ES2315024T3

ES2315024T3 - Nuevos tratamientos para el cancer.

Info

Publication number: ES2315024T3
Application number: ES99959548T
Authority: ES
Inventors: Angus George Onyvax Limited DALGLEISH; Peter Michael Onyvax Limited SMITH; Andrew Derek Onyvax Limited SUTTON; Anthony Ian Onyvax Limited WALKER
Original assignee: Onyvax Ltd
Current assignee: Onyvax Ltd
Priority date: 1998-12-10
Filing date: 1999-12-09
Publication date: 2009-03-16
Anticipated expiration: 2019-12-09
Also published as: NZ512005A; IL143295A; WO2000033870A2; AU1668700A; CA2354046C; EP1137434A2; GB9827103D0; HUP0104857A3; NO326035B1; JP2002531521A; ZA200104163B; NO20012818D0; PL348829A1; ATE412425T1; IL143295A0; HUP0104857A2; AU777969B2; WO2000033870A3; CZ20012033A3; KR100612552B1

Abstract

Un agente inmunoterápico alogénico para el tratamiento del cáncer de próstata que comprende tres líneas celulares de tumor de próstata humano de las que una línea celular procede de un tumor primario y las otras dos líneas celulares proceden de tejido metastásico.

Description

Nuevos tratamientos para el cáncer.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a agentes para el tratamiento de cáncer primario, metastásico y residual en mamíferos (incluyendo seres humanos) por inducción del sistema inmune del mamífero o ser humano aquejado de cáncer para organizar un ataque contra la lesión tumoral. En particular, la invención pertenece al uso de células completas con o sin adyuvantes de vacunas y/u otros factores accesorios. Más particularmente, esta descripción describe el uso de combinaciones particulares de células completas que forman la base de la estrategia de tratamiento.

Antecedentes de la invención

Se conoce en el campo que las células cancerosas contienen numerosas mutaciones, cualitativas y cuantitativas, espaciales y temporales, con respecto a sus homólogas normales no cancerosos y que, en determinados periodos durante el crecimiento y la propagación de células tumorales, una proporción de éstas es capaz de ser reconocida por el sistema inmune del hospedadora como anormal. Esto ha conducido a numerosos esfuerzos de investigación por todo el mundo para desarrollar inmunoterapias que aprovechen el poder del sistema inmune del hospedador y lo dirijan para atacar las células cancerosas, eliminando de este modo dichas células anormales, al menos hasta un nivel que no suponga un riesgo para la vida (revisado en Maraveyas, A. y Dalgleish, A. G. 1977 Active Immunotherapy for solid tumors in vaccine design in The Role of Cytokine Networks, Ed. Gregoriadis et al., Plenum Press, Nueva York, páginas 126-145; Morton, D. L. y Ravindranath, M. H. 1996 Current concepts concerning melanoma vaccines in Tumor Immunology - Immunotherapy and Cancer Vaccines, ed. Dalgleish, A. G. y Browsing, M., Cambridge University Press, páginas 241-268. Véanse también otros artículos en estas publicaciones para detalles adicionales).

Se han adoptado numerosas estrategias en la búsqueda de inmunoterapias para el cáncer, y estos se han clasificado en cinco categorías:

Inmunoterapia inespecífica

Los esfuerzos para estimular el sistema inmune inespecíficamente se remontan más de un siglo al trabajo pionero de William Coley (Coley, W. B., 1894 Teatment of inoperable malignant tumours with toxins of erisipelas and the Bacillus prodigosus. Trans. Am. Surg. Assoc. 12: 183). Aunque tiene éxito en un número limitado de casos (por ejemplo, BCG para el tratamiento del cáncer de vejiga urinaria, IL-2 para el tratamiento del melanoma y de cáncer renal) es ampliamente reconocido que es poco probable que la inmunomodulación inespecífica demuestre ser suficiente para tratar la mayoría de los cánceres. Aunque los estimulantes del sistema inmune inespecíficos pueden conducir a un estado mejorado general de sensibilidad inmune, carecen de la capacidad de dirección y también de la perspicacia para tratar con lesiones tumorales que tienen muchos mecanismos y plasticidad para evadir, resistir y subvertir la inmunovigilancia.

Anticuerpos y anticuerpos monoclonales

La inmunoterapia pasiva en forma de anticuerpos y, particularmente, anticuerpos monoclonales ha sido objeto de una investigación y un desarrollo considerable como agentes anticancerosos. Originariamente aclamados como la bala mágica debido a su exquisita especificidad, los anticuerpos monoclonales han fracasado a la hora de cumplir con sus expectativas en el campo de la inmunoterapia del cáncer por varias razones, incluyendo respuestas inmunes contra los propios anticuerpos (anulando por lo tanto su actividad) y la incapacidad del anticuerpo para acceder a la lesión a través de los vasos sanguíneos. Hasta la fecha, se han registrado tres productos como agentes farmacéuticos para uso en seres humanos, en concreto, Panorex (Glaxo-Wellcome), Rituxan (IDEC/Genentech/Hoffman la Roche) y Herceptin (Genentech/Hoffman la Roche), con más de 50 otros proyectos en la línea de investigación y desarrollo. Los anticuerpos también pueden emplearse en la inmunoterapia activa utilizando anticuerpos antiidiotipo que parecen mimetizar (en un sentido inmunológico) antígenos cancerosos. Aunque son elegantes en concepto, la utilidad de estrategias basadas en anticuerpos puede demostrar estar limitada en última instancia por el fenómeno de "escape inmunológico", en el que un subconjunto de células cancerosas en un mamífero o sujeto humano muta y pierde el antígeno reconocido por el anticuerpo particular y, por lo tanto, puede conducir al sobrecrecimiento de una población de células cancerosas que ya no pueden tratarse con ese anticuerpo.

Vacunas de subunidades

Basándose en la experiencia en vacunas para enfermedades infecciosas y otros campos, muchos investigadores han buscado identificar antígenos que se asocien de forma exclusiva o preferente con células cancerosas, en concreto antígenos específicos de tumores (TSA) o antígenos asociados con tumores (TAA) y el uso de dichos antígenos o fracciones de los mismos como la base para una inmunoterapia activa específica.

Existen numerosas formas de identificar proteínas o péptidos derivados de las mismas que entran dentro de la categoría de TAA o TSA. Por ejemplo, es posible utilizar técnicas de presentación diferencial en las que la expresión de ARN se compara entre tejido tumoral y tejido normal adyacente para identificar ARN que se expresen de forma exclusiva o preferente en la lesión. La secuenciación del ARN ha identificado varios TAA y TSA que se expresan en ese tejido específico en ese momento específico, pero en eso mismo reside la deficiencia potencial de la estrategia, en que la identificación del TAA o TSA representa sólo una "fotografía" de la lesión en cualquier momento dado que puede no proporcionar un reflejo adecuado del perfil antigénico en la lesión a lo largo del tiempo. De forma similar, una combinación de clonación de linfocitos T citotóxicos (CTL) y clonación-expresión de ADNc de tejido tumoral ha conducido a la identificación de muchos TAA y TSA, particularmente en melanomas. La estrategia se ve afectada por la misma debilidad intrínseca que las técnicas de presentación diferencial, por el hecho de que la identificación de un solo TAA o TSA puede no proporcionar una representación apropiada de un perfil antigénico clínicamente
relevante.

Están en desarrollo más de cincuenta de dichas estrategias de vacunas de subunidades para el tratamiento de una amplia variedad de cánceres, aunque ninguna ha recibido todavía autorización de comercialización para uso como un producto farmacéutico humano. De una forma similar a la descrita para estrategias basadas en anticuerpos anteriormente, las vacunas de subunidades también pueden estar limitadas por el fenómeno de escape inmunológico.

Terapia génica

La mayoría de los ensayos de terapia génica en sujetos humanos han sido en el área del tratamiento del cáncer y, de éstos, una proporción sustancial se ha diseñado para desencadenar y/o amplificar respuestas inmunes en los pacientes. Son de especial importancia en el desarrollo comercial Alovectina 7 y Leuvectina, desarrollados por Vical Inc para una variedad de tumores humanos, CN706 desarrollado por Calydon Inc para el tratamiento del cáncer de próstata y terapia génica con proteína de estrés de StressGen Inc para melanomas y cáncer de pulmón. En el momento actual, es demasiado pronto para juzgar si estas y muchas otras "terapias inmunogénicas" en desarrollo por organismos comerciales y académicos demostrarán tener éxito en última instancia, pero está ampliamente aceptado que la utilidad comercial de estas estrategias está probablemente a más de una década de distancia.

Vacunas basadas en células

Los tumores tienen la extraordinaria capacidad de contrarrestar el sistema inmune de una diversidad de formas que incluyen: regulación negativa de la expresión de proteínas diana potenciales; mutación de las proteínas diana potenciales; regulación negativa de la expresión en superficie de receptores y otras proteínas; regulación negativa de la expresión de MHC de clase I y II, impidiendo de este modo la presentación directa de péptidos TAA o TSA; regulación negativa de moléculas coestimuladoras, que conduce a la estimulación incompleta de células T conduciendo a la anergia; supresión de porciones de membrana selectivas no representativas para actuar como señuelo para el sistema inmune; supresión de porciones de membrana selectivas para generar anergia en el sistema inmune; secreción de moléculas inhibidoras; inducción de muerte de células T; y muchas otras formas. Lo que está claro es que la heterogenicidad y plasticidad inmunológica de los tumores en el cuerpo debe igualarse en cierta medida por estrategias inmunoterapéuticas que incorporen una heterogenicidad similar. El uso de células cancerosas completas o derivados brutos de las mismas como inmunoterapias para el cáncer puede observarse como análogo al uso de virus inactivados o atenuados completos como vacunas frente a enfermedades víricas. Las ventajas potenciales son:

(a) células completas que contienen una amplia variedad de antígenos, proporcionando un perfil antigénico de una heterogenicidad suficiente para igualar a la de las lesiones que se han descrito anteriormente,

(b) ser multivalente (es decir, contener múltiples antígenos), el riesgo de escape inmunológico se reduce (la probabilidad de que las células cancerosas "pierdan" todos los antígenos es remota); y

(c) las vacunas basadas en células incluyen TSA y TAA que todavía tienen que identificarse como tales; es posible, si no probable, que los antígenos actualmente no identificados puedan ser clínicamente más relevantes que el número relativamente pequeño de TSA/TAA que se conocen.

Las vacunas basadas en células entran dentro de dos categorías. La primera, basada en células autólogas, implica la extirpación de una biopsia de un paciente, el cultivo de células tumorales in vitro, la modificación de las células a través de la transfección y/o otros medios, la irradiación de las células para hacerlas incompetentes para la replicación y, después, la inyección de las células de nuevo en el mismo paciente como una vacuna. Aunque este enfoque disfrutó de una atención considerable en la última década, se ha hecho cada vez más evidente que esta terapia confeccionada individualmente es intrínsecamente impráctica por varias razones. La estrategia requiere mucho tiempo (con frecuencia el plazo de entrega para producir dosis clínicas de vacuna supera la esperanza de vida del paciente), costoso y, como un producto "hecho a medida", no es posible especificar un producto normalizado (solamente el procedimiento, no el producto, puede normalizarse y, por lo tanto, optimizarse y controlarse la calidad). Además, la biopsia tumoral usada para preparar la vacuna autóloga tendrá ciertas características de crecimiento, interacciones y comunicación con tejidos circundantes que la hacen en cierto modo única. Esto alude a una desventaja potencialmente significativa para el uso de células autólogas para inmunoterapia: una biopsia que proporciona las células iniciales representa una fotografía inmunológica del tumor en ese entorno en ese momento en el tiempo, y esto puede ser inadecuado como una representación inmunológica a lo largo del tiempo con el fin de una vacuna con actividad sostenida que pueda administrarse durante el curso completo de la enfermedad.

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El segundo tipo de vacuna basada en células y el sujeto de la presente invención describe el uso de células alogénicas que estén genéticamente (y por lo tanto, inmunológicamente) emparejadas erróneamente con los pacientes. Las células alogénicas se benefician de ciertas ventajas de multivalencia como células autólogas. Además, puesto que las vacunas de células alogénicas pueden basarse en líneas celulares inmortalizadas que pueden cultivarse indefinidamente in vitro, por lo tanto esta estrategia no experimenta las desventajas de plazo de entrega y coste de las estrategias autólogas. De forma similar, la estrategia alogénica ofrece la oportunidad de usar combinaciones de tipos celulares que pueden coincidir con el perfil de enfermedad de un individuo en términos de fase de la enfermedad, la localización de la lesión y la resistencia potencial a otras terapias.

Existen numerosos informes publicados de la utilidad de vacunas para el cáncer basadas en células (véase, por ejemplo, Dranoff, G. et al., WO 93/06867; Gansbacher, P. WO 94/18995; Jaffee, E. M. et al., WO 97/24132; Mitchell, M. S. WO 90/03183; Morton, D. M. et al., WO 91/06866). Estos estudios abarcan un intervalo de variaciones desde el procedimiento de base de uso de células cancerosas como un antígeno para inmunoterapia, hasta la transfección de las células para producir GM-CSF, IL-2, interferones u otras moléculas inmunológicamente activas y el uso de genes "suicida". Algunos grupos han usado líneas celulares alogénicas que son de HLA emparejado o parcialmente emparejado con el haplotipo de los pacientes y también líneas celulares alogénicas que están erróneamente emparejadas con el haplotipo de los pacientes en el campo del melanoma, y también líneas celulares de próstata alogénicas emparejadas erróneamente transfectadas con GM-CSF.

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Descripción de la invención

La invención descrita en este documento se refiere a un producto que comprende combinaciones específicas de líneas celulares destinadas al uso como un agente inmunoterápico alogénico para el tratamiento del cáncer de próstata en seres humanos. La heterogenicidad del inmunoterápico descrito en este documento iguala a la heterogenicidad del perfil antigénico en el cáncer de próstata diana e inmuniza a los destinatarios con muchos de los TAA y TSA potenciales que se expresan en diversas fases de la enfermedad. Las líneas celulares se seleccionan a partir de líneas celulares apropiadas que poseen las siguientes características: las células se inmortalizan, de origen prostático o prostático metastásico, muestran un buen crecimiento en cultivos celulares a gran escala, y están bien caracterizadas, permitiendo el control de calidad y una producción reproducible de las líneas celulares componentes.

La invención descrita en este documento también se refiere a un producto que comprende una combinación de líneas celulares descritas anteriormente mediante la cual las líneas celulares se seleccionan para permitir el emparejamiento erróneo máximo de haplotipo con la población de pacientes deseada, asegurando de este modo el potencial halogénico máximo y la posterior respuesta inmune contra el producto.

La invención descrita describe una vacuna que comprende una combinación de tres líneas celulares diferentes preparadas a partir de material de biopsia de cáncer de próstata primario y metastásico usando métodos conocidos en la técnica (revisados y citados en Rhim, J. S. y Kung, H. F., 1997 Critical Reviews in Oncogenesis 8 (4): 305-328) y/o seleccionados del Grupo A (líneas celulares procedentes de lesiones de cáncer de próstata primario) y Grupo B (líneas celulares procedentes de lesiones de cáncer de próstata metastásico) enumeradas en la Tabla 1.

El documento WO 97/28255 (Topalian) describe la producción de líneas celulares inmortalizadas procedentes de tumores de próstata primarios y el uso de estas líneas celulares en una inmunoterapia activa. Se sugiere que una composición farmacéutica puede contener una o más de estas líneas celulares. Se sugiere que una línea celular de próstata normal puede administrarse junto con una o más líneas celulares malignas emparejadas procedentes del mismo tumor primario. Por último, se menciona que existen líneas celulares inmortalizadas procedentes de tejido metastásico.

Se definen en las reivindicaciones realizaciones de la invención.

Las líneas celulares se irradian letalmente utilizando irradiación gamma a 50-300 Gy para asegurar que son de replicación incompetente.

Las líneas celulares y combinaciones mencionadas anteriormente, para ser útiles como agentes inmunoterápicos deben congelarse para permitir el transporte y el almacenamiento, por lo tanto, un aspecto adicional de la invención es cualquier combinación de células mencionadas anteriormente formulada con una solución crioprotectora. Las soluciones crioprotectoras adecuadas pueden incluir, pero sin limitación, solución de glicerol acuoso al 10-30% v/v, dimetilsulfóxido al 5-20% v/v o albúmina de suero humano al 5-20% p/v pueden usarse como crioprotectores individuales o en combinación.

TABLA 1

1

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Una realización adicional de la invención es el uso de las combinaciones de líneas celulares con estimulantes inmunes inespecíficos tales como BCG o M. Vaccae, toxoide de Tetanus, toxoide de Diphtheria, Bordetella pertussis, interleuquina 2, interleuquina 12, interleuquina 4, interleuquina 7, adyuvante completo de freund, adyuvante incompleto de freund u otros agentes inespecíficos conocidos en la técnica. La ventaja es que los estimulantes inmunes generales generan un estado inmune potenciado en general, mientras que la combinación de líneas celulares, añaden al sistema inmune tanto potenciación a través de su emparejamiento erróneo de haplotipo como dirección de la respuesta inmune contra una plétora de TAA y TSA como resultado de la heterogenicidad de sus orígenes
específicos.

La invención se describirá a continuación con respecto a los siguientes ejemplos y las Figuras en las que:

La Figura 1 muestra datos de proliferación de células T para los Pacientes Nº 202 y 205;

La Figura 2 muestra análisis de transferencia de Western de suero de los Pacientes Nº 201 y 203;

La Figura 3 muestra títulos de anticuerpos de suero del Paciente Nº 201; y

La Figura 4 muestra datos de PSA para los Pacientes 201 y 208.

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Ejemplo 1 Crecimiento, irradiación, formulación y almacenamiento de células

Una línea celular inmortalizada obtenida de tejido de próstata primario, en concreto, NIH1542-CP3TX, se cultivó en cultivo en frasco rotativo en medio KSFM suplementado con extracto de pituitaria bovina 25 \mug/ml, 5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico, L-glutamina 2 mM, tampón HEPES 10 mM y suero fetal de ternero al 5% (FCS) (en lo sucesivo denominado "KSFM modificado" después de la recuperación a partir de reservas en nitrógeno líquido. Después de la expansión en matraces estáticos T175 las células se sembraron en frascos rotativos con un área de superficie de cultivo de 1.700 cm^{2} a 2-5 x 10^{7} células por frasco rotativo.

También se usaron dos líneas celulares obtenidas de metástasis, en concreto LnCap y Du145, obteniéndose ambas de la ATCC. LnCap se cultivó en matraces estáticos de área de superficie grande en medio RPMI suplementado con FCS al 10% y L-glutamina 2 mM después de la siembra a 1-10 x 10 células por recipiente y, después, se cultivó hasta cerca de la confluencia. Du145 se expandió a partir de reservas congeladas en matraces estáticos y después se sembró en frascos rotativos de 850 cm^{2} a 1-20 x 10^{7} células por frasco y se cultivó hasta la confluencia en medio DMEM que contenía FCS al 10% y L-glutamina 2 mM.

Todas las líneas celulares se recogieron utilizando tripsina a concentración normal 1x. Después de un lavado exhaustivo en DMEM las células se resuspendieron a una concentración de 10-40 x 10^{6} células/ml y se irradiaron a 50-300 Gy usando una fuente de Co^{60}. Después de la irradiación, las células se formularon en solución de crioconservación compuesta por DMSO al 10%, albúmina de suero humano al 8% en solución salina tamponada con fosfato y se congelaron a una concentración celular de 15-50 x 10^{6} células/ml por refrigeración a una velocidad de 1ºC por minuto y, después, se transfirieron a un congelador de nitrógeno líquido hasta que fueran necesario su uso.

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Vacunación

Se seleccionaron pacientes con cáncer de próstata en base a ser refractarios a la terapia hormonal con un nivel de PSA en suero de 30 ng/ml. Se solicitaron los permisos éticos y la autorización de la MCA (UK Medicines Control Agency) y se obtuvieron para realizar este ensayo en 15 pacientes.

El programa de vacunación era el siguiente:

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Las células se calentaron suavemente en un baño de agua a 37ºC y se mezclaron con adyuvante micobacteriano antes de la inyección en pacientes. Las inyecciones se realizaron por vía intradérmica en cuatro sitios de inyección en territorios de ganglios linfáticos de drenaje. El intervalo mínimo entre dosis era de dos semanas y la mayoría de las dosis se administraron a intervalos de cuatro semanas. Antes de la primera dosis y antes de algunas dosis posteriores, los pacientes se ensayaron para hipersensibilidad de tipo retardada (DTH) frente a las tres líneas celulares enumeradas en el programa de vacunación anterior y también frente a PNT2 (una línea celular epitelial de próstata normal inmortalizada obtenida de la ECACC) (todos los ensayos implicaban 0,8 x 10^{6} células sin adyuvante).

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Análisis de la respuesta inmunológica (a) Respuestas de proliferación de células T

Para determinar si la vacunación daba como resultado una expansión específica de poblaciones de células T que reconocieran antígenos procedentes de las líneas celulares de la vacunación se realizó un ensayo de proliferación sobre células T después de la estimulación con lisados de las líneas celulares de próstata. Se extrajo sangre completa en cada visita al médico y se usó en un ensayo de proliferación basado en BrdU (bromodesoxiuridina), como se describe a continuación:

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Método de proliferación de BrdU en paciente Reactivos

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Método

1) Diluir 1 ml de sangre con 9 ml de RPMI + L-gln 2 mM + PS + 2-Me 50 \muM. No añadir suero. Dejar durante una noche a 37ºC.

2) A la mañana siguiente, dividir en alícuotas 450 \mul de sangre diluida en pocillos de una placa de 48 pocillos y añadir 50 \mul de lisado estimulante. El lisado se prepara por congelación-descongelación de células tumorales (2 x 10^{6} equivalentes celulares/ml) x 3 en nitrógeno líquido y después almacenamiento de alícuotas congeladas hasta que sean necesarias.

3) Cultivar las células a 37ºC durante 5 días.

4) En la tarde día 5, añadir 50 \mul de BrdU a 30 \mug/ml

5) Dividir en alícuotas 100 \mul de cada muestra en una placa de fondo redondo de 96 pocillos.

6) Centrifugar la placa y desechar el sobrenadante.

7) Lisar los glóbulos rojos usando 100 \mul de Pharmlyse durante 5 minutos a temperatura ambiente.

8) Lavar x 2 con 50 \mul de Cytofix.

9) Centrifugar y eliminar el sobrenadante por sacudida.

10) Permeabilizar con 100 \mul de lavado Perm durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT).

11) Añadir 30 \mul de mezcla de anticuerpos que comprende anticuerpos a la dilución correcta completada hasta el volumen con lavado Perm.

12) Incubar durante 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente.

13) Lavar x 1 y resuspender en 100 \mul de paraformaldehído al 2%.

14) Añadir esto a 400 \mul de FACSFlow en tubos de grupo listos para analizar.

15) Analizar en FACScan almacenando 3000 acontecimientos de CD3 disparados.

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Placa de 6 pocillos para estimulación

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Placa de 96 pocillos para tinción de anticuerpos

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Los resultados para los ensayos de proliferación se muestran en la Figura 1 en la que un índice de proliferación para células T positivas para CD4 o CD8 se representa frente a los diversos lisados celulares, obteniéndose el índice de proliferación por división por el porcentaje de células T proliferantes por el control sin lisado.

Se muestran los resultados para los pacientes números 202 y 205. Los resultados se proporcionan para cuatro lisados celulares, en concreto, NIH1542, LnCap, Du-145 y PNT-2 (una línea celular epitelial de próstata normal inmortalizada). En conjunto, el 50% de los pacientes tratados generaban una respuesta proliferativa específica contra NIH1542-CP3TX, LnCap y DU-145 en cierta medida y, en algunos casos, también contra PNT-2.

(b) Transferencias de Western utilizando suero de pacientes

Se prepararon lisados celulares normalizados para varias líneas celulares de próstata para permitir que se cargaran cantidades similares de proteína en un gel de SDS-PAGE desnaturalizante para análisis por transferencia de Western. Cada transferencia se cargó con marcadores de pesos moleculares y cantidades equivalentes de proteína obtenida de lisados celulares de NIH1542, LnCap, DU-145 y PNT-2. Después, la transferencia se sondó con suero de pacientes obtenidos de la prevacunación y después de 16 semanas de la vacunación (de cuatro a seis dosis).

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Método a) Preparación de muestras (líneas de tumor de próstata)

\bullet: Lavar los sedimentos celulares 3 veces en PBS.

\bullet: Resuspender a 1 x 10^{7} células/ml de tampón de lisis.

\bullet: Pasar por 5 ciclos de lisis por congelación-descongelación rápida en nitrógeno líquido/baño de agua.

\bullet: Centrifugar a 1500 rpm durante 5 min para eliminar residuos celulares.

\bullet: Ultracentrifugar a 20.000 rpm durante 30 min para eliminar contaminantes de membrana.

\bullet: Dividir en alícuotas de 200 \mul y almacenar a -80ºC.

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b) Electroforesis en gel

\bullet: Mezclar los lisados 1:1 con tampón de muestras Laemelli y llevar a ebullición durante 5 minutos.

\bullet: Cargar 20 \mug de muestras en pocillos de geles de gradiente de 4-20%.

\bullet: Procesamiento de geles en tampón de transferencia de Bjerrum y Schafer-Nielson (con SDS) a 200 V durante 35 min.

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c) Transferencia de Western

\bullet: Geles, membranas de nitrocelulosa y papel de transferencia equilibrados en tampón de transferencia durante 15 min.

\bullet: Organizar un sándwich de gel-nitrocelulosa sobre el ánodo de la celda de transferencia electroforética semiseca: 2 láminas de papel de transferencia, membrana de nitrocelulosa, gel, 2 láminas de papel de transferencia.

\bullet: Aplicar el cátodo y procesar a 25 V durante 90 min.

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d) Detección inmunológica de proteínas

\bullet: Bloquear las membranas de nitrocelulosa durante una noche a 4ºC con Marvel al 5% en PBS/Tween 20 al 0,05%.

\bullet: Aclarar las membranas dos veces en PBS/Tween 20 al 0,05%, después lavar durante 20 min y 2 x 5 min a RT en una plataforma de agitación.

\bullet: Incubar las membranas en dilución 1:20 de plasma de paciente aclarado durante 120 min a RT en una plataforma de agitación.

\bullet: Lavar como anteriormente con un lavado final adicional de 5 min.

\bullet: Incubar las membranas en una dilución 1:250 de anti-IgG o IgM humana con biotina durante 90 min a RT en una plataforma de agitación.

\bullet: Lavar como anteriormente con un lavado final adicional de 5 min.

\bullet: Incubar las membranas en una dilución 1:1000 de conjugado de peroxidasa de rábano rusticano-estreptavidina durante 60 min a RT en una plataforma de agitación.

\bullet: Lavar como anteriormente.

\bullet: Incubar las membranas en sustrato de diaminobenzidina peroxidasa durante 5 min para permitir el desarrollo del color, detener la reacción por aclarado de la membrana con agua.

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Los resultados de las transferencias de Western sondadas con anticuerpo secundarios anti-IgG para los pacientes 201 y 203 se muestran en la Figura 2. La Figura muestra las medidas basales y los puntos de tiempo de la semana 16 para cada paciente con cuatro lisados celulares en cada transferencia.

En conjunto, en los pacientes que recibieron al menos de cuatro a seis dosis, más del 50% mostraban un aumento en la intensidad de las bandas presentes antes de la vacunación y/o un ensanchamiento del número de bandas que se reconocen por el suero.

Es de interés particular la reactividad del suero de los pacientes 201 y 203 hacia el lisado PNT-2 que no formaba parte del régimen de vacunación (distinto del ensayo de DTH) pero, sin embargo, parece compartir antígenos comunes con NIH1542, LnCap y DU145 en el suero de ambos pacientes.

(c) Determinación del título de anticuerpos

Se determinaron los títulos de anticuerpo por recubrimiento de placas de ELISA con lisados de líneas celulares normalizados y realización de estudios de dilución en suero de pacientes vacunados con las líneas celulares.

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Método para ELISA con IgG anti-lisado

1.: Recubrir placas con 50 \mul/pocillo de lisados (a 10 \mug/ml) usando las siguientes diluciones:

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2.: Cubrir e incubar durante una noche a 4ºC.

3.: Lavar x 2 en PBS-Tween. Golpear la placa sobre toallas de papel para secar.

4.: Bloquear con PBS/FCS al 10% (100 \mul/pocillo).

5.: Cubrir e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora (mínimo).

6.: Lavar x 2 en PBS-Tween.

7.: Añadir 100 \mul de PBS/FCS al 10% en las filas 2-8.

8.: Añadir 200 \mul de muestra de plasma (diluido 1 en 100 PBS-FCS al 10%, es decir, 10 \mul de plasma añadidos a 990 \mul de PBS-FCS al 10%) a la fila 1 y realizar diluciones seriadas de 100 \mul hacia abajo en la placa como a continuación. Desechar los 100 \mul extra del pocillo de la parte inferior. Cubrir e incubar en el frigorífico durante una noche.

9.: Diluir anticuerpo biotinilado (Pharmingen; IgG 34162D), es decir, concentración final 1 mg/ml (es decir 20 ml en 10 ml).

10.: Cubrir e incubar a RT durante 45 min.

11.: Lavar x 6 como anteriormente.

12.: Diluir estreptavidina-HRP (Pharmingen, 13047E 0; diluir 1:100 (es decir 10 ml \rightarrow 10 ml).

13.: Añadir 100 ml/pocillo.

14.: Incubar 30 min a RT.

15.: Lavar x 8.

16.: Añadir 100 ml de sustrato/pocillo. Dejar que se desarrolle 10-80 min a RT.

17.: Detener la reacción de color por adición de 100 ml de H_{2}SO_{4} 1 M.

18.: Leer la DO a A405 nm.

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Los resultados (Figura 3) muestran que después de la vacunación con al menos de cuatro a seis dosis, los pacientes pueden mostrar un aumento en el título de anticuerpos frente a lisados de líneas celulares.

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(d) Evaluación de los niveles de PSA

Los niveles de PSA para pacientes que recibían la vacuna se registraron al ingreso en el ensayo y a lo largo del curso de la vacunación, usando kits clínicos usados de forma rutinaria. Los valores de PSA para los pacientes 201 y 208 se muestran en la Figura 4 y representan una disminución o estabilización de los valores de PSA, que en este grupo de pacientes habitualmente continúa aumentando, a menudo exponencialmente. El resultado para el paciente 201 está algo confundido por el tratamiento de radioterapia para aliviar el dolor óseo, aunque el nivel de PSA había disminuido significativamente antes de la radioterapia.

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Ejemplo 2

La invención también puede aplicarse a pacientes con cáncer de próstata de fase más temprana y la inmunoterapia también puede administrarse a través de diferentes vías. Como ejemplo, puede usarse el siguiente protocolo:

Se cultivan células, se irradian, se formulan y se almacenan de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1. Los pacientes con cáncer de próstata se seleccionan antes de una prostatectomía radical y se vacunan con una combinación de tres líneas celulares irradiadas (8 x 10^{6} células por línea) tres veces a intervalos de dos semanas antes de la cirugía. Aproximadamente la mitad de los pacientes se vacunan por vía intradérmica en cuatro territorios de ganglios linfáticos de drenaje (líneas celulares mezcladas con adyuvante micobacteriano durante al menos la primera dosis); los pacientes restantes se inyectan por vía intraprostática con adyuvante micobacteriano intradérmico administrado en un sitio alejado durante al menos la primera dosis. Se examinan muestras de biopsia de la próstata extirpadas por cirugía para determinar muerte de células de próstata y la presencia de células inmunes infiltrantes. Además, se determina la función de células T, el análisis de transferencia de Western y los títulos de anticuerpo de acuerdo con el método del Ejemplo 1. También se mide la PSA en suero a intervalos en estos pacientes.

Después de este protocolo, pueden detectarse respuestas inmunológicas. Además, la muerte de células de próstata puede detectarse en biopsias quirúrgicas.

Claims

1. Un agente inmunoterápico alogénico para el tratamiento del cáncer de próstata que comprende tres líneas celulares de tumor de próstata humano de las que una línea celular procede de un tumor primario y las otras dos líneas celulares proceden de tejido metastásico.

2. Un agente inmunoterápico alogénico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las otras dos líneas celulares proceden de dos tejidos metastásicos diferentes.

3. Un agente inmunoterápico alogénico para el tratamiento del cáncer de próstata que comprende tres líneas celulares de tumor de próstata humano de las que dos líneas celulares proceden de uno o dos tumores primarios y la otra línea celular procede de un tejido metastásico.

4. El agente inmunoterápico de las reivindicaciones 1-3, en el que las líneas celulares tumorales se han irradiado a de 50 a 300 Gy.

5. El agente inmunoterápico de las reivindicaciones 1-3, en el que las líneas celulares tumorales se han irradiado a de 100 a 150 Gy.

6. Una composición de vacuna inmunoterápica alogénica para el tratamiento del cáncer de próstata que comprende o consiste en un agente de acuerdo con cualquier reivindicación anterior junto con un excipiente, adyuvante o vehículo fisiológicamente aceptable.

7. Una composición inmunogénica alogénica que comprende un agente inmunoterápico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, combinado con un adyuvante de vacuna seleccionado de una preparación micobacteriana, toxoide de Tetanus, toxoide de Diphtheria, Bordetella pertussis, interleuquina 2, interleuquina 12, interleuquina 4, interleuquina 7, adyuvante completo de freund, adyuvante incompleto de freund u otro adyuvante inespecífico.

8. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el agente inmunoterápico se combina con un adyuvante de vacuna seleccionado de preparaciones micobacterianas, en la que las preparaciones se seleccionan del grupo constituido por BCG y M. Vaccae.

9. El agente inmunoterápico o la composición de las reivindicaciones 1-8, en el que las células se formulan con una solución crioprotectora que incluye, pero sin limitación, solución de glicerol acuoso al 10-30% v/v, dimetilsulfóxido al 5-20% v/v o albúmina de suero humano al 5-20% p/v como crioprotectores individuales o en combinación.

10. El agente inmunoterápico o la composición de las reivindicaciones 1-8, en el que las células se formulan con una solución crioprotectora que incluye dimetilsulfóxido al 5-20% v/v y albúmina de suero humano al 5-20% p/v en combinación.

11. El agente inmunoterápico o la composición de las reivindicaciones 1-10, que induce una respuesta inmune en pacientes caracterizada por la activación de células T inmunes.

12. El agente inmunoterápico o la composición de las reivindicaciones 1-10, que induce una respuesta inmune en pacientes caracterizada por la inducción de la producción de anticuerpos.

13. El agente inmunoterápico o la composición de las reivindicaciones 1-10, que induce una disminución en la velocidad de aumento o una disminución en el nivel de PSA en suero en pacientes de cáncer de próstata.

14. Uso de un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento alogénico de un cáncer de próstata humano.