、この
センサが反応速度を増す為に体温又は外部の熱源により暖められうることを示す
。実施例４ 多種類の酵素の複数個の固定化 ＣｈＥ類がバクテリアルＯＰハイドラーゼ（ＯＰＨＢ）及び／又は兎血清ハイ
ドロラーゼ（ＯＰＨＲ）と一緒に共固定化された。独自に固定化された各酵素の
酵素活性と比較して、ＯＰＨと共固定化されたＡＣｈＥ又はＢＣｈＥの酵素活性
に低下は無かった。図１０参照。更に、共固定化されたＯＰＨの酵素活性におい
ても低下はなかった。従って、複数個の酵素であって、それらが種々のＯＰ化合
物と異なって反応する酵素を選択して広い範囲のＯＰ化合物に対して効果的な不
純物除去物質を生成するために１つの物質中に利用することもできる。 最後に、相互検出図解（図１３Ａ）に必要な多種類酵素の例も又図１０に示され
る。コリンオキシダーゼのＡＣｈＥ又はＢＣｈＥとの共固定化は独自に固定化さ
れた酵素と比較して固定化プロセス又は酵素の活性を変更しない。実施例５ 高速混合合成 接着剤工業（ＣＰＡ，Greenville, RI02828から改良された合成方法を用いる
ことにより、酵素活性を低下させるせん断力が減少される。図１１参照。個の方
法において、酵素は幾つかの固定化技術において要求されるような有機バッファ
中にはない。これは空気誘導せん断の減少をもたらし、酵素活性が維持される。
この方法は操作が簡単で，素早く且つ再現性もある。この低せん断混合装置は結
果として生ずる固定化ＡＣｈＥ及び／又はＢＣｈＥの酵素活性を、混合ドリルな
どの高せん断装置で調製された同一混合物と比較して２倍以上にする。表３参照
。
定化アセチルコリンエステラーゼのｐＨ曲線と比較してください。 Ｆ．溶液コリンエステラーゼとセンサ（固定化）コリンエステラーゼの温度依存 活性 固定化ＡＣｈＥ及びＢＣｈＥを含むセンサは、それらの溶液相補体と比較して
殆ど同一の温度依存活性を示した。しかし、図６に示すように、固定化酵素は長
時間、高温での変性条件に更に耐性があるが、溶液酵素は耐性がない。固定化酵
素は液体窒素中での凍結にも耐性がある。これらのグラフは低温において、この
センサが反応速度を増す為に体温又は外部の熱源により暖められうることを示す
。実施例４ 多種類の酵素の複数個の固定化 ＣｈＥ類がバクテリアルＯＰハイドラーゼ（ＯＰＨＢ）及び／又は兎血清ハイ
ドロラーゼ（ＯＰＨＲ）と一緒に共固定化された。独自に固定化された各酵素の
酵素活性と比較して、ＯＰＨと共固定化されたＡＣｈＥ又はＢＣｈＥの酵素活性
に低下は無かった。図１０参照。更に、共固定化されたＯＰＨの酵素活性におい
ても低下はなかった。従って、複数個の酵素であって、それらが種々のＯＰ化合
物と異なって反応する酵素を選択して広い範囲のＯＰ化合物に対して効果的な不
純物除去物質を生成するために１つの物質中に利用することもできる。 最後に、相互検出図解（図１３Ａ）に必要な多種類酵素の例も又図１０に示され
る。コリンオキシダーゼのＡＣｈＥ又はＢＣｈＥとの共固定化は独自に固定化さ
れた酵素と比較して固定化プロセス又は酵素の活性を変更しない。実施例５ 高速混合合成 接着剤工業（ＣＰＡ，Greenville, RI02828から改良された合成方法を用いる
ことにより、酵素活性を低下させるせん断力が減少される。図１１参照。個の方
法において、酵素は幾つかの固定化技術において要求されるような有機バッファ
中にはない。これは空気誘導せん断の減少をもたらし、酵素活性が維持される。
この方法は操作が簡単で，素早く且つ再現性もある。この低せん断混合装置は結
果として生ずる固定化ＡＣｈＥ及び／又はＢＣｈＥの酵素活性を、混合ドリルな
どの高せん断装置で調製された同一混合物と比較して２倍以上にする。表３参照
。
【００５１】
【表３】
【００５２】実施例６ 酵素活性の測定 図１３は本発明のバイオセンサと用いられる色々な検出方法を説明している。
ＯＰ化合物の定性検出は、目に見える発色及び／又は化学蛍光発色を用いて視覚
的に遂行される。定量検出は手に持てる装置を用いて行うことができ、蛍光、化
学蛍光又は発色の値を測定する。加えて、使い捨て炭素マイクロ電極からなる電
子バイオセンサはＨ２Ｏ２生成からの電気化学信号を検出するために用いること
ができる。
ＯＰ化合物の定性検出は、目に見える発色及び／又は化学蛍光発色を用いて視覚
的に遂行される。定量検出は手に持てる装置を用いて行うことができ、蛍光、化
学蛍光又は発色の値を測定する。加えて、使い捨て炭素マイクロ電極からなる電
子バイオセンサはＨ２Ｏ２生成からの電気化学信号を検出するために用いること
ができる。
【００５３】 この物質のＣｈＥ活性は改良エルマン法を用いて、ＡＣｈＥの為には基質とし
てアセチルチオコリンを含有する、ＢＣｈＥの為には基質としてブチリルチオコ
リンを含有する水性リン酸バッファ環境中で評価された。黄色を生成するこれら
の反応は分光光度分析で４１２nmで監視された。エルマン分析の最終反応性生物
はＣｈＥを欠く物質に吸着しなかった。生成された生成物は時間と共に線状であ
った。それにより反応性生物の水性環境中への放出は速度制限が無いことを示し
ている。ＯＰハイドロラーゼ活性の測定のために、用いられた基質はｐ−ニトロ
ヘニルフォスフェートであり、反応は５００nmで監視された。
てアセチルチオコリンを含有する、ＢＣｈＥの為には基質としてブチリルチオコ
リンを含有する水性リン酸バッファ環境中で評価された。黄色を生成するこれら
の反応は分光光度分析で４１２nmで監視された。エルマン分析の最終反応性生物
はＣｈＥを欠く物質に吸着しなかった。生成された生成物は時間と共に線状であ
った。それにより反応性生物の水性環境中への放出は速度制限が無いことを示し
ている。ＯＰハイドロラーゼ活性の測定のために、用いられた基質はｐ−ニトロ
ヘニルフォスフェートであり、反応は５００nmで監視された。
【００５４】 このエルマン分析とＯＰハイドロラーゼ分析は、その酵素が阻害されないなら
、黄色色素を生成する。酵素が阻害するなら無色である。又、コリンエステラー
ゼのためには、２，６−ジクロロインドフェニルアセテート（赤色）、ＣｈＥに
より加水分解で青（２，６‐ジクロロインドフェニレート）に変わる。再度、青
色の存在しないことはＯＰによるＣｈＥ阻害を示す。
、黄色色素を生成する。酵素が阻害するなら無色である。又、コリンエステラー
ゼのためには、２，６−ジクロロインドフェニルアセテート（赤色）、ＣｈＥに
より加水分解で青（２，６‐ジクロロインドフェニレート）に変わる。再度、青
色の存在しないことはＯＰによるＣｈＥ阻害を示す。
【００５５】 ＣｈＥ阻害の蛍光検出の為に、基質は１−メチル−７−アセトキシキノリニウ
ムアイオダイド、又は蛍光マレイミド、n-（４−（７−ジメチルアミノ−コウマ
リン−３−イル）フェニル）−マレイミドでよい。１−メチル−７−アセトキシ
キノリニウムアイオダイドは、加水分解で高い蛍光物質である１−メチル−７−
ハイドロキシ生成する。蛍光マレイミド、n-（４−（７−ジメチルアミノ−コウ
マリン−３−イル）フェニル）−マレイミドはＣｈＥ類によるでアセチル又はブ
チリルチオコリンの加水分解で形成されるチオールと縮合する。即ち、３９０nm
/ex ４７３nm発光。
ムアイオダイド、又は蛍光マレイミド、n-（４−（７−ジメチルアミノ−コウマ
リン−３−イル）フェニル）−マレイミドでよい。１−メチル−７−アセトキシ
キノリニウムアイオダイドは、加水分解で高い蛍光物質である１−メチル−７−
ハイドロキシ生成する。蛍光マレイミド、n-（４−（７−ジメチルアミノ−コウ
マリン−３−イル）フェニル）−マレイミドはＣｈＥ類によるでアセチル又はブ
チリルチオコリンの加水分解で形成されるチオールと縮合する。即ち、３９０nm
/ex ４７３nm発光。
【００５６】 化学発光検出は、ＣｈＥと基質（ＡＣｈ又はベンゾイルクロライン）を追加し
て、コリンオキシダーゼとパーオキシダーゼがルミノールの含む混合物に追加さ
れる。この化学発色方法に於いて、光源は必要でない。従って、より小型のより
エネルギー効率の高い検出器にすることができる。更に、化学発光は暗さに慣れ
た目での検出をできるようにする。Amplex Red(Molecular Probes,Inc.)とＨ２
Ｏ２の反応生成物であるこのインジケータレゾルフィンは、感度を増大できる蛍
光 と可視赤色色素の両方であるという利点を有する。（図１３参照）。
て、コリンオキシダーゼとパーオキシダーゼがルミノールの含む混合物に追加さ
れる。この化学発色方法に於いて、光源は必要でない。従って、より小型のより
エネルギー効率の高い検出器にすることができる。更に、化学発光は暗さに慣れ
た目での検出をできるようにする。Amplex Red(Molecular Probes,Inc.)とＨ２
Ｏ２の反応生成物であるこのインジケータレゾルフィンは、感度を増大できる蛍
光 と可視赤色色素の両方であるという利点を有する。（図１３参照）。
【００５７】 代表的エルマン比色分析のために、標準装置によるＯＰ化合物の検出の下限は
凡そＯＰの３５フェムトグラムである。この限界はＣｈＥが固定化された物質の
１cm2で得ることができる。この量はこの物質の合成中に大きくすることも小さ
くすることもできる。このように、この物質に共有結合するＯＰ神経剤の最大累
積量は約１００pgである。
凡そＯＰの３５フェムトグラムである。この限界はＣｈＥが固定化された物質の
１cm2で得ることができる。この量はこの物質の合成中に大きくすることも小さ
くすることもできる。このように、この物質に共有結合するＯＰ神経剤の最大累
積量は約１００pgである。
【００５８】 マイクロ電極はＣｈＥ活性を検出するのに用いることができる。このように、
前記共有結合設計は、例えば、ＣｈＥ類、コリンオキシダーゼ、及びパーオキシ
ダーゼの多酵素で用いられ得る。この混合物は炭素電極の周りにスポットされ、
硬化される。図１４参照。この酵素−炭素電極は酵素の損失なしに水のような流
れる液体を連続的に分析するために用いることができる。
前記共有結合設計は、例えば、ＣｈＥ類、コリンオキシダーゼ、及びパーオキシ
ダーゼの多酵素で用いられ得る。この混合物は炭素電極の周りにスポットされ、
硬化される。図１４参照。この酵素−炭素電極は酵素の損失なしに水のような流
れる液体を連続的に分析するために用いることができる。
【００５９】 光学分析及びＵＶ−可視分光光度計、蛍光計、及び電気化学検出器などの通常
の研究室の装置は定量的バイオセンサに発展させるのために用いることができる
。
の研究室の装置は定量的バイオセンサに発展させるのために用いることができる
。
【００６０】 同様に、上記基質及びインジケータは小さなパケット、リポゾームなどのに入
れられいてもよく、多孔性支持体に詰め込まれ、取込まれていても良い。その物
質が圧搾され、押さ付けられ、他の方法で操作されるとき、基質とインジケータ
は放出され、結果として生ずる色の変化でＯＰ化合物の存在を示す。
れられいてもよく、多孔性支持体に詰め込まれ、取込まれていても良い。その物
質が圧搾され、押さ付けられ、他の方法で操作されるとき、基質とインジケータ
は放出され、結果として生ずる色の変化でＯＰ化合物の存在を示す。
【００６１】 酵素活性の測定 固定化コリンオキシダーゼと固定化ＡＣｈＥを含むスポンジ１０mgが基質（ア
セチルコリン）、インジケータ（Molecular Probes,Inc.のAmplex Red）及び西
洋わさびパーオキシダーゼを含むバッファ２．５mLの入ったキュベット中でイン
キュベートされた。１つのスポンジは２５°Ｃで５分間ＭＥＰＱに曝され、水で
すすがれ、次いで同じバッファの第２キュベット中に入れられた。別のキュベッ
トは上記と同じバッファだけが入れられ、バイオセンサスポンジは入れられなか
った。
セチルコリン）、インジケータ（Molecular Probes,Inc.のAmplex Red）及び西
洋わさびパーオキシダーゼを含むバッファ２．５mLの入ったキュベット中でイン
キュベートされた。１つのスポンジは２５°Ｃで５分間ＭＥＰＱに曝され、水で
すすがれ、次いで同じバッファの第２キュベット中に入れられた。別のキュベッ
トは上記と同じバッファだけが入れられ、バイオセンサスポンジは入れられなか
った。
【００６２】 ２５°Ｃで５分間インキュベート後、試料が５６０nmにおいて視覚的に分光光
度計で観察された。蛍光分析では560nm励起、５８０nm発光である。白紙に対す
る可視鑑定で、左の試料（ラベルＡ）はセンサがアクティブで基質と反応すると
き、強い色（赤）を示す。中央の試料（ラベルＢ）はＯＰ ＭＥＰＱに曝された
後のセンサの状態を示す。これは毒されもはや発色しない。実に、右の試料、ラ
ベルＣではバッファのみでセンサを含まないものは、識別できない。
度計で観察された。蛍光分析では560nm励起、５８０nm発光である。白紙に対す
る可視鑑定で、左の試料（ラベルＡ）はセンサがアクティブで基質と反応すると
き、強い色（赤）を示す。中央の試料（ラベルＢ）はＯＰ ＭＥＰＱに曝された
後のセンサの状態を示す。これは毒されもはや発色しない。実に、右の試料、ラ
ベルＣではバッファのみでセンサを含まないものは、識別できない。
【００６３】 同じ試料は蛍光計で監視され、又は手で持てる分光光度計で可視範囲で監視さ
れ得る。蛍光分析の利点は可視スペクトルでの分析にわたって感度が非常に強化
されることである。実験室の分光光度計を用ると、蛍光測定されたときキュべッ
ト中で信号及び感度が４０００倍強化された。
れ得る。蛍光分析の利点は可視スペクトルでの分析にわたって感度が非常に強化
されることである。実験室の分光光度計を用ると、蛍光測定されたときキュべッ
ト中で信号及び感度が４０００倍強化された。
【００６４】 ＡＣｈＥとコリンオキシダーゼのセンサは、エネルギー源のない完全な暗闇中
で有機リン酸塩の不存在及び存在の基で表示するために用いることができる。Ａ
ＣｈＥ／コリンオキシダーゼ固定化センサは基質（アセチルコリン）、ルミノー
ル（５−アミノ−２，３‐ジヒドロ−１，４−フターラジンジオン）、１０ug/m
Lの西洋わさびパーオキシダーゼを含むバッファ２．５mL中でインキュベートさ
れた。蛍光は蛍光計で定量された。励起もなく（光源がない）、放出も０のオー
ダーでなっかった（毒されていないセンサの反応により生成する光を測定するた
めの広い開口）。ＡＣｈＥは基質を加水分解し、コリンオキシダーゼは生成物（
図１３の図解参照）に作用する。その結果は、化学蛍光である。化学蛍光は、暗
さに慣れた人の目のしきい値以上で４分間以上観察された（水平な点線で示され
ている）。実施例７ ＤＦＰでの固定化ＦＢＳ―ＡＣｈＥの阻害 固定化ＦＢＳ―ＡＣｈＥの試料１００mgが色々な濃度のＤＦＰで、ｐＨ８．０
の５０ｍＭリン酸バッファ２ｍＬ中で２５°Ｃで１時間インキュベートされた。
試料中の残留ＤＦＰが、新しい１Ｕ/mL溶液の０．５mLへ反応混合物の０．５mL
づつを加えて１時間インキュベートし、エルマン分析で用いる１０μｌを分析す
ることにより、測定された。この結果は図１７に示されている。
で有機リン酸塩の不存在及び存在の基で表示するために用いることができる。Ａ
ＣｈＥ／コリンオキシダーゼ固定化センサは基質（アセチルコリン）、ルミノー
ル（５−アミノ−２，３‐ジヒドロ−１，４−フターラジンジオン）、１０ug/m
Lの西洋わさびパーオキシダーゼを含むバッファ２．５mL中でインキュベートさ
れた。蛍光は蛍光計で定量された。励起もなく（光源がない）、放出も０のオー
ダーでなっかった（毒されていないセンサの反応により生成する光を測定するた
めの広い開口）。ＡＣｈＥは基質を加水分解し、コリンオキシダーゼは生成物（
図１３の図解参照）に作用する。その結果は、化学蛍光である。化学蛍光は、暗
さに慣れた人の目のしきい値以上で４分間以上観察された（水平な点線で示され
ている）。実施例７ ＤＦＰでの固定化ＦＢＳ―ＡＣｈＥの阻害 固定化ＦＢＳ―ＡＣｈＥの試料１００mgが色々な濃度のＤＦＰで、ｐＨ８．０
の５０ｍＭリン酸バッファ２ｍＬ中で２５°Ｃで１時間インキュベートされた。
試料中の残留ＤＦＰが、新しい１Ｕ/mL溶液の０．５mLへ反応混合物の０．５mL
づつを加えて１時間インキュベートし、エルマン分析で用いる１０μｌを分析す
ることにより、測定された。この結果は図１７に示されている。
【００６５】 ＤＦＰでの固定化ＦＢＳ―ＡＣｈＥの阻害はバッファ中に懸濁された発泡体へ
加えられたＤＦＰ理論量と比例した。実施例８ ＤＦＰでの固定化Ｅｑ―ＢＣｈＥの阻害 固定化Ｅｑ―ＢＣｈＥの試料５０mgが色々な濃度のＤＦＰで、ｐＨ８．０の５
０ｍＭリン酸バッファ２ｍＬ中で２５°Ｃで１８時間インキュベートされた。試
料中の残留ＤＦＰが、新しい１Ｕ/mLＥｑ―ＢＣｈＥ溶液の０．５mLへ反応混合
物の０．５mLづつを加えて１時間インキュベートし、エルマン分析で用いる１０
μｌを分析することにより、測定された。この結果は図１８に示されている。実施例９ 多固定化酵素からなる区別バイオセンサ コリンエステラーゼ、ＯＰハイドロラーゼ、及びＯＰ以外を加水分解する酵素
類からなる物質は多孔性支持体の表面又は内部に共有結合で固定化されると，区
別バイオセンサを生成することができる。区別バイオセンサは、多孔性支持体の
表面又は内部に固定された種々のＣｈＥ類、ＯＰハイドロラーゼ類、及び／又は
ラッカーゼ類から作ることができ、各ＣｈＥ類、ＯＰハイドロラーゼ類、及び／
又はラッカーゼ類は、プラスチック片のような担体上に独自に且つ別々に固定さ
れている。例えば、ラビットからの血清ＯＰハイドロラーゼは、サリンに高い活
性を示すが、ソーマンには示さない。従って、固定化ＯＰＨｒを有する物質とラ
ッビットの血清以外のソースからのＯＰハイドロラーゼを有する物質を１枚のプ
ラスチック片に固定するとサリンとソマンを識別するバイオセンサとして作用で
きる。
加えられたＤＦＰ理論量と比例した。実施例８ ＤＦＰでの固定化Ｅｑ―ＢＣｈＥの阻害 固定化Ｅｑ―ＢＣｈＥの試料５０mgが色々な濃度のＤＦＰで、ｐＨ８．０の５
０ｍＭリン酸バッファ２ｍＬ中で２５°Ｃで１８時間インキュベートされた。試
料中の残留ＤＦＰが、新しい１Ｕ/mLＥｑ―ＢＣｈＥ溶液の０．５mLへ反応混合
物の０．５mLづつを加えて１時間インキュベートし、エルマン分析で用いる１０
μｌを分析することにより、測定された。この結果は図１８に示されている。実施例９ 多固定化酵素からなる区別バイオセンサ コリンエステラーゼ、ＯＰハイドロラーゼ、及びＯＰ以外を加水分解する酵素
類からなる物質は多孔性支持体の表面又は内部に共有結合で固定化されると，区
別バイオセンサを生成することができる。区別バイオセンサは、多孔性支持体の
表面又は内部に固定された種々のＣｈＥ類、ＯＰハイドロラーゼ類、及び／又は
ラッカーゼ類から作ることができ、各ＣｈＥ類、ＯＰハイドロラーゼ類、及び／
又はラッカーゼ類は、プラスチック片のような担体上に独自に且つ別々に固定さ
れている。例えば、ラビットからの血清ＯＰハイドロラーゼは、サリンに高い活
性を示すが、ソーマンには示さない。従って、固定化ＯＰＨｒを有する物質とラ
ッビットの血清以外のソースからのＯＰハイドロラーゼを有する物質を１枚のプ
ラスチック片に固定するとサリンとソマンを識別するバイオセンサとして作用で
きる。
【００６６】 更に、幾つかの種類の好ハロゲンバクテリア及びアルテロモナスバクテリアか
らの酵素は、有機リン化合物に対する酵素活性に大きな違いを有しているので、
これらの酵素が多孔性支持体の表面又は内部に共有結合で固定化されている複数
の物質は区別作用バイオセンサとして用いるために１つの担体に別々に固定する
ことができる。例えば、A.undiからのＯＰＨはサリンやタバンに対してよりもソ
マンに対して高い酵素活性を示すので、A.undiからのＯＰＨと他のソースからの
ＯＰＨとで、サリンやタバンを越えてソマンを区別して検出するバイオセンサと
して作用できる。更に，種々のＯＰハイドロラーゼ、ＣｈＥ類、ラッカーゼ、ラ
ッカーゼのメディエイタ、及びそれらの変異物は、複数のＯＰ化合物に対して異
なる特性及び／又は活性を示すようにスクリーニングしたり、発展させたりする
ことができる。
らの酵素は、有機リン化合物に対する酵素活性に大きな違いを有しているので、
これらの酵素が多孔性支持体の表面又は内部に共有結合で固定化されている複数
の物質は区別作用バイオセンサとして用いるために１つの担体に別々に固定する
ことができる。例えば、A.undiからのＯＰＨはサリンやタバンに対してよりもソ
マンに対して高い酵素活性を示すので、A.undiからのＯＰＨと他のソースからの
ＯＰＨとで、サリンやタバンを越えてソマンを区別して検出するバイオセンサと
して作用できる。更に，種々のＯＰハイドロラーゼ、ＣｈＥ類、ラッカーゼ、ラ
ッカーゼのメディエイタ、及びそれらの変異物は、複数のＯＰ化合物に対して異
なる特性及び／又は活性を示すようにスクリーニングしたり、発展させたりする
ことができる。
【００６７】 表４は幾つかの酵素の概略を示し、与えられたＯＰ化合物の速やかな定量およ
び定性同定に用いられる。
び定性同定に用いられる。
【００６８】 担体は各ＯＰに対して異なる特性を示す異なる固定化酵素のスポットを含む幾
つかの区分に分けられ得る。例えば、１つのＯＰ薬がテストされる試料に存在す
るなら、ＡＣｈＥ及び／又はＢＣｈＥ阻害があるだろう。即ちＡＣｈＥ及び／又
はＢＣｈＥ中で色の変化がない。もしＯＰ薬がサリンなら、ラビットＯＰハイド
ロラーゼはサリンを加水分解して、その結果ラビットＯＰハイドロラーゼの区分
で色が変化するはずである。更に，A.undinaを含む区分は、サリンは基質のほん
の一部であるので与えられた基質を控えめに阻害するだけなので、控えめな色の
変化があるだろう。ＶＸが存在するなら、ラッカーゼを含む区分の色はラッカー
ゼがＶＸを加水分解するので変化するだろう。
つかの区分に分けられ得る。例えば、１つのＯＰ薬がテストされる試料に存在す
るなら、ＡＣｈＥ及び／又はＢＣｈＥ阻害があるだろう。即ちＡＣｈＥ及び／又
はＢＣｈＥ中で色の変化がない。もしＯＰ薬がサリンなら、ラビットＯＰハイド
ロラーゼはサリンを加水分解して、その結果ラビットＯＰハイドロラーゼの区分
で色が変化するはずである。更に，A.undinaを含む区分は、サリンは基質のほん
の一部であるので与えられた基質を控えめに阻害するだけなので、控えめな色の
変化があるだろう。ＶＸが存在するなら、ラッカーゼを含む区分の色はラッカー
ゼがＶＸを加水分解するので変化するだろう。
【００６９】
【表４】
【００７０】 このように、表５に示すような固定化酵素からなる物質は独自に担体に固定さ
れうる。これらの物質を具備する担体がテストされる試料に曝されて後、特定の
ＯＰ薬の存在は適切な基質の存在で与えられた物質の色の変化を観察することに
より測定され得る。
れうる。これらの物質を具備する担体がテストされる試料に曝されて後、特定の
ＯＰ薬の存在は適切な基質の存在で与えられた物質の色の変化を観察することに
より測定され得る。
【００７１】
【表５】
【００７２】実施例１０ ＯＰ化合物の遠隔定量及び定性分析 ＯＰ被阻害酵素は、直ぐには元に戻らず控訴は固定化されているので、この物質
は、テストの場所から、与えられたＯＰ化合物の存在及び量を分析する別の場所
へ移送されてもよい。更に、この物質は所定の時間ＯＰ化合物を監視する場所に
おいて置かれても良い。このＯＰ被阻害酵素は直ぐには元に戻らないので、阻害
化合物及び組成物はテストの場所，又は、異なる場所でこの物質から除去されて
もよい。更に，この分析は、サンプリング後、直ちに又は間もなく行われる必要
はない。
は、テストの場所から、与えられたＯＰ化合物の存在及び量を分析する別の場所
へ移送されてもよい。更に、この物質は所定の時間ＯＰ化合物を監視する場所に
おいて置かれても良い。このＯＰ被阻害酵素は直ぐには元に戻らないので、阻害
化合物及び組成物はテストの場所，又は、異なる場所でこの物質から除去されて
もよい。更に，この分析は、サンプリング後、直ちに又は間もなく行われる必要
はない。
【００７３】 Ａ．フッ素化合物で誘導されるＯＰの放出 高濃度のＦ−はこの物質に固定され且つ阻害されたＣｈＥに結合したＯＰ化合
物の放出を引き起こす。図１５参照。これにより可溶性のフォスフォフルオリデ
ートが生成し、これは存在するＯＰ化合物に特異的である。このフォスフォフル
オリデートはガスクロマトグラフィーで同定及び定量され得る。更に，元のＯＰ
化合物を決定する為にマススペクとロメトリーで確認できる。特に、阻害された
ＣｈＥを含むが洗浄された有毒物質を含まない物質をｐＨ４まで酸性にし、２Ｍ
弗化カリウムでインキュベートした。この溶液は、次にC18SipPak(Waters Assoc
iates, Milford, Mass.)で抽出される。このＯＰ化合物は遊離され、ガスクロマ
トグラフィー及びマススペクとロメトリーで同定される。関心のある殆どのＯＰ
試薬が同定できる。ＯＰ除草剤からも識別される。この実施例において、この物
質は機械的ストレス、厳しい化学的条件、及び極端な及び変化する温度に非常に
抵抗性があるので、後日ＯＰ化合物をテストするために、試料を凍結する必要は
ない。
物の放出を引き起こす。図１５参照。これにより可溶性のフォスフォフルオリデ
ートが生成し、これは存在するＯＰ化合物に特異的である。このフォスフォフル
オリデートはガスクロマトグラフィーで同定及び定量され得る。更に，元のＯＰ
化合物を決定する為にマススペクとロメトリーで確認できる。特に、阻害された
ＣｈＥを含むが洗浄された有毒物質を含まない物質をｐＨ４まで酸性にし、２Ｍ
弗化カリウムでインキュベートした。この溶液は、次にC18SipPak(Waters Assoc
iates, Milford, Mass.)で抽出される。このＯＰ化合物は遊離され、ガスクロマ
トグラフィー及びマススペクとロメトリーで同定される。関心のある殆どのＯＰ
試薬が同定できる。ＯＰ除草剤からも識別される。この実施例において、この物
質は機械的ストレス、厳しい化学的条件、及び極端な及び変化する温度に非常に
抵抗性があるので、後日ＯＰ化合物をテストするために、試料を凍結する必要は
ない。
【００７４】 Ｂ．酵素の消化 他の工程として、ＯＰ化合物の暴露後の同定の為に酵素の消化が用いられても
良い。このＯＰ化合物は多孔性支持体かに固定された酵素から放出され、ｐＨ１
０の１Ｍトリスバッファとアルカリ性フォスファタ−ゼで消化されても良い。そ
の後、高分子生成物が濃縮され、ピリジンととトリメチルシリル化試薬の溶液に
溶かされる。このサンプルは次にガスクロマトグラフィー及びマススペクとロメ
トリーで分析される。実施例１１ この物質の形成に先立つ酵素カップリング これらの酵素は当業界で知られている手段でこの物質を形成するに先だってカ
ップリングさせ、架橋結合した酵素錯体を形成することができる。Hashida, S.,
Imagawa, M,. Inoue, S., Ruan, K.-h, 及びIshikawa, E（1984）J.Applied Bio
chem 6, 56-63及びSamaoszuk,M>K>, Petersen,A., Lo-Hsueh, M., 及びRietveld
, C.(1989)(A peroxide-generating immunocongugate directed to eosinophil
peroxidase is cytotooxic to Hodgkin's disease cells in vitro.).Antibody
Immunocon..Radiopharm.2(1), 37-46を参照。
良い。このＯＰ化合物は多孔性支持体かに固定された酵素から放出され、ｐＨ１
０の１Ｍトリスバッファとアルカリ性フォスファタ−ゼで消化されても良い。そ
の後、高分子生成物が濃縮され、ピリジンととトリメチルシリル化試薬の溶液に
溶かされる。このサンプルは次にガスクロマトグラフィー及びマススペクとロメ
トリーで分析される。実施例１１ この物質の形成に先立つ酵素カップリング これらの酵素は当業界で知られている手段でこの物質を形成するに先だってカ
ップリングさせ、架橋結合した酵素錯体を形成することができる。Hashida, S.,
Imagawa, M,. Inoue, S., Ruan, K.-h, 及びIshikawa, E（1984）J.Applied Bio
chem 6, 56-63及びSamaoszuk,M>K>, Petersen,A., Lo-Hsueh, M., 及びRietveld
, C.(1989)(A peroxide-generating immunocongugate directed to eosinophil
peroxidase is cytotooxic to Hodgkin's disease cells in vitro.).Antibody
Immunocon..Radiopharm.2(1), 37-46を参照。
【００７５】 例えば、ACｈEは公知の方法で架橋剤を用いてコリンオキシダーゼと結合させ
ることができる。従って、ＡＣｈＥとコリンオキシダーゼは近接して存在し、Ａ
ＣｈＥの加水分解物であるコリンは次にコリンオキシダーゼによりＨ２Ｏ２ｗｏ
生成する。このタイプの酵素のカスケードは更に効果的な酵素のカップリングを
提供し、より速いより感度のよいものを提供する。加えて、コリンオキシダーゼ
の近接により、コリンオキシダーゼのＡＣｈＥに対する割合を減少できる。2種
以上の異なった酵素が用いられてよい。実施例１２ 水性環境での有機リン酸塩に対する長期感度 固定化酵素の最大の利点はそれらがポリウレタンマトリックスのな化で永久的
に共有結合で固定されていることである。このことは以下の溶液状態の酵素又は
紙、チケット、又は指示Ｓとリップに共有結合ではなく付与される酵素にはない
特性をセンサに与える。
ることができる。従って、ＡＣｈＥとコリンオキシダーゼは近接して存在し、Ａ
ＣｈＥの加水分解物であるコリンは次にコリンオキシダーゼによりＨ２Ｏ２ｗｏ
生成する。このタイプの酵素のカスケードは更に効果的な酵素のカップリングを
提供し、より速いより感度のよいものを提供する。加えて、コリンオキシダーゼ
の近接により、コリンオキシダーゼのＡＣｈＥに対する割合を減少できる。2種
以上の異なった酵素が用いられてよい。実施例１２ 水性環境での有機リン酸塩に対する長期感度 固定化酵素の最大の利点はそれらがポリウレタンマトリックスのな化で永久的
に共有結合で固定されていることである。このことは以下の溶液状態の酵素又は
紙、チケット、又は指示Ｓとリップに共有結合ではなく付与される酵素にはない
特性をセンサに与える。
【００７６】 Ａ．異なるｐＨで２５°Ｃで連続インキュベートごの活性保存能力 ２５°ＣでｐＨ４．０から１０．５のバッファ中で２ヶ月後の固定化ＡＣｈＥ
とＢＣｈＥ酵素の活性が図２１Ａと２１Ｂにそれぞれ示される。
とＢＣｈＥ酵素の活性が図２１Ａと２１Ｂにそれぞれ示される。
【００７７】 Ｂ．自然水源において環境温度２５°Ｃで連続インキュベートごの活性保存能 力 環境中で長期間計か語にもＡＣｈＥセンサが活性を保っている更なる証拠が図
２１Ｃ及び図２１Ｄに観察されている。
２１Ｃ及び図２１Ｄに観察されている。
【００７８】 Ｃ．上記Ａ及びＢでＭ２７２チケットの比較 Ｍ２７２チケットは水溶液中で有機リン酸塩に感度があるものとして最近出ま
わっている。このチケットは非共有結合したEelコリンエステラーゼを含む。固
定化したＡＣｈＥ及びＢＣｈＥセンサが１−２ヶ月後にも活性を保持しているの
に対し、Ｍ２７２チケットは、湾の水中で（図２１Ｅ）及びバッファ中で（図２
１Ｆ）５分後に、８０％以上の活性を失った。実施例１３ フェイルスポジティブに対する抵抗性 このセンサはフェイルスポジティブに対する抵抗性を有することが好ましい。
この定義においてＯＰのフェイルスポジティブは酵素を変成させる全ての化合物
である。有機化合物は溶液状態の多くの蛋白質及び項をを阻害し変成させること
が知られているので、このＡＣｈＥセンサを標準ガソリン（図２１Ａ）及びジー
ゼル排気ガス（図２１Ｂ）に曝して活性を評価した。連続して２−３時間曝した
後にも初期活性の８０％以上を保持していた。ポリマーマトリックスも破壊され
ていなかった。これらの結果は、このマトリックスが固定化されたアセチルコリ
ンエステラーゼを有機燃料の蒸気などの変成条件に対して安定化し、フェイルス
ポジティブ応答を減少させたことを示している。実施例１４ 農薬（ジクロロフォス）及び有機リン酸（ソマン，ＧＤ）に対する溶液且つ固 定化マンマリアンＡＣｈＥの感度 ＡＣｈＥセンサと溶液ＡＣｈＥを、50ｍＬのフォスフォレートバッファに2.5
ｍＬのジクロロフォス希釈液に５分間曝した後、溶液状の酵素と固定化したセン
サの活性を測定した。図２３Ａに示すように、溶液状の酵素と固定化したセンサ
の感度は非常に近いＥＣ５０の値を示したが、スポンジに関する傾斜は、溶液酵
素よりも約２０％緩かった。これらの結果は、農薬の阻害に対して、ＡＣｈＥス
ポンジは溶液状のマンマリアン酵素よりも少し感度が低いことを示している。
わっている。このチケットは非共有結合したEelコリンエステラーゼを含む。固
定化したＡＣｈＥ及びＢＣｈＥセンサが１−２ヶ月後にも活性を保持しているの
に対し、Ｍ２７２チケットは、湾の水中で（図２１Ｅ）及びバッファ中で（図２
１Ｆ）５分後に、８０％以上の活性を失った。実施例１３ フェイルスポジティブに対する抵抗性 このセンサはフェイルスポジティブに対する抵抗性を有することが好ましい。
この定義においてＯＰのフェイルスポジティブは酵素を変成させる全ての化合物
である。有機化合物は溶液状態の多くの蛋白質及び項をを阻害し変成させること
が知られているので、このＡＣｈＥセンサを標準ガソリン（図２１Ａ）及びジー
ゼル排気ガス（図２１Ｂ）に曝して活性を評価した。連続して２−３時間曝した
後にも初期活性の８０％以上を保持していた。ポリマーマトリックスも破壊され
ていなかった。これらの結果は、このマトリックスが固定化されたアセチルコリ
ンエステラーゼを有機燃料の蒸気などの変成条件に対して安定化し、フェイルス
ポジティブ応答を減少させたことを示している。実施例１４ 農薬（ジクロロフォス）及び有機リン酸（ソマン，ＧＤ）に対する溶液且つ固 定化マンマリアンＡＣｈＥの感度 ＡＣｈＥセンサと溶液ＡＣｈＥを、50ｍＬのフォスフォレートバッファに2.5
ｍＬのジクロロフォス希釈液に５分間曝した後、溶液状の酵素と固定化したセン
サの活性を測定した。図２３Ａに示すように、溶液状の酵素と固定化したセンサ
の感度は非常に近いＥＣ５０の値を示したが、スポンジに関する傾斜は、溶液酵
素よりも約２０％緩かった。これらの結果は、農薬の阻害に対して、ＡＣｈＥス
ポンジは溶液状のマンマリアン酵素よりも少し感度が低いことを示している。
【００７９】 ＡＣｈＥセンサ（酵素を固定）とアセチルコリンエステラーゼ溶液の阻害につ
いても、同様な結果が観察された。図２３Ｂは、酵素をソマンに５分間曝して酵
素の阻害を測定した時、ソマンへの曝しによる酵素活性の喪失を表わす曲線が意
味のある程変化していないことを示している。ソマンなしでは、色発展と酵素活
性（１００％レベル）があるのに対し、30ｐｇのソマンでは、殆ど色反応がなく
、活性は制御レベルの２０％低い。
いても、同様な結果が観察された。図２３Ｂは、酵素をソマンに５分間曝して酵
素の阻害を測定した時、ソマンへの曝しによる酵素活性の喪失を表わす曲線が意
味のある程変化していないことを示している。ソマンなしでは、色発展と酵素活
性（１００％レベル）があるのに対し、30ｐｇのソマンでは、殆ど色反応がなく
、活性は制御レベルの２０％低い。
【００８０】 以上、本発明について説明したが、上述の刊行物及び特許文献は、本発明の理
解と開示に必要な限り、この明細書の開示に含まれる。
解と開示に必要な限り、この明細書の開示に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 アセチルコリンエステラーゼ、ブチリルコリンエステラーゼ及び有機リン酸ト
リエステラーゼのモデル化した表面を示す図。
リエステラーゼのモデル化した表面を示す図。
【図１Ｂ】 残留物をプレポリマーに共有結合したラッカーゼの表面のモデルを示す図（酵
素の上面、正面と酵素の底面、背面）。
素の上面、正面と酵素の底面、背面）。
【図２】 硬化した材料を示す図。
【図３】 酵素とプレポリマーの特別反応を概略的に示す図。
【図４】 材料の合成中に付加されたＢＣｈＥの量と最終材料におけるＢＣｈＥの量との
間の直線関係を示す図。
間の直線関係を示す図。
【図５】 合成中に一定量のＡＣｈＥ及びＴＤＩポリマーに付加されたＢＳＡの増加量を
示す図。
示す図。
【図６】 本発明による材料が、４℃で３年以上、25℃及び45℃で12ヶ月以上、酵素の安
定を維持したことを示す図。
定を維持したことを示す図。
【図７】 本発明による材料が洗浄後に酵素の活性を維持したことを示す図。
【図８】 可溶性のポリウレタン結合ＡＣｈＥの基質濃度依存曲線を示す図。
【図９】 可溶性の固定化ＡＣｈＥのｐＨの範囲を示す図。
【図１０】 共に固定化されたＣｈＥとＯＰＨの相対的活性を示す図。
【図１１】 図１１Ａ及びＢは、手動式の混合ガン及び処分可能な混合ステータの外観図。
【図１２】 固定化したＡＣｈＥ活性を含む小さい材料を示す図。
【図１３】 ＣｈＥ活性を検出するための変更可能な手順を示す図。
【図１４】 ＣｈＥを固定化した炭素電極モデルを示す図。
【図１５】 ＯＰ化合物とＣｈＥの反応をＦがどのように反転するかを示す図。
【図１６】 図１６Ａは、固定化されたＦＢＳ−ＡＣｈＥの酵素活性を示し、図１６Ｂは、
固定化されたＥｑ−ＢＣｈＥの酵素活性を示す。
固定化されたＥｑ−ＢＣｈＥの酵素活性を示す。
【図１７】 発泡体で固定化されたＦＢＳ−ＡＣｈＥのＤＦＰによる阻害とＨ１−６による
再活性化を示す図。
再活性化を示す図。
【図１８】 発泡体で固定化されたＥｑ−ＢＣｈＥのＤＦＰによる阻害とＴＭＢ４による再
活性化を示す図。
活性化を示す図。
【図１９】 図１９Ａは、可溶性の固定化コリンオキシダーゼのｐＨ曲線を示し、図１９Ｂ
は、可溶性ポリウレタン結合コリンオキシダーゼの基質濃度依存曲線を示す。
は、可溶性ポリウレタン結合コリンオキシダーゼの基質濃度依存曲線を示す。
【図２０】 図２１Ａは、固定化された可溶性ＡＣｈＥの温度曲線を示し、図２１Ｂは、固
定化された可溶性ＢＣｈＥの温度曲線を示す。
定化された可溶性ＢＣｈＥの温度曲線を示す。
【図２１Ａ】 25℃でいくつかのｐＨで連続して培養後のＡＣｈＥセンサの動作を示す。
【図２１Ｂ】 25℃でいくつかのｐＨで連続して培養後のＢＣｈＥセンサの動作を示す。
【図２１Ｃ】 25℃でチェサピーク湾（汽水）の水に連続して曝された後のＡＣｈＥセンサの
動作を示す。
動作を示す。
【図２１Ｄ】 25℃でアレゲニー川（淡水）の水に連続して曝された後のＡＣｈＥセンサの動
作を示す。
作を示す。
【図２１Ｅ】 水条件（チェサピーク湾の汽水）に対するＭ２７２チケットの感度を示す。
【図２１Ｆ】 水条件（50ｍＭフォスフォレートバッファ、ｐＨ8.0）に対するＭ２７２チケ
ットの感度を示す。
ットの感度を示す。
【図２２】 図２２Ａは、飽和ガソリンに連続的に曝された時の抵抗となるＡＣｈＥセンサ
を示す。図２２Ｂは、飽和ガソリンに連続的に曝された時の抵抗となるＡＣｈＥ
センサを示す。
を示す。図２２Ｂは、飽和ガソリンに連続的に曝された時の抵抗となるＡＣｈＥ
センサを示す。
【図２３】 図２３Ａは、ジクロロフォス農薬に対する固定化ＡＣｈＥセンサと可溶性ＡＣ
ｈＥの用量依存阻害を示し、図２３Ｂは、有機リン酸ソマン（ＧＤ）に対する固
定化ＡＣｈＥ（センサ）と可溶性ＡＣｈＥの用量依存阻害を示す。
ｈＥの用量依存阻害を示し、図２３Ｂは、有機リン酸ソマン（ＧＤ）に対する固
定化ＡＣｈＥ（センサ）と可溶性ＡＣｈＥの用量依存阻害を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 27/327 Ｇ０１Ｎ 27/46 ３０１Ｇ 27/416 27/30 ３５３Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ドクトル，ブペンドラ，ピー アメリカ合衆国，メリーランド州 20854， ポトマック，10613 グラット アーバー ドライブ Ｆターム(参考） 2G054 AA01 AA02 AB10 CA30 CE02 EA03 EA06 4B029 AA07 FA12 4B063 QA01 QA18 QQ22 QQ23 QQ32 QQ61 QQ95 QR02 QR03 QR12 QR41 QR67 QS36 QX02
Claims (31)
- 【請求項１】 少なくとも1つの有機リン及び／又は有機硫黄化合物を分析するためのバイオ
センサであって、共有結合により発泡支持体の表面又は内部に固定された少なく
とも１つの酵素を含み、該酵素はアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）、ブ
チリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）、トリエステラーゼ、プソイドコリンエ
ステラーゼ、コリンオキシダーゼ、パーオキシダーゼ、有機リン酸ハイドロラー
ゼ（ＯＰＨ），フォスフォトリエステラーゼ及びパラオキシダーゼからなる群か
ら選ばれ、前記有機リン及び／又は有機硫黄化合物は前記酵素の１又は２以上の
阻害物であることを特徴とするバイオセンサ。 - 【請求項２】 更に、多ゾーンを含み、各ゾーンは前記有機リン及び／又は有機硫黄化合物の
種類で異なるように選択された前記酵素の１又は２以上の独自の酵素を含むこと
を特徴とする請求項１記載のバイオセンサ。 - 【請求項３】 前記多ゾーンは配列を形成していることを特徴とする請求項２記載のバイオセン
サ。 - 【請求項４】 前記有機リン及び／又は有機硫黄化合物を検出するための測定に適していること
を特徴とする請求項１記載のバイオセンサ。 - 【請求項５】 前記検出はコリンエステラーゼの阻害に基づいていることを特徴とする請求項
１記載のバイオセンサ。 - 【請求項６】 更に、コリンエステラーゼ活性を測定することによる前記有機リン及び／又は
有機硫黄化合物の検出のための炭素電極を備えていることを特徴とする請求項１
記載のバイオセンサ。 - 【請求項７】 前記発泡体はウレタンである請求項１記載のバイオセンサ。
- 【請求項８】 前記発泡体はウレタン、ポリエーテル又はポリエステルポリオールを架橋剤の
存在下にイソシアネートと反応させることで合成されることを特徴とする請求項
７記載のバイオセンサ。 - 【請求項９】 前記発泡体は前記酵素の存在下で合成されることを特徴とする請求項８記載の
バイオセンサ。 - 【請求項１０】 前記酵素は発泡体構造の中に組込まれていることを特徴とする請求項9記載の
バイオセンサ。 - 【請求項１１】 前記合成は素早い混合で行われることを特徴とする請求項８記載のバイオセン
サ。 - 【請求項１２】 前記発泡支持体は担体上でしっかり固定されていることを特徴とする請求項１
記載のバイオセンサ。 - 【請求項１３】 前記酵素である第１の酵素は、該第１の酵素によって製造された生成物と反応
するか、或いはＯＰと反応する、もう１つの酵素である第２の酵素と共固定化さ
れていることを特徴とする請求項１記載のバイオセンサ。 - 【請求項１４】 前記第１の酵素はコリンエステラーゼであり、前記第２の酵素はコリンオキシ
ダーゼである請求項１３記載のバイオセンサ。 - 【請求項１５】 前記第１の酵素はコリンエステラーゼであり、前記第２の酵素はＯＰハイド
ロラーゼである請求項１３記載のバイオセンサ。 - 【請求項１６】 前記酵素の存在はその活性により測定されることを特徴とする請求項１記載の
バイオセンサ。 - 【請求項１７】 前記活性は蛍光、化学蛍光又は可視的発色検出用のインジケータにより検出さ
れることを特徴とする請求項１６記載のバイオセンサ。 - 【請求項１８】 前記活性は、アセチルコリン、ブチリルチオコリン、ジエチルｐ−ニトロフェ
ニルフォスフェート、２，６−ジクロロインドフェニルアセテート、１−メチル
−７−アセトキシキノリニウムアイオダイド、n-（４−（７−ジメチルアミノ−
コウマリン−３−イル）フェニル）−マレイミド又はその他の公知のコリンエス
テラーゼ類の基質から選ばれた酵素の基質に基づいて決定されることを特徴とす
る請求項１６記載のバイオセンサ。 - 【請求項１９】 試料中の少なくとも１つの危険化学物質を検出し測定する方法であって、請求
項１のバイオセンサを試料と接触させ、前記危険化学物質を検出し及び／又は測
定することからなる方法。 - 【請求項２０】 更に、視覚的に、化学的に、及び／又は電気的に危険化学物質を検出し測定す
るためのインジケータを用いることを含み、視覚的、化学的、及び／又は電気的
変化が前記インジケータの存在で危険化学物質の存在と量を示す請求項１９記載
の方法。 - 【請求項２１】 前記接触させるステップと検出するステップは他方の後すぐには遂行されない
請求項１９記載の方法。 - 【請求項２２】 前記危険物質はＯＰであり、前記接触と検出は前記ＯＰが酵素から放出された
後に発生する請求項１９記載の方法。 - 【請求項２３】 前記ＯＰは前記酵素がフッ素アニオンと接触することにより放出され、前記検
出及び測定ステップはＯＰの分離及びその測定を含む請求項２２記載の方法。 - 【請求項２４】 複数の酵素又は架橋結合した酵素錯体を多孔性支持体の表面、内部又はカプセ
ル化されて固定することからなり、前記複数の酵素又は架橋結合した酵素錯体は
アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）、ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣ
ｈＥ）、トリエステラーゼ、プソイドコリンエステラーゼ、コリンオキシダーゼ
、パーオキシダーゼ、有機リン酸ハイドロラーゼ（ＯＰＨ），フォスフォトリエ
ステラーゼ、パラオキシダーゼ、ラッカーゼ、ラッカーゼのメディエイタ、ラッ
カーゼのコファクタ及びＡＢＴＳからなる群から選ばれた少なくとも1つの酵素
からなることを特徴とする危険化合物の検出及び測定のためのバイオセンサの製
造方法。 - 【請求項２５】 前記固定化ステップは前記複数の又は前記架橋結合した酵素錯体をポリウレタ
ンプレポリマーと混合することからなる請求項２４記載の方法。 - 【請求項２６】 前記ポリウレタンプレポリマーは少なくとも１つのジイソシアネートの混合物
からなる請求項２５記載の方法。 - 【請求項２７】 前記ジイソシアネートはトリルジイソシアネートである請求項２６記載の方法
。 - 【請求項２８】 同じ量の前記複数の又は前記架橋結合した酵素錯体と前記ポリウレタンプレポ
リマーは、前記複数の又は前記架橋結合した酵素錯体を前記ポリウレタンプレポ
リマーで包み込む条件で同時に混合される請求項２５記載の方法。 - 【請求項２９】 前記混合は静的混合装置で行われる請求項２７記載の方法。
- 【請求項３０】 試料中の少なくとも１つの危険化学物質を検出し測定するキットであって、請
求項１記載のバイオセンサと前記化学物質を視覚的に、化学的に及び／又は電気
的に検出及び測定する試薬とからなるキット。 - 【請求項３１】 更に、中央集積ポイントへ結果を送信する手段を具備している請求項３０記載
のキット。
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| US13098999P | 1999-04-26 | 1999-04-26 | |
| US60/130,989 | 1999-04-26 | ||
| PCT/US2000/011058 WO2000065081A2 (en) | 1999-04-26 | 2000-04-26 | Immobilized enzymes as biosensors for chemical toxins |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=22447365
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000614415A Pending JP2002543396A (ja) | 1999-04-26 | 2000-04-26 | 化学毒素用バイオセンサとしての固定化酵素 |
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|---|---|
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| IL (2) | IL146193A0 (ja) |
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