JP2002520048A - ヒト・アスパラギン酸プロテアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト・アスパラギン酸プロテアーゼ（ＮＨＡＰ）及びＮＨＡＰを同定しコードするポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニスト、及びアンタゴニストを提供する。また本発明は、ＮＨＡＰの発現が関連する疾病の診断、治療、又は予防方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、１９９８年１月１６日に出願された「ヒトプロテアーゼ分子」なる
名称の同時係属中の米国特許出願第０９／００８，２７１号の一部継続出願であ
る。

【０００２】 （技術分野） 本発明は、アスパラギン酸プロテアーゼの核酸及びアミノ酸配列、及び呼吸器
疾患、内分泌疾患、及び免疫疾患、及び癌の診断、治療、及び予防におけるこれ
らの配列の使用に関するものである。

【０００３】 （発明の背景） タンパク質分解プロセスは、正常な細胞の成長、分化、再構築、及びホメオス
タシスにとって必要不可欠な要素である。細胞内のペプチド結合の切断は、前駆
体タンパク質の活性形態への成熟、標的のタンパク質からのシグナル配列の除去
、正しくない形で折り畳まれたタンパク質の分解、及び細胞内でのペプチドの調
節された代謝回転のために必要不可欠である。プロテアーゼは、アポトーシス、
炎症、及び胚発育、創傷治癒及び正常な成長の際の組織再構築に関与する。また
プロテアーゼは、細菌、寄生虫、及びウイルスのホストへの侵入及びホスト内で
の複製における必要不可欠な要素である。哺乳動物のプロテアーゼの４つの主要
なカテゴリーが、活性部位の構造、作用機構、及び全体の三次元的構造に基づい
て特定された（Beynon, R.J.及びJ.S. Bond (1994) proteolytic Enzymes: A Pr
actical Approach, Oxford University Press, New York, NY, pp. 1-5）。

【０００４】 カテゴリーの１つは、前駆体タンパク質のプロセシングからタンパク質の細胞
内分解に至る様々な細胞プロセスに関与するシステインプロテアーゼである。シ
ステインプロテアーゼを産生するのは、単球、マクロファージ、及び炎症部位に
移動し、その防御的な役割を果たすために様々な分子を分泌して損傷を受けた組
織を修復する免疫系の他の細胞である。或る種の疾患においては、これらの細胞
が、同じ分子を過剰に産生し、組織破壊を引き起こすことがある。リソソームの
プロテアーゼのカテプシンファミリーとしては、カテプシンＢ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｏ
２、及びＳのようなシステインプロテアーゼ、及びペプシンＡ、ガストリクシン
、キモシン、レニン、及びカテプシンＤ及びＥのようなアスパラギン酸プロテア
ーゼが挙げられる。エンドソームプロテアーゼファミリーの様々なメンバーは異
なった発現の仕方をする。例えばカテプシンＤのようなメンバーは、広範な組織
分布を示すが、カテプシンＬのように、単球、マクロファージ、及び他の免疫系
の細胞においてのみ見られるものもある。

【０００５】 アスパラギン酸プロテアーゼの特徴的な活性部位の残基は、一対のアスパラギ
ン酸残基であり、例えばペニシロペプシンにおいてはａｓｐ（33番）及びａｓｐ
（213番）である。アスパラギン酸プロテアーゼは、その活性の最適ｐＨが２乃
至３の範囲にあることから、酸性プロテアーゼとも呼ばれる。このｐＨ範囲にお
いて、アスパラギン酸残基の一方はイオン化され、他方はイオン化されない。ア
スパラギン酸プロテアーゼの強力なインヒビターとして６アミノ酸のペプチドで
あるペプスタチンがあり、これは遷移状態において正常な基質に類似する。

【０００６】 カテプシンの調節及び発現の異常は、様々な炎症性疾病状態の証拠である。リ
ウマチ性関節炎のような自己免疫疾患では、システインプロテアーゼのカテプシ
ンＣが分泌されることにより、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、及び骨の細
胞外基質において見られる他の構造タンパク質が分解される。炎症の滑膜から単
離された細胞では、ストロメライシン、サイトカイン、ＴＩＭＰ−１、カテプシ
ン、ゼラチナーゼ、及び他の分子のｍＲＮＡが優先的に発現される。カテプシン
Ｌ及びＤの発現は、リウマチ性関節炎及び変形性関節炎の患者から得られた滑膜
組織において上昇する。カテプシンＬの発現も、単核細胞の流入の一因となり得
、この単核細胞の流入によってリウマチ様滑膜の破壊が更に進む（Keyszer, G.M
. (1995) Arthritis Rheum. 38:976-984）。カテプシンの発現の上昇及び調節の
変化は、様々な種類の癌の転移の可能性と関係があり、そのため治療上の及び予
後における興味の対象となる（Chambers, A.F.他 (1993) Crit. Rev. Oncog. 4:
95-114.）。

【０００７】 新規なアスパラギン酸プロテアーゼ及びそれをコードするポリヌクレオチドの
発見は、呼吸器疾患、内分泌疾患、及び免疫疾患、及び癌の診断、予防、及び治
療において役立つ新たな組成物を提供することにより、当分野における必要性を
満たすものである。

【０００８】 （発明の概要） 本発明は、実質的に精製されたポリペプチドであるアスパラギン酸プロテアー
ゼ（集合的に「ＮＨＡＰ」と称し、それぞれ「ＮＨＡＰ−１」及び「ＮＨＡＰ−
２」と称する）を提供する。或る実施態様では、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片、及びＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：３の断片からなる群から選択されたアミノ酸を有する実質的に精製されたポ
リペプチドを提供する。

【０００９】 更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、又はそれら
の配列の何れかの断片のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性
を有する実質的に精製された変異体を提供する。本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片、及びＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：３の断片からなる群から選択されたアミノ酸を有するポリペプチドを
コードする単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片、及
びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の断片からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと７０％以上のポリヌクレオチド配
列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異体も包含する。

【００１０】 更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１の断片、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の断片からなる群から選択されたア
ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、厳密な条件
の下でハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチドを提供すると共
に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断
片、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の断片からなる群から選択されたアミノ酸配列を
有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列を有する単離
され精製されたポリヌクレオチドも提供する。

【００１１】 また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２の断片、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の断片からなる群から選択されたポ
リヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。更
に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：２の断片、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の断片からなる群から選択されたポリヌ
クレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列と７０％以上のポリヌクレオチド配
列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異体を提供すると共に
、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の断片
、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の断片からなる群から選択されたポリヌクレオチド
配列を含むポリヌクレオチドに相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌ
クレオチドを提供する。

【００１２】 更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１の断片、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の断片からなる群から選択されたア
ミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも断片
を含む発現ベクターを提供する。別の実施態様では、この発現ベクターは、宿主
細胞内に含められる。

【００１３】 また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１の断片、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の断片からなる群から選択されたア
ミノ酸配列を含むポリペプチドの製造方法であって、（ａ）前記ポリペプチドの
発現に適した条件の下で、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少
なくとも断片を含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）前記
宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むことを特徴とする
、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片
、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の断片からなる群から選択されたアミノ酸配列を含
むポリペプチドの製造方法を提供する。

【００１４】 また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１の断片、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の断片からなる群から選択されたア
ミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを、適切な製薬用担体と共
に含む医薬品組成物を提供する。

【００１５】 更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１の断片、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の断片からなる群から選択されたア
ミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する精製された抗体、及び前記ポリペプチ
ドの精製されたアゴニスト及び精製されたアンタゴニストを提供する。

【００１６】 また本発明は、ＮＨＡＰの発現又は活性の低下に関係する内分泌疾患の治療又
は予防方法であって、そのような治療が必要な患者に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
３の断片からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポ
リペプチドを含む医薬品組成物を有効な量投与する過程を含む、ＮＨＡＰの発現
又は活性の低下に関係する内分泌疾患の治療又は予防方法を提供する。

【００１７】 また本発明は、ＮＨＡＰの発現又は活性の上昇に関連する内分泌疾患の治療又
は予防方法であって、そのような治療が必要な患者に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
３の断片からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドのアンタ
ゴニストを有効な量投与する過程を含む、ＮＨＡＰの発現又は活性の上昇に関連
する内分泌疾患の治療又は予防方法を提供する。

【００１８】 また本発明は、癌の治療又は予防方法であって、そのような治療が必要な患者
に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断
片、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の断片からなる群から選択されたアミノ酸配列を
有するポリペプチドのアンタゴニストを有効な量投与する過程を含む、癌の治療
又は予防方法を提供する。

【００１９】 また本発明は、免疫疾患の治療又は予防方法であって、そのような治療が必要
な患者に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１の断片、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の断片からなる群から選択されたアミノ酸
配列を有するポリペプチドのアンタゴニストを有効な量投与する過程を含む、免
疫疾患の治療又は予防方法を提供する。

【００２０】 また本発明は、核酸を含む生物学的サンプルにおける、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：３の断片からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドの検出方法であって、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
の断片からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド配列の相補配列と、生物学的サンプルにおける核酸の少なくと
も１種類とをハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過
程と、（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記
ハイブリダイゼーション複合体の存在が、前記生物学的サンプルにおける該ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在と相関性を有する、該過程とを有
する、核酸を含む生物学的サンプルにおける、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の断
片からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドの検出方法を提供する。或る実施態様では、前記方法が、ハイブ
リダイゼーションの前に、前記ポリヌクレオチドを増幅する過程を含む。

【００２１】 （発明の実施の形態） 本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列、及び方法について説明する前に、本
発明は、ここに開示した特定の方法論、プロトコル、細胞系、ベクター、及び試
薬に限定されず、これらを変更して実施できることを理解されたい。また、ここ
で用いられる用語法は、特定の実施例のみを説明する目的で用いられたものであ
り、特許請求の範囲の請求項のみによって限定される本発明の範囲を限定するこ
とを意図したものではないということも理解されたい。

【００２２】 本明細書及び請求の範囲において、単数を表す「或る」及び「その（この）」
と形容されたものは、前後関係でそうでないことが明らかである場合以外は、複
数の意味も含んでいることに注意しなければならない。従って、例えば「或る宿
主細胞」なる表記が表すものには、複数のそのような宿主細胞が含まれ、この「
抗体」なる表記は、１種またはそれ以上の種類の抗体及び当業者に周知のその等
価物等も表している。

【００２３】 本明細書における全ての科学技術専門用語は、特別に定義されていない限り、
本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者に一般に理解されるのと
同じ意味を有する。ここに説明したものと類似のまたは等価な方法や材料を本発
明の実施や試験において用いることができるが、好適な方法、装置、及び材料を
本明細書において説明する。本明細書に記載された全ての文献は、本発明の関連
において用いられ得る文献で報告された細胞系、ベクター、及び方法論を説明し
開示する目的で引用されたものであり、この引用により本明細書の一部とする。
本明細書のあらゆる開示内容を、本発明におけるそのような開示内容が従来技術
に先行し得ないことを認めるものと解釈してはならない。

【００２４】 定義 本明細書において、ＮＨＡＰは、任意の種、具体的にはウシ、ヒツジ、ブタ、
マウス、ウマ、及び好ましくはヒトを含む哺乳動物に由来する、天然物、合成物
、半合成物、又は組換え体の何れかを起源として得られる実質的に精製されたＮ
ＨＡＰのアミノ酸配列である。

【００２５】 本明細書において、用語「アゴニスト」は、ＮＨＡＰに結合したときＮＨＡＰ
の効果を強めたり、その効果の持続時間を長くさせる分子である。アゴニストに
は、ＮＨＡＰに結合し、その効果を変調するタンパク質、核酸、糖質や、任意の
他の分子が含まれ得る。

【００２６】 本明細書において「アレル変異体」とは、ＮＨＡＰをコードする遺伝子の対立
形である。アレル変異体は、核酸配列の少なくとも一箇所の変異によって生じ得
、これにより変異したｍＲＮＡ或いはポリペプチドを生ずるが、その変異ポリペ
プチドの構造や機能は、変わる場合もあれば変わらない場合もある。与えられた
元のままの遺伝子または組換え遺伝子には、アレル形が存在しないもの、１つ存
在するもの、或いは多数存在するものがある。一般にアレルを生じる変異はヌク
レオチドの自然な欠失、付加並びに置換に因るものである。このタイプの変化は
それぞれ単独で、或いは他の変化と同時に、所定の配列内で１回又は２回以上生
じ得る。

【００２７】 本明細書において、ＮＨＡＰをコードする「変異」核酸配列とは、異なるヌク
レオチド残基の欠失、挿入並びに置換を含み、ＮＨＡＰと同一のポリヌクレオチ
ド、またはＮＨＡＰの機能的特徴の少なくとも１種類を備えているポリペプチド
を作り出すものである。この定義には、ＮＨＡＰをコードするポリヌクレオチド
配列の正常な染色体上の遺伝子座以外の座位を有する、アレル変異体との不適切
又は予期しないハイブリダイゼーション、及びＮＨＡＰをコードするポリヌクレ
オチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検
出が困難な多型が含まれている。コードされたタンパク質も同様に「変異」した
ものであり得、サイレント変化となるアミノ酸残基の欠失、挿入並びに置換を含
み、結果的に機能的に等価なＮＨＡＰとなるものであり得る。意図的なアミノ酸
の置換は、ＮＨＡＰの生物学的または免疫学的活性が保持される限りの範囲で、
残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性並びにまた両親媒性についての類似
に基づいてなされ得る。例えば負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸
及びグルタミン酸があり、正に荷電したアミノ酸としては、リジン及びアルギニ
ンがあり、近い親水性値を有する荷電していない極性頭基を有するアミノ酸とし
ては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、
グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン並びにチロシンがある。

【００２８】 本明細書において「アミノ酸」または「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、
ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の配列及びその断片であり、自然発生
の又は合成した分子である。これに関連して、「断片（フラグメント）」、「免
疫原性断片」、または「抗原性断片」とは、好ましくは約５〜約１５個以上のア
ミノ酸、最も好ましくは１４個以上のアミノ酸からなる長さを有するとともに、
ＮＨＡＰの生物学的活性又は免疫学的活性を保持しているＮＨＡＰの断片である
。ここで「アミノ酸配列」が自然発生のタンパク質分子のアミノ酸配列を表すも
のとして用いられている場合には、「アミノ酸配列」等の用語は、アミノ酸配列
を本明細書に記載のタンパク質分子に関連する完全な元のままのアミノ酸配列に
限定する意味で用いられているわけではない。

【００２９】 本明細書において「増幅」は、核酸配列の更なるコピーを生成することであり
、通常は当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて行われる（
例えば、Dieffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995) PCR Primer. a Laborato
ry Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, pp.1-5を参照）。

【００３０】 本明細書において、用語「アンタゴニスト」は、ＮＨＡＰに結合したとき、Ｎ
ＨＡＰの生物学的又は免疫学的活性の強さを低下させたり、活性の持続時間を短
縮させる分子である。アンタゴニストとしては、ＮＨＡＰの作用を低下させるタ
ンパク質、核酸、糖質や、任意の他の分子等が挙げられる。

【００３１】 本明細書において、用語「抗体」は、完全な抗体分子と、Ｆａ、Ｆ（ａｂ'）₂ 、及びＦｖフラグメントのような抗原決定基と結合し得るそのフラグメントとを
指す。ＮＨＡＰポリペプチドに結合する抗体は、免疫化の抗原として、完全なポ
リペプチドを用いて、或いは小さい目的のペプチドを含むそのフラグメントを用
いて作り出すことができる。動物を免疫化するために用いられるポリペプチドま
たはオリゴペプチドは、翻訳されたＲＮＡから作り出されたものか、化学的に合
成されたものであり得、必要ならば担体タンパク質と結合させることができる。
ペプチドに化学的に結合する通常用いられる担体としては、ウシ血清アルブミン
及びサイログロブリン、及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が挙
げられる。この結合したペプチドを用いて動物を免疫化する。

【００３２】 本明細書において、用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の断片
（即ちエピトープ）である。タンパク質の一部分、即ち断片を用いてホストの動
物を免疫化すると、このタンパク質の様々な領域が、抗原決定基（該タンパク質
上の所定の領域または三次元構造）に特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る
。抗原決定基は、抗体との結合について、元の抗原（即ち免疫応答を引き出すた
めに用いられる免疫原）と競合し得る。

【００３３】 本明細書において、用語「アンチセンス」は、特定の核酸配列の「センス」鎖
に対して相補的なヌクレオチド配列である。アンチセンス分子は、合成や転写を
含む任意の方法で作り出すことができる。この相補的ヌクレオチドは、一旦細胞
内に導入されると、細胞によって作られた天然の配列と結合して二重鎖を形成し
、更なる転写や翻訳を阻害する。「マイナス（−）」なる表現はアンチセンス鎖
を表すことがあり、「プラス（＋）」はセンス鎖の意味で用いられることがある
。

【００３４】 本明細書において、用語「生物学的に活性」は、自然発生の分子の構造的機能
、調節機能、又は生化学的機能を有するタンパク質を表す。同様に「免疫学的に
活性」は、天然の、組換え体の、又は合成のＮＨＡＰ、若しくはそのオリゴペプ
チドの、適当な動物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定の抗体に結合
する能力を指す。

【００３５】 本明細書において、用語「相補的」または「相補性」は、塩基対を形成してポ
リヌクレオチド同士が自然に結合する性質である。例えば、配列「５’Ａ−Ｇ−
Ｔ３’」は相補的配列「３’Ｔ−Ｃ−Ａ５’」に結合する。２本の一本鎖分子の
間の相補性は、幾つかの核酸のみが結合する「部分的」なものであるか、若しく
は両一本鎖分子の全てにわたって相補性が存在する場合は完全に相補的なもので
あり得る。核酸鎖同士の相補性の程度は、核酸鎖同士のハイブリダイゼーション
の効率及び強さに有意な影響を与える。このことは、核酸鎖同士の結合によって
左右される増幅反応において、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）分子の設計及び使用
において特に重要である。

【００３６】 本明細書において「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定
のアミノ酸配列を含む組成物」とは、所定のポリヌクレオチド配列またはアミノ
酸配列を含むあらゆる物質をさす。この組成物には、乾燥した製剤又は水溶液が
含まれる。ＮＨＡＰまたはＮＨＡＰの断片をコードするポリヌクレオチド配列を
含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。こ
のプローブは凍結乾燥して保存することができ、糖質のような安定化剤と結合さ
せることができる。ハイブリダイゼーションにおいて、このプローブは、塩（例
えばＮａＣｌ）、界面活性剤（例えばＳＤＳ）及び他の物質（例えばデンハート
液、乾燥ミルク、サケ精子ＤＮＡ等）を含む水溶液に展開することができる。

【００３７】 本明細書において「コンセンサス」は、再配列決定して不要な塩基を分離し、
XL-PCR^TM（The Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT）を用いて５′方向及び／ま
たは３′方向に延長し、再配列決定した核酸配列か、フラグメントを組み立てる
ためのコンピュータプログラム（例えばGELVIEW^TM Fragment Assembly system,
GCG, Madison WI）を用いて２種以上のインサイト社クローンの重複した配列を
組み合わせて導き出した核酸配列である。延長と組み合わせの両方によってコン
センサス配列が作られることもある。

【００３８】 本明細書において、「ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する」なる表現は
、ノーザン法による解析でＮＨＡＰをコードする核酸配列と同一または近縁な核
酸の存在が検出されることが、サンプル内のＮＨＡＰをコードする核酸の存在を
表し、従ってＮＨＡＰをコードする遺伝子からの転写物の発現と相関性を有して
いる、ということを表している。

【００３９】 本明細書において「欠失」は、１個または２個以上のヌクレオチド若しくはア
ミノ酸残基またはヌクレオチドが欠ける、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列
の変化である。

【００４０】 本明細書において、用語「誘導体」は、ポリペプチド配列またはポリヌクレオ
チド配列を化学的に修飾したものを意味する。ポリヌクレオチド配列の修飾の例
としては、水素からアルキル基、アシル基、又はアミノ基への置換があげられる
。誘導体ポリヌクレオチドは、修飾していない分子の生物学的又は免疫学的機能
のなかの少なくとも１種類を保持しているポリペプチドをコードする。誘導体ポ
リペプチドは、元のポリペプチドの生物学的又は免疫学的機能のなかの少なくと
も１種類を保持しており、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（PEGylati
on）、または他のプロセスで修飾されたものである。

【００４１】 本明細書において、用語「類似性」は、或る程度の相補性を意味する。部分的
な類似性と、完全な類似性があり得る。用語「同一性」は、用語「類似性」の代
りに用いることができる。部分的に相補的な配列は、同一の配列が標的の核酸と
ハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害するものであり、このことを「
実質的に類似性を有する（実質的に類似な）」という。完全に相補的な配列と標
的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、低い厳密性条件の下でのハイブリ
ダイゼーションアッセイ（サザンブロット法またはノーザンブロット法、溶液ハ
イブリダイゼーション等）によって調べることができる。実質的に類似な配列、
即ちハイブリダイゼーションプローブは、低い厳密性条件の下で、標的の配列と
完全に類似な（同一の）配列との結合について競合し、それを阻害する。このこ
とは、厳密性の条件が低いことが非特異的な結合を許容するということを意味す
るわけではない。低い厳密性条件でも、２つの配列の相互の結合が特異的（即ち
選択的）相互作用であることが必要だからである。非特異的結合が存在しないこ
とは、部分的な程度の相補性も有していない（例えば約３０％未満の類似性また
は同一性を有する）第２の標的配列を用いることにより調べることができる。非
特異的結合が不存在の場合、プローブは第２の非相補的標的配列とハイブリダイ
ズしない。

【００４２】 「パーセント同一性」或いは「％同一性」という言いまわしは、２以上のアミ
ノ酸または核酸配列を比較した際の配列類似性のパーセンテージである。パーセ
ント同一性は、例えばMegAlign^TMプログラム（DNASTAR, Inc., Madison WI）を
用いることによって電子的に求めることができる。このMegAlign^TMプログラムは
、異なる方法、例えばクラスタ法（clustal method）（例えばHiggins, D.G.及
びP.M. Sharp (1988) Gene 73:237-244参照）に従って２以上の配列のアライメ
ントを作成することができる。このクラスタ法のアルゴリズムでは、配列群を、
全ての配列の対について両配列間の距離を調べることによってクラスタ（集団）
にグループ分けする。このクラスタ群について、一対毎にアライメントをとり、
次にグループにおいてアライメントをとる。２つのアミノ酸配列、例えば配列Ａ
と配列Ｂの間のパーセント類似性は、（配列Ａの長さ−配列Ａにおけるギャップ
残基の数−配列Ｂにおけるギャップ残基の数）／（配列Ａと配列Ｂとの間の残基
の一致の総数）×１００で計算する。２つのアミノ酸配列の間の類似性の差が低
いか無いケースは、パーセント類似性の計算に含められない。核酸配列間のパー
セント同一性も、他の周知の方法、例えばJotun Hein法（例えばHein J. (1990)
Methods Enzymol. 183: 626-645参照）によってカウント即ち計算することがで
きる。配列間の同一性は、他の周知の方法、例えばハイブリダイゼーション条件
を変えることによっても決定することができる。

【００４３】 本明細書において「ヒト人工染色体」（ＨＡＣ）は、約６ｋｂ〜１０Ｍｂのサ
イズのＤＮＡ配列を含んでおり、安定した分裂期染色体の分離及び維持に必要な
全ての要素を含む直鎖状の小染色体である（例えば、Harrington, J.J.等 (1997
) Nat Genet. 15:345-355参照）。

【００４４】 本明細書において、用語「ヒト化抗体」は、元の結合能力をそのまま保持しつ
つヒトの抗体により近いものとなるように、非抗原結合領域におけるアミノ酸配
列を改変した抗体分子である。

【００４５】 本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション（ハイブリッド形成）」と
は、核酸の鎖が塩基対の形成によって相補鎖と結合する過程である。

【００４６】 本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、２つの核酸配
列の間で、相補的な塩基間での水素結合の形成によって形成された複合体である
。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中で形成させるか（例えばＣ₀ｔ又は
Ｒ₀ｔ解析の場合）、或いは核酸は溶液中に存在する一方の核酸と、固形支持体
（例えば細胞やその核酸が固定されるような、紙、メンブラン、濾紙、チップ、
ピン、スライドガラス、または他の適切な基板）に固定されたもう一方の核酸と
の間で形成させることができる。

【００４７】 本明細書において「挿入」或いは「付加」は、自然発生の分子における配列と
比較して、１個または２個以上のヌクレオチドが加わるようなヌクレオチド配列
の変化、或いは１個または２個以上のアミノ酸残基が加わるようなアミノ酸配列
の変化である。

【００４８】 「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫疾患、または感染症や遺伝病等に関連する
状態であり得る。この状態は、細胞の及び全身の防御系に影響を及ぼし得る様々
な因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、及び他のシグナル伝達分子の発現に
よって特性化され得る。

【００４９】 本明細書において、用語「マイクロアレイ」は、異なるポリヌクレオチドを基
板上に配列したものである。基板としては、例えば紙、ナイロン又は他のタイプ
のメンブラン、濾紙、チップ、スライドガラス、又は他の任意の適切な固体支持
体が用いられる。

【００５０】 本明細書において、マイクロアレイに関連して用いられる用語「エレメント」
または「アレイエレメント」とは、基板の表面上に配列されたハイブリダイズ可
能なポリヌクレオチドである。

【００５１】 本明細書において、用語「変調」は、ＮＨＡＰの活性の変化である。例えば、
変調によって、タンパク質の活性の上昇や低下、結合特性の変化、又はＮＨＡＰ
の生物学的、機能的、免疫学的特性の他の変化が生ずる。

【００５２】 本明細書において「核酸」または「核酸配列」という用語は、ヌクレオチド、
オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはその断片を表す。この用語は、
一本鎖か二本鎖のセンス鎖またはアンチセンス鎖であり得るゲノム起源又は合成
したＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはあらゆるＤＮＡ様ま
たはＲＮＡ様物質をも表す。これに関連して、「断片（フラグメント）」は、例
えば同じゲノム内の他のあらゆる配列とは区別される点で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を特定する独特のポリヌクレオチド配列の領域を含
む核酸配列である。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の断片またはＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：４の断片は、ハイブリダイゼーション及び増幅技術や、近縁なポリヌクレオ
チド配列からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の断片またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を区別す
るための類似の方法において有用である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の断片またはＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の断片の長さは、少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドから
なる長さである。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の断片、及
びその断片が対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の領域の
正確なサイズは、断面の使用目的に応じて当業者が繰り返し求めることができる
。或いは、断片が翻訳されると、完全長ペプチドの幾つかの機能的特徴（例えば
抗原性）や、構造的ドメインの特徴（例えばＡＴＰ結合部位）を保持しているポ
リペプチドが作り出される。

【００５３】 本明細書において、用語「機能的に関連する」または「機能的に結びついた」
は、機能的に関連する核酸配列を意味する。プロモーターは、そのプロモーター
がコーディング配列によってコードされたポリペプチドの翻訳を調節しているな
れば、コーディング配列と機能的に関連、或いは機能的に結びついている。機能
的に関連する、または機能的に結びついた核酸配列同士は、近接し、同じ読み枠
内に存在することもあるが、或る種のゲノムエレメント、例えばリプレッサー遺
伝子は、ポリペプチドをコードする配列に近接した位置には存在しないが、その
ポリペプチドの発現を調節するオペレーター配列に結合する。

【００５４】 本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」は、ＰＣＲ増幅、ハイブリダ
イゼーションアッセイやマイクロアレイで用いることができる核酸配列であって
、長さが約６ヌクレオチド以上、最大６０ヌクレオチド程度、好適には１５〜３
０ヌクレオチド、より好適には２０〜２５ヌクレオチドであるものを指す。本明
細書において、用語「オリゴヌクレオチド」は、当分野において一般に定義され
ている用語「アンブリマー」、「プライマー」、「オリゴマー」、及び「プロー
ブ」と実質的に同義である。

【００５５】 本明細書において、「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）は、末端がリジンであるアミ
ノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した、約５ヌクレオチド以上の長さのオ
リゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子即ち抗遺伝子剤を意味する。末端のリ
ジンがこの物質に溶解性を賦与している。ＰＮＡは、相補的な一本鎖ＤＮＡやＲ
ＮＡに優先的に結合して転写物の伸長を止め、また、ＰＮＡをポリエチレングリ
コール化して細胞におけるその寿命を延ばすことができる（Nielsen, P.E.他(19
93) Anticancer Drug Des. 8:53-63）。

【００５６】 本明細書において、用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている
。ＮＨＡＰをコードする核酸またはその断片またはＮＨＡＰ自体を含む疑いのあ
る生物学的サンプルとしては、体液；細胞からの抽出物や細胞から単離された染
色体、細胞小器官、又は細胞膜からの抽出物；細胞；溶液中の、または固体支持
体に結合したゲノムのＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡ；組織：組織プリントそ
の他がある。

【００５７】 本明細書において、用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、タン
パク質またはペプチドと、アゴニスト、抗体、またはアンタゴニストとの相互作
用である。この相互作用は、結合する分子によって認識されるタンパク質上の特
定の構造、例えば、抗原決定基即ちエピトープの存在に左右される。例えば、抗
体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、フリーの標識したＡ及びその
抗体を含む反応において、エピトープＡを含むポリペプチド、またはフリーの非
標識Ａが存在すると、抗体に結合した標識Ａの量が低下する。

【００５８】 本明細書において、用語「厳密な条件（厳密性条件）」とは、ポリヌクレオチ
ドと特許請求の範囲に記載のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可
能な条件を意味する。厳密な条件は、塩濃度、例えばホルムアミドのような有機
溶媒の濃度、温度、及び他の周知の条件によって定義することができる。詳述す
ると、塩濃度を下げたり、ホルムアミド濃度を高めたり、或いはハイブリダイゼ
ーション温度を高めることによって厳密性を高めることができる。

【００５９】 本明細書において、用語「実質的に精製された」は、天然の環境から取り除か
れ、天然にはそれが結合して存在する他の構成要素から単離又は分離されて、６
０％以上、好ましくは７５％以上、最も好ましくは９０％以上がフリーな状態に
ある核酸配列又はアミノ酸配列を表す。

【００６０】 本明細書において「置換」は、それぞれ１個または２個以上のヌクレオチド或
いはアミノ酸を、異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置き換えることである。

【００６１】 本明細書の定義では、「形質転換」は、外来ＤＮＡが入ってレシピエント細胞
を変化させるプロセスを意味する。このプロセスは、周知の様々な方法に従って
自然の条件または人工の条件の下で生じ得、また、外来核酸配列を原核細胞また
は真核細胞の宿主細胞に導入するための何らかの既知の方法に基づいている。形
質転換のための方法は、形質転換される宿主細胞によって選択され、以下に限定
するものではないが、ウイルス感染による方法、電気穿孔法（エレクトロポレー
ション）、熱ショック、リポフェクション、及び微粒子銃を用いる方法が含まれ
得る。用語「形質転換（された）」細胞とは、挿入されたＤＮＡが、自律的に複
製するプラスミドとして、または宿主の染色体の一部としてその内部で複製が可
能な安定的に形質転換された細胞とともに、導入されたＤＮＡやＲＮＡを限られ
た時間だけ発現する一過性の形質転換をされた細胞等である。

【００６２】 本明細書においてＮＨＡＰポリペプチドの「変異体」は、１又は２箇所以上の
アミノ酸が変異したアミノ酸配列である。この変異体は「保存的」変化を含むも
のであり得、この保存的変化では、（例えばロイシンをイソロイシンで置き換え
る場合のように）置換されるアミノ酸が類似な構造的及び化学的特性を有する。
稀に、変異体が「非保存的」に変化する場合もある（例えばグリシンがトリプト
ファンで置換される場合）。類似した小変化として、アミノ酸の欠失か挿入、若
しくはその両方が含まれることもある。例えばLASERGENE^TMソフトウエアのよう
な周知のコンピュータプログラムを用いることが、生物学的或いは免疫学的活性
を損なわずに置換、挿入、又は欠失できるアミノ酸が何れかということを決定す
る助けとなる。

【００６３】 用語「変異体または変異配列」は、ポリヌクレオチド配列に関連して用いられ
る場合、ＮＨＡＰに近縁なポリヌクレオチド配列を包含し得る。この定義には、
例えば、「アレル変異体」（前に定義した）、「スプライスバリアント」、「種
変異体」、または「多型変異体」も含まれる。スプライスバリアントは、基準の
分子と有意な同一性を有し得るが、ｍＲＮＡのプロセシングの際にエキソンのス
プライシング部位が変わるためにポリヌクレオチドの数が多いか或いは少ないも
のである。対応するポリペプチドは、追加の機能的ドメインを有していたり、或
いはドメインが欠けていることがある。種変異体は、種の間で異なるポリヌクレ
オチド配列である。これから生ずるポリペプチドは、通常、互いに有意なアミノ
酸同一性を有している。多型変異体は、ポリヌクレオチド配列の１箇所の塩基が
異なっている「一塩基多型」（ＳＮＰｓ）も包含している。ＳＮＰｓが存在する
ことが、例えば、一定の集団、疾病状態、または疾病状態の性向を示すことがあ
る。

【００６４】 発明 本発明は、２種の新規なヒト・アスパラギン酸プロテアーゼ（ＮＨＡＰ）、Ｎ
ＨＡＰをコードするポリヌクレオチド、及び呼吸器疾患、内分泌疾患、及び免疫
疾患、及び癌の診断、治療、又は予防のためのこれらの組成物の使用法の発見に
基づくものである。

【００６５】 本発明のＮＨＡＰ−１及びＮＨＡＰ−２をコードする核酸は、以下のインサイ
ト社クローン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、即ちクローン
No. 372637H1（LUNGNOT02を起源）、1242901H1（LUNGNOT03を起源）、2222291H
1（LUNGNOT18を起源）、2435410H1（EOSINOT03を起源）、及び2756549H1（THP1A
ZS08を起源）において、アミノ酸配列アライメントのコンピュータ検索、例えば
BLAST等を用いて同定された。ＮＨＡＰ−１の完全長ｃＤＮＡ配列は、GeneTrapp
er^TMメソッド（Life Technologies, Gaithersburg MD）及びインサイト社クロー
ンNo. 2756549（THP1AZS08を起源）から作られたオリゴヌクレオチドを用いて、
ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーから得た。ＮＨＡＰ−２の完全長ｃＤＮＡ配列は、
GeneTrapper^TMメソッド（Life Technologies）と、ＮＨＡＰ−１の場合に用いた
ものと同一のオリゴヌクレオチドとを用いてヒト白血球ｃＤＮＡライブラリーか
ら得た。

【００６６】 或る実施例では、本発明は、図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、及び図１Ｄに示すＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。ＮＨＡＰ−１
は４２０個のアミノ酸からなる長さを有し、残基Ｍ（1番）〜Ｐ（21番）に渡る
シグナルペプチド配列を有する。Ｎグリコシル化可能部位は、残基Ｎ（90番）、
Ｎ（133番）、及びＮ（336番）に見られる。リン酸化可能部位は、カゼインキナ
ーゼＩＩによるリン酸化可能部位がＳ（60番）及びＴ（338番）に、プロテイン
キナーゼＣによるリン酸化可能部位がＳ（106番）、Ｔ（143番）、Ｔ（346番）
、及びＳ（393番）に見られる。２つのロイシンジッパーパターンは、Ｌ（309番
）及びＬ（316番）から始まっており、細胞接着可能部位は、配列Ｒ387ＧＤに見
られる。アスパラギン酸プロテアーゼの特徴である２つの活性部位アスパラギン
酸残基は、残基Ｄ（96番）及びＤ（283番)に見られる。BLOCKS及びPRINTS解析に
よっても、アスパラギン酸プロテアーゼの特徴である２つのアスパラギン酸残基
を包含する配列を同定できる。図３Ａ、図３Ｂ、及び図３Ｃに示すように、ＮＨ
ＡＰ−１は、マウスのアスパラギン酸プロテアーゼ様タンパク質（GI 1906810；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）と化学的及び構造的類似性を有する。詳述すると、Ｎ
ＨＡＰ−１とマウスのアスパラギン酸様タンパク質は、６９％の配列同一性を共
有している。この２種のタンパク質は、シグナル配列、３カ所のグリコシル化可
能部位、及びＮＨＡＰ−１ではＳ（106番）、Ｔ（143番）、及びＴ（338番）に
見られるリン酸化可能部位を共有している。ＮＨＡＰ−１及びＮＨＡＰ−２にお
いて見られる２つの活性部位アスパラギン酸残基、及びそれを取り囲む配列は、
マウスのタンパク質においても保存されている。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ
酸残基Ｐ（54番）からアミノ酸残基Ｖ（76番）に渡る断片をコードする、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２の、ヌクレオチド（160番）〜ヌクレオチド（228番）の断片は、
例えばハイブリダイゼーションプローブとして有用である。

【００６７】 別の実施例では、本発明は、図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、及び図２Ｄに示すよう
なＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。ＮＨＡ
Ｐ−２は４３３個のアミノ酸からなる長さを有し、Ｍ（1番）〜Ｐ（21番）にわ
たるシグナル配列、Ｎ（90番）、Ｎ（125番）、及びＮ（336番）の３箇所のＮグ
リコシル化可能部位、Ｔ（143番）のｃＡＭＰ−ｃＧＭＰ依存性プロテインキナ
ーゼのリン酸化可能部位、Ｓ（60番）、Ｓ（181番）、Ｔ（338番）及びＴ（383
番）のカゼインキナーゼリン酸化可能部位、Ｓ（106番）、Ｓ（129番）、及びＴ
（143番）のプロテインキナーゼＣによるリン酸化可能部位、Ｙ（７８番）のチ
ロシンキナーゼによるリン酸化可能部位を有し、細胞接着部位は、配列Ｒ387Ｇ
Ｄに見出される。アスパラギン酸プロテアーゼの特徴である２つの活性化部位ア
スパラギン酸残基は、残基Ｄ（96番）及びＤ（283番）に見出される。BLOCKS及
びPRINTS解析によっても、アスパラギン酸プロテアーゼの特徴である２つのアス
パラギン酸残基を含む配列を同定できる。図３Ａ、図３Ｂ及び図３Ｃに示すよう
に、ＮＨＡＰ−２は、マウスアスパラギン酸プロテアーゼ様タンパク質（GI 190
6810；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）と化学的及び構造的類似性を有する。詳述する
と、ＮＨＡＰ−２とマウスのアスパラギン酸プロテアーゼ様タンパク質は、６９
％の配列同一性を共有し、Ｎ（90番）及びＮ（336番）の２つのグリコシル化可
能部位、及びＮＨＡＰ−２のＳ（106番）、Ｓ（129番）、Ｔ（143番）、及びＴ
（338番）に見られるリン酸化可能部位を共有している。ＮＨＡＰ−２に見られ
る２つの活性化部位アスパラギン酸残基及びそれを取り囲む配列は、マウスのタ
ンパク質においても保存されている。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸残基Ｐ（
54番）〜アミノ酸残基Ａ（76番）の断片をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の、
ヌクレオチド（190番）〜ヌクレオチド（258番）の配列は、例えばハイブリダイ
ゼーションプローブとして役立つ。

【００６８】 電子的なノーザン法による解析の結果から、様々なｃＤＮＡライブラリーにお
いて発現されたＮＨＡＰが集まったクローンが分かる。このようなｃＤＮＡライ
ブラリーの５９％以上は癌及び不死化細胞系関連であり、２２％以上は、炎症及
び免疫応答に関連するものである。特に注目すべきは、肺組織（３７％）におけ
るＮＨＡＰの発現である。ＮＨＡＰ−２のｃＤＮＡライブラリーを用いる膜をベ
ースにしたノーザン法解析によって、腎臓、肺、及び例えば脾臓、骨髄、及び末
梢血白血球のような免疫応答に関連する組織における〜１．３ｋｂのＲＮＡ種の
発現が分かった（図４参照）。ＮＨＡＰ−２プローブが、ＮＨＡＰ−２と〜９０
％の相同性を有していることから、この解析は、ＮＨＡＰ−１とＮＨＡＰ−２の
両方の発現を表している。ＮＨＡＰ−１に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ
を用いた膜をベースにしたノーザン法解析の結果（図５）から、〜１．３ｋｂの
ＲＮＡ種が肺においてのみ発現されることが分かった。ＮＨＡＰ−１特異的ウサ
ギ免疫血清を用いた正常な及び疾病状態のヒト組織サンプルを免疫細胞化学的に
染色することにより、脳下垂体、甲状腺の瀘胞細胞、正常な肺の気胞、細気管支
肺胞性癌、及び肺の腺癌におけるこのタンパク質の発現が立証された。

【００６９】 図６は、大腸菌において発現された組換えＮＨＡＰ−１タンパク質のウエスタ
ンブロット法分析の結果を示す。ＮＨＡＰ−１は、免疫前血清ではなく免疫血清
を用いて約４５ｋＤａのバンドとして検出され、ＮＨＡＰ−１の発現物を含むＩ
ＰＴＧで誘導された細胞において圧倒的に多く見出された。

【００７０】 ＦＩＳＨ解析による染色体上の位置決定実験により、ＮＨＡＰ−１及びＮＨＡ
Ｐ−２をコードする遺伝子は、染色体１９の長いアーム、特にバンド１９ｑ１３
．３に対応する領域に位置決定されることが分かった。

【００７１】 また本発明は、ＮＨＡＰの変異体を包含する。好適なＮＨＡＰ変異体は、ＮＨ
ＡＰアミノ酸配列と８０％以上、より好適には９０％以上、最も好ましくは９５
％以上のアミノ酸配列同一性を有し、且つＮＨＡＰの機能的特徴または構造的特
徴の少なくとも１種類を保持しているものである。

【００７２】 また本発明は、ＮＨＡＰをコードするポリヌクレオチドを包含する。具体的な
実施例では、本発明は、ＮＨＡＰをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を含
むポリヌクレオチドを包含する。更に別の実施例では、本発明は、ＮＨＡＰをコ
ードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の配列を含むポリヌクレオチドを包含する。

【００７３】 また本発明は、ＮＨＡＰをコードするポリヌクレオチドの変異体を包含する。
詳述すると、そのような変異体ポリヌクレオチド配列は、ＮＨＡＰをコードする
ポリヌクレオチド配列と７０％以上、より好適には８０％以上、最も好ましくは
９５％以上のポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施態様は
、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列と７０％以上、より好適には８０％以上、最も好
ましくは９５％以上のポリヌクレオチド配列同一性を有する。更に本発明は、Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の配列と７０％以上、より好適には８０％以上、最も好まし
くは９５％以上のポリヌクレオチド配列同一性を有する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
のポリヌクレオチド変異体を包含する。上述のポリヌクレオチド変異体の何れか
１つは、ＮＨＡＰの機能的特徴または構造的特徴の少なくとも１種類を有するア
ミノ酸配列をコードし得る。

【００７４】 当業者には理解されるように、遺伝暗号の縮重の結果、任意の既知の自然発生
遺伝子のヌクレオチド配列と最小限の類似性しか有していないものも含めて、多
種のＮＨＡＰをコードするヌクレオチド配列が作り出され得る。従って本発明は
、可能なコドン選択に基づく組み合わせを選択することによって作り出されるあ
らゆる可能な核酸配列の変異をその範囲に含んでいる。それらの組み合わせは、
自然発生のＮＨＡＰのヌクレオチド配列に適用されるような標準的なトリプレッ
ト遺伝暗号に基づいて作り出されるものであり、このような変異は全てここに具
体的に開示されたものと考えられたい。

【００７５】 ＮＨＡＰをコードするヌクレオチド配列及びその変異体は、適切に選択された
厳密性の条件の下で自然発生配列のヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であ
るのが好ましいが、実質的に異なるコドン、例えば非自然発生のコドンを有して
いる、ＮＨＡＰをコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る
。コドンの選択においては、特定のコドンが宿主によって使用される頻度に従っ
て、特定の原核細胞又は真核細胞の発現宿主におけるペプチド発現の発生率を高
めるように選択することができる。ＮＨＡＰをコードするヌクレオチド配列及び
その誘導体を、コードされるアミノ酸配列を変えないように実質的に改変する他
の理由として、例えば自然発生の配列から作られる転写物より長い半減期のよう
な、より望ましい特性を有するＲＮＡ転写物を作り出すことが挙げられる。

【００７６】 本発明には、ＮＨＡＰ及びＮＨＡＰ誘導体をコードするＤＮＡ配列又はその断
片の、完全な合成ケミストリによる作製も含まれる。この合成配列は、作製後、
周知の試薬を用いて様々な入手可能な発現ベクター及び細胞系に挿入することが
できる。更に、合成ケミストリを用いてＮＨＡＰをコードする配列又はその任意
の断片に突然変異を導入することができる。

【００７７】 また本発明の範囲に含まれるものとして、種々の厳密性条件（例えば、Wahl,
G.M. 及びS.L.Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399-407、及びKimmel, A.R
. (1987) Methods in Enzymol. 152:507-511参照）の下で請求項に記載のヌクレ
オチド配列、具体的にはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２の断片、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の断片とハイブリダイズし
得るポリヌクレオチド配列がある。例えば、厳密な条件の塩濃度は、通常、概ね
750mM未満のNaCl及び75mM未満のクエン酸３ナトリウム、好ましくは約500mM未満
のNaCl及び50mM未満のクエン酸３ナトリウム、最も好ましくは約250mM未満のNaC
l及び25mM未満のクエン酸３ナトリウムである。低い厳密性のハイブリダイゼー
ションは、例えばホルムアミドのような有機溶媒の不存在下で生じ、高い厳密性
のハイブリダイゼーションは、約35％以上のホルムアミドの存在下で、最も好ま
しくは約50％以上のホルムアミドの存在下で生ずる。厳密な条件の温度は、通常
、30℃以上、より好ましくは37℃以上、最も好ましくは42℃以上の温度である。
例えばハイブリダイゼーション時間、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）のような
界面活性剤の濃度、及びキャリアＤＮＡを有無のような他のパラメータを変える
ことは、当業者に周知である。厳密性の様々な水準は、これらの様々な条件を必
要に応じて変えることによって得られる。好適実施例では、ハイブリダイゼーシ
ョンが、750mMのNaCl、75mMのクエン酸３ナトリウム、及び1％のSDSにおいて、3
0℃で生ずる。より好ましい実施例では、ハイブリダイゼーションが、500mMのNa
Cl、50mMのクエン酸３ナトリウム、1％のSDS、35％ホルムアミド、及び100μg/m
lの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）において、37℃で生ずる。最も好ましい
実施例では、ハイブリダイゼーションが、250mMのNaCl、25mMのクエン酸３ナト
リウム、1％のSDS、50％ホルムアミド、及び200μg/mlのｓｓＤＮＡにおいて、4
2℃で生ずる。これらの条件を適宜改変することは、当業者には明らかであろう
。

【００７８】 ハイブリダイゼーションの後に行われる洗浄ステップでも、厳密性を変えるこ
とができる。洗浄での厳密性条件は、塩濃度及び温度によって定義することがで
きる。上述のように、洗浄での厳密性は、塩濃度をを低くしたり、温度を高める
ことによって高くすることができる。例えば、洗浄ステップにおける厳密な条件
の塩濃度は、好ましくは約30mM未満のNaCl及び3mM未満のクエン酸３ナトリウム
、最も好ましくは約15mM未満のNaCl及び1.5mM未満のクエン酸３ナトリウムであ
る。洗浄ステップにおける厳密な条件の温度は、通常、約25℃以上、より好まし
くは約42℃以上、最も好ましくは約68℃以上である。好適実施例では、洗浄ステ
ップを、30mMのNaCl、3mMのクエン酸３ナトリウム、及び0.1％のSDSにおいて25
℃で行う。より好ましい実施例では、洗浄ステップを、15mMのNaCl、1.5mMのク
エン酸３ナトリウム、及び0.1％のSDSにおいて42℃で行う。最も好ましい実施例
では、洗浄ステップを、15mMのNaCl、1.5mMのクエン酸３ナトリウム、及び0.1％
のSDSにおいて68℃で行う。これらの条件を適宜改変することは、当業者には明
らかであろう。

【００７９】 ＤＮＡのシークエンシング及び解析の方法は周知である。この方法では酵素を
使用する。このような酵素としては、例えばＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断
片であるSEQUENASE^TM（Amersham Pharmacia Biotech Ltd., Uppsala, Sweden）
、Taqポリメラーゼ（The Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT）、熱安定性T7ポリ
メラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech Ltd., Uppsala, Sweden）、或いはELON
GASE増幅システム（Life Technologies）のような校正エキソヌクレアーゼとポ
リメラーゼとの組み合わせがある。配列の調製は、例えばABI CATALYST^TM 800（
The Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT）またはMICROLAB 2200（Hamilton Co.,
Reno, NV）システムをサーマルサイクラーとともに用いて自動化するのが好まし
い。また、シークエンシングも、例えばABI PRISM^TM 373または377システム（Th
e Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT）またはMEGABACE^TM 1000キャピラリー電気
泳動システム（Molecular Dynamics, Inc., Sunnyvale, CA）によって自動化す
るのが好ましい。配列の解析は、周知のコンピュータプログラム及びアルゴリズ
ムを用いて行うことができる（例えばAusbel (前出) unit 7.7;及びMeyers, R.A
. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiely VCH, Inc, New York,
NY参照）。

【００８０】 ＮＨＡＰをコードする核酸配列を、部分的なヌクレオチド配列を利用して当業
者に周知の様々なＰＣＲをベースにした方法を用いて延長し、プロモーター及び
調節エレメントのような上流の配列を検出することができる。例えば、使用でき
る方法の一つである「制限部位」ＰＣＲ法では、汎用の入れ子プライマーを用い
て、クローニングベクター内のゲノムＤＮＡから未知の配列を増幅する（例えば
Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322参照）。別の方法である逆
ＰＣＲ法では、多岐した方向に延びているプライマーを用いて、環状の鋳型から
未知の配列を増幅する。この鋳型は、既知のゲノムの座位とその周囲の配列を含
む制限断片から導き出されたものである（例えばTriglia, T.他（1988）Nucleic
Acids Res 16:8186参照）。第３の方法であるキャプチャＰＣＲ法では、ヒト及
び酵母菌人工染色体ＤＮＡにおける既知の配列に隣接するＤＮＡ断片をＰＣＲに
よって増幅する（例えばLagerstrom, M.他（1991）PCR Methods Applic 1:111-1
19参照）。この方法では、ＰＣＲを行う前に、その配列の未知の領域に、複数の
制限酵素による消化及び連結を用いて、組換え二本鎖配列を挿入しておくことが
できる。未知の配列を引き出すために用いることができる他の方法も知られてい
る（例えばParker, J.D.他 (1991) Nucleic Acids Res 19:3055-3060）。更に、
ＰＣＲ、ネスト化プライマー、PromoterFinder^TMライブラリーを用いて、ゲノム
ＤＮＡ内歩行を行うことができる（Clontech, Palo Alto CA）。この手順ではラ
イブラリーをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エクソン接合部を探
し出すのに有用である。あらゆるＰＣＲをベースにした方法において、プライマ
ーは、市販のソフトウェア、例えばOLIGO^TM 4.06 Primer Analysis software（N
ational Biosciences Inc., Plymouth MN）又は他の適切なプログラムを用いて
、長さが２２〜３０ヌクレオチドで、ＧＣ含量が概ね５０％以上となり、かつ約
６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計することができる。

【００８１】 完全長ｃＤＮＡをスクリーニングするときに好適なライブラリーは、サイズ選
択された大形のｃＤＮＡを含むライブラリーである。またランダムプライミング
した（random primed）ライブラリーは、遺伝子の５′領域を含む配列を含むこ
とが多く、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーでは完全長ｃＤＮＡが得られない場合に
好ましい。ゲノムライブラリーは、５′の翻訳されない調節領域まで配列を延長
するために有用であり得る。

【００８２】 シークエンシングやＰＣＲの産物のヌクレオチド配列をサイズ分析したりその
存在を確認するために、市販のキャピラリー電気泳動システムを用いることがで
きる。詳述すると、キャピラリーシークエンシングでは、電気泳動による分離の
ための流動性ポリマー、レーザーで活性化される４種の各ヌクレオチドに対して
特異的な蛍光色素、及び放射される波長の検出のためのＣＣＤカメラを用いる。
出力／光強度は適切なソフトウエア（例えばGenotyper^TM及びSequence Navigato
r^TM（The Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT））を用いて電気信号に変換され、
サンプルの負荷からコンピュータ解析及び電子データ表示までの全過程をコンピ
ュータ制御することができる。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプル内に
少量しか存在しないＤＮＡ断片の配列決定に特に適している。

【００８３】 本発明の別の実施例では、ＮＨＡＰをコードするポリヌクレオチド配列または
その断片を組換えＤＮＡ分子にクローン化して、適切な宿主細胞内におけるＮＨ
ＡＰ、その断片、またはその機能的等価物の発現を誘導することができる。遺伝
暗号固有の縮重のために、実質的に同一であるか機能的に等価なアミノ酸配列を
コードする他のＤＮＡ配列が作り出されることがあるが、これらの配列もＮＨＡ
Ｐを発現させるために用いることができる。

【００８４】 本発明のヌクレオチド配列は、以下に限定するものではないが、遺伝子産物の
クローニング、プロセシング、及び／または発現の仕方を変える目的等の様々な
目的でＨＮＡＰをコードする配列を改変するために、周知の方法を用いて組換え
ることができる。ヌクレオチド配列は、無作為断片によるＤＮＡ再編成や、遺伝
子断片及び合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲによる再組立によって組換えること
ができる。例えば、オリゴヌクレオチドによる特定部位突然変異誘発で突然変異
を誘発させることによって、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変
更、コドン選好の変化、スプライスバリアントの生成等を生じさせることができ
る。

【００８５】 本発明の別の実施例では、周知の化学的方法を用いてＮＨＡＰをコードする配
列の全体、或いはその一部を合成することができる（例えばCaruthers. M.H.他
（1980）Nuc Acids Res Symp Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Ac
ids Res Symp. Ser.225-232参照）。或いは、化学的方法を用いてＮＨＡＰそれ
自体、またはその断片を合成することができる。例えば、様々な固相技術でペプ
チド合成を行うことができる（例えばRoberge, J.Y.他(1995) Science 269:202-
204参照）。合成の自動化は、ABI 431Aペプチドシンセサイザ（The Perkin-Elme
r Corp., Norwalk, CT）を用いることにより達成することができる。更に、ＮＨ
ＡＰのアミノ酸配列またはその一部を、直接の合成の際に改変したり、及び／ま
たは他のタンパク質またはその一部の配列と結合して、変異体ポリペプチドを作
り出すことができる。

【００８６】 このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーにより実質的に精製する
ことができる（例えばChiez, R.M.及びF.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol.
182:392-421参照）。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸解析或いはシーク
エンシングにより確認することができる（例えばCreighton T.（1984）Proteins
Structure And Molecular Properties, WH Freeman and Co., NY参照）。

【００８７】 生物学的に活性なＮＨＡＰを発現させるためには、ＮＨＡＰをコードするヌク
レオチド配列或いはその誘導体を、適切な発現ベクター、即ち適切な宿主内にお
ける挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要なエレメントを含
むベクターに挿入する。これらのエレメントとしては、ベクター及びＮＨＡＰを
コードするポリヌクレオチド配列における、エンハンサー、構成的及び誘導的プ
ロモーター、及び５’及び３’末端の非翻訳領域のような調節配列等がある。こ
れらのエレメントは、その強さ及び特異性が様々に異なったものであり得る。Ｎ
ＨＡＰをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために、特定の開始シグ
ナルを用いることもできる。このようなシグナルとしては、開始コドンのＡＴＧ
及びその近傍の配列、例えばコザック配列等がある。ＮＨＡＰをコードする配列
及びその開始コドン及び上流の調節配列を、適切な発現ベクターに挿入する場合
には、追加的な転写または翻訳の調節シグナルは不要であり得る。しかし、コー
ディング配列またはその断片のみを挿入する場合には、フレーム内ＡＴＧ開始コ
ドンを含む外来の翻訳調節シグナルをベクターに挿入しなければならない。外来
の翻訳エレメント及び開始コドンは、天然・合成両方の様々な起源をもつもので
あり得る。発現の効率は、使用される特定の宿主細胞系に適したエンハンサーを
含めることによって向上させることができる（例えばScharf, D他(1994) Result
s Probl. Cell Differ. 20:125-162参照）。

【００８８】 ＮＨＡＰをコードする配列及び適切な転写や翻訳の調節領域を含む発現ベクタ
ーを作製するために、当業者に周知の方法を用いることができる。これらの方法
としては、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術、並びにin vivo遺伝子組換え
技術が含まれる（例えば、Sambrook, J.他（1989）Molecular Cloning, A Labor
atory Manual, Cold Spring Harbor Press, Planview NY, ch. 4, 8及びAusubel
, F.M.等(1995, 及び定期的な増補) Current Protocol in Molecular Biology,
John Wiley &Sons, New York, NY, ch. 9, 13,及び16を参照）。

【００８９】 様々な発現ベクター／宿主系を、ＮＨＡＰコーディング配列の保持、発現のた
めに利用することができる。このようなものとしては、以下に限定するものでは
ないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベク
ターで形質転換した細菌のような微生物；酵母菌発現ベクターで形質転換した酵
母菌；ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞
系；ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）、タ
バコモザイクウイルス（TMV））或いは細菌の発現ベクター（例えばTi、或いはp
BR322プラスミド）で形質転換した植物細胞系；或いは動物細胞系が挙げられる
。本発明は、使用される宿主細胞によって限定されるものではない。

【００９０】 細菌系では、ＮＨＡＰをコードするポリヌクレオチドの用途に応じて様々なク
ローニング及び発現ベクターを選択することができる。例えば、ＮＨＡＰをコー
ドするポリヌクレオチドのルーチンのクローニング、サブクローニング、及び成
長（propagation）を、例えばBluescript（Stratagene）やpSport1^TMプラスミド
（GIBCO BRL）のような多機能大腸菌ベクターを用いて達成することができる。
ベクターの様々なクローニング部位にＮＨＡＰをコードする配列を組み入れてla
cZ遺伝子を壊すことによって、組換え分子を含む形質転換された細菌を特定する
ための比色によるスクリーニングを行うことができるようになる。更に、これら
のベクターは、in vitro転写、ジデオキシ法のシークエンシング、ヘルパーファ
ージによる一本鎖レスキュー（single strand rescue）、及びクローン化した配
列における入れ子欠失の生成のために有用であり得る（例えばVan Heeke, G.及
びS.M. Schuster（1989）J. Biol. Chem. 264:5503-5509）。例えば抗体産生の
ために大量のＮＨＡＰが必要な場合には、ＮＨＡＰの高レベルで発現を誘導する
ベクターを用いることができる。例えば、強い誘導性Ｔ５またはＴ７バクテリオ
ファージプロモーターを含むベクターを用いることができる。

【００９１】 ＮＨＡＰの産生のために、酵母菌発現系を用いることもできる。例えばα因子
、アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨのような構成的または誘導的プロモータ
ーを含む様々なベクターを、酵母菌のサッカロミセスセレビシエ（Saccharomyce
s cerevisiae）やメタノール資化酵母ピチアパストリス（Pichia pastoris）に
おいて用いることができる。更に、そのようなベクターは、発現されたタンパク
質の細胞外への分泌または細胞内での保持の何れかを誘導し、安定的な発現のた
めの外来配列の宿主のゲノムへの組み入れを可能にする（例えばAusubel, 前出;
及びGrant他(1987)Methods Enzymol. 153:516-54; Scorer, C.A.他(1994) Bio/
Technology 12:181-184参照）。

【００９２】 ＮＨＡＰの発現のために植物系も用いることができる。例えばCaMVの35S及び1
9Sプロモーターのようなウイルスのプロモーターを、単独で、或いはTMV（Takam
atsu,N.他（1987）EMBO J 6:307-311）のオメガリーダー配列と共に用いて、Ｎ
ＨＡＰをコードする配列の転写を促進することができる。或いは、RUBISCOの小
サブユニットや熱ショックプロモーターのような植物のプロモーターを用いても
よい（例えばCoruzzi, G.他（1984）EMBO J 3:1671-1680; Broglie, R.他（1984
）Science 224:838-843; 及びWinter, J.他（1991）Results Probl. Cell Diffe
r. 17:85-105参照）。これらの作製物は、直接的なＤＮＡ形質転換或いは病原体
によるトランスフェクションにより植物細胞内に導入できる（例えばHobbs, S.
又はMurry, L.E. McGraw Hill Yearbook of Science and Technology（1992）Mc
Graw Hill NY, pp191-196を参照されたい）。

【００９３】 哺乳動物の細胞では、多種のウイルスをベースにした発現系を利用することが
できる。発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合には、ＮＨＡＰをコー
ドする配列を、後期プロモーター及び三連リーダー配列（tripartite leader se
quence）からなるアデノウイルスの転写／翻訳複合体に連結することが可能であ
る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１領域又はＥ３領域へ挿入することにより、
宿主細胞におけるＮＨＡＰを発現する感染性のウイルスが得られる（例えばLoga
n, J.及びT. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659）。さらに、
哺乳類宿主細胞内の発現を増加させるためにラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エン
ハンサーのような転写エンハンサーを用いることができる。

【００９４】 また、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いることにより、プラスミドに組み入れ
られてそこから発現され得るものより大きいＤＮＡの断片を供給することもでき
る。治療上の目的で、６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣを構築し、従来のデリバリー方
法（リポソーム、ポリカチオンのアミノポリマー、又は小胞）を利用して供給す
ることができる。

【００９５】 哺乳動物系において長期間にわたる組換えタンパク質の産生を確保するために
は、細胞系におけるＮＨＡＰの安定した発現が望ましい。例えば、ウイルスの複
製起源及び／または内在性発現エレメント及び選択マーカー遺伝子を同一のベク
ター上、或いは個別のベクター上に含み得る発現ベクターを用いて、ＮＨＡＰを
コードする配列を、細胞系に形質転換することができる。ベクターの導入の後、
細胞を濃縮培地内で概ね１〜２日間増殖させ、次に選択培地に切り替える。選択
マーカーの目的は、選択薬に対する耐性を与え、その存在に基づいて導入された
配列を間違いなく発現する細胞を増殖させ、回収できるようにすることである。
安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞の型に適した組織培養
技術を用いて増殖させることができる。

【００９６】 形質転換された細胞系を回収するために任意の数の選択系を用いることができ
る。選択系としては、限定するものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ遺伝子（tk）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（
apr）が挙げられ、それぞれtk^-又はapr^-細胞において用いられる（例えばWigler
, M.他 (1977) Cell 11:223-232、及びLowy, I.他 (1980) Cell 22:817-823参照
）。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択の基礎として用い
ることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはア
ミノ配糖体のネオマイシン及びＧ−４１８に対する耐性を与え、als或いはpatは
クロルスルフロン（chlorsulfuron）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフ
ェラーゼ（phosphinotricin acetyltransferase）に対する耐性を与える（例え
ば、Wigler, M.他 (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570、Colberre-Ga
rapin, F.他 (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14、及びMurry (前出)参照）。別の
選択に利用できる遺伝子として、例えば、代謝のために細胞が要求する物質を変
える、trpBやhisDが文献に記載されている（例えばHartman, S.C.及びR.C. Mull
igan（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-8051）。可視マーカー、例えば
アントシアニン、緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein；ＧＦＴ）
、β−グルクロニダーゼ及びその基質であるβ−Ｄ−グルクロノシド、またはル
シフェラーゼ及びその基質であるルシフェリンを用いてもよい。これらのマーカ
ーは、形質転換体を特定するためばかりでなく、特定の発現ベクター系によ一過
性の或いは安定的なタンパク質発現の量を定量するために藻い入ることができる
（例えばRhodes, C.A.他 (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131）。

【００９７】 マーカー遺伝子の発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在も示唆され
るが、その存在及び発現は確認する必要があることがある。例えばＮＨＡＰをコ
ードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合は、ＮＨＡＰをコードす
る配列が組み入れられた形質転換された細胞を、マーカー遺伝子の機能の欠如に
基づいて確認できる。或いは、マーカー遺伝子はＮＨＡＰをコードする配列と直
列に配置され得、両者が単一のプロモータの制御下となり得る。誘導に応じたマ
ーカー遺伝子の発現、即ち選択は、通常、直列に配置された配列の発現をも同時
に表す。

【００９８】 一般に、ＮＨＡＰをコードする核酸配列を含みＮＨＡＰを発現する宿主細胞は
、当業者に周知の様々な方法により同定することができる。このような方法とし
ては、限定するものではないが、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリ
ダイゼーション、ＰＣＲによる増幅、及び核酸及びタンパク質を検出かつ／また
は定量するための、膜、溶液、或いはチップを用いる技術を含むタンパク質バイ
オアッセイ或いはイムノアッセイ等が挙げられる。

【００９９】 このタンパク質に特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいず
れかを用いる、ＮＨＡＰの発現を検出、測定するための免疫学的方法は周知であ
る。このような方法としては、以下に限定するものではないが、酵素結合免疫検
定法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）及び蛍光表示式細胞分取器法（FA
CS）等が挙げられる。ＮＨＡＰポリペプチド上の２つの非干渉なエピトープに対
して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナルベースイムノ
アッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好適であるが、競合的
結合アッセイを用いてもよい。これらアッセイの並びに他のアッセイは周知であ
る（例えばHampton, R.他(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual,
APS Press, St. Paul MN; Coligan, J.E.他(1997及び定期的に発行される補遺）
Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley-Inters
cience, New York, NY; 及びMaddox, D.E.他(1983) J. Exp. Med. 158:1211-121
6参照）。

【０１００】 様々な標識・結合技術が当業者には周知であり、種々の核酸及びアミノ酸のア
ッセイにおいて用いることができる。ＮＨＡＰをコードするポリヌクレオチドに
近縁な配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ・Ｐ
ＣＲプローブを作製するための手段には、オリゴ標識法、ニックトランスレーシ
ョン法、末端標識法、或いは標識したヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含まれ
る。或いは、ＮＨＡＰをコードする配列またはその任意の断片を、ｍＲＮＡプロ
ーブの作製のためのベクターにクローン化してもよい。そのようなベクターは周
知で、市販されており、これを用いて例えばＴ７、Ｔ３、或いはＳＰ６のような
適切なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えることによって、
in vitroでＲＮＡプローブを合成することができる。これらの方法は、種々の市
販のキット、例えばPharmacia Upjohn（Kalamazoo, MI）；Promega（Madison WI
）；及びU.S. Biochemical Corp.（Cleveland OH）から提供されているものを用
いて実施することができる。検出を容易にするために用いられ得る適切なリポー
ター分子、すなわち標識としては、放射性核種、酵素、フルオレセント（蛍光剤
）、化学発光剤、或いは色素剤や、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子等
が挙げられる。

【０１０１】 ＮＨＡＰをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、このタ
ンパク質を細胞培地で発現させ、そこから回収するのに適した条件の下で培養す
ることができる。形質転換された細胞により産生されるタンパク質は、用いられ
る配列及び／またはベクターに応じて、分泌されるか、または細胞内に保持され
る。当業者には理解されるように、ＮＨＡＰをコードするポリヌクレオチドを含
む発現ベクターを、原核細胞か真核細胞の細胞膜を通してのＮＨＡＰ分泌を誘導
するシグナル配列を含むように設計することができる。

【０１０２】 さらに宿主細胞株は、挿入された配列の発現を変調したり、発現したタンパク
質を望ましい形にプロセシングする能力ついて選択することができる。このよう
なポリペプチドの修飾としては、限定するものではないが、アセチル化、カルボ
キシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（lipidation）並びにアシル化が含
まれる。またタンパク質の「プレプロ」部分を切り離す翻訳後プロセシングも、
タンパク質のターゲティング、折り畳み、及び／又は作用を特定するために用い
ることができる。翻訳後の作用のための特定の細胞装置及び特徴的な機構を有し
ている種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、293、及びWI38）はAmerican T
ype Culture Collection（ATCC; Bethesda, MD）より入手でき、導入される外来
タンパク質の正しい修飾やプロセシングが確実に行われるように、このなかから
選択することができる。

【０１０３】 本発明の別の実施例では、ＮＨＡＰをコードする、天然の、修飾した、或いは
組換えた核酸配列をヘテロの配列に連結して、上述の宿主系の何れかにおける融
合タンパク質の翻訳を生じさせることができる。例えば、市販の抗体によって認
識され得る異種分子を含むキメラＮＨＡＰタンパク質は、ペプチドライブラリー
からのＮＨＡＰの活性のインヒビターの選別を促進し得る。そのような分子とし
ては、限定するものではないが、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、
マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結
合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、及び赤血球凝集素（HA）が挙げられ
る。GST、MBP、Trx、CBP、及び6-Hisによって、それぞれ固定化グルタチオン、
マルトース、酸化フェニルアルシン（phenylarsine oxide）、カルモジュリン、
及び金属キレート樹脂の上でのそれらの同属の融合タンパク質の精製が可能とな
る。FLAG、c-myc、及び赤血球凝集素（HA）によって、それらのエピトープのタ
グを特異的に認識する市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用い
た融合タンパク質のイムノアフィニティ精製が可能となる。融合タンパク質を、
ＮＨＡＰをコードする配列とへテロのタンパク質配列との間にタンパク分解酵素
による切断部位を含むように組換えることによって、ＮＨＡＰを、精製の後にヘ
テロの分子から切り離すことができるようになる。融合タンパク質の発現及び精
製のための方法は、Ausubel, F.M.他(1995及び定期的補遺) Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, ch 10に記載されて
いる。融合タンパク質の発現や精製を速やかに行うために、様々な市販のキット
を用いてもよい。

【０１０４】 本発明の更に別の実施例では、放射標識したＮＨＡＰを、TNT^TMウサギ網状赤
血球のライセートまたはコムギ胚芽抽出物系（Promega, Madison, WI）を用いて
in vitroで合成することができる。これらの系は、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６プ
ロモーターに機能的に関連するタンパク質コーディング配列の転写と翻訳を結び
つける。翻訳は、放射標識したアミノ酸前駆体、好ましくは³⁵S-メチオニンの存
在の下で生じる。

【０１０５】 ＮＨＡＰの断片の作製は、組換え体の産生によって行うのみならず、固相技術
を用いた直接のペプチド合成によっても行うことができる（例えばCreighton,
前出pp.55-60参照）。タンパク質合成は、手作業により、或いは自動的に行うこ
とができる。合成の自動化は、例えば、Applied Biosystems 431Aペプチド合成
機 (The Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT) を用いて達成することができる。
ＮＨＡＰの様々な断片を個別に合成し、それを連結して完全長分子を作り出すこ
とができる。

【０１０６】 治療 ＮＨＡＰとマウス由来のアスパラギン酸プロテアーゼ様タンパク質（Gl 19068
90）との間に例えば配列及びモチーフに関連する化学的及び構造的類似性が存在
する。更に、ＮＨＡＰは、内分泌組織の疾患、癌、炎症及び免疫応答の疾患、及
び呼吸器疾患で発現される。従って、ＮＨＡＰは、呼吸器疾患、内分泌疾患、及
び免疫疾患、及び癌において一定の役割を果たしていると考えられる。

【０１０７】 従って、或る実施例では、ＮＨＡＰの発現又は活性の低下に関連する内分泌疾
患の治療又は予防のために、ＮＨＡＰ又はその断片若しくは誘導体を患者に投与
し得る。このような疾患としては、以下に限定するものではないが、性腺機能低
下症、シーハン症候群、尿崩症、カルマン症候群、ハンド−シュラー−クリスチ
ャン病、レトラー−ジーヴェ病、サルコイドーシス、エンプティセラ症候群、及
び小人症のような下垂体機能低下症に関連する疾患、及び結節性甲状腺腫、粘液
水腫、細菌感染に関連する急性甲状腺炎、ウイルス感染に関連する亜急性甲状腺
炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、及びクレチン病を含む甲状腺機能低下症に
関連する疾患を挙げることができる。

【０１０８】 別の実施例では、限定するものではないが、上に列挙したもののような内分泌
疾患の治療又は予防のために、ＮＨＡＰ又はその断片若しくは誘導体を発現し得
るベクターを患者に投与し得る。

【０１０９】 更に別の実施例では、限定するものではないが、上に列挙したもののような内
分泌疾患の治療又は予防のために、実質的に精製されたＮＨＡＰを、適切な医薬
用担体と共に含む医薬品組成物を患者に投与し得る。

【０１１０】 更に別の実施例では、限定するものではないが、上に列挙したもののような内
分泌疾患の治療又は予防のために、ＮＨＡＰの活性を変調するアゴニストを患者
に投与し得る。

【０１１１】 更に別の実施例では、ＮＨＡＰの発現又は活性の上昇に関連する内分泌疾患の
治療又は予防のためにＮＨＡＰのアンタゴニストを患者に投与し得る。このよう
な疾患としては、以下に限定するものではないが、先端肥大症、巨人症、及び抗
利尿ホルモン（ＡＤＨ）不適切症候群（ＳＩＡＤＨ）のような下垂体機能亢進症
；甲状腺中毒症及びその様々な形態、グレーブス病、前頸骨粘液水腫、中毒性多
結節性甲状腺腫、甲状腺癌、及びプランマー病のような甲状腺機能亢進症；及び
コン症候群（慢性高カルシウム血症）のような上皮小体機能亢進症を挙げること
ができる。或る実施態様では、ＮＨＡＰに特異的に結合する抗体を、アンタゴニ
ストとして直接的に用いたり、或いはＮＨＡＰを発現する細胞又は組織に薬物を
送達するためのターゲティング又はデリバリー機構として間接的に用いることが
できる。

【０１１２】 更に別の実施例では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む内分
泌疾患の治療又は予防のために、ＮＨＡＰをコードするポリヌクレオチドの相補
配列を発現するベクターを患者に投与し得る。

【０１１３】 更に別の実施例では、呼吸器疾患の治療又は予防のためにＮＨＡＰのアンタゴ
ニストを患者に投与し得る。このような疾患としては、以下に限定するものでは
ないが、アレルギー、喘息、急性及び慢性の炎症性肺疾患、成人呼吸窮迫症候群
（ＡＲＤＳ）、肺気腫、肺うっ血及び肺浮腫、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、
間質性肺疾患、及び肺癌を挙げることができる。

【０１１４】 別の実施例では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む呼吸器疾
患の治療又は予防のために、ＮＨＡＰをコードするポリヌクレオチドの相補配列
を発現するベクターを患者に投与し得る。

【０１１５】 更に別の実施例では、癌の治療又は予防のために、ＮＨＡＰのアンタゴニスト
を患者に投与することができる。このような癌としては、以下に限定するもので
はないが、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌腫、具体的
には副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、
腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、
脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌を挙げることができる。

【０１１６】 更に別の実施例では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む癌の
治療又は予防のために、ＮＨＡＰをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発
現するベクターを患者に投与し得る。

【０１１７】 更に別の実施例では、免疫疾患の治療又は予防のために、ＮＨＡＰのアンタゴ
ニストを患者に投与し得る。このような疾患としては、以下に限定するものでは
ないが、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群
、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド沈着症、貧血症、喘息、アテローム性
硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触
性皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ
球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児性赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、腎
炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増
加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋炎又は心膜炎、変形
性関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ性関
節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマ
トーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウ
ェルナー症候群、癌と血液透析と体外循環の合併症、ウイルス感染、細菌感染、
真菌感染、寄生虫感染、原虫感染、蠕虫感染、及び外傷等を挙げることができる
。

【０１１８】 別の実施例では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む免疫疾患
の治療又は予防のために、ＮＨＡＰをコードするポリヌクレオチドの相補配列を
発現するベクターを患者に投与し得る。

【０１１９】 別の実施例では、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、
相補配列、又はベクターを、他の適切な薬物と組み合わせて投与することができ
る。併用療法において使用するための適切な薬剤を、当業者は既存の医薬上の原
理に基づいて選択することができよう。治療薬を組み合わせることにより、上述
した様々な疾患の治療又は予防に効果を奏する相乗作用を与えることができる。
この方法を用いることにより、より低い用量の薬剤で治療効果を達成することが
でき、従って副作用を減らすことができる。

【０１２０】 ＮＨＡＰのアンタゴニストは周知の方法を用いて製造することができる。詳述
すると、精製されたＮＨＡＰを、抗体を作り出したり、或いはＮＨＡＰに特異的
に結合するものを同定するべく薬物のライブラリーをスクリーニングするために
用いることができる。ＮＨＡＰに対する抗体も周知の方法を用いて作り出すこと
ができる。このような抗体としては、以下に限定するものではないが、ポリクロ
ーナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、及び一本鎖抗体、Ｆａｂフラグ
メント、及びＦａｂ発現ライブラリーによって作り出されたフラグメントを挙げ
ることができる。中和抗体（即ち二量体形成を阻害するもの）は、治療の用途に
特に好適である。

【０１２１】 ポリクローナル抗体を作り出すため、ＮＨＡＰか、免疫学的特性を有するその
断片或いはオリゴペプチドを注射することによって、ヤギ、ウサギ、ラット、マ
ウス等の様々なホストを免疫化することができる。モノクローナル抗体の製造を
含むダウンストリームの用途のために用いるホストとしては、ラット及びマウス
が好ましい。免疫学的反応を増強するために、ホストの種に応じた様々なアジュ
バントを用いることができる。そのようなアジュバントとしては、限定するもの
ではないが、フロイントのアジュバント、水酸化アルミニウムのような無機質ゲ
ル、リゾレシチンのような界面活性剤、プルロニックポリオール（pluronic pol
yol）、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシニア
ン並びにジニトロフェノール等が挙げられる。ヒトで使用するアジュバントのな
かでは、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム−パルヴム
（Corynebacterium parvum）が特に好適である（抗体の製造及び解析のための方
法について再検討するためには、例えばHarlow, E.及びLane, D. (1988) Antibo
dies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Ha
rbor, N.Y.参照）。

【０１２２】 ＮＨＡＰに対する特異的抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペ
プチド、または断片は、好ましくは５個以上のアミノ酸、より好ましくは１４個
以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。またこれらの配列は、元のタン
パク質のアミノ酸配列の一部と同一であり、小形の自然発生の分子の全アミノ酸
配列を含んでいるのが好ましい。ＮＨＡＰアミノ酸の短いストレッチを、キーホ
ールリンペットヘモシアニンのような他のタンパク質のストレッチと融合するこ
とができ、そのキメラ分子に対する抗体を産生させることができる。

【０１２３】 ＮＨＡＰのモノクローナル抗体は、培地内の無制限増殖性細胞系（continuous
cell line）に抗体分子を産生させる技術を用いて作製できる。このような技術
として、限定するものではないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリド
ーマ技術、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術等が挙げられる（例えばKohler, G.
他(1975) Nature 256:495-497；Kozbor, D.他(1983) J. Immunol. Methods 81 :
31-42；Cote, R.J.他(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030；及びCole,
S.P.他(1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120）。

【０１２４】 さらに、適切な抗原特異性並びに生物活性を有する分子を得るための、例えば
マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングする技術のような「キメラ
抗体」の産生のために開発された技術を用いることができる（例えばMorrison,S
.L.他 (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855；Neuberger, M.S.他 (198
4) Nature 312:604-608；Takeda, S.他 (1985) Nature 314:452-454）。或いは
、周知の方法によって一本鎖抗体の製造のための技術を適用して、ＮＨＡＰに特
異的な一本鎖抗体を作り出すことができる。関連する特異性を有するがイディオ
タイプの構成が異なる抗体は、無作為の免疫グロブリン組み合わせライブラリー
からの鎖再編成（chain shuffling）によって作り出すことができる（例えばBur
ton D.R.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11134-10137）。

【０１２５】 また、文献（例えばOrlandi, R.他(1989), Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-
3837；及びWinter, G.他1991, Nature 349:293-299参照）に開示されているよう
に、高度に特異的な結合試薬のパネルや組換え免疫グロブリンライブラリーをス
クリーニングすることによって、或いはリンパ球集団のin vivoでの産生を誘導
することによって抗体を作り出すこともできる。

【０１２６】 ＮＨＡＰに対する特異結合部位を含む抗体断片を作り出すこともできる。この
ような断片としては、限定するものではないが、抗体分子のペプシンによる消化
で生成することができるＦ（ａｂ′）₂フラグメントや、Ｆ（ａｂ′）₂フラグメ
ントのジスルフィド架橋を減らすことにより作り出すことができるＦａｂフラグ
メント等が挙げられる。或いは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフ
ラグメントを迅速かつ容易に同定できるように、Ｆａｂ発現ライブラリーを作製
してもよい（例えば、Huse, W.D.他（1989）Science 256:1275-1281参照）。

【０１２７】 所望の特異性及び最小限の交差（cross-reactivity）を有する抗体を同定する
ためのスクリーニングに、様々なイムノアッセイを利用することができる。確立
された特異性を有するモノクローナル抗体或いはポリクローナル抗体のいずれか
を用いる、競合的結合アッセイ或いはラジオイムノアッセイの様々なプロトコル
が当分野で周知である。このようなイムノアッセイでは、ＮＨＡＰとその特異的
抗体との複合体の形成量が測定される。好適なのは、特定のＮＨＡＰタンパク質
上の２つの互いに非干渉なエピトープに対して反応するモノクローナル抗体を用
いる二部位モノクローナル抗体ベースイムノアッセイ（two sites monoclonal b
ased immunoassay）であるが、競合的結合アッセイも用いられる（Maddox , 前
出）。

【０１２８】 ラジオイムノアッセイとともに、スキャッチャード解析（Scatchard analysis
）のような様々な方法を用いて、ＮＨＡＰの抗体の親和性を評価することができ
る。親和性は結合定数Ｋ_aで表され、この結合定数Ｋ_aは、平衡状態の下において
ＮＨＡＰ−抗体複合体のモル濃度をフリーの抗原及びフリーの抗体のモル濃度で
除したものとして定義される。ポリクローナル抗体は異なる複数のＮＨＡＰエピ
トープに対する親和性が一様でなく、このポリクローナル抗体の調製物に対して
求められたＫ_aは、ＮＨＡＰの抗体の平均の親和性、即ち結合活性を表す。モノ
クローナル抗体は特定のＮＨＡＰのエピトープに単一特異的であり、このモノク
ローナル抗体の調製物に対して求められたＫ_aは、親和性の真の測定値を表す。
Ｋ_aが約10⁹〜10¹²L/molの範囲にある高親和性抗体調製物は、ＮＨＡＰ−抗体複
合体が厳密な操作に耐えなければならないような免疫学的精製法での使用に好適
であり、Ｋ_aが約10⁶〜10⁷L/molの範囲にある低親和性抗体調製物は、最終的に抗
体からＮＨＡＰを好ましくは活性状態で分離する必要のある免疫学的精製法及び
類似の手順での使用に好適である（Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A
Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.; 及びLiddell, J. E.及び
Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley
& Sons, New York, NY）。

【０１２９】 ポリクローナル調製物の力価及び結合活性を更に評価して、ある種のダウンス
トリームの用途で用いる調製物の質や適合性を決定することができる。例えば、
１ml当たり、少なくとも１〜２mgの特異的抗体、好ましくは５〜１０mgの特異的
抗体を含むポリクローナル抗体調製物は、ＮＨＡＰ−抗体複合体の沈降に必要な
手順で用いるのに好適である。抗体の特異性、力価、及び結合活性を評価するた
めの手順、及び抗体の質や様々な用途での抗体の使用のための指針は、一般に有
効である（例えばCatty, (前出)、及びColigan他 (前出)参照）。

【０１３０】 本発明の別の実施例では、ＮＨＡＰをコードするポリヌクレオチド、またはそ
の任意の断片や相補配列を、治療上の目的で用いることができる。或る実施態様
では、ｍＲＮＡの転写をブロックすることが望ましいような状況において、ＮＨ
ＡＰをコードするポリヌクレオチドに対する相補配列を用いることができる。詳
述すると、ＮＨＡＰをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列で細胞を形質
転換することができる。従って、相補的分子または断片を用いて、ＮＨＡＰの活
性を変調、即ち遺伝子の機能を調節することができる。このような技術は現在周
知であり、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、若しくはより大きな断
片は、ＮＨＡＰコーディング配列のコード領域や調節領域の様々な位置から設計
することができる。

【０１３１】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス或いはワクシニアウイルス由来の
発現ベクター、或いは種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクターを、標的
の器官、組織、または細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いることが
できる。ＮＨＡＰをコードする遺伝子のポリヌクレオチドに相補的な核酸配列を
発現するベクターは、当業者に周知の方法を用いて作製することができる（例え
ばSambrook (前出) 及びAusubel (前出)参照）。

【０１３２】 ＮＨＡＰをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を高レベルで発現する
発現ベクターで細胞または組織を形質転換することにより、ＮＨＡＰをコードす
る遺伝子を遮断することができる。このような作製物を用いて、翻訳不可能なセ
ンス配列或いはアンチセンス配列を細胞に導入することができる。このようなベ
クターは、ＤＮＡへ組み入れられない場合でも、そのベクターが内在性ヌクレア
ーゼにより破壊されるまでＲＮＡ分子の転写を続ける。このような一過性の発現
は、非複製ベクターでも１ヶ月以上、適当な複製エレメントがベクター系の一部
である場合には更に長い期間継続し得る。

【０１３３】 上述のように、ＮＨＡＰをコードする遺伝子の制御領域、５′領域、または調
節領域（シグナル配列、プロモーター、エンハンサー、及びイントロン）に対す
る相補配列、即ちアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ）を設計する
ことにより遺伝子の発現の仕方を変えることができる。転写開始部位、例えば開
始部位の概ね＋１０〜−１０の間の位置にある領域に由来するオリゴヌクレオチ
ドが好適である。同様に、三重らせん塩基対合法を用いて阻害を達成することが
できる。三重らせん対合が有用なのは、二重らせんが、ポリメラーゼ、転写因子
、或いは調節分子の結合のために十分にほどける能力をそれが阻害するからであ
る。三重らせんＤＮＡを用いた最近の治療上の進歩については、文献に記載され
ている（例えば Huber, B.E.及びB.I. Carr, Molecular and Immunologic Appro
aches, Futura Publishing Co, Mt Kisco NY, pp. 163-177におけるGee, J.E.他
(1994)参照）。また、相補配列、即ちアンチセンス分子を設計して、転写物のリ
ボソームへの結合を妨げてｍＲＮＡの転写を阻害することもできる。

【０１３４】 酵素性ＲＮＡ分子であるリボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することが
できる。リボザイムの作用機構では、リボザイム分子が、相補的標的ＲＮＡに配
列特異的にハイブリダイズし、その後エンドヌクレアーゼによる切断（endonucl
eolytic cleavage）が行われる。例えば、人工合成のハンマーヘッド型リボザイ
ム分子は、ＮＨＡＰをコードする配列のエンドヌクレアーゼによる切断を特異的
かつ効果的に触媒し得る。

【０１３５】 標的となり得るＲＮＡ内の特定のリボザイム切断部位を、初めに、標的の分子
における、配列GUA、GUU並びにGUCを含むリボザイム切断部位をスキャンするこ
とによって同定する。一旦同定されれば、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対
応する１５〜２０個のリボヌクレオチドからなる短いＲＮＡ配列に対して、その
オリゴヌクレオチドの機能を停止させる２次構造の特徴を評価することができる
。候補の標的の適切性も、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ribonucl
ease protection assay）によって、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリ
ダイゼーションにおける接触性（accessibility）を測定することにより評価す
ることができる。

【０１３６】 本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子の合成のための当分
野で周知の方法により作製することができる。これらの技術としては、固相ホス
ホラミダイト化学合成法のようなオリゴヌクレオチドの化学合成技術等が挙げら
れる。或いは、ＲＮＡ分子は、in vivo及びin vitroでのＮＨＡＰをコードする
ＤＮＡ配列の転写により作り出すことができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７
或いはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する様々なベ
クターに組み入れることができる。或いは、相補的ＲＮＡを合成するｃＤＮＡ作
製物を、構成的に或いは誘導的に、細胞系、細胞或いは組織内に導入することが
できる。

【０１３７】 ＲＮＡ分子はその細胞内での安定性を高めたり、半減期を長くするために修飾
することができる。可能な修飾としては、限定するものではないが、その分子の
５′末端か３′末端、或いはその両方へのフランキング配列の付加や、分子のバ
ックボーン内でのホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネート（phos
phorothioate）或いは２′Ｏ−メチルの使用が挙げられる。この方式（concept
）は、本来ＰＮＡの作製において用いられるもので、これら分子の全てに、以下
の方法によって拡張することができる。即ち内在性エンドヌクレアーゼにより容
易に認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンの、ア
セチル−、メチル−、チオ−形態、及び類似の形態の修飾によるばかりでなく、
イノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブトシン（Wybutosine）のよう
な従来あまり用いられなかった塩基を含めることによって拡張することができる
。

【０１３８】 細胞或いは組織内にベクターを導入するための多くの方法が利用可能であり、
それらの方法は、in vivo、in vitro、及びex vivoでの使用についても同様に適
している。ex vivo治療法の場合には、患者から採取された幹細胞にベクターを
導入し、自家移植用にクローンとして増殖させて同じ患者に戻す方法がある。ま
たトランスフェクションによるデリバリー、リポソーム注入またはポリカチオン
アミノポリマーによるデリバリーは、当分野でよく知られた方法を用いて実施す
ることができる（例えばGoldman, C.K.他(1997) Nature Biotechnology 15:462-
466参照）。

【０１３９】 上述の治療法は何れも、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、最も
好ましくはヒトのような哺乳動物を含む、任意の適切な被験体に適用することが
できる。

【０１４０】 本発明の別の実施例では、上述の治療効果をあげるために、医薬品組成物を医
薬上許容される担体とともに投与する。このような医薬品組成物は、ＮＨＡＰ、
ＮＨＡＰに対する抗体、ＮＨＡＰの模擬体（mimetics）、アゴニスト、アンタゴ
ニスト、又はインヒビターからなるものであり得る。この医薬品組成物は、単体
で、或いは例えば安定剤のような１種以上の他の薬剤とともに、滅菌した生体適
合性の医薬用担体を用いて投与する。このような担体としては、限定はしないが
、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖或いは水等が挙げられる。このような組成
物は、単体で、或いは他の薬剤やホルモンと組み合わせた形で患者に投与するこ
とができる。

【０１４１】 本発明で用いられる医薬品組成物の投与経路としては、以下に限定するもので
はないが、経口投与、静脈内投与、筋内投与、動脈内投与、髄内投与、くも膜下
内投与、心室内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経腸投与
、局所投与、舌下投与、或いは直腸内投与等が挙げられる。

【０１４２】 これらの医薬品組成物は、主成分に加えて、作用物質を医薬上使用可能な製剤
にするための処理を容易にする、賦形剤及び補助剤のような適切な医薬上許容さ
れる担体を含み得る。調合或いは投与に関する技術の詳細は、Remington's Phar
maceutical Sciences（Maack Publishing Co., Easton, PA）の最新版において
見ることができる。

【０１４３】 経口投与用の医薬品組成物は、当分野で周知の医薬上に許容される担体を用い
て適切な剤形に製剤することができる。このような担体により、この医薬品組成
物を、患者が服用するための、錠剤、丸剤、カプセル剤、液体剤、ゲル剤、シロ
ップ剤、スラリー剤、懸濁液等に製剤することができる。

【０１４４】 経口投与するための製剤は、活性化合物と固形の賦形剤とを結合することによ
って作製できる。必要ならば、適切な補助剤を添加できる。適切な賦形剤として
は、ラクトース、スクロース、マンニトール或いはソルビトールを含む砂糖のよ
うな糖質或いはタンパク質の賦形剤、トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ
等のでんぷん、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース或いは
カルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロース、アラビアゴム或
いはトラガカントのようなゴム、並びにゼラチン或いはコラーゲンのようなタン
パク質である。必要ならば崩壊剤或いは可溶化剤、例えば架橋結合したポリビニ
ルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムのようなその塩を
加えてもよい。

【０１４５】 糖衣剤コア（dragee core）は、濃縮砂糖溶液等により適切な錠皮を塗布して
用いられる。錠皮を塗布するための溶液としては、アラビアゴム、タルク、ポリ
ビニルピロリドン、カルボポルゲル剤、ポリエチレングリコール及び／または二
酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶剤或いは溶剤混合物等が挙げられる
。錠剤の識別のため、すなわち主成分の量即ち投与量を表示するために染料或い
は色素を錠剤或いは錠皮に加えてもよい。

【０１４６】 経口投与可能な製剤としては、ゼラチンからなるプッシュフィットカプセル及
びゼラチンからなる柔軟な密封されたカプセル、並びにグリセロール或いはソル
ビトールのような錠皮が挙げられる。プッシュフィットカプセルは、ラクトース
或いはでんぷんのような賦形剤或いは結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネ
シウムのような潤滑剤、並びに所望に応じて安定剤と混合された主成分を含み得
る。柔軟なカプセルでは、主成分が、安定剤とともに或いは安定剤なしで、脂肪
油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解或
いは懸濁されている。

【０１４７】 非経口投与用の製剤は、水溶液、好ましくはハンクの溶液、リンゲル溶液或い
は生理緩衝食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液において配合することがで
きる。水性の注射用懸濁剤には、 例えばカルボキシルメチルセルロースナトリ
ウム、ソルビトール或いはデキストランのような懸濁剤の粘性を高める物質を含
めることができる。更に、主成分の懸濁液は、適切な油性注射用懸濁剤として調
製される。適切な親油性の溶媒或いは担体としては、胡麻油のような脂肪油や、
オレイン酸エチル、トリグリセリド或いはリポソームのような合成脂肪酸エステ
ルがある。脂質でないポリカチオンのアミノポリマーをデリバリーのために用い
ることもできる。懸濁剤には、溶解度を高め濃縮度の高い溶液の調製を可能にす
る適切な薬剤または安定剤を、所望に応じて加えることができる。

【０１４８】 局所的投与または経鼻粘膜投与用には、浸透させる特定の障壁に対して適切な
浸透剤を用いて製剤する。このような浸透剤は、当技術分野において周知である
。

【０１４９】 本発明の医薬品組成物は周知の方法、例えば従来通りの混合、溶解、顆粒化、
糖衣形成、研和、乳化、封入（entrapping）、或いは凍結乾燥により製造される
。

【０１５０】 この医薬品組成物は塩類として提供されることもあり、限定するものではない
が塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む種々の酸とと
もに形成することができる。塩は、水性或いはプロトニック溶剤において、対応
するフリーの塩基形態より溶解性が高くなる傾向がある。この他、好ましい製剤
には、ｐＨ４．５〜５．５の範囲にあって、使用前に緩衝剤と結合させる、１ｍ
Ｍ〜５０ｍＭのヒスチジン、０．１％〜２％のショ糖、及び２％〜７％のマンニ
トールの全てまたは何れかを含む凍結乾燥粉末がある。

【０１５１】 医薬品組成物は、調製された後、適切な容器内に入れ、さらに提示した状態の
治療のためにラベル付けすることができる。ＮＨＡＰの投与の場合、このような
ラベルには、投与の量、頻度、方法が表示される。

【０１５２】 本発明において使用するために適切な医薬品組成物は、主成分を所望の目的を
達成するために有効な量含む組成物である。有効な量の決定は、当業者の能力の
範囲内で十分行うことができる。

【０１５３】 あらゆる化合物について、治療上有効な量は、初めに、新生物細胞、或いは通
常マウス、ウサギ、イヌ、ブタのような動物モデルの何れかの細胞培地のアッセ
イから推定することができる。適切な濃度範囲や投与経路を決定するために動物
モデルを用いることもできる。次に、このような情報を利用して、ヒトにおける
有効な量や投与経路を決定することができる。

【０１５４】 治療上有効な量とは、症状や状態を改善する有効成分、例えばＮＨＡＰまたは
その断片、ＮＨＡＰの抗体、ＮＨＡＰのアゴニスト、アンタゴニスト、またはイ
ンヒビターの量である。そのような化合物の毒性及び治療上の有効性は、細胞培
地における或いは実験動物を用いた標準的な医薬上の手順によって、例えばＥＤ ₅₀ （個体群の５０％における治療上の有効な量、５０％有効量）、ＬＤ₅₀（個体
群の５０％の致死投与量）統計量を計算することによって決定することができる
。毒性と治療有効性との間の投与量の比は治療指数であり、ＬＤ₅₀／ＥＤ₅₀の比
として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬品組成物が好ましい。これ
らの細胞培地のアッセイ及び動物実験から得られるデータは、ヒトで使用するた
めの投与量の範囲を決める際に用いることができる。そのような化合物の投与量
は、毒性がほとんど或いは全くなく、ＥＤ₅₀を達成する循環濃度の範囲内にある
ことが望ましい。投与量は、用いられる剤形、患者の感受性並びに投与経路に応
じてこの範囲内で変わってくる。

【０１５５】 正確な投与量は、処置が必要な患者に関連する要素を考慮して担当医師が決定
する。用量及び投与は、主成分を十分なレベルだけ与え、かつ所望の効果を維持
するべく調節する。考慮すべき要素としては、疾病状態の重症度、患者の一般的
な健康状態、患者の年齢、体重、並びに性別、投与の時間及び頻度、併用する薬
剤、反応感受性、並びに治療に対する反応等が挙げられる。長期的に作用する医
薬品組成物は、その特定の配合の半減期及びクリアランス速度に応じて３〜４日
毎に、１週間毎に、或いは２週間に１度投与することができる。

【０１５６】 通常の投与量は０．１〜１００，０００μｇの範囲にあって、全投与量は最大
約１ｇであり、投与経路に応じて変わってくる。特定の投与量或いはデリバリー
の方法に関する手引きは、当分野の実施者が通常入手できる文献において見出す
ことができる。当業者であれば、ヌクレオチドでは、タンパク質やインヒビター
用の剤形とは異なる剤形を採用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドのデリバリーの方式は、特定の細胞、状態、位置等によって決まっ
てくる。

【０１５７】 診断 別の実施例では、ＮＨＡＰに特異的に結合する抗体を、ＮＨＡＰの発現によっ
て特性化される疾病の診断において、或いは、ＮＨＡＰやＮＨＡＰのアゴニスト
、アンタゴニスト、またはインヒビターで治療を受けている患者のモニタリング
のためのアッセイにおいて用いることができる。診断のために有用な抗体は、上
述の治療用のものと同一の方法で作ることができる。ＮＨＡＰの診断アッセイと
して、ヒトの体液、細胞或いは組織の抽出物においてＮＨＡＰを検出するために
抗体或いは標識を利用する方法等がある。抗体は、修飾して用いても、修飾なし
で用いてもよく、共有結合、或いは非共有結合かのいずれかでリポーター分子と
結合させることにより標識することができる。様々なリポーター分子が周知であ
り、それを用いることができるが、その幾つかについては上記した。

【０１５８】 ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）並びに
ＦＡＣＳ（蛍光表示式細胞分取器法）のような、ＮＨＡＰを測定するための様々
なプロトコルが当分野では周知であり、これによってＮＨＡＰ発現の変化や異常
を診断するための基礎が得られる。ＮＨＡＰの発現の正常値、つまり標準値は、
哺乳動物、好ましくはヒトの正常な被験者の体液或いは細胞抽出物とＮＨＡＰの
抗体とを、複合体形成に適した条件の下で結合させることによって確立する。標
準の複合体形成量は、様々な方法、好ましくは測光手段を用いることにより定量
することができる。被験者の、生検組織の患部組織サンプル及び対照サンプルに
おいて発現されたＮＨＡＰの量を、標準値と比較する。標準値と被験者の値との
偏差から、疾病の診断のためのパラメータを確立する。

【０１５９】 本発明の別の実施例では、ＮＨＡＰをコードするポリヌクレオチドを、診断目
的で用いることができる。使用できるポリヌクレオチドとしては、オリゴヌクレ
オチド配列、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡ等がある。このポリヌク
レオチドは、ＮＨＡＰの発現が疾病と相関性を有し得る生検組織における遺伝子
発現を検出し、定量するために用いられる。診断アッセイは、ＮＨＡＰが存在す
る状態か、存在しない状態か、過剰発現している状態の何れの状態にあるかを区
別したり、治療的な介入においてＮＨＡＰレベルの調節をモニタリングするため
に利用することができる。。

【０１６０】 或る実施態様では、ＮＨＡＰまたは近縁な分子をコードする、ゲノム配列を含
むポリヌクレオチド配列を検出できるＰＣＲプローブとのハイブリダイゼーショ
ンを利用して、ＮＨＡＰをコードする核酸配列を同定することができる。そのプ
ローブの特異性、即ちそのプローブが非常に高度に特異的な領域（例えば５′調
節領域）、或いは特異性の低い領域（例えば保存的モチーフ）の何れに由来する
のか、ということや、及びハイブリダイゼーション或いは増幅の（高い、中程度
の或いは低い）厳密性によって、そのプローブが自然発生のＮＨＡＰをコードす
る配列のみを同定するものであるか、或いはアレル変異体や近縁な配列も同定す
るものであるかということが決まってくる。

【０１６１】 プローブは、近縁な配列を検出するためにも用いることができ、好ましくは、
ＮＨＡＰをコードする任意の配列と少なくとも５０％の同一性を有するべきであ
る。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得
、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の配列か、ＮＨＡＰ遺伝子
のイントロン、プロモータ、及びエンハンサーを含むゲノムの配列に由来するも
のであり得る。

【０１６２】 ＮＨＡＰをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプロー
ブを作製するための手段としては、ＮＨＡＰやＮＨＡＰ誘導体をコードするポリ
ヌクレオチド配列を、ｍＲＮＡプローブ生成のためのベクターにクローン化する
方法がある。このようなベクターは周知で市販されており、適切なＲＮＡポリメ
ラーゼや適切な標識ヌクレオチドを加えることによりin vitroでのＲＮＡプロー
ブ合成のために用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブは様々な
リポーター分子により標識することができる。例えば、³²Ｐや³⁵Ｓのような放射
性核種により、またはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合するア
ルカリホスファターゼのような酵素標識等により標識することができる。

【０１６３】 ＮＨＡＰをコードするポリヌクレオチド配列を、ＮＨＡＰの発現に関連する疾
患の診断のために用いることができる。そのような疾患の例としては、以下に限
定するものではないが、内分泌疾患、例えば性腺機能低下症、シーハン症候群、
尿崩症、カルマン症候群、ハンド−シュラー−クリスチャン病、レトラー−ジー
ヴェ病、サルコイドーシス、エンプティセラ症候群、及び小人症を含む下垂体機
能低下症に関連する疾患や、例えば先端肥大症、巨人症、及び抗利尿ホルモン（
ＡＤＨ）不適切症候群（ＳＩＡＤＨ）のような下垂体機能亢進症や、例えば甲状
腺腫、粘液水腫、細菌感染に関連する急性甲状腺炎、ウイルス感染に関連する亜
急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、及びクレチン病のような甲状腺
機能低下症に関連する疾患や、例えば甲状腺中毒症及びその様々な形態、グレー
ブス病、前頸骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、及びプランマー
病のような甲状腺機能亢進症や、例えばコン症候群（慢性高カルシウム血症）の
ような上皮小体機能亢進症；アレルギー、喘息、急性及び慢性の炎症性肺疾患、
成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺気腫、肺うっ血及び肺浮腫、慢性閉塞性肺
疾患（ＣＯＰＤ）、間質性肺疾患、及び肺癌のような呼吸器疾患；腺癌、白血病
、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌腫、具体的には副腎、膀胱、骨、骨
髄、脳、乳房、子宮頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、
卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状
腺、及び子宮の癌；免疫疾患、例えば後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジ
ソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド沈着症、
貧血症、喘息、アテローム性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺
炎、気管支炎、胆嚢炎、接触性皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋
炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児性赤芽球症、
結節性紅斑、萎縮性胃炎、腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病
、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力
症、心筋炎又は心膜炎、変形性関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ラ
イター症候群、リウマチ性関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフ
ィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰
瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌と血液透析と体外循環の合併症
、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、寄生虫感染、原虫感染、蠕虫感染、及び
外傷が挙げられる。患者の生検組織や体液を利用する、サザンブロット法或いは
ノーザンブロット法、ドットブロット法或いは他の膜をベースにした技術や、Ｐ
ＣＲ技術や、ディップスティック試験法（試験紙法）、ピン技術、及びＥＬＩＳ
Ａアッセイや、またはマイクロアレイにおいてＮＨＡＰをコードするポリヌクレ
オチド配列を用いることによって、ＮＨＡＰの発現の変化を検出することができ
る。このような定性的或いは定量的試験法は当分野では周知である。

【０１６４】 特定の実施態様では、関連する疾患、特に上に列挙した疾患の存在検出するア
ッセイにおいてＮＨＡＰをコードするヌクレオチド配列が有用であり得る。ＮＨ
ＡＰをコードするヌクレオチド配列を標準的な方法で標識し、ハイブリダイゼー
ション複合体の形成に適した条件の下で患者の体液や組織サンプルに加えること
ができる。適切なインキュベーション時間の経過後、このサンプルを洗浄し、シ
グナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルにおけるシグナルの量が、
対照サンプルのシグナル量と有意に異なっている場合、このヌクレオチド配列は
サンプルのヌクレオチド配列とハイブリダイズしており、サンプルのなかのＮＨ
ＡＰをコードするヌクレオチド配列のレベルの変化が生じていることは、関連す
る疾患の存在を示している。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験、また
は個々の患者の治療のモニタリングにおける特定の治療上の処置の有効性を評価
するために用いることもできる。

【０１６５】 ＮＨＡＰの発現に関連する疾病の診断の基礎とするために、正常な、即ち標準
の発現プロフィールを確立する。この標準プロフィールは、動物或いはヒト何れ
かの正常な被験者から採取された体液或いは細胞の抽出物を、ハイブリダイゼー
ション或いは増幅に適した条件下でＮＨＡＰをコードする配列又はその断片と結
合することにより確立し得る。標準のハイブリッド形成量は、既知の量の実質的
に精製されたＮＨＡＰが用いられる実験で得られる値と、正常被験者で得られる
値とを比較することにより定量することができる。正常なサンプルから得られた
標準値は、疾病の症状を呈する患者のサンプルから得られる値と比較することが
できる。標準値と被験者値との偏差を用いて疾病の存在を確認する。

【０１６６】 一旦疾患が確認され、治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイを定期的に反復して行って、患者における発現のレベルが正常な患者
において観察されるレベルに近づき始めたか否かを決定することができる。継続
的なアッセイから得られる結果を用いて、数日間或いは数ヶ月にわたる期間での
治療の効果を知ることができる。

【０１６７】 癌については、生検組織において転写物が比較的多量に存在することが、疾病
の発生の素因を示し、つまり実際の臨床的症状が現れる前に疾病を検出する手段
となり得る。このタイプのより確定診断により、医療従事者が予防的処置を講じ
たり、より早期に積極的な治療を開始し、癌の発生や更なる進行を予防すること
が可能となる。

【０１６８】 ＮＨＡＰをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドの他の診断目的
の使用法では、ＰＣＲ法を利用することがある。このようなオリゴマーは化学的
に合成したり、酵素を用いて作製したり、或いはin vitroで作製することができ
る。オリゴマーは、好ましくは、ＮＨＡＰをコードするポリヌクレオチドの断片
、またはＮＨＡＰをコードするポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの
断片を含み、特定の遺伝子或いは状態を識別するために最適な条件下で用いられ
る。オリゴマーは、近縁なＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出または定量のための低
めの厳密性条件の下で用いることもできる。

【０１６９】 ＮＨＡＰの発現の定量のために用いることもできる方法として、放射標識（ra
diolabeling）或いはビオチン標識したヌクレオチドの利用、対照の核酸の同時
増幅（coamplification）の利用、並びに実験結果を補完して引かれた標準のグ
ラフ曲線の利用等がある（例えばMelby, P.C.他(1993) J. Immunol. Methods, 1
59:235-244；及びDuplaa, C.他(1993) Anal. Biochem. 229-236参照）。多数の
サンプルの定量では、目的のオリゴマーが様々な希釈溶液中に存在し、分光光度
計を用いたり比色定量によって迅速に定量することができるようなＥＬＩＳＡ形
式のアッセイを行うことによって一層定量のスピードを上げることができる。

【０１７０】 別の実施例では、ここに開示するポリヌクレオチド配列の何れかに由来するオ
リゴヌクレオチドまたは長めの断片を、マイクロアレイにおけるターゲット（標
的）として用いることができる。マイクロアレイを用いることにより、多くの遺
伝子の発現レベルを同時にモニタし、また遺伝子の変異体、変異及び多型を同定
することができる。この情報は、遺伝子の機能の決定や、疾病の遺伝的な基礎の
理解、疾病の診断、及び治療薬の開発やその作用のモニタリングのために利用す
ることができる。

【０１７１】 マイクロアレイは、周知の方法を用いて準備し、使用し、解析することができ
る（例えばBrennam, T.M.他(1995)米国特許第5,474,796号；Schena, M.他 (1996
) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619；Baldeschweiler他 (1995) PCT出願
WO 95/251116；Shalon, D.他 (1995) PCT出願WO95/35505：Heller, R.A.他 (199
7) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155；及びHeller, M.J.他 (1997) 米国特
許第5,605,662号参照）。

【０１７２】 本発明の別の実施例では、ＮＨＡＰをコードする核酸配列を用いて、自然発生
のゲノム配列マッピングのために有用なハイブリダイゼーションプローブを作り
出すことができる。この配列は、特定の染色体、染色体の特定の領域、又は人工
染色体作製物にマッピングし得る。人工染色体作製物としては、例えばヒト人工
染色体（ＨＡＣｓ）、酵母菌人工染色体（ＹＡＣｓ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ
ｓ）、細菌性Ｐ１作製物、又は単染色体ｃＤＮＡライブラリー等がある（例えば
Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127-134；及びTrask, B.J. (1991) Trends G
enet. 7:149-154参照）。

【０１７３】 蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、他の物理的染色体マッ
ピング技術及び遺伝子地図データと関係がある（例えば、Meyers, R. A. (ed.) Molecular Biology and Biotechnology , VCH Publishers New York, NY, pp. 96
5-968に記載のHeinz-Ulrich他(1995)参照）。遺伝子地図データの例は、種々の
科学誌や、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）サイトに見られる。
物理的染色体地図上でのＮＨＡＰをコードする配列の位置と、特定の疾病（即ち
特定の疾病の素因）との相関関係を助けとして、ある疾病に関係するＤＮＡの領
域のを決定することができる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、キ
ャリア、及び患者との遺伝子配列の違いを検出することができる。

【０１７４】 染色体調製物のin situハイブリダイゼーションや、確立された染色体マーカ
ーを用いる連鎖解析のような物理的マッピング技術を、遺伝子地図を拡大するた
めに用いることができる。多くの場合、特定のヒト染色体の数やアームが未知で
あっても、マウスのような別の哺乳動物の染色体上の遺伝子配置から、関連する
マーカーがわかる。新たな配列は、物理的マッピングにより染色体のアームへ割
当てることができる。これにより、位置クローニング或いは他の遺伝子発見技術
を用いて疾病遺伝子を調査する研究者に貴重な情報をもたらすことができる。ひ
とたび、疾患或いは症候群が、遺伝子連鎖によって特定のゲノム領域に粗く位置
決定されたならば（例えば毛細血管拡張性運動失調は11q22-23へ）、その領域に
マッピングされる任意の配列は、さらなる研究のための関連する遺伝子、或いは
調節遺伝子を表し得ることになる（例えばGatti, R.A.等（1988）Nature 336:57
7-580参照）。本発明のヌクレオチド配列を、正常者、キャリア、及び患者の間
の、転座、逆位等によって生じた染色体の位置の違いを検出するために用いるこ
ともできる。

【０１７５】 本発明の別の実施例では、ＮＨＡＰや、その触媒作用性または免疫原性断片、
オリゴペプチドを、様々な薬物スクリーニング技術において化合物のスクリーニ
ングのために用いることができる。そのようなスクリーニングにおいて用いられ
る断片は、溶液に遊離した形態で存在するか、固形支持体へ付着した形態で存在
するか、細胞表面へ付着した形態で存在するか、或いは細胞内に存在するもので
あり得る。ＮＨＡＰと試験対象の薬剤との複合体形成を測定することができる。

【０１７６】 別の薬物スクリーニング技術によって、対象のタンパク質に対する適切な結合
親和性を有する化合物の高スループットのスクリーニングを行うことができる（
例えばGesen他(1984)PCT出願WO84/03564参照）。この方法では、多数の異なる小
形ペプチドの試験対象の化合物を、プラスチックピン或いは他の表面のような固
体基質上で合成する。試験対象の化合物をＮＨＡＰ又はその断片と反応させ、洗
浄する。次に結合ＮＨＡＰを周知の方法により検出する。また、前述の薬物スク
リーニング技術において使用するために、精製ＮＨＡＰをプレート上に直接コー
ティングすることもできる。或いは、非中和抗体を用いて、ペプチドを捕捉して
固形支持体上にペプチドを固定することができる。

【０１７７】 別の実施例では、ＮＨＡＰに結合し得る中和抗体がＮＨＡＰの結合について試
験対象の化合物と特異的に競合する競合的薬物スクリーニングアッセイを用いる
ことができる。この方法では、抗体を用いて、ＮＨＡＰの１又は２以上の抗原決
定基を共通に有する任意のペプチドの存在を検出することができる。

【０１７８】 更に別の実施例では、ＮＨＡＰをコードするヌクレオチド配列を、ヌクレオチ
ド配列の既知の特性、（例えば、限定するものではないが、トリプレット遺伝暗
号や特異的塩基対合のような特性に基づく現時点では未開発の新規技術）に基づ
く分子生物学上の技術において用いることができる。

【０１７９】 当業者であれば、更なる詳細な説明がなくとも、上述の説明に基づいて本発明
を最大限に利用することができると思われる。従って、以下の特定の好適実施例
は、あらゆる他の部分における開示内容を限定するものではなく単なる例示と解
釈されたい。

【０１８０】 本明細書に記載されているあらゆる特許、特許出願、及び文献、特に米国特許
出願第09/116,641号の開示内容は、ここで引用することにより本明細書の一部と
する。

【０１８１】

【実施例】

１ ｃＤＮＡライブラリーの作製 ＲＮＡはClontech社（Palo Alto, CA）から購入するか、或いは末尾の表１に
記載の組織からインサイト社において単離した。組織をグアニジウムイソチオシ
アネートの中でホモジナイズ・溶解し、その溶解産物を塩化セシウム密度勾配遠
心法で遠心分離した。或いは、この組織をフェノール又はTRIzol試薬（Life Tec
hnologies）のような変性剤、フェノール及びグアニジンイソチオシアネートの
単相溶液の適切な混合物においてホモジナイズ・溶解し、この溶解産物をクロロ
ホルム（1:5 v/v）で抽出した。イソプロパノールか酢酸ナトリウム及びエタノ
ールの何れかを用いてＲＮＡを溶解産物から沈殿させた。或いは、ＲＮＡを、分
離用アガロースゲル電気泳動法によって溶解産物から精製し、Whatman P81ペー
パー（Whatman, Lexington, MA）から回収した。ＲＮＡのフェノール抽出及び沈
殿の操作を、ＲＮＡの純度を高めるために必要なだけ反復し、このＲＮＡをＲＮ
アーゼの無い溶液に保存した。場合によっては、このＲＮＡをＤＮアーゼで処理
した。ライブラリーのほとんどについては、オリゴd(T)を結合した常磁性粒子（
Promega, Madison, WI）、Oligotex樹脂、又はOligotex kit（QIAGEN Inc, Chat
sworth, CA）を用いてポリ（Ａ＋）ＲＮＡを単離した。或いは、RNA Isolation
kit（Stratagene）又はArabion PolyA Quick kit（Ambion, Austin, TX）を用い
てＲＮＡを組織の溶解産物から直接単離した。

【０１８２】 ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリーの作製のため、共に周知の方法（Au
subel, 1997. units 5.1-6.6）に基づいた手順である、UNIZAPベクター（Strata
gene, La Jolla, CA）又はSuperScript plasmid system（Life Technologies）
の推奨手順に従ってＲＮＡを用いた。或いは、インサイト社が提供したＲＮＡを
用いてStratagene社がｃＤＮＡを作製した。逆転写は、オリゴd(T)又はランダム
プライマーを用いて開始させた。合成オリゴヌクレオチドアダプタを二本鎖ＤＮ
Ａに連結し、適切な制限酵素でｃＤＮＡを切断した。多くのライブラリーについ
ては、Sephacryl S1000又はSepharose CL2B又はCL4Bカラムクロマトグラフィを
用いて、或いは分離用アガロースゲル電気泳動法を用いてｃＤＮＡをサイズ選択
した（300-1000 bp）。ｃＤＮＡを適切なプラスミド、例えばpBluescript（Stra
tagene）、pSPORT 1（Life Technologies）、pINCY（Incyte Pharmaceuticals,
Inc. Palo Alto CA）のポリリンカーの適合性の制限酵素部位に連結した。pINCY
はJM109細胞で増幅し、QiaQuickカラム（QIAGEN Inc）を用いて精製した。組換
えプラスミドは、コンピテントな大腸菌細胞、例えばXLI-Blue、XLI-BiueMRF、
又はSOLR（Stratagene）若しくはDH5a、DH10B、又はElectroMAX DH10B（Life Te
chnologies）に形質転換した。

【０１８３】 ２ ｃＤＮＡクローンの単離 プラスミドを、in vivo切出し（UniZAP vector system, Stratagene）又は細
胞の溶解によって宿主細胞から回収した。プラスミドの精製は、MAGIC MINIPREP
S DNA purification system（Promega, Madison, WI）；Miniprep kit（Advance
d Genetic Technologies Corporation, Gaithersburg, MD）；QIAwell-8 Plasmi
d、QIAwell PLUS DNA purification systems、又はQIAwell ULTRA；若しくはREA
L Prep 96 plasmid kit（QIAGEN Inc）をその推奨プロトコルに従って用いて行
った。沈殿させた後、このプラスミドを０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁し、凍結乾
燥して、或いは凍結乾燥しないで４℃で保存した。

【０１８４】 或いは、高スループットのダイレクトリンクＰＣＲ法（Rao, V.B. (1994) Ana
l. Biochem. 216:1-14）を用いて、プラスミドＤＮＡを宿主細胞の溶解産物から
増幅した。宿主細胞の溶解及びサーマルサイクル（熱の上下）過程は、単体の反
応混合物において行った。サンプルを処理した上で３８４穴プレート（Genetix
Ltd, Christchurch UK）に保存し、増幅したプラスミドＤＮＡの作製物を、Pico
Green Dye（Molecular Probes, Eugene OR）及びFluoroscan II蛍光スキャナ（
Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光定量法で定量した。

【０１８５】 ３ シークエンシング及び解析 ｃＤＮＡを調製し、Peltier Thermal Cyclers（PTC200; MJ Research, Watert
own MA）と組合わせてABI CATALYST 800（Perkin Elmer）又はHamilton MICRO L
AB 2200（Hamilton, Reno, NV）の何れかを用いて配列決定した。標準的なABIプ
ロトコル、塩基指定（base calling）ソフトウェア、及びキットを用いて、Sang
er F及びA.R. Coulsonの方法（1975; J. Mol. Biol. 94:441-448）によって、AB
I373又は377 DNAシークエンシングシステム（Perkin Elmer）でｃＤＮＡを配列
決定した。或いは、Amersham Pharmacia Biotech製の溶液及び色素を用いて、ｃ
ＤＮＡを調製し配列決定した。読み枠の決定は、標準的な方法（Ausubel, 前出
）を用いて行った。

【０１８６】 配列表のヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列を問い合わせ配列として用
いて、GenBankの霊長類（pri）、齧歯類（rod）、哺乳動物（mamp）、脊椎動物
（vrtp）、及び真核生物（eukp）のデータベース、SwissProt、BLOCKS、及び既
に同定されたモチーフ及び配列が注釈付きで含められている他のデータベース等
のデータベースを検索した。一次配列パターン及び二次構造ギャップペナルティ
を処理するSmith Waterman（Smith, T.等 (1992) Protein Engineering 5:35-51
）のようなアルゴリズム及びBLAST （Basic Local Alignment Search Tool; Alt
schul, S.F. (1993)J. Mol. Evol 36:290-300；及びAltschui他 (1990) J. Mol.
Biol. 215:403-410）、及びHMM （隠れマルコフモデル（Hidden Markov Models
）; Eddy, S.R.(1996) Cur. Opin. Str. Biol. 6:361-365及びSonnhammer, E.L.
L.他 (1997) Proteins 28:405-420）のようなプログラム及びアルゴリズムを用
いて、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の組立て及び解析を行った。これらの
データベース、プログラム、アルゴリズム、方法及びツールは既存の利用可能の
ものであり、Ausubel（前出, unit 7.7）、Meyers, R.A.（1995; Molecular Bio
logy and Biotechnology, Wiley VCH, Inc, New York NY, p 856-853）、ソフト
ウェア（Genetics Computer Group (GCG), Madison Wl）によって提供される文
書や、インターネットのウェブサイト上の文書に記載されている。多くのデータ
ベース及びツールをリストし、記述し、及び／リンクしている２つの総合的なウ
ェブサイトは、（１）the www resource in practical sequence analysis（htt
p://genome.wusti.edu/）、及び（２）the bibliography of computational gen
e recognition（http://linkage. rockefeiler. edu/wli/gene/programs.html）
である。例えば、第１のウェブサイトは、データベースとしてPFAM（http://gen
ome.wustl.edu/Pfam/）にリンクしており、HMMサーチツール（http://genome.wu
stl.edu/eddy/cgi-bin/hmm_page.cgi）にもリンクしている。明細書末尾の表２
には、ここで用いるデータベース及びツールの概要が記載されている。表２の第
１列には、ツール、プログラム、又はアルゴリズムが、表の第２列にはデータベ
ースが、第３列には簡単な説明が記載されており、第４列には、（そこに記載が
ある場合は）２つの配列の間の一致度を決定するスコア（この値が高くなる程相
同性が高くなる）が記載されている。

【０１８７】 ４ 完全長ＮＨＡＰのクローニング GeneTrapper^TM cDNA Positive Selection System kit（Life Technologies）
を用いて、ＮＨＡＰ−１及びＮＨＡＰ−２の完全長ｃＤＮＡクローンを単離した
。製品の使用説明書に従って、インサイト社クローンNo. 2756549の部分的核酸
配列に基づきオリゴヌクレオチドを設計し、３’末端をビオチン標識し、ヒト肺
（Cat. No. 10424-018, Life Technologies）及びヒト白血球（Cat. No. 10421-
014, Life Technologies）のプラスミドｃＤＮＡライブラリーからの一本鎖ＤＮ
Ａとハイブリダイズさせた。５種のｃＤＮＡクローン、gt83、gt86、gt97、gt88
、及びgt91を、肺ｃＤＮＡライブラリーから単離した。また白血球ライブラリー
からは５種のｃＤＮＡクローン、gt4、gt22、gt49、gt53、及びgt90を単離した
。配列決定を行った結果、肺ライブラリーから単離したクローンは、インサイト
社クローンNo. 372637及び1242901の核酸配列、及び後にＮＨＡＰ−１と称され
る遺伝子（前の出願ではＨＵＰＭ−４）と同一であった。肺ライブラリーから単
離したクローンの核酸配列は、白血球ライブラリーから単離したもの及びインサ
イト社クローンNo. 2435410及び2756549とは異なっていた。従って２種の遺伝子
が同定され、後にＮＨＡＰ−１及びＮＨＡＰ−２と称するものとした。ＮＨＡＰ
−１は、ｃＤＮＡクローンgt83、gt86、gt97、gt88、gt91、インサイト社クロー
ンNo. 372637及び1242901を含む。ＮＨＡＰ−２は、ｃＤＮＡクローンgt4、gt22
、gt49、gt53、gt90、及びインサイト社クローンNo. 2435410及び2756549を含む
。配列の相同性解析の結果、ＮＨＡＰ−１とＮＨＡＰ−２との間の８９％の核酸
配列同一性が分かった。

【０１８８】 ５ ノーザン法による解析 ノーザン法による解析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる
実験技術であり、この方法では特定の細胞の型又は組織からのＲＮＡが結合した
メンブランに標識したヌクレオチド配列をハイブリダイズさせる。（例えばSamb
rook, 前出, ch. 7;及びAusubel, 前出, ch. 4及び16参照） 膜をベースにしたノーザン法による解析を、ＮＨＡＰ−２のｃＤＮＡでプロー
ビングしたMultiple Tissue Northern Blots（Clontech, Palo Alto, CA）を用
いて様々なヒト組織からのＲＮＡサンプルについて行った。このプローブは、HI
GH PRIMER DNA labeling kit（Boerheinger Mannhelm, Indianapolis, IN）を用
いてランダムプライミング法で³³Ｐで標識した。ハイブリダイゼーションは、５
０％のホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ、５０ｍＭのＮａＰＯ₄、ｐＨ７．４、１Xデ
ンハート溶液、２％のＳＤＳ、及び１００ug/mlのサケ精子ＤＮＡを含む溶液に
おいて４２℃で終夜、厳密な条件の下で行った。ブロットを室温で２〜３回２Ｘ
ＳＳＣで洗浄し、次に、必要な場合は０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで５
０℃で１〜２回洗浄し、−８０℃でオートラジオグラフィにかけた。ノーザン法
による解析の結果、腎臓、末梢血の白血球、脾臓、及びリンパ節から〜１．３ｋ
ｂのＲＮＡ種が高レベルで発現されていることが立証された（図４）。このＲＮ
Ａ種は、肺、骨髄、胸腺、及び胎仔の肝臓においてもより低いレベルであるが発
現された。ＮＨＡＰ−２がＮＨＡＰ−１と８９％の相同性を有していることから
、このノーザン法による解析の結果は、ＮＨＡＰ−１とＮＨＡＰ−２の両方の発
現プロフィールを反映している。上記のブロットを剥ぎ取って、ＮＨＡＰ−１特
異的オリゴヌクレオチドで再度プロービングすると、１．３ｋｂのＲＮＡ種の発
現が肺のみにおいて見出された（図５）。

【０１８９】 BLASTを利用する類似のコンピュータ技術を用いて、例えばGenBank又はLIFESE
Q^TMデータベース（Incyte Pharmaceuticals）のようなヌクレオチドデータベー
スにおいて同一の又は近縁な分子を検索した。

【０１９０】 検索の基準値は積スコアであり、これは以下の式、 （配列の一致率（％）×最大BLASTスコア（％））／１００ で定義されるものである。

【０１９１】 この積スコアは、２つの配列間の類似性の程度、及び配列の長さの一致の双方
を考慮に入れている。例えば、積スコアが４０の場合は、誤差が１〜２％の範囲
の一致であり、スコアが７０の場合は正確な一致である。類似な分子は通常積ス
コアとして１５〜４０を示すものを選択することによって同定されるが、よりス
コアの低いものも近縁関係にある分子として同定される。

【０１９２】 ノーザン法による解析の結果から、様々なｃＤＮＡライブラリーにおけるＮＨ
ＡＰをコードする転写物の存在が分かった。このようなｃＤＮＡライブラリーの
５９％は癌及び不死化細胞系関連であり、２２％以上は炎症及び免疫応答に関連
するものである。この解析では転写物の存在量及びパーセント存在率も報告され
る。存在量は或るｃＤＮＡライブラリーに存在する特定の転写物の数を直接反映
し、パーセント存在率は、存在量をそのｃＤＮＡライブラリーにおいて調べられ
た配列の総数で除したものである。

【０１９３】 ６ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の配列に基づいて作製された
ハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤＮＡ、ゲノムのＤＮＡ、または
ｍＲＮＡをスクリーニングする。約２０の塩基対からなるオリゴヌクレオチドの
標識について特に記すが、より大きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも基本的に
同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO4.06（National Biosciences
）のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし、それぞれ５０ｐｍｏｌの
オリゴマーと、２５０μＣｉの[γ‐³²Ｐ]アデノシン三リン酸（Amersham, Chic
ago, IL）と、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN、Boston, MA）とを
組み合わせて用いることにより標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、Se
phadex G-25超精細サイズ排除デキストランビードカラム（Pharmacia & Upjohn
, Kalamazoo, MI）を用いて実質的に精製する。毎分１０⁷カウントの標識された
プローブを含むアリコットを、エンドヌクレアーゼAseI，Bgl II，EcoRI，Pst I
，Xba1或いはPvuII（DuPont NEN）の１つを用いて切断したヒトゲノムＤＮＡの
典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において用いる。

【０１９４】 各切断物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画して、ナイロン製
メンブラン（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）にトランスファ
ーする。ハイブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグ
ナルを取り除くため、ブロットを、最大０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び
０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまでの段階的に厳密性が増す条件で順次室温に
て洗浄する。XOMAT AR^TMフィルム（Kodak, Rochester, NY）をブロットに数時間
露光した後、ハイブリダイゼーションパターンを視覚的に比較する。

【０１９５】 ７ マイクロアレイ 化学的結合プロシージャ及びインクジェット装置を用いて、基板の表面上にア
レイエレメントを合成することができる（例えばBaldeschweiler, 前出、参照）
。ドットブロット法又はスロットブロット法で用いるものに類似したアレイを利
用し、熱、ＵＶ、化学的、又は機械的結合プロシージャを用いて基板の表面にエ
レメントを配列し結合してもよい。通常のアレイは、手作業により、又は市販の
方法及び機械を使用することによって作成することができ、任意の適切な数のエ
レメントを有し得る。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズしていない
プローブを取り除き、スキャナを用いて蛍光の強度及びパターンを決定する。マ
イクロアレイ上でエレメントにハイブリダイズした各プローブの相補性の程度及
び相対的な量をスキャンしたイメージを解析することによって評価し得る。

【０１９６】 完全長ｃＤＮＡ、Expressed Sequence Tags（ＥＳＴｓ）、又はその断片は、
マイクロアレイのエレメントを含み得る。ハイブリダイゼーションに適したフラ
グメントを、例えばLASERGENE^TMのような周知のソフトウェアを用いて選択する
ことができる。本発明のヌクレオチド配列の１つに対応する、若しくは本発明に
関連するｃＤＮＡライブラリーからランダムに選択された完全長ｃＤＮＡ、ＥＳ
Ｔ、又はそのフラグメントを、適切な基板、例えばスライドガラス上に配列する
。このｃＤＮＡを、例えばＵＶでクロスリンクさせ、次に熱及び化学的処理をし
、乾燥させることによってスライド上に固定する（例えばSchena, M. 他 (1995)
) Science 270:467-470及びShaion, D.他 (1996) Genome Res. 6:639-645を参照
）。蛍光プローブを準備し、基板上のエレメントにハイブリダイズさせるために
用いる。この基板を上記のような手順で解析する。

【０１９７】 ８ 相補的ポリヌクレオチド ＮＨＡＰをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、自
然発生のＮＨＡＰの発現を検出したり、その発現を低下させる、即ち阻害するた
めに用られる。約１５〜約３０個の塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用につ
いて特に記すが、より小さな或いはより大きな配列のフラグメントの場合でも概
ね同じ方法を用いることができる。OLIGO4.06ソフトウェア及びＮＨＡＰのコー
ディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害する
ためには、最も独特な５′配列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、これ
を用いてプロモーターがコーディング配列に結合しないようにする。翻訳を阻害
するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがＮＨＡＰ
をコードする転写物に結合しないようにする。

【０１９８】 ９ ＮＨＡＰ−１の発現 ＮＨＡＰをコードするｃＤＮＡを用いて、ｃＤＮＡを適当なベクターにサブク
ローニングし、このベクターを宿主細胞に導入することによって完全長ＮＨＡＰ
−１を発現させた。大腸菌におけるＮＨＡＰ−１の発現のために、His6のＮ末端
タグを与える細菌の発現ベクターpET15b（Novagen, Inc., Madison, WI）にサブ
クローニングした。大腸菌における発現をモニタリングするため、ＩＰＴＧによ
る誘導の前及び後に培地から得た細胞の溶解物を、低い変性条件の下でポリアク
リルアミドゲル電気泳動法を用いて分離し、免疫前血清及び免疫血清（IC620）
でプロービングした。抗血清の結合の検出は、ＨＲＰ結合ロバ抗ウサギＩｇによ
って行い、ＥＣＬ（機能強化（enhanced）化学ルミネセンス）を用いて可視化し
た。ＮＨＡＰ−１組換えタンパク質は、主として、免疫血清にさらされたＩＰＴ
Ｇで誘導された細胞の不溶性分画からの〜４５ｋｄのバンドとして検出された（
図６）。誘導されていない細胞や、免疫前血清でプロービングされた細胞ではバ
ンドは検出されなかった。ＮＨＡＰ−１のｃＤＮＡを、Ｓｆ９昆虫細胞における
発現のためにバキュロウイルスpFast-bac-HTc（Life Technologies）や、哺乳動
物ＨＥＫ２９３細胞における発現のためにpCMV-SPORT（Life Technologies）に
もサブクローニングした。

【０１９９】 １０ ＮＨＡＰの活性の立証 ＮＨＡＰのプロテアーゼ活性を、様々な色素生産性分子が結合した適切な合成
ペプチド基質の加水分解によって測定する。この場合加水分解の程度は、放出さ
れた発色団の分光光度的（又は蛍光定量的）な吸光度によって定量される（Beyn
on, R.J.及びJ.S. Bond (1994) Proteolytie Enzymes: A Practical Approach,
Oxford University Press, New York, NY, pp.25-55）。ペプチド基質は、エン
ドペプチダーゼ（セリン、システイン、アスパラギン酸プロテアーゼ）、アミノ
ペプチダーゼ（ロイシンアミノペプチダーゼ）、又はカルボキシペプチダーゼ（
カルボキシペプチダーゼＡ及びＢ、プロコラーゲンＣプロテイナーゼ）等のプロ
テアーゼ活性のカテゴリに基づいて設計される。一般に使用される色素源として
は、２−ナフチルアミン、４−ニトロアニリン、及びフリルアクリル酸が挙げら
れる。アッセイは周囲温度で行い、適切なバッファに溶解した酵素及び適切な基
質のアリコットを用いる。反応は、適切なキュベットにおいて行い、その後ペプ
チド基質の加水分解の際に放出された色素源の吸光度の増加／減少が生ずる。こ
のアッセイにおいて吸光度の変化は酵素活性に比例する。

【０２００】 １１ 機能分析アッセイ ＮＨＡＰの機能を、哺乳動物細胞培養系において、ＮＨＡＰをコードする配列
を生理学的に高いレベルで発現させることによって評価する。ｃＤＮＡを、それ
を高レベルで発現させる強力なプロモーターを有する哺乳動物の発現ベクターに
サブクローニングする。選択されるベクターとしては、pCMV SPORT^TM（Life Tec
hnologies, Gaithersburg, MD）及びpCR^TM 3. 1（Invitrogen, Carlsbad, CA）
、両ベクターは共にサイトメガロウイルスのプロモーターを有している。５〜１
０μｇの組換えベクターをリポソーム製剤又はエレクトロポレーションの何れか
を利用してヒトの細胞系、好ましくは内皮細胞又は造血細胞を起源とする細胞系
に一時的にトランスフェクトする。またマーカータンパク質をコードする配列を
有する別のプラスミドを１〜２μｇ同時感染させる。マーカータンパク質の発現
は、トランスフェクト細胞を非トランスフェクト細胞から区別するための手段と
なり、組換えベクターからのｃＤＮＡの発現の信頼できる予測が可能となる。選
択できるマーカータンパク質としては、例えばGreen Fluorescent Protein（GFP
）（Clontech, Palo Alto, CA）、CD64又はCD64-GFP融合タンパク質等が挙げら
れる。GFP又はCD64−GFPを発現するトランスフェクト細胞を特定し、その特性、
例えばそのアポトーシス状態を評価するために、自動式のレーザー光を用いる技
術であるフローサイトメトリー（流動細胞計測法）（ＦＣＭ）を用いる。ＦＣＭ
によって蛍光分子の取込みを検出し、定量細胞死の前又は細胞死の際の事象を診
断する。このような事象としては、ヨウ化プロピジウムでＤＮＡを染色すること
によって測定される核のＤＮＡ含量の変化、散乱光及び９０度横向きの散乱光を
当てることによって測定される細胞のサイズ及び粒状度の変化、ブロモデオキシ
ウリジンの取込みの低下によって測定されるＤＮＡ合成のダウンレギュレーショ
ン、特異的抗体との反応性によって測定される細胞表面及び細胞内のタンパク質
の発現の変化、及びフルオレセイン結合アレキシンＶタンパク質と細胞表面との
結合によって測定される原形質膜の組成の変化がある。フローサイトメトリーの
方法は、Ormerod, M. G. (1994) Flow Cytometry, Oxford, New York, NYに記載
されている。

【０２０１】 遺伝子の発現に対するＮＨＡＰの影響は、ＮＨＡＰをコードする配列及びCD64
又はCD64-GFPの何れかをトランスフェクトした高度に精製された細胞の集団を用
いて評価することができる。CD64及びCD64-GFPはトランスフェクト細胞の表面で
発現され、ヒト免疫グロブリンＧ（IgG）の保存的領域に結合する。トランスフ
ェクト細胞は、ヒトIgG又はCD64に対する抗体の何れかでコーティングされた磁
性ビーズ（DYNAL, Lake Success, NY）を用いて非トランスフェクト細胞から効
率的に分離する。ｍＲＮＡの細胞からの精製は、当業者に周知の方法を用いて行
うことができる。ＮＨＡＰをコードするｍＲＮＡ及び目的の他の遺伝子の発現は
、ノーザンブロット法による解析又はマイクロアレイ技術によって解析すること
ができる。

【０２０２】 １２ ＮＨＡＰに特異的な抗体の製造 ＮＨＡＰ−１のＣ末端の１９個のアミノ酸残基を含むオリゴペプチドを合成し
た。２匹のウサギを、フロイントの完全アジュバント（Zeneca LifeScience Mol
ecules, Wilmington, DE）を用いてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体で免疫化した
。得られた抗血清のIC619及びIC620を、高ペプチド活性についてＥＬＩＳＡで試
験した。ウエスタンブロット法による解析によって大腸菌及びＳｆ９昆虫細胞に
おいて発現された組換えタンパク質を認識することが分かった。簡単に述べると
、対応する発現産物を含む大腸菌及びＳｆ９細胞を溶解し、変性ＰＡＧＥゲル（
NuPage gels, Novex）上でタンパク質を分離し、前に説明した方法に従ってニト
ロセルロース膜にトランスファーした。次にこのブロットに抗血清IC619又はIC6
20をプロービングした。抗血清の結合は、ＨＲＰ結合ロバ抗ウサギＩｇで検出し
、ＥＣＬ（機能強化化学ルミネセンス）システム（Amersham Pharmacia Biotech
）を用いて可視化した。

【０２０３】 １３ 特異的抗体を用いる自然発生ＮＨＡＰの精製 自然発生ＮＨＡＰ或いは組換えＮＨＡＰを、ＮＨＡＰに特異的な抗体を用いる
イムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィ
ニティーカラムは、例えばCnBr-活性化Sepharose（Pharmacia & Upjohn）のよう
な活性化クロマトグラフィー用レジンと抗ＮＨＡＰ抗体とを共有結合させること
により構築する。結合の後、そのレジンを製品の使用説明書の指示に従って、ブ
ロックし洗浄する。

【０２０４】 ＮＨＡＰを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムをＮ
ＨＡＰを優先的に吸着できる条件下で（例えば界面活性剤の存在下において高イ
オン強度のバッファーで）洗浄する。このカラムを、抗体とＮＨＡＰとの結合を
切るような条件下で（例えばｐＨ２−３のバッファー、或いは高濃度の尿素また
はチオシアナートイオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、ＮＨＡＰ
を回収する。

【０２０５】 １４ 正常な組織及び端部組織におけるＮＨＡＰ−１の免疫細胞化学的解析 一次抗体としてＮＨＡＰ−１に特異的なウサギ免疫血清IC619を用いてヒトの
組織サンプルにおけるタンパク質の位置決定をするために免疫細胞化学的解析を
行った。この解析は、LifeSpan BioSciences, Inc., Seattle WAにより行われた
。この検出システムは、ビオチン標識した二次抗体で標識した後に、ストレプト
アビジン−セイヨウワサビペロオキシダーゼ結合体及びＤＡＢ基質を加えたスト
レプトアビジン−ビオチンキットを含むDAKO LSAB+ Kit（DAKO corp., Carpinte
ria CA）からなるものであった。内在性ビオチン及び内在性ペルオキシダーゼに
対して組織のブロックも行った。各組織サンプルについて行ったネガティブコン
トロールとしては、免疫前血清による染色等を行った。更に、１０倍量のＮＡＰ
１由来の免疫化ペプチドと共に抗体IC619をインキュベートすることにより染色
をブロックするための実験も行った。この解析の結果、抗体IC619が脳下垂体前
葉、甲状腺濾胞細胞、及び肺のII型肺細胞において強い陽性な染色を生ずること
が立証された。正常な組織及び患部組織の両方を含む全ての検査した肺組織にお
いて、II型肺細胞は抗体IC619に対して陽性に染色された。詳述すると、肺気管
支−肺胞癌及び肺腺癌は強い正の染色を生じた。小細胞癌、扁平上皮癌、腺癌、
及び転移性結腸腺癌を含む他の肺新生物は、染色時陰性であった。

【０２０６】 １５ 蛍光In Situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析によるＮＨＡＰ
−１及びＮＨＡＰ−２の染色体上の位置決定 ＮＨＡＰ−１及びＮＨＡＰ−２の両方の染色体上の位置決定をするためにＦＩ
ＳＨ解析を行った（Genome Systems, Inc., St. Louis, MO）。ＮＨＡＰ−１及
びＮＨＡＰ−２に対応する２つのゲノムクローンからのＤＮＡを、ニックトラン
スレーション法によりジゴキシゲニンｄＵＴＰで標識した。標識したプローブを
同じ長さに切り揃えたヒトＤＮＡと結合させ、男性のドナーから得られた、ＰＨ
Ａで刺激した末梢血の白血球に由来する正常な分裂中期の染色体を、５０％のホ
ルムアミド、１０％のデキストラン硫酸及び２Ｘ ＳＳＣを含む溶液内で個別に
ハイブリダイズさせた。蛍光標識した抗ジゴキシゲニン抗体の中でハイブリダイ
ズしたスライドをインキュベートし、ＤＡＰＩで対抗染色することにより特定の
シグナルを検出した。これらの実験の結果、１９番染色体の長いアームが特に標
識された。１９番染色体に対する特異的ハイブリダイゼーションによって１０本
のスプレッドを定量した結果、ＮＨＡＰ−１及びＮＨＡＰ−２をコードする遺伝
子は、互いに区別不可能で、バンド１９ｑ１３．３に対応する領域である染色体
アーム１９ｑのセントロメアからテロメアに渡る距離の７３％の位置にあること
が立証された。

【０２０７】 １６ ＮＨＡＰと相互作用する分子の同定 ＮＨＡＰ又は生物学的に活性なその断片を、¹²⁵Ｉボルトンハンター試薬で標
識する（例えば、Bolton他 (1973) Biochem. J. 133:529参照）。マルチウェル
プレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したＮＨＡＰとともにインキ
ュベートし、洗浄して、標識したＮＨＡＰ複合体を有するウェルをアッセイする
。異なるＮＨＡＰ濃度で得られたデータを用いて、候補の分子とＮＨＡＰの会合
、親和性、数について数値を計算する。

【０２０８】 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法
及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。特定の好適実施例に関
して本発明を説明したが、本発明の真の範囲が、そのような特定の実施例に不当
に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連
分野の専門家には明らかな本明細書に記載の本発明の実施のための方法の様々な
改変は、特許請求の範囲に含まれることが意図されている。

【０２０９】 以下の表１は、インサイト社クローン、及びＮＨＡＰをコードする核酸配列が
同定された関連ライブラリー、ライブラリーの簡単な説明、及び各ｃＤＮＡをク
ローン化したベクターを示す。

【０２１０】 以下の表２は、本発明の配列を組立て解析するために用いたデータベース及び
ツールの概要を示した表である。表２の第１列は、ツール、プログラム、又はア
ルゴリズムを示し、第２列はデータベースを示し、第３列は簡単な説明を示し、
第４列は、（記入されている場合は）２つの配列の間の一致度を決定するスコア
（この値が高くなる程より相同性が高い）を示す。

【０２１１】

【表１】

【０２１２】

【表２】

【０２１３】

【表３】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 ＮＨＡＰ−１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）の一部を示す図である。配列アライメントは、MacDNASIS PRO^{T M} ソフトウェア（Hitachi Software Engineering Co., Ltd., San Bruno, CA）を
用いて作成した。

【図１Ｂ】 ＮＨＡＰ−１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）の一部を示す図である。配列アライメントは、MacDNASIS PRO^{T M} ソフトウェア（Hitachi Software Engineering Co., Ltd., San Bruno, CA）を
用いて作成した。

【図１Ｃ】 ＮＨＡＰ−１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）の一部を示す図である。配列アライメントは、MacDNASIS PRO^{T M} ソフトウェア（Hitachi Software Engineering Co., Ltd., San Bruno, CA）を
用いて作成した。

【図１Ｄ】 ＮＨＡＰ−１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）の一部を示す図である。配列アライメントは、MacDNASIS PRO^{T M} ソフトウェア（Hitachi Software Engineering Co., Ltd., San Bruno, CA）を
用いて作成した。

【図２Ａ】 ＮＨＡＰ−２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４）の一部を示す図である。配列アライメントは、MacDNASIS PRO^{T M} ソフトウェアを用いて作成した。

【図２Ｂ】 ＮＨＡＰ−２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４）の一部を示す図である。配列アライメントは、MacDNASIS PRO^{T M} ソフトウェアを用いて作成した。

【図２Ｃ】 ＮＨＡＰ−２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４）の一部を示す図である。配列アライメントは、MacDNASIS PRO^{T M} ソフトウェアを用いて作成した。

【図２Ｄ】 ＮＨＡＰ−２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４）の一部を示す図である。配列アライメントは、MacDNASIS PRO^{T M} ソフトウェアを用いて作成した。

【図３Ａ】 ＮＨＡＰ−１（372637：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ＮＨＡＰ−２（2435410；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、及びマウス腎臓由来のアスパラギン酸プロテアーゼ様
タンパク質（GI 1906810：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）の間のアミノ酸配列アライ
メントを示す図である。この配列アライメントは、マルチシーケンスアライメン
トプログラムであるLASERGENE^TMソフトウェア（DNASTAR Inc, Madison WI）を用
いて作成した。

【図３Ｂ】 ＮＨＡＰ−１（372637：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ＮＨＡＰ−２（2435410；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、及びマウス腎臓由来のアスパラギン酸プロテアーゼ様
タンパク質（GI 1906810：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）の間のアミノ酸配列アライ
メントを示す図である。この配列アライメントは、マルチシーケンスアライメン
トプログラムであるLASERGENE^TMソフトウェア（DNASTAR Inc, Madison WI）を用
いて作成した。

【図３Ｃ】 ＮＨＡＰ−１（372637：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ＮＨＡＰ−２（2435410；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、及びマウス腎臓由来のアスパラギン酸プロテアーゼ様
タンパク質（GI 1906810：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）の間のアミノ酸配列アライ
メントを示す図である。この配列アライメントは、マルチシーケンスアライメン
トプログラムであるLASERGENE^TMソフトウェア（DNASTAR Inc, Madison WI）を用
いて作成した。

【図４】 ＮＨＡＰ−２のｃＤＮＡでプロービングしたＮＨＡＰ−２及びＮＨＡＰ−１の
ノーザンブロッティング解析の結果を示す図である。組織ブロットはClontech,
Palo Alto, CA.から得た。

【図５】 図４と同じ組織を用いて行った、ＮＨＡＰ−１特異的オリゴヌクレオチドでプ
ロービングしたＮＨＡＰ−１のノーザンブロッティング解析の結果を示す図であ
る。

【図６】 大腸菌における組み換えＮＨＡＰ−１タンパク質の発現のウエスタンブロッテ
ィング解析の結果を示す図である。コンピテントな大腸菌株BL21（DE3）を、ベ
クター（pET15b）又はＮＨＡＰ−１発現作成物（pETI 5b/NHAP-1）の何れかで形
質転換した。ＩＰＴＧによる誘導の前（Ｐ）又はＩＰＴＧによる誘導の後（Ｉ）
の培地からの細胞溶解産物を、低い変性条件の下でポリアクリルアミドゲル電気
泳動法を用いて分離し、免疫前及び免疫血清（IC620）でプロービングした。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 3/00 37/02 ４Ｃ０８５ 11/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 ４Ｈ０４５ 35/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 37/02 1/19 Ｃ０７Ｋ 16/40 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/15 9/64 Ｚ 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 9/64 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｆ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 エルセンボス、ローラ・エイ アメリカ合衆国コネチカット州06355・ミ スティック・＃エイ２・ヒューイットロー ド 45 (72)発明者 フォグリアーノ、マイケル アメリカ合衆国コネチカット州06371・オ ールドライム・スワンスウッドレーン ４ (72)発明者 コハン、ビクトリア・エル アメリカ合衆国コネチカット州06333・イ ーストライム・スプリングロックロード 43 (72)発明者 バンドマン、オルガ アメリカ合衆国カリフォルニア州94043・ マウンテンビュー・アンナアベニュー 366 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA14 CA04 CA11 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 GA11 HA01 HA12 HA15 4B050 CC01 CC03 DD11 LL01 LL03 4B063 QA01 QA19 QQ01 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR55 QR62 QS25 QS34 QS36 QX02 4B064 AG27 CA01 CA19 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 BA02 CA25 CA33 CA44 CA46 4C084 AA02 AA17 CA53 DC50 ZA592 ZA812 ZB012 ZB082 ZB132 ZB262 ZC022 ZC062 4C085 AA13 AA14 CC04 CC22 DD24 DD63 DD86 FF02 FF03 4H045 AA11 AA20 AA30 CA40 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその断片を含む
   実質的に精製されたポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配
   列同一性を有する実質的に精製された変異体。
3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする単離され精製された
   ポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチドと少なくとも７０％のポリヌ
   クレオチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異体。
5. 【請求項５】 請求項３のポリヌクレオチドと、厳密な条件の下でハイブ
   リダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチド配列に相補的な配列を有する
   単離され精製されたポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のポリヌクレオチド配列又はその断
   片を含む単離され精製されたポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 請求項７のポリヌクレオチドと少なくとも７０％のポリヌ
   クレオチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異体。
9. 【請求項９】 請求項７のポリヌクレオチドに相補的な配列を有する単離
   され精製されたポリヌクレオチド。
10. 【請求項１０】 請求項３のポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む発
    現ベクター。
11. 【請求項１１】 請求項１０の発現ベクターを含む宿主細胞。
12. 【請求項１２】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその断片を含
    むポリペプチドの製造方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の下で、請求項１１の宿主細胞を
    培養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと
    を特徴とするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその断片を含むポリペプ
    チドの製造方法。
13. 【請求項１３】 請求項１のポリペプチドを適切な医薬用担体と共に含む
    医薬品組成物。
14. 【請求項１４】 請求項１のポリペプチドに特異的に結合する精製された
    抗体。
15. 【請求項１５】 請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
16. 【請求項１６】 請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。
17. 【請求項１７】 内分泌疾患の治療又は予防方法であって、 そのような治療が必要な患者に、請求項１３の医薬品組成物を有効な量投与す
    る過程を含む内分泌疾患の治療又は予防方法。
18. 【請求項１８】 内分泌疾患の治療又は予防方法であって、 そのような治療が必要な患者に、請求項１６のアンタゴニストを有効な量投与
    する過程を含む内分泌疾患の治療又は予防方法。
19. 【請求項１９】 免疫疾患の治療又は予防方法であって、 そのような治療が必要な患者に、請求項１６のアンタゴニストを有効な量投与
    する過程を含む免疫疾患の治療又は予防方法。
20. 【請求項２０】 呼吸器疾患の治療又は予防方法であって、 そのような治療が必要な患者に、請求項１６のアンタゴニストを有効な量投与
    する過程を含む呼吸器疾患の治療又は予防方法。
21. 【請求項２１】 癌の治療又は予防方法であって、 そのような治療が必要な患者に、請求項１６のアンタゴニストを有効な量投与
    する過程を含む癌の治療又は予防方法。
22. 【請求項２２】 生物学的サンプルにおけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミ
    ノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその断片を検出
    する方法であって、 （ａ）請求項６のポリヌクレオチドと、前記生物学的サンプルの核酸材料の少
    なくとも１種類とをハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成
    する過程と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイ
    ブリダイゼーション複合体の存在が、前記生物学的サンプルにおける前記ポリペ
    プチドをコードするポリヌクレオチドの存在と相関性を有する、該過程とを含む
    ことを特徴とする生物学的サンプルにおけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配
    列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその断片の検出方法。
23. 【請求項２３】 ハイブリダイゼーションの前に、前記ポリヌクレオチド
    を増幅する過程を更に含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。