JP2002531521A

JP2002531521A - ガンの新規処置

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Publication number: JP2002531521A
Application number: JP2000586360A
Authority: JP
Inventors: ジョージダルグリッシュ，アングス; マイケルスミス，ピーター; デレクサットン，アンドリュー; イーアンウォーカー，アンソニー
Original assignee: オニバックスリミティド
Priority date: 1998-12-10
Filing date: 1999-12-09
Publication date: 2002-09-24
Anticipated expiration: 2019-12-09
Also published as: GB9827103D0; JP4607330B2; HUP0104857A2; DE69939837D1; ES2315024T3; EP1137434A2; WO2000033870A2; AU777969B2; CZ20012033A3; CA2354046A1; US6699483B1; KR20010090873A; WO2000033870A3; AU1668700A; NO326035B1; PL348829A1; ZA200104163B; ATE412425T1; IL143295A; NO20012818L

Abstract

(57)【要約】本発明はヒトの前立腺ガンの処置のための同種間の免疫療法剤としての使用が意図される細胞系の特異的な組み合わせを含んで成る生成物に関する。前記免疫療法の異種性は標的の前立腺ガンにおける抗原性プロファイルの異種性と適合し、そして疾患の様々な段階で発現する多くの潜在的なＴＡＡ及びＴＳＡによって受容者を免疫化する。本発明は原発性又は転移性の前立腺ガンの生検材料から調製される３つの異なる細胞系の組み合わせを含んでなるワクチンを開示する。前記細胞系はそれらが複製不能となることを保証する、５０〜３００Gyのガンマ線照射を用いて致死的に照射される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明の分野本発明は、腫瘍の病巣に対する攻撃を開始するためにガンに苦しむ哺乳類又は
ヒトの免疫系を誘導することによって、哺乳類（ヒトを含む）の原発性、転移性
及び残留性のガンの処置のための薬剤に関する。特に、本発明はワクチンアジュ
バント及び／又は他の補助因子を用いる又は用いない、全細胞、その誘導体及び
一部の使用に関する。更に具体的には、この開示は処置計画の基礎を形成する全
細胞並びにその誘導体及び一部の特定の組み合わせの使用を記載する。

【０００２】本発明の背景ガン細胞が、それらの正常な非ガン性対応物と比較して、定性的及び定量的、
空間的及び時間的に多くの変異を含み、そして腫瘍細胞の増殖及び伝播の間のあ
る時点で、これらの一部が宿主の免疫系によって異常として認識されることがで
きることは当業界で知られている。このことは、宿主の免疫系の力を利用し、そ
してガン細胞への攻撃を指示する免疫療法を開発する世界中の多くの研究努力を
導き、それによって少なくとも生命を脅かさないレベルまでその様な異常な細胞
を排除してきた（Maraveyas, A. & Dalgleish, A. G. 1977 Active immunothera
py for solid tumours in vaccine design in The Role of Cytokine Networks,
Ed. Gregoriadis et al., Plenum Press, New York, pages 129-145; Morton,
D. L. and Ravindranath, M. H. 1996 Current concepts concerning melanoma
vaccines in Tumor Immunology - Immunotherapy and Cancer Vaccines, ed. Da
lgleish, A. G. and Browning, M., Cambridge University Press, pages 241-2
68に概説されている。更なる詳細はこれらの出版物の他の紙面を参照のこと）。

【０００３】ガンの免疫療法を追求する多くの試みがなされてきており、そしてこれらは以
下の５つの範疇に分類されうる：

【０００４】非特異的免疫療法免疫系を非特異的に刺激する試みは、ＷｉｌｌｉａｍＣｏｌｅｙの一世紀以
上前の草分け的な実験に遡る（Coley, W. B., 1894 Treatment of inoperable m
alignant tumours with toxins of erisipelas and the Bacillus prodigosus.
Trans. Am. Surg. Assoc. 12: 183)。限定されるいくつかの場合において成功す
るが（例えば、泌尿器の膀胱ガンの処置のためのＢＣＧ、メラノーマ及び腎臓ガ
ンの処置のためのＩＬ−２）、非特異的な免疫調節が、多くのガンを処置するの
に十分であることを証明しない様であることは広く認識されている。非特異的な
免疫刺激剤は免疫応答性の一般的な増強される状態を導きうるが、それらは標的
化能力及び、更に免疫監視をくぐり、阻止し、そしてくつがえす多くの機構及び
可塑性を有するであろう腫瘍の病巣を扱うための巧妙さを欠く。

【０００５】抗体及びモノクローナル抗体抗体、及び特にモノクローナル抗体の形態の受動免疫療法は、抗ガン剤として
の、多くの研究及び開発の対象であった。最初、その素晴らしい特異性のために
魔法の弾丸と呼ばれたモノクローナル抗体は、抗体自身に対する免疫応答（それ
によりそれらの活性が排除される）及び血管を通過して病巣に近づくことのでき
ない抗体の能力を含むいくつかの理由のため、ガンの免疫療法の分野におけるそ
れらの期待を果たすのに失敗した。最近、３つの生成物がヒトへの使用のための
医薬として登録され、すなわちＰａｎｏｒｅｘ（Ｇｌａｘｏ−Ｗｅｌｌｃｏｍｅ
）、Ｒｉｔｕｘａｎ（ＩＤＥＣ／Ｇｅｎｅｔｅｃｈ／ＨｏｆｆｍａｎｌａＲ
ｏｃｈｅ）及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ／Ｈｏｆｆｍａｎｌａ
Ｒｏｃｈｅ）のことであり、研究及び開発のための５０以上の他の計画が進行
している。抗体は、（免疫学的感覚において）ガン抗原を模倣している様な抗イ
ディオタイプ抗体を用いる能動免疫療法にも利用されうる。概念は洗練されてい
るが、抗体に基づいた試みの利用は最終的に、哺乳類又はヒトの対象者のガン細
胞のサブセットが変異し、そして特定の抗体によって認識される抗原を失い、そ
してそれによって、もはや抗体で処置が不可能なガン細胞の集団の増殖を導きう
るという、「免疫学的逸脱」の現象によって制限されうることを証明しうる。

【０００６】サブユニットワクチン感染症及び他の分野のためのワクチンの実験を頼りに、多くの研究者が、排他
的に又は選択的にガン細胞と関連している抗原、すなわち腫瘍特異的抗原（ＴＳ
Ａ）又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を同定し、そして特異的な能動免疫療法の基礎
として前記の抗原又はその画分を使用しようと努めてきた。

【０００７】ＴＡＡ又はＴＳＡの範疇に分類されるタンパク質又はそれから誘導したペプチ
ドを同定するために、多くの方法が存在する。例えば、ディファレンシャルディ
スプレイ技術を利用することが可能であり、これによってＲＮＡの発現が、病巣
で排他的又は選択的に発現するＲＮＡを同定するために、腫瘍組織と隣接してい
る正常な組織との間で比較される。前記ＲＮＡの配列決定は、その特異的な組織
でその特異的な時期に発現する複数のＴＡＡ及びＴＳＡを同定したが、その中に
は、ＴＡＡ又はＴＳＡの同定が、病巣における抗原のプロファイルの十分な反映
を長時間提供できない、いずれかの与えられた時期の病巣の「片鱗」のみを表す
という試みの潜在的な欠陥がある。同様に、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の
クローニング及び腫瘍組織由来のｃＤＮＡの発現クローニングは、多くのＴＡＡ
及びＴＳＡの同定を、特にメラノーマにおいてもたらした。前記の試みは、ＴＡ
Ａ又はＴＳＡの１つだけの同定が、臨床的に関連している抗原のプロファイルの
適当な表現を提供できないという、ディファレンシャルディスプレイ技術と同一
の固有の欠点を有する。

【０００８】５０以上のその様なワクチンの試みは、広範なガンの処置において発達してい
るが、ヒトの医薬生成物としての市販の認可を受けたものはまだない。上文の抗
体に基づいた試みに記載したものに類似の方法において、サブユニットワクチン
は、免疫学的逸脱の現象によっても制限されうる。

【０００９】遺伝子治療ヒトの対象者における多くの遺伝子治療の試験が、ガンの処置の領域内でされ
てきており、これらの多くが患者の免疫応答を引き起こしそして／あるいは増幅
する様に検討されてきた。商業的な開発における特に注目すべきものは、Ｖｉｃ
ａｌＩｎｃによって開発されたヒト腫瘍の範囲のためのアロベクチン−７及び
ロイベクチン、ＣａｌｙｄｏｎＩｎｃによって開発された前立腺ガンの処置の
ためのＣＮ７０６、並びにＳｔｒｅｓｓＧｅｎＩｎｃの、メラノーマ及び肺ガ
ンのためのストレスタンパク質の遺伝子治療である。現在、企業及び大学の連合
によって進められている、これら及び他の多くの「免疫−遺伝子治療」が最終的
に成功したのかと証明するのは尚早であるが、これらの試みのうち、商業的な利
用が１０年以上先であろうことは広く受け入れられている。

【００１０】細胞を基にしたワクチン腫瘍は：潜在的な標的タンパク質の発現のダウンレギュレーション；潜在的な
標的タンパク質の変異；受容体及び他のタンパク質の表面発現のダウンレギュレ
ーション；ＭＨＣクラスＩ及びIIの発現のダウンレギュレーション、それによる
ＴＡＡ又はＴＳＡペプチドの直接的な提示の不可能；アネルギーを導くＴ細胞の
不完全な刺激を導く共刺激分子のダウンレギュレーション；免疫系に対するおと
りとして働く、選択的な、代表的でない膜部分の分断；免疫系をアネルギー化す
る選択的な膜部分の分断；阻害分子の分泌；Ｔ細胞の死滅の誘導；及び多くの他
の方法を含む、様々な方法において、免疫系を中和する注目すべき能力を有する
。明らかなことは、身体の中の免疫学的異種性及び可塑性が、異種性を同様に組
み入れる免疫療法の計画によって、ある程度適合されなければならないであろう
ことである。全ガン細胞、又はその粗製誘導体の、ガンの免疫療法としての使用
は、ウイルス性疾患に対するワクチンとしての、全部の不活性化又は弱毒化ウイ
ルスの使用と類似して考察されうる。潜在的な利点は：（ａ）全細胞が、上述した病巣のものに適合する十分な異種性の抗原のプロファ
イルを提供する幅広い抗原を含み；（ｂ）多価であり（すなわち複数の抗原を含み）、免疫学的逸脱の危険性が低下
しており（これらの抗原の全てを「欠いている」ガン細胞の確率が操作される）
；そして（ｃ）細胞を基にしたワクチンが、それ自身まだ同定されていないＴＳＡ及びＴ
ＡＡを含む；これは、現在まだ同定されていない抗原が知られている比較的少な
いＴＳＡ／ＴＡＡよりも臨床的に関連していない様であるならば可能である、こ
とである。

【００１１】細胞を基にしたワクチンは、２つの範疇に分けられる。最初に、自己組織由来
の細胞を基にしたものは、患者からの生検の摘出、ｉｎｖｉｔｒｏでの腫瘍細
胞の培養、トランスフェクション及び／又は他の手段による細胞の修飾、細胞複
製不能にするための照射及び、続いて同一の患者に細胞を戻すためにワクチンと
して注射することを含む。この試みは、過去十年にわたってかなりの注目を受け
たが、この個々の目的に合わせた治療が、複数の理由から本質的に実行不能であ
ることが次第に明らかとなってきた。この試みは時間がかかり（しばしば、ワク
チンの臨床的な投与量の製造のためのリードタイムが、患者の期待寿命を超える
）、高価であり、そして「注文の」生成物として、標準化した生成物を指定する
ことができない（生成物ではなく、方法のみが標準化され、そして、それ故に最
適化され、そして質が調節されうる）。更に、自己組織由来のワクチンを調製す
るために使用した腫瘍の生検は、ある増殖特性、それを独特なものにする周囲の
組織との相互作用及び関係を有するだろう。このことは、免疫療法のための自己
の細胞の使用に対する潜在的に重大な欠点を暗示しており：最初の細胞を提供す
る生検は、ちょうどその時点で、その環境における腫瘍の免疫学的な片鱗を提示
し、そしてこれは疾患の進行全体に及んで与えられうる、維持される活性を有す
るワクチンのために、長時間に及ぶ免疫学的提示として不適当であると思われる
。

【００１２】細胞を基にしたワクチンの第２の型及び本発明の目的は、患者にとって遺伝的
に（そしてそれ故に免疫学的に）不適合な同種細胞の使用を記載する。同種細胞
は自己細胞と同一な多価の利点にする恩恵を受ける。更に、同種細胞のワクチン
がｉｎｖｉｔｒｏで無期限に培養されうる不死化細胞系に基くことがある場合
、次の様に、この試みは自己組織を用いる試みのリードタイム及び費用上の不利
を被らない。同様に、同種間の試みは、疾患の段階の観点から見た個体の疾患の
プロファイル、病巣の位置及び他の治療に対する潜在的な抵抗性に適合しうる細
胞型の組み合わせを使用する機会を提供する。

【００１３】細胞を基にしたガンワクチンの利用の、多くの刊公された報告が存在している
（例えば、Dranoff, G. et al. WO93/06867; Gansbacher, P. WO94/18995; Jaff
ee, E. M. et al. WO97/24132; Mitchell, M. S. WO90/03183; Morton, D. M. e
t al. WO91/06866を参照のこと）。これらの研究は、ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−２、
インターフェロン又は他の免疫学的に活性な分子を産生するための細胞のトラン
スフェクション及び「自殺」遺伝子の使用に対する、免疫療法の抗原としてガン
細胞を用いる基本的な方法に由来する変形の範囲を包含する。集団は、患者のハ
プロタイプに対してＨＬＡ適合又は部分的に適合する同種細胞系及び更にメラノ
ーマの領域の患者のハプロタイプに対して不適合な同種細胞系及び更にＧＭ−Ｃ
ＳＦでトランスフェクションした不適合な同種の前立腺細胞系を使用した。

【００１４】本発明の説明本明細書で開示する本発明は、ヒトの前立腺ガンの処置のための同種間の免疫
療法剤としての使用を意図した細胞系の特異的な組み合わせを含んで成る生成物
に関する。本明細書に記載の免疫療法の異種性は標的前立腺ガンの抗原性プロフ
ァイルに適合し、そして疾患の様々な段階で発現する多くの潜在的なＴＡＡ及び
ＴＳＡで受容者を免疫化する。本細胞系は次の特徴を有する適当な細胞系から選
択される：細胞が不死化され、元の前立腺又は転移性の前立腺が大規模な細胞培
養において良好な増殖を示し、そして構成細胞系の質の調節及び再現性のある製
造を許容することがよく特徴づけられている。

【００１５】本明細書に開示されている本発明は更に、上述した細胞系の組み合わせを含ん
で成る生成物に関し、前記細胞系は、意図される患者の集団と最大のハプロタイ
プの不適合を許容する様に選択され、それによって最大の同種間の可能性及び続
く、前記生成物に対する免疫応答を保証する。

【００１６】説明される本発明は、原発性又は転移性の前立腺ガンの生検材料から、当業界
で知られている方法を用いて調製し（Rhim, J. S. and Kung, H-F., 1997 Criti
cal Reviews in Oncogenesis 8(4): 305-328において概説され、そして引用され
ている）、そして／あるいは表１に列記したＡ群（原発性の前立腺ガンの病巣に
由来する細胞系）及びＢ群（転移性の前立腺ガンの病巣に由来する細胞系）から
選択した３つの異なる細胞系の組み合わせを含んで成るワクチンを開示する。

【００１７】１つの態様において、細胞系の組み合わせは原発性の前立腺ガンの病巣に由来
する３つの異なる細胞系から成る。

【００１８】別の態様において、前記の組み合わせは、原発性の前立腺ガンの病巣に由来す
る２つの異なる細胞系及び転移性の前立腺ガンの病巣に由来する１つの細胞系か
ら成る。

【００１９】別の態様において、前記の組み合わせは、転移性の前立腺ガンの病巣に由来す
る２つの異なる細胞系と組み合わせた原発性の前立腺ガンの病巣に由来する１つ
の細胞系から成る。

【００２０】更なる態様において、前記の組み合わせは、転移性の前立腺ガンの病巣に由来
する３つの異なる細胞系から成る。

【００２１】前記細胞は、それらが複製不可能となることを保証する、５０〜３００Gyのガ
ンマ線照射を用いて致死的に照射される。

【００２２】免疫療法剤として有用であるべき前記細胞系及び上述した組み合わせは、輸送
及び貯蔵を許容するために凍結されねばならず、故に本発明の更なる観点は、凍
結保護溶液で調製される上述した細胞のいずれかの組み合わせにある。適当な凍
結保護溶液は、限定しないが１０〜３０％ｖ／ｖ水性グリセロール溶液、５〜２
０％ｖ／ｖジメチルスルホキシド又は５〜２０％ｗ／ｖヒト血清アルブミンを含
むことがあり、これらを単一の凍結保護剤として又は組み合わせて、そのいずれ
かで使用することもある。

【表１】

【００２３】本発明の更なる態様は、非特異的な免疫賦活剤、例えばＢＣＧ又はＭ．バッカ
エ（Ｖａｃｃｅ）、破傷風毒素、ジフテリア毒素、百日咳菌、インターロイキン
２、インターロイキン１２、インターロイキン４、インターロイキン７、フロイ
ント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント又は当業界で知られてい
る他の非特異的な薬剤と組み合わせた細胞系の使用にある。一般的な免疫賦活剤
が一般的に増強されている免疫状態を作り出し、一方、細胞系の組み合わせが、
それらのハプロタイプの不適合を介して免疫の増強に加わり、そしてそれらの特
異的な起源の異種性の結果として過剰なＴＡＡ及びＴＳＡに対する免疫応答を標
的にすることが利点である。

【００２４】本発明は次の例、及び図に関して記述される。

【００２５】例１細胞の増殖、照射、調製及び保存原発性の前立腺組織に由来する不死化した細胞系、すなわちＮＩＨ１５４２−
ＣＰ３ＴＸは、液体窒素貯蔵からの回収後、２５μｇ／mlウシ下垂体抽出物、５
ng／mlの上皮増殖因子、２mM Ｌ−グルタミン、１０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液及び
５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＫＳＦＭ培地（以降、「修飾ＫＳＦＭ」
と称する）中での回転びん培養で増殖した。Ｔ１７５静置フラスコでの培養後、
１７００cm² の増殖表面積を有する回転びん中に、回転びん当たり２〜５×１０ ⁷ で播種した。

【００２６】２つの転移由来の細胞系、すなわちＬｎＣａｐ及びＤＵ１４５も使用し、これ
らは共にＡＴＣＣ起源である。ＬｎＣａｐは、容器当たり１〜１０×１０⁶ 細胞
での播種後に、１０％ＦＣＳ及び２mM Ｌ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ培地
中で、大きな表面積の静置フラスコでほぼコンフルコントになるまで増殖した。
Ｄｕ−１４５は、静置フラスコにおいて冷凍貯蔵物から増大させ、そして次に８
５０cm² の回転びん中に、びん当たり１〜２０×１０⁷ 細胞で播種し、そして１
０％ＦＣＳ及び２mM Ｌ−グルタミンを含むＤＭＥＭ培地でコンフルコントにな
るまで増殖した。

【００２７】全ての細胞系が、１倍の標準的な濃度のトリプシンを用いて採集された。ＤＭ
ＥＭ中での広範囲の洗浄の後、前記細胞を１０〜４０×１０⁶ 細胞／mlの濃度で
再懸濁され、そしてＣｏ⁶⁰源を用いて５０〜３００Gyで照射された。照射後、前
記細胞は１０％ＤＭＳＯ，８％ヒト血清アルブミン／リン酸緩衝塩溶液から成る
凍結保護溶液中で調製し、そして１分当たり１℃の割合で冷却することによって
１５〜５０×１０⁶ 細胞／mlの細胞濃度で凍結し、そして次に使用が必要とされ
るまで液体窒素の冷凍器に移した。

【００２８】ワクチン接種前立腺ガンの患者は、３０ng／mlの血清ＰＳＡレベルでのホルモン治療に対す
る抵抗性に基づいて選択される。倫理的な許可及びＭＣＡ〔イギリスの薬剤管理
機関（ＵＫＭｅｄｉｃｉｎｅＣｏｎｔｒｏｌＡｇｅｎｃｙ）〕の認可は、
１５人の患者においてこの試験を行うために請求され、そして得られた。

【００２９】ワクチン接種計画は次の通りである：

【表２】

【００３０】前記細胞は３７℃の水溶中でおだやかに暖められ、そして患者への注射の前に
放線菌のアジュバントと混合された。注射は、流入領域リンパ節のくぼみに、４
つの注射部位で皮内から行った。投与間の最小の間隔は２週間であり、そして投
与の多くは４週の間隔で与えられた。最初の投与の前に、そしてそのいくつか後
の投与の前に、患者は上文のワクチン接種計画に列記した３つの細胞系及びＰＮ
Ｔ２（ＥＣＡＣＣに起源を有する不死化した正常な表皮細胞系）に対する遅延型
過敏（ＤＴＨ）について試験された（全ての試験がアジュバント無しで０．８×
１０⁶ 個の細胞を含む）。

【００３１】免疫学的応答の解析（ａ）Ｔ細胞の増殖応答ワクチン接種がワクチン接種した細胞系に由来する抗原を認識したＴ細胞集団
の特異的な増大をもたらしたかどうかを決定するために、我々は前立腺細胞系の
溶解液による賦活化の後、Ｔ細胞上での増殖アッセイを行った。全細胞はクリニ
ックを訪れる各人から抽出し、そして後述するＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジ
ン）に基づいた増殖アッセイにおいて使用した。

【００３２】患者のＢｒｄＵ増殖法

【表３】

【００３３】方法１）１mlの血液を９mlのＲＰＭＩ＋２mM Ｌ−ｇｌｎ＋ＰＳ＋５０μＭ２−Ｍ
ｅで希釈する。血清を加えない。３７℃で一晩放置する。２）次の朝、４５０μｌの希釈血液を４８穴プレートに分割し、そして５０μｌ
の賦活溶解液を加える。前記溶解液は、腫瘍細胞（２×１０⁶ 細胞等価物／ml）
を液体窒素中で３回凍結融解し、そして続いて必要になるまで凍結してアリコー
トを保存することによって作製した。３）３７℃で５日間細胞を培養する。４）５日目の晩に、３０μｇ／mlのＢｒｄＵを５０μｌ加える。５）１００μｌの各試料を９６穴丸底プレートに分割する。６）プレートを遠心し、そして上清を除く。７）室温で５分間、１００μｌのＰｈａｒｍａｌｙｓｅを用いて赤血球を溶解す
る。８）５０μｌのＣｙｔｏｆｉｘで２回洗浄する。９）遠心し、そして上清を軽くはじいて除去する。１０）１００μｌのＰｅｒｍ洗浄液で、室温で１０分間透過処理をする。１１）Ｐｅｒｍ洗浄液で体積を合わせる補正希釈時の抗体を含んで成る、３０μ
ｌの抗体混合物を加える。１２）暗がりにおいて室温で３０分間インキュベートする。１３）１回洗浄し、そして１００μｌの２％パラホルムアルデヒド中で再懸濁す
る。１４）これを解析の準備ができたクラスターチューブ中の４００μｌのＦＡＣＳ
フローに加える。１５）３０００回のＣＤ３の事象を保有する、ＦＡＣＳスキャンで解析する。

【表４】

【表５】

【表６】

【００３４】増殖アッセイの結果は図１に示され、ここでＣＤ４又はＣＤ８のいずれかにポ
ジティブなＴ細胞の増殖指数は様々な細胞の溶解液に対して示され、前記の増殖
指数は溶解液無しのコントロールによるＴ細胞の増殖の割合で割ることで導かれ
る。

【００３５】患者番号２０２及び２０５の結果を示す。４つの細胞溶解液、すなわちＮＩＨ
１５４２，ＬｎＣａｐ，ＤＵ−１４５及びＰＮＴ−２（不死化した正常な前立腺
の表皮細胞系）の結果を与える。結局、処置した患者のうち５０％がＮＩＨ１５
４２−ＣＰ３ＴＸ，ＬｎＣａｐ及びＤＵ−１４５に対して多少、そしてＰＮＴ−
２に対してもいくつかの場合において特異的な増殖を増している。

【００３６】（ｂ）患者の血清を利用するウエスタンブロット標準化した細胞溶解液は、ウエスタンブロット解析のための変性ＳＤＳＤＡ
ＧＥゲル上に同様のタンパク量を添加することを可能にするために、いくつかの
前立腺細胞系について調製された。各ブロットは、分子量マーカー、並びにＮＩ
Ｈ１５４２，ＬｎＣａｐ，Ｄｕ−１４５及びＰＮＴ−２の細胞溶解液由来の等量
のタンパク質が添加された。このブロットは、続いてワクチン接種前及びワクチ
ン接種の１６週後（４〜６回の投与）の患者の血清でプローブした。

【００３７】方法ａ）試料の調製（前立腺の腫瘍系）・細胞のペレットをＰＢＳ中で３回洗浄する。・１×１０⁷ 細胞／ml溶解緩衝液で再懸濁する。・液体窒素／水溶中での素速い凍結融解に５サイクル通す。・細胞片を除去するために５分間１５００rpm で遠心する。・膜混入物を除去するために３０分間２０，０００rpm で超遠心する。・２００μｌに分割し、そして−８０℃で保存する。

【００３８】ｂ）ゲル電気泳動・溶解液をＬａｅｍｅｌｌｉの試料緩衝液と１：１で混合し、そして５分間煮沸
する。・４〜２０％のグラジエンドゲルの穴に２０μｇの試料を添加する。・Ｂｊｅｒｒｕｍ及びＳｃｈａｆｅｒ−Ｎｉｅｌｓｏｎのトランスファー緩衝液
（ＳＤＳを含む）中で、２００Ｖで３５分間ゲルを流す。

【００３９】ｃ）ウエスタントランスファー・トランスファー緩衝液中で１５分間、ゲル、ニトロセルロース膜及びブロッテ
ィングペーパーを平衡化する。・セミドライの電気泳動トランスファーセルの陽極上のゲル−ニトロセルロース
サンドイッチを並べる：２枚のブロッティングペーパー、ニトロセルロース膜、
ゲル、２枚のブロッティングペーパー。・陰極をかけ、そして２５Ｖで９０分間流す。

【００４０】ｄ）タンパク質の免疫学的検出・４℃で一晩、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中の５％Ｍａｒｖｅｌでニ
トロセルロース膜をブロッキングする。・ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で膜を２回すすぎ、続いて室温で２０
分間及び２×５分間、振盪プラットホーム上で洗浄する。・振盪プラットホーム上で室温で１２０分間、明らかにした患者の血漿の1：２
０希釈液中で膜をインキュベートする。・５分の最終洗浄を加えて、上文の様に洗浄する。・振盪プラットホーム上で室温で９０分間、ビオチン抗ヒトＩｇＧ又はＩｇＭの
１：２５０希釈液中で膜をインキュベートする。・５分の最終洗浄を加えて、上文の様に洗浄する。・振盪プラットホーム上で室温で６０分間、ストレプトアビジン−西洋クサビペ
ルオキシダーゼ結合体の１：１０００希釈液中で膜をインキュベートする。・上文の様に洗浄する。・発色させるために、５分間ジアミノベンジジンペルオキシダーゼ基質中で膜を
インキュベートし、膜を水ですすぐことで反応を停止させる。

【００４１】抗ＩｇＧ２次抗体でプローブした、患者２０１及び２０３についてのウエスタ
ンブロットの結果を図２に示す。この図は、４つの細胞溶解液を用いた各患者に
ついて基準線及び１６週の時点を各ブロット上で示す。

【００４２】全体的に、少なくとも４〜６回の投与を受けた患者の５０％以上が、ワクチン
接種前に存在しているバンド及び／又は前記血清によって認識される、広範囲に
わたる数のバンドの強度の増大を示した。

【００４３】特に注目すべきものは、ワクチン接種法（ＤＴＨ試験以外）の一部を形成しな
かったＰＮＴ２溶解液に対する、患者２０１及び２０３由来の血清の反応性であ
るが、それにもかかわらず両方の患者の血清においてＮＩＨ１５４２，ＬｎＣａ
ｐ及びＤＵ１４５と共通の抗原を共有する様である。

【００４４】（ｃ）抗体の力価の決定抗体の力価は、標準化した細胞系でＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、そ
して前記の細胞系でワクチン接種した患者由来の血清に対する希釈研究を行うこ
とで決定した。

【００４５】抗溶解液ＩｇＧを用いるＥＬＩＳＡの方法１．次の希釈を用いて、５０μｌ／穴溶解液（１０μｇ／ml）でプレートをコ
ートする。

【表７】２．カバーをし、そして４℃で一晩インキュベートする。３．２回ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄する。乾燥させるためにペーパータオル上で
プレートをたたく。４．ＰＢＳ／１０％ＦＣＳでブロックする（１００μｌ／穴）。５．カバーし、そして室温で１時間（最低）インキュベートする。６．ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２回洗浄する。７．１００μｌのＰＢＳ−１０％ＦＣＳを列２〜８に加える。８．２００μｌの血漿試料（ＰＢＳ−１０％ＦＣＳ中で１／１００希釈、すなわ
ち１０μｌの血漿を９９０μｌのＰＢＳ−１０％ＦＣＳに加えたもの）を列１に
加え、そしてプレートの下方向への１００μｌの連続希釈を行う。一番下の穴か
ら過剰な１００μｌを除く。カバーし、そして冷蔵庫で一晩インキュベートする
。９．ビオチン化した抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｒ；ＩｇＧ３４１６２Ｄ）を最
終濃度１mg／mlに希釈する（すなわち２０ml／１０ml）。１０．カバーし、そして室温で４５分間インキュベートする。１１．上文の様に６回洗浄する。１２．ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｒ，１３０４７ＥＯ
；１：１０００希釈）に希釈する（すなわち１０ml−＞１０ml）。１３．穴当たり１００mlを加える。１４．室温で３０分間インキュベートする。１５．８回洗浄する１６．穴当たり１００ml基質を加える。室温で１０〜８０分展開する。１７．１００mlの１ＭＨ₂ＳＯ₄を加えることで発色反応を停止する。１８．４０５nmでＯＤを読み取る。

【００４６】結果（図３）は、少なくとも４〜６回の投与によるワクチン接種の後、患者が
細胞系の溶解液に対する抗体の力価の増大を示すことがあることを示す。

【００４７】（ｄ）ＰＳＡレベルの評価前記ワクチンを受けた患者のＰＳＡレベルは、試験開始時及びワクチン接種を
通して、慣習的に使用されている臨床用キットを用いて記録した。患者２０１及
び２０８のＰＳＡは図４に示され、そしてこの患者の群において通常、しばしば
指数関数的に上昇し続けるＰＳＡ値の落ち込み又は安定化を表す。患者２０１の
結果は、骨の痛みを軽減するための放射線治療によっていくらか混乱するが、Ｐ
ＳＡ値は放射線治療前に有意に落ち込んだ。

【００４８】例２本発明は更に初期の前立腺ガンの患者に使用されることがあり、そしてこの免
疫療法は異なる経路で投与されることもある。例えば、次のプロトコールが使用
されうる：

【００４９】細胞は、例１に記載の方法に従い増殖され、照射され、調製され、そして保存
される。前立腺ガン患者は、根治的な前立腺切除の前に選択され、そして３つの
照射された細胞系の組み合わせ（８×１０⁶ 細胞／系）を用いて、手術前に２週
間隔で３回ワクチン接種される。約半分の患者が流入領域リンパ節のくぼみに皮
内からワクチン接種され（少なくとも最初の投与時に放射菌のアジュバントと混
合した細胞系）；残りの患者は、少なくとも最初の投与時に遠位での皮内放射菌
アジュバント投与と一緒に、前立腺内に注射される。手術によって摘出した前立
腺の生検試料は、前立腺細胞の死及び浸潤している免疫細胞の存在について試験
される。更に、Ｔ細胞の機能、ウエスタンブロット解析及び抗体の力価は、例１
の方法に従い決定される。血清ＰＳＡはこれらの患者において、時間を空けて測
定される。

【００５０】このプロトコールに従い、免疫学的応答が検出されうる。更に、前立腺細胞の
死は外科的な生検において検出されうる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は患者番号２０２及び２０３のＴ細胞増殖データを示す。

【図２】図２は患者番号２０１及び２０３由来の血清のウエスタンブロット解析を示す
。

【図３】図３は患者番号２０１由来の血清の抗体の力価を示す。

【図３（続き）】図３（続き）は患者番号２０１由来の血清の抗体の力価を示す。

【図４】図４は患者２０１及び２０８のＰＳＡデータを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 47/42 Ａ６１Ｋ 47/42 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 37/02 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｘ 15/01 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者スミス，ピーターマイケルイギリス国，ロンドンエスダブリュ17 ０ダブリュジー，クランマーテラス，セントジョージズホスピタルメディカルスクール，ピー．オー．ボックス 17717，オニバックスリミティド (72)発明者サットン，アンドリューデレクイギリス国，ロンドンエスダブリュ17 ０ダブリュジー，クランマーテラス，セントジョージズホスピタルメディカルスクール，ピー．オー．ボックス 17717，オニバックスリミティド (72)発明者ウォーカー，アンソニーイーアンイギリス国，ロンドンエスダブリュ17 ０ダブリュジー，クランマーテラス，セントジョージズホスピタルメディカルスクール，ピー．オー．ボックス 17717，オニバックスリミティドＦターム(参考） 4B065 AA93X AB10 AC20 BA16 BA24 BB01 BC01 CA45 4C076 AA12 BB16 BB32 DD38 DD55 EE41 FF39 FF63 4C085 AA02 AA03 AA38 BB01 CC01 DD07 DD23 DD24 FF03 FF13 FF19 FF20 4C087 AA01 AA02 BB40 CA04 MA01 MA66 MA67 NA14 ZB07 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】３つのヒト前立腺腫瘍細胞系を含んで成る前立腺ガンの処置
のための免疫療法剤であって、このうちの１つの細胞系が原発腫瘍に由来し、そ
して他の２つの細胞系が転移組織に由来する免疫療法剤。
【請求項２】３つのヒト前立腺腫瘍細胞系を含んで成る前立腺ガンの処置
のための免疫療法剤であって、このうちの１つの細胞系が原発腫瘍に由来し、そ
して他の２つの細胞系が２つの異なる転移組織に由来する免疫療法剤。
【請求項３】３つのヒト前立腺細胞系を含んで成る前立腺ガンの処置のた
めの免疫療法剤であって、この３つの細胞系が１，２又は３つの原発腫瘍に由来
する免疫療法剤。
【請求項４】３つのヒト前立腺細胞系を含んで成る前立腺ガンの処置のた
めの免疫療法剤であって、このうちの２つの細胞系が１又は２つの原発腫瘍に由
来し、そして他の細胞系が転移組織に由来する免疫療法剤。
【請求項５】３つのヒト前立腺腫瘍細胞系を含んで成る前立腺ガンの処置
のための免疫療法剤であって、このうちの３つの細胞系が転移組織に由来する免
疫療法剤。
【請求項６】３つのヒト前立腺腫瘍細胞系を含んで成る前立腺ガンの処置
のための免疫療法剤であって、このうちの３つの細胞系が２又は３つの異なる転
移組織に由来する免疫療法剤。
【請求項７】原発腫瘍由来の１又は複数の腫瘍細胞系がＮＩＨ１５１９−
ＣＰＴＸ，ＮＩＨ１５３２−ＣＰ２ＴＸ，ＮＩＨ１５３５−ＣＰ１ＴＸ，ＮＩＨ
１５４２−ＣＰ３ＴＸ及びＣＡ−ＨＰＶ−１０から選択される、請求項１〜４の
いずれか１項に記載の免疫療法剤。
【請求項８】転移組織由来の１又は複数の腫瘍細胞系がＬｎＣａｐ，ＤＵ
１４５又はＰＣ３から選択される、請求項１，２，４，５及び６のいずれか１項
に記載の免疫療法剤。
【請求項９】３つの細胞系、すなわちＮＩＨ１５４２−ＣＰ３ＴＸ，ＤＵ
１４５及びＬｎＣａｐを含んで成る前立腺ガンの処置のための免疫療法剤。
【請求項１０】前記の腫瘍細胞系が５０〜３００Gyで照射された、請求項
１〜９のいずれか１項の免疫療法剤。
【請求項１１】前記の腫瘍細胞系が１００〜１５０Gyで照射された、請求
項１〜９のいずれか１項に記載の免疫療法剤。
【請求項１２】放線菌調製物、例えばＢＣＧ又はＭ．バッカエ（Ｖａｃｃ
ａｅ）、破傷風毒素、ジフテリア毒素、百日咳菌、インターロイキン２、インタ
ーロイキン１２、インターロイキン４、インターロイキン７、完全フロイントア
ジュバント、不完全フロイントアジュバント又は他の非特異的薬剤アジュバント
から選択されるワクチンアジュバントと組み合わせた、請求項１〜１１のいずれ
か１項に記載の免疫療法剤を含んで成る免疫原性組成物。
【請求項１３】放線菌調製物、例えばＢＣＧ又はＭ．バッカエから選択さ
れるワクチンアジュバントと組み合わせた、請求項１〜１１のいずれか１項に記
載の免疫療法剤を含んで成る免疫原性組成物。
【請求項１４】前記細胞が、限定しないが１０〜３０％ｖ／ｖの水性グリ
セロール溶液、５〜２０％ｖ／ｖジメチルスルホキシド又は５〜２０％ｗ／ｖの
ヒト血清アルブミンを単一の凍結保護物質として又は組み合わせで、そのいずれ
かで含む凍結保護溶液で調製される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の免
疫療法剤又は組成物。
【請求項１５】前記細胞が、５〜２０％ｖ／ｖジメチルスルホキシド及び
５〜２０％ｗ／ｖのヒト血清アルブミンを組み合わせて含む、凍結保護溶液で調
製される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の免疫療法剤又は組成物。
【請求項１６】免疫Ｔ細胞の活性化を特徴とする患者の免疫応答を誘導す
る、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の免疫療法剤又は組成物。
【請求項１７】抗体産生の誘導を特徴とする患者の免疫応答を誘導する、
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の免疫療法剤又は組成物。
【請求項１８】前立腺ガンの患者の血清ＰＳＡのレベルにおいて、増加又
は減少の速度で低下を誘導する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の免疫療
法剤又は組成物。
【請求項１９】皮内投与される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の
免疫療法剤又は組成物。
【請求項２０】前立腺内に投与される、請求項１〜１８のいずれか１項に
記載の免疫療法剤又は組成物。
【請求項２１】生理学的に許容される補形薬、アジュバント又は担体と一
緒に、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の免疫療法剤を含んで成るか又はそ
れから成る、前立腺ガンの処置のための免疫療法ワクチン組成物。
【請求項２２】適当な剤形の１又は複数回投与で、請求項１〜２２のいず
れか１項に記載の免疫療法剤又は組成物を患者に投与することを含む、前立腺ガ
ンの予防又は処置の方法。
【請求項２３】ヒトの前立腺ガンの処置のための薬剤の製造における、請
求項１〜１１のいずれか１項に記載の免疫療法剤の使用。