KR100612552B1 - 새로운 암치료법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간의 전립선암 치료용 동종면역요법 약제로서 사용하기 위해 고안된 세포계의 특이 결합으로 이루어진 제품에 관한 것이다. 면역요법의 이형성은 표적 전립선암의 항원성 프로파일의 이형성과 매치되며 병의 다양한 단계에서 발현되는 많은 잠재 TAA 및 TSA의 부형제를 면역화한다. 본 발명은 일차 또는 변성 전립선암 생검 물질로부터 제조된 세개의 다른 세포계의 결합을 포함하는 백신을 기재한다. 세포계는 그들의 복제부전을 확실히 하기 위해 50 내지 300 Gy에서 감마조사를 사용하여 치사적으로 조사된다.

Description

새로운 암치료법{NEW CANCER TREATMENTS}

본 발명은 암에 걸린 포유동물 또는 인간의 면역 시스템이 종양병변에 대해 공격을 취하도록 유도함으로써 (인간을 포함한) 포유동물의 1차, 전이 및 잔류 암을 치료하는 약제에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 전세포, 유도체 및 그들의 일부를, 백신 보조액 및/또는 기타 보조인자와 함께 또는 없이 사용하는 것에 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 치료전략의 기본을 형성하는 전세포와 유도체 및 그들 일부의 특정 결합물의 사용에 관한 것이다.

암세포는 정상적인, 암에 걸리지 않은 세포에 비해 정성 및 정량적, 공간적 및 일시적인 많은 돌연변이를 함유하며, 병변세포가 성장 및 전이하는 특정 기간에 이들 일부는 숙주의 면역 시스템에 의해 병적인 것으로 인식될 수 있다. 이것은 숙주 면역 시스템의 힘을 이용하여 이것이 암세포를 공격하도록 함으로써 최소한 생명을 위협하지 않는 정도로 이상세포를 제거하는 면역요법을 개발하려는 세계적인 연구 활동을 무수히 일으켰다(Maraveyas, A. & Dalgleish, A.G. 1997, 시토킨 네트워크의 역할에서의 백신 디자인에 대한 고체 종양의 활성면역요법, Ed. Gregoriadis et al., Plenum Press, NewYork, 129-145쪽; Morton, D.L. 및 Ravindranath, M.H. 1996 종양 면역학에서 흑종백신에 관한 현개념-면역요법 및 암 백신, ed. Dalgleish, A.G. 및 Browning, M., 캠브리지 대학 출판사, 241-268쪽. 더욱 상세한 것을 위해서는 이들 출판물의 다른 논문을 참조).

암 면역요법을 탐구하기 위한 많은 연구가 있어 왔고 이들은 다음의 다섯가지 분야로 분류될 수 있다.

비-특이 면역요법

비-특이적으로 면역 시스템을 자극시키기 위한 노력은 William Coley(Coley, W.B., 1894 '에리시필스(erisipeals) 및 바실루스 프로디고서스(Bacillus prodigosus)의 독소를 갖는 수술 불가능한 악성종양의 치료' Trans. Am. Surg. Assoc. 12:183)의 선구적 작업까지 한 세기를 거슬러간다. 비록 성공은 몇몇 경우(예를 들면, 방광암 치료용 BCG, 흑종 및 신장암 치료용 IL-2로 한정되지만, 비-특이 면역조정이 대부분의 암을 치료하는데 충분하다는 것을 증명할 수 없다는 것이 잘 알려져 있다. 비-특이 면역-자극제는 일반적으로 면역반응의 상태를 강화시킬 수 있는 반면, 표적화능 및 또한 여러가지 메카니즘을 갖는 종양병변을 처리하기 위한 예민 및 면역학적 경계를 회피하고, 침범당하지 않게 하며 파멸하기 위한 유연성이 부족하다.

항체 및 단일클론성 항체

항체, 특히 단일클론성 항체 형태의 수동 면역요법은 항암제로서 중요한 연구 및 개발 주제이다. 원래는 그들의 특이성 때문에 매직 탄환(magic bullet)으로 불리우는, 단일클론성 항체는 항체 자신에 대한 면역반응(그로 인한 그들의 활성이 저지됨) 및 혈관을 통하여 병변에 접근하는데 대한 항체의 무능력을 포함한 여러 원인 때문에 암 면역요법 분야에서 기대 만큼 생존할 수 없었다. 현재까지 세개의 제품 즉, Panorex(글락소-윌컴사), Rituxan(IDEC/제넨텍/호프만 라 로쉐) 및 Herceptin(제넨텍/호프만 라 로쉐)이 인간에게 사용하도록 약학적으로 등록되어 있으며 현재 연구 및 개발중인 50개의 기타 프로젝트들이 있다. 항체들은 의태(면역학적 의미에서) 암항원에 나타나는 항-유전형 항체를 사용한 활성 면역요법에도 적용될 수 있다. 비록 개념은 우아하지만, 항체-기재 접근의 효용은 궁극적으로 포유동물이나 인간의 환자의 암세포의 서브셋이 특정 항체에 의해 인식되는 항원을 돌연변이시키고 상실하며, 그것에 의해 더 이상 항체로 처리할 수 없는 암세포 개체군의 생장을 일으킬 수 있는 '면역학적 탈출' 현상에 의해 제한된다는 것이 증명될 것이다.

서브유니트 백신

전염성 질병 및 기타 분야용 백신에 대한 경험으로부터, 많은 연구인들은 암 세포와 배타적으로 또는 선택적으로 결합되는 항원, 즉 종양특이항원(TSA) 또는 종양결합항원(TAA)을 확인하고 이런 항원들 또는 이들의 단편을 특이활성 면역요법의 기초로서 사용하기 위한 탐구를 해왔다.

TAA 또는 TSA 범주에 속하는 것들로부터 유도된 단백질 또는 펩타이드를 확인하는 수 많은 방법이 있다. 예를 들면, 미분 디스플레이법(differential display techniques)을 이용하는 것이 가능하며, 이 방법에 의해 병변에서 배타적으로 또는 선택적으로 발현되는 RNA를 확인하기 위해 종양 조직과 이웃 정상 조직간의 RNA 발현을 비교하는 것이 가능하다. RNA 서열화에 의해 특정 시간에 특정 조직에서 발현 되는 몇몇 TAA 및 TSA를 확인할 수 있지만, 주어진 시간에서의 TAA 또는 TSA의 확인은, 시간에 걸친 병변에서의 항원성 프로파일의 충분한 반영을 제공하지 못하고, 오직 병변의 "스냅"만을 나타내는 접근상의 잠재적 결함을 갖는다. 유사하게, cDNA의 세포독성 T 임파구(CTL) 클로닝 및 종양 조직의 발현-클로닝의 결합은, 특히 흑종에서 많은 TAA 및 TSA를 확인하게 한다. 접근방법은 미분 디스플레이법과 같은 고유의 결점을 갖는데, 그것은 오직 하나의 TAA 또는 TSA의 확인이 임상적으로 적절한 항원 프로파일의 알맞는 설명을 제공하지 않는다는 것이다.

다양한 암을 치료하기 위하여 50 개를 넘는 이와 같은 서브유니트 백신 접근법이 개발 중에 있으나, 아직 인간에 대한 약물제품으로 승인을 받은 것은 없다. 상기의 항체-기재 접근과 유사한 방법으로, 서브유니트 백신은 면역학적 탈출의 현상에 의해 역시 제한될 수 있다.

유전자 치료법

인간 개체에 대한 유전자 요법 시도의 대부분은 암치료 분야에 관한 것이며, 이중 상당한 부분은 환자의 면역 반응을 개시하고 증폭하는 것을 고안하고 있다. 상업적 개발중 현저한 것은 인간 종양용으로 바이칼(Vical)사에 의해 개발되고 있는 알로벡틴(Allovectin)-7 과 루벡틴(Leuvectin), 전립선암 치료용으로 칼리돈(Calydon)사에서 개발중인 CN706, 및 StressGen 사의 흑종 및 폐암 치료용 스트레스 단백질 유전자치료법이다. 현재, 이들 및 상업적 및 연구적으로 개발 중인 많은 기타 '면역-유전자 치료법'이 궁극적으로 성공한 시험이라고 판단하기에는 너무 이르지만, 이들 접근의 상업적 효용은 지난 10년보다 더 중요할 것이라는 것 이 광범위하게 받아들여지고 있다.

세포-기재 백신

종양은 다음과 같은 다양한 방법으로 면역 시스템을 방해하는 현저한 능력을 가진다. 잠재 표적 단백질 발현의 하향조절(downregulation); 잠재 표적 단백질의 변성; 수용체 및 기타 단백질 표면 발현의 하향조절; MHC 류 Ⅰ 및 Ⅱ 발현의 하향조절에 의한 TAA 또는 TSA 펩티드의 직접 표현 불허; 면역성 결여를 일으키는 T-세포의 불완전 자극을 야기하는 보조자극 분자의 하향조절; 면역계에 미끼로 작용하도록 선택적, 비-표현 막 일부의 쉐딩(shedding); 면역계의 면역성을 결여시키는 선택막 일부의 쉐딩; 억제 분자의 분비; T-세포의 치사 유도; 및 기타 많은 방법. 명백한 것은, 신체내 종양의 면역학적 이형성 및 가소성이 유사하게 이형성을 표현하는 면역요법적 전략에 의해 어느정도 어울려야 한다는 것이다. 암 면역요법으로서 전체 암 세포, 또는 그의 원 유도체를 사용하는 것은 바이러스성 질병에 대한 백신으로서 완전 비활성화되거나 또는 약화된 바이러스를 사용하는 것과 유사하게 고려될 수 있다. 잠재적인 이점은

(a) 전세포는 상기와 같이 병변의 항원과 매치하기에 충분한 이형성의 항원성 프로파일을 제공하는, 넓은 범위의 항원을 함유한다.

(b) (즉, 복합 항원을 함유하는) 다가의, 면역학적 탈출의 위험이 감소된다(암세포가 이들 항원 모두를 상실할 확률은 희박함); 및

(c) 세포-기재 백신이, 아직 이와 같이 확인되어야 하는 TSAs및 TAAs을 포함한다; 그렇지 않다면, 현재 확인 안된 항원이 상대적으로 소수인 공지의 TSAs/TAAs 보다 임상적으로 더 적당할 수 있는 가능성이 있다.

세포-기재 백신은 두 범주에 속한다. 첫째는, 자가이식 세포를 기초로, 환자에게서 생검을 분리하고, 인비트로에서 종양 세포를 배양시키고, 트란스펙션 및/또는 다른 수단으로 세포를 전이시키고, 세포를 조사(irradiating)하여 복제-부적격으로 만든 다음, 세포를 다시 동일 환자에게 백신으로 접종하는 것을 포함한다. 비록 이 접근법이 지난 10년동안 주목을 받아왔지만, 개별적으로 제조되는 이 치료법은 몇가지 이유로 인해 본질적으로 비실용적이라는 것이 명백하다. 이 방법은 많은 시간을 필요로 하고(종종 백신의 임상 1회 분량을 제조하는데 걸리는 시간이 환자의 예상 수명을 초과한다), 고가이며, '주문'제품으로서 표준화된 제품을 명기하는 것이 불가능하다(제품이 아닌, 방법만이 표준화 가능하며 그러므로 최적화 및 품질조절이 가능하다). 그 밖에, 자가이식 백신을 제조하기 위해 사용되는 종양 생검은, 이것을 어느정도 독특하게 만드는 성장특성, 상호작용 및 주변 조직과의 전달을 가질 것이다. 이것은 면역요법에서 자가이식 세포를 사용하는데 잠재적으로 중요한 결점을 암시한다; 초기 세포를 제공하는 생검은 당시 주변환경에서의 종양의 면역학적 스냅을 나타내며, 이것은 질병의 전체 진행과정에 걸쳐 제공될 수 있는, 지속적인 활성을 갖는 백신을 목적으로 하는 시간을 넘는 면역적 표현으로는 불충분할 것이다.

세포-기재 백신의 두번째 타입 및 본 발명의 주제는 유전적으로(및 면역학적으로) 환자에게 맞지 않는 동종 세포를 사용하는 것이다. 동종 세포는 자가이식 세포와 같이 다가인 동일한 장점의 이익을 갖는다. 추가로, 동종 세포 백신은 인비트로에서 무한히 배양될 수 있는 불멸세포계를 기초로 할 수 있으므로, 본 접근은 자 가이식 접근의 시간 및 비용상의 결점을 겪지 않는다. 유사하게, 동종 접근은 질병의 단계, 병변의 위치 및 잠재적 내성에 의한 개개의 질병 프로파일을 다른 치료법에 매치시킬 수 있는 세포 타입들의 결합물을 사용하는 기회를 제공한다.

세포-기재 암 백신의 사용에 관한 많은 보고서가 있다(예를 들면, Dranoff, G. et al. WO 93/06867; Gansbacher, P. WO 94/18995; Jaffee, E.M. et al. WO 97/24132; Mitchell, M.S. WO 90/03183; Morton, D.M. et al. WO 91/06866 을 참조). 이들 연구는 면역요법 항원으로서 암세포를 사용하는 기본 공정으로부터, GM-CSF, IL-2, 인터페론 또는 기타 면역학적-활성 분자를 생산하기 위한 세포의 트란스펙트까지의 일련의 변이 및 자살유전자의 사용을 포함한다. 그룹은 환자의 하프로타입(haplotype)에 HLA-매치 또는 부분적으로 매치되는 동종 세포를 사용하며 및 또한 흑종분야에서 환자의 하프로타입에 맞지 않으며 또한 GM-CSF로 트란스펙트된 동종 전립선 세포계에 맞지 않는 동종 세포계을 사용한다.

본 발명은 인간의 전립선암을 치료하기 위한 동종(또는 동종이계: allogeneic) 면역요법제로서 사용하기 위한 세포계(cell line)의 특이 결합으로 이루어진 제품에 관한 것이다. 본 명세서에 기재된 면역요법의 이형성은 표적 전립선암 중의 항원성 프로파일의 이형성과 매치되며 질병의 다양한 단계에서 발현되는 많은 잠재적 TAA 및 TSA로 수용체를 면역화시킨다. 세포계는 다음의 특성을 갖는 적당한 세포계로부터 선택된다: 세포는 기원상 불멸 전립선 또는 전이 전립선이며, 대규모 세포 배양에서 우수한 성장을 나타내며, 및 성분 세포계의 품질 조절 및 복제가능한 생산을 허용하는 특징을 갖는다.

본 발명은 세포계가 미래의 환자군과 하프로타입간의 최대 미스매치를 허용하도록 선택되는 상기 세포계의 결합으로 이루어진 제품에 관한 것으로, 그것에 의해 최대 동종 잠재력 및 수반되는 제품에 대한 면역반응을 확실히 한다.

본 발명은 (Rhim, J.S. 및 Kung, H-F., 1997 Critical Rewiews in Oncogenesis 8(4): 305-328에서 검토되고 인용된)선행기술에서 공지된 방법을 사용하여 일차 또는 변성 전립선암 생검으로부터 제조되고 및/또는 표 1의 그룹 A(일차 전립선암 병변에서 유도된 세포계) 및 그룹 B(변성 전립선암 병변으로부터 유도된 세포계)로부터 선택된 세개의 다른 세포계의 결합으로 이루어진 백신을 기재한다.

한 구현예에서, 세포계들의 결합은 일차 전립선암 병변으로부터 유도된 세개의 다른 세포계로 이루어진다.

다른 구현예에서, 결합은 일차 전립선암 병변으로부터 유도된 두개의 다른 세포계와 변성 전립선암 병변으로부터 유도된 하나의 세포계로 이루어진다.

다른 구현예에서, 결합은 일차 전립선암 병변으로부터 유도된 하나의 세포계와 변성 전립선암 병변으로부터 유도된 두개의 다른 세포계의 결합으로 이루어진다.

또 다른 구현예에서, 결합은 변성 전립선암 병변으로부터 유도된 세개의 다른 세포계로 이루어진다.

세포계는 이들의 확실한 복제부전을 위해 50 내지 300 Gy에서 감마선을 사용하여 방사선으로 치사량으로 조사된다.

상기의 세포계 및 결합은, 면역요법제로서의 사용하기 위해 운송 및 저장을 위해 냉동되어야 하며, 그러므로 본 발명의 또 다른 면은 냉동보호액으로 제제화된 상기 세포들의 결합이다. 적당한 냉동보호액은 10-30 % v/v 글리세롤 수용액, 5-20 % v/v 디메틸술폭사이드 또는 5-20 % v/v 인간 혈청알부민을 포함할 수 있으나 이것으로 한정되는 것은 아니며, 단일 냉동보호액으로서 또는 결합물로서 사용될 수 있다.

그룹 A	그룹 B
NIH1519-CPTX, NIH1532-CP2TX, NIH1535-CP1TX 및 NIH1542-CP3TX (NIH에서 Suzanne Topalian 박사에 의해 일차 전립선암에서 얻은 불멸화된 세포계; 이들 세포계들은 Cancer Research, vol 57(5), pp 995-1002에 기재되어 있으며 특허를 위해 ATCC에 기탁되어 있다) CA-HPV-10(ATCC 번호:CRL-2220)	DU145(ATCC 번호:HTB-81) LnCap(ATCC 번호: CRL-1740 및 CRL-10995) PC3(ATCC번호:CRL-1435)

본 발명의 또 다른 구현예는, BCG 또는 미코박테륨 베케(M. Vaccae), 파상풍톡소이드, 디프테리아톡소이드, 보데텔라 파상풍, 인터로킨(interleukin)2, 인터로킨 12, 인터로킨 4, 인터로킨 7, 완전 프로인트 보조액, 불완전 프로인트 보조액 또는 기타 공지의 비특이 약제와 같은, 비-특이 면역자극제를 갖는 세포계 결합을 사용하는 것이다. 장점은 세포계 결합이 이들의 하프로타입 미스매치를 통한 면역강화에 첨가되며 이들의 특이 기원의 이형성의 결과로서 TAA 및 TSA의 다혈증에 대해 면역 반응을 표적하는 반면, 일반 면역 자극제는 일반적으로 강화된 면역상태를 생성한다는 것이다.

본 발명은 다음의 실시예 및 도면을 참조로 하여 기재될 것이다.

도 1은 환자번호 202 및 205의 T-세포 증식 데이타를 나타내는 도면이다.

도 2는 환자번호 201 및 203의 혈청의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타내는 도면이다.

도 3 a 및 b는 환자번호 201의 혈청을 항체 측정을 나타낸다.

도 4는 환자번호 201 및 208의 PSA(전립선 특이 항원) 데이타를 나타낸다.

실시예 1

세포의 성장, 조사, 제제화 및 저장

일차 전립선 조직에서 유도된 불멸 세포계, 즉 NIH1542-CP3TX를 보바인 뇌하수체제제 추출물 25 ㎍/㎖, 표피성장 인자 5 ng/㎖, L-글루타민 2 mM, HEPES 완충용액 10 mM, 배아 송아지 혈청(FCS) 5%(이하, "전이된 KSFM"으로 칭함)이 추가된 KSFM 배지중에서 회전병배양으로 증식시키고, 액체질소 원료중에서 회수하였다. T175 정적 플라스크에서 팽창시키고 세포를 회전병 당 세포 2-5 x 10⁷ 을 증식표면적 1,700 cm²으로 회전병에 심었다.

또한, 두개의 변성-유도 세포계, 즉 모두 ATCC로부터 얻은 LnCap 및 Du145을 사용하였다. LnCap는 TCS 10% 및 L-글루타민 2 mM이 추가된 RPMI 배지중의 큰 표면적 정적 플라스크에서 증식하였고, 용기당 세포 1-10 x 10⁶으로 심은 다음, 합류점 근처까지 증식시켰다. Du145는 정적 플라스크에서 냉동 원료로부터 팽창시킨 후 병 당 세포 1-20 x 10⁷을 850 cm² 으로 회전병에 심고, FCS 10 % 및 L-글루타민 2 mM에서 합류점까지 성장시켰다.

모든 세포계를 1 x 노말 농도의 트립신을 사용하여 수확하였다. DMEM에서 대량 세정 후, 세포를 농도 10-40 x 10⁶ 세포/㎖로 재-현탁시키고 Co⁶⁰ 소스를 사용하여 50-300 Gy에서 조사하였다. 그 다음, 세포를 DMSO 10 %, 인산염 완충 살린 중의 인간 혈청 알부민 8%로 이루어진 냉동보호액 중에서 제제화하고, 1 ℃/분의 비율로 냉각하여 세포농도 15-50 x 10⁶세포/㎖로 냉동시킨 다음, 사용할 때까지 액체 질소 냉동기에 옮겨 놓았다.

접종

혈청 PSA 수치 30 ng/㎖를 기준으로, 호르몬 요법으로 치료하기 힘든 전립선암 환자들을 선택하였다. 15명의 환자에게 임상시험을 실시하기 위해 윤리적 허용 및 MCA(영국 Medicines Control Agency)허가를 얻었다.

접종 예정표는 다음과 같았다.

투약번호	투여된 세포계
1,2 및 3	NIH1542-CP3TX(투여량당 세포 24 x 106)
4 및 그 이후	LnCap/Du145/NIH1542(투여량당 각 세포계의 세포 8 x 106)

세포를 환자에게 주사하기 전에 수조 37 ℃에서 천천히 가온시키고 미코박테리아 보조액과 혼합시켰다. 접종은 네 개의 접종 위치에서 피내에서 임파선 베이진으로 서서히 흘러나가도록 이루어진다. 최소 투여간격은 2 주 였고, 대부분의 투여는 4 주 간격으로 주어졌다. 첫번째 투여 전에, 및 이후의 몇몇 투여 전에, 환자들 을 상기 접종 예정표에 리스트된 3개의 세포계에 대한 및 또한 PNT2(ECACC를 원료로한 불멸 정상 전립선 상피세포계)에 대한 지연형 과민증(DTH)을 시험하였다(모든 시험은 보조액 없이 0.8 x 10⁶ 세포를 포함한다).

면역학적 반응 분석

(a)T-세포 증식 반응

왁진 주사가 접종 세포계로부터 유도된 항원을 인식하는 T-세포 개체군의 특이 팽창을 일으키는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 T-세포에 대한 증식 조사 및 전립선 세포계의 용해질에 의한 자극을 실시하였다. 진료소를 찾은 각 방문자들의 전혈을 추출하여 하기의 증식 조사를 기초로 BrdU(브로모디옥시우리딘)에 사용하였다.

환자 BrdU 증식법

시약

RPMI 라이프 테크놀러지스, 페이즐리 스코들랜드

BrdU 시그마 케미칼 사, 풀, 도어셋

PharMlyse 35221E 파민겐, 옥스포드, 영국

시토픽스(Cytofix)/

시토펌(Cytoperm) 2090KZ "

Perm/세정 완충용액 2091KZ "

FICT 항-BrdU/Dnase 340649 벡톤 딕킨슨

PerCP 항-CD3 347344 "

Pe Anti-CD4 30155X 파민겐

Pe Anti-CD8 30325X "

FITC mu-lgG1 349041 벡톤 딕킨슨

PerCP lgG1 349044 "

PE lgG1 340013 "

방법

1) 혈액 1 ml를 RPMI 9 ml + L-gln 2 mM + PS + 2-Me 50 μM로 희석시킨다. 혈청은 첨가하지 않는다. 37 ℃에서 철야방치한다.

2) 다음날 아침, 희석시킨 혈액을 48-웰 플레이트의 웰로 450 ㎕ 부분표본시키고, 자극 용해질 50 ㎕를 첨가하였다. 용해질은 종양 세포(2 x 10⁶ 세포 등가/ml)를 액체 질소중에서 냉동-해동시켜 제조한 다음, 필요할 때까지 부분표본 냉동으로 저장한다.

3) 세포를 37 ℃에서 5일간 배양한다.

4) 제 5일 저녁에 50 ㎕의 BrdU @30 ㎍/ml를 첨가한다.

5) 각 시료 100 ㎕를 96-웰 둥근바닥 플레이트에 부분표본 시킨다.

6) 플레이트를 회전시키고 상등액은 버린다.

7) Pharmlyse 100 ㎕를 사용하여 5분 동안 실온에서 적세포를 용해시킨다.

8) 시토픽스 50 ㎕로 두번 세정한다.

9) 회전시키고 가볍게 쳐서 상등액을 제거한다.

10) 실온에서 10 분 동안 100 ㎕ Perm-세정수를 침투시킨다.

11) 최대 Perm-세정수 부피까지 보정 희석된 항체를 포함하는 항체 혼합물 30 ㎕를 첨가한다.

12) 암실에서 실온에서 30분 동안 배양한다.

13) 한번 세정하고 2% 파라포름알데히드 100 ㎕로 재현탁한다.

14) 이것을 분석용으로 준비한 클러스터 튜브중의 FACSFlow 400 ㎕에 첨가한다.

15) FACScan으로 분석하고 3000 게이트된 씨디3 이벤트(3000 gated CD3 events)에서 저장한다.

자극용 6-웰 플레이트

	Nil	ConA	1542	LnCap	Du145	Pnt2
PBL1
PBL2
PBL3
PBL4
PBL5
PBL6

항체 염색용 96-웰 플레이트

PBL1		PBL2		PBL3		PBL4		PBL5		PBL6
Nil A	15 D	Nil A	15 D	Nil A	15 D	Nil A	15 D	Nil A	15 D	Nil A	15 D
Nil D	15 E	Nil D	15 E	Nil D	15 E	Nil D	15 E	Nil D	15 E	Nil D	15 E
Nil E	Ln D	Nil E	Ln D	Nil E	Ln D	Nil E	Ln D	Nil E	Ln D	Nil E	Ln D
Con D	Ln E	Con D	Ln E	Con D	Ln E	Con D	Ln E	Con D	Ln E	Con D	Ln E
Con E	Du D	Con E	Du D	Con E	Du D	Con E	Du D	Con E	Du D	Con E	Du D
	Du E		Du E		Du E		Du E		Du E		Du E
	Pn D		Pn D		Pn D		Pn D		Pn D		Pn D
	Pn E		Pn E		Pn E		Pn E		Pn E		Pn E

설명:

A: lgG1-FITC(5 ㎕) lgG1-PE(5㎕) lgG1-PerCP(5 ㎕)

15 ㎕ MoAb+15 ㎕

D: BrdU-FITC(5 ㎕) CD4-PE(5 ㎕) CD3-PerCP(5 ㎕)

15 ㎕ MoAb+15 ㎕

E: BrdU-FITC(5 ㎕) CD8-PE(5 ㎕) CD3-PerCP(5 ㎕)

15 ㎕ MoAb+15 ㎕

15: NIH1542-CP3TX

Ln: LnCap

D: Du145

Pn: PNT2

Con: ConA 렉틴(양성 제어)

Nil: 자극 없음

증식 조사 결과를 도 1에 나타내었고, 여기서 CD4 또는 CD8 양성 T-세포에 대한 증식 인덱스를 여러가지 세포 용해질에 대해 작성하였고, 증식 인덱스는 증식된 T-세포의 비율을 용해질이 없는 대조로 나누어 얻었다.

환자 번호 202 및 205에 대한 결과를 나타내었다. 4 개의 세포 용해질, 즉 NIH1542, LnCap, DU-145 및 PNT-2(불멸 정상 전립선 상피세포계)의 결과를 나타내었다. 전체적으로, 처치 환자의 50%는 NIH1542-CP3TX, LnCap 및 DU-145에 특이 증식반응을 어느 정도 얻었고, 몇몇 경우에는 PNT-2에 대해서도 반응을 얻었다.

(b) 환자의 혈청을 이용한 웨스턴 블롯(Western Blot)

웨스톤 블롯 분석을 위해 유사한 양의 단백질을 변성 SDS PAGE 겔에 놓을 수 있도록 표준화된 세포 용해질을 다수의 전립선 세포계로 준비하였다. 각 블롯에 분자량 표지, 및 NIH1542, LnCap, Du-145 및 PNT-2의 세포 용해질로부터 얻은 동일량의 단백질을 놓았다. 그 다음, 접종-전 및 접종-16주 후(4 내지 6 투여) 얻은 환자의 혈청을 사용하여 블롯을 조사하였다.

방법

a)시료 제조(전립선 종양계)

ㆍ세포 펠렛을 PBS 중에서 3번 세정한다.

ㆍ용혈 완충용액 1 x 10⁷ 세포/ml로 재현탁한다.

ㆍ액체 질소/물 욕조중에서 급속 냉동 해동 용해를 5회 반복시킨다.

ㆍ세포 부스러기를 제거하기 위해 1500 rpm에서 5 분동안 원심분리한다.

ㆍ막오염물질을 제거하기 위해 20,000 rpm에서 30 분간 초원심분리한다.

ㆍ200 ㎕로 부분표본하고 -80 ℃에서 저장한다.

b)전기영동법

ㆍ용해질을 래밀리(Laemelli) 시료 완충용액과 1: 1로 혼합하고 5분간 가열한다.

ㆍ시료 20 ㎍을 4-20 % 경사 겔 웰에 놓는다.

ㆍ겔을 200 V에서 35 분 동안 Bjerrum 및 샤퍼-낼슨(Schafer-Neilson)트란스퍼 완충용액(SDS)중 작동시킨다.

c)웨스턴 전이

ㆍ겔, 니트로셀룰로스 막 및 블로팅 페이퍼를 전이 완충용액중에서 15분간 평형시킨다.

ㆍ반-건식 전기영동 전이 셀의 양극에 겔-니트로셀룰로스를 샌드위치 배열한다: 블로팅 페이퍼 2장, 니트로셀룰로스 막, 겔, 블로팅 페이퍼 2장

ㆍ음극을 적용하고 25 V에서 90 분동안 작동시킨다.

d) 단백질의 면역학적 검출

ㆍ니트로셀룰로스 막을 PBS/0.05% Tween 20 중의 5% Marvel로 4 ℃ 에서 철야로 블록시킨다.

ㆍ막을 PBS/0.05% Tween 20 중에서 두번 헹구고, 20분 동안 및 5 분 동안 두번 실온에서 진탕 플랫폼에서 세정한다.

ㆍ막을 진탕 플랫폼에서 투명화된 환자의 플라즈마의 1:20 희석액 중에서 실온에서 120분 동안 배양한다.

ㆍ상기와 같이 세정하고 추가로 5 분동안 최종 세정한다.

ㆍ막을 비오틴 항-인간 lgG 또는 lgM의 1: 250 희석액 중에서 진탕 플랫폼 위에서 실온에서 90분 동안 배양한다.

ㆍ상기와 같이 세정하고 추가로 5 분동안 최종 세정한다.

ㆍ막을 스트렙타비딘-호스라디쉬 퍼옥시다제(streptavidin-horserasdish peroxidase) 컨쥬게이트 1:1000 희석액 중에서 진탕 플랫폼 위에서 실온에서 60분 동안 배양한다.

ㆍ상기와 같이 세정한다.

ㆍ색 전개를 허용하기 위해 막을 디아미노벤지딘 퍼옥시다제 기질 중에서 5 분 동안 배양하고, 막을 물로 헹굼으로써 반응을 정지시킨다.

환자 201 및 203에 대해 항-lgG 제2 항체로 검사한 웨스턴 블롯의 결과를 도 2에 나타내었다. 도는 기준선 및 각 블롯에서 4개 세포 용해질로 각 환자에 대해 위크 16 시간 지점을 나타내었다.

적어도 4 내지 6회 투여 받은 환자 전체중 50 % 이상은 접종 전에 밴드 존재의 강도가 증가했음을 나타내며 및/또는 혈청에 의해 인식되어질 밴드의 수가 넓어짐을 나타낸다.

접종 제도의 일부를 형성하지 않는 PNT2 용해질에 대한 환자 201 및 203의 혈청의 반응성은 특별한 점이지만, 그럼에도 불구하고 양쪽 환자 혈청 중에서 NIH1542, LnCap 및 DU145과 공통 항원을 공유한다는 것을 나타낸다.

(c)항체 역가 결정

ELISA 플레이트를 표준화된 세포계 용해질로 코팅하고, 세포계로 접종한 환자의 혈청에 대해 희석 연구를 실시하여 항체 역가를 결정하였다.

항-용해질 lgG를 갖는 ELISA용 방법

1. 판을 용해질(@10 ㎍/ml) 50 ㎕/웰로 다음과 같이 희석하여 코팅한다.

용해질 단백질 농도 코팅농도 양/ml 5 ml중의 양/㎕

PNT2 2.5 mg/ml 10 ㎍/ml 3.89 ㎕ 19.4 ㎕

1542 4.8 mg/ml 10 ㎍/ml 2.07 ㎕ 10.3 ㎕

Du145 2.4 mg/ml 10 ㎍/ml 4.17 ㎕ 20.8 ㎕

LnCap 2.4 mg/ml 10 ㎍/ml 4.12 ㎕ 20.6 ㎕

2. 뚜겅을 덮고 철야로 4 ℃에서 배양한다.

3. PBS-Tween으로 2번 세정한다. 종이 타월로 두드려 건조시킨다.

4. PBS/10% FCS(100 ㎕/웰)로 블록한다.

5. 뚜겅을 덮고 실온에서 1시간(최소)동안 배양시킨다.

6. PBS-Tween으로 두번 세정한다.

7. 2-8 열에 PBS-10% FCS 100 ㎕를 첨가한다.

8. 1 열에 플라즈마 시료 200 ㎕를 첨가하고(PBS-10%FCS 100 중 1로 희석, 즉 플라즈마 10 ㎕를 PBS-10% FCS 990 ㎕에 첨가) 연속 100 ㎕ 희석액을 하기와 같이 내려놓는다. 플레이트 기저부분에서 여분 100 ㎕를 버린다. 뚜껑을 덮고 냉장고에서 철야 배양한다.

9. 비오티닐화된 항체를 희석한다(Pharmingen;lgG 34162D). 최종농도 1 mg/ml (10 mls 중 20 ml)

10. 뚜껑을 덮고 실온에서 45 분동안 배양한다.

11. 상기와 같이 6번 세정한다.

12. 스트랩타비딘-HRP(Pharmingen, 13047E 0; 희석 1:1000(즉, 10 ml ->10 mls)를 희석한다.

13. 100 ml/웰을 첨가한다.

14. 실온에서 30분 동안 배양한다.

15. 8번 세정한다.

16. 100 ml 기질/웰을 첨가한다. 실온에서 10-80 분 전개한다.

17. 1M H₂SO₄ 100 ml를 첨가하여 색 반응을 중지시킨다.

18. A 405 nm에서 OD를 읽는다.

결과(도 3a 및 3b)는 적어도 4 내지 6회의 접종 후를 나타내며, 환자는 세포계 용해질에 대한 항체역가의 증가를 나타낸다.

(d)PSA 수치 평가

정기적으로 사용되는 임상키트를 사용하여, 접종 과정에 걸쳐 각 실험에 들어가면서 백신을 수여받은 환자의 PSA 수치를 기록하였다. 환자 201 및 208에 대한 PSA 수치를 도 4에 나타내었다. 도 4는 PSA 수치의 하락 또는 안정을 나타내는데, 이것은 종종 이 환자군에서 지수적으로 계속 상승한다. 환자 201의 결과는, 비록 PSA 수치가 방사선 요법 전에 상당히 떨어졌지만, 어느정도 골격통증을 경감시키기 위한 방사선 요법 처리와 혼동된다.

실시예 2

또한, 본 발명은 초기 단계의 전립선암 환자에게 적용될 수 있으며, 면역요법은 또한 다른 경로를 통해 투여될 수 있다. 실시예로서 다음의 안을 사용할 수 있다:

세포는 실시예 1의 방법에 따라 증식되고, 조사되고, 제제화되고 저장된다. 전립선암 환자에게 근치 전립선 절제 전에, 3 개의 방사선조사 세포계 결합을 수술 전에 2주 간격으로 세번 접종하였다. 환자중 약 반은 네개의 임파선 베이진으로 피하 접종되었고(적어도 첫번째 투여의 경우는 미코박테리아 보조액와 세포계를 혼합하였다); 나머지 환자는 피내 미코박테리아 보조액 투여로 적어도 첫번째 투여에서 거리를 두고 전립선내 접종되었다. 수술로 제거된 전립선의 생검 시료를 전립선 세포 치사 및 침윤된 면역 세포의 존재에 대해 시험하였다. 추가로, T-세포 작용, 웨스턴 블롯분석 및 항체역가를 실시예 1의 방법에 따라 결정하였다. 이들 환자에게서 혈청 PSA 수치를 일정 간격으로 측정하였다.

이 원안 후, 면역학적 반응을 검출할 수 있다. 추가로, 외과적 생검으로 전립선 세포의 치사를 검출할 수 있다.

Claims (23)

1종의 세포계는 일차 종양으로부터 유래되고 다른 2종의 세포계는 전이조직으로부터 유래된 3종의 인간 전립선 종양 세포계를 포함하는 전립선암 치료용 동종 면역요법 약제.

3종의 인간 전립선 종양 세포계의 혼합물을 포함하는 전립선암 치료용 동종 면역요법 약제로, 여기서 1종의 세포계는 일차 종양으로부터 유래되고 다른 2종의 세포계는 2종의 다른 전이조직으로부터 유래된 동종 면역요법 약제.

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제 1항에 있어서, 종양 세포계가 전이 조직으로부터 유래되고 LnCap(ATCC CRL-1740), Du145(ATCC HTB-81) 또는 PC3(ATCC CRL-1435)로 구성된 군으로부터 선택되는 면역요법 약제.

제 1항에 있어서, 종양 세포계가 50 내지 300 Gy로 조사된 면역요법 약제.

제 1항에 있어서, 종양세포계가 100 내지 150 Gy에서 조사된 면역요법 약제.

BCG, 미코박테륨 베케(Mycobacterium Vaccae), 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 보데텔라 백일해, 인터로킨 2, 인터로킨 12, 인터로킨 4, 인터로킨 7, 완전 프로인트 보조액, 및 불완전 프로인트 보조액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 백신 보조액과 조합된 제 1항의 면역요법 약제를 포함하는 동종 면역원성 조성물.

백신 보조액과 조합된 제 1항의 면역요법 약제를 포함하는 면역원성 조성물로, 여기서 상기 보조액이 미코박테리아 제제인 면역원성 조성물.

제 1항에 있어서, 세포가 글리세롤 수용액 10 내지 30 % v/v, 디메틸술폭사이드 5 내지 20 %v/v, 및 인간 혈청알부민 5 내지 20 %w/v으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 냉동보호액으로 제제화되는 면역요법 약제.

제 1항에 있어서, 세포가 디메틸술폭사이드 5 내지 20 % v/v 및 인간 혈청알부민 5 내지 20 w/v%를 조합하여 포함하는 냉동보호액으로 제제화되는 면역요법 약제.

제 1항에 있어서, 상기 약제가 면역 T-세포의 활성화에 의해 환자의 면역 반응을 유도할 수 있는 면역요법 약제.

제 1항에 있어서, 상기 약제가 항체 생산의 유도에 의해 환자에 면역 반응을 유도할 수 있는 것인 면역요법 약제.

제 1항에 있어서, 상기 약제가 전립선암 환자의 혈청 PSA 수치의 감소를 유도하거나, 또는 전립선암 환자의 혈청 PSA 수치의 증가속도의 감소를 유도할 수 있는 면역요법 약제.

제 1항에 있어서, 상기 약제가 피하로 투여될 수 있는 것인 면역요법 약제.

제 1항에 있어서, 상기 약제가 전립선내로 투여될 수 있는 것인 면역요법 약제.

전립선암 치료용 동종 면역요법 백신 조성물로, 상기 조성물이 제 1항에 따른 약제와, 부형제, 보조액 및 담체로 이루어진 군으로부터 선택되는 생리적으로 허용가능한 약제를 포함하는 조성물.

3종의 다른 인간 전립선 종양 세포계를 포함하는 전립선암 치료용 동종 면역요법 약제로, 1종의 세포계는 일차 전립선 종양으로부터 유래되고 다른 2종의 세포계는 전이 전립선 조직으로부터 유래되는 동종 면역요법 약제.

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