DE102008029174A1

DE102008029174A1 - Biosensor und Verfahren zum Bestimmen eines Gifts sowie Verwendungen des Biosensors

Info

Publication number: DE102008029174A1
Application number: DE200810029174
Authority: DE
Inventors: Heike Dr. Barlag
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Priority date: 2008-06-19
Filing date: 2008-06-19
Publication date: 2009-12-24
Also published as: WO2009153074A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Biosensor zum Bestimmen eines Gifts in einer Probe, der mindestens zwei Enzyme, die an dem Biosensor angeordnet sind und die mit einer auf die Anwesenheit mindestens eines Enzyminhibitors zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht werden, eine Messeinheit zum Messen einer Enzyminhibition, die durch eine Wechselwirkung zwischen den Enzymen auf dem Biosensor und mindestens einem Inhibitor in der Probe verursacht wird, und eine Auswertungseinheit zum Auswerten der Enzyminhibition umfasst, wobei die Auswertungseinheit eine Beziehung zwischen den gemessenen Enzyminhibitionen und der Giftigkeit der Probe für einen Organismus angibt. Ferner sind ein Verfahren zum Bestimmen eines Gifts in einer Probe sowie erfindungsgemäße Verwendungen des Biosensors umfasst.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Biosensor und ein Verfahren zum Bestimmen eines Gifts in einer Probe. Ebenfalls umfasst sind bestimmte erfindungsgemäße Verwendungen des Biosensors.
Giftige bzw. toxische Substanzen stellen im Trinkwasser, in Lebensmitteln und in der Luft eine akute Gefahr für Mensch und Tier dar. Durch biologische Tests mit lebenden Organismen können Gifte und deren toxische Wirkungen gemessen werden. In den Testverfahren werden lebende Organismen, wie Fische, Muscheln und Mikroorganismen verwendet. Die Testverfahren beruhen auf der Beobachtung, dass sich das Verhalten des ganzen Organismus bei Zugabe von Schadstoffen zum Wasser ändert (Brack et al., 1999). Bakterien und Algen reagieren ebenfalls auf Schadstoffe, indem ihre Bioluminiszenz bzw. photosynthetische Aktivität gehemmt wird.
Biologische Tests mit lebenden Organismen sind jedoch sehr aufwändig und aufgrund physiologischer Schwankungen im Organismus schwer zu standardisieren. Außerdem sind die Ergebnisse solcher Tests nicht eindeutig auf den Menschen übertragbar. Zudem können lebende Organismen zum Nachweis von niedrigen Schadstoffkonzentrationen z. B. bei der Kontrolle des Trinkwassergrenzwertes häufig nicht eingesetzt werden, weil sie nicht ausreichend empfindlich reagieren.
Chemisch-analytische Verfahren, wie chromatographische Techniken zum Nachweis toxischer Substanzen stellen eine Alternative zu Tests mit lebenden Organismen dar (Engst und Noske, 2006). Sie haben sich jedoch aufgrund der großen Zahl nachzuweisender Stoffe als sehr zeitaufwändig und kostenintensiv erwiesen. Zudem können durch diese Verfahren nur bekannte Substanzen nachgewiesen werden. Außerdem ist der Nachweis von Substanzen, deren Charakter und Merkmale lediglich vermutet werden, problematisch.
Enzyminhibitoren stellen für den Menschen eine Klasse bzw. Gruppe giftiger Substanzen dar. Durch ihre Wirkung auf isolierte Enzyme können sie sehr gut in niedrigen Konzentrationen nachgewiesen werden. Für den Nachweis von Cyanid wird das Enzym Cyanidase verwendet, das Cyanid in Ameisensäure und Ammoniak zerlegt. Der Abbau führt zu einer Änderung des pH-Wertes, die anschließend als elektrische Potenzialdifferenz gemessen werden kann (Keusgen et al., 2001).
Ein auf Enzymen basierendes Nachweissystem, das auch als Enzymhemmtest bezeichnet wird, ist unabhängig von der Substanz, d. h. unabhängig von der chemischen Natur des Toxins. So können auch unbekannte und unvermutete Toxine in einem einzigen Nachweisverfahren schnell, einfach und mit hoher Empfindlichkeit erkannt werden. Durch die Entwicklung von kontinuierlichen Durchfluss-Systemen ist der Nachweis von toxischen Substanzen mittels Enzyminhibition automatisierbar und äußerst effizient (Solé et al., 2003). Eine Kombination verschiedener Enzyme erhöht zusätzlich die Empfindlichkeit von Enzymhemmtests.
Durch Enzymhemmtests oder chemisch-analytische Verfahren kann jedoch lediglich die Anwesenheit eines Toxins nachgewiesen und seine Konzentration bestimmt werden. Es ist aber durch keine dieser Techniken möglich, die Wirkung des Toxins, d. h. die Toxizität bzw. Giftigkeit, auf einen tierischen oder menschlichen Organismus zu bestimmen. Die Hemmung einzelner Enzyme durch Toxine bzw. Gifte weicht von der Wirkung von Toxinen bzw. Giften auf einen Gesamtorganismus erheblich ab. Aussagen über Wirkungen von Giften sind derzeit nur durch Tests mit lebenden Organismen möglich, die aber kosten- und zeitaufwändig sowie schwer standardisierbar sind.
Daher liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, einen neuen Biosensor zur Bestimmung der Giftigkeit einer Probe vorzuschlagen, der in einem vollautomatischen System eingesetzt werden kann, wartungsarm ist und auf einfache Weise häufig regeneriert werden kann, so dass der Sensor selten ausgetauscht werden muss. Der Biosensor soll adressierbar sein, wobei mit Adressierbarkeit die spezifische Bindung einzelner Enzyme an verschiedene Sensoren des Biosensors gemeint ist. Durch die Auswahl verschiedener Enzyme, die auf die gleichen Gifte reagieren, wird der Sensor so kalibriert, dass er die Wirkung auf den Menschen wiedergibt.
Diese Aufgabe wird durch einen Biosensor zum Bestimmen eines Gifts in einer Probe gelöst, der mindestens zwei Enzyme, die an dem Biosensor angeordnet sind und die mit einer auf die Anwesenheit mindestens eines Enzyminhibitors zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht werden, eine Messeinheit zum Messen einer Enzyminhibition, die durch eine Wechselwirkung zwischen den Enzymen auf dem Biosensor und mindestens einem Inhibitor in der Probe verursacht wird, und eine Auswertungseinheit zum Auswerten der Enzyminhibition umfasst, wobei die Auswertungseinheit eine Beziehung zwischen den gemessenen Enzyminhibitionen und der Giftigkeit der Probe für einen Organismus angibt und die Enzyme durch den Inhibitor in der Probe bei gleicher Konzentration unterschiedlich stark inhibiert werden.
Daneben betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen eines Gifts in einer Probe, das die Schritte des In Kontakt Bringens des erfindungsgemäßen Biosensors mit einer zu untersuchenden Probe, das Messen von Enzyminhibitionen, die durch eine Wechselwirkung zwischen den Enzymen auf dem erfindungsgemäßen Biosensor und mindestens einem Inhibitor in der Probe verursacht werden, und das Auswerten der Enzyminhibitionen, umfasst, wobei das Auswerten eine Beziehung zwischen den gemessenen Enzyminhibitionen und der Giftigkeit der Probe für einen Organismus angibt.
Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Biosensors zum Untersuchen einer Probe auf Gift/e.
Die abhängigen Patentansprüche enthalten vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren näher beschrieben.
1 zeigt einen Sensorarray mit Enzymen E aus den verschiedenen Familien von Enzymen A, B, C bis M.
2 zeigt die Inhibition von Esterase 1 als Funktion der Konzentration verschiedener Inhibitoren.
3 zeigt die Inhibition der Esterase 1 als Funktion der Toxizität. Als Maß für die Toxizität bzw. Giftigkeit dient der LD₅₀ Wert (Ratte oral).
4 zeigt die Inhibition der Esterase 2 als Funktion der Toxizität bzw. Giftigkeit mit unterschiedlichen Empfindlichkeiten im Vergleich zu Esterase 1.
5 zeigt eine aus den Messungen der Esterasen 1 und 2 berechnete Antwort des Biosensors mit einem annähernd linearen Zusammenhang zwischen der Menge des Inhibitors bei 50 Inhibition und Toxizität, repräsentiert durch LD50 (Ratte oral).
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Biosensor zum Bestimmen eines Gifts in einer Probe, umfassend:

– mindestens zwei Enzyme, die an dem Biosensor angeordnet sind und die mit einer auf die Anwesenheit mindestens eines Enzyminhibitors zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht werden,
– eine Messeinheit zum Messen einer Enzyminhibition, die durch eine Wechselwirkung zwischen den Enzymen auf dem Bio sensor und mindestens einem Inhibitor in der Probe verursacht wird, und
– eine Auswertungseinheit zum Auswerten der Enzyminhibition,

Somit können Enzyme mit unterschiedlicher Empfindlichkeit gegenüber den verschiedenen Substanzen einer Gruppe von Inhibitoren eingesetzt werden. Dabei kann der Effekt von Inhibitoren auf einzelne Enzyme erheblich von der Giftwirkung der Substanz auf den Menschen abweichen. Daher werden die Signale der verschieden empfindlichen Enzyme gewichtet miteinander verrechnet. Wesentlich für die Erfindung ist, dass der Biosensor eine Beziehung zwischen allen eingesetzten Enzymen und der Giftigkeit der Probe auf den Organismus angibt. Bei Kalibrierungsmessungen wird im Wesentlichen nicht der Zusammenhang zwischen der Konzentration der Inhibitoren und der Inhibitionswirkung hergestellt, sondern zwischen der Giftigkeit der Inhibitoren in der Probe und der Inhibitionswirkung. Wenn die Giftigkeit einer konkreten Substanz für den Menschen nicht hinreichend bekannt ist, wird auf ein Tiermodell zurückgegriffen. Hier stellt die Kalibrierung auf die LD50 Dosis der Substanz für die Ratte eine Möglichkeit dar.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Probe zwei oder mehr Inhibitoren unterschiedlicher Konzentration auf.
Es ist besonders vorteilhaft, wenn die Auswertungseinheit eine multivariate Datenanalyse umfasst. Hiermit kann einfach und unkompliziert eine Korrelation zwischen dem Signal, das durch die Auswertungseinheit des Biosensors hervorgerufen wird, und der Giftigkeit der Probe hergestellt werden.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Biosensor mindestens ein Enzymsubstrat, das vorzugsweise Acetylcholin und/oder Paraaminophenylbutyrat ist. Diese Ausführungsform betrifft somit die Bestimmung der Giftigkeit einer Probe aufgrund von Acetylcholinesterasehemmern. Dabei können in der Probe auch mehrere Acetylcholinesterasehemmer im Gemisch vorliegen. Auf dem Biosensor sind verschiedene nicht-menschliche Esterasen immobilisiert. Sie sind, verglichen mit der menschlichen Acetylcholinesterase, besonders stabil. Das Substrat Paraaminophenylbutyrat kann eingesetzt werden, so dass mit einem, in dieser Ausführungsform, elektrochemisch arbeitenden erfindungsgemäßen Biosensor das Enzymprodukt besonders einfach gemessen werden kann. Die Enzyme können außerdem weiter modifiziert sein, um sie besser an dem Sensor zu immobilisieren. Alle Enzyme werden mit der Probe in Kontakt gebracht, und die Inhibitionswirkung auf die verschiedenen Esterasen wird getrennt erfasst. Durch den Vergleich der Biosensorantwort durch die Auswertungseinheit mit vorherigen Kalibrierungsmessungen wird die Giftigkeit der Probe für den Menschen ermittelt bzw. errechnet.
Vorzugsweise umfasst der Biosensor mindestens ein Kontrollenzym. Besonders bevorzugt ist dabei eine Phosphatase.
In einer weiteren Ausführungsform sind die verwendeten Enzyme aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus natürlichen Enzymen, synthetischen Enzymen, mutierten Enzymen und modifizierten Enzymen. Für den erfindungsgemäßen Biosensor eignen sich insbesondere auch mutierte oder modifizierte Enzyme, die sich in ihrer Reaktion signifikant von den zugrunde liegenden natürlich vorkommenden Varianten unterscheiden können. Hierdurch können Aussagen über die Relevanz bestimmter Mutationen für die Funktion eines Enzyms getroffen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform gehören die Enzyme derselben Gruppe von Enzymen an. Sie sind vorzugsweise Esterasen.
Durch die gleichzeitige Verwendung einer Gruppe von Enzymen, die alle durch die gleiche Art von Giften, aber in unterschiedlicher Stärke inhibiert werden, wird ein System aufge baut, das die Empfindlichkeit des menschlichen Organismus auf diese Substanzgruppe anzeigt. Unter dem Begriff „gleiche Art von Giften” wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht eine gleichartige chemische Struktur verstanden, sondern eine übereinstimmende Wirkungsweise der Gifte, in dieser Ausführungsform, die Hemmung der Acetylcholinesterase. Dadurch ist es ohne aufwändige chemische Analyse möglich, zu bestimmen, ob die Probe aufgrund der Beimischung einer bestimmten Art von Giften für den Menschen gefährlich sein kann. Ein solches System besitzt den besonderen Vorteil, dass es in sehr kurzer Zeit, in der Regel in weniger als 15 Minuten, ein verlässliches Ergebnis liefert. So ist es insbesondere für online Überwachungen geeignet. Alternativ dazu kann der Sensor aber auch beispielsweise in mobilen Feldgeräten eingesetzt werden.
Ausführungsformen, in denen das Enzym eine Esterase und der Enzyminhibitor ein Acetylcholinesterasehemmer ist, sind bevorzugt. Die Acetylcholinesterasehemmer sind von besonderem Interesse, weil sie als Pestizide und als Kampfstoffe verwendet werden. Die Esterase ist derart ausgewählt, dass sie besonders stabil, insbesondere temperaturstabil ist.
In einer weiteren Ausführungsform sind die Enzyme auf dem Biosensor in einem Array angeordnet, was eine noch schnellere und vielfältigere Messung erlaubt.
Vorteilhafterweise wird der Biosensor vor seiner Verwendung kalibriert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen eines Gifts in einer Probe, das die Schritte umfasst:

– In Kontakt bringen des Biosensors nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit einer zu untersuchenden Probe,
– Messen von Enzyminhibitionen, die durch eine Wechselwirkung zwischen den Enzymen auf dem Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche und mindestens einem Inhibitor in der Probe verursacht werden, und
– Auswerten der Enzyminhibitionen,

In einer bevorzugten Ausführungsform werden zwei oder mehr Enzyminhibitoren unterschiedlicher Konzentration gemessen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Biosensors zum Untersuchen einer Probe auf Gift/e.
Insbesondere eignet sich der erfindungsgemäße Biosensor zum Überwachen von verschiedenen Flüssigkeiten, insbesondere zum Bestimmen von Giften in Wasser, vorzugsweise Trinkwasser, Klärwasser, Oberflächenwasser, Brunnenwasser, Ballastwasser von Schiffen und/oder Kühlwasser.
Es können ebenfalls Nahrungsmittel, insbesondere Getränke wie Milch, Saft, Bier und Wein überwacht werden. Darüber hinaus kann der Biosensor zum Überwachen von aus Feststoffen gelösten Extrakten, insbesondere Pestiziden, biologischen und/oder chemischen Kampfstoffen und/oder Schwermetallen verwendet werden.
Ferner kann die Probe ebenso ein Gas sein, vorzugsweise Luft z. B. in Klimaanlagen oder Atemmasken.
In Folgenden wird ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren beschrieben.
1 zeigt die Darstellung des Sensorassays: E steht für Enzym, A, B, C bis M sind die verschiedenen Familie von Enzymen, z. B. Esterasen, Phosphatasen, usw. Die Nummern beziehen sich auf die unterschiedlichen Varianten der einzelnen Enzyme in den Enzymfamilien. Die Variationen der Enzyme dienen der Simulation der humanen Antwort auf die entsprechende Familie von Enzyminhibitoren.
2 zeigt die Inhibition einer Esterase (Esterase 1) als Funktion der Konzentration verschiedener Inhibitoren.
In 3 wird als Charakteristikum für die gemessene Inhibitionswirkung für einen Inhibitor die Menge Inhibitor in der Probe bei 50% Inhibition verwendet. Als Maß für die Giftigkeit dient der LD₅₀ Wert für die Ratte oral. Falls verfügbar, wird vorzugsweise die akute Referenzdosis (ArfD), festgelegt von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) oder dem Bundesinstitut für Risikobewertung, verwendet. Alternativ dazu können beispielsweise auch die gestattete tägliche Aufnahme, ADI (für „acceptable daily intake”) oder die Menge, bei der kein Nachweis möglich ist, NOEL (für „no observed effect level”) verwendet werden. Wird die Menge des Inhibitors bei 50% Inhibition gegen die Giftigkeit aufgetragen, so ergibt sich kein einfacher Zusammenhang. Bei einem unbekannten Inhibitor lässt sich daher zunächst nicht von der gemessenen Inhibition auf die Giftigkeit schließen. Ziel ist es daher, Variationen von Enzymen zu finden, die unterschiedlich auf die Inhibitoren der gleichen Familie reagieren.
4 zeigt die Messung der Inhibitionen einer zweiten Esterase mit erniedrigter Empfindlichkeit gegenüber Paraoxon und erhöhter Empfindlichkeit gegenüber Omethoat, Quinalphos und Methidation.
5 zeigt die aus den Messungen der beiden Esterasen 1 und 2 berechnete Antwort des Sensors. Aus den beiden Messungen wird die Antwort des Biosensors durch die Mittelwertbildung über die reziproken Werte berechnet. Dadurch entsteht eine Gesamtantwort mit einem annähernd linearen Zusammenhang zwischen der Inhibitormenge bei 50% Inhibition und der Giftigkeit, repräsentiert durch LD50 für Ratte oral. Durch die Verwendung von mehr als zwei Esterasen kann die Linearisierung noch verbessert werden.
Durch die Linearisierung der Sensorsystemantwort wird ein eindeutiger Zusammenhang zwischen dem Signal und der Giftigkeit der Probe hergestellt und zwar unabhängig vom Inhibitor. Das bedeutet, dass aus dem Signal des erfindungsgemäßen Biosensors die Giftigkeit ohne Kenntnis des Inhibitors berechnet werden kann. Auch für die Gemische von Inhibitoren ist dies möglich, da die Inhibitionswirkung additiv ist.
Aus dem LD50 Wert oder konkreter, der akuten Referenzdosis für den Menschen können Grenzwerte für Trinkwasser abgeleitet werden. Das System kann unter Verwendung dieser Grenzwerte als Alarmgeber für Trinkwasser eingesetzt werden. Bei Überschreitung des Grenzwertes wird ein Alarm ausgegeben und entsprechende Maßnahmen zum Schutz der Bevölkerung eingeleitet.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Brack et al., 1999 [0002]
- Engst und Noske, 2006 [0004]
- Keusgen et al., 2001 [0005]
- Solé et al., 2003 [0006]

Claims

Biosensor zum Bestimmen eines Gifts in einer Probe, umfassend: – mindestens zwei Enzyme, die an dem Biosensor angeordnet sind und die mit einer auf die Anwesenheit mindestens eines Enzyminhibitors zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht werden, – eine Messeinheit zum Messen einer Enzyminhibition, die durch eine Wechselwirkung zwischen den Enzymen auf dem Biosensor und mindestens einem Inhibitor in der Probe verursacht wird, und – eine Auswertungseinheit zum Auswerten der Enzyminhibition, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswertungseinheit eine Beziehung zwischen den gemessenen Enzyminhibitionen und der Giftigkeit der Probe für einen Organismus angibt und die Enzyme durch den Inhibitor in der Probe bei gleicher Konzentration unterschiedlich stark inhibiert werden.
Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe zwei oder mehr Inhibitoren unterschiedlicher Konzentration aufweist.
Biosensor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswertungseinheit eine multivariate Datenanalyse umfasst.
Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Biosensor mindestens ein Enzymsubstrat umfasst.
Biosensor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzymsubstrat Acetylcholin und/oder Paraaminophenylbutyrat ist/sind.
Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Biosensor mindestens ein Kontrollenzym, und vorzugsweise eine Phosphatase, umfasst.
Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus natürlichen Enzymen, synthetischen Enzymen, mutierten Enzymen und modifizierten Enzymen.
Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme derselben Gruppe von Enzymen angehören, vorzugsweise Esterasen sind.
Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme auf dem Biosensor in einem Array angeordnet sind.
Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Biosensor vor der Verwendung kalibriert wird.
Verfahren zum Bestimmen eines Gifts in einer Probe, das die Schritte umfasst: – In Kontakt bringen des Biosensors nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit einer zu untersuchenden Probe, – Messen von Enzyminhibitionen, die durch eine Wechselwirkung zwischen den Enzymen auf dem Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche und mindestens einem Inhibitor in der Probe verursacht werden, und – Auswerten der Enzyminhibitionen, dadurch gekennzeichnet, dass das Auswerten eine Beziehung zwischen den gemessenen Enzyminhibitionen und der Giftigkeit der Probe für einen Organismus angibt.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass zwei oder mehr Enzyminhibitoren unterschiedlicher Konzentration gemessen werden.
Verwendung eines Biosensors nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zum Untersuchen einer Probe auf Gift/e.
Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe Wasser ist, vorzugsweise Trinkwasser, Klärwasser, Oberflächenwasser, Brunnenwasser, Ballastwasser von Schiffen und/oder Kühlwasser.
Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe ein Nahrungsmittel ist.
Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe ein Gas ist, vorzugsweise Luft.
Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das/die Gift/e aus der Gruppe ausgewählt ist/sind, bestehend aus Pestiziden, biologischen Kampfstoffen, chemischen Kampfstoffen und Schwermetallen.