NO326035B1 - Allogent immunterapeutisk middel, agens, sammensetning og vaksine for behandling av prostatakreft, og anvendelse av disse. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse omhandler agens for behandlingen av primær-, metastatisk- og restkreft i pattedyr (inkludert mennesker) ved å indusere immunsystemet i pattedyr eller mennesker som har kreft til å utløse et angrep mot kreftskaden. Spesielt omhandler oppfinnelsen hele celler, derivater og deler derav, med eller uten vaksineadjuvanser og/eller andre hjelpefaktorer. Mer spesielt angir beskrivelsen anvendelsen av spesielle kombinasjoner av hele celler og derivater og deler derav som danner basisen for behandlingsstrategi.

Det er kjent i feltet at kreftceller inneholder flere mutasjoner, kvalitative og kvantitative, romlig og temporalt, relativt til sine normale, ikke-kreftaktige motparter og at i visse perioder under kreftcellers vekst og spredning er en del av disse i stand til å bli gjenkjent av vertens immunsystem som unormale. Dette har ført til flere forskningsforsøk verden over for å utvikle immunterapier som innehar kraften fra vertens immunsystem og retter den mot å angripe kreftcellene, og derved eliminere slike skadde celler, i det minste til et nivå som ikke er livstruende (gjennomgått i Maraveyas, A. & Dalgleish, A.G., 1977, Active immunotherapy for solid tumours in vaccine design in The Role of Cytokine Networks, red. Gregoriadis et al., Plenum Press, New York, sidene 129-145; Morton, D.L. og Ravindranath, M.H., 1996, Current concepts concerning melanoma vaccines in Tumor Immunology - Immunotherapy and Cancer Vaccines, red. Dalgleish, A.G. og Browning, M., Cambridge University Press, sidene 241-268. Se også andre artikler i disse publikasjonene for ytterligere detaljer).

Flere tilnærmingsmåter har vært benyttet i forsøket på kreftimmunterapier, og disse kan bli klassifisert i fem kategorier:

Ikke-spesifikk immunterapi

Forsøk på å stimulere immunsystemet ikke-spesifikt daterer seg et århundre tilbake til pionerarbeidet til William Coley (Coley, W.B., 1894, Treatment of inoperable malignant tumours with toxins of erisipelas and the Bacillus prodigosus, Trans. Am. Surg. Assoc. 12: 183). Selv om det er suksessrikt i et begrenset antall med tilfeller

(for eksempel BCG for behandling av urinblærekreft, IL-2 for behandlingen av melanom og nyrekreft), er det bredt akseptert at ikke-spesifikk immunmodulering sannsynligvis ikke vil være tilstrekkelig for å behandle hoveddelen av krefttilfeller. Mens ikke-spesifikke immunstimulerende midler kan føre til en generelt økt tilstand av immunrespons, mangler de den målrettende evnen, og også subtiliteten, for å hamle opp med kreftskader som har mange mekanismer og plastisitet for å invadere, motstå og nedbryte (subvert) immunovervåkning.

Antistoffer og monoklonale antistoffer

Passiv immunterapi i form av antistoffer, og spesielt monoklonale antistoffer, har vært tema for betydelig forskning og utvikling som antikreftagens. Selv om de opprinnelig ble hyllet som den magiske kulen (magic bullet) som følge av sin utmerkede spesifisitet, har monoklonale antistoffer av et antall ulike årsaker inkludert immunrespons for antistoffene selv (som derved hemmer deres aktivitet) og manglende evne av antistoffene til å ha tilgang til skader gjennom blodårene, mislykkes i å leve opp til forventningene innen kreftimmunterapifeltet. Pr. i dag har tre produkter blitt registrert som farmasøytika for human anvendelse, nemlig Panorex (Glaxo-Wellcome), Rituxan (IDEC/Genentech/Hoffman la Roche), og Herceptin (Genentech/Hoffman la Roche) med over 50 andre prosjekter i forsknings- og utviklingsstrømningen. Antistoffer kan også bli benyttet i aktiv immunterapi ved å utnytte anti-idiotypantistoffer, som synes å etterligne (på en immunologisk måte) kreftantigener. Selv om dette konseptet er elegant, kan utnyttelsen av antistoffbaserte tilnærmingsmåter til sist vise seg å være begrenset av fenomenet med «immunologisk flukt», der en undergruppe av kreftceller i pattedyr eller menneskelige subjekter muterer og mister antigenet som gjenkjennes av det spesielle antistoffet, og derved kan føre til utveksten av en populasjon med kreftceller som ikke lenger er behandlbare med det antistoffet.

Subenhetvaksiner

Ved å trekke på erfaringen med vaksiner for infeksiøse sykdommer på andre områder, har mange forskere søkt å identifisere antigener som eksklusivt eller fortrinnsvis er assosiert med kreftceller, nemlig tumorspesifikke antigener (TSA) eller tumorassosierte antigener (TAA), og å anvende slike antigener eller fraksjoner derav som basis for spesifikk aktiv immunterapi.

Det finnes flere måter å identifisere proteiner eller peptider avledet derfrå på, som faller i kategorien av TAA eller TSA. For eksempel er det mulig å utnytte forskjellige displayteknikker der RNA-ekspresjon blir sammenlignet med tumorvev og nærliggende normalt vev for å identifisere RNA'er som eksklusivt eller fortrinnsvis blir uttrykt i skaden. Sekvensering av RNA har identifisert flere TAA og TSA som er uttrykt i det spesifikke vevet og på det spesifikke tidspunktet, men deri ligger den mulige mangelen i tilnærming og ved at identifisering av TAA eller TSA kun representerer et «øyeblikksbilde» («snapshot») av skaden på det gitte tidspunktet, som ikke nødvendigvis tilveiebringer adekvat refleksjon av antigenprofilen i skaden over tid. På samme måte har en kombinasjon av cytotoksisk T-lymfocytt (CTL) kloning og ekspresjonskloning av cDNA fra tumorvev ført til identifiseringen av mange TAA og TSA, spesielt i melanom. Tilnærmingen lider av de samme innebygde svakhetene som ulike displayteknikker, ved at identifiseringen av kun én TAA eller TSA ikke kan tilveiebringe en passende representasjon av en klinisk relevant antigenprofil.

Over femti slike subenhetsvaksinetilnærminger er under utvikling for behandling av et stort spekter av kreft, selv om ingen ennå har mottatt markedsføringstillatelse for anvendelse som et humant farmasøytisk produkt. På samme måte som den som er beskrevet for antistoffbaserte tilnærminger ovenfor, kan subenhetvaksiner også bli begrenset av fenomenet med immunologisk flukt.

Genterapi

De viktigste genterapiforsøkene i humane subjekter har vært på området med kreftbehandling, og av disse har en vesentlig del blitt utviklet for å trigge og/eller oppformere pasienters immunrespons. Spesielt verdt å merke seg i kommersiell utvikling er Allovectin-7 og Leuvectin, som er utviklet av Vical Inc. for et spekter av menneskelige tumorer, CN706 som er utviklet av Calydon Inc. for behandlingen av prostatakreft og StressGen Inc. sin stressproteingenterapi for melanom og lungekreft. På det nåværende tidspunkt er det for tidlig å vurdere hvorvidt disse og mange andre «immun-genterapier» under utvikling av kommersielle og akademiske enheter, endelig vil vise seg å være suksessfulle, men det er bredt akseptert at kommersiell nytte av disse tilnærmingsmåtene sannsynligvis er mer enn et tiår frem i tid.

Cellebaserte vaksiner

Tumorer har den bemerkelsesverdige evnen til å motvirke immunsystemet på en mengde måter, inkludert: Nedregulering av ekspresjonen av potensielle målproteiner; mutasjon av potensielle målproteiner; nedregulering av overflateekspresjon av reseptorer og andre proteiner; nedregulering av MHC klasse I og II-ekspresjon, og derved ikke tillate direkte presentasjon av TAA- eller TSA-peptider; nedregulering av ko-stimulerende molekyler som fører til ufullstendig stimulering av T-celler som fører til anergi; skyggelegging av selektive, ikke-representative membrandeler for å virke som lokkemiddel for immunsystemet; skjuling av selektive membrandeler for å anergisere immunsystemet; sekresjon av inhibitoriske molekyler; induksjon av T-celledød; og mange andre måter. Det som er klart, er at den immunologiske heterogeniteten og plastisiteten av tumorer i kroppen vil måtte tilpasses til en viss grad immunterapeutiske strategier som på lignende måte innlemmer heterogenitet. Anvendelsen av hele kreftceller, eller rå derivater derav, som kreftimmunterapier, kan bli sett på som analoger til anvendelsen av hele inaktiverte eller attenuerte virus som vaksiner mot virussykdommer. De potensielle fordelene er: (a) hele celler inneholder et vidt spekter av antigener, som tilveiebringer en antigenprofil med en tilstrekkelig heterogenitet for å tilpasse den til skadene som beskrevet ovenfor; (b) ved å være multivalente (det vil si inneholder multiple antigener), blir risikoen for immunologisk flukt er redusert (sannsynligheten for at kreftceller «mister» alle disse antigenene er liten); og (c) cellebaserte vaksiner inkluderer TSA'er og TAA'er som fremdeles må

identifiseres som sådan; det er mulig, selv om det ikke er sannsynlig, at nåværende ikke-identifiserte antigener kan være mer relevante klinisk enn det relativt lille antallet med TAS'er/TAA'er som er kjent.

Cellebaserte vaksiner faller i to kategorier. Den første, basert på autologe celler, involverer fjerningen av en biopsi fra en pasient, dyrking av tumorcellene in vitro, å modifisere celler gjennom transfeksjon og/eller andre metoder, å bestråle cellene for å gjøre dem replikasjonsufullstendige og deretter injisere cellene tilbake i den samme pasienten som en vaksine. Selv om denne tilnærmingsmåten har fått vesentlig oppmerksomhet i løpet av det siste tiåret, har det vært blitt mer og mer klart at denne individtilpassede terapien er innebygget upraktisk av flere grunner. Tilnærmingen er tidkrevende (ofte vil tiden for å fremstille kliniske doser av vaksiner overstige pasientens antatte levetid), dyr, og som et «skreddersydd» produkt er det ikke mulig å spesifisere et standardisert produkt (kun prosedyren, ikke produktet, kan bli standardisert og således optimalisert og kvalitetskontrollert). Videre vil tumorbiopsien som benyttes for å fremstille den autologe vaksinen ha visse vekstkarakteristika, interaksjoner og kommunikasjoner med omkringliggende vev som gjør den noe unik. Dette hentyder til en potensielt signifikant ulempe ved anvendelsen av autologe celler for immunterapi: En biopsi som tilveiebringer de initielle cellene representerer et immunologisk øyeblikksbilde av tumoren, i det miljøet, på det tidspunktet, og dette kan være ikke-adekvat som en immunologisk representasjon over tid med den hensikt å fremstille en vaksine med forlenget aktivitet som blir gitt over hele sykdomsforløpet.

Den andre typen av cellebasert vaksine, og temaet for den foreliggende oppfinnelsen, beskriver anvendelsen av allogene celler som er genetisk (og således immunologisk) feiltilpasset (mismatched) til pasientene. Allogene celler drar fordel av de samme fordelene med multivalens som autologe celler. I tillegg, ettersom allogene cellevaksiner kan baseres på udødelige cellelinjer som kan bli dyrket uendelig in vitro, lider denne tilnærmingsmåten således ikke av ledetiden og kostnadsulempene ved autologe tilnærmingsmåter. På samme måte tillater den allogene tilnærmingsmåten muligheten for å anvende kombinasjoner av celletyper som kan koble sykdomsprofilen hos et individ i form av stadium på sykdommen, lokaliseringen av skaden og potensiell motstand mot andre terapier.

Det er flere publiserte rapporter på utnyttelsen av cellebaserte kreftvaksiner (se for eksempel Dranoff, G. et al., WO 93/06867; Gansbacher, P., WO 94/18995; Jaffee, E.M. et al., WO 97/24132; Mitchell, M.S., WO 90/03183; Morton, D.M. et al., WO 91/06866, WO-A1-9728255). Disse studiene omfatter et spekter av variasjoner fra basisprosedyren med å anvende kreftceller som et immunterapiagens, til å transfektere cellene og produsere GM-CSF, IL-2, interferoner eller andre immunologisk aktive molekyler, og anvendelsen av «selvmords »-gener. Grupper har benyttet allogene cellelinjer som er HLA-tilpassede eller delvis tilpassede til pasientens haplotype, og også allogene cellelinjer som er feiltilpasset til pasientens haplotype i feltet med melanom og også feiltilpassede allogene prostatacellelinjer transfektert med GM-CSF.

Det beskrives heri et produkt omfattet av spesifikke kombinasjoner av cellelinjer tenkt for anvendelse som et allogent immunterapiagens for behandlingen av prostatakreft i mennesker. Heterogeniteten til immunterapeutikumet beskrevet heri matcher heterogeniteten til den antigene profilen i målprostatakreften, og immuniserer mottakeren med mange av de potensielle TAA og TSA som er uttrykt på ulike trinn i sykdommen. Cellelinjene er valgt fra passende cellelinjer som viser de følgende karakteristika: Cellene er udødelige, prostata eller metastatisk prostata i opprinnelse, viser god vekst i storskala cellekultur, og er godt karakterisert, noe som tillater kvalitetskontroll og reproduserbar produksjon av komponentcellelinj ene.

Det beskrives også heri omhandler også et produkt som omfatter en kombinasjon av cellelinjer beskrevet over, der cellelinjene er valgt for å tillate maksimum feiltilpassing av haplotype med den tiltenkte pasientpopulasjonen, noe som sikrer maksimum allogent potensial og påfølgende immunrespons for produktet.

Det beskrives også en vaksine som omfatter en kombinasjon av tre ulike cellelinjer fremstilt fra primært eller metastatisk prostatakreftbiopsimateriale ved å benytte fremgangsmåter kjent i faget (gjennomgått og sitert i Rhim, J.S. og Kung, H-F., 1997, Critical Review in Oncogenesis 8(4): 305-328), og/eller valgt fra gruppe A (cellelinjer avledet fra primære prostatakreftskader) og gruppe B (cellelinjer avledet fra metastatiske prostatakreftskader) listet opp i tabell 1.

Nærmere bestemt omfatter den foreliggende oppfinnelse et allogent immunterapeutisk middel for behandlingen av prostatakreft som omfatter tre humane prostata tumorcellelinjer der en celle linje er avledet fra en primærtumor og de to andre cellelinjene er avledet fra metastatisk vev. I en utførelsesform omfatter den foreliggende oppfinnelse et allogent immunterapeutisk middel der de to andre cellelinjene er avledet fra to forskjellige metastatiske vev.

I ytterligere en annen utførelsesform omfatter den foreliggende oppfinnelse et allogent immunterapeutisk agens for behandlingen av prostatakreft omfattende tre humane prostata tumorcellelinjer der to cellelinjer er avledet fra en eller to primærtumor(er) og den andre cellelinjen er avledet fra et metastatisk vev. I en utførelsesform er tumorcellelinjene omfattet av det allogene immunterapeutiske agens blitt bestrålt ved 50 til 300 Gy. I følge en annen utførelsesform er de nevnte tumorcellelinjene har blitt bestrålt ved 100 til 150 Gy.

I følge ytterligere en utførelsesform omfatter den foreliggende oppfinnelse en allogen immunogen vaksinesammensetning for behandling av prostatakreft, hvori sammensetningen omfatter eller inneholder et middel i følge hvilket som helst av de foregående krav sammen med et fysiologisk akseptabel eksipient, adjuvans eller bærer.

I henhold til en annen utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse en allogen immunogen sammensetning som omfatter et immunterapeutisk middel i følge oppfinnelsen kombinert med et vaksineadjuvans valgt fra et mycobakterielle preparat, tetanustoksoid, difteritoksoid, Bordetella Pertussis, interleukin 2, interleukin 12, interleukin 4, interleukin 7, komplett Freunds adjuvans, ukomplett Freunds adjuvans eller andre ikke-spesifikke adjuvanser.

I henhold til en utførelsesform er det immunterapeutiske middelet er kombinert med et vaksineadjuvans valgt fra mycobakterielle preparater så som BCG eller M. Vaccae.

I henhold til en annen utførelsesform omfatter oppfinnelsen et immunterapeutisk middel eller sammensetning der cellene er formulert med en kryobeskyttende løsning inkludert, men ikke begrenset til 10-30% volum/volum vandig glyserolløsning, 5-20% volum-volum dimetylsulfoksid eller 5-20% vekt/volum humant serum albumin, enten som separate kryobeskyttere eller i kombinasjon.

I henhold til ytterligere en annen utførelsesform omfatter oppfinnelsen et immunterapeutisk middel eller sammensetning hvori cellene er formulert med en kryobeskyttende løsning som inkluderer 5-20% volum/volum dimetylsulfoksid og 5-20% vekt/volum humant serum albumin i kombinasjon.

I følge ytterligere en annen utførelsesform omfatter oppfinnelsen et immunterapeutisk middel eller sammensetning som induserer en immunrespons i pasienter ved at immune T-celler aktiveres.

I følge ytterligere en utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse et immunterapeutisk middel eller sammensetning som induserer en immunrespons i pasienter ved at antistoffproduksjon induseres.

Oppfinnelsen omfatter også et immunterapeutisk middel eller sammensetning som induserer en reduksjon i hastigheten på stigningen eller en nedgang i nivået av serum PSA i prostatakreftpasienter.

Endelig omfatter den foreliggende oppfinnelse en anvendelse av et middel oppfinnelsen til fremstillingen av et medikament for den allogene behandlingen av human prostatakreft.

Cellelinjene blir dødelig bestrålt ved å benytte gammastråling ved 50-300 Gy for å sikre at de er replikasjonsinkompetente.

Cellelinjer og kombinasjoner listet opp over må, for å være nyttige som immunterapiagens, bli frosset for å tillate transportering og lagring, derfor er et ytterligere aspekt ved den foreliggende oppfinnelsen en hvilken som helst kombinasjon av celler referert til over formulert med en kryobeskyttende løsning. Passende kryobeskyttende løsninger kan inkludere, men ikke være begrenset til, 10-30% volum/volum vandig glyserolløsning, 5-20% volum/volum dimetylsulfoksid eller 5-20% vekt/volum menneskelig serum albumin, som kan bli benyttet enten som enkle kryobeskyttere eller i kombinasjon.

En ytterligere utforming av oppfinnelsen er anvendelsen av cellelinjekombinasjoner med ikke-spesifikke immunstimulatorer så som BCG eller M. Vaccae, tetanus toksoid, difteri toksoid, Bordetella Pertussis, interleukin 2, interleukin 12, interleukin 4, interleukin 7, fullstendig Freunds adjuvans, ufullstendig Freunds adjuvans eller andre ikke-spesifikke agens kjent i faget. Fordelen er at de generelle immunstimulatorene danner en generelt økt immunstatus, mens kombinasjonene av cellelinjer, både adderer til immunforsterkning gjennom sin haplotypefeiltilpassing, og målretter immunresponsen til en overflod av TAA og TSA som et resultat av heterogeniteten av deres spesifikke opprinnelser.

Foreliggende oppfinnelse gjelder dermed et allogent immunterapeutisk middel for behandlingen av prostatakreft, som er kjennetegnet ved at det omfatter tre humane prostata tumorcellelinjer der en celle linje er avledet fra en primærtumor og de to andre cellelinjene er avledet fra metastatisk vev.

Oppfinnelsen gjelder videre et allogent immunterapeutisk agens for behandlingen av prostatakreft, som er kjennetegnet ved at det omfatter tre humane prostata tumorcellelinjer der to cellelinjer er avledet fra en eller to primærtumor(er) og den andre cellelinjen er avledet fra et metastatisk vev.

I tillegg omfatter oppfinnelsen en allogen immunogen vaksinesammensetning for behandling av prostatakreft, som er kjennetegnet ved at den omfatter eller inneholder et middel i følge hvilket som helst av de foregående krav sammen med et fysiologisk akseptabel eksipient, adjuvans eller bærer.

Oppfinnelsen vedrører også en allogen immunogen sammensetning, som er kjennetegnet ved at den omfattende et immunterapeutisk middel i følge hvilket som helst av kravene 1-5 kombinert med et vaksineadjuvans valgt fra et mycobakterielle preparat, tetanustoksoid, difteritoksoid, Bordetella Pertussis, interleukin 2, interleukin 12, interleukin 4, interleukin 7, komplett Freunds adjuvans, ukomplett Freunds adjuvans eller andre ikke-spesifikke adjuvanser.

Oppfinnelsen angår også anvendelse av et middel i følge oppfinnelsen i fremstillingen av et medikament for den allogene behandlingen av human prostatakreft

Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet med referanse til de følgende eksemplene, og figurene, der: Figur 1 viser T-celleproliferasjonsdata for pasient nr. 202 og 205; Figur 2 viser Western blot-analyser for serum fra pasient nr. 201 og 203;

Figur 3 viser antistofftiter av serum fra pasient nr. 201; og

Figur 4 viser PSA-data for pasientene 201 og 208.

EKSEMPEL 1

Vekst, bestråling, formulering og lagring av celler

En udødeliggjort cellelinje avledet fra primært prostatavev, nemlig NIH1542-CP3TX, ble dyrket i rulleflaskekultur i KSFM-medium supplert med 25 ug/ml bovint hypofyseekstrakt, 5 ng/ml med epidermal vekstfaktor, 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES-buffer og 5% føtalt kalveserum (FCS) (heretter kalt «modifisert KSFM») etter gjenvinning fra flytende nitrogenstamløsninger. Etter ekspansjon i Tl 75 statiske flasker ble cellene sådd i rulleflasker med et vekstoverflateareal på 1,700 cm<2> ved 2-5 x IO<7> celler pr. rulleflaske.

To metastaseavledede cellelinjer ble også benyttet, nemlig LnCap og Dul45, begge med kilde fra ATCC. LnCap ble dyrket i store overflatearealstatiske flasker i RPMI-medium supplert med 10% FCS og 2 mM L-glutamin etter såing ved 1-10 x 10 celler pr. flaske, og deretter dyrket til nesten konfluens. Dul45 ble ekspandert fra frosne stamløsninger i statiske flasker og deretter sådd i 850 cm2 rulleflasker ved 1-20 x IO<7> celler pr. flaske, og dyrket til konfluens i DMEM-medium som inneholdt 10% FCS og 2 mM L-glutamin.

Alle cellelinjene ble høstet ved å benytte trypsin ved lx normal konsentrasjon. Etter nøye vasking i DMEM ble cellene resuspendert ved en konsentrasjon på 10-40 x IO<6> celler/ml, og bestrålt ved 50-300 Gy ved å benytte en Co<60->kilde. Etter bestråling ble cellene formulert i kryobevarende løsning som besto av 10% DMSO, 8% humant serum albumin i fosfatbufret saltløsning, og frosset ved en cellekonsentrasjon på 15-50 x IO<6> celler/ml ved kjøling med en hastighet på 1°C pr. minutt, og deretter overført til en flytende nitrogenfryser inntil de skulle benyttes.

Vaksinering

Prostatakreftpasienter ble valgt på basis av å være motstandsdyktige mot hormonterapi med et serum PSA-nivå på 30 ng/ml. Etisk tillatelse og MCA- (UK Medicines Control Agency) autorisering ble søkt og oppnådd for å utføre denne testen på 15 pasienter.

Vaksineringsregimet var som følger:

Cellene ble varmet forsiktig i vannbad ved 37°C og tilblandet med mycobakteriell adjuvans før injeksjon i pasienter. Injeksjoner ble gjort intradermalt ved fire injeksjonsseter til drenerende lymfeknutebasseng. Minimumsintervall mellom dosene var to uker, og mesteparten av dosene ble gitt med intervaller på fire uker. Før den første dosen, og før noen påfølgende doser, ble pasientene testet for forsinket-type hypersensitivitet (DTH) mot de tre cellelinjene listet opp i vaksineringsplanen over, og også mot PNT2 (en udødelig normal prostata epitelcellelinje med kilde fra ECACC) (alle tester involverte (0,8 x IO6 celler uten adjuvans).

Analyse av immunologisk respons

(a) T- celleproliferasi onrespons

For å bestemme hvorvidt vaksinering resultere i en spesifikk ekspansjon av T-cellepopulasjoner som gjenkjente antigener avledet fra de vaksinerende cellelinjene, utførte vi et proliferasjonsassay på T-celler etter stimulering med lysater av prostatacellelinjene. Helblod ble ekstrahert ved hvert besøk på klinikken og anvendt i et BrdU- (bromdeoksyuridin) basert proliferasjonsassay som beskrevet nedenfor:

Metode

1) Fortynnet 1 ml blod med 9 ml RPMI + 2 mM L-gln + PS + 50 |am 2-Me. Ikke tilsett serum. La stå over natten ved 37°C. 2) Påfølgende morgen, porsjoner 450 |J,1 med fortynnet blod til brønner på en 48 brønners plate, og tilsett 50 [il med stimulerende lysat. Lysatet blir laget ved å fryse-tine tumorceller (2 x IO6 celleekvivalenter/ml) x3 i flytende nitrogen, og deretter lagre porsjoner frosne inntil de kreves.

3) Dyrk cellene ved 37°C i 5 dager.

4) Om kvelden den 5. dagen tilsett 50 (il BrdU @ 30 ug/ml.

5) Porsjoner 100 fj.1 av hver prøve i en 96 brønners rundbunnet plate.

6) Spinn platen og hell av supernatanten.

7) Lyser røde celler ved å benytte 100 ^il Pharmlyse i 5 minutter ved romtemperatur.

8) Vask x2 med 50 \ il med Cytofix.

9) Spinn og fjern supernatanten ved knipsing.

10) Permeabiliser med 100 ul Perm-vask i 10 minutter ved romtemperatur. 11) Tilsett 30 ul med antistoffblanding som omfatter antistoffer med korrekt fortynning laget opp til volum med Perm-vask.

12) Inkuber i 30 minutter i mørke ved romtemperatur.

13) Vask xl og resuspender i 100 ul 2% paraformaldehyd.

14) Tilsett dette til 400 ul FACSFlow i klaserør klare for analyse.

15) Analyser på FACScan, lagring 3000 portstyrt CD3-hendelser.

6 brønners plate for stimulering

Resultatene for poliferasjonsassayene er vist på figur 1 der en proliferasjonsindeks for enten CD4- eller CD8-positive T-celler er plottet mot de ulike cellelysatene, proliferasjonsindeksen blir utledet ved å dele gjennom prosenten av T-celler som prolifererer med ikke-lysatkontrollen.

Resultater er vist for pasient nr. 202 og 205. Resultater er gitt for fire cellelysater, nemlig NIH1542, LnCap, DU-145 og PNT-2 (en udødelig normal prostataepitelcellelinje). Samlet sett utløser 50% av pasientene som blir behandlet en spesifikk proliferativ respons på NIH1542-CP3TX, LnCap og DU-145 til en viss grad, og i noen tilfeller også mot PNT-2.

(b) Western Blot som ben<y>tter pasienters serum

Standardiserte cellelysater ble fremstilt for et antall med prostatacellelinjer for å muliggjøre lignende mengder av protein å bli lastet på en denaturert SDS PAGE-gel for Western Blot-analyse. Hvert blot ble lastet med molekylvektmarkører, og like mengder av protein avledet fra cellelysater av NIH1542, LnCap, DU-145 og PNT-2. Blotet ble deretter probet med serum fra pasienter avledet fra prevaksinering og påfølgende 16 ukers vaksinering (fire til seks doser).

Metode

a) Prøvepreparering (prostata tumorlinjer)

<*> Vask cellepelleter 3 ganger i PBS.

<*> Resuspender ved en 1 x IO<7> celler/ml med lyseringsbuffer.

<*> Passer gjennom 5 sykluser med rask frysing-tining, lyser i flytende nitrogen/vannbad.

<*> Sentrifuger ved 1500 rpm i 5 minutter for å fjerne cellerester.

<*> Ultrasentrifuger ved 20 000 rpm i 30 minutter for å fjerne membrankontaminanter.

<*> Porsjoner til 200 ul og lagre ved -80°C.

b) Gelelektroforese

Lysater blandet 1:1 med Laermelli prøvebuffer og kokt i 5 minutter.

20 ug prøver lastet på 4-20% gradientgelbrønner.

Geler kjørt i Bjerrum og Schafer-Nielson overføringsbuffer (med SDS) ved 200 V i 35 minutter.

c) Western-overføring

Geler, nitrocellulosemembraner og blottingpapir ekvilibrert i

overføringsbuffer i 15 minutter.

Arranger gel-nitrocellulosesandwich på anode av semi-tørre elektroforetiske overføringsceller: 2 lag med blottingspapir, nitrocellulosemembran, gel, 2 flak med blottingspapir.

Sett på katode og kjør ved 25 V i 90 minutter.

d) Immunologisk deteksjon av proteiner

<*> Blokker nitrocellulosemembraner over natten ved 4°C med 5% Marvel i

PBS/0/0,5% Tween 20.

<*> Rens membranene to ganger i PBS/0/0,5%Tween 20, vask deretter i 20 minutter og 2 x 5 minutter ved romtemperatur på risteplattform.

Inkuber membraner i 1:20 fortynning med klart pasientplasma i 120

minutter ved romtemperatur på en risteplattform.

Vask som over med ytterligere 5 minutters sluttvask.

Inkuber membraner i 1:250 fortynning av biotin anti-humant IgG eller IgM

i 90 minutter ved romtemperatur på en risteplattform.

Vask som over med ytterligere 5 minutters sluttvask.

<*> Inkuber membraner i 1:1000 fortynning med streptavidin-pepperrotperoksidasekonjugat i 60 minutter ved romtemperatur på en risteplattform.

<*> Vask som over.

<*> Inkuber membranene i diaminobenzidinperoksidasesubstrat i 5 minutter for å tillate fargeutvikling, stopp reaksjonen ved å rense membranen med vann.

Resultater av Western Blot probet med anti-IgG andre antistoffer (second antibodies) for pasienter 201 og 203 er vist på figur 2. Figuren viser basislinjen og uke 16 tidspunkter for hver pasient med fire cellelysater på hvert blot.

Samlet sett, i pasienter som mottok minst fire til seks doser, viste over 50% en økning i intensitet av bånd som var tilstede før vaksinering og/eller en utviding av antallet bånd som ble gjenkjent av serumet.

Spesielt å merke seg er reaktiviteten til serum fra pasienter 201 og 203 mot PNT2-lysat, som ikke danner del av vaksineringsregimet (annet enn DTH-testing), men ikke desto mindre synes å dele felles antigener med NIH1542, LnCap og DU145 i begge pasienters serum.

(c) Antistofftiterbestemmelse

Antistofftiter ble bestemt ved å belegge ELISA-plater med standardiserte cellelinjelysater og å utføre fortynningsstudier på serum fra pasienter vaksinert med cellelinjene.

Metode for ELISA med anti- lysat IgG

1. Belegg plater med 50 ul/brønnlysater (@ 10 ug/ml) ved å benytte de følgende fortynningene:

2. Dekk til og inkuber over natten ved 4°C.

3. Vask x2 PBS-Tween. Dunk platene på papirhåndklær for å tørke.

4. Blokker med PBS/10% FCS (100 ul/brønn).

5. Dekk og inkuber ved romtemperatur i 1 time (minimum).

6. Vask x2 PBS-Tween.

7. Tilsett 100 ul PBS-10% FCS til radene 2-8.

8. Tilsett 200 ul plasmaprøve (fortynnet 1 i 100 i PBS-10% FCS, det vil si 10 ul plasma tilsatt til 990 ul PBS-10% FCS) til rad 1 og gjør serier på 100 ul fortynninger ned til planten som under. Hell av ekstra 100 ul fra bunnbrønn. Dekk til og inkuber i kjøleskap over natten. 9. Fortynn biotinylert antistoff (Pharmingen; IgG 34162D) det vil si sluttkonsentrasjon 1 mg/ml (det vil si 20 ml i 10 ml).

10. Dekk til og inkubert ved romtemperatur i 45 minutter.

11. Vask x 6 som over.

12. Fortynn streptavidin-HRP (Pharmingen, 13047E 0; fortynn 1:1000 (det vil si

10 ml -> 10 ml)).

13. Tilsett 100 ml/brønn.

14. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.

15. Vaskx8.

16. Tilsett 100 ml substrat/brønn. Tillat å utvikle i 10-80 minutter ved romtemperatur.

17. Fargereaksjon stoppet ved å tilsette 100 ml 1 M H2SO4.

18. Les OD ved A405 nm.

Resultatene (figur 3) viser at etter vaksinering med minst fire til seks doser kan pasientene vise en økning i antistofftiter mot cellelinjelysater.

(d) Evaluering av PSA- nivåer

PSA-nivåer for pasienter som mottok vaksinen ble målt ved inngangen til forsøket og gjennom hele forløpet med vaksinering, ved å benytte rutinemessig benyttede kliniske sett. PS A-verdiene for pasienter 201 og 208 er vist på figur 4 og skildrer en nedgang eller stabilisering av PSA-verdiene, som i denne gruppen av pasienter vanligvis fortsetter å stige, ofte eksponensielt. Resultatet for pasient 201 er noe forvirret av radioterapibehandlingen for å hindre bensmerte, selv om PSA-nivået hadde falt signifikant før radio terapi.

EKSEMPEL 2

Oppfinnelsen kan også bli anvendt på tidlig stadium prostatakreftpasienter, og immunterapi kan også bli administrert gjennom ulike veier. Som et eksempel kan den følgende protokollen bli benyttet: Celler blir dyrket, bestrålt, formulert og lagret i henhold til fremgangsmåtene beskrevet i eksempel 1. Prostatakreftpasienter blir valgt før radikal prostataektomi og blir vaksinert med en kombinasjon av tre bestrålte cellelinjer (8 x IO<6> celler pr. linje) tre ganger med to ukers intervaller før kirurgi. Omkring halvparten av pasientene blir vaksinert intradermalt i fire drenerende lymfeknutebassenger (cellelinjer blandet med mycobakteriell adjuvans iallfall for den første dosen); gjenværende pasienter blir injisert intra-prostatale, med intradermalt mycobakteriell adjuvans administrert på et annet sted iallfall for den første dosen. Biopsiprøver av prostataen fjernet ved kirurgi blir studert for prostatacelledød, og nærværet av infiltrerende immunceller. I tillegg blir T-cellefunksjon, Western Blot-analyse og antistofftiter bestemt i henhold til fremgangsmåten i eksempel 1. Serum PSA blir også målt ved intervaller i disse pasientene.

Ved å følge denne protokollen kan immunologisk respons bli påvist. I tillegg kan død av prostataceller bli påvist i kirurgiske biopsier.

Claims (14)

1. Allogent immunterapeutisk middel for behandlingen av prostatakreft, karakterisert ved at det omfatter tre humane prostata tumorcellelinjer der en celle linje er avledet fra en primærtumor og de to andre cellelinjene er avledet fra metastatisk vev.

2.. Allogent immunterapeutisk middel ifølge krav 1, karakterisert ved at de to andre cellelinjene er avledet fra to forskjellige metastatiske vev.

3. Allogent immunterapeutisk agens for behandlingen av prostatakreft, karakterisert ved at det omfatter tre humane prostata tumorcellelinjer der to cellelinjer er avledet fra en eller to primærtumor(er) og den andre cellelinjen er avledet fra et metastatisk vev.

4. Immunterapeutisk agens som angitt i kravene 1-3, karakterisert ved at tumorcellelinjene har blitt bestrålt ved 50 til 300 Gy.

5. Immunterapeutisk agens som angitt i kravene 1-3, karakterisert ved at tumorcellelinjene har blitt bestrålt ved 100 til 150 Gy.

6. Allogen immunogen vaksinesammensetning for behandling av prostatakreft karakterisert ved at den omfatter eller inneholder et middel i følge hvilket som helst av de foregående krav sammen med et fysiologisk akseptabel eksipient, adjuvans eller bærer.

7. Allogen immunogen sammensetning, karakterisert ved at den omfattende et immunterapeutisk middel i følge hvilket som helst av kravene 1-5 kombinert med et vaksineadjuvans valgt fra et mycobakterielle preparat, tetanustoksoid, difteritoksoid, Bordetella Pertussis, interleukin 2, interleukin 12, interleukin 4, interleukin 7, komplett Freunds adjuvans, ukomplett Freunds adjuvans eller andre ikke-spesifikke adjuvanser.

8. Immunogen sammensetning i følge krav 7, karakterisert ved at det immunterapeutiske middelet er kombinert med et vaksineadjuvans valgt fra mycobakterielle preparater så som BCG eller M. Vaccae.

9. Immunterapeutisk middel eller sammensetning i følge kravene 1-8, karakterisert ved at cellene er formulert med en kryobeskyttende løsning inkludert, men ikke begrenset til 10-30% volum/volum vandig glyserolløsning, 5-20% volum-volum dimetylsulfoksid eller 5-20% vekt/volum humant serum albumin, enten som separate kryobeskyttere eller i kombinasjon.

10. Immunterapeutisk middel eller sammensetning i følge kravene 1-8, karakterisert ved at cellene er formulert med en kryobeskyttende løsning som inkluderer 5-20% volum/volum dimetylsulfoksid og 5-20% vekt/volum humant serum albumin i kombinasjon.

11. Immunterapeutisk middel eller sammensetning i følge kravene 1-10, som induserer en immunrespons i pasienter, karakterisert ved aktivering av immune T-celler.

12. Immunterapeutisk middel eller sammensetning som angitt i kravene 1-10 som induserer en immunrespons i pasienter, karakterisert ved induksjon av antistoffproduksjon.

13. Immunterapeutisk middel eller sammensetning som angitt i kravene 1-10, karakterisert ved at den induserer en reduksjon i hastigheten på stigningen eller en nedgang i.nivået av serum PS A i prostatakreftpasienter.

14. Anvendelse av et middel i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 5 i fremstillingen av et medikament for den allogene behandlingen av human prostatakreft.