JP2002540218A

JP2002540218A - 多発性硬化症の処置に有用なペプチド及びこれを含有する薬学組成物

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Publication number: JP2002540218A
Application number: JP2000608646A
Authority: JP
Inventors: マリノマリア; イッポリトアゴスティノ; ファッシーナジォルジオ
Original assignee: Tecnogen SpA
Current assignee: Tecnogen SpA
Priority date: 1999-03-29
Filing date: 1999-03-29
Publication date: 2002-11-26
Also published as: EP1165610A1; AU3419699A; WO2000058354A1; CA2367003A1; DE69929429D1; CA2367003C; EP1165610B1

Abstract

(57)【要約】多発性硬化症の処置に有用なペプチド化合物であって、Ｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｒ′（Ｉ）（配列番号：１）；Ｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｒ′（ＩＩ）（配列番号：２）；Ｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｒ′（ＩＩＩ）（配列番号：３）；及びＲ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｒ′（ＩＶ）（配列番号：４）（式中、ＲはＨ−又はＣＯＣＨ_３で、Ｒ′はＣＯＯＨ又はＣＯＮＨ_２であり、各アミノ酸がＬ又はＤの立体配置を有する。）からなる群より選ばれるペプチド化合物。これを含有する薬学組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の属する技術分野）本発明は多発性硬化症の処置に有用なペプチド化合物及びこれを含有する薬学
組成物に関する。

【０００２】（従来の技術）多発性硬化症（ＭＳ）は、最も一般的な中枢神経系の急性脱髄疾患である。特
に、ＭＳは、中枢神経系（ＣＮＳ）で、本質的に、白質、視神経、及び脳室周囲
の領域において、散在した脱髄のプラーク又は島によって病理学的に特徴付けら
れる。

【０００３】実際、ＣＮＳの神経を包んでいるミエリンの消失は、その神経の脳への及び脳
からの電気的活動電位を生じさせる能力を破壊することを伴い、このことはＭＳ
の種々の症状を生じさせる。かかる症状は影響を受けた中枢神経系の領域に依存
する。通常、影響を受けるこれらの系には、視覚、協調運動、感覚、認知機能、
膀胱制御、単語又は音節の始まりでの躊躇の傾向のある緩徐な発声を伴う言語が
含まれ、また、１つ以上の四肢、体躯におけるか、又は顔面の片側上の感覚異常
、脚又は手の弱さ又は不体裁さが含まれる。

【０００４】これらの経過は高度に変化し、予測できず、ほとんどの患者において、弛張性
である。いくらかの患者はこの疾病の影響が最小であるが、他の患者はすべての
能力障害までの進行が早い。

【０００５】さらに、女性は男性よりもＭＳを発現し易く、この疾病は温帯気候（１：２０
００）の方が熱帯（１：１００００）よりも一層一般的であることが知られてい
る。

【０００６】現在、ＭＳによって生じる本質的な神経性の能力障害の進行を止めることがで
きる療法は知られていない。目下の療法は、急性の罹患からの回復を促進する副
腎皮質ステロイドが認められているが、これらは長期的な経過を変えるとは信じ
られていない。免疫抑制剤、シクロホスファミド、レフルノミド(leflunomide)
及びシクロスポリンは時に進行性のＭＳに用いられるが、それらは催奇性及び発
癌性である。

【０００７】この理由から、科学者は現在、破壊的な免疫細胞を除去し、残りの身体の保護
的免疫系を無傷のままにすることができる新しい治療剤の研究を進めている。

【０００８】これまで、かかる研究はＴリンパ球によりもたらされるより一層明らかな役割
を示している。Ｔリンパ球は、身体（自己）に属する物質と外来の物質との間を
識別することができる。それらは、Ｔ細胞表面から突き出るタンパク質、Ｔ細胞
受容体（ＴＣＲ）によって１種の特異的抗原（通常はペプチドフラグメント）を
認識するが、これはこのフラグメントが、特定の抗原を示す細胞の表面に配置さ
れる主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子と関連する時にのみ起こる。形成さ
れる三分子の複合体（ＭＨＣ−ペプチド−ＴＣＲ）は、自己反応性のＴ細胞クロ
ーンの活性化を引き起こし、これはインターフェロンγ及び腫瘍壊死因子として
タンパク質を放出し、これらはＭＳの脱髄過程を引き起こす。

【０００９】Ｔ細胞受容体は修飾されたリガンドを認識し、ＴＣＲ拮抗作用〔デマジストリ
ス（ＤｅＭａｇｉｓｔｒｉｓ）等、“セル（Ｃｅｌｌ）”、６８巻、６２５〜
６３４頁、１９９２年）、Ｔ細胞寛容又はＴ細胞アネルギー〔シュバルツ（Ｓｃ
ｈｗａｒｔｚ）、“サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）”、２４８巻、１３４９〜１
３５６頁、１９９０年；スロアン−ランカスター（Ｓｌｏａｎ−Ｌａｎｃａｓｔ
ｅｒ）等、“ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）”、３６３巻、１５６〜１５９頁、１
９９３年〕として、異なる機構により種々の方法において応答することが知られ
ている。

【００１０】明らかに、そのアネルギーは、自然のタンパク質抗原の主要な免疫優性のＴ細
胞決定要因に対応する合成ペプチドによって誘導され、それらはＴ細胞のそれら
自身に対する無応答性を誘導することができる〔ビダート（Ｖｉｄａｒｄ）等、
“プロシーディングスオブナショナルアカデミーオブサイエンシーズ
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ”、９２巻、２２５９〜２
２６２頁、１９９５年〕。アネルギーのリンパ球は、抗原を用いる再刺激におい
てＩＬ−２を産生することができない（シュバルツ、“サイエンス”、２４８巻
、１３４９〜１３５６頁、１９９０年）。

【００１１】例えば、ヒトのミエリン塩基性タンパク（ｈＭＢＰ）からの脳炎惹起性のペプ
チドエピトープの８７〜９９のＶａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌ
ｅ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏにおいて、プロリン（９
６→Ｐｒｏ）のアラニンによる置換は、ＭＢＰに特異的なＴ細胞クローンにおい
て増殖性の応答を誘導する能力を低下させると共に、Ｔ細胞の反応性低下を引き
起こす。しかし、かかるペプチドは、感受性マウス株において更に脳脊髄炎を起
こすことがある〔ブローク，エス．（Ｂｒｏｋｅ，Ｓ．）等、“ネイチャー”、
３７９号、３４３〜３４６頁、１９９６年〕。

【００１２】このアプローチは臨床的に有用な結果を導かなかった。その理由は、変化させ
たペプチドが、自己反応性Ｔ細胞サブセット上で特異的に働くことができ、特定
の条件においてまた疾病を起こすからである。

【００１３】これらの理由から、感受性のヒト、又は自己反応性応答を誘導されずにＭＳを
患う個体において、自己反応性Ｔリンパ球の無応答性（アネルギー）の状態を誘
導することができるペプチドの必要性が未だ感じられている。

【００１４】本発明では、これらの特性が以下の群から選ばれるペプチド化合物によって所
有されることを見出した：Ｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｒ′（Ｉ）（配列番号：１）、Ｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｒ′（ＩＩ）（配列番号：２）、Ｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｒ′（ＩＩＩ）（配列番号：３）、及びＲ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｒ′（ＩＶ）（配列番号：４）（式中、ＲはＨ−又はＣＯＣＨ_３で、Ｒ′はＣＯＯＨ又はＣＯＮＨ_２であり、各
アミノ酸がＬ又はＤの立体配置を有する。）。

【００１５】したがって、本発明の第１の目的は、Ｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｒ′（Ｉ）（配列番号：１）、Ｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｒ′（ＩＩ）（配列番号：２）、Ｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｒ′（ＩＩＩ）（配列番号：３）、及びＲ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｒ′（ＩＶ）（配列番号：４）（式中、ＲはＨ−又はＣＯＣＨ_３で、Ｒ′はＣＯＯＨ又はＣＯＮＨ_２であり、各
アミノ酸がＬ又はＤの立体配置を有する。）からなる群より選ばれるペプチド化
合物を提供することである。

【００１６】本発明のペプチド化合物は、アミノ酸の適切な保護、保護されたアミノ酸の結
合及び保護基の除去のためにペプチド化学において通常用いられる方法に従い調
製することができる。

【００１７】好ましくは、前記ペプチドは固相合成技術にしたがって調製する。この技術は
以下の工程を含む： −適切な試薬によって、αアミノ基及びアミノ基の双方が保護されたＣ末端アミ
ノ酸を、もしあれば、側鎖で、固相合成のための適切な支持体に結合する工程； −適切な試薬によってαアミノ酸の保護を除去する工程； −第２のアミノ酸を、Ｃ末端から始めて、αアミノ基で、及びもしあれば、側鎖
のアミノ基で双方を保護して、結合する工程； −αアミノ基で保護基を除去し、Ｎ末端残分までのペプチド配列に含まれるすべ
てのアミノ酸の結合が完了するまで結合及び脱保護工程を実行する工程； −残る側鎖保護基を除去し、固相合成のための支持体から組み立てたペプチドを
分離する工程。

【００１８】これらの技術は広く文献に記載されており、当業者によく知られている〔アテ
ルトン及びシェッパード（Ａｔｈｅｒｔｏｎ＆Ｓｈｅｐｐａｒｄ）、１９８９年
、固相ペプチド合成（ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ）、ＩＲＬプレス社、英国のオックスフォード所在〕。

【００１９】これによって、本発明の第２の目的は、薬学組成物を提供することであり、こ
の組成物は、Ｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｒ′（Ｉ）（配列番号：１）、Ｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｒ′（ＩＩ）（配列番号：２）、Ｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｒ′（ＩＩＩ）（配列番号：３）、及びＲ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｒ′（ＩＶ）（配列番号：４）（式中、Ｒ、Ｒ′、アミノ酸配置は上記の意味を有する。）からなる群より選ば
れる治療に有効な量のペプチド、及び少なくとも１種の薬学的に許容できる不活性な成分を含有する。

【００２０】本発明の更に他の目的は、多発性硬化症を患う患者を処置する方法を提供する
ことであり、この方法は、必要とする患者に、Ｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−
Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｒ′（Ｉ）（配列番号：１）、Ｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｒ′（ＩＩ）（配列番号：２）、Ｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｒ′（ＩＩＩ）（配列番号：３）、及びＲ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｒ′（ＩＶ）（配列番号：４）（式中、Ｒ、Ｒ′、アミノ酸配置は上記の意味を有する。）からなる群より選ば
れるペプチド化合物の有効量を投与する工程を含む。

【００２１】好ましくは、本発明の薬学組成物は、式（Ｉ）〜（ＩＶ）（配列番号：１〜４
）の少なくとの1種のペプチド化合物及び少なくとも1種の薬学的に許容される不
活性な成分を含有する適切な剤形で調製する。

【００２２】適切な投与経路の例は、吸入又は経口経路であり；それらは免疫学的な反応性
低下（経口寛容）の状態を誘導することが知られている〔グラインシュタイン（
Ｇｒａｉｎｓｔｅｉｎ）等、“ケミカルイムノロジー（Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．）”、５８巻、２５９〜２９０頁、１９９４年〕。

【００２３】適切な剤形の代表的な例は、経口投与用の丸剤、カプセル、糖衣丸剤、顆粒、
溶液及びシロップであり、局所投与用の軟膏及びプラスターであり；直腸投与用
の座剤及び注射、吸入及び眼科投与用の滅菌溶液である。

【００２４】また、これらの剤形は、保存剤、安定剤、表面活性剤、緩衝剤、浸透圧を調整
するための塩、乳化剤、甘味料、顔料、香料等のような他の通常の成分を含むこ
とができる。

【００２５】特定の治療により必要な場合、本発明の薬学組成物は、他の活性な薬理学的な
成分を含有することができ、この成分の併用投与は治療学上有用である。

【００２６】本発明の薬学組成物における本発明のペプチド化合物の代表的な量は、１〜１
００ｍｇ／ｋｇ／日の投与レベルを確かにするほどである。

【００２７】本発明の薬学組成物における式（Ｉ）〜（ＩＶ）（配列番号：１〜４）のペプ
チド化合物の量は、例えば、疾病の重症度、患者の体重、剤形、投与の選定経路
、日毎に投与された剤形の数及び式（Ｉ）〜（ＩＶ）（配列番号：１〜４）の選
定したペプチド化合物の特定の効果のような既知の因子に基づいて、十分広い範
囲で変更することができる。

【００２８】本発明の薬学組成物の剤形は、薬学における化学者に既知であり、混合、造粒
、圧縮、溶解、滅菌等のような方法が包含される技術に従って調製することがで
きる。

【００２９】以下（アッセイ１）で詳述するように、本発明のペプチド化合物の生物学的活
性は、実験的な自己免疫性の脳脊髄炎（ＥＡＥ）の発生に適切なマウスの感受性
株においてインビボ研究により評価し、これはＭＳのネズミモデルを意味する。

【００３０】実際、ＭＳ及びＥＡＥの双方は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞仲介疾患であり、ＭＢＰ又は
脳炎惹起性ペプチドフラグメントでマウスを単純に免疫化することによって誘導
することができる。ＥＡＥは、ＭＳと同様に、Ｔリンパ球による中枢神経系の浸
潤によって特徴付けられ、結果として、脱髄及び急性の脱髄、慢性の脱髄又は慢
性の再発性の麻痺を起こす。

【００３１】アッセイ１は、本発明のペプチド化合物が疾病の臨床的徴候の発生を遅らせ、
重症度を減少させ、処置したマウスの生存率を高めることができることを示して
いる。

【００３２】本発明を、更に、以下の例及びアッセイによって詳細に説明するが、これらは
例示目的のためだけのものであり、本発明を制限するものとして解釈してはなら
ない。

【００３３】例１式（Ｉ）（配列番号：１）、式（ＩＩ）（配列番号：２）のペプチド化合物及び
比較のペプチド化合物Ｐ８１〜１００（配列番号：５）（脳炎惹起性のマウスＭ
ＢＰエピトープの８１〜１００配列に対応する。）これらのペプチド化合物を、次の完全自動化されたモデル（Ｍｏｄｅｌ）４３
１Ａアプライドバイオシステム社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ）のペ
プチド合成機、ソフトウエアバージョン１．２でのＦｍｏｃ／ＤＣＣ／ＨＯＢｔ
法〔ボダンツキー（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）、“プリンシプルズオブペプチド
シンセシス（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ）”、シュプリンガー出版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨ
ーク所在、１９８４年〕の固相合成、それに続く製造者の指示に従って合成した
。この合成は、式（Ｉ）（配列番号：１）のペプチド化合物の合成用のＦｍｏｃ
−グリシン〔ノババイオケム社（ＮＯＶＡＢＩＯＣＨＥＭ）、スイス国のローフ
ェルフィンガー（Ｌａｕｆｅｌｆｉｎｇｅｒ）所在、カタログ番号０４−１２−
２０１０、０．１ミリモル〕を用いて予め誘導体化するペプチド合成のためのア
シッドレービル樹脂（Ｗａｎｇ樹脂）（ノババイオケム社、スイス国のローフェ
ルフィンガー所在）、及び式（ＩＩ）（配列番号：２）のペプチド化合物及びペ
プチド化合物Ｐ８１〜１００（配列番号：５）の合成用のＦｍｏｃ−グルタミン
（ｔｒｙｔｉｌ）（ノババイオケム社、スイス国のローフェルフィンガー所在、
カタログ番号０４−１２−２０３６、０．１ミリモル）を用いて予め誘導体化す
るもので行った。Ｎ末端のＦｍｏｃ保護されたアミノ基を、第１の合成サイクル
において、２０％ピリジンのＮ−メチル−ピロリドン〔メルク社（Ｍｅｒｃｋ）
、独国のダルムシュタット所在〕の３ｍＬを用いて、室温で１４分間、かき混ぜ
ながら処理することで除去した。次いで、脱保護した樹脂を、Ｎ−メチル−ピロ
リドン（２．５ｍＬ）を用いて９分間室温で５回洗浄した。平均時間で、添加（
１ミリモル）すべき第２のアミノ酸を、カルボキシル端で１ＭのＨＯＢＴのＮ−
メチル−ピロリドンの１ｍＬ及び１Ｍのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣ
Ｃ）のＮ−メチル−ピロリドンの１ｍＬを用いて処理することにより活性化した
。次いで、活性化したアミノ酸を樹脂と共に５１分間かき混ぜながらインキュベ
ーションした。次いで、この樹脂を４回、２ｍＬのＮ−メチル−ピロリドンを用
いて０．５分間洗浄した。この時点で、樹脂を、ピぺリジンを用いて脱保護し、
隣のアミノ酸と結合させる次の工程にかけた。この方法を以下に示すように保護
したすべてのアミノ酸について、順次繰り返した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇ
ｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ
（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｏ
Ｈ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−
Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ。
この合成が完了した後、及びＮ末端Ｆｍｏｃ基をピペリジンで除去した後、樹脂
を、メタノール、ジクロロメタンで、及び再びメタノール（メルク社、独国のダ
ルムシュタット所在）で洗浄し、減圧下に１２時間、厳密に乾燥させた。次いで
、ペプチドの材料を樹脂から、レジンの２００ｍｇをトリフルオロ酢酸〔ピアス
社（Ｐｉｅｒｃｅ）、米国イリノイ州ロックフォード所在〕、フェノール〔シグ
マ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、イタリア国ミラノ所在〕
、チオアニソール（シグマ−アルドリッチ社、イタリア国ミラノ所在）、水（シ
グマ−アルドリッチ社、イタリア国ミラノ所在）及びエタンジチオール（シグマ
−アルドリッチ社、イタリア国ミラノ所在）の比率８３：６：５：４：２の混合
物の５ｍＬを用い、室温で３．５時間処理することによって分離した。次いで、
混合物をガラスろ過機上でろ過し、そのペプチド材料を１０ｍＬの冷エチルエー
テルの添加によって沈澱させた。このペプチド材料を遠心分離によって得、その
ペレットを水、アセトニトリル（メルク社、独国のダルムシュタット所在）、及
びトリフルオロ酢酸の比率９０：１０：０．１の２５ｍＬの混合物中で溶解し、
アクアポア（Ａｑｕａｐｏｒｅ）カラム（アプライドバイオシステム社、米国カ
リフォルニア州フォスターシティ所在）上での半ば調製用のＲＰ−ＨＰＬＣによ
って精製した。主ピークに対応する材料を収集し、冷凍し、及び凍結乾燥させた
。これらのペプチド化合物を、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ、アミノ酸分析によって、
及び減圧下で一昼夜乾燥させたペプチド樹脂の定量によって特徴付けた。ペプチ
ド化合物を樹脂から、ＴＦＡ／フェノール／チオアニソール／Ｈ_２Ｏ／エタンジ
チオール８３：６：５：４：２（５ｍＬ／２００ｍｇ樹脂）を用い、室温で３．
５時間インキュベーションして、切断した。次いで、これらの混合物をろ過し、
ペプチドの材料を１０ｍＬの冷エチルエーテルの添加によって沈澱させた。凍結
乾燥後、生成物をＨ_２Ｏ／ＣＨ_３ＣＮ／ＴＦＡの９０：１０：０．１中で溶解し
、半ば調製用のＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。精製後、それらのペプチドを
分析用ＨＰＬＣ、アミノ酸分析及びシナピン酸（シグマ−アルドリッチ社、イタ
リア国ミラノ所在）をマトリクスとして用いるクラトスコンパクト（ＫＲＡＴ
ＯＳＫｏｍｐａｃｔ）ＭＡＬＤＩＩＩＩ〔クラトスアナリティカルズ社（
ＫＲＡＴＯＳＡｎａｌｙｔｉｃａｌｓ）英国マンチェスター所在〕上でのＴＯ
Ｆ−ＭＡＬＤＩ質量分析によって特徴付けた。

【００３４】このようにして、以下のペプチド化合物を調製した：Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ
−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（Ｉ）（配列番号：１）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ
−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（ＩＩ）（配列番号：２）、Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−
Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
Ｓｅｒ−Ｇｌｎ（Ｐ８１〜１００）（配列番号：５）。

【００３５】同じ方法で、以下のペプチドも調製した：Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（ＩＩＩ）（配列番号：３）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ
−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（ＩＶ）（配列番号：４）。

【００３６】アッセイ１式（Ｉ）（配列番号：１）及び式（ＩＩ）（配列番号：２）のペプチド化合物の
インビボ活性式（Ｉ）及び（ＩＩ）（配列番号：１〜２）のペプチド化合物のインビボ活性
を、ＳＪＬの雌のマウスの４つの群を６〜１５週齢で用いて評価した。このマウ
スの株は、実験的アレルギー性脳炎（ＥＡＥ）を発生させる能力のために遺伝学
的に選定した。

【００３７】マウスの２つの群を、式（Ｉ）及び（ＩＩ）（配列番号：１〜２）のペプチド
化合物（３００ナノモル）のそれぞれを０．０５ｍＬの生理的溶液中に溶解して
次いで０．０５ｍＬの不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）（シグマ社、イ
タリア国所在）で乳化して用いて、腹腔内に免疫化した。

【００３８】陽性及び陰性コントロールとして、それぞれ、Ｐ８１〜１００（配列番号：５
）及びＩＦＡ単独を用いた。

【００３９】２週間後、ＥＡＥをすべての群において、Ｐ８１〜１００（配列番号：５）の
３００ナノモルを０．１ｍＬの生理的溶液中に溶解して次いで０．１ｍＬの完全
フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（シグマ社、イタリア国所在）で乳化して用
いて誘発することによって誘導した。

【００４０】百日咳毒素（２００ナノグラム）〔フルカセイミ社（ＦｌｕｋａＣｈｅｍｉ
ｅＡＧ）、スイス国所在〕を、免疫化の時及び２日後に静脈内に注射した。百
日咳毒素の役割は、自己反応性リンパ球の遊走を脳のバリヤーによって高めるこ
とである〔ベルナルド（Ｂｅｒｎａｒｄ）等、“ジャーナルオブイムノロジ
ー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）”、１１４巻、１５３７〜１５４０頁、１９７５年
〕。

【００４１】マウスを、９日を起点として６０日まで毎日、ＥＡＥの臨床的徴候を観察し、
以下の臨床的尺度：１、リンプテイル；２、部分的な後ろのリンプ麻痺；３、完
全な後ろのリンプ麻痺；４、後ろ及び前のリンプ麻痺；５、瀕死（ブローク，エ
ス．等、“ネイチャー”、３７９巻、３４３〜３４６頁、１９９６年）に従って
等級付けした。等級５のマウスは安楽死させた。結果を表１に示す。

【００４２】

【表１】＊ＥＡＥの発生率は、臨床的なＥＡＥを有するマウスの数／免疫化したマウスの
数として現す。＊＊発症の日は、発症の日の平均±ＳＤ（標準偏差）として現す。＊＊＊重症度は、病気マウスの平均重症度±ＳＤとして現す。

【００４３】表１からのデータは、式（Ｉ）（配列番号：１）のペプチド化合物で処置され
たマウスがＥＡＥを発生させないことを示す。式（ＩＩ）（配列番号：２）のペ
プチド化合物で処置したマウスは、ＥＡＥの臨床的徴候を発現したが、減少した
発生率及び陽性コントロール（ＩＦＡ群）に比べて発症の遅延の増加を示した。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ジォルジオファッシーナイタリア国 20133 ミラノヴィアバッシーニ 49 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 BA01 BA08 BA18 BA23 CA59 ZA012 4H045 AA10 AA20 AA30 BA17 EA20 FA34

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ペプチドであって、Ｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｒ′（Ｉ）（配列番号：１）、Ｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｒ′（ＩＩ）（配列番号：２）、Ｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｒ′（ＩＩＩ）（配列番号：３）、及びＲ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｒ′（ＩＶ）（配列番号：４）（式中、ＲはＨ−又はＣＯＣＨ_３で、Ｒ′はＣＯＯＨ又はＣＯＮＨ_２であり、各
アミノ酸がＬ又はＤの立体配置を有する。）からなる群より選ばれることを特徴
とするペプチド。
【請求項２】薬学組成物であって、Ｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｒ′（Ｉ）（配列番号：１）、Ｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｒ′（ＩＩ）（配列番号：２）、Ｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｒ′（ＩＩＩ）（配列番号：３）、及びＲ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｒ′（ＩＶ）（配列番号：４）（式中、ＲはＨ−又はＣＯＣＨ_３で、Ｒ′はＣＯＯＨ又はＣＯＮＨ_２であり、各
アミノ酸がＬ又はＤの立体配置を有する。）からなる群より選ばれる少なくとも
１種のペプチド化合物の有効量と、少なくとも１種の薬学的に許容される不活性成分とを含有することを特徴とす
る薬学組成物。
【請求項３】多発性硬化症を患っている患者を処置するにあたり、必要としている患者に、Ｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｒ′（Ｉ）（配列番号：１）、Ｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｒ′（ＩＩ）（配列番号：２）、Ｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｒ′（ＩＩＩ）（配列番号：３）、及びＲ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｒ′（ＩＶ）（配列番号：４）（式中、ＲはＨ−又はＣＯＣＨ_３で、Ｒ′はＣＯＯＨ又はＣＯＮＨ_２であり、各
アミノ酸がＬ又はＤの立体配置を有する。）からなる群より選ばれるペプチド化
合物の有効量を投与する工程を含むことを特徴とする患者の処置方法。