JP2002514056A

JP2002514056A - ワクチン

Info

Publication number: JP2002514056A
Application number: JP51972698A
Authority: JP
Inventors: パチュク，キャサリン; ヘロルド，カスリーン
Original assignee: アメリカン・ホーム・プロダクツ・コーポレーション
Priority date: 1996-10-23
Filing date: 1997-10-23
Publication date: 2002-05-14
Also published as: EP0958373A1; WO1998017820A1; US5958895A; BR9712366A; AU5153098A; CA2269754A1; KR100564268B1; AU734443B2; KR20000052743A; EP0958373A4; AU734443C

Abstract

(57)【要約】予防及び治療ワクチンが開示されている。単純疱疹ウィルス感染を予防又は治療するためのワクチンが開示されている。単純疱疹ウィルス感染を防止する方法及び単純疱疹ウィルスに感染した個体を治療する方法並びに単純疱疹ウィルス用の予防及び治療ワクチン用の組成物及び作成方法が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】ワクチン技術分野本発明は単純疱疹ウィルス用ワクチンを含む予防および治療用ワクチン、単純疱疹ウィルス感染予防方法および単純疱疹ウィルスに感染した個体の治療方法、並びに単純疱疹ウィルス予防および治療用ワクチン組成物および作成方法に関するものである。背景技術単純疱疹ウィルス（HSV）には単純疱疹ウィルス１（HSV1）と単純疱疹ウィルス２（HSV2）の両方が含まれるが、このウィルスに感染した者だけでなく集団中の非感染メンバーにとっても重大な健康上の関心事である。症状を軽減するとともに、休眠ウィルスが活性化し生殖組織または口腔組織に腫れ物として現れるウィルスの能力の増強を低減または除去するのに有効な治療用組成物および治療方法を見つけるために多大の努力が費やされてきた。さらに、非感染個体における感染を予防するためのワクチンは開発中である。開発中のワクチンの１つのタイプは、サブユニットワクチンが精製糖タンパクＤ（ｇＤ）を含有するものである。このｇＤタンパクはHSV-1（gD-1）またはHSV-2（gD-2）から誘導してもよい。かかる組成物及びワクチンにはいくつかの利点があるけれども、個体をHSV感染に対して予防的に免疫するための有効な組成物及び方法並びにHSV感染個体の治療方法に対する需要が依然として存在する。かかる予防剤および治療剤を製造するための組成物および方法に対する需要がある。発明の概要本発明はHSV2 gD2を含む単離された単純疱疹ウィルス遺伝子および該遺伝子の修飾形体に関する。HSV2 gD2の修飾形体には機能性膜貫通領域及び／又は機能性シグナルペプチドを欠失しているものがある。本発明は真核生物細胞内で発現するのに必要な調節要素に作用的にリンクされたHSV2 gD2またはHSV2 gD2の修飾物のいずれかをコードするヌクレオチド配列を包含するプラスミドに関する。本発明は個体にHSV2 gD2に対する免疫応答を誘導する方法であって、個体に真核生物細胞内で発現するのに必要な調節要素に作用的にリンクされたHSV2 gD2またはHSV2 gD2の修飾物のいずれかをコードするヌクレオチド配列を包含するプラスミドを投与する工程を包含する方法に関する。本発明はHSVに感染した個体の治療方法であって、個体に、真核生物細胞内で発現するのに必要な調節要素に作用的にリンクされたHSV2 gD2またはHSV2 gD2の修飾物のいずれかをコードするヌクレオチド配列を包含するプラスミドを投与する工程を包含する治療方法に関する。本発明は個体のHSV感染予防方法であって、個体に、真核生物細胞内で発現するのに必要な調節要素に作用的にリンクされたHSV2 gD2またはHSV2 gD2の修飾物のいずれかをコードするヌクレオチド配列を包含するプラスミドを投与する工程を包含する、HSVに個体が感染するのを予防する方法に関する。本発明は真核生物細胞内で発現するのに必要な調節要素に作用的にリンクされたHSV2 gD2またはHSV2 gD2の修飾物のいずれかをコードするヌクレオチド配列を包含するDNAワクチンに関する。ある実施形態では、該ワクチンはHSV2 gD2またはその修飾形体をコードするヌクレオチド配列を包含するプラスミドを包含する。ある実施形態では、該ワクチンはポリヌクレオチド機能エンハンサーその他の促進組成物を包含する促進DNAワクチンである。図面の簡単な説明図1A−1DはgD構築物を示す。図２はGenbankからのHSV gDの配列を示す。図3A−3EはHSV gD2コーディング配列にgD2欠失をもつ種々の挿入断片およびプラスミドを示す。図4A−4Eは免疫化マウスにおける体液性免疫応答を示す。示されたgD2発現ベクターで免疫されたマウスにおける抗gD2特異血清抗体を７９日目に標準ELISAにより測定した。血清サンプルは1:100に希釈した。図５は抗体のイソタイピングを示す。７９日目におけるIgG1およびIgG2 gD2 −特異抗体の相対レベルを標準ELISAにより測定した。図6A-6Eは免疫後のマウス脾臓細胞のリンパ増殖性免疫応答を示す。４０μｇD NAで免疫したマウスからの１０⁵個の全脾臓細胞を20ng gD2/ウェルで培養した。４日インキュベーションした後、細胞を1μCiの³H-チミジンを用いて18時間インキュベートした。ついでリンパ増殖を³H-チミジン取り込みの関数として測定した。図７は本発明による構築物を示す。発明の詳細な説明本発明は改良DNAワクチンおよびワクチンプロトコル、並びにこれらを作成するための組成物および方法に関する。本発明は改良DNA抗−HSVワクチンおよびワクチンプロトコル、並びにこれらを作成するための組成物および方法に関する。本発明はワクチンに導入できるHSV2 gG2 cDNAを提供する。さらに、本発明はワクチンに導入できる修飾されたHSV2 gD2をコードする配列を提供する。ある実施形態では、修飾されたHSV gD2は機能性シグナルペプチドを欠失している。ある実施形態では、修飾されたHSV gD2は機能性膜貫通領域（TMR）を欠失している。ある実施形態では、修飾されたHSV gD2は機能性シグナルペプチドと機能性膜貫通領域を欠失している。野生型−または全長構築物はシグナルペプチドを含有しており、これがgDポリペプチドを小胞体に送りそこでgDポリペプチドがグリコシル化される。gDポリペプチドは分泌経路を通って細胞表面まで移動しC-末端近傍に位置する疎水性領域である膜貫通領域（TMR）を介して表面膜と連絡を保つ。 TMR欠失を構築したのは細胞から分泌され抗原供与細胞により取り上げられ利用されるようにして、gDに対する体液性免疫応答を増強するためである。細胞性免疫応答も増強されることがある。我々は、この構築物を転移された細胞はそれを培地中に分泌し、細胞膜に結合したgDは検出しえないこと、を示した。シグナルペプチド欠失は細胞質に局在するように、そしておそらくはミスフォールドされるように構築された。これによりプロテオソームにgDをより多く輸送する手段が与えられ、MHCクラス１分子とより多くのgD由来ペプチドが複合体を形成することができることとなる。これによりgDに対する細胞性免疫応答が増強される。２種類のシグナルペプチド欠失型構築物がある。一方はTMRをもち、他方はもたない。両タイプのタンパクは細胞質に局在していると推測されているが、疎水度の差に基づいて細胞質内の分布には差があるかも知れない。我々は、これらの構築物でトランスフェクションされた細胞は細胞質に局在するgDを発現することを示した。細胞膜と結合したgDは検出できず、トランスフェクションされた細胞の培地にもgDが検出されない。発現されたgDの分子量からグリコシル化されていないことがわかる。図1AはHSV2 gD2タンパクの図を示す。ある実施形態では、調節配列の規制下において、このタンパクをコードするヌクレオチド配列がワクチンに含められる。ある好適な実施形態では、ワクチンはDNAワクチンである。図1BはTMR欠失をもつHSV2 gD2タンパクの図を示す。ある実施形態では、全TMR が欠失している。ある実施形態では、TMRコーディング配列のほとんどを欠失していることにより機能が阻害されている。ある実施形態では、調節配列の規制下において、このタンパクをコードするヌクレオチド配列がワクチンに含められる。ある好適な実施形態では、ワクチンはDNAワクチンである。図1Cはシグナルペプチド欠失をもつHSV2 gD2タンパクの図を示す。ある実施形態では、全シグナルペプチドが欠失している。ある実施形態では、シグナルペプチドの機能はシグナルペプチドコーディング配列のほとんどを欠失することにより阻害される。ある実施形態では、調節配列の規制下において、このタンパクをコードするヌクレオチド配列がワクチンに含められる。ある好適な実施形態では、ワクチンはDNAワクチンである。図1DはTMR欠失とシグナルペプチド欠失をもつHSV2 gD2タンパクの図を示す。ある実施形態では、全TMR機能が欠失している。ある実施形態では、TMR機能は、 TMRコーディング配列のほとんどを欠失することにより阻害される。ある実施形態では、全シグナルペプチドが欠失している。ある実施形態では、シグナルペプチドの機能は、シグナルペプチドコーディング配列のほとんどを欠失することにより阻害される。ある実施形態では、調節配列の規制下の、このタンパクをコードするヌクレオチド配列がワクチンに含められる。ある好適な実施形態では、ワクチンはDNAワクチンである。図4A−4E、図5、および図6A−6EはHSV gDタンパクのTMRを除去することにより IgG抗体イソタイプがIgG2aからIgG1にシフトした。このシフトは優勢なTH1から優勢なTH2応答へのシフト、または細胞性から抗体応答へのシフトを示す代替マーカーであると考えられる。これら細胞により放出されるサイトカインもそれに応じて異なっていると推測される。 TMRをコードする配列またはふつう膜に錨着されている任意のタンパクの膜結合領域、例えば他の疱疹ウィルス・エンベロープ・タンパクHSV1，HSV2，EBV，C MV，HZV、を欠失または変異させることにより類似の効果を達成することができる。上に挙げたウィルスは一部分にすぎず、当業者は本発明を実施するために用いることができる他のウィルスを容易に選択することができる。さらに、他の使用可能なタンパクとしては、細胞エンベロープ結合タンパクが使用できる。同様に、TMRまたは他の膜保持シグナルを除去もしくは他の方法により欠失させると、分泌経路に入るが、細胞エンベロープに結合したホスト細胞タンパクだけでなく、他のウィルスからの内部細胞質保持シグナルのような他の膜保持シグナルを含むタンパクを、分泌させることができよう。さらに、シグナルペプチドを付加し、かつ膜または細胞コンパートメント局在シグナルを除去することにより、細胞またはウィルスのコードする、細胞エンベロープに結合しないタンパクが分泌されるように設計することができる。所望により、該構築物を以下のように変化させることにより、TH2応答が優性となるシフトを生じるような分泌を達成することができる。 1)TMRまたは膜結合領域を除去又は変異させる； 2)シグナルまたはリーダー配列を加える； 3)付加されたプロテアーゼ部位において膜結合領域を切るプロテアーゼを一緒に共発現する； 4)自己切断するインテインをコードする配列を付加する。インテインをコードする配列はTMRを遺伝子の残部から分離する切断が起きるように遺伝子内に挿入されよう。このようにすれば、免疫エピトープを含有するが、依然としてTMRが細胞エンベロープにタンパクを錨着する際に機能しないようにすることができるTM Rタンパク発現が維持されるであろう。細胞内にタンパクを保持することを望むならば、シグナルまたはリーダー配列を除去してもよく、特異的にER（小胞体）にターゲットを絞ることを望むならば、ER保持シグナルおよび分泌性ペプチドのための配列を付加してもよい。主としてTh1からTh2へ免疫応答をシフトする能力のおかげで改良されたワクチンプロトコルの設計が可能となる。ある実施形態では、主たるそしておそらく最初の増強はTh1応答を生じるように設計される。該最初の増強または後続の増強をTh2応答を駆動するように設計して、被接種者に対する保護を改善するようにしてもよい。ある好適な実施形態では、図1A−1Dに記載の構築物がDNAワクチンに導入される。DNAワクチンは米国特許第５，５８９，４６６号公報及び同第５，５９３，９７１号公報（引用によりここに導入される）、PCT/US90/01515、PCT/US93/023 38、PCT/US93/048131、PCT/US94/00899、及びこれらに引用されている優先権出願（それぞれ引用によりここに導入される）、および１９９６年５月６日出願の米国特許出願第08/642,045号（引用によりここに導入される）に記載されている。これらの出願に記載されている送達プロトコルに加えて、DNAを送達する別方法が米国特許第4,945,050号公報及び同第5,036,006号公報（引用によりここに導入される）に記載されている。 DNAワクチン技術を使用して、遺伝子発現に必要な調節要素に作用的にリンクされた、図1A−1Dに記載のコーディング配列を包含するプラスミドDNAが個体に投与される。個体の細胞はプラスミドDNAを取り込み、コーディング配列が発現される。このようにして生成した抗原は免疫応答が対象とするターゲットとなる。該抗原を対象とする免疫応答は個体にHSVに対して予防上または治療上有益であった。 DNAワクチンには裸ワクチンおよび促進化ワクチンがある。さらに、それらは組織に物質を投与するためのいくつかの異なる装置を含む広範囲の技法により投与することができる。公表された文献にはDNAワクチン技術の諸相を記載するいくっかの総説を含み、該技術を用いて得られた結果の多くの報告のいくつかを引用している。引用によりここに導入される下記の総説（各総説にそれぞれ引用されている文献も、それぞれ引用によりここに導入される）はDNAワクチン技術を論じている：McDonnelW.M and F.K．Askari 1996 New Engl．J．Med．334(1)42- 45;Robinson，A．1995 Can．Med．Assoc．J．152(10):1629-1632;Fynan， E.F．et al．1995 Int．J．Immunopharmac．17(2)79-83;Pardoll，D.M．and A.M ．Beckerleg 1995 Immunity 3:165-169;and Spooner et al．1995 Gene Therapy 2:173-180．本発明によれば、図1A−1Dに記載された挿入物のコーディング配列がプラスミドに挿入され、ついでこのプラスミドがワクチン組成物に用いられる。ここで用いられているように、挿入物という用語は、図1A−1Dに記載されたgD 2タンパクをコードするヌクレオチド配列を意味し、非機能性TMR及び／又は非機能性シグナルペプチドを包含するgD2タンパクをコードするヌクレオチド配列を含む。ここで用いられているように、遺伝子構築物という用語は真核細胞内で挿入物を発現させるのに必要な調節要素に作用的にリンクされた挿入物を包含するプラスミドを意味する。DNA発現のための調節要素はプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む。さらに、Kozak領域のような他の要素も遺伝子構築物に含めてもよい。開始シグナル及び終止シグナルはコーディング配列の一部であるとしばしば考えられる必要な調節要素である。本発明の遺伝子構築物のコーディング配列は機能的な開始及び終止シグナルを含む。本発明はHSVに対する免疫応答を誘導するために個体の細胞内に遺伝材料を導入する方法に関する。これらの方法は該個体の組織に、発現に必要な調節要素に作用的にリンクされた、図1A−1Dに示すもののようなコーディング配列を含むDN Aを投与する工程を包含する。本発明は図1A−1Dに示すもののような挿入物のコーディング配列を含むDNAワクチンとして有用な遺伝子構築物を提供する。ある実施形態では、Watson et al．1983 Gene 26:307-312（引用によりここに導入される）に報告されているcDNAを用いて挿入物を構築する。この配列はGene bank寄託番号K01408（引用によりここに導入される）で公表されており、図２に示されている。Watsonクローンのコーディング配列は268−1449である。シグナルペプチドをコードする配列は268−342を含む。TMRは1249−1446にコードされている。ある実施形態では、挿入物は全コーディング配列を包含する。ある実施形態では、挿入物は全コーディング配列のみからなる。ある実施形態では、挿入物は全コーディング配列を包含するが、フレームシフトまたは欠失もしくは挿入により、タンパクの残部に影響せずに、シグナルペプチドが作用不能となっている。ある実施形態では、シグナルペプチドをコードする配列が欠失し、挿入物が残るコーディング配列を包含している。ある実施形態では、例えば、287−1449、297−1449、307−1449、317−1449、327−1449および337−1449のような、シグナルペプチドをコードする完全配列より少ない配列が含まれている。ある実施形態では、挿入物は全コーディング配列を包含するが、フレームシフトまたは欠失もしくは挿入により、TMRが作用不能となっているが、タンパクの残部には影響しない。ある実施形態では、TMRをコードする配列が欠失し、挿入物が残るコーディング配列を包含している。ある実施形態では、例えば、268−1 426、268−1406、268−1386、268−1366、268−1346、268−1326、268−1306、2 68−1286、268−1266および268−1246のような、TMRをコードする完全配列より少ない配列が含まれている。ある実施形態では、挿入物は全コーディング配列を包含するが、フレームシフトまたは欠失もしくは挿入により、シグナルペプチドが作用不能となっており、かつフレームシフトまたは欠失もしくは挿入により、TMRが作用不能となっているが、タンパクの残部に影響しない。ある実施形態では、シグナルペプチドをコードする配列が欠失しており、挿入物は欠失または作用不能TMRをもつ残りのコーディング配列を包含している。ある実施形態では、シグナルペプチド及びTMR が欠失している。ある実施形態では、挿入物は278-1426、288-1386、298-1346、 308-1306、318-1266、328-1246及び342-1248からなる。ある実施形態では、挿入物はPCT/US94/00899（1994年1月26日出願、1994年8月 4日にWO 94/16737として国際公開、引用によりここに導入される）に記載のプラスミドに挿入される。ある実施形態では、挿入物は米国特許出願第08/642,045号（1996年5月6日出願、引用によりここに導入される）に記載のプラスミドに挿入される。本発明によれば、個体をHSV1及びHSV2を含む、HSV、特にHSV2、に対して予防的及び／又は治療的に免疫する組成物および方法が提供される。遺伝材料、すなわち挿入物、は目的タンパク、すなわちgD2、をシグナルペプチド及び／又はTMR と一緒にあるいはこれらなしにコードする。遺伝材料は個体の細胞により発現され免疫応答が誘発される免疫原ターゲットとして働く。本発明はHSV2 gD2タンパクに対する免疫応答を誘発するのに有用である。誘発された免疫応答はHSV1 gD1タンパクと交差反応することがある。本発明は個体を HSV、特にHSV2に対して、HSV2 gD2に対する免疫応答によりHSVに対する保護免疫が与えられるように免疫するのに有用である。本発明は、ウィルスタンパクを発現している感染細胞に指向させることができる、HSV2 gD2に対する免疫応答を誘発することにより、感染した個体中のHSVと戦うのに有用である。本発明によれば、DNAは調節要素に作用的にリンクされた非修飾または修飾HSV 2 gD2タンパクをコードする。DNA発現のための調節要素はプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む。さらに、Kozak領域のような他の要素も遺伝子構築物に含まれていてもよい。ここで用いられているように、「発現可能型」という用語は、個体の細胞中に存在するときは挿入物が発現されるように挿入物に作用的にリンクされた必要な調節要素を含有する遺伝子構築物をいう。細胞に取り込まれたときは、遺伝子構築物（複数）は機能性染色体外分子として細胞中に残留し、及び／又は細胞のDNAに組み込まれてもよい。DNAを細胞に導入してそこでプラスミドまたは複数のプラスミドの形で別個の遺伝材料として残るようにしてもよい。あるいはまた、染色体に組み込み可能な線状DNAを細胞に導入してもよい。DNAを細胞に導入するときは、DNAの染色体への組み込みを促進する試薬を添加してもよい。組み込みを促進するのに有用なDNA配列をDNA分子に含めてもよい。あるいはまた、RNAを細胞に投与してもよい。遺伝子構築物を動原体、末端小粒及び複製起点を含む線状ミニ染色体として提供することも企図されている。遺伝子構築物は弱毒化された生きている微生物または細胞内で生存している組み換え微生物ベクターの一部として残留していてもよい。遺伝子構築物は、遺伝材料が細胞の染色体に組み込まれているかあるいは染色体外に留まる組み換えウィルスワクチンのゲノムの一部であってもよい。遺伝子構築物は核酸分子の遺伝子発現に必要な調節要素を含む。該要素はプロモーター、開始コドン、終止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含む。さらに、エンハンサーが、免疫原ターゲットタンパクをコードする配列の遺伝子発現にしばしば必要とされる。これらの要素が所望のタンパクをコードする配列に作用的にリンクされていること及び該調節要素が被投与個体において作用可能なものであることが必要である。開始コドン及び終止コドンは一般に免疫原ターゲットタンパクをコードするヌクレオチド配列の一部であると考えられている。しかしながら、これらの要素は遺伝子構築物を投与された個体において機能することが必要である。開始コドン及び終止コドンはコーディング配列と読み枠を合わせて組み立てられていなければならない。用いたプロモーター及びポリアデニル化シグナルは個体の細胞内で機能する必要がある。本発明を、特にヒトに対する遺伝子ワクチンの生産において、実施するのに有用なプロモーターの例としては、シミアンウィルス40（SV40）由来プロモーター、マウス乳ガンウィルス（MMTV）プロモーター、ヒト免疫不全ウィルス（HIV）、例えばHIV長末端反復（LTR）プロモーター、モロニーウィルス、ALV、サイトメガロウィルス（CMV）、例えばCMV即時型プロモーター、エプスタイン・バールウィルス（EBV）、ラウス肉腫ウィルス（RSV）並びにヒト遺伝子由来のプロモーター、例えばヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびヒトメタロチオネインがあるが、これらに限定されない。本発明を、特にヒトに対する遺伝子ワクチンの生産において、実施するのに有用なポリアデニル化シグナルは、SV40ポリアデニル化シグナルおよびLTRポリアデニル化シグナルを含むがこれらに限定されない。特に、pCEP4プラスミド（インビトロジェン社、サンジエゴ市、CA）中のSV40ポリアデニル化シグナルが用いられる。 DNA発現に必要な調節要素以外にも、他の要素もDNA分子中に含めてもよい。そのような追加要素としてはエンハンサーがある。エンハンサーはヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン及びCMV、RSV及びEBV由来のもののようなウィルス性エンハンサーを含む群から選ぶことができるが、これらに限定されない。遺伝子構築物は、該構築物を染色体外に維持しかつ細胞内で複数コピーの該構築物を生産するためにヒト複製起点を備えていてもよい。インビトロジェン社（サンジエゴ市、CA）からのプラスミドpCEP4およびpREP4はエプスタイン・バールウィルス複製起点および組み込みなしに高コピーエピソーム複製を生じる核抗原 EBNA-1コード領域を含有する。なんらかの理由で遺伝子構築物を受領した細胞を除去したいときは、細胞破壊をターゲットとする追加要素を追加してもよい。発現可能型のヘルペスチミジンキナーゼ（tk）遺伝子を遺伝子構築物に含めてもよい。医薬gangcyclovirを個体に投与してその医薬がtk産生細胞の選択的殺傷を引き起こすようにして、遺伝子構築物を用いた細胞の選択的破壊手段を提供することもできる。タンパク産生を最大にするために、該構築物が投与される細胞における遺伝子発現によく適合した調節配列を選択してもよい。さらに、細胞内でもっとも効率的に転写されるコドンを選択してもよい。当業者は細胞内で機能するDNA構築物を生産することができる。本発明の方法は個体の組織に核酸分子を投与する工程を包含する。ある好適な実施形態では、核酸分子は筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮下、皮内、または局所投与されるか、あるいは膣、直腸、尿道、頬、舌下からなる群から選ばれる粘膜組織の洗浄により投与される。ある実施形態では、核酸分子は促進剤の投与と連係して細胞に送達される。促進剤はポリヌクレオチド機能エンハンサーまたは遺伝子ワクチン促進剤とも呼ばれる。促進剤は米国特許出願第08/008,342号（1993年1月26日出願）、米国特許出願第08/029,336号（1993年3月11日出願）、米国特許出願第08/125,012号（199 3年9月21日出願）及び国際出願第PCT/US94/00899号（1994年1月26日出願）（これらは引用によりここに導入される）に記載されている。さらに、促進剤はPCT 出願第PCT/US95/04071号（3/30/95出願）（引用によりここに導入される）に記載されている。核酸分子と連係して投与される促進剤は核酸分子との混合物として投与してもよく、あるいは別個に、核酸分子の投与と同時、前または後に投与してもよい。さらに、トランスフェクション剤及び／又は複製剤及び／又は炎症剤として働き、かつ促進剤とともにもしくは促進剤なしに共投与できる他の剤としては、成長因子、サイトカイン、およびリンホカイン、例えば−ｉｎｔａｆｅｒｏｎ、γ−インタフェロン、血小板由来成長因子（PDGF）、GC-SF、GM-CSF、T NF、表皮成長因子（EGF）、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10およびB7. 2並びに線維芽細胞成長因子、免疫刺激複合体（ISCOMS）のような界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピッドA（MPL）を含むLPS類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、およびスクワレンおよびスクワレンのような小胞、およびヒアルロン酸も該遺伝子構築物と連係して使用・投与される。ある実施形態では、本発明の遺伝子構築物は安息香酸エステル類、アニリド類、アミジン類、ウレタン類およびそれらの塩酸塩類からなる群から選ばれる、局所麻酔剤のファミリーのような促進剤とともに処方されるか投与される。促進剤は、ある実施形態では、下記の式の一つをもつ化合物であってもよい。 Ar-R¹-O-R²-R³ または Ar-N-R¹-R²-R³ または R⁴-N-R⁵-R⁶ または R⁴-O-R¹-N-R⁷ 式中、 Arはべンゼン、p-アミノベンゼン、m-アミノベンゼン、o-アミノベンゼン、置換ベンゼン、置換p-アミノベンゼン、置換m-アミノベンゼン、置換o-アミノベンゼン、ここに前記アミノベンゼン化合物のアミノ基はアミノ、C₁-C₅アルキルアミン、C₁-C₅,C₁-C₅ジアルキルアミンであってもよく、置換化合物中の置換基はハロゲン、C₁-C₅アルキルおよびC₁-C₅アルコキシである； R¹はC=Oである； R²はC₁-C₁₀アルキルであり、分岐アルキルを含む； R³は水素、アミン、C₁-C₅アルキルアミン、C₁-C₅,C₁-C₅ジアルキルアミンである； R²+R³は環状アルキル、C₁-C₁₀アルキル置換環状アルキル、環状脂肪族アミン、C₁-C₁₀アルキル置換環状脂肪族アミン、ヘテロ環、C₁-C₁₀アルキルN-置換ヘテロ環を含むC₁-C₁₀アルキル置換ヘテロ環である； R⁴はAr、R²またはC₁-C₅アルコキシ、環状アルキル、C₁-C₁₀アルキル置換環状アルキル、環状脂肪族アミン、C₁-C₁₀アルキル置換環状脂肪族アミン、ヘテロ環、C₁-C₁₀アルキル置換ヘテロ環及びC₁-C₁₀アルキルN-置換ヘテロ環を含むC₁-C₁₀ アルコキシ置換ヘテロ環である； R⁵はC=NHである； R⁶はAr、R²またはC₁-C₅アルコキシ、環状アルキル、C₁-C₁₀アルキル置換環状アルキル、環状脂肪族アミン、C₁-C₁₀アルキル置換環状脂肪族アミン、ヘテロ環、C₁-C₁₀アルキル置換ヘテロ環及びC₁-C₁₀アルキルN-置換ヘテロ環を含むC₁-C₁₀ アルコキシ置換ヘテロ環である；そして R⁷はAr、R²またはC₁-C₅アルコキシ、環状アルキル、C₁-C₁₀アルキル置換環状アルキル、環状脂肪族アミン、C₁-C₁₀アルキル置換環状脂肪族アミン、ヘテロ環、C₁-C₁₀アルキル置換ヘテロ環及びC₁-C₁₀アルキルN-置換ヘテロ環を含むC₁-C₁₀ アルコキシ置換ヘテロ環である。エステルの例としては：ピペロカイン、メプリルカイン及びイソブカインのような安息香酸エステル類；プロカイン、テトラカイン、ブテタミン、プロポキシカイン及びクロロプロカインのようなパラ−アミノ安息香酸エステル類；メタブタミン及びプリマカインのようなメタ−アミノ安息香酸類；およびパレトキシカインのようなパラ−エトキシ安息香酸エステル類がある。アニリドの例としては、リドカイン、エチドカイン、メピバカイン、ブピバカイン、ピロカインおよびプリロカインがある。そのような化合物の他の例としては、ジブカイン、ベンゾカイン、ジクロニン、プラモキシン、プロパラカイン、ブタカイン、ベノキシネート、カルボカイン、メチル・ブピバカイン、ブタシン・ピクレート、フェナカイン、ジオタン、ルッカイン、イントラカイン、ヌペルカイン、メタブトキシカイン、ピリドカイン、ビフェナミン、および植物由来の二環類、例えばコカイン、シンナモイルコカイン、トルキシリンおよびコカエチレン並びにそのような化合物のすべてと塩酸塩との複合体がある。好適な実施形態では、促進剤はブピバカインである。ブピバカインとメピバカインの相違点は、ブピバカインがメピバカインのN-メチル基の代わりにN-ブチル基をもつことである。化合物はそのNにおいてC₁-C₁₀を有してもよい。化合物はプロカインおよびクロロプロカインのように、ハロゲンで置換されていてもよい。アニリド類が好ましい。促進材は遺伝子構築物より前に、と同時に、またはの後に投与される。促進剤と遺伝子構築物を同じ組成物に処方してもよい。ブピバカイン−HC1は化学的には２−ピペリジンカルボキサミド、1-ブチル-N- （2,6-ジメチルフェニル）-モノハイドロクロライド、モノハイドレートという名称であり、アストラ・ファーマシューティカル・プロダクツ・インコーポレーテッド（ウェストボロ、MA）、サノフィ・ウィンスロップ・ファーマシューティカルス（ニューヨーク、NY）、イーストマン・コダック（ロチェスター、NY）を含む多くの供給元から製薬用途に広く市販されている。ブピバカインはメチルパラベンとともにまたは含まずに、そしてエピネフリンとともにまたは含まずに商業的に処方されている。そのような処方のいずれを用いてもよい。製剤用途に本発明で使用できる0−25％、0.5％および0.75％の濃度で市販されている。別の濃度、特に望ましい効果を奏する0.05％−1.0％の濃度のものを所望により調製してもよい。本発明によれば、約250μｇないし約10mgのブピバカインが投与される。ある実施形態では、約250μgないし約7.5mgが投与される。ある実施形態では、約0.05mgないし約5.0mgが投与される。ある実施形態では約0.5mgないし約3.0mgが投与される。ある実施形態では約５ないし50μgが投与される。例えば、ある実施形態では等張の製薬用担体中の約50μlないし約2ml、好ましくは 50μlないし約1500μl、さらに好ましくは約1mlの0.25−0.50％ブピバカイン−H C1及び0.1％メチルパラベンがワクチンと同じ部位に、ワクチンの投与の前に、と同時にまたは投与後に投与される。同様に、ある実施形態では、等張の製薬用担体中の約50μlないし約2ml、好ましくは50μlないし約1500μl）さらに好ましくは約1mlの0.25−0.50％ブピバカイン−HC1がワクチンと同じ部位にワクチンの投与の前、と同時にまたはの後に投与される。ブピバカインおよび任意の他の同様に作用する化合物、特に関連する局所麻酔剤のファミリーのものを細胞による遺伝子構築物の取り込みの所望の促進が得られる濃度で投与してもよい。本発明のある実施形態では、個体はまず促進剤を注射してから遺伝子構築物を投与される。すなわち、遺伝子構築物投与前の例えば約１週間ないし10日までに、個体はまず促進剤を注射される。ある実施形態では、個体は遺伝子構築物投与の前または後の約１ないし５日間、ある実施形態では遺伝子構築物の投与前又は後の24時間、に促進剤を注射される。あるいはまた、促進剤が使用される場合は遺伝子構築物の投与と同時に、数分前又は後に、投与される。従って、促進剤及び遺伝子構築物は組み合わせて単一の製薬組成物としてもよい。ある実施形態では、遺伝子構築物は促進剤なしで、すなわち、遺伝子構築物が促進剤の投与と連係して投与されない投与プロトコルを用いて促進剤を含まない処方で投与される。ヘルペス・シンプレックス２糖タンパクD（gD）遺伝子はウィルス・エンベロープおよび感染細胞の原形質膜と結合する糖タンパクをコードする。gDによりコードされるシグナルペプチドは、形成されつつあるポリペプチドを小胞体のルーメンに向けて輸送し、そこでポリペプチドは分泌経路に入り、グリコシル化され、折り畳まれる。タンパクは膜貫通領域またはTMRと呼ばれる疎水性のC-末端ドメインを介して原形質膜に結合した状態を維持する。ヘルペス・シンプレックス２糖タンパクD（gD）遺伝子を発現するプラスミドを用いたDNA免疫は、体液性及び細胞性免疫応答をいくつかの動物モデルにおいて誘発することが示されている。マウスでは、最初のgD−発現プラスミドにより生じた免疫応答は主としてTH1または細胞性応答であることが見出された。我々が証明したのは、遺伝子を修飾してワクチンのプラスミド成分により優勢的に分泌型のgDが発現されるようにすると、免疫中にTH2または体液性応答が含まれるようにできることである。コードされたタンパクは天然のgD2タンパクとは、TMR をコードする最後の66個のアミノ酸が欠失している点だけが異なる。我々の証明したところによると、TMR−欠失タンパクをコードするように操作された構築物は、トランスフェクションされた細胞の培地内に優勢的に分泌されるタンパクを発現する。少量のタンパクだけが細胞−結合性である。高濃度の可溶性抗原がTh 2応答を刺激することが示されているが、低薬用量の可溶性抗原ではIL-12の産生が刺激され、Th1応答が導かれる(Abbas，A.K.，Murphy，K.M.，Sher，A．(1996) ．Functional diversity of helper Tlymphocytes．Nature 381:787-793)。抗原の分泌に有利に設計された構築物はTh2免疫応答を促進するであろう。従って、本発明は、所望のTH1またはTH2免疫応答を誘発する抗原タンパクを発現する能力を有する操作されたポリヌクレオチド構築物、そのような操作されたポリヌクレオチド構築物を含有しこれらを発現する能力を有するプラスミドその他のベクター構築物、および所望のTH1またはTH2免疫応答を達成するためにそのような構築物で動物を免疫する方法に関する。望ましい一実施形態では、本発明は遺伝子または一群の遺伝子を操作して、コードされたタンパクが細胞から分泌され、TH2応答を可能とする遺伝子操作方法に関する。他の望ましい実施形態では、本発明は、ほ乳類を最初に少なくとも一回、TH1応答を誘発するタンパクをコードするプラスミドで免疫し、引き続き行われる免疫は該タンパクが効率的に分泌できるようにするプラスミド系を用いて該応答がその後TH2応答にむけて促進されるように行う、免疫方法に関する。ある応用例では、本発明はほ乳類をまずTH2応答を誘発するポリヌクレオチドワクチンで免疫し、ついでTH1応答を促進するワクチンで増強する方法に関する。本発明の他の実施形態では、TH1およびT H2応答の双方を促進する一種または二種以上のワクチン組成物を用いた同時または同時期免疫によりTH1およびTh2応答の双方が達成される。本発明の構築物は以下のようにして操作することかできる：ある好適な実施形態では、修飾された構築物はTMR欠失を含み発現された抗原タンパクの細胞外区画への分泌が増強されることにより、TH2又は体液性免疫応答が増強される。他の好適な実施形態では、修飾された構築物はシグナルまたはリーダーペプチド欠失を含み、細胞質ゾル分画への細胞内局在が生じることにより、TH1または細胞性免疫応答が増強される。他の好適な実施形態では、シグナル欠失およびTMR欠失の双方が作出され、免疫原タンパクの発現が細胞質ゾル分画に局在することにより、TH1または細胞性免疫応答が増強される。以下に記載するのは細胞関連タンパクの分泌を可能にする方法の一覧である。まず最初に必要なのは、分泌経路に入らない細胞関連タンパクについて、タンパクのアミノ末端のシグナルペプチドを操作することである。これはこれらのタンパクのあるものについては効率的な分泌に必要とされるすべてであるかも知れないが、他のものはさらなる修飾が必要である。例えば、普通は分泌されないあるタンパクは膜と相互作用するドメインを含有し、この相互作用によりこれらのタンパクの分泌が阻害されていることがある。あるいはまた、これらのタンパクはタンパクを核のようなある細胞下分画に局在させるモチーフを含有していることがあり、これらの配列もまたタンパクの効率的な分泌を阻害していることがあり得る。従って、これらのドメインを欠失または変異により破壊することが必要であろう。多くの場合、これらの配列は既に知られており、他の場合は、既知のドメインおよび局在ドメインに対する相同性を、該配列を走査することにより、同定することができる。他の場合には、未同定阻害配列をマッピングし、選択に基づく変異アプローチにより破壊することができる。ふつう分泌経路には入るが膜保持ドメインまたはタンパクを分泌経路内のサブ分画に局在させるドメインを介して細胞と結合しているタンパクについては、最初に必要なことはこれらのドメインを除去することである。これらは欠失又は変異により除去できる。ある場合には、これらのタンパクによりコードされている天然のシグナルペプチドがタンパクをER内に輸送するのに効率的でないことがある。これらの場合、天然のシグナルペプチドの代わりに異種シグナルペプチドを用いることができる。異種シグナルペプチドの一例としては、HSV2 gD遺伝子によりコードされたものがある。配列の欠失は構築物内の配列の欠失または変異によってもよい（図７）。あるいはまた、阻害配列が区別されたドメインとして存在し（すなわち、タンパク中に霜降り肉状に散らばっていない）かつタンパクのC-末端に局在し、そして構築物中にこれらの配列を維持することが免疫原性の目的から望ましい場合には、該構築物はこれらの配列が分泌を決定されているタンパクの一部に共有結合されないように操作することができる。これは分泌されるべきタンパクの部分と分泌を阻害する配列をもつタンパクの部分との間にプロテアーゼ部位をコードすることにより行うことができる。このプロテアーゼ部位はワクチンタンパクを発現する細胞に固有のプロテアーゼ用の切断部位であろう。あるいはまた、該プロテアーゼはコードされているワクチンタンパクと同じ構築物上にまたはワクチンプラスミドと共注入される別のプラスミド上にトランス状態で提供することができよう。この場合、切断はワクチンプラスミドを発現する細胞内に天然に生じるプロテアーゼに依存しないであろう。ポリオ3Cプロテアーゼ（2）またはインテイン（3 ）のような自己切断プロテアーゼを分離すべきタンパクのドメイン同士の間に含めることも利用できる。プロテアーゼ法ではドメインを除去できない場合がある。例えば、細胞下局在ドメインは前駆体ポリペプチドの一部として（タンパク分解に先だって）最初に発現され、実際上形成されつつあるポリペプチドのERへの輸送を妨げるであろう。この場合、該ドメインは欠失または部位特異的変異により除去する必要がある。また、所望のタンパク分解反応がER内で起きるか確認する必要があろう。目的とする分泌についての他の考察点は細胞外分画におけるタンパクの安定性である。タンパクが不安定であるならば、他のペプチドまたはタンパクと、例えば融合タンパクとして融合することにより、その安定性と抗原性を増加させることも可能である。ある場合には、融合タンパクが集まって血清に安定な粒子になるようにすることができる。本発明は、また、集合して粒子を形成する融合タンパクを発現するように操作されたポリヌクレオチド構築物並びにそのようなポリヌクレオチド構築物を用いて免役する方法に関する。かかるタンパクは安定であるだけでなく、APCs（抗原供与細胞）により優先的に取り込まれ、かつMHCクラス１およびクラス２分子の双方により提示されるように加工されうるサイズである。主として分泌されるタンパクをコードするように修飾された本発明の構築物は、ウィルス、寄生生物および細菌感染に対する予防ワクチンにおけるように、TH 2または体液性応答が必要とされる多数の抗原に対して適している。発現されるように選択されたタンパクはウィルス粒子、寄生生物、細菌または芽胞を構成する抗原タンパクであろう。しかしながら、感染生物自体の一部でないが、特に感染細胞の細胞膜と結合するタンパクも発現のターゲットであってもよいであろう。というのは、これらの抗原に対する体液性応答は補体経路またはADCC経路により細胞死という結果を生じることがあると考えられるからである。実施例実施例１挿入TMRはHSV2 gD2の５’フランキング配列の37個のヌクレオチドおよびHSV g D2リーダーペプチドをコードする配列および成熟タンパクの最初の302個のアミノ酸からなる。６６個のアミノ酸がカルボキシ末端から削除されている。この構築物は３’HSV gD2フランキング配列の１ヌクレオチドを有する。この挿入物をAPL-400-004ベクターにクローニングして図3Aに示すAPL-400-004 TMRを生産する。ある実施形態では、第二の構築物、APL-400-024 TMRを調製する。該プラスミドは、米国特許出願第08/642,045号（1996年5月6日出願）のカナマイシン抵抗キメラ構築物をAPL-400-004 TMRベクターのカナマイシン抵抗遺伝子の代わりに有する以外はAPL-400-004 TMRと同等である。実施例２挿入物L-1はHSV2 gD2のATGに隣接する真性5’フランキング配列の9bp及びこれに続くATGおよびアミノ酸26から始まる成熟タンパクをコードする領域に対するコーディング配列からなる。リーダーペプチドを包含する最初の２５個のアミノ酸に対するコーディング配列は削除されている。この挿入物は終止コドンに隣接する約550bpの3’フランキング配列も含む。この挿入物をAPL-400-004ベクターにクローニングして図3Bに示すAPL-400-004 L_-1を生産し、さらに真性フランキング（5’）配列の39bp5’を包含し、これは TAベクター(PCR II、インビトロジェン)由来である。ある実施形態では、第二の構築物、APL-400-024 L_-1を調製する。該プラスミドは、米国特許出願第08/642,045号（1996年5月6日出願）のカナマイシン抵抗キメラ構築物をAPL-400-004ベクターのカナマイシン抵抗遺伝子の代わりに有する以外はAPL-400-004 L_-1と同等である。実施例３挿入物L_-IIはHSV2 gD2のATGに隣接する真性5’フランキング配列の41bp及びこれに続くATGおよびアミノ酸26から始まる成熟タンパクをコードする領域に対するコーディング配列からなる。リーダーペプチドを包含する最初の２５個のアミノ酸に対するコーディング配列は削除されている。この挿入物は終止コドンに隣接する約550bpの3’配列も含む。この挿入物をAPL-400-004ベクターにクローニングして図3Cに示すAPL-400-004 L_-IIを生産する。ある実施形態では、第二の構築物、APL-400-024 L-_IIを調製する。該プラスミドは、米国特許出願第08/642,045号（1996年5月6日出願）のカナマイシン抵抗キメラ構築物をAPL-400-004ベクターのカナマイシン抵抗遺伝子の代わりに有する以外はAPL-400-004 L_-IIと同等である。実施例４挿入物L_-3はHSV2 gD2のATGに隣接する真性5’フランキング配列の41bp及びこれに続くATGおよびKozak部位を保存するためのATG後の6bp、そしてアミノ酸26から始まる成熟タンパクをコードする領域に対するコーディング配列からなる。リーダーペプチドを包含する最初の２５個のアミノ酸に対するコーディング配列は削除されている。この挿入物は終止コドンに隣接する約550bpの3’配列も含む。この挿入物をAPL-400-004ベクターにクローニングして図3Dに示すAPL-400-004 L_-3を生産する。ある実施形態では、第二の構築物、APL-400-024 L_-3を調製する。該プラスミドは、米国特許出願第08/642,045号（1996年5月6日出願）のキメラカナマイシン抵抗構築物をAPL-400-004ベクターのカナマイシン抵抗遺伝子の代わりに有する以外はAPL-400-004 LO_-3と同等である。実施例５挿入物L_-3TMRはHSV2 gD2のATGに隣接する真性5’フランキング配列の41bp及びこれに続くATG及びKozak部位を保存するためのATG後の6bp、そしてアミノ酸26から始まる成熟タンパクをコードする領域に対するコーディング配列からなる。リーダーペプチドを包含する最初の２５個のアミノ酸に対するコーディング配列及び膜貫通領域を包含する成熟タンパクのカルボキシ末端の66個のアミノ酸に対するコーディング配列は削除されている。この挿入物は終止コドンに続く約1bpの3 ’配列も含む。この挿入物をAPL-400-004ベクターにクローニングして図3Eに示すAPL-400-004 L_-3TMRを生産する。ある実施形態では、第二の構築物、APL-400-024 L_-3TMRを調製する。該プラスミドは、米国特許出願第08/642,045号（1996年5月6日出願）のカナマイシン抵抗キメラ構築物をAPL-400-004ベクターのカナマイシン抵抗遺伝子の代わりに有する以外はAPL-400-004 L_-3TMRと同等である。実施例６マウスを０日目および14日目に20μgDNA/0.4％ブピバカインで筋肉内（I.M.）免疫した。マウスから14日目及び42日目に採血し、血清を抗gD抗体の存否について検査した。TMR欠失で免疫されたマウスは体液性応答が全長HSV gD構築物で免疫されたマウスよりも高いことがわかった。いずれかシグナルペプチド欠失物で免疫したマウスにも血清転換（セロコンバージョン）は検出されなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ヘロルド，カスリーンアメリカ合衆国ペンシルバニア州19147, フィラデルフィア，フルトン・ストリート 229 シー

Claims

【特許請求の範囲】１．機能性膜貫通領域及び／又は機能性シグナルペプチドを欠くHSV2 gD2タンパクをコードする、単離された単純疱疹ウィルスHSV2 gD2遺伝子。２．請求の範囲第１項記載の単純疱疹ウィルスHSV2 gD2遺伝子を包含し、該遺伝子は真核細胞において発現するのに必要な調節要素に作用的にリンクされているプラスミド。３．個体に請求の範囲第２項記載のプラスミドを投与する工程を包含する個体におけるHSV2 gD2に対する免疫応答誘発方法。４．個体に請求の範囲第２項記載のプラスミドを投与する工程を包含するHSVに感染した個体の治療方法。５．個体に請求の範囲第２項記載のプラスミドを投与する工程を包含する、個体のHSV感染防止方法。