JP2002512949A - 安定化されたタンパク質結晶、それを含む処方物、およびそれを作製する方法 - Google Patents

安定化されたタンパク質結晶、それを含む処方物、およびそれを作製する方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、タンパク質、ペプチドおよび核酸のような生物学的に活性な高分子の安定化、貯蔵、および送達のための方法に関する。詳細には、本発明は、タンパク質または核酸結晶、それらを含む処方物および組成物に関する。タンパク質および核酸の結晶化のための方法、ならびに乾燥処方物またはスラリー処方物における使用のための、安定化されたタンパク質結晶または核酸結晶の調製のための方法が提供される。本発明はさらに、ヒトおよび動物への生物学的送達のための組成物への、タンパク質、糖タンパク質、酵素、抗体、ホルモンおよびペプチドの結晶または結晶処方物のカプセル化に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 (発明の技術分野) 本発明は、タンパク質、ペプチド、および核酸のような生物学的に活性な高分
子の安定化、貯蔵、および送達のための方法に関する。特に、本発明は、タンパ
ク質または核酸の結晶、それらを含む処方物、および組成物に関する。タンパク
質および核酸の結晶化のための方法、ならびに、乾燥処方物またはスラリー処方
物中での使用のための安定化されたタンパク質結晶または核酸結晶の調製のため
の方法が提供される。本発明の結晶、結晶処方物、および結晶組成物は、生物学
的に活性な高分子成分の非経口投与のための希釈剤とともに再構成され得る。
【0002】 本発明の方法は、治療的タンパク質または免疫原性タンパク質をコードする、
そして非経口的に投与され得る「裸の」DNA配列およびRNA配列の結晶を調
製するために有用である。引き続いて細胞によって取り込まれ、そして適切なグ
リコシル化パターンを有するタンパク質を発現するために使用される、溶解して
いるDNAおよびRNA分子は、治療的または免疫原性のいずれかであり得る。
あるいは、本発明は、RNAもしくはDNAのセンスポリヌクレオチドおよびア
ンチセンスポリヌクレオチドの結晶、結晶処方物、および結晶組成物を調製する
ために有用である。
【0003】 本発明はさらに、タンパク質、糖タンパク質、酵素、抗体、ホルモン、および
ペプチドの結晶または結晶処方物を、ヒトおよび動物に対する生物学的送達のた
めに組成物中にカプセル化することに関する。本発明に従って、タンパク質結晶
または結晶処方物が、ポリマー性キャリアを含むマトリクス中にカプセル化され
、組成物を形成する。この処方物および組成物は、タンパク質のネイティブな生
物学的に活性な三次構造の保持を増強し、そして必要とされる場所および時点で
、活性タンパク質をゆっくりと放出し得るリザーバーを作製する。このようなポ
リマー性キャリアは、生体適合性ポリマーおよび生物分解性ポリマーを含む。生
物学的に活性なタンパク質は、引き続いて、特定のカプセル化技術、ポリマー形
成、結晶形状、結晶溶解度、結晶架橋、および使用される処方条件によって決定
されるように、長期にわたって制御された様式で放出される。タンパク質を結晶
化するための方法、薬学的成分または賦形剤を使用して安定した処方物を調製し
、そして必要に応じてそれらをポリマー性キャリア中にカプセル化して組成物を
産生するための方法、および、生物医学的な適用(治療タンパク質およびワクチ
ンの送達を含む)のためにこのようなタンパク質結晶の処方物および組成物を使
用するための方法が提供される。本発明のこのタンパク質結晶の処方物および組
成物についてのさらなる用途は、ヒトの食品、農業用飼料、獣医学的組成物、診
断薬、化粧品、および個人医療組成物におけるタンパク質送達を含む。
【0004】 (発明の背景) タンパク質は、薬学、獣医学的産物、化粧品、および他の消費財、食品、飼料
、診断薬、工業化学および浄化の分野で、広範な適用において使用されている。
ときどき、このような使用は、タンパク質それ自体に固有の束縛によって制限さ
れるか、またはそれらが使用される環境または媒体によって制約されてきた。こ
のような束縛は、タンパク質の乏しい安定性、性能の変動、または高いコストを
生じ得る。
【0005】 個々のタンパク質分子がそれらの独特な機能を果たすことが必要とされる時点
まで、タンパク質の高次の三次構造または四次構造が保存されるべきであること
は不可避である。現在までのところ、タンパク質の使用についての限定要因(特
に治療レジメにおいて)は、送達の間に遭遇する化学的および物理的変性に対す
るタンパク質構造の感度にある。
【0006】 これらの障壁を克服するために、種々のアプローチが利用されてきた。しかし
、これらのアプローチは、しばしばタンパク質活性の損失、またはタンパク質安
定化キャリアもしくは処方物のさらなる出費のいずれかを被る。
【0007】 タンパク質の広範囲に及ぶ使用に対する障壁を克服するための1つのアプロー
チは、架橋酵素結晶(「CLEC(登録商標)」)技術(N.L.St.Cla
irおよびM.A.Navia、J.Am.Chem.Soc.、114、43
14−16頁(1992))である。PCT特許出願PCT/US91/054
15もまた参照のこと。架橋した酵素結晶は、通常、酵素機能と適合性でない環
境でその活性を保持している。そのような環境は、プロテアーゼ、有機溶媒、高
温、または極端なpHへの長時間の暴露を含む。このような環境において、架橋
した酵素結晶は、不溶性、安定、かつ活性のままである。
【0008】 一般的には、タンパク質技術の最近の進歩にもかかわらず、以下に議論する2
つの問題が、産業および医学における生物学的高分子の使用を制限し続けている
。第1の問題は、製造および貯蔵の間の化学的および物理的変性に対する高次の
三次構造の分子的な安定性および感受性に関する。第2の問題は、治療用タンパ
ク質の生物学的送達の分野は、提供されるビヒクルが、特定の患者または疾患プ
ロセスの必要性と一致する割合で、ネイティブなタンパク質(例えば、タンパク
質、糖タンパク質、酵素、抗体、ホルモン、核酸、およびペプチド)を放出する
ことを必要とすることである。
【0009】 (高分子の安定性) 多数の因子が、生物学的高分子を、従来的な化学的な実体(例えば、そのサイ
ズ、コンホメーション、および両親媒性特性のような)から区別する。高分子は
、化学的分解に感受性であるだけではなく、物理的な分解にもまた、感受性であ
る。これらは、種々の環境因子(例えば、温度、酸化剤、pH、凍結、振盪、お
よび剪断ストレス)に感受性である(Cholewinski,M.,Luck
el,B.およびHorn,H.,Acta Helv.71,405(199
6))。薬物開発のための高分子を考慮する上で、安定性因子は、産生プロセス
を選択する場合に考慮されなければならない。
【0010】 薬学的製品の開発および製造の間の生物学的活性の維持は、その高分子の固有
の安定性ならびに利用される安定化技術に依存する。以下を含む種々のタンパク
質の安定化技術が存在する: a)タンパク質の水溶液または懸濁液への化学的「安定化剤」の添加。例えば
、米国特許第4,297,344号は、選択されたアミノ酸の添加による、凝固
因子IIおよび凝固因子VIII、抗トロンビンIIIならびにプラスミノーゲ
ンの熱に対する安定化を開示する。米国特許第4,783,441号は、界面活
性物質の添加によってタンパク質を安定化するための方法を開示する。米国特許
第4,812,557号は、ヒト血清アルブミンを使用して、インターロイキン
−2を安定化するための方法を開示する。このような方法の欠点は、各々の処方
物が目的のタンパク質に特異的であり、そして大きな開発労力を必要とすること
である。
【0011】 b)調製物を凍結保護物質とともに混合し、そして極低温で保存する凍結/融
解法。しかし、すべてのタンパク質が凍結/融解サイクルで生き残るわけではな
い。
【0012】 c)凍結保護付加物(通常、グリセロール)を伴う低温保存。
【0013】 d)米国特許第5,098,893号に記載されるようなガラス形態における
保存。この場合、タンパク質は、アモルファスもしくはガラス状状態にある水溶
性物質または水膨潤性物質中に溶解される。
【0014】 e)タンパク質の安定化のために最も広範に使用されている方法は、凍結乾燥
(freeze−drying or lyophilization)である
(Carpenter,J.F.,Pical,M.J.,Chang,B.S
.およびRandolph,T.W.,Pharm.Res.,14:(8)9
69(1997))。十分なタンパク質の安定性が水溶液中で達成され得ない場
合には常に、凍結乾燥が最も実行可能な代替を提供する。凍結乾燥の1つの不利
な点は、これが洗練された処理を必要とし、時間を消費し、そして高価であるこ
とである(Carpenter,J.F.,Pical,M.J.,Chang
,B.S.およびRandolph,T.W.,Pharm.Res.,14:
(8)969(1997)およびそこに引用される文献)。さらに、凍結乾燥が
注意深く実行されない場合、この技術の凍結工程および脱水工程によって大部分
の調製物が少なくとも部分的に変性する。この結果は、頻繁に、タンパク質分子
の部分の不可逆的な凝集であり、これは、処方物を非経口的投与のために受容不
可能にする。
【0015】 上記の技術によって産生されたタンパク質処方物の大部分は、低温保存(とき
どき、−20℃までの低温)を必要とする。出荷または貯蔵の間、温度の上昇に
さらすことは、有意な活性の損失を生じ得る。従って、上昇した温度において、
または環境温度においてでさえ、貯蔵は、多くのタンパク質にとって可能ではな
い。
【0016】 タンパク質、ペプチド、および核酸は、薬品、診断、食品、化粧品、洗剤、お
よび研究の産業においてますます利用されている。迅速、安価、かつ広範な生物
学的高分子に適用可能な、代替的な安定化の手順についての大きな必要性が存在
している。特に、これらの生物学的高分子の機能を妨害し得る、過剰な賦形剤の
使用に依存しない安定化手順が必要とされている。
【0017】 低分子結晶薬物の安定性は、処方プロセスの間に極度な力に抵抗性であり得る
ようなものである(米国特許第5,510,118号を参照のこと)。比較的不
溶性の薬物の結晶物質のナノ粒子のミリング(milling)に付随する力は
:剪断ストレス、乱流、高衝撃衝突、キャビテーション、および粉砕を含む。低
分子結晶化合物は、対応するアモスファス固体よりも化学的分解に対してはるか
により安定であると理解されている(Pical,M.J.,Lukes,A.
L.,Lang,J.E.およびGaines,J.Pharm.Sci.,6
7,767(1978))。不運にも、タンパク質および核酸のような高分子の
結晶は、低分子には付随しないさらなる問題および困難さを示す。
【0018】 今世紀の大部分の間、科学および医学は、糖尿病に対して有用な形態でインス
リンを提供する問題を解決するように試みてきた。このタンパク質の安定性の問
題および生物学的送達の問題のいくつかを解決するための試みがなされてきた。
例えば、米国特許第5,506,203号は、吸収エンハンサーと組み合わせた
アモルファスインスリンの使用を記載する。固体状態インスリンは、偏光光学顕
微鏡によって示されるように、独占的にアモルファス物質であった。
【0019】 Jensenらは、インスリンの気道送達における使用のために吸収エンハン
サーとともにインスリンを共沈殿させた(PCT特許出願WO98/42368
を参照のこと)。ここでは、吸収エンハンサーは、界面活性物質(例えば、脂肪
酸の塩または胆汁酸塩)として記載された。直径10マイクロメートル未満であ
り、かつ亜鉛を欠くインスリン結晶は、S.Havelundによって作製され
た(PCT特許出願WO98/42749を参照のこと)。同様に、結晶はまた
、肺投与を増強するために界面活性剤の存在下で作製された。
【0020】 今日まで、当業者は、低分子について観察される結晶状態の安定性の非常な増
強は、生物学的な高分子に転化されないことを認識している(Pical,M.
J.およびRigsbee,D.R.,Pharm.Res.,14:1379
(1997))。例えば、結晶インスリンの水懸濁物は、対応するアモルファス
相の懸濁物と比較して、わずかにより安定なのみである(係数2の程度まで)(
Brange,J.,Langkjaer,L.,Havelund,S.,お
よびVolund,A.,Pharm.Res.,9:715(1992))。
固体状態においては、凍結乾燥したアモルファスインスリンは、調べられたすべ
ての条件下において、凍結乾燥した結晶インスリンよりもはるかにより安定であ
る(Pical,M.J.およびRigsbee,D.R.,Pharm.Re
s.,14:1379(1997))。
【0021】 今日まで、結晶タンパク質の処方物は、非常に小さいタンパク質(例えば、1
0,000ダルトン未満の分子量を有するタンパク質)についてのみ利用可能で
あった。分子量は、高分子のすべての特性(その高分子の体積、水和、粘度、拡
散、移動度、および安定性を含む)に著しい効果を有する。(Cantor,C
.R.およびSchimmel,P.R.,Biophysical Chem
istry,W.H.Freeman and Co.,New York,1
980)。
【0022】 (発明の要旨) 本発明者らは、驚くべきことに、雰囲気温度または上昇した温度で溶液中に保
持される場合に安定でない生物学的高分子が、それにもかかわらず、結晶形態で
そのような温度で長期間にわたり首尾よく乾燥形態で保存され得ることを発見し
た。実際問題として、この発見の5つの局面が特に有利である。
【0023】 第一に、保存される物質の結晶性が非常に重要である。なぜなら、大規模な結
晶化は、臨床での製造プロセス(例えば、治療剤またはワクチンを製造するため
のプロセス)において、最終の精製工程および/または濃縮工程として導入され
得るからである。さらに、大規模結晶化は、製造プロセスにおける精製工程のい
くつかにとって代わり得る。例えば、タンパク質結晶化は、タンパク質処方物の
生産をストリームライン化して、その生産をより便利にし得る。
【0024】 第二に、溶液中で生じる高分子の相互作用は、全ての反応速度のかなりの減少
に起因して、結晶状態において防止されるか、または重度に減少される。従って
、この結晶状態は、生物学的高分子の混合物の保存に独特に適している。
【0025】 第三に、固体結晶調製物が容易に再構成されて、非常に高いタンパク質濃度を
有する容易に使用される非経口処方物を生成し得る。そのようなタンパク質濃度
は、その処方物が皮下投与について意図されている場合に特に有用であると考え
られる(PCT特許出願WO97/04801を参照のこと)。皮下投与につい
て、1.5ml以下の注射容量は充分寛容される。従って、1週間に1回のベー
スで1mg/mlで投与されるタンパク質について、少なくとも50mg/ml
のタンパク質濃度が必要とされ、そして100〜200mg/mlが好ましい。
これらの濃度は、凝集の問題に起因して、液体処方物において達成することは困
難である。これらの濃度は、本発明の結晶処方物において容易に達成され得る。
【0026】 第四に、タンパク質結晶はまた、薬学的投薬調製物のために特に有利な形態を
構成する。この結晶は、インビボで徐放処方物のための基礎として使用され得る
。当業者が理解するように、粒子径は、結晶の溶解および活性の放出のために重
要である。放出速度は、その結晶が実質的に均一な粒子径を有し、そしてアモル
ファス沈澱を含まない場合にはより予測可能であることもまた公知である(欧州
特許第0 265 214号を参照のこと)。従って、タンパク質結晶は、移植
可能なデバイスにおいて有利に使用され得る(PCT特許出願WO96/400
49を参照のこと)。移植物リザーバは、一般に、およそ25〜250μlであ
る。この容量制限によって、高濃度の処方物(10%を超える)および最小限量
の懸濁物ビヒクルが好ましい。本発明のタンパク質結晶は、そのような高濃度で
の非水性の懸濁物中で容易に処方され得る。
【0027】 第五に、結晶の別の利点は、特定の変数が、経時的に高分子の放出を調節する
ために操作され得ることである。例えば、結晶の大きさ、形状、溶解をもたらす
賦形剤を用いる処方、架橋、ポリマーマトリクスへの架橋およびカプセル化のレ
ベルはすべて、生物学的分子についての送達ビヒクルを産生するように操作され
得る。
【0028】 本発明は、活性なタンパク質の最も安定な形態、結晶形態を用いること、なら
びに(1)乾燥した結晶を安定化することが必要な場合に成分または賦形剤を添
加すること、あるいは(2)そのタンパク質結晶もしくは結晶処方物を、ポリマ
ー性キャリアにカプセル化して、各結晶を含む組成物を生成し、続いて活性なタ
ンパク質分子の放出を可能にすることのいずれかによって上記の障害を克服する
。任意の形態のタンパク質(糖タンパク質、抗体、酵素、ホルモンまたはペプチ
ドを含む)が本発明の方法に従って、結晶化され得、そして組成物中で安定化ま
たはカプセル化され得る。さらに、そのようなタンパク質をコードする核酸が同
様に処理され得る。
【0029】 結晶は、異なるもしくは特定の環境への送達または特定の機能をもたらすに適
切な独特の特性を有する種々のポリマー性キャリアを用いてカプセル化され得る
。その組成物の溶解の速度およびそれゆえ活性タンパク質の送達は、結晶の大き
さ、ポリマー組成、ポリマー架橋、結晶架橋、ポリマーの厚さ、ポリマーの疎水
性、ポリマーの結晶性またはポリマーの溶解性を変動させることによって調節さ
れ得る。
【0030】 本発明の結晶への成分もしくは賦形剤の添加またはタンパク質結晶もしくは結
晶処方物のカプセル化は、タンパク質成分のさらなる安定化をもたらす。
【0031】 (発明の詳細な説明) 本明細書中に記載した本発明がより充分に理解され得るために、以下の詳細な
説明を示す。この説明において、以下の用語が使用される。
【0032】 アモルファス固体−タンパク質の非結晶固体形態。ときに、アモルファス沈澱
と呼ばれる。これは、結晶の固体状態に特徴的である分子格子構造を有しない。
【0033】 アンチセンスポリヌクレオチド−その発現の阻害が意図される遺伝子のmRN
Aに相補的であるRNAをコードするRNAまたはDNA。
【0034】 水性有機溶媒混合物−n%の有機溶媒(ここで、nは、1と99との間である
)およびm%水性溶媒(ここで、mは、100−nである)を含む混合物。
【0035】 生体適合性ポリマー−非抗原性(アジュバントとして使用されない場合)で、
非発ガン性で、非毒性であり、そして他の様式でも生きている生物とは固有に不
適合ではないポリマー。例としては以下が挙げられる:ポリ(アクリル酸)、ポ
リ(シアノアクリレート)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(無水物)、ポリ(デプシ
ペプチド)、ポリ(エステル)(例えば、ポリ(乳酸)またはPLA)、ポリ(
乳酸コグルコール酸)すなわちPLGA、ポリ(β−ヒドロキシ酪酸(hydr
oxybutryate))、ポリ(カプロラクトン)およびポリ(ジオキサノ
ン);ポリ(エチレングリコール)、ポリ((ヒドロキシプロピル)メタクリル
アミド)、ポリ[(オルガノ)ホスファゼン]、ポリ(オルトエステル)、ポリ
(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、マレイン酸無水物−アルキ
ルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン
酸、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、
ヒアルロン酸、オリゴサッカリド、グリカミノグリカン、硫酸化ポリサッカリド
、それらの混和物およびコポリマー。
【0036】 生体分解性ポリマー−加水分解または可溶化によって分解するポリマー。分解
は、不均一(主に、粒子表面で生じる)または均一(ポリマーマトリクス全体で
均一に分解する)、またはそのようなプロセスの組合せであり得る。
【0037】 生物学的高分子−タンパク質、デオキシリボ核酸(DNA)およびリボ核酸(
RNA)のような生物学的ポリマー。本願の目的のために、生物学的高分子はま
た、高分子といわれる。
【0038】 化学組成における変化−タンパク質または核酸の結晶または結晶処方物を取り
囲む環境の化学物質成分において、その結晶成分の安定性または溶解速度に影響
を与える任意の変化。
【0039】 剪断力における変化−使用条件下において、タンパク質または核酸の結晶また
は結晶処方物を取り囲む環境の因子における任意の変化(例えば、力学的圧力に
おける変化(これは、正であっても負であってもよい)、回転攪拌、遠心分離、
タンブリング、機械的振盪および濾過ポンプ)。
【0040】 組成物−架橋されていないタンパク質結晶、架橋されている結晶、核酸結晶ま
たはそれらを含む処方物のいずれか。これらは、ポリマー性キャリア内にカプセ
ル化されてコーティングされた粒子を形成している。本明細書において使用され
る場合、組成物は常に、カプセル化結晶または処方物をいう。
【0041】 制御溶解−以下からなる群より選択される因子によって制御されている、タン
パク質または核酸の結晶または結晶処方物の溶解あるいはその処方物の結晶成分
の放出:その結晶の表面積;その結晶の大きさ;その結晶の形状;賦形剤成分の
濃度;賦形剤成分の数および性質;賦形剤成分の分子量ならびにそれらの組合せ
【0042】 コポリマー−1を超えるモノマー種を用いて作製されるポリマー。
【0043】 結晶−第二の形態であるアモルファス固体状態とは異なる物質の固体状態の1
つの形態。結晶は、格子構造、特徴的形状および光学的特性(例えば、屈折率)
を含む特徴的な特性を示す。結晶は、三次元で周期的に反復するパターンで配置
される原子からなる(C.S.Barrett,Structure of M
etals、第二版、McGraw−Hill、New York、1952、
1頁)。本発明の結晶は、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、抗体、治療的
タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードするDNAもしくはRNAで
あり得る。
【0044】 (タンパク質結晶または核酸結晶の乾燥)N2、気体または不活性ガスでの乾
燥、真空オーブン乾燥、凍結乾燥、揮発性有機溶媒での洗浄続いてこの溶媒のエ
バポレーション、またはフュームフード(fume hood)におけるこの溶
媒のエバポレーション含む手段による水、有機溶媒または液体ポリマーの除去。
代表的には、乾燥は、この結晶が自由に流れる粉末になる場合に達成される。乾
燥は、濡れた結晶に対してガスの流れを通過させることにより実行され得る。ガ
スは、窒素、アルゴン、ヘリウム、二酸化炭素、空気またはそれらの組合せから
なる群より選択され得る。
【0045】 (有効量)幾らかの期間にわたってそれらが投与される、被検体または領域を
、処置、免疫化、ブースト、保護、修復または解毒化するために有効である、本
発明のタンパク質結晶もしくは核酸結晶または結晶処方物あるいは結晶組成物の
量。
【0046】 (乳化剤)ポリマーコート化タンパク質結晶と溶液との間の界面張力を低下さ
せる、表面活性剤。
【0047】 (処方物すなわち(タンパク質結晶組成物もしくは核酸結晶組成物))本発明
のタンパク質結晶または核酸結晶および1以上の成分または賦形剤(糖および生
体適合性ポリマーを含む)の組合せ。賦形剤の例は、American Pha
rmaceutical Association and the Phar
maceutical Society of Great Britianに
より共同で刊行された、Handbook of Pharmaceutica
l Excipients中に記載されている。本出願の目的に関して、「処方
物」は、「結晶処方物」を含む。さらに、「処方物」は、「タンパク質結晶処方
物または核酸結晶処方物」を含む。
【0048】 (除染のための処方物)以下の群より選択される処方物:化学廃棄物、除草剤
、殺虫剤、農薬および環境災害の除染のための処方物。
【0049】 (遺伝子治療)個体において欠損しているか、欠けているか、または不十分に
発現されるタンパク質をコードするDNAの処方物および/または組成物を使用
する治療。この結晶は、DNAが細胞中に取り込まれる非増殖性組織中に注射さ
れ、そして1〜6ヶ月の期間にわたって発現される。発現したタンパク質は、内
因性タンパク質を一時的に置換または補充するように働く。遺伝子治療はまた、
プロモーターと比較して逆の遺伝子の配向でトランスジーンを提供し、その結果
、アンチセンスmRNAは、インビボで産生されることによって、遺伝子発現を
阻害するように働く。
【0050】 (糖タンパク質)炭水化物に共有結合したタンパク質またはペプチド。この炭
水化物は、単量体であり得るか、またはオリゴサッカリドから構成され得る。
【0051】 (ホモポリマー)単一の単量体種で作製されたポリマー。
【0052】 (免疫療法剤)腫瘍細胞、ウイルス、または細菌に対して保護的免疫を誘導す
るタンパク質活性を有する、上記の腫瘍細胞、ウイルスまたは細菌に由来するタ
ンパク質。免疫療法剤は、(タンパク質として)直接的に、またはこのタンパク
質をコードするDNAもしくはRNAを注射することによって(間接的に)投与
され得る。
【0053】 免疫療法剤はまた、タンパク質もしくは糖タンパク質サイトカインまたは上記
の腫瘍細胞、ウイルスまたは細菌を低下または排除する免疫系を刺激する免疫細
胞同時刺激性分子であり得る。
【0054】 (液体ポリマー)水性溶媒または有機溶媒の非存在下における、ポリエチレン
グリコール(PEG)のような、純粋な液相合成ポリマー。
【0055】 (高分子)タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、治療用タンパク質、DNA
分子またはRNA分子。
【0056】 (投与の方法)タンパク質結晶または核酸結晶あるいは結晶処方物または結晶
組成物は、種々の様式または投与に適切であり得る。これらは、経口投与、非経
口投与、皮下投与、静脈内投与、肺投与、病変内投与、または局所投与を含み得
る。あるいは、核酸結晶は、「DNA銃」を用いる非増殖性組織(例えば、筋肉
)への送達のために、金粒子、または他のキャリアビーズに共有結合的に付着さ
れ得る。
【0057】 (裸のDNA)プロモーターに作動可能に連結され得、そして複製コンピテン
トなプラスミド中に挿入され得る、ワクチン抗原、治療用タンパク質、または免
疫療法タンパク質をコードする非複製性の非組み込み性ポリヌクレオチド。この
DNAは、トランスフェクションを容易にするタンパク質、ウイルス粒子、リポ
ソーム性処方物、脂質およびリン酸カルシウム沈澱剤との会合から自由である。
【0058】 (裸のDNAワクチン)ワクチン抗原をコードするDNAまたはワクチン抗原
の結晶および免疫療法剤。このワクチンは、このDNAが細胞中に取り込まれる
非増殖性組織中に注射され、そして1〜6ヶ月の期間にわたって発現される。こ
の核酸結晶は、投与部位への送達を補助するために、金粒子に共有結合され得る
【0059】 (有機溶媒)液体ポリマーおよびそれらの混合物を含む、非水性起源の任意の
溶媒。本発明に適切な有機溶媒は、アセトン、メチルアルコール、メチルイソブ
チルケトン、クロロホルム、1−プロパノール、イソプロパノール、2−プロパ
ノール、アセトニトリル、1−ブタノール、2−ブタノール、エチルアルコール
、シクロヘキサン、ジオキサン、エチルアセテート、ジメチルホルムアミド、ジ
クロロエタン、ヘキサン、イソオクタン、塩化メチレン、tert−ブチルアル
コール、トルエン、4塩化炭素、またはそれらの組合せを含む。
【0060】 (ペプチド)通常、3〜35のアミノ酸残基、そして頻繁には(ただし、より
大きいタンパク質のフラグメントを必ずしも示さない)小〜中程度の分子量のポ
リペプチド。
【0061】 (薬学的に有効な量)幾らかの期間にわたって投与される、生きている生物に
おける状態を処置するために効果的な、タンパク質結晶もしくは核酸結晶または
結晶処方物もしくは結晶組成物の量。
【0062】 (成分)薬学的な成分または薬学的賦形剤を含む、任意の賦形剤(単数または
複数)。賦形剤は、例えば、以下を含む: (酸性化剤) 酢酸、氷酢酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、希塩酸、リンゴ酸、硝酸、リン酸
、希リン酸、硫酸、酒石酸。
【0063】 (エアロゾル噴霧薬) ブタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、イソブ
タン、プロパン、トリクロロモノフルオロメタン。
【0064】 (空気の置き換え) 二酸化炭素、窒素。
【0065】 (アルコール変性剤(denaturant)) 安息香酸デナトニウム(denatonium benzoate)、メチル
イソブチルケトン、スクロースオクタアセテート(octacetate)。
【0066】 (アルカリ化剤) 強アンモニア溶液、炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、ジイソプロパノ
ールアミン、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナ
トリウム、水酸化ナトリウム、トロラミン(trolamine)。
【0067】 (抗ケーキング剤:滑沢剤(glidant)の項を参照のこと) (消泡剤(Antifoaming agent)) ジメチコーン、シメチコーン(simethicone)。
【0068】 (保存剤) 塩化ベンザルコニウム、塩化ベンザルコニウム溶液、塩化ベンゼルトニウム(
benzelthonium)、安息香酸、ベンジルアルコール、ブチルパラベ
ン(butylparaben)、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール
、クロロクレゾール、クレゾール、デヒドロ酢酸、エチルパラベン、メチルパラ
ベン、メチルパラベンナトリウム、フェノール、フェニルエチルアルコール、酢
酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、
プロピルパラベン、プロピルパラベンナトリウム、安息香酸ナトリウム、デヒド
ロ酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸、チメロサール、チモ
ール。
【0069】 (抗酸化剤) アスコルビン酸、パルミチン酸アコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、
ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プ
ロピル、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム
、チオ硫酸ナトリウム、二酸化硫黄、トコフェロール、トコフェロール賦形剤。
【0070】 (緩衝化剤) 酢酸、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、ホウ酸、クエン酸、酪酸、亜
リン酸、クエン酸カリウム、メタリン酸カリウム、リン酸カリウム一塩基、酢酸
ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム溶液、二塩基性リン酸ナトリ
ウム、一塩基性リン酸ナトリウム。
【0071】 (カプセル剤滑沢剤) 錠剤およびカプセル剤滑沢剤を参照のこと。
【0072】 (キレート剤) エデト酸二ナトリウム、エチレンジアミンテトラ酢酸およびその塩、エデト酸
。 (コーティング剤) カルボキシメチルセルロースナトリウム、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セル
ロース、エチルセルロース、ゼラチン、薬学的うわぐすり、ヒドロキシプロピル
セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル
セルロースフタレート、メタクリル酸コポリマー、メチルセルロース、ポリエチ
レングリコール、ポリビニルアセテートフタレート、セラック、スクロース、二
酸化チタン、カルナウバロウ、微結晶ワックス、ゼイン。
【0073】 (着色料) カラメル、赤色、黄色、黒色またはこれらのブレンド、酸化鉄。
【0074】 (錯体化剤) エチレンジアミンテトラ酢酸およびその塩(EDTA)、エデト酸、ゲンチシ
ン酸エタノールメイド(gentisic acid ethanolmaid
e)、オキシキノリンスルフェート。
【0075】 (乾燥剤) 塩化カルシウム、硫酸カルシウム、二酸化ケイ素。
【0076】 (乳化剤および/または可溶化剤) アカシア、コレステロール、ジエタノールアミン(隣接型(adjunct)
)、モノステアリン酸グリセリル、ラノリンアルコール、レシチン、モノ−およ
びジ−グリセリド、モノエタノールアミン(隣接型)、オレイン酸(隣接型)、
オレイルアルコール(安定化剤)、ポロキサマー、ポリオキシエチレン50ステ
アレート、ポリオキシ35ヒマシ(caster)油、ポリオキシ40水素化ヒ
マシ油、ポリオキシ10オレイルエーテル、ポリオキシ20セトステアリルエス
テル、ポリオキシ40ステアレート、ポリソルベート20、ポリソルベート40
、ポリソルベート60、ポリソルベート80、プロピレングリコールジアセテー
ト、プロピレングリコールモノステアレート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステア
リン酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モ
ノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、ステアリン酸、トロ
ールアミン、乳化ロウ。
【0077】 (ろ過助剤) 粉末化したセルロース、精製ケイ質土。
【0078】 (矯臭剤および香料) アネトール、ベンズアルデヒド、エチルバニリン、メントール、サリチル酸メ
チル、グルタミン酸一ナトリウム、橙花油、ペパーミント、ペパーミント油、ペ
パーミント精、ローズ油、より強力な(stronger)ローズ水、チモール
、トルバルサムチンキ、バニラ、バニラチンキ、バニリン。
【0079】 (滑沢剤および/または抗ケーキング剤) ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、コロイド状ケイ素二酸化物、タルク
【0080】 (湿潤化剤) グリセリン、ヘキシレングリコール、プロピレングリコール、ソルビトール。
【0081】 (軟膏基剤) ラノリン、無水ラノリン、親水性軟膏、白色軟膏、黄色軟膏、ポリエチレング
リコール軟膏、ペトロラタム、親水性ペトロラタム、白色ペトロラタム、ローズ
水軟膏、スクワラン。
【0082】 (可塑化剤) ヒマシ油、ジアセチル化モノグリセリド、ジエチルフタレート、グリセリン、
モノ−およびジ−アセチル化モノグリセリド、ポリエチレングリコール、プロピ
レングリコール、トリアセチン、トリエチルシトレート。
【0083】 (ポリマー膜) 酢酸セルロース。
【0084】 (溶媒) アセトン、アルコール、希釈アルコール、アミレン水和物、安息香酸ベンジル
、ブチルアルコール、四塩化炭素、クロロホルム、コーン油、綿実油、酢酸エチ
ル、グリセリン、ヘキシレングリコール、イソプロピルアルコール、メチルアル
コール、メチルクロライド、メチレンイソブチルケトン、鉱油、ピーナッツ油、
ポリエチレングリコール、炭酸プロピレン、プロピレングリコール、ゴマ油、注
射用水、注射用滅菌水、洗浄用滅菌水、精製水。
【0085】 (吸収剤) 粉末セルロース、木炭、精製ケイ質土。
【0086】 (二酸化炭素吸収剤) 水酸化バリウム石灰、ソーダ石灰。
【0087】 (硬化剤) 硬化ヒマシ油。セトステアリル(cetostearyl)アルコール、セチ
ルアルコール、セチルエステルワックス、硬化脂肪(hard fat)、パラ
フィン、ポリエチレン賦形剤、ステアリルアルコール、乳化ワックス、白蝋、黄
蝋(yellow wax)。
【0088】 (坐剤基剤) ココアバター、硬化脂肪、ポリエチレングリコール。
【0089】 (懸濁剤および/または増粘剤) アラビアゴム、寒天、アルギン酸、モノステアリン酸アルミニウム、ベントナ
イト、精製ベントナイト、マグマベントナイト、カルボマー(carbomer
)934p、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロ
ースナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム12、カラゲーナン、
微晶性およびカルボキシメチルセルロースナトリウムセルロース、デキストリン
、ゼラチン、グアーゴム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセ
ルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ケイ酸マグネシウムアルミニ
ウム、メチルセルロース、ペクチン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコ
ール、ポビドン、アルギン酸プロピレングリコール、二酸化ケイ素、二酸化ケイ
素コロイド、アルギン酸ナトリウム、トラガカントゴム、キサンタンガム。
【0090】 (甘味剤) アスパルターム、デキストレート(dextrate)、デキストロース、賦
形剤デキストロース、フルクトース、マンニトール、サッカリン、サッカリンカ
ルシウム、サッカリンナトリウム、ソルビトール、ソルビトール溶液、スクロー
ス、圧縮糖、コーティング糖、シロップ。
【0091】 (錠剤結合剤) アラビアゴム、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微晶性
セルロース、デキストリン、エチルセルロース、ゼラチン、液体グルコース、ガ
ーゴム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ポリエチレ
ンオキシド、ポビドン、アルファ化デンプン、シロップ。
【0092】 (錠剤および/またはカプセル剤希釈剤) 炭酸カルシウム、リン酸カルシウム(2塩基)、リン酸カルシウム(3塩基)
、硫酸カルシウム、微晶性セルロース、粉末セルロース、デキストレート、デキ
ストリン、デキストロース賦形剤、フルクトース、カオリン、ラクトース、マン
ニトール、ソルビトール、デンプン、アルファ化デンプン、スクロース、圧縮糖
、コーティング糖。
【0093】 (錠剤崩壊剤) アルギン酸、微晶性セルロース、クロスカルメロース(croscarmel
lose)ナトリウム、クロスポビドン(corsepovidon)、ポラク
リリンカリウム、グリコール酸ナトリウムデンプン、デンプン、アルファ化デン
プン。
【0094】 (錠剤および/またはカプセル剤潤滑剤) ステアリン酸カルシウム、ベヘン酸グリセリン、ステアリン酸マグネシウム、
軽鉱油、ポリエチレングリコール、ステアリルフマル酸ナトリウム、ステアリン
酸、精製ステアリン酸、タルク、硬化植物油、ステアリン酸亜鉛。
【0095】 (強壮剤) デキストロース、グリセリン、マンニトール、塩化カリウム、塩化ナトリウム
【0096】 (ビヒクル:矯味矯臭化(flavored)および/または甘味化) 芳香性エリキシル、化合物ベンズアルデヒドエリキシル、イソアルコールエリ
キシル、ハッカ水、ソルビトール溶液、シロップ、トルーバルサムシロップ。
【0097】 (ビヒクル:油性) アーモンド油、コーン油、綿実油、オレイン酸エチル、ミリスチル酸イソプロ
ピル、パルミチン酸イソプロピル、鉱油、軽鉱油、ミリスチルアルコール、オク
チルドデカノール、オリーブ油、ピーナッツ油、キョウニン油、ゴマ油、ダイズ
油、スクアリン。
【0098】 (ビヒクル:固体キャリア) 糖球 (ビヒクル:滅菌化) 注射用静菌水、注射用静菌塩化ナトリウム。
【0099】 (増粘剤)(懸濁剤を参照のこと)。
【0100】 (撥水剤) シクロメチコン、ジメチコン、シメチコン。
【0101】 (湿潤剤および/または可溶化剤) 塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、ドク
サートナトリウム、ノノキシノール9、ノノキシノール10、オクトキシノール
9、ポロキサマー、ポリオキシル35、ヒマシ油、ポリオキシル40、硬化ヒマ
シ油、ステアリン酸ポリオキシル50、ポリオキシル10オレイルエーテル、ポ
リオキシル20、セトステアリルエーテル、ステアリン酸ポリオキシル40、ポ
リソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート60、ポリソルベート
80、ラウリル硫酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソ
ルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、チロキ
サポール。
【0102】 好ましい成分または賦形剤は、以下の塩を含む:1)アミノ酸(例えば、グリ
シン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アスパラギン、グ
ルタミン、プロリン)、2)炭水化物(例えば、単糖類(例えば、グルコース、
フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、リボー
ス)、および3)二糖類(例えば、ラクトース、トレハロース、マルトース、ス
クロース)、および4)多糖類(例えば、マルトデキストリン、デキストラン、
スターチ、グリコーゲン)、および5)アルジトール(例えば、マンニトール、
キシリトール、ラクチトール、ソルビトール)、6)グルクロン酸、ガラクツロ
ン酸、7)シクロデキストリン(例えば、メチルシクロデキストリン、ヒドロキ
シプロピル−β−シクロデキストリンなど)、8)無機塩(例えば、塩化ナトリ
ウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、ナトリウムおよびカリウムのリン酸塩
、ホウ酸塩、炭酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウム)、および9)有機塩
(例えば、酢酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、乳酸塩)、10)以下のよ
うな、乳化剤または可溶化剤(アラビアゴム、ジエタノールアミン、モノステア
リン酸グリセリン、レシチン、モノエタノールアミン、オレイン酸、オレイルア
ルコール、ポロキサマー、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリ
ン酸、モノラウリン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、および他のソ
ルビタン誘導体、ポリオキシル誘導体、ワックス、ポリオキシエチレン誘導体、
ソルビタン誘導体)、11)以下のような、増粘試薬(寒天、アルギン酸および
その塩、ガーガム、ペクチン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、
セルロースおよびその誘導体、炭酸プロピレン、ポリエチレングリコール、ヘキ
シレングリコール、チロキサポール)。賦形剤または成分のさらに好ましい群は
、以下を含む:スクロース、トレハロース、ラクトース、ソルビトール、ラクチ
トール、イノシトール、ナトリウム塩およびカリウム塩(例えば、酢酸塩、リン
酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩)、グリシン、アルギニン、ポリエチレンオキシド
、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、メ
トキシポリエチレングリコール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデ
キストリン。
【0103】 (ポリマー)−− 低分子の、単純な化学的単位の反復によって構築される高
分子。反復単位は、直線化または分枝化され得、相互連結されたネットワークを
形成し得る。反復単位は、通常、そのモノマーと等価であるか、ほぼ等価である
【0104】 (ポリマーキャリア)−− タンパク質の送達(生物学的送達を含む)のため
にタンパク質結晶のカプセル化に使用されるポリマー。このようなポリマーは、
生体適合性ポリマーおよび生分解性ポリマーを含む。ポリマーキャリアは、単一
のポリマー型であり得るか、またはそれは、ポリマー型の混合体から構成され得
る。ポリマーキャリアとして有用なポリマーとしては、例えば、以下が挙げられ
る:ポリ(アクリル酸)、ポリ(シアノアクリレート)、ポリ(アミノ酸)、ポ
リ(無水物)、ポリ(デプシペプチド)、ポリ(エステル)(例えば、ポリ(乳
酸)すなわちPLA、ポリ(乳酸−コ−グリコール酸)すなわちPLGA、ポリ
(B−ヒドロキシブチレート)、ポリ(カプロラクトン)、およびポリ(ジオキ
サノン(dioxanon)));ポリ(エチレングリコール)、ポリ((ヒド
ロキシプロピル)メタクリルアミド)、ポリ((オルガノ)ホスファゼン(ph
osphazene))、ポリ(オルトエステル)、ポリ(ビニルアルコール)
、ポリ(ビニルピロリドン)、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテルコポリ
マー、プルロニックポリオール、アルブミン、天然および合成ポリペプチド、ア
ルギナート、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼ
ラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン、硫化多糖類、またはタ
ンパク質結晶をカプセル化する任意の従来の材料。
【0105】 (タンパク質)−− 炭素、水素、酸素、窒素および通常硫黄を含み、かつペ
プチド結合によって連結されるアミノ酸の鎖から構成される複合高分子ポリマー
。本出願におけるタンパク質とは、糖タンパク質、抗体、非酵素タンパク質、酵
素、ホルモンおよびペプチドをいう。タンパク質の分子量の範囲は、1000ダ
ルトンのペプチドから600〜1000キロダルトンの糖タンパク質を含む。低
分子タンパク質(10,000ダルトン未満)は、非常に小さいために高度に組
織化された3次構造によって特徴付けされないかもしれない。ここで、この3次
構造は、疎水性のコアの周辺に組織化される。
【0106】 本発明の一つの実施態様において、このようなタンパク質は、10,000ダ
ルトン以上の分子量を有する。代替的な実施態様に従って、この分子量は、20
,000ダルトン以上である。別の代替的な実施態様に従って、この分子量は、
30,000ダルトン以上である。さらに代替的な実施態様に従って、この分子
量は、40,000ダルトン以上である。別の代替的な実施態様に従って、この
分子量は、50,000ダルトン以上である。
【0107】 (タンパク質活性)−− 結合、触媒、シグナル伝達、トランスポート、また
はタンパク質が使用される環境内での機能的応答(例えば、免疫応答、酵素活性
、またはそれらの組み合わせ)を誘導する他の活性からなる群より選択される活
性。
【0108】 (タンパク質活性の放出速度)−− 単位時間あたりに溶解されるタンパク質
の量。
【0109】 (タンパク質結晶)−− 結晶格子中に整列されたタンパク質分子。タンパク
質結晶は、3次元に周期的に繰り返される特異的タンパク質−タンパク質相互作
用のパターンを含む。本発明のタンパク質結晶は、アモルファス固体形態または
タンパク質の沈殿物(例えば、タンパク質溶液の凍結乾燥によって得られるもの
)を含まない。
【0110】 (タンパク質結晶処方物)−− コートされた粒子を形成するためにポリマー
性キャリア内にカプセル化されたタンパク質結晶の組み合わせ。タンパク質結晶
処方物のコートされた粒子は、球状形態を有し得、そして直径500マイクロメ
ーターまでのマイクロスフェアであり得るか、またはそれらは、他の形態を有し
得、そして微小粒子であり得る。本出願の目的のために、「タンパク質結晶処方
物」は、用語「組成物」に含まれる。
【0111】 (タンパク質送達系)−− 1以上のタンパク質結晶処方物または組成物、処
方物を作製するためのプロセス、あるいは処方物を生物学的実態に投与する方法
またはそのための手段。
【0112】 タンパク質の充填量 −− 乾燥処方物の重量に関して、タンパク質の重量の
パーセンテージと同じように計算されたマイクロスフェアのタンパク質含有量。
タンパク質充填量の代表的な範囲は,1〜80%である。
【0113】 タンパク質の放出 −− ポリマーキャリアからの活性タンパク質の放出を,
1つ以上の、以下の因子によって制御する:(1)ポリマーマトリクスの分解;
(2)ポリマーマトリクス内の結晶融解の速度;(3)融解したタンパク質のポ
リマーマトリクスを通る拡散;(4)タンパク質の充填量;および(5)タンパ
ク質結晶/ポリマーマトリクスへの生物学的媒体の拡散。
【0114】 予防的に有効な量 −− いくらかの時間にわたって投与される、生存してい
る生物における状態を予防するために有効な、タンパク質もしくは核酸の結晶あ
るいはタンパク質もしくは核酸の結晶処方物またはタンパク質もしくは核酸の結
晶組成物の量。
【0115】 再構成 −− 適切な緩衝液または薬学的処方物中の、タンパク質もしくは核
酸の結晶あるいはタンパク質もしくは核酸の結晶処方物またはタンパク質もしく
は核酸の結晶組成物の融解。
【0116】 貯蔵安定性 −− 特定の状態の下でインキュベートされた時間に対する、ネ
イティブタンパク質からの比活性の損失および/または2次構造における変化。
【0117】 安定性 −− 特定の条件下の溶液中での時間に対するネイティブタンパク質
からの比活性の損失および/または2次構造における変化。
【0118】 安定化 −− 賦形剤または成分を含むタンパク質結晶またはDNA結晶もし
くはRNA結晶の処方物を調製することによる、ネイティブタンパク質からの比
活性の損失および/または2次構造における変化を妨げるプロセス。
【0119】 治療用タンパク質 −− 上記のようなタンパク質であって、これは、処方物
または組成物、あるいは薬学的処方物または薬学的組成物において生存している
生物に投与される。治療用タンパク質は、本明細書中で記載されるタンパク質型
の全てを含む。
【0120】 ワクチン抗原 −− ウイルス、寄生生物、細菌または腫瘍細胞のような病原
性因子由来のタンパク質。このようなワクチン抗原のタンパク質活性は、病原性
因子または腫瘍に特異的な防御的免疫応答の誘導物である。
【0121】 (結晶性) 高分子の結晶性は、インビボにおいて、これらの貯蔵および送達のために、大
いに重要である。しかし、母液の外側で安定である、このような結晶性高分子を
大量に調製するための技術は、ほとんど存在しない。タンパク質または核酸の結
晶は、非常に脆く、そして高い比率の溶媒を含むので、これらは、相当の注意を
伴って取り扱わなければならない。X線結晶学において、高分子結晶からの回折
パターンが空気中での脱水の際に迅速に変性することは周知である。通常、結晶
は,その母液から注意深く分離され,そしてキャピラリーチューブへ挿入される
。このチューブを,少量の母液の内側に沿って、デンタルワックス(denta
l wax)またはシリコングリースを用いて空気から密封し、水和を維持する
[McPherson,A.、Preparation and Analys
is of Protein Crystals、Robert E.Krie
qer Publishing、Malabar、214頁(1969)]。別
の技術は、低温において高分子結晶からデータを収集することである。この結晶
を調製し、次いで、急速に冷却して水性媒体における氷格子形成を防止する。氷
の、堅いガラス形態の代わりに、損傷がほとんどない結晶を容器に入れる。次い
で、結晶を、100ケルビンで維持して,結晶の崩壊を防止する[(Rodge
rs,D.W.Methods in Enzymology(Carter,
C.W.およびSweet,R.M.編)Academic Press、第2
76巻、183頁(1997)]。この技術は,これらの母液の外側の結晶を維
持させることを可能にするが,一方、100ケルビンより高い温度においては使
用され得ない。
【0122】 原則的に、乾燥した結晶は,凍結乾燥によって調製され得る。しかし、この技
術は,材料の急速な冷却を包含し、そして安定な生成物を凍結するためにのみ適
用され得る。この水溶液は、まず、−40℃と−50℃との間で凍結される。次
いで、この氷は真空下で取り除かれる。この氷形成は、通常、タンパク質結晶格
子に対して破壊的であり、結晶性および非晶性沈殿物の混合物を生じる。
【0123】 結晶性状態において,周囲温度における貯蔵条件下で純粋かつ安定である高分
子を生成することが望ましい。このような結晶は、治療剤およびワクチンの投薬
調製物にために、タンパク質または核酸の特に有利な形態を構成する。本発明は
、固体粒子かまたは非水性溶媒中に分散されるかのいずれかとして、結晶性高分
子の貯蔵のための処方物および組成物を提供する。さらに、本発明は,単一の生
物学的高分子または互いに相互作用しない高分子の混合物の貯蔵に対して適用さ
れ得る。
【0124】 別の実施態様において、本発明は、母液を非水性溶媒と置換することを包含す
る、生物学的高分子を懸濁液中の貯蔵に適切にするための方法を提供する。さら
に別の実施態様において,結晶性スラリーは、第1の溶媒を遠心分離で除去(s
pinning cut)し、そして水を除去するために第2の有機溶媒を使用
して残存する結晶性固体を洗浄し、次いで非水性溶媒をエバポレーションするこ
とによって固体にされ得る。
【0125】 結晶性治療用タンパク質の非水性スラリーは、皮下送達のために特に有用であ
り、一方,固体処方物は、理想的には肺投与に適している。肺送達は,他の経路
または投与によって送達することが困難な生物学的高分子のために、特に有用で
ある(例えば,PCT特許出願WO96/32152、WO95/24183お
よびWO97/41833を参照のこと)。
【0126】 以下で言及されるタンパク質は、それら自体のタンパク質結晶、または細胞の
の取り込みに際してそれらのタンパク質をコードするDNAもしくはRNAを含
む核酸結晶を含む。
【0127】 本発明は,タンパク質または核酸の結晶の組成物および処方物を有利に提供す
る。
【0128】 (カプセル化した結晶の安定性) 当業者は、タンパク質の安定性が、タンパク質の放出を制御するポリマー微粒
子送達系の首尾のよい処方物に対する最も重要な障害の1つであることを理解し
ている。ポリマーキャリア中にカプセル化したタンパク質の安定性は、3つの別
個の段階(タンパク質結晶組成物の製造、得られた組成物からのタンパク質の放
出、およびタンパク質の放出後のインビボ安定性)で調査され得る。可溶性タン
パク質または非晶性タンパク質を含む微粒子またはマイクロスフェアの調製の間
、有機溶媒および凍結乾燥の使用は、タンパク質の安定性に対して特に不利益で
ある。続いて、放出されたタンパク質は、水分誘導性の(moisture−i
nduced)凝集を受けやすく、従って永続的な不活化を生じる。
【0129】 タンパク質の高い安定性を、本発明に従うタンパク質処方物およびタンパク質
組成物の調製の間に達成するために、個々のタンパク質分子の可動度を制限する
必要がある(結晶性固体状態において達成される最善の結果)。この適用の目的
のために、固体状態は、2つのカテゴリー(非晶性および結晶性)に分類される
。結晶性材料中に通常存在する、三次元的に広い範囲の規則性(long−ra
nge order)は、非晶性状態中に存在しない。さらに、互いに関連する
分子の位置は、高度な規則性の結晶状態に関して、非晶性状態または液体状態に
おいて、よりランダムである。従って、非晶性タンパク質は、それらの結晶性対
照物よりも、より低い安定性であり得る。
【0130】 図1は、Candida rugosaリパーゼ(「CRL」)の以下の分子
状態の相対的な安定性を示す:20%有機溶媒中での架橋した非晶性、液体、結
晶性、20%有機溶媒中での架橋した結晶性、有機溶媒なしで架橋した結晶性。
図1は、結晶性CRLが、20%有機溶媒中で、175時間を越えて、80%の
活性を保持することを示す。対照的に、酵素の非晶形態および可溶性形態の両方
は、数時間以内に完全に不活化される。本発明は、それらの優れた安定性の特徴
に起因して、タンパク質の結晶性形態を有利に利用する。
【0131】 (結晶性の維持) 本発明に従ってタンパク質処方物およびタンパク質組成物を調製するためのタ
ンパク質供給源としてタンパク質結晶を使用するために、結晶化溶液(母液)の
外側のタンパク質結晶の融解の問題が克服されなければならない。タンパク質の
結晶性、そしてそれ故安定性を維持するために、本発明のタンパク質結晶処方物
およびタンパク質結晶組成物の生成において、いくつかのアプローチが使用され
得る: 1.結晶は、ポリマーキャリアでカプセル化されたタンパク質結晶を生成する過
程において母液中に残存する。タンパク質結晶化において使用される多くの化合
物(例えば、塩、PEG、および有機溶媒)は、ポリマーを処理する条件と適合
性である。 2.融解の速度論。母液の外側の結晶融解の速度は、pH、温度、金属イオン(
例えば、Zn、CuおよびCa)の存在、ならびに沈殿剤の濃度のような条件に
依存する。これらの条件を変化させることによって、数時間の間、結晶の融解を
減速し得る。同時に、微粒子形成の処理は、非常に速く、そして通常は、完了ま
でに数秒から数分が必要である。 3.乾燥したタンパク質結晶。母液は、濾過によって除去され得、そして残存す
る結晶ペーストは、風乾によって、真空下で、水混和性有機溶媒を用いる洗浄に
よって、および/または凍結乾燥によって、乾燥され得る。 4.タンパク質結晶は、非融解性結晶または緩徐な融解性結晶を形成するために
、化学的に架橋され得る。 5.結晶サイズおよび形状は、結晶化の過程で操作および制御され得る。従って
、非晶性タンパク質と比較して、異なる融解速度および続く異なる徐放プロフィ
ールを各々有する結晶形態の範囲が、利用可能である。
【0132】 (タンパク質の構成) 本発明の処方物および組成物のタンパク質の構成は、天然にまたは合成的に改
変される構成であり得る。それらは、糖タンパク質、リンタンパク質、イオウタ
ンパク質、ヨウ素タンパク質、メチル化タンパク質、非改変化タンパク質または
他の改変を含むタンパク質であり得る。このようなタンパク質の構成は、例えば
、治療用タンパク質、予防用タンパク質(抗体を含む)、洗浄剤タンパク質(界
面活性剤タンパク質を含む)、個人医療タンパク質(化粧用タンパク質を含む)
、獣医用タンパク質、食品タンパク質、飼料タンパク質、診断用タンパク質およ
び浄化タンパク質を含む、任意のタンパク質であり得る。
【0133】 本発明の1つの実施態様において、このようなタンパク質は、10,000ダ
ルトン以上の分子量を有する。代替の実施態様に従って、その分子量は、20,
000ダルトン以上の分子量である。別の代替の実施態様に従って、その分子量
は、30,000ダルトン以上である。さらなる代替の実施態様に従って、その
分子量は、40,000ダルトン以上であり得る。別の代替の実施態様に従って
、その分子量は、50,000ダルトン以上である。
【0134】 このようなタンパク質に含まれるものは、例えば、ヒドロラーゼ、イソメラー
ゼ、リアーゼ、リガーゼ、アデニレートシクラーゼ、トランスフェラーゼおよび
オキシドレダクターゼのような酵素である。ヒドロラーゼの例としては、エラス
ターゼ、エステラーゼ、リパーゼ、ニトリラーゼ(nitrilase)、アミ
ラーゼ、ペクチナーゼ、ヒダントイナーゼ(hydantoinase)、アス
パラギナーゼ、ウレアーゼ、サブチリシン、サーモライシンおよび他のプロテア
ーゼならびにリゾチームが挙げられる。リアーゼの例としては、アルドラーゼお
よびヒドロキシニトリルリアーゼ(hydroxynitrile lyase
)が挙げられる。オキシドレダクターゼの例としては、ペルオキシダーゼ、ラッ
カーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼおよび他のデヒ
ドロゲナーゼが挙げられる。他の酵素としては、セルラーゼおよびオキシダーゼ
が挙げられる。
【0135】 治療用タンパク質または予防用タンパク質の例としては、ホルモン(例えば、
インスリン、グルカゴン(glucogon)様ペプチド1および副甲状腺ホル
モン)、抗体、インヒビター、増殖因子、postridicalホルモン、神
経成長ホルモン、血液凝固(blood clotting)因子、接着分子、
骨形態発生タンパク質(bone morphogenic protein)
およびレクチン栄養因子)、サイトカイン(例えば、TGF−β、IL−2、I
L−4、α−IFN、β−IFN、γ−IFN、TNF、IL−6、IL−8、
リンホトキシン、IL−5、遊走阻止因子、GMCSF、IL−7、IL−3、
単球−マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、多剤耐性タ
ンパク質、他のリンホカイン、トキソイド、エリトロポイエチン、第VIII因
子、アミリン、TPA、ドルナーゼ−α、α−1−抗トリプシン、ヒト成長ホル
モン、神経成長ホルモン、骨形態発生タンパク質、ウレアーゼ、トキソイド、受
胎ホルモン(FSHおよびLSH)が挙げられる。
【0136】 以下のような治療用タンパク質もまた含まれる: 白血球マーカー(例えば、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7
、CD8、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD1
8、CD19、CE20、CD22、CD23、CD27およびそのリガンド、
CD28およびそのリガンド、B7.1、B7.2、B7.3、CD29および
そのリガンド、CD30およびそのリガンド、CD40およびそのリガンドgp
39、CD44、CD45およびアイソフォーム、Cdw52(Campath
抗原)、CD56、CD58、CD69、CD72、CTLA−4、LFA−1
ならびにTCR)、 組織適合性抗原(例えば、MHCクラスI抗原またはMHCクラスII抗原、
ルイスY抗原、SLex、SLey、SLeaおよびSLeb); インテグリン(例えば、VLA−1、VLA−2、VLA−3、VLA−4、
VLA−5、VLA−6およびLFA−1); 接着分子(例えば、Mac−1およびp150、95); セレクチン(例えば、L−セレクチン、P−セレクチンおよびE−セレクチン
ならびにそれらの対応するレセプターVCAM−1、ICAM−1、ICAM−
2およびLFA−3); インターロイキン(例えば、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL
−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−10、IL−11、IL−12、
IL−13、IL−14およびIL−15); インターロイキンレセプター(例えば、IL−1R、IL−2R、IL−4R
、IL−5R、IL−6R、IL−7R、IL−8R、IL−10R、IL−1
1R、IL−12R、IL−13R、IL−14RおよびIL−15R); ケモカイン(例えば、PF4、RANTES、MIP1α、MCP1、NAP
−2、Groα、GroβおよびIL−8); 増殖因子(例えば、TNFα、TGFβ、TSH、VEGF/VPF、PTH
rP、EGFファミリー、EGF、PDGFファミリー、エンドセリンおよびガ
ストリン放出ペプチド(GRP)); 増殖因子レセプター(例えば、TNFαR、RGFβR、TSHR、VEGF
R/VPFR、FGFR、EGFR、PTHrPR、PDGFRファミリー、E
PO−R;GCSF−Rおよび他の造血レセプター; インターフェロンレセプター(例えば、IFNαR、IFNβRおよびIFN
γR); Igおよびそれらのレセプター(例えば、IgE、FceRIおよびFceR
II); 血液因子(例えば、補体C3b、補体C5a、補体C5b−9、Rh因子、フ
ィブロネクチン、フィブリンおよびミエリン関連増殖インヒビター)。
【0137】 本発明の処方物および組成物のタンパク質成分は、任意の天然タンパク質抗原
、合成タンパク質抗原または組換えタンパク質抗原であり得、例えば、破傷風毒
素、ジフテリア(diptheria)毒素、ウイルス表面タンパク質(例えば
、CMV糖タンパク質B、HおよびgCIII、HTV−1エンベロープ糖タン
パク質、RSVエンベロープ糖タンパク質、HSVエンベロープ糖タンパク質、
EBVエンベロープ糖タンパク質、VZVエンベロープ糖タンパク質、HPVエ
ンベロープ糖タンパク質、インフルエンザウイルス糖タンパク質、肝炎ファミリ
ー表面抗原)、ウイルス性構造タンパク質、ウイルス性酵素、寄生生物性タンパ
ク質、寄生生物性糖タンパク質、寄生生物性酵素ならびに細菌性タンパク質を含
む。
【0138】 腫瘍抗原(例えば、her2−neu、ムチン、CEAおよびエンドシアリン
(endosialin))もまた含まれる。アレルゲン(例えば、ハウスダス
トダニ抗原、lol p1(草)抗原およびウルシオール)が含まれる。
【0139】 毒素(例えば、シュードモナスエンドトキシンおよびオステオポンチン/ウロ
ポンチン(uropontin)、ヘビ毒液およびハチ毒液)が含まれる。
【0140】 糖タンパク質腫瘍関連抗原(例えば、癌胎児抗原(CEA)、ヒトムチン、h
er−2/neuおよび前立腺特異的抗原(PSA)[R.A.Henders
onおよびO.J.Finn、Advances in Immunology
、62、217−56頁(1996)])も含まれる。
【0141】 (投与および生物学的送達) これまでに、治療用タンパク質は、それらのごくわずかな経口生物利用能およ
び血漿中での短い生存という特徴のために、一般に、頻繁な注射により投与され
ていた。本発明のタンパク質結晶処方物および組成物は、タンパク質薬物につい
ての微粒子ベースの徐放系を含み、患者のコンプライアンスおよびコンビニエン
スの改善、より安定した血液レベルおよび可能用量の減少を有利に許容する。本
発明の緩やかでかつ一定した放出能力は、投薬量を有利に減少させ得る。これは
、活性タンパク質のより効率的な送達に起因する。有意なコストの節約は、本明
細書中に記載のタンパク質処方物および組成物を用いて達成され得る。
【0142】 本発明に従うポリマー送達キャリア中にタンパク質結晶を含む処方物および組
成物はまた、ワクチン、医薬品、個人医療処方物および組成物、獣医学的処方物
、または経口酵素補充において使用される、任意の慣習的なキャリアまたはアジ
ュバントを含み得る。これらのキャリアおよびアジュバントとしては、例えば、
フロイントアジュバント、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム
、レシチン、緩衝物質(ホスフェート)、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カ
リウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質(例
えば、硫酸プロタミン)、リン酸水素ニナトリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、
コロイド状シリカ、マグネシウム、トリケイ酸塩、セルロースベースの物質およ
びポリエチレングリコールが挙げられる。局所形態またはゲルベース形態のため
のアジュバントとしては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポ
リアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマ
ー、ポリエチレングリコールおよび樹木のワックスアルコールが挙げられる。
【0143】 本発明の1つの実施態様に従って、タンパク質結晶は、制御放出投与(医薬品
制御放出投与を含む)に使用される任意の従来の材料と組合わせられ得る。この
ような材料としては、例えば、コーティング、殻およびフィルム(例えば、腸溶
性コーティングならびにポリマーコーティングおよびフィルム)が挙げられる。
【0144】 本発明に従うポリマー送達キャリアおよび組成物(組成物)におけるタンパク
質処方物は、移植可能なデバイスのようなデバイスであり得、そして微粒子タン
パク質送達系であり得る。
【0145】 本発明の1つの実施態様において、高分子結晶は、約0.01μmと約500
μとの間、あるいは約0.1μmと約100μmとの間の最も長い寸法を有する
。最も好ましい実施態様は、タンパク質結晶処方物成分のタンパク質結晶は、そ
れらの最も長い寸法において約50μmと約100μmとの間であることである
。このような結晶は、球状、針状、棒状、プレート状(例えば、五角形および正
方形)、菱形、立方形、二錘形(bipyramids)および柱形からなる群
より選択される形状を有し得る。
【0146】 本発明に従って、組成物を作製するための、ポリマーキャリア中のタンパク質
結晶またはタンパク質結晶処方物のカプセル化は、架橋されたまたは非架橋のタ
ンパク質結晶について実行され得る。このようなタンパク質結晶は、市販されて
いるかまたは本明細書中に例示されるように生成され得る。
【0147】 本発明に従うタンパク質または核酸結晶もしくは結晶処方物および組成物は、
化粧品(例えば、クリーム、ローション剤、乳液、泡、洗剤、コンパクト、ジェ
ル、ムース、スラリー、粉末、スプレー、ペースト、軟膏(ointment)
、軟膏(salve)、香膏、ドロップ、シャンプーおよび日焼け止め剤)を含
む個人医療用組成物における成分として使用され得る。例えば、局所用クリーム
およびローション剤において、それらは、湿潤剤としてか、または皮膚の保護、
軟化、脱色、洗浄、除タンパク質剤、脂質除去、湿潤、漂白、着色または解毒す
るために使用され得る。それらはまた、化粧品中の抗酸化剤として使用され得る
【0148】 本発明に従って、任意の個体(ヒト、動物および植物を含む)は、それらがあ
る期間にわたって投与された個体における状態を処置するのに十分な期間、薬学
的に有効な量のタンパク質もしくは核酸結晶物または結晶処方物または結晶組成
物を用いて、薬学的に受容可能な様式で処置され得る。あるいは、個体は、それ
らがある期間にわたって投与される個体における状態を予防するのに有効である
、本発明のタンパク質あるいは核酸結晶もしくは結晶処方物または組成物の予防
的有効量を受容され得る。
【0149】 タンパク質もしくは核酸結晶または結晶処方物または結晶組成物は、単独で、
またはアジュバントを伴うもしくは伴わない薬学的調製物、個人医療用調製物ま
たは獣医学的調製物の一部としてか、あるいは予防用調製物(例えば、ワクチン
)の一部として、投与され得る。それらは、非経口経路かまたは経口経路により
投与され得る。例えば、それらは、経口、肺、鼻、耳、肛門、皮膚、眼、静脈内
、筋肉内、動脈内、腹腔内、粘膜、舌下、皮下、または頭蓋内経路により投与さ
れ得る。薬学的、個人治療的または獣医学的適用のいずれかにおいて、タンパク
質もしくは核酸結晶または結晶処方物または結晶組成物は、任意の上皮表面に局
所的に投与され得る。このような上皮表面としては、口、眼、耳、肛門および鼻
表面が挙げられ、これらは、タンパク質もしくは核酸結晶または結晶処方物また
は結晶組成物の適用により処置、保護、修復または解毒され得る。
【0150】 本発明に従うタンパク質もしくは核酸結晶または結晶処方物または結晶組成物
を含む薬学的、個人治療用、獣医学的または予防的処方物および組成物はまた、
錠剤、リポソーム、顆粒、球、微粒子、マイクロスフェアおよびカプセルからな
る群より選択され得る。
【0151】 このような使用、および本発明に従う他の使用について、タンパク質あるいは
核酸結晶もしくは結晶処方物および組成物は、錠剤中に処方され得る。このよう
な錠剤は、扱いが容易でかつ活性または能力の受容可能なレベルを保持するタン
パク質もしくは核酸結晶または結晶処方物または結晶組成物の貯蔵のための、液
体なし、ホコリなしの形態で構成される。
【0152】 あるいは、タンパク質もしくは核酸結晶または結晶処方物または結晶組成物は
、反応組成物を提供する投与のために使用される種々の都合良い貯蔵物形態であ
り得る。これらは、例えば、固体、半固体および液体形態(例えば、液体溶液ま
たは懸濁液、スリラー、ジェル、クリーム、香膏、乳液、ローション、粉末、ス
プレー、泡、ペースト、軟膏(ointment)、軟膏(salve)、香膏
およびドロップ)を含む。
【0153】 本発明に従うタンパク質もしくは核酸結晶または結晶処方物または結晶組成物
はまた、薬学的組成物、個人医療用組成物または獣医学的処方物において使用さ
れる任意の従来のキャリアまたはアジュバントを含み得る。これらのキャリアは
およびアジュバントには、例えば、フロイントアジュバント、イオン交換体、ア
ルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、緩衝物質(ホスフェート)、グ
リシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分的グリセリ
ド混合物、水、塩または電解質(例えば、硫酸プロタミン)、リン酸水素二ナト
リウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、マグネシウム、トリケイ
酸塩、セルロースベースの物質およびポリエチレングリコールが挙げられる。局
所的またはゲルベース形態のためアジュバントは、例えば、カルボキシメチルセ
ルロース、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ブ
ロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび樹木ワックスアルコールを含み
得る。
【0154】 本発明のタンパク質もしくは核酸結晶または結晶処方物または結晶組成物の最
も有効な投与形態および投薬レジメは、所望の効果、以前の治療(もしあれば)
、個人の健康状態または症状自体の状態、ならびにタンパク質もしくは核酸結晶
または結晶処方物または結晶組成物に対する応答、ならびに処置する医師または
臨床医の判断に依存する。このタンパク質もしくは核酸結晶または結晶処方物ま
たは結晶組成物は、ある時点かまたは一連の処置にわたる、薬学的、ワクチン接
種、遺伝子治療、免疫治療、個人医療用組成物または獣医学的処方物に受容可能
な任意の投薬形態において処方され得る。
【0155】 単回投薬を提供するタンパク質もしくは核酸結晶または結晶処方物または結晶
組成物の量は、投与、処方、投薬レベルまたは投薬頻度の特定の様式に依存して
変化する。代表的な調製物は、約0.01%と約99%との間、好ましくは約1
%と約50%との間の、タンパク質結晶または核酸結晶(W/W)を含む。ある
いは調製物は、約0.01%と約80%との間のタンパク質結晶、好ましくは約
1%と約50%との間のタンパク質結晶(W/W)を含む。あるいは、調製物は
、約0.01%と約80%との間のタンパク質結晶処方物、好ましくは約1%と
約50%との間のタンパク質結晶処方物(W/W)を含む。
【0156】 個体の状態の改善の際、タンパク質もしくは核酸結晶または結晶処方物または
結晶組成物の維持用量が、必要ならば投与され得る。続いて、投与の投薬量また
は頻度、あるいはその両方は、改善された状態が維持されるレベルまで、症状の
関数として減少され得る。症状が所望のレベルまで緩和された場合、処置は、止
めるべきである。しかし、個体は、それらの状態または症状のいずれの再発に基
づき、長期において、断続的な処置を必要とし得る。
【0157】 (結晶、結晶処方物、および結晶組成物の産生) 本発明の1つの実施態様に従って、結晶、結晶処方物、および結晶組成物が、
以下の工程によって調製される:最初に、タンパク質または核酸が結晶化される
。次に、糖、糖アルコール、粘度増加剤、湿潤剤もしくは可溶化剤、緩衝塩、乳
化剤、抗菌剤、抗酸化剤、および被覆剤から選択される賦形剤または成分が、母
液に直接的に添加される。あるいは、結晶は、母液が除去された後に最少で1時
間から最大で24時間までの間、賦形剤溶液中に懸濁される。賦形剤濃度は、代
表的には、約0.01〜30%重量/重量である。最も好ましくは、約0.1〜
10%である。成分濃度は、約0.01〜90%である。結晶濃度は、約0.0
1〜95%である。次いで、濾過によるかまたは遠心分離によるかのいずれかに
よって、結晶スラリーから母液を取り除く。引き続いて、必要に応じて50〜1
00%の1つ以上の有機溶媒(例えば、エタノール、メタノール、イソプロパノ
ール、または酢酸エチルのような)の溶液を用いて、室温または−20℃〜25
℃の温度のいずれかにて、結晶を洗浄する。結晶を、その結晶上に窒素流、空気
流、不活性ガス流のいずれかを通すことによって、乾燥させる。あるいは、風乾
によって、または凍結乾燥法によって、または真空乾燥によって、結晶を乾燥さ
せる。この乾燥は、洗浄後に最少で1時間から最大で72時間までの間、最終産
物の水分含有率が10%重量未満、最も好ましくは5%未満になるまで実施され
る。最終的に、必要であれば、結晶の微粉化が実施され得る。
【0158】 本発明の1つの実施態様に従って、タンパク質結晶、タンパク質結晶処方物ま
たはタンパク質結晶組成物を調製する場合、エンハンサー(例えば、界面活性剤
)は、結晶化の間には添加されない。賦形剤または成分は、約1〜10%重量/
重量の濃度で、あるいは約0.1〜25%重量/重量の濃度で、あるいは約0.
1〜50%重量/重量の濃度で、結晶化の後に母液に添加される。賦形剤または
成分は、結晶と共に母液中において、約0.1〜3時間インキュベートされる。
あるいは、このインキュベーションは、0.1〜12時間実施される。あるいは
、このインキュベーションは、0.1〜24時間実施される。
【0159】 本発明の別の実施態様において、成分または賦形剤は母液以外の溶液中に溶解
され、そしてタンパク質結晶は、母液から取り出されて、そしてこの賦形剤溶液
または成分溶液中に懸濁される。成分または賦形剤の濃度およびインキュベーシ
ョン時間は、上記の濃度および時間と同じである。
【0160】 (徐放形態および徐放ワクチン) 本発明の別の実施態様において、ポリマーキャリア中でのリパーゼのカプセル
化は、腸リパーゼ欠損に罹患している患者を処置するために有用な組成物を提供
する。そのような患者としては、膵性脂肪便を有する患者が挙げられる。これは
、進行型の膵性機能不全が、経口的なリパーゼ補充を必要とするためである。不
幸なことに、現在の治療方法は、胃腸管を通して移動する間に活性なリパーゼを
保護し、そして小腸内でこの酵素活性が臨床的に必要とされる箇所でこの酵素活
性を放出するのに十分な程に順応的ではあり得ない(L.Guarnerら、「
Fate of oral enzymes in pancreatic i
nsufficiency」、Gut、第34巻、第708〜712頁(199
3)を参照のこと)。緩徐に有効な活性リパーゼを調製する際の本発明の順応性
は、リパーゼ補充としばしば関連する現在の問題点を解決する。本発明の1つの
実施態様に従って、カプセル化リパーゼ結晶(組成物)と、非カプセル化架橋リ
パーゼ結晶または非カプセル化架橋リパーゼ処方物との組合わせは、薬物療法レ
ジメンを提供する。この薬物療法レジメンにおいて、酵素活性は、早くから、非
カプセル化架橋リパーゼから利用可能である。この物質がタンパク質分解性の分
解を受けるにつれて、カプセル化酵素(組成物)は、より遠位の腸内へと酵素活
性を放出し始める。類似のストラテジーが、他の酵素または治療用タンパク質の
補充の問題を解決するために使用され得る。
【0161】 本発明はまた、他の徐放方法論(例えば、ホルモン、抗体もしくは酵素、また
はそれらを含有する組成物を含むカプセル化タンパク質結晶で予め負荷されてい
る、シリコンベースの環(ring)または桿(rod))を利用し得る。本発
明の技術の目的は、数週間または数ヶ月の期間にわたって、血流に一定レベルの
タンパク質を提供することである。そのようなインプラントは、皮内に挿入され
得、そして必要とされる場合に、安全に置換および除去され得る。
【0162】 本発明に従う他の処方物および組成物としては、タンパク質(抗原)結晶、ア
ジュバント、およびカプセル化ポリマーを含むワクチン処方物およびワクチン組
成物が挙げられる。タンパク質抗原は、ウイルス性糖タンパク質、ウイルス性構
造タンパク質、ウイルス性酵素、細菌性タンパク質、またはウイルス性もしくは
細菌性タンパク質の幾分操作されたホモログ、あるいは任意の免疫増強タンパク
質(例えば、サイトカイン)であり得る。そのような処方物または組成物の1つ
の実施態様としては、3つ以上の異なる放出プロフィールを有するマイクロスフ
ェアを含有する単回ワクチン注射が挙げられる。この様式において、抗原処方物
または抗原組成物は、永続する免疫性を生成するのに十分な持続期間にわたって
、放出され得る。この処方物または組成物によって、複数の抗原ブーストは、一
回単位の形態であり得る。より早い分解調製物(組成物)は、免疫応答を増強す
るために免疫原アジュバントを含み得る。そのような系の1つの利点は、タンパ
ク質結晶を用いることによって、このエピトープのネイティブの三次元構造が維
持され、そしてそれらのネイティブ形態で免疫系に提示されるということである
【0163】 一旦、免疫系が初回抗原刺激を受けると、アジュバント効果に対する必要性は
少なくなり得る。従って、より緩徐に分解される接種においては、より少ない抗
原性アジュバントが含められ得、そしてこの処方物および組成物の最も緩徐に分
解されるマイクロスフェアにおいては、おそらくアジュバントは全く必要とされ
得ない。この様式において、遠隔地にある患者集団は、感染疾患に対する防御を
提供するために、複数回処置される必要がない。タンパク質の生物学的送達につ
いての当業者は、このテーマに対して多くの改変が可能であることを認識する。
従って、本明細書中に提供される実施例は、本発明を制限することを意図しない
【0164】 本発明の別の実施態様においては、混合ワクチンが産生され得、それによって
一回の注射で複数の疾患に対する免疫が誘導される。上記のように、異なる放出
プロフィールを有するマイクロスフェアは、単独で、または処方物および組成物
において組合わせられ得る。そしてこれには、混合ワクチン(処方物および組成
物)を産生するための複数の病原菌由来の抗原を含むマイクロスフェアが挙げら
れ得る。例えば、複数の放出プロフィールを有し、そして麻疹、おたふくかぜ、
風疹、ポリオ、およびB型肝炎の因子の抗原結晶を含有するマイクロスフェアが
合わせられ得、そして小児に投与され得る。あるいは、複数の放出プロフィール
を有し、そしてHIV gp120の異なる分離菌の結晶を含有するマイクロス
フェアが、HIV−1またはHIV−2のためのワクチンを産生するために合わ
せられ得る。
【0165】 本発明の別の利点は、ポリマーキャリア内にカプセル化され、そしてマイクロ
スフェアを含有する組成物を形成しているタンパク質結晶が、凍結乾燥法によっ
て乾燥され得るということである。凍結乾燥法(lyophilization
)(すなわち、凍結乾燥(freeze−drying))は、組成物から水分
を分離させる。タンパク質結晶組成物は、最初に凍結され、次いで高真空下に置
かれる。真空下で、結晶のH2Oは昇華し、わずかな結合水のみを含むタンパク
質結晶組成物が残される。そのような工程は、この組成物をさらに安定化させ、
そして代表的に遭遇する周囲温度でのより簡便な貯蔵および輸送を可能にする。
【0166】 この特徴は、特に、処方物または組成物における、単回用量の滅菌容器(「ア
ンプル」)、あるいはスラリーのような単回用量の任意の所望増分に調剤され得
る治療用タンパク質およびワクチンについて望ましい。次いで、調剤されたスラ
リー、処方物または組成物を含むアンプルは、滅菌条件下で、キャップされ得、
バッチ凍結(batch frozen)され得、そして凍結乾燥され得る。そ
のような滅菌容器は、世界中にわたって輸送され得、そして周囲温度で貯蔵され
得る。そのような系は、遠隔地および世界の未開地域へと滅菌ワクチンおよび治
療用タンパク質を提供するために有用である。使用の時点で、このアンプルは、
選択された滅菌溶媒または滅菌緩衝液を用いて再水和され、そして投薬される。
このシナリオの下では、最小限の冷凍が必要とされるか、または冷凍は全く必要
とされない。
【0167】 (タンパク質結晶化) タンパク質結晶は、水溶液、または有機溶媒を含む水溶液からの制御されたタ
ンパク質結晶化によって発生する。制御され得る溶液の条件としては、例えば、
溶媒、有機溶媒のエバポレーション速度、適切な共存溶質および緩衝液の存在、
pHならびに温度が挙げられる。タンパク質の結晶化に作用する種々の因子につ
いての包括的な概説は、McPherson、Methods Enzymol
.114、第112〜20頁(1985)によって公表されている。
【0168】 McPhersonおよびGilliland、J.Crystal Gro
wth、90、第51〜59頁(1988)によって、結晶化されたタンパク質
および核酸、ならびにそれらが結晶化された条件の、包括的リストが編集されて
いる。結晶および結晶化処方の大要、ならびに解明されたタンパク質構造および
核酸構造の座標(coordinate)の収集所は、Brookhaven
National LaboratoryのProtein Data Ban
k(http//www.pdb.bnl.gov;Bernsteinら、J
.Mol.Biol.112、第535〜42頁(1977))によって維持さ
れる。これらの参照は、適切なタンパク質結晶の形成に対する前置きとして、タ
ンパク質の結晶化に必要とされる条件を決定するために使用され得、そして他の
タンパク質についての結晶化ストラテジーを導き得る。あるいは、多くの場合は
、多くのタンパク質について受容可能なレベルの純度が達成され得るという条件
で、知的な試行錯誤の研究ストラテジーによって、それらの適切な結晶化条件が
作り出され得る(例えば、C.W.Carter、Jr.およびC.W.Car
ter、J.Biol.Chem.、254、第12219〜23頁(1979
)を参照のこと)。
【0169】 一般的に、結晶は、結晶化されるべきタンパク質を、適切な水性溶媒または適
切な結晶化因子(例えば、塩または有機溶媒)を含有する水性溶媒と組合わせる
ことによって産生される。溶媒は、タンパク質と組合わせられ、そして結晶化の
誘導に適切であり、かつタンパク質の活性および安定性の維持のために受容可能
であることが実験的に決定された温度での攪拌に供され得る。この溶媒は、必要
に応じて、共存溶質(例えば、二価のカチオン、補因子、またはカオトロープ)
、ならびにpHを制御するための緩衝液種を含み得る。共存溶質の必要性および
それらの濃度は、結晶化を促進させるために実験的に決定される。
【0170】 非晶質沈殿物と結晶性物質との間を識別することが重要である。結晶性物質は
、物質の固体状態の形態であり、これは非晶質の固体状態とは異なる。結晶は、
格子構造、特徴的形状、および光学的特徴(例えば、屈折率および複屈折)を含
む特徴的な特性を示す。結晶は、三次元において周期的に繰り返されるパターン
で配置される原子からなる。対照的に、非晶質物質は、物質の非結晶性固体状態
であり、時として非晶質沈殿物といわれる。そのような沈殿物は、結晶性固体状
態に特徴的な分子格子構造を全く有さず、そして複屈折、または物質の結晶性形
態に代表的な他の分光学的特徴を示さない。
【0171】 産業的スケールの工程においては、結晶化へと導く制御された沈殿析出は、バ
ッチプロセスにおけるタンパク質、沈殿剤、共存溶質、および必要に応じて緩衝
液を単純に組合わせることによって、最良に実施され得る。別の選択肢として、
タンパク質は、出発物質としてタンパク質沈殿物を使用することによって結晶化
され得る。この場合、タンパク質沈殿物を結晶化溶液に添加し、そして結晶形成
までインキュベートする。代替的な研究室での結晶化方法(例えば、透析または
拡散蒸着)もまた、採択され得る。McPherson(前出)およびGill
iland(前出)は、結晶化の文献についてのそれらの概説において、適切な
条件の包括的リストを包含する。
【0172】 時折、結晶化タンパク質が架橋されるべき場合において、意図される架橋剤と
結晶化媒質との間の不適合性は、結晶をより適切な溶媒系に交換することを必要
とし得る。
【0173】 結晶化条件がすでに記載されている多くのタンパク質が、本発明に従ってタン
パク質結晶を調製するために使用され得る。しかし、上記に引用された参考文献
の大半において報告された条件は、多くの場合、わずかに大きな、回折の質の結
晶(diffraction quality crystal)を産生するよ
うに最適化されていることに留意すべきである。従って、本発明のタンパク質結
晶を作製する際に使用される、より少ない結晶の大規模産生のための高収量工程
を提供するために、これらの条件を幾分調整することが必要とされ得るというこ
とが当業者によって認識される。
【0174】 (タンパク質結晶の架橋) 本発明の1つの実施態様によると、例えば、ポリマーキャリア(組成物)から
のタンパク質の放出速度は、ゆっくりであり得、そしてクロスリンカー(例えば
、生体適合性のクロスリンカーのような)を使用して化学的に架橋したタンパク
質結晶の使用により制御され得る。従って、一旦タンパク質結晶が、好適な培地
中で増殖されると、クロスリンカーされ得る。
【0175】 架橋は、可逆性のクロスリンカー(並行にまたは順に)を使用して実行され得
る。得られた架橋タンパク質結晶は、反応性の多機能性(multi−func
tional)リンカーにより特徴付けられる。トリガーは、別の基として取り
込まれる。反応性官能基(functionality)は、タンパク質の反応
性アミノ酸側鎖をともに結合させることに関与し、そしてトリガーは、周囲の環
境の1つ以上の条件(例えば、pH、温度、または熱力学的な水の活性)を変化
させることにより破壊され得る結合からなる。これは以下のように例示される: X−Y−Z + 2AA残基 −−>AA1−X−Y−Z−AA2 環境の変化 −−>AA1−X + Y−Z−AA2 −−ここで、XおよびZは、反応性官能基を有する基であり、 −−ここで、Yは、トリガーであり、 −−ここで、AA1およびAA2は、同じタンパク質上かまたは2つの異なるタ
ンパク質上の反応性アミノ酸残基を示す。架橋剤とタンパク質との間の結合は、
共有結合、イオン結合、または水素結合であり得る。周囲の環境の変化は、トリ
ガー結合の切断およびタンパク質の解離を生じる。従って、このような可逆性の
架橋剤と架橋したタンパク質結晶内の架橋が切断した場合、タンパク質結晶の解
離を生じ、従って、活性を失う。
【0176】 あるいは、クロスリンカーのおよびトリガーの反応性官能基は、以下のように
同じであり得る: X−Z + 2AA残基 −−>AA1−X−Z−AA2 環境の変化 −−>AA1 + X−Z−AA2
【0177】 クロスリンカーは、同種官能基(X=Y)または異種官能基(Xは、Yと同じ
ではない)であり得る。反応性官能基XおよびYは、以下の官能基であり得るが
それらに限定されない(ここで、R、R’、R”およびR’”は、アルキル基、
アリール基または水素基であり得る): I.反応性アシル供与体は、以下により例示される:カルボキシレートエステ
ルRCOOR’、アミドRCONHR’、アシルアジドRCON3、カルボジイ
ミドR−N=C=N−R’、N−ヒドロキシイミドエステルRCO−O−NR’
、イミドエステルR−C=NH2’(OR’)、無水物RCO−O−COR’、
カルボネートRO−CO−O−R’、ウレタンRNHCONHR’、酸性ハロゲ
ン化物RCOHal(ここで、Halは、1つのハロゲンである)、アシルヒド
ラジドRCONNR’R”、O−アシリスキュアー(acyliscurea)
RCO−O−C=NR’(−NR”R’”)。
【0178】 II.反応性カルボニル基は、以下により例示される:アルデヒドRCHO、
およびケトンRCOR’、アセタールRCO(H2)R’、ケタールRR’CO2 R’R”。タンパク質の固定化および架橋の当業者に公知の官能基を含む反応性
カルボニルは、以下の文献に記載される[Pierce Catalog an
d and Handbook、Pierce Chemical Compa
ny、Rockford、Illinois(1994);S.S.Wong、
Chemistry of Protein Conjugation and
Cross−Linking、CRC Press、Boca Raton、
Florida(1991)]。
【0179】 III.アルキルまたはアリール供与体は、以下により例示される:アルキル
ハロゲン化物またはアリールハロゲン化物R−Hal、アジドR−N3、硫酸エ
ステルRSO3R’、リン酸エステルRPO(OR’3)、アルキルオキソニウム
塩R3O+、スルホニウムR3S+、硝酸エステルRONO2、Michaelア
クセプターRCR’=CR’”COR”、フッ化アリールArF、イソニトリル
【0180】
【化1】 ハロアミン(haloamine)R2N−Hal、アルケンおよびアルキン。
【0181】 IV.硫黄含有基は、以下により例示される:ジスルフィドRSSR’、スル
フヒドリルRSH、エポキシド
【0182】
【化2】 V.塩は以下により例示される;アルキルアンモニウム塩またはアリールアン
モニウム塩R4N+、カルボキシレートRCOO−、スルフェートROSO3−、
ホスフェートROPO3”およびアミンR3N。
【0183】 以下の表1は、放出機構により体系付けられるトリガーの例を挙げる。表1に
おいて、R=は、多機能架橋剤であり、これは、アルキル、アリール、または架
橋すべきタンパク質と反応し得る活性基を有する他の鎖であり得る。これらの反
応基は、任意の種々の基(例えば、求核置換、フリーラジカル置換、または求電
子置換に感受性の基(特に、ハロゲン化物、アルデヒド、カルボネート、ウレタ
ン、キサンタン、エポキシドを含む))であり得る。
【0184】
【表1】 可逆性クロスリンカーのさらなる例は、T.W.Green、Protect
ive Groups in Organic Synthesis、John
WileyおよびSons(編)(1981)に記載される。可逆性保護基に
使用するための任意の種々のストラテジーは、可逆性の制御された可溶化が可能
な、架橋されたタンパク質結晶の生成に好適なクロスリンカー中に導入され得る
。種々のアプローチが、この主題のWaldmannの総説(Angewant
e Chemie Inl.Ed.Engl.35、2056頁(1996))
に列挙される。
【0185】 可逆性クロスリンカーの他の型は、ジスフィルド結合含有クロスリンカーであ
る。このようなクロスリンカーにより形成されたトリガー破損架橋は、還元剤(
例えば、システイン)の架橋したタンパク質結晶環境への添加である。
【0186】 ジスフィルドクロスリンカーは、Pierce Catalog and H
andbook(1994−1995)に記載され、そしてより最近には、G.
T.Hermansonによる「Bioconjugate Techniqu
es」、(1996)、Academic Press、Division o
f Harcourt Brace and Company、525 B S
treet、Suite 1990、San Diego、CA 92101−
4495に記載される。 このようなクロスリンカーの例は、以下を含む: (同種二官能性(対称性)) (DSS)− ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)、Lomant
剤としても知られる (DTSSP)−3−3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネー
ト)、DSPの水溶性版 (DTBP)− ジメチル3,3’−ジチオビスプロピオンイミデート・HCl
。 (BASED)− ビス−(β−[4−アジドサリチルアミノ]エチル)ジスル
フィド (DPDPB)− 1,4−ジ−(3’−[2’−ピリジルジチオ]−プロピオ
ンアミド)ブタン (異種二官能性(非対称性)) (SPDP)− N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオ
ネート (LC−SPDP)− スクシンイミジル−6−(3−[2−ピリジルジチオ]
プロピオネート)ヘキサノエート (スルホ−LC−SPDP)− スルホスクシンイミジル−6−(3−[2−ピ
リジルジチオ]プロピオネート)ヘキサノエート、LC−SPDPの水溶性版 (APDP)− N−(4−[p−アジドサリチルアミド]ブチル)−3’−(
2’−ピリジルジチオ)プロピオンアミド (SADP)− N−スクシンイミジル(4−アジドフェニル)1,3’−ジチ
オプロピオネート (スルホ−SADP)− スルホスクシンイミジル(4−アジドフェニル)1,
3’−ジチオプロピオネート、SADPの水溶性版 (SAED)− スルホスクシンイミジル−2−(7−アジド−4−メチルクマ
リン(methycoumarin)−3−アセトアミド)エチル−1,3’ジ
チオプロピオネート (SAND)− スルホスクシンイミジル−2−(m−アジド−o−ニトロベン
ズアミド)エチル−1,3’−ジチオプロピオネート (SASD)− スルホスクシンイミジル−2−(p−アジドサリチルアミド)
エチル−1,3’−ジチオプロピオネート (SMPR)− スクシンイミジル−4−(p−マレイミドフェニル)ブチレー
ト (スルホ−SMPR)− スルホスクシンイミジル−4−(p−マレイミドフェ
ニル)ブチレート (SMPT)− 4−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α−(2−
ピリジルチオ)トルエン (スルホ−LC−SMPT)− スルホスクシンイミジル−6−(α−メチル−
α−(2−ピリジルチオ)トルアミド)ヘキサノエート。
【0187】 詳細には、G.T.Hermanson、(1996)、Academic
Press、Division of Harcourt Brace & C
ompany、525 B Street、Suite 1900、San D
iego、CA 92101−4495による「Bioconjugate T
echniques」の、Zero−length Cross−linker
s、Homobifunctional Cross−linkers and
Heterobifunctional Cross−linkersのII
部、3−5章を参照のこと。
【0188】 本発明のタンパク質の形成に有用な架橋タンパク質結晶はまた、PCT特許出
願PCT/US91/05415に示される方法に従って調製され得る。
【0189】 (ポリマーキャリアにおけるタンパク質結晶のカプセル化) 本発明の1つの実施態様によると、組成物は、タンパク質結晶が少なくとも1
つのポリマーキャリアにおいて、カプセル化によりマイクロスフェア形態になる
ように、ポリマーキャリアのマトリックスとともにカプセル化される場合、それ
らのネイティブな三次構造および生物学的に活性な三次構造を保存するように生
成される。結晶は、異なる生物学的環境への送達または特定の機能に効果を及ぼ
すために好適な独特の特性を有する、種々の生体適合性および/または生分解性
ポリマーを使用してカプセル化され得る。従って、活性なタンパク質の溶解速度
および送達速度は、特定のカプセル化技術、ポリマー組成物、ポリマー架橋、ポ
リマーの厚さ、ポリマー溶解度、タンパク質結晶の相対位置および程度、ならび
にもしあれば、タンパク質結晶架橋の相対位置および程度により決定される。
【0190】 カプセル化されるタンパク質の結晶または処方物は、有機溶媒に溶解したポリ
マーキャリアに懸濁される。ポリマー溶液は、溶液に添加された後、タンパク質
の結晶または処方物を完全に被膜するに十分な濃度に濃縮されなければならない
。このような量は、約0.02と約20との間、好ましくは、約0.1と約2と
の間のポリマーに対するタンパク質結晶の重量比を提供する量である。タンパク
質結晶は、約0.5分と約30分の間、好ましくは約1分と約3分との間の時間
の間、溶液中のポリマーと接触される。結晶は、懸濁されたままであるべきであ
るべきであり、そしてポリマーと接触させることにより結晶は被膜されるので、
凝集し得ない。
【0191】 その接触後、結晶は被膜され、そして新生マイクロスフェアと呼ばれる。新生
マイクロスフェアは、被膜化が起こっている間大きさが増加する。本発明の好ま
しい実施態様において、ポリマーキャリアおよび有機溶媒とともに懸濁された被
膜化結晶または新生ミクロスエフェアは、乳化剤として公知の界面活性剤を含む
大量の水溶液に移される。この水溶液において、懸濁された新生マイクロスフェ
アは、水相に浸漬され、ここで、有機溶媒は、エバポレートするか、またはポリ
マーから拡散させる。最終的に、ポリマーは、もはや可溶性ではなく、そしてタ
ンパク質結晶または処方物をカプセル化して組成物を形成した沈殿相を形成する
点に達する。このプロセスのこの局面は、ポリマーキャリアまたはポリマーの硬
化といわれる。乳化剤は、硬化相プロセスの間の系での物質の種々の相間の界面
の表面張力を低減するのを助ける。あるいは、被膜ポリマーが、いくらかの固有
の界面活性を有する場合、別の界面活性剤を添加する必要はない。
【0192】 カプセル化タンパク質結晶を本発明に従って調製するために有用な乳化剤とし
ては、ポリマー被覆タンパク質結晶もしくはポリマー被覆結晶処方物と溶液との
間の表面張力を減少し得る、本明細書に例示されるようなポリ(ビニルアルコー
ル)、界面活性剤および他の表面活性剤が挙げられる。
【0193】 本発明のマイクロスフェアを調製するために有用な有機溶媒としては、塩化メ
チレン、酢酸エチル、クロロホルムおよび他の非毒性溶媒が挙げられ、これらは
ポリマーの特性に依存する。ポリマーを溶解しそして究極的には非毒性である溶
媒が、選択されるべきである。
【0194】 本発明の好ましい実施態様は、タンパク質結晶の結晶性が、カプセル化過程の
間維持されることである。結晶性は、被覆過程の間、有機溶媒を使用して維持さ
れる(ここにおいては、結晶は可溶性ではない)。続いて、一旦被覆された結晶
が水性溶媒に移されると、先の工程でのポリマーキャリアの迅速な硬化および結
晶の十分な被覆が、溶解から結晶性材料を保護する。他の実施態様において、架
橋されたタンパク質結晶の使用は、水性溶媒および有機溶媒の両方において、結
晶性の維持を容易にする。
【0195】 タンパク質結晶を被覆するために、ポリマーキャリアとして使用されるポリマ
ーは、ホモポリマーまたはコポリマーのいずれかであり得る。マイクロスフェア
の加水分解速度は、大部分は、個々のポリマー種の加水分解速度によって決定さ
れる。一般的に、加水分解速度は、以下のように減少する:ポリカーボネート>
ポリエステル>ポリウレタン>ポリオルトエステル>ポリアミド。生分解性ポリ
マーおよび生体適合性ポリマーの総説については、W.R.Gombotzおよ
びD.K.Pettit、「Biodegradable polymers
for protein and peptide drug deliver
y」、Bioconjugate Chemistry、第6巻、332〜35
1頁(1995)を参照のこと。
【0196】 好ましい実施態様において、ポリマーキャリアは、PLGAのような単一のポ
リマー型からなる。次の好ましい実施態様において、ポリマーキャリアは、50
% PLGAおよび50%アルブミンのようなポリマーの混合物であり得る。
【0197】 本発明に従うカプセル化タンパク質結晶を調製するための、ポリマーキャリア
として有用な他のポリマーは、以下からなる群から選択される、生体適合性/生
分解性ポリマーを含む:ポリ(アクリル酸)、ポリ(シアノアクリレート)、ポ
リ(アミノ酸)、ポリ(無水物)、ポリ(デプシペプチド)、ポリ(エステル)
(例えば、ポリ(乳酸)もしくはPLA)、ポリ(b−ヒドロキシ酪酸)、ポリ
(カプロラクトン)およびポリ(ジオキサノン);ポリ(エチレングリコール)
、ポリ(ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド、ポリ[(オルガノ)ホスファ
ゼン(phosphazene)]、ポリ(オルトエステル)、ポリ(ビニルア
ルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、無水マレイン酸アルキルビニルエーテ
ルコポリマー、pluronicポリオール、アルブミン、アルギン酸、セルロ
ースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン
酸、オリゴサッカリド、グリカミノグリカン(glycaminoglycan
)、硫酸化ポリサッカリド、それらの混合物ならびにコポリマー。他の有用なポ
リマーは、J.HellerおよびR.W.Balar、「Theory an
d Practice of Controlled Drug Delive
ry from Biodegradable Polymers」Acade
mic Press,New York、NY、(1980);K.C.R.L
ehmanおよびD.K.Dreher,Pharmaceutical Te
chnology 第3巻、5− 頁(1979);E.M.Ramadan,
A.El−HelwおよびY.El−Said、Journal of Mic
roencapsulateion、第5巻、125頁(1988)に記載され
る。好ましいポリマーは、使用されるタンパク質結晶の特定のタンパク質成分、
およびカプセル化結晶(処方物および組成物)の意図される使用に依存する。あ
るいは、タンパク質結晶をカプセル化するために、溶媒エバポレーション技術が
使用され得る(D.Babay,A.HoffmannおよびS.Benita
,Biomaterials 第9巻、482−488頁(1988)を参照の
こと)。
【0198】 本発明の好ましい実施態様において、タンパク質結晶は、二重エマルジョン法
(double emulsion method)(本明細書中に例証される
)を使用して、ポリ乳酸−co−グリコール酸のようなポリマーを用いて、少な
くとも1つのポリマーキャリア中にカプセル化される。本発明の最も好ましい実
施態様において、ポリマーは、ポリ乳酸−co−グリコール酸(「PLGA」)
である。PLGAは、乳酸(「L」)とグリコール酸(「G」)とでの重縮合反
応により調製されるコポリマーである。PLGAポリマーの結晶性および疎水性
を調節するために、種々の割合のLおよびGが使用され得る。ポリマーのより高
度な結晶性は、結果としてより緩徐な溶解をもたらす。20〜70%のG含有量
を有するPLGAポリマーは、非結晶性固体である傾向があるが、GまたはLい
ずれかの高いレベルは、優れたポリマー結晶性をもたらす。PLGAの調製につ
いてのさらなる情報は、D.K.GildingおよびA.M.Reed、「B
iodegradable polymers for use in sur
gery−poly(glycolic)/poly(lactic acid
) homo and copolymers:1」Polymer 第20巻
、1459−1464頁(1981)を参照のこと。PLGAは、水への曝露後
、エステル結合の加水分解により分解されて、非毒性の乳酸およびグリコール酸
のモノマーを生成する。
【0199】 別の実施態様において、二重層(double−walled)ポリマー被覆
されたマイクロスフェアは、有益であり得る。二重層ポリマー被覆されたマイク
ロスフェアは、2つの別々のポリマー溶液を、塩化メチレンまたはポリマーを溶
解し得る他の溶媒中に調製することによって生成され得る。タンパク質結晶をこ
の溶液の一方に添加し、そして分散させる。ここで、このタンパク質結晶は、第
1のポリマーで被覆される。次いで、この第1のポリマーで被覆されたタンパク
質結晶を含む溶液を、第2のポリマー溶液と混合する。(Pekarek,K.
J.;Jacob,J.S.およびMathiowitz,E. Double
−walled polymer microspheres for con
trolled drug release,Nature,367,258−
260を参照のこと)。今度は、第2のポリマーが、タンパク質結晶をカプセル
化している第1のポリマーをカプセル化する。理想的には、次いで、この溶液を
、表面活性剤もしくは乳化剤を含む、より大きな容積の水溶液中に滴下する。水
溶液において、この溶媒は、2つのポリマー溶液からエバポレートされそしてポ
リマーを沈殿させる。
【0200】 上記の工程は、タンパク質結晶、DNA結晶またはRNA結晶のいずれかをこ
れらのいずれかの処方物中から使用して行われ、組成物を生成し得る。
【0201】 本発明に従う処方物は、タンパク質結晶および少なくとも1つの成分を含む。
このような処方物は、50℃で貯蔵された場合、50℃の溶液中でのこのタンパ
ク質の可溶性形態よりも、少なくとも60倍のより長い有効期限によって特徴付
けられる(T1/2によって測定した場合)。あるいは、このような処方物は、4
0℃および75%の湿度で貯蔵された場合、40℃および75%の湿度で貯蔵さ
れたこのタンパク質結晶の非処方物形態よりも、少なくとも59倍のより長い有
効期限によって特徴付けられる(T1/2によって測定した場合)。あるいは、こ
のような処方物は、50℃で貯蔵された場合、50℃で貯蔵されたこのタンパク
質結晶の非処方物形態よりも、少なくとも60%のより長い有効期限によって特
徴付けられる(T1/2によって測定した場合)。あるいは、このような処方物は
、50℃で4日間貯蔵された後のタンパク質のα−へリックス構造含有量の20
%未満の損失によって特徴付けられ、ここで、このタンパク質の可溶性形態は、
50℃で6時間貯蔵された後に、このタンパク質のα−へリックス構造含有量を
50%を超えて損失する(FTIRによって測定した場合)。あるいは、このよ
うな処方物は、50℃で4日間貯蔵された後のこのタンパク質のα−へリックス
構造含有量の20%未満の損失によって特徴付けれら、ここで、このタンパク質
の可溶性形態は、50℃で6時間貯蔵された後に、このタンパク質のα−へリッ
クス構造含有量を50%を超えて損失し(FTIRによって測定した場合)、そ
してここで、このような処方物は、50℃で貯蔵される場合に、50℃の溶液中
でのこのタンパク質の可溶性形態よりも、少なくとも60倍のより長い有効期限
によって特徴付けられる(T1/2によって測定した場合)。
【0202】 本発明に従う組成物は、上記のタンパク質結晶処方物のうちの1つ、および少
なくとも1つのポリマーキャリアを含み、ここで、この処方物は、このポリマー
キャリアのマトリックス中にカプセル化されている。
【0203】 あるいは、本発明に従う組成物は、タンパク質結晶および少なくとも1つの成
分の処方物を含む。このような組成物は、50℃で貯蔵された場合、50℃の溶
液中でのこのタンパク質の可溶性形態よりも、少なくとも60倍のより長い有効
期限によって特徴付けられ得る(T1/2によって測定した場合)。あるいは、こ
のような組成物は、40℃および75%の湿度で貯蔵された場合、40℃および
75%の湿度で貯蔵されたこのタンパク質結晶の非処方物形態よりも、少なくと
も59倍のより長い有効期限によって特徴付けられる(T1/2によって測定した
場合)。あるいは、このような組成物は、50℃で貯蔵された場合、50℃で貯
蔵されたこのタンパク質結晶の非処方物形態よりも、少なくとも60%のより長
い有効期限によって特徴付けられる(T1/2によって測定した場合)。あるいは
、このような組成物は、50℃で4日間貯蔵された後のタンパク質のα−へリッ
クス構造含有量の20%未満の損失によって特徴付けられ、ここで、このタンパ
ク質の可溶性形態は、50℃で6時間貯蔵された後に、このタンパク質のα−へ
リックス構造含有量を50%を超えて損失する(FTIRによって測定した場合
)。あるいは、このような組成物は、50℃で4日間貯蔵された後のこのタンパ
ク質のα−へリックス構造含有量の20%未満の損失によって特徴付けれら、こ
こで、このタンパク質の可溶性形態は、50℃で6時間貯蔵された後に、このタ
ンパク質のα−へリックス構造含有量を50%を超えて損失し(FTIRによっ
て測定した場合)、そしてここで、この処方物は、50℃で貯蔵される場合に、
50℃の溶液中でのこのタンパク質の可溶性形態よりも、少なくとも60倍のよ
り長い有効期限によって特徴付けられる(T1/2によって測定した場合)。
【0204】 本発明がより理解され得るように、以下に実施例を示す。これらの実施例は、
例示のみの目的のためであり、いかなる様式によっても本発明の範囲を限定する
ように解釈され得ない。
【0205】 (実施例) (実施例1 リパーゼ) (Candida rugosaのリパーゼの結晶化) 材料: A−Candida rugosaのリパーゼの粉末 B−セライト(Celite)粉末(珪藻土) C−MPD(2−メチル−2,4−ペンタジオール) D−5mM Caアセテート緩衝液pH4.6 E−脱イオン水。
【0206】 (手順) 1kgのリパーゼの粉末のアリコートを1kgのセライトとよく混合し、次い
で、22Lの蒸留水を加えた。この混合物を攪拌してリパーゼの粉末を溶解させ
た。溶解が完了した後、酢酸を使用してpHを4.8に調整した。次に、この溶
液を濾過して、セライトおよび溶解していない物質を除去した。次いで、この濾
過物を30Kカットオフ(cut−off)中空繊維を使用してポンピング(p
umping)し、30kD未満の分子量のタンパク質を全て除いた。蒸留水を
加え、そしてリパーゼ濾過物を、残留物(retentate)の伝導率が蒸留
水の伝導率と等しくなるまで中空繊維によりポンピングした。この時点で、蒸留
水の添加を止め、そして5mMのCa−アセテート緩衝液を加えた。次に、Ca
−アセテート緩衝液を、残留物の伝導率がCa−アセテート緩衝液の伝導率と等
しくなるまで中空繊維によるポンピングにより送達した。その時点で、緩衝液の
添加を止めた。このリパーゼ溶液を、30mg/ml溶液にまで濃縮した。この
結晶化を、MPDを攪拌しながらこのリパーゼ溶液に緩やかにポンピングするこ
とによって開始させた。MPDが20%容積/容積に達するまで、MPDの添加
を続けた。この混合液を24時間またはタンパク質の90%が結晶化するまで攪
拌した。得られた結晶を結晶化緩衝液で洗浄して、この結晶から可溶性物質を全
て除去した。次いで、この結晶を新鮮な結晶化緩衝液中に懸濁して、42mg/
mlのタンパク質濃度を達成した。
【0207】 (実施例2) (賦形剤としてショ糖を使用するリパーゼ結晶の処方) リパーゼ結晶の乾燥工程および貯蔵の間の安定性を増強するために、この結晶
を賦形剤と共に処方した。この実施例において、リパーゼ結晶は、乾燥工程の前
に、母液の存在下でスラリー形態で処方された。ショ糖(Sigma Chem
ical Co.,St.Louis,MO)を、母液中のリパーゼ結晶に賦形
剤として加えた。十分なショ糖を、母液(10mM塩化カルシウムおよび20%
MPDを含む10mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.8)中20mg/ml
タンパク質濃度のリパーゼ結晶に、最終濃度が10%に達するまで加えた。得ら
れた懸濁物を室温で3時間反転させた。ショ糖での処置の後、この結晶を、この
液体から、遠心分離(実施例6、方法4または5に記載される)により分離した
【0208】 (実施例3) (トレハロースを賦形剤として使用するリパーゼ結晶の処方) リパーゼ結晶を、実施例2において、スクロースの代わりにトレハロース(S
igma Chemical Co.、St.Louis、MO)を添加するこ
とにより処方し、母液中の最終濃度10%にした。得られた懸濁物を、室温で3
時間転倒混和(tumble)し、そしてその結晶を、実施例6の方法4または
5に記載のように、遠心分離により液体から分離した。
【0209】 (実施例4) ポリエチレンオキシド(PEO)を賦形剤として使用するリパーゼ結晶の処方
) リパーゼ結晶を、以下のように水中0.1%のポリエチレンオキシドを使用し
て処方した。この結晶(母液中20mg/ml)を、スイングバケットローター
を備えたBeckman GS−6R卓上遠心機において1000rpmの遠心
分離により母液から分離した。次いで、この結晶を、0.1%ポリエチレンオキ
シド(Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO)中で
3時間懸濁し、次いで、実施例6の方法4または5に記載のように、遠心分離に
より分離した。
【0210】 (実施例5) (メトキシポリエチレングリコール(MOPEG)を賦形剤として使用するリ
パーゼ結晶の処方) リパーゼ結晶を、実施例2にように、スクロースの代わりに母液中10%のメ
トキシポリエチレングリコール(最終濃度)(Sigma Chemical
Co.、St.Louis、MO)を添加し、そして実施例6の方法4または5
のように、3時間後に遠心分離により分離することにより処方した。
【0211】 (実施例6) (結晶処方物を乾燥する方法) (方法1.室温でのN2ガス乾燥) 実施例1、10、14、および21のように調製した結晶を、スイングバケッ
トローターを備えたBeckman GS−6R卓上遠心機において1000r
pmの遠心分離により、50ml FischerブランドDisposabl
e遠心管(ポリプロピレン)中で、賦形剤を含む母液から分離した。次いで、こ
の結晶を、約10psi圧の窒素の気流をこの管に一晩通すことによって乾燥し
た。
【0212】 (方法2.真空オーブン乾燥) 実施例1、10、14、および21のように調製した結晶を、まず、スイング
バケットローターを備えたBeckman GS−6R卓上遠心機において10
00rpmの遠心分離を使用して、50ml FischerブランドDisp
osableポリプロピレン遠心管中で、母液/賦形剤溶液から分離した。次い
で、湿った結晶を、室温にて25 in Hgで真空オーブン(VWR Sci
entific Products)中に配置し、そして少なくとも12時間乾
燥した。
【0213】 (方法3.凍結乾燥) 実施例1、10、14、および21のように調製した結晶を、まず、スイング
バケットローターを備えたBeckman GS−6R卓上遠心機において10
00rpmの遠心分離を使用して、50ml FischerブランドDisp
osableポリプロピレン遠心管中で、母液/賦形剤溶液から分離した。次い
で、この湿った結晶を、Virtis Lyophilizer Model
24を使用して、半分閉めたバイアル中で凍結乾燥した。貯蔵温度(shelf
temperture)を、凍結工程の間ゆっくりと−40℃へと低減した。
この温度を16時間保った。次いで、2次乾燥を、さらに8時間実行した。
【0214】 (方法4.有機溶媒および風乾) 実施例1、10、14、および21のように調製した結晶を、まず、スイング
バケットローターを備えたBeckman GS−6R卓上遠心機において10
00rpmの遠心分離を使用して、50ml FischerブランドDisp
osableポリプロピレン遠心管中で、母液/賦形剤溶液から分離した。次い
で、この結晶を、有機溶媒(エタノールまたはイソプロパノールまたは酢酸エチ
ルあるいは他の適切な溶媒のような)中に懸濁し、遠心分離し、その上清をデカ
ントし、そして換気フード中で2日間室温で風乾した。
【0215】 (方法5.室温での風乾) 実施例1、10、14、および21のように調製した結晶を、スイングバケッ
トローターを備えたBeckman GS−6R卓上遠心機において1000r
pmの遠心分離により、50ml FischerブランドDisposabl
e遠心管(ポリプロピレン)中で、賦形剤を含む母液から分離した。続いて、結
晶を、換気フード中で2日間風乾させた。
【0216】 (実施例7) (可溶性リパーゼサンプル調製) 比較のために、可溶性リパーゼのサンプルを、リパーゼ結晶をリン酸緩衝化生
理食塩水(pH7.4)に、20mg/mlに溶解することにより調製した。
【0217】 図2は、可溶性リパーゼについての安定性を示す。比活性は、時間とともに非
常に迅速に減少する。2〜3時間以内、比活性は、約660マイクロモル/分/
mgタンパク質から約100マイクロモル/分/mgタンパク質に減少する(す
なわち約85%減少)。可溶性リパーゼについてのT1/2を算出すると1.12
時間であった。
【0218】 (実施例8) (リパーゼ活性を測定するためのオリーブオイルアッセイ) 実施例1〜7からのリパーゼ結晶を、pH7.7緩衝液中のオリーブオイルに
対する活性について評価した。このアッセイを、Pharmaceutical
Enzymes−Properties and Assay Method
s、R.RuyssenおよびA.Lauwers(編)、Scientifi
c Publishing Company、Ghent、Belgium(1
978)に記載される手順に対するわずかな改変形を使用して、滴定により実行
した。
【0219】 (試薬) 1.オリーブオイルエマルジョン: アラビアゴム(Sigma)16.5gを、水180ml、オリーブオイル(S
igma)20mlに溶解し、そしてQuick Prepミキサーを3分間使
用して乳化した 2.滴定液:0.05M NaOH 3.溶液A:3.0M NaCl 4.溶液B:75mM CaCl2・2H2O 5.混合物:溶液A40mlを、溶液B20mlおよび水100mlと混合し
た 6.0.5%アルブミン: 7.リパーゼ基質溶液(溶液7)を、オリーブオイルエマルジョン(溶液1)
50mlを混合物(溶液5)40mlおよび0.5%アルブミン(溶液6)10
mlに添加することにより調製した。
【0220】 (アッセイ手順) リパーセ基質溶液(溶液7)を、水浴中で37℃に温めた。まず、基質20m
lを、反応容器に加え、そしてそのpHを、0.05M NaOH(溶液2)を
使用して7.7に調整し、そしてかき混ぜながら37℃に平衡化した。反応を、
酵素を添加することにより開始した。反応の進行を、酵素と基質の混合物を0.
05M NaOHで滴定することによりそのpHを7.7に維持しながら、モニ
ターした。
【0221】 比活性(マイクロモル/分/mgタンパク質)は、(初速×1000×滴定液
の濃度)/(酵素の量)に等しかった。ゼロ点は、酵素を伴わない反応を実行す
ること(すなわち、反応混合物中で酵素の代わりに緩衝液を使用すること)によ
り決定した。
【0222】 (実施例9) (活性) 実施例1〜5からの乾燥結晶の貯蔵活性を、実施例8に記載のようなオリーブオ
イルアッセイを使用して測定した。乾燥結晶(5mg)を、リン酸緩衝化生理食
塩水(「PBS」)(pH7.4)1mlに溶解し、そしてその活性を、オリー
ブオイルを基質として使用して測定した。
【0223】 (貯蔵安定性(shelf stability)) 実施例2〜5からの乾燥結晶リパーゼ処方物の貯蔵安定性を、相対湿度75%
および温度40℃に制御された湿潤チャンバー(HOTPACK)中で実行した
。この結晶の活性を、乾燥サンプル5mgをPBS緩衝液(pH7.4)に溶解
し、オリーブオイルアッセイにおける活性を測定し、次いで最初の結果と比較す
ることにより測定した。
【0224】 (方法5により乾燥した結晶処方物) 図3は、スクロース、トレハロース、およびPEOを用いて処方されたリパー
ゼ結晶の貯蔵安定性プロフィールを示す。方法5により乾燥した場合、PEOが
最も保護的な賦形剤であり、次にスクロース次いでトレハロースであった。
【0225】 (方法4により乾燥した結晶処方物) 図4は、スクロース、トレハロース、PEO、およびMOPEGを用いて処方
されたリパーゼ結晶の貯蔵安定性プロフィールを示す。方法4により乾燥した場
合、賦形剤PEO、スクロースおよびMOPEGは、T1/2に対するそれらの効
果により測定した場合に、酵素活性を保存するそれらの能力は同様であった。ト
レハロースは、他の賦形剤よりもリパーゼ活性の保護が劣った。
【0226】 (貯蔵安定性) 酵素の比活性が50%減少するのに要する時間は、T1/2として既知である。
表2は、乾燥リパーゼ結晶の処方物についての比活性のT1/2に対する効果を示
す。リパーゼについて、スクロースが最も保護的な賦形剤であり、ポリエチレン
オキシド(PEO)、メトキシポリエチレングリコール(MOPEG)、そして
最後にトレハロースと続いた。スクロースは、比活性のT1/2に対するその効果
により測定した場合は、10倍を超えてより保護的であった。
【0227】
【表2】 1/2を、Sigma Plotプログラムを使用する非線形回帰分析により
有効期限データから算出した。表2は、リパーゼ処方物が、PEOを賦形剤とし
て使用した場合に可溶性よりも1,923倍安定であったことを示す。さらに、
リパーゼ処方物は、スクロースを賦形剤として使用した場合に、可溶性リパーゼ
よりも23,300倍安定であった(表2)。MOPEGおよびPEOを賦形剤
として使用したリパーゼ結晶の処方物は、可溶性リパーゼよりも9,270倍お
よび17,800倍安定であった(表2)。
【0228】 表2に示されるように、非処方結晶と比較して、処方された結晶の安定性は大
きく増強されていた。表2に示されるように、例えば、トレハロースを用いて処
方された結晶は、賦形剤を用いずに生成された非処方リパーゼ結晶よりも40℃
で59倍安定であった。同様に、表2に示されるように、MOPEGを用いて処
方された結晶は、非処方結晶よりも286倍安定であり、そしてPEOを用いて
処方された結晶は、賦形剤を用いずに生成された非処方リパーゼ結晶よりも40
℃で549倍安定であった。最後に、表2に示されるように、スクロースを用い
て処方された結晶は、賦形剤を用いずに生成された非処方リパーゼ結晶よりも4
0℃で718倍安定であった。
【0229】 (水分含量) 水分含量を、VA−06 Vaporizerを装備するMitsubish
i CA−06 Moisture Meter(Mitsubishi Ch
emical Corporation,Tokyo,Japan)を使用して
、製造業者の指示に従って、Karl Fischer法によって決定した。
【0230】
【表3】 (結晶化度) 処方物の結晶強度を、定量的顕微鏡観察によって測定した。結晶が、乾燥後に
その形状を維持するか否かを可視化するために、乾燥した結晶を、Image
ProPlusソフトウェアとともにCamera AdapterとDXC−
970MD 3CCD Color Video Cameraを装着したOl
ympus BX60顕微鏡の下で検査した。乾燥させた結晶のサンプルを、ガ
ラスカバーストリップで覆い、取り付け、そしてOlympus UPLAN
F1対物レンズ 10×/0.30 PH1を備えたOlympus顕微鏡(位
相差)使用して、10倍の拡大率で検査した。
【0231】 この分析において、スクロース、トレハロース、PEOおよびMOPEGでも
ともと処方された結晶は、40℃および75%湿度にて129日後に容易に可視
化された。図5は、PEOで処方された結晶が、最初の時点で存在したことを示
す。129日後に得られそして図6に示した類似の顕微鏡観察は、結晶化度が、
期間全体にわたって維持されたことを実証する。類似のデータを、スクロース、
MOPEGおよびトレハロースで処方した結晶について得た(データは示さず)
【0232】 (FTIRによる二次構造の特徴づけ) フーリエ変換赤外分光法(「FTIR」)スペクトルを、Dongらに記載さ
れるように、Nicoletモデル550Magnaシリーズ分光計で収集した
(Dong,A.,Caughey,B.,Caughey,W.S.,Bha
t,K.S.およびCoe,J.E.Biochemistry,1992;3
1:9364−9370;Dong,A.Prestrelski,S.J.,
Allison,S.D.およびCarpenter,J.F.J.Pharm
.Sci.,1995;84;415−424)。固体サンプルについて、1〜
2mgのタンパク質を、350mgのKBr粉末で軽く施し、そして乱反射部品
を用いて小さなカップを満たした。スペクトルを収集し、次いで、第2の誘導体
を用いる二次構造の個々の成分の相対領域の決定のためのGalacticソフ
トウェアからのGrams 32、およびアミドI領域(1600〜1700c
-1)の下でカーブフィッティングプログラムを用いて、処理した。
【0233】 比較のために、可溶性リパーゼサンプルを、リン酸緩衝化生理食塩水中にリパ
ーゼ結晶を溶解することによって調製し、そして安定性についてFTIRによっ
て分析した。
【0234】 二次構造を、以下のように決定した:FTIRスペクトルを、Nicolet
モデル550 Magnaシリーズ分光計で収集した。可溶性リパーゼの1ml
のサンプルを、ARK ESPのセレン化亜鉛結晶上に置いた。スペクトルを、
最初の時点(0)およびほとんどの活性が損失したまたはほぼ0の活性になった
後に収集した。次いで、獲得したデータを、第2の誘導体を用いる二次構造の個
々の成分の相対領域の決定のためのGalacticソフトウェアからのGra
ms 32ソフトウェア、およびアミドI領域(1600〜1700cm-1)の
下でカーブフィッティングプログラムを用いて、処理した。
【0235】
【表4】 (結論) 表4は、可溶性リパーゼについて、約50%および75%のα−ヘリックスお
よびβ−シート構造含量が、3日間にわたって損失したことを示す。ランダム構
造の含量において対応する増加が存在した。
【0236】 対照的に、図4は、処方し乾燥した結晶が、可溶性酵素より非常に安定である
ことを示す。このような結晶は、40℃および75%湿度にて66日後に、6.
1%〜21.1%の範囲のα−ヘリックス構造の損失を示した。この時点で、溶
液中ランダムコイルは、3日間にわたって7〜50%増加し、一方、結晶化度は
、66日後でさえ最小のランダムコイル含量を示した。
【0237】 FTIRを用いて二次構造における変化をモニタリングすることで得られた表
4のデータは、図4に示す活性データと相関した。詳細には、スクロース、PE
OおよびMOPEGで処方されたリパーゼは、トレハロースで処方した結晶(2
1%のα−ヘリックス構造の損失を示し、そして最も低い活性プロフィールを有
した)よりも、α−ヘリックス構造の有意により少ない損失を示し、かつ上昇し
た温度および湿度にて66日間にわたって、より高い比活性を維持した。
【0238】 (実施例10:ヒト血清アルブミン) (ヒト血清アルブミンの結晶化) 10グラムの粉末化したヒト血清アルブミンを、100mMリン酸緩衝液(p
H5.5)(4℃)の75mlの攪拌した溶液に添加した。最終タンパク質濃度
は120mg/mlであった(溶液のOD280値から推定した)。最初に、硫酸
アンモニウム溶液(767g/l)(脱イオン水で調製した)を、最終濃度が3
50g/lまたは50%飽和まで、このタンパク質溶液に添加した。次に、結晶
化溶液を、50%硫酸アンモニウム(pH5.5)中の50mg/mlアルブミ
ン結晶1mlを用いて「播種(seed)」した。種結晶(seed crys
tal)を、100mMリン酸緩衝液中50%飽和の硫酸アンモニウム(pH5
.5)の溶液との沈殿物を含まない結晶のサンプルを洗浄することによって調製
した。播種した結晶化溶液を、4℃にて一晩、強力に回転するプラットフォーム
上でインキュベートした。棒(rod)の形状の結晶(20μm)は、約16時
間後の一晩の溶液中に出現した。
【0239】 (実施例11) (賦形剤としてゼラチンを用いるHSA結晶の処方) ヒト血清アルブミン(HSA)結晶の乾燥および保存の間の安定性を増強する
ために、この結晶を賦形剤とともに処方した。この実施例において、HSA結晶
を、乾燥前の母液の存在下でスラリー形態で処方した。ゼラチン(Sigma
Chemical Co.,St.Louis,MO)を、賦形剤としての母液
中のリパーゼ結晶に添加した。十分なゼラチンを、母液(100mMリン酸緩衝
液中2.5M硫酸アンモニウム(pH5.5))中のリパーゼ結晶に、タンパク
質濃度20mgs/mlにて、10%の最終濃度に達するまで、添加した。得ら
れた懸濁物を、室温にて3時間回転させた。ゼラチンでの処理の後、結晶を、実
施例6の方法1に記載の遠心分離によって液体から分離した。
【0240】 (HSA結晶の乾燥) 次いで、HSA結晶を実施例6に記載の4つの方法によって乾燥させた。この
結晶を、方法4の有機溶媒として冷エタノール(4℃)中に懸濁させた。
【0241】 (実施例12) (可溶性ヒト血清アルブミン調製) 比較のために、可溶性HSAサンプルを、水中20mg/mlでHSAを溶解
させることによって調製した。
【0242】 (実施例13) (貯蔵安定性(shelf stability)) HSAの乾燥した結晶処方物の貯蔵安定性を、50℃の温度の水浴中で行った
。この結晶の安定性を、FTIR分析により以下の構造崩壊によってモニタリン
グした。
【0243】 (水分含量) 水分含量を、VA−06 Vaporizerを装備するMitsubish
i CA−06 Moisture Meter(Mitsubishi Ch
emical Corporation,Tokyo,Japan)を使用して
、製造業者の指示に従って、Karl Fischer法によって決定した。
【0244】
【表5】 (結晶化度) 処方物の結晶強度を、実施例9に記載のように、定量的顕微鏡観察によって測
定した。図7は、HSA結晶が、ゼラチンで処方物を調製した直後に、容易に可
視化されたことを示す。図8は、結晶化度が、50℃にて4日間後に維持された
ことを示す。
【0245】 (FTIRによる二次構造の特徴付け) FTIRスペクトルを、Dongらに記載されるように、Nicoletモデ
ル550Magnaシリーズ分光計で収集した(Dong,A.,Caughe
y,B.,Caughey,W.S.,Bhat,K.S.およびCoe,J.
E.Biochemistry,1992;31:9364−9370;Don
g,A.Prestrelski,S.J.,Allison,S.D.および
Carpenter,J.F.J.Pharm.Sci.,1995;84;4
15−424)。固体サンプルについて、1〜2mgのタンパク質を、350m
gのKBr粉末で軽く施し、そして乱反射部品を用いて小さなカップを満たした
。スペクトルを収集し、次いで、第2の誘導体を用いる二次構造の個々の成分の
相対領域の決定のためのGalacticソフトウェアからのGrams 32
、およびアミドI領域(1600〜1700cm-1)の下でカーブフィッティン
グプログラムを用いて、処理した。
【0246】 比較のために、可溶性HSAサンプルを、水中にHSA結晶を溶解することに
よって調製し、そして安定性についてFTIRによって試験した。二次構造を、
実施例9に記載のように決定した。
【0247】
【表6】 (結論) 可溶性HSAは、溶液中で1時間後に78%のα−ヘリックス含量の急速な減
少、およびランダムコイル構造の対応する増加を示した。
【0248】 乾燥処方した結晶は、約16%のα−ヘリックス含量の減少、β−シート含量
の大幅な減少を示し、そしてランダム構造の含量の増加は示さなかった。
【0249】 (実施例14:ペニシリンアシラーゼ) (ペニシリンアシラーゼの結晶化) Boehringer Mannheimからのペニシリンアシラーゼの硫酸
アンモニウム懸濁物が、粗材料であった。ペニシリンアシラーゼの懸濁物を、脱
イオン水を用いて1:3希釈した。この溶液を、30Kメンブレンを用いるダイ
アフィルトレーションによって、A280nm/mlで200ODの最終濃度まで濃
縮した。次いで、この酵素溶液を、4M NaH2PO4・H2Oを用いてA280nm /mlで150ODmまで希釈した。
【0250】 1.9M NaPO4の最終溶液濃度となる4Mおよび1Mの十分なNaH2
4・H2Oの二相性溶液を、調製した。この場合、280mlの1M NaH2
PO4・H2Oを、549mlの4M NaH2PO4・H2Oの頂部に注意深く重
層した。この酵素溶液を、容器の側面に穏やかに注ぎ、1M層の上に層を形成し
た。船舶用インペラーと共にオーバーヘッド攪拌機を設定した。アジテーターを
、その刃を4M/1M界面のすぐ下にして容器中に置いた。速度を、8.0の設
定、すなわち600rpmに調整した。このアジテーターのスイッチを入れ、1
0分後に停止させた。インペラーを容器からはずした。種結晶の容積を、0.5
容積%と0.1容積%との間で目盛り付きピペットを用いて測定し、そして20
Lの滅菌ポリカーボネート容器中に添加した。この種を、添加前に10秒間より
も長く静置しなかった。この溶液を、フラットブレードインペラーを用いて約1
分間、手動で攪拌した。この結晶化混合物を、24時間静置させた。
【0251】 24時間後、この容器を開け、そして溶液を30秒間、手動で混合した。この
溶液を、さらに24時間沈澱させた。計48時間後、上清のうちの10mlのサ
ンプルを採取した。このサンプルを、0.2ミクロンAcrodiscを用いて
濾過した。上清のA280nmを測定した。上清のA280nmが1.0mg/mlよりも
大きい場合、結晶化をさらに24時間継続させた。上清の濃度が1.0mg/m
l未満になった場合、結晶スラリーおよび上清のA280nmを直接決定した。
【0252】 (実施例15:PA結晶についてのペニシリンGアッセイ) ペニシリンアシラーゼについての活性アッセイの基礎は、この酵素によるベン
ジルペニシリンの酵素的加水分解を測定する滴定アッセイを含む。この酵素は、
ペニシリンGからのフェニルアセチル基の切断を触媒し、これによりpHの減少
を引き起こす。この活性は、反応1分間に(28℃にてpH8を維持するために
)必要な50mM NaOHの容積の測定による。このアッセイは、塩化カリウ
ムおよびTrisを用いて作製された基質緩衝液を使用する。そしてこのアッセ
イを、U/mgで報告した。
【0253】 (ペニシリンアシラーゼアッセイ): (このアッセイにおいて用いられる化学物質および溶液): 1. ペニシリン−G、Sigma、カリウム塩 2. 0.05N 水酸化ナトリウム 3. 1.0M KC1、20mM Tris緩衝液、pH8.0 4. 10mM Tris、10mM CaCl2緩衝液、pH8.0 5. 0.01M PBS緩衝液、pH7.5 (基質溶液の調製) 1gのペニシリン−Gを、10mlの1.0M KC1、20mM Tris
緩衝液、pH8.0および約70mlのDI水、1mlの10mM Tris、
10mM CaCl2溶液中に添加した。次いで、この溶液のpHを、0.05
N NaOHを用いて8.0に調整した。次いで、最終溶液容積を、100ml
に調整した。この溶液を、各使用の前に新たに調製し、そして調製から5時間以
内に使用した。
【0254】 (PAサンプル溶液の調製) ペニシリンアシラーゼのサンプルを、PBS緩衝液、pH7.4中に溶解させ
た。代表的には、2mg〜4mg(乾燥重量)のタンパク質を、各アッセイに用
いた。
【0255】 (ペニシリンGの加水分解についてのアッセイ) 20mlのペニシリンアシラーゼ基質溶液を、滴定容器中に添加し、そして2
8℃に平衡化させた。この酵素溶液をこの反応容器に添加した後、pHを8.0
に維持するために0.05N NaOHを用いて反応混合物を滴定することによ
り、ペニシリン−Gの加水分解をモニタリングした。
【0256】 (実施例16:ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン(HPCD)を
賦形剤として用いるPA結晶の処方): 乾燥および保存の間のPA結晶の安定性を増強するために、この結晶を、賦形
剤と共に処方した。本実施例では、PA結晶を、乾燥前に母液の存在下でスラリ
ー形態で処方した。ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン(HPCD)
(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)を、賦形
剤として母液中のPA結晶に添加した。十分なHPCDを、母液(1.9M N
aH2PO4、pH6.6)中20mg/mのタンパク質濃度でリパーゼ結晶に添
加して、10%という最終濃度に到達させた。得られた懸濁物を、室温にて3時
間転動(tumbled)させた。HPCDを用いる処理後、この結晶を、実施
例6の方法1に記載のように遠心分離によって液体から分離した。
【0257】 (実施例17:母液自体を賦形剤として用いるPA結晶の処方): PA結晶を、母液(1.9M NaH2PO4、pH6.6)を用いて処方した
。この結晶を、実施例16においてのように、遠心分離によって分離した。
【0258】 (実施例18:PAの乾燥) 次いで、実施例15〜17からのPA結晶を、実施例6の方法1、3または4
に従って乾燥させた。実施例6の方法4について用いた有機溶媒は、酢酸エチル
であった。
【0259】 (実施例19:可溶性PA調製物): 比較標準として、可溶性PAのサンプルを、20mg/mlで水中にPA結晶
を溶解させることによって調製した。
【0260】 可溶性PAの安定性を、経時的に測定した。そして時間に対する55℃でのプ
ロット比活性を図9に示す。溶液中のPA酵素活性は、迅速に減衰し、そして約
20時間後に検出できなかった。
【0261】 (実施例20:乾燥結晶の活性): 実施例18からの乾燥結晶の活性を、実施例15に記載される通りにPen
Gアッセイにおいて試験した。乾燥した結晶(5mg)を、1mlの水中に溶解
させ、そしてその活性を、基質としてPen Gを用いて測定した。
【0262】 (貯蔵安定性): PA乾燥結晶処方物の貯蔵安定性を、PierceによるReactive−
Therm III−Heating/Stirringモジュールを55℃の
温度で用いて決定した。活性を、5mgの乾燥サンプルを水中に溶解し、そして
実施例15に記載のPen Gアッセイにおいて酵素活性を測定することにより
測定し、そして最初の結果と比較した。図10は、賦形剤を含むPA結晶および
賦形剤を含まないPA結晶の貯蔵安定性プロフィールを示す。図10はまた、窒
素(方法1)または風乾(方法4)を用いて乾燥したPA結晶処方物の貯蔵安定
性プロフィールを示す。
【0263】
【表7】 1/2を、Sigma Plotプログラムを用いる非線形回帰分析による有
効期限データから算出した。処方された結晶の安定性は、処方されていない結晶
に比較して、表7に示すように、増強された。例えば、HPCDを用いて処方さ
れた結晶は、55℃にて可溶性PAより418倍安定であった(表7)。HPC
Dを用いて処方された結晶は表7に示すように、賦形剤なしで作製された、処方
されていないPA結晶よりも、55℃にて3.5倍安定であった。
【0264】 (水分含量): 水分含量を、VA−06 Vaporizer(Mitsubishi Ch
emical Corporation,Tokyo,Japan)を備えたM
itsubishi CA−06 Moisture Meterを用いて製造
業者の使用説明書に従ってKarl Fischer方法によって決定した。
【0265】
【表8】 (結晶性): 処方物の結晶の完全性を、実施例9に記載される通りに定量的顕微鏡観察によ
って測定した。結晶によって示される通り、結晶性は、プロセスの間中維持され
(データは示さず)、これは容易に可視可能であった。
【0266】 (FTIRによる二次構造の特徴付け): 安定性を、乾燥され、そして処方されたPA結晶の二次構造含量を、実施例9
に記載される通りにFTIRによって定量することによって評価した。可溶性P
Aを、比較の目的のために用いた。
【0267】
【表9】 (結論): α−ヘリックス含量の減少は、可溶性ペニシリンアシラーゼについては1日後
に76%であった。対照的に、HPCDを賦形剤として用い、そして処方物を実
施例6の方法1によって乾燥した場合、55℃の温度で43日後にほんの31%
のα−ヘリックス含量が失われただけであった。
【0268】 (実施例21:グルコースオキシダーゼ) (グルコースオキシダーゼ結晶の調製) 本発明者らは、グルコースオキシダーゼの結晶を以下の通りに調製した。最初
に、糖タンパク質を、アニオン交換クロマトグラフィーによって精製し、次いで
結晶化パラメーターを最適化した(データは示さず)。
【0269】 これらの研究の結果として、本発明者らは、グルコースオキシダーゼの結晶化
条件が、一般に、7%〜17%のPEG 4000またはPEG 6000、8
%〜20%の2−プロパノールまたはエタノール、および3と6との間のpHに
調整する緩衝液の範囲に入ることを見出した。しかし、この範囲内およびこの範
囲付近の多くのセットの実験条件が、グルコースオキシダーゼおよび他の糖タン
パク質の結晶化について満足な結果を生じ得ることを理解すべきである。当業者
は、所望の大きさおよび品質の結晶を効率的に生じる正確な条件が、実験条件の
差異(例えば、タンパク質および試薬の純度、攪拌速度、剪断力の効果、ならび
に炭水化物含量)に起因して変化することを理解する。
【0270】 (グルコースオキシダーゼの大規模結晶化) 本発明者らは、グルコースオキシダーゼの予備的規模の結晶化に好ましい条件
を決定した。予備的規模の結晶化は一般に、100ml〜900mlの糖タンパ
ク質を含む。
【0271】 (A.種を用いない、一定pHでの結晶化) グルコースオキシダーゼを、水中でダイアフィルトレーションし、そして5と
15との間のA280まで濃縮した。グルコースオキシダーゼ濃縮物を、pH5.
0にて0.2M酢酸Na中に18% PEG 6000、32% 2−プロパノ
ールを含有する1容積の結晶化試薬と混合した(1:1)。混合後、この溶液を
6℃まで冷却した。グルコースオキシダーゼ結晶化溶液を、プロペラスターラー
を用いて100rpmにて24時間攪拌した。この時間の間に、この結晶が徐々
に形成された。
【0272】 (実施例22:賦形剤としてトレハロースを使用するグルコースオキシダーゼ
の処方) 乾燥および貯蔵の間のグルコースオキシダーゼ(GOD)結晶の安定性を増強
するために、この結晶を、賦形剤とともに処方した。この実施例において、GO
D結晶を、乾燥の前に、母液の存在下でスラリー形態に処方した。トレハロース
(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)を、賦形
剤として母液中のGOD結晶に添加した。十分なトレハロースを、母液(32%
イソプロパノールおよび9% PEG 6000を含む100mM 酢酸ナト
リウム緩衝液(pH5.5))中の、タンパク質濃度が20mg/mlのGOD
結晶に、終濃度が10%に達するまで添加した。得られた懸濁物を、3時間室温
で転倒混和した。トレハロースでの処理後、実施例6の方法1に記載のように遠
心分離によって、結晶と液体とを分離した。
【0273】 (実施例23:賦形剤としてラクチトール(lactitol)を使用するグ
ルコースオキシダーゼ結晶の処方) 母液に対して終濃度10%になるまで(トレハロースの代わりに)ラクチトー
ル(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)を添加
することによって、グルコースオキシダーゼ結晶を実施例22と同様に処方した
。3時間の遠心分離後に、この結晶と母液/ラクチトール溶液とを分離した。
【0274】 (実施例24:賦形剤としてヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン(
HPCD)を使用するグルコースオキシダーゼ結晶の処方) 母液に対して終濃度10%になるまで(トレハロースの代わりに)ヒドロキシ
プロピル−β−シクロデキストリン(HPCD)(Sigma Chemica
l Co.,St.Louis,MO)を添加することによって、グルコースオ
キシダーゼ結晶をHPCD使用して、実施例22と同様に処方し、そして3時間
インキュベートした。次いで、実施例6の方法1に記載のように、3時間の遠心
分離後に、この結晶と母液/HPCD溶液とを分離した。
【0275】 (実施例25:賦形剤としてゼラチンを使用するグルコースオキシダーゼ結晶
の処方) 母液に対して終濃度10%になるまで(トレハロースの代わりに)ゼラチン(
Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)を添加する
ことによって、グルコースオキシダーゼ結晶を実施例22と同様に処方した。3
時間の遠心分離後に、この結晶と母液/ゼラチン溶液とを分離した。
【0276】 (実施例26:賦形剤としてメトキシポリエチレングリコールを使用するグル
コースオキシダーゼ結晶の処方) 母液に対して終濃度10%になるまで、メトキシポリエチレングリコール(S
igma Chemical Co.,St.Louis,MO)を添加するこ
とによって、グルコースオキシダーゼ結晶を実施例22と同様に処方した。3時
間の遠心分離後に、実施例6の方法1に記載のように、この結晶と母液/メトキ
シポリエチレングリコール溶液とを分離した。
【0277】 (実施例27:賦形剤としてスクロースを使用するグルコースオキシダーゼ結
晶の処方) 母液に対して終濃度10%になるまでスクロース(Sigma Chemic
al Co.,St.Louis,MO)を添加することによって、グルコース
オキシダーゼ結晶を実施例22と同様に処方した。3時間の遠心分離後に、この
結晶と母液/スクロース溶液とを分離した。
【0278】 (実施例28:グルコースオキシダーゼ処方物の乾燥) 上記のグルコースオキシダーゼ結晶処方物を、実施例6に記載の方法に従って
乾燥させた。方法4は、有機溶媒として冷イソプロパノール(4℃)を使用した
【0279】 (実施例29:可溶性グルコースオキシダーゼの調製) 比較のために、可溶性グルコースオキシダーゼサンプルを、50mM クエン
酸緩衝液(pH6.0)中、20mg/mlでグルコースオキシダーゼ結晶を溶
解することによって調製した。
【0280】 図11は、50℃での可溶性グルコースオキシダーゼの安定性を経時的に示す
。比活性は時間がたつにつれて急速に減少する。24時間後、比活性は、90%
を超えて減少する。可溶性グルコースオキシダーゼのT1/2は、0.91時間と
算出された。
【0281】 (実施例30:グルコースオキシダーゼ活性アッセイ) 以下のプロトコルを使用して、乾燥したグルコースオキシダーゼ結晶および結
晶処方物の活性を決定した。
【0282】 化学薬品および溶液: 1.リン酸緩衝液(20mM、pH7.3)、NaCl(0.1M)溶液 2.21mM O−ジアニシジンジヒドロクロリドストック溶液。使用前に、作
業溶液として0.21mMまで希釈 3.2M グルコース溶液 4.ペルオキシド溶液(2mg/ml) 5.50mM クエン酸緩衝液(pH6.0)。
【0283】 サンプル調製: 1.2mgのグルコースオキシダーゼを1mlの50mM クエン酸緩衝液(p
H6.0)に添加し、そして約2分間、十分にボルテックスする。この溶液を、
室温で1時間転倒混和して、再構成した 2.上記の酵素溶液0.1mlと4.9mlの同じクエン酸緩衝液とを混合する
ことによって希釈酵素溶液を調製する。
【0284】 酵素活性測定のためのアッセイ手順: 1.UV−Vis分光光度計によってこのアッセイをモニターした。速度モード
を使用し、そして460nmの波長および25℃の温度を設定する 2.25℃の水浴中でO−ジアニシジン/ホスフェート作業溶液を温め、そして
使用の少なくとも20分前に酸素でこの溶液を泡立てる 3.酵素溶液を添加せずに試薬溶液を使用してブランクを測定する 4.2.4mlの酸素化したO−ジアニシジン/ホスフェート作業溶液、0.4
mlの2M グルコース溶液、および0.1mlのペルオキシダーゼを、使い捨
てキュベットにピペットで入れる 5.キュベット壁上に10mlの酵素サンプルを添加し(この工程でサンプルと
試薬とが混合しないように、キュベットを傾ける)、そしてパラフィルム片で覆
う。キュベットを2回反転させて素早く混合し、分光光度計のセル区画にキュベ
ットを挿入し、そしてデータを収集し始める。 酵素比活性を以下の式を使用して算出する: 比活性=A*B*C/D*E*F ここで、A=1分間あたりの460nmでの吸光度単位の変化 B=反応混合物容積(ml) C=希釈倍率 D=11.3(定数) E=使用した酵素の重量(mg) F=サンプル容積(ml)。
【0285】 (実施例31:乾燥した結晶の活性) グルコースオキシダーゼの乾燥した結晶処方物の活性を、実施例30に記載の
ように測定した。
【0286】 (貯蔵(shelf)安定性) グルコースオキシダーゼ結晶処方物の貯蔵安定性の研究を行った。この場合、
この処方物を、実施例6の方法4を用いて乾燥させ、そして2mlのスクリュー
キャップ付きエッペンドルフチューブ中で13日間、50℃の温度にて水浴中に
貯蔵した。特定の時点での活性を、50mM クエン酸緩衝液(pH6.0)中
に2mgの乾燥したサンプルを溶解して、次いで、実施例30に従って活性を測
定することにより得た。
【0287】 50℃で貯蔵した種々のグルコースオキシダーゼ処方物の貯蔵安定性を決定し
た。このデータを図12に示す。ラクチトールは、上昇した温度において期間に
わたり、グルコースオキシダーゼ比活性を保存するに最も有効な賦形剤であった
【0288】
【表10】 1/2を、Sigmaプロットプログラムを使用する非線形回帰分析により有
効期限データから算出した。表10は、トレハロースが賦形剤として使用された
場合、グルコースオキシダーゼ処方物が可溶性グルコースオキシダーゼより、9
5倍より安定であったことを示す。さらに、グルコースオキシダーゼ処方物は、
賦形剤としてラクチトールが使用された場合、可溶性グルコースオキシダーゼよ
り121倍より安定であった(表10)。HPCDまたはMOPEGを賦形剤と
して使用するグルコースオキシダーゼ結晶処方物は、可溶性グルコースオキシダ
ーゼより、それぞれ、60倍および325倍より安定であった(表10)。最後
に、ゼラチンまたはスクロースを賦形剤として使用するグルコースオキシダーゼ
結晶処方物は、可溶性グルコースオキシダーゼより、それぞれ、99倍および8
2倍より安定であった(表10)。
【0289】 賦形剤としてトレハロース、ラクチトール、HPCD、MOPEG、ゼラチン
またはスクロースのいずれかを用いて作製されたグルコースオキシダーゼ結晶処
方物は、表10に示されるように、T1/2により測定した場合、賦形剤を用いず
に作製されたグルコースオキシダーゼ結晶より、50℃において2.5倍、3.
2倍、1.6倍、8.6倍、2.6倍、または2.2倍、より安定であった。
【0290】 (水分含量) 水分含量を、VA−06 Vaporizer(Mitsubishi Ch
emical Corporation,Tokyo,Japan)を備えたM
itsubishi CA−06 Moisture Meterを使用して、
製造業者の説明書に従ってKarl Fischer法により決定した。
【0291】
【表11】 (結晶化度) GOD処方物の結晶完全性を、実施例9に記載のように定量的顕微鏡観察によ
って測定した。この実施例において、結晶は容易に結晶化された。このことによ
り、結晶化度は、プロセスの間中維持されたことを示す。
【0292】 図13は、グルコースオキシダーゼ結晶がラクチトール処方物の調製直後に容
易に視覚化されたことを示す。図14は、結晶化度が50℃で13日間の後に維
持されたことを実証する。結晶材料もまた、図15に示すように、トレハロース
でのグルコースオキシダーゼの処方後に容易に視覚化された。同様に、残った結
晶材料も、図16に示されるように、50℃で13日間の後に容易に視覚化され
た。
【0293】 (FTIRによる二次構造の特徴) 実施例9に記載のように、乾燥したGOD結晶および処方したGOD結晶の二
次構造量をFTIRにより定量することにより、安定性を評価した。比較のため
に、可溶性グルコースオキシダーゼサンプルを、50mM クエン酸緩衝液(p
H6.0)中にグルコースオキシダーゼ結晶を溶解し、そしてARK ESPの
セレン化亜鉛結晶上で約1mlを配置することにより調製し、次いで、これを、
FTIRにより安定性について分析した。
【0294】
【表12】 (結論) 可溶性グルコースオキシダーゼは、50℃でわずか6時間以内で、そのα−ヘ
リックス含量の75%を損失した。
【0295】 糖ラクチトール、スクロース、およびトレハロースは、高温での貯蔵の際のα
−ヘリックス含量の損失を防止するのに、最も有効な賦形剤であった。ラクチト
ール、スクロース、およびトレハロース中で処方され、そして方法4によって乾
燥されたグルコースオキシダーゼ結晶は、50℃で4日後に、α−ヘリックス構
造含量の18.1〜19.4%のみの損失を示した。
【0296】 (実施例32:Candida rugosaリパーゼ結晶の乾燥) 材料: A−Candida rugosaリパーゼ(実施例1) B−ポリ(エチレングリコール)、100%、PEG200、300、40
0、または600 C−アセトン 手順: 結晶懸濁液(140mg)の4mlアリコートを、4つの15ml管に添加す
る。次に、この懸濁液を、1000RPM〜3000RPMの間で、1〜5分間
の間、または結晶化緩衝液が除去されるまで遠心分離する。次いで、4mlの液
体ポリマー(200と600との間のいかなるPEGも適切である)を各管に添
加し、そしてこの内容物を均一になるまで混合する。この懸濁液を1000RP
M〜3000RPMの間で、1〜5分間の間、または液体ポリマーが除去される
まで、遠心分離する。次に、4mlのアセトン(イソプロパノール、ブタノール
、および他の溶媒もまた適切である)を各管に入れ、そして十分に混合する。結
晶/有機溶媒懸濁液を、0.8cm×4cm BIO−RADポリ分取クロマト
グラフィーカラム(スピンカラム)に移す。カラムを、有機溶媒を除去するため
に、1000RPMで、1〜5分間の間、遠心分離する。最後に、窒素ガスをカ
ラムに通し、自由流動粉末が生じるまで、結晶を乾燥させる。
【0297】 (実施例33:Purafect(プロテアーゼ)4000L結晶化) 材料: A−粗製purafect 4000L B−15% NaSO4溶液 手順: 1容量の粗製purafect酵素溶液を、2容量の15%Na2SO4溶液と
混合する。混合物を、室温で24時間、または結晶化が完了するまで、攪拌する
。結晶を15% Na2SO4溶液で洗浄し、可溶性酵素を除去する。結晶を新鮮
な15% Na2SO4溶液中に懸濁し、27mg/mlのタンパク質濃度を得る
【0298】 (実施例34:Purafect結晶の乾燥) 材料: A−purafect結晶懸濁液 B−ポリ(エチレングリコール)、100% PEG 200、300、400、または600 C−有機溶媒 手順: 結晶懸濁液(140mg)の4mlアリコートを、4つの15ml管に添加す
る。次に、この懸濁液を、1000RPM〜3000RPMの間で、1〜5分間
の間、または結晶化緩衝液が除去されるまで、遠心分離する。次いで、4mlの
液体ポリマー(200と600との間のいかなるPEGも適切である)を各管に
添加し、そしてこの内容物を均一になるまで混合する。この懸濁液を1000R
PM〜3000RPMの間で、1〜5分間の間、または液体ポリマーが除去され
るまで、遠心分離する。次に、4mlのアセトン(イソプロパノール、ブタノー
ル、および他の溶媒もまた適切である)を各管に入れ、そして十分に混合する。
結晶/有機溶媒懸濁液を、0.8cm×4cm BIO−RADポリ分取クロマ
トグラフィーカラム(スピンカラム)に移す。カラムを、有機溶媒を除去するた
めに、1000RPMで1〜5分間、遠心分離する。最後に、窒素ガスをカラム
に通し、自由流動粉末が生じるまで、結晶を乾燥させる。
【0299】 (実施例35:結晶化のためのDNAの生成) pUCプラスミド由来のプラスミド(例えば、pSP64)は、結晶化用のD
NAまたはmRNAのいずれかを産生するために使用され得る。本実施例におい
て、プラスミドpSP64(Promega Biological Rese
arch Productsから入手可能)を用いて結晶化用のDNAを生成さ
せる。目的のタンパク質をコードするcDNAを、マルチプルクローニング部位
で利用可能な多数の制限部位のいずれかに挿入する。次いで、組換えプラスミド
を、E.coli細菌を形質転換するために使用する。次に、大量のプラスミド
を、アンピシリン含有培地中の細菌の増殖により得る。組換えプラスミドを生産
し、E.coli細胞を形質転換し、そして細菌増殖およびプラスミドDNA調
製のための技術は「Molecular Cloning、第2版」(1989
)Sambrook、J.、Fritsch、E.F.およびT.Maniat
isにおいて詳細に記載される。
【0300】 続いて、プラスミドDNAを、細胞をまず溶解し、次いでゲノムDNA、RN
A、および他の細胞材料からプラスミドDNAをCsCl勾配を用いて分離する
ことにより、細菌培養物から精製する。これらの技術は、当該分野で周知であり
、Sambrookらで詳細に議論されている。勾配精製DNAを、Tris−
EDTA緩衝液飽和N−ブタノールで抽出し、そして最後にエタノールで抽出す
る。次に、プラスミドDNAを、RNA結晶化のためにmRNAの生成(実施例
36)、またはDNA結晶化のために目的の遺伝子の切り出し(実施例37)に
使用される、プラスミドのいずれかの線状化に供する。
【0301】 (実施例36:結晶化のためのmRNAの生成) SP6 RNAポリメラーゼと組み合わせたSP64プラスミド(Prome
ga Biological Research Productsから入手可
能)を、5’キャップ化RNA転写物のミリグラム量の生成のために使用する。
実施例35で調製したプラスミドを、遺伝子の切り出しの前に、ポリAテールの
下流の制限酵素で線状化する。この線状化したプラスミドを、2回のフェノール
/クロロホルム抽出および2回のクロロホルム抽出によって精製する。次に、D
NAを、NaOAc(0.3M)および2容量のEtOHで沈殿させる。次に、
ペレットを、DEPC処理した蒸留した脱イオン水中におよそ1mg/mlで再
懸濁する。
【0302】 転写を、400mM Tris HCl(pH8.0)、80mM MgCl 2 、50mM DTT、および40mMスペルミジンで構成される緩衝液中で実
施する。続く試薬を、室温で1容量のDEPC処理水に対して以下の順に添加す
る:1容量のSP6 RNAポリメラーゼ転写緩衝液;rATP、rCTP、お
よびrUTP(1mM濃度まで);rGTP(0.5mM濃度まで);7meC
(5’)ppp(5’)Gキャップアナログ(New England Bio
labs、Beverly、Mass.、01951)(0.5mM濃度まで)
;上記で調製した線状化DNAテンプレート(0.5mg/ml濃度まで);R
NA(Promega、Madison、Wis.)(2000U/ml濃度ま
で);およびSP6 RNAポリメラーゼ(Promega、Madison、
Wis.)(3000U/ml濃度まで)。転写混合物を、37℃で1時間イン
キュベートする。
【0303】 次いで、DNAテンプレートを、使用した1μgのDNAテンプレート当たり
2UのRQ1 DNAse(Promega)を添加することにより消化する。
消化反応を、15分間実施する。転写RNAを、クロロホルム/フェノールで2
回、およびクロロホルムで2回抽出する。上清溶液を、2容量のEtOH中0.
3M NaOAcで沈殿させ、そしてこのペレットを、500ml転写産物当た
り100ml DEPC処理脱イオン水で再懸濁する。最後に、上清溶液を、R
NAse非含有Sephadex G50カラム(Boehringer Ma
nnheim # 100 411)に通す。得られるmRNAは、結晶化に用
いられるのに十分に純粋である。
【0304】 (実施例37:DNA結晶化) 材料: A−精製プラスミドDNA(実施例35) B−スペルミン C−MPD(2−メチル−2,4−ペンタンジオール) D−5mM酢酸カルシウム緩衝液(pH7.0) E−脱イオン水 手順: 増幅されたDNA(実施例35)を、制限消化によってプラスミドから除去す
る。挿入された遺伝子を、適切な分子量のゲルバンドからの目的遺伝子のアガロ
ースゲル電気泳動および抽出によって、プラスミドビヒクルから精製する。
【0305】 ハンギングドロップ(hanging drop)技術を使用して、5mM酢
酸ナトリウム/20% MPD/1mMスペリミン緩衝液(pH7.0)中5m
g/mlのDNAを、90%のDNAが結晶化されるまで、室温でインキュベー
トする。得られる結晶を、結晶化緩衝液で洗浄し、全ての可溶性材料を結晶から
除去する。次いで、5mg/mlのDNA濃度を達成するまで、結晶を新鮮な結
晶化緩衝液中に再懸濁する。
【0306】 (実施例38:RNA結晶化) 材料: A−精製mRNA(実施例36) B−スペルミン C−MPD(2−メチル−2,4−ペンタンジオール) D−5mM酢酸カルシウム緩衝液(pH7.0) E−脱イオン水 手順: ハンギングドロップ技術を使用して、5mM酢酸カルシウム/20% MPD
/1mMスペリミン緩衝液(pH7.0)中5mg/mlのRNA(実施例36
)を、90%のRNAが結晶化されるまで、室温でインキュベートする。得られ
る結晶を、結晶化緩衝液で洗浄し、全ての可溶性材料を結晶から除去する。次い
で、5mg/mlのRNA濃度を達成するまで、結晶を新鮮な結晶化緩衝液中に
再懸濁する。
【0307】 (実施例39:DNA結晶を用いるHIV gp120に対する免疫応答の誘
発) HIV gp160をコードするDNAを、実施例36および37の方法に従
って調製する。次いで、HIV gp160の結晶を、マウスの免疫化のために
使用する。広範な中和免疫を誘発するワクチンを設計するために、HIVの初代
分離株および実験分離株の両方の多くの遺伝的クローンは、Aids Rese
arch and Reagent Program、National In
stitutes of Allergy and Infectious D
iseases、Rockville MD 20852から入手可能である。
【0308】 DNA結晶を、結晶化緩衝液中で維持し、そして200μl/マウスを後脚に
注射する。gp120に対する免疫応答の発達を、1ヶ月の基準でELISAに
おいて対応するV3ループペプチドに対する血清抗体を測定することにより決定
する。
【0309】 (実施例40:mRNA結晶を用いるHIV gp120に対する免疫応答の
誘発) HIV gp160をコードするRNAを、実施例35、36および38の方
法に従って調製する。次いで、HIV gp160 mRNAの結晶を、マウス
の免疫化のために使用する。広範な中和免疫を誘発するワクチンを設計するため
に、HIVの種々の初代分離株および実験分離株は、Aids Researc
h and Reagent Program、National Insti
tutes of Allergy and Infectious Dise
ases、Rockville MD 20852から入手可能である。
【0310】 RNA結晶を、結晶化緩衝液中で維持し、そして200μl/マウスを後脚に
注射する。gp120に対する免疫応答の発達を、1ヶ月の基準でELISAに
おいて対応するV3ループペプチドに対する血清抗体を測定することにより決定
する。
【0311】 (実施例41 オリゴDNA結晶化) 材料: A−合成オリゴDNA B−スペルミン C−MPD(2−メチル−2,4−ペンタンジオール) D−5mM 酢酸Ca緩衝液 pH7.0 E−脱イオン水 手順: ハンギングドロップ(hanging drop)技術を用いて、5mM酢酸
Mg/30% MPD/1mMスペルミン緩衝液(pH7.0)中5mg/ml
の合成オリゴDNAを、このDNAの90%が結晶化するまで室温にてインキュ
ベートする。得られた結晶を結晶化緩衝液で洗浄し、この結晶からすべての可溶
性物質を除去する。次いで、この結晶を、新しい結晶化緩衝液中に再懸濁し、5
mg/mlのDNA濃度を達成する。
【0312】 (実施例42 遺伝子発現の阻害のためのアンチセンスDNA投与) 抑制されるべきmRNA種のセンス鎖に相補的であるDNA配列をコードする
オリゴDNA結晶を、実施例41に記載するように生成する。次に、この結晶ま
たはこの結晶を含む処方物を、遺伝子発現の阻害が意図される部位に投与する。
引き続いて、細胞が、このDNA結晶または溶解されたDNAを取り込み、そし
てこのオリゴDNAおよび宿主mRNAが、相補的な塩基対を形成し、そして遺
伝子発現が一定の時間阻害される。
【0313】 (カプセル化されたタンパク質結晶) (実施例43 Pseudomonas cepaciaリパーゼの大規模結
晶化) 15kgの粗製Pseudomonas cepaciaリパーゼ(PS30
リパーゼ−Amano)(「LPS」)のスラリーを、100Lの蒸留した脱イ
オン水中に溶解し、そしてさらなる蒸留した脱イオン水を用いて容量を200L
にした。この懸濁液を、Air Drive Lightningミキサー中で
室温にて2時間混合し、次いで0.5μmフィルターを通して濾過し、セリット
(celite)を除去した。次いで、この混合物を、3K中空ファイバーフィ
ルター膜カートリッジを使用して限外濾過し、そして10L(121.4g)に
濃縮した。固体の酢酸カルシウムを、20mM Ca(CH3COO)2の濃度に
まで添加した。必要に応じて、pHを、濃酢酸を用いて5.5に調整した。この
混合物を加熱し、そして30℃の温度に維持した。硫酸マグネシウムを、0.2
Mの濃度にまで添加し、続いてグルコポン(glucopon)を1%の濃度に
まで添加した。次いで、イソプロパノールを23%の最終濃度にまで添加した。
得られた溶液を、30℃にて30分間混合し、次いで30℃から12℃にまで2
時間にわたって冷却した。次いで、結晶化を16時間進行させた。
【0314】 この結晶を沈殿させ、そして可溶性タンパク質を、末端に10mlのピペット
を有するタイゴン管を備えた蠕動ポンプを用いて除去した。新しい結晶化溶液(
23%イソプロピルアルコール、0.2M MgSO4、1%グルコポン、20
mM Ca(CH3COO)2、pH5.5)を添加し、タンパク質の濃度を30
mg/mlにした(1mg/ml溶液のO.D.280=1.0、分光光度計を
波長280で用いて測定した場合)。結晶の収量は、約120グラムであった。
【0315】 (架橋されたLPS結晶) 架橋されたPseudomonas cepaciaリパーゼ結晶(Chir
oCLEC−PCTMという名称で販売されており、Altus Biologi
cs,Inc.(Cambridge,Massachusetts)から入手
可能である)を用いて、実施例48によって処方物を生成した。あるいは、上記
のように調製したリパーゼ結晶は、任意の従来方法を用いて架橋され得る。
【0316】 (実施例44 グルコースオキシダーゼ結晶の架橋) 次いで、本発明者らは、実施例21において調製されたグルコースオキシダー
ゼ結晶を下記のように架橋した。この架橋手順は、グルタルアルデヒド、または
Tris緩衝液(2−アミノ−2−ヒドロキシメチル−1,3−プロパンジオー
ル)、リジン、もしくはジアミノオクタンのいずれかを用いて前処理されたグル
タルアルデヒドを含んだ。
【0317】 この架橋を、60mgのタンパク質を用いて行った。Tris前処理グルタル
アルデヒド(48mg Tris塩/1gグルタルアルデヒド)を、0.2Mリ
ン酸ナトリウム、pH7.0中に懸濁した1gのGO結晶あたり0.2gおよび
0.6gの濃度にまで添加した。反応を、室温にて2時間進行させた。2時間後
、この結晶をガラスファイバー紙を通して濾過および洗浄した。
【0318】 この架橋した結晶を、実施例48に記載のようにカプセル化した。様々に架橋
された結晶の間で、カプセル化プロセスにおいて差異はなかった。代表的なサン
プルを、図21に示す。
【0319】 (実施例45 架橋されたCandida rugosaリパーゼ結晶) 架橋したCandida rugosaリパーゼ結晶(ChiroCLEC−
CRTMという名称で販売されており、Altus Biologics,Inc
.(Cambridge,Massachusetts)から入手可能である)
を用いて、実施例48によって処方物を生成した。あるいは、上記で調製したリ
パーゼ結晶は、任意の従来方法を用いて架橋され得る。
【0320】 (実施例46 ヒト血清アルブミン結晶の架橋) 実施例10において調製されたヒト血清アルブミン結晶に対して架橋を行った
。この架橋反応を、50%の飽和硫酸アンモニウムを含む母液中の攪拌された結
晶溶液中で、4℃にて行った。ホウ酸塩で前処理したグルタルアルデヒドでの架
橋の前には、この結晶を洗浄しなかった。
【0321】 前処理したグルタルアルデヒドを、1容量の50%グルタルアルデヒド(「G
A」)を、等量の300mMホウ酸ナトリウム(pH9)に添加することによっ
て調製した。次いで、このグルタルアルデヒド溶液を、60℃にて1時間インキ
ュベートした。この溶液を、室温まで冷却し、そして濃HClを用いてpHを5
.5に調整した。次に、この溶液を、氷上で迅速に4℃にまで冷却した。
【0322】 前処理したグルタルアルデヒド(25%)を、段階様式で、15分間隔で0.
05%の増分(総濃度)を用いて、2%の濃度にまで結晶化溶液に添加した。使
用された結晶化溶液のアリコートは、1ml〜500mlの容量の範囲に及んだ
。次いで、この結晶を、5%GAにし、そして4℃にて4時間インキュベートし
て架橋させた。最終的に、アルブミン架橋した結晶を、低速の遠心分離によって
回収し、そしてpH7.5、100mM Tris HClを用いて繰り返し洗
浄した。この架橋された結晶が、凝集することなく高速で遠心分離され得るとき
に、洗浄を停止した。
【0323】 (実施例47 ペニシリンアシラーゼの架橋) 前処理したグルタルアルデヒドを、実施例46の方法によって調製した。
【0324】 前処理したグルタルアルデヒド(25%)を、段階様式で、15分間隔で0.
05%の増分(総濃度)を用いて、1.5%の濃度にまで結晶化溶液に添加した
。使用された結晶化溶液のアリコートは、1ml〜500mlの容量の範囲に及
んだ。最終的に、架橋した結晶を、低速の遠心分離によって回収し、そしてpH
7.5、100mM Tris HClを用いて繰り返し洗浄した。この架橋さ
れた結晶が、凝集することなく高速で遠心分離され得るときに、洗浄を停止した
【0325】 (実施例48 ポリ乳酸−コ−グリコール酸(PLGA)中のタンパク質結晶
のマイクロカプセル化) A.糖タンパク質、タンパク質、酵素、ホルモン、抗体およびペプチド Candida rugosaおよびPseudomonas cepaci
a由来のリパーゼ、Aspergillus niger由来のグルコースオキ
シダーゼ、ならびにEscherichia coli由来のペニシリンアシラ
ーゼの非架橋結晶を用いて、マイクロカプセル化を行った。さらに、Candi
da rugosa由来のリパーゼ、Aspergillus niger由来
のグルコースオキシダーゼ、およびEscherichia coli由来のペ
ニシリンアシラーゼの架橋された酵素結晶を用いて、マイクロカプセル化を行っ
た。表13は、この実施例によって生成されたマイクロスフェアのサンプルのお
よその平均直径を示す。さらに、生成されたヒト血清アルブミンまたは任意の他
のタンパク質結晶またはタンパク質結晶処方物は、この技術によってカプセル化
され得る。
【0326】
【表13】 B.乾燥結晶の調製: 実施例6によって乾燥された結晶または結晶処方物を、各々用いて、本発明の
マイクロスフェアを生成し得る。本発明における使用のためのタンパク質結晶を
乾燥させるための1つのプロセスは、空気乾燥を含む。
【0327】 実施例1からのCandida rugosaリパーゼ結晶(非架橋および架
橋)、実施例21および44からのグルコースオキシダーゼ(非架橋および架橋
)、ならびに実施例14および47からのペニシリンアシラーゼ(非架橋および
架橋)の各々約500mgを、空気乾燥させた。最初に、母液を、3000rp
mでの5分間の遠心分離によって除去した。次に、結晶を、25℃にて2日間、
換気フード中に置いた。
【0328】 (C.ポリマーおよび溶媒) タンパク質結晶をカプセル化するのに使用したポリマーは、PLGAであった
。PLGAは、50/50ポリ(DL−ラクチド−co−グリコリド)として、
Birmingham Polymers,Inc.からロット番号D9718
8から購入した。このロットは、HFIP中30℃で、0.44dl/gの固有
の粘度を有していた。
【0329】 塩化メチレンは、分光学的グレードであり、そしてAldrich Chem
ical Co.Milwaukee,WIから購入した。ポリビニルアルコー
ルを、Aldrich Chemical Co.Milwaukee,WIか
ら購入した。
【0330】 (D.PLGAにおける結晶のカプセル化) 結晶を、二重エマルジョン法を使用してPLGA中にカプセル化した。一般的
なプロセスは、以下の通りであった。乾燥タンパク質結晶またはタンパク質結晶
のスラリーのいずれかを、まず、塩化メチレン中のポリマー溶液に添加した。そ
の結晶をポリマーでコートし、そして新生マイクロスフェアとなった。次いで、
有機溶媒溶液中のそのポリマーを、界面活性剤を含有するより大きな容量の水溶
液へと移した。結果として、その有機溶媒は、蒸発し始め、そしてそのポリマー
は硬化した。この実施例では、漸減濃度の乳化剤の2つの連続的な水溶液を、そ
のポリマーコートを硬化するために使用し、マイクロスフェアを形成した。以下
の手順は、この一般的なプロセスの1つの例示であった。ポリマーサイエンスの
当業者は、その手順の多くの改変が利用され得ること、および以下の実施例は本
発明を限定することを意図されたものではないことを理解する。
【0331】 (1.0 乾燥タンパク質結晶の使用) 実施例1に従って製造された架橋された、および架橋されていないCandi
da rugosaリパーゼの乾燥結晶、実施例21および45に従って製造さ
れた架橋された、および架橋されていないグルコースオキシダーゼ、実施例14
および47に従って製造された架橋された、および架橋されていないペニシリン
アシラーゼを、150mgサンプルへと計量した。次いで、計量したタンパク質
結晶を、2mlの塩化メチレンおよび0.6gPLGA/1ml溶媒のPLGA
を含有する15mlのポリプロピレン遠心分離チューブ(Fisher Sci
entific)に直接添加した。その結晶を、溶媒の表面へ直接添加した。次
いで、そのチューブを、2分間室温でボルテックスすることによって十分に混合
し、PLGAを含む溶媒中でタンパク質結晶を完全に分散させた。その結晶を、
ポリマーで完全にコートした。新生マイクロスフェアを懸濁された状態に維持す
るために、さらにボルテックスまたは攪拌をして、さらなるコーティングを許容
し得る。そのポリマーは、3.0節に記載されるように硬化され得る。
【0332】 (2.0 タンパク質結晶スラリーの使用) Pseudomonas cepaciaリパーゼの結晶スラリーを、200
μlの母液当たり約50mgの結晶を使用して作製した。結晶スラリーを、塩化
メチレンおよび0.6gのPLGA/1ml溶媒のポリ(乳酸−co−グリコー
ル酸)の2mlの溶液とともに、15mlポリプロピレン遠心分離チューブ(F
isher Scientific)へ迅速に注入した。そのニードルを溶媒の
表面下に挿入し、そして溶液中に注入した。この場合、150mgの総タンパク
質、または600μlの水溶液を注入した。プラスチックシリンジLeur−l
ok(Becton−Dickinson&Company)を使用して、22
ゲージ(Becton−Dockinson&Company)のステンレスス
チールニードルを介して注入した。次いで、タンパク質結晶PLGAスラリーを
、2分間室温でボルテックスすることによって完全に混合した。その結晶をポリ
マーで完全にコートした。新生マイクロスフェアを懸濁した状態で維持し、さら
にコーティングするために、必要に応じて、さらにボルテックスまたは攪拌した
【0333】 (3.0 ポリマーコーティングの硬化) 液体ポリマーコートから塩化メチレンを除去することを容易にし、そしてその
ポリマーをタンパク質結晶上で硬化させるために、2工程プロセスを利用した。
工程間の差異は、乳化剤の濃度が第1の溶液においてずっと高く、そして第1の
溶液の容量が、第2の溶液よりもずっと小さいことである。
【0334】 第1の工程において、ポリマーでコートされた結晶および塩化メチレン懸濁液
を、室温で、0.5%塩化メチレンを含む水中180mlの6%ポリビニルアル
コール(本明細書中以下で「PVA」)の攪拌したフラスコに滴下して加えた。
この溶液を、1分間迅速に混合した。
【0335】 工程2において、新生マイクロスフェアを含有する第1のPVA溶液を、2.
4リットルの冷(4℃)蒸留水中に迅速に注いだ。この最終浴を、4℃で1時間
、溶液の表面を窒素下でおいて、穏やかに混合した。1時間後、マイクロスフェ
アを、0.22μmのフィルターを使用して濾過し、そして凝集を減少させるた
めに0.1%Tween20を含有する3リットルの蒸留水で洗浄した。
【0336】 (実施例49) (カプセル化した結晶の作製) Pseudomonas cepaciaリパーゼのカプセル化マイクロスフ
ェアを、相分離技術によって調製する。実施例43において調製された結晶LP
Sを、二重エマルジョン法を使用して、ポリ乳酸−co−グリコール酸(「PL
GA」)中にカプセル化する。タンパク質結晶の700mgのアリコートを、P
LGAを含有する塩化メチレン(0.6g PLGA/1ml溶媒;10ml)
中に注入する。その混合物を、マイクロファインチップを供えたホモジナイザー
を使用して、30秒間、3,000rpmでホモジナイスする。得られる懸濁液
を、6%ポリ(ビニルアルコール)(「PVA」)および塩化メチレン(4.5
ml)を含有する攪拌しているタンク(900ml)に移す。その溶液を、1,
000rpmで1分間混合する。PVA溶液中のマイクロスフェアを、蒸留水中
に浸漬させることによって沈殿させ、洗浄し、そして濾過する。次いで、そのマ
イクロスフェアを、凝集を減少させるために0.1%のTweenを含有する蒸
留水で洗浄し、そして2日間、4℃で窒素で乾燥させる。
【0337】 (実施例50) (A.マイクロスフェアのタンパク質濃度) 実施例48で調製したマイクロスフェアの総タンパク質含量を測定した。25
mgのPLGA/PVAマイクロスフェアの3連のサンプルを、1Nの水酸化ナ
トリウム中で48時間混合させながらインキュベートした。次いで、タンパク質
含量を、Bradford法(M.M.Bradford,Analytica
l Biochemistry、vol.72、248〜254頁(1976)
)およびBioRad Laboratories(Hercules,CA)
からの市販のキットを使用して見積もった。タンパク質を含有するマイクロスフ
ェアを、結晶を含まないPLGAマイクロスフェアと比較した。これを表14に
示す。
【0338】
【表14】 表14から選択されたサンプルのミリグラム当たりの活性または比活性を決定
した。これを表15に示す。
【0339】
【表15】 (実施例51) (マイクロスフェアからのタンパク質の放出) 実施例48で調製されたPLGAマイクロスフェアからのタンパク質の放出を
、0.22μmのフィルターを含有する微少遠心分離濾過チューブ中に50mg
のタンパク質カプセル化PLGAマイクロスフェアを配置することによって測定
した。次に、600μlの放出緩衝液(0.2%Tween20を含むリン酸緩
衝化生理食塩水、pH7.4)を、フィルターの保持側のマイクロスフェアに添
加した。そのチューブを37℃でインキュベートし、溶解させる。経時的に放出
させたタンパク質の量を測定するために、サンプルを異なる時間間隔で採取した
。そのチューブを3000rpmで1分間遠心分離し、そしてその濾過物をタン
パク質活性および総タンパク質測定について取り出した。次いで、マイクロスフ
ェアをさらなる600μlの放出緩衝液で再懸濁した。
【0340】 (A.マイクロスフェアから放出された総タンパク質) 表16は、ほぼ90%のインプットしたタンパク質が全ての場合において回収
されたことを示す。さらに、マイクロカプセル化したタンパク質結晶から放出さ
れた総Pseudomonas cepaciaリパーゼのパーセントは、約5
.7日間、またはインプットしたタンパク質の80%を超えるものが、15.8
%/日の速度で放出されるまで、比較的定常であった。この長い迅速放出の後は
、1日当たりわずか0.6%の放出のみが8日間続いた 対照的に、表16は、Candida rugosaリパーゼ結晶が、まず最
初ゆっくりとした放出を示し、続いて迅速な放出相が続いた反対のプロフィール
を示したことをさらに示す。最初の3日間において、約10%のタンパク質が2
.4%/日の緩やかな勾配を伴って放出された。4日から14日まで、さらにタ
ンパク質の80%が、直線的に、7.5%/日の勾配で、放出された。表16に
示した放出したプロフィールは、37℃、pH7.4で得られた。
【0341】 これらのデータは、本発明のカプセル化したタンパク質が治療用タンパク質の
生物学的送達に適していることを示す。送達の種々の速度は、タンパク質結晶、
結晶の選択、結晶の架橋、カプセル化するポリマーの疎水性および親水性の特徴
、カプセル化の数、マイクロスフェアの用量、および他の簡単に制御可能な変数
の選択を操作することによって選択され得る。
【0342】
【表16】 (B.マイクロスフェアから放出されたタンパク質の活性) 経時的に放出されたタンパク質の生物学的活性を、リパーゼマイクロスフェア
についてのオリーブ油アッセイを用いて測定した。これらの結果を表17に示す
【0343】 表17に示すように、放出されたタンパク質の生物学的活性は、マイクロスフ
ェアが、活性タンパク質を保護および放出することを実証する。タンパク質の投
入量に基づいて計算した放出された活性の累積率は、放出されたタンパク質の総
量と密接な相関関係にあった(表16と表17とを比較のこと)。二つの異なる
結晶リパーゼは、本質的に100%活性なタンパク質を放出した。37℃での液
浸の7日後でさえ、マイクロスフェアから放出されたタンパク質は、完全に活性
であった。
【0344】
【表17】 上記に示す活性測定を、実施例8に記載したオリーブオイルアッセイを用いて
行った。
【0345】 (実施例52) (PLGAマイクロスフェアの顕微鏡検査) 結晶が、カプセル化後にインタクトであったか否かを可視化するために、実施
例48に従って調製したPLGAマイクロスフェアを、DXC−970MD 3
CCDカラービデオカメラ、カメラアダプター(CMA D2)、Image
ProPlusソフトウェアを備えたOlympus BX60マイクロスコー
プの下で検査した。乾燥マイクロスフェアのサンプルを、ガラスカバーガラスで
覆い、マウントし、そしてOlympus UPLAN E1対物レンズ10×
0.30 PH1(位相差)を備えるOlympus顕微鏡を用いて10×の拡
大率の下で検査して、結晶を容易に可視化し、そして結晶サイズを決定した。マ
イクロスフェアサイズおよび結晶サイズを、OlympusからのImage
Proソフトウェアおよび製造業者によって提供される0.5〜150μmサイ
ジングビーズを用いて決定した。PLGAマイクロスフェアの外側のサイズを決
定し、結晶についても同様に決定した。
【0346】 図17は、実施例48の方法によってカプセル化されたCandida ru
gosa由来のリパーゼの架橋酵素結晶を示す。結晶サイズは、約25μmであ
り、そしてマイクロスフェアは、約90μmであった。拡大率は、250×であ
った。
【0347】 図18は、実施例48の方法によってカプセル化されたCandida ru
gosa由来のリパーゼの非架橋酵素結晶を示す。結晶サイズは、約25μmで
あり、そしてマイクロスフェアは、約120μmであった。拡大率は、250×
であった。
【0348】 図19は、実施例48の方法によってカプセル化されたEscherichi
a coli由来のペニシリンアシラーゼの架橋酵素結晶を示す。結晶サイズは
、約25μmであり、そしてマイクロスフェアは、約70μmであった。拡大率
は、250×であった。
【0349】 図20は、実施例48の方法によってカプセル化されたEscherichi
a coli由来のペニシリンアシラーゼの非架橋酵素結晶を示す。結晶サイズ
は、約50μmであり、そしてマイクロスフェアは、約90μmであった。拡大
率は、250×であった。
【0350】 図21は、実施例48の方法によってカプセル化されたAspergillu
s niger由来のグルコースオキシダーゼの架橋酵素結晶を示す。結晶サイ
ズは、0.5〜1μmの範囲であり、そしてマイクロスフェアは、約50μmで
あった。拡大率は、500×であった。
【0351】 図22は、実施例48の方法によってカプセル化されたAspergillu
s niger由来のグルコースオキシダーゼの非架橋酵素結晶を示す。結晶サ
イズは、0.5〜1μmの範囲であり、そしてマイクロスフェアは、約50μm
であった。拡大率は、500×であった。
【0352】 図23は、実施例48の方法によって母液中にスラリーとしてカプセル化され
たPseudomonas cepacia由来のリパーゼの非架橋酵素結晶を
示す。結晶サイズは、約2.5μmであり、そしてマイクロスフェアは、約60
μmであった。拡大率は、500×であった。
【0353】 図24は、Pseudomonas cepacia由来のリパーゼの非架橋
酵素結晶を示す。結晶サイズは、約2.5μmであった。拡大率は、1000×
であった。
【0354】 (実施例53) (タンパク質放出) PLGAマイクロスフェアからのタンパク質の放出を、0.22μmフィルタ
ーを含むマイクロ遠心濾過チューブ中に50mgのPLGAマイクロスフェアを
置くことによって測定する。放出緩衝液(10mM HEPES、pH7.4、
100mM NaCl、0.02% Tween、0.02%アジド)の600
μlのアリコートを、フィルターの保持側面(retentate side)
上のマイクロスフェアへ添加して懸濁する。チューブを、3ccバイアル栓で密
閉し、パラフィルムを覆う。次いで、マイクロスフェアを、37℃でインキュベ
ートする。サンプルを、チューブの遠心分離(13,000rpm、1分)によ
って経時的に得る。濾液を取り出し、そしてマイクロスフェアを、600μlの
放出緩衝液を用いて再懸濁する。放出されたタンパク質の品質を、SEC−HP
LCおよび酵素活性によってアッセイする。
【0355】 タンパク質結晶の形およびサイズを、本発明のタンパク質結晶処方物の溶解の
割合か、または他の特性を調整するために選択し得る。
【0356】 (実施例54) (生物学的ポリマーを用いるリパーゼ結晶のカプセル化) 生物学的ポリマーはまた、タンパク質結晶のカプセル化に有用である。本実施
例は、Candida rugosaリパーゼ結晶の架橋結晶および非架橋結晶
のカプセル化を実証する。非架橋結晶および架橋結晶を、実施例1および実施例
45に記載のように調製した。抗体および化学薬品を、Sigmaから購入した
【0357】 (1.0 被覆結晶の調製) 10mg/mlにて1.5mlのウシ血清アルブミン(「BSA」)の溶液を
、pH7に調整した5mMリン酸緩衝液中で調製した。次いで、15mlのCa
ndida rugosaリパーゼ結晶の10mg/ml懸濁液を、5mM K
/Naリン酸緩衝液、1M NaCl、pH7(「緩衝液」)中で調製した。B
SA溶液を結晶溶液へ添加し、そして二つの溶液を、十分に混合した。結晶を、
オービタルシェーカー(orbital shaker)を使用してBSA中で
30分間ゆっくりと混合しながらインキュベートした。BSAとのインキュベー
ションに続いて、結晶を、真空ろ過によって一晩乾燥した。乾燥させた結晶をア
ルブミンを有さない緩衝液中に再懸濁した。結晶を、280nmの吸光度で測定
した洗浄液中にタンパク質を検出出来なくなるまでか、またはA280nmが0.0
1未満になるまで、緩衝液を用いて洗浄した。この結晶を、低速遠心分離によっ
て回収した。
【0358】 (2.0 アルブミン被膜の検出) 被覆結晶を、ウェスタンブロットによって評価して、アルブミン層の存在を確
認した。洗浄に続いて、被覆タンパク質結晶を、100mM NaOH中で一晩
インキュベートして、マイクロスフェアを成分タンパク質へと溶解した。サンプ
ルを、中和し、ろ過し、そしてSambrookら、「Molecular C
loning: A Laboratory Manual」,Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press,Cold Sp
ring Harbor,New York(1989)に従ってSDS−PA
GEイムノブロットによって分析した。
【0359】 Candida ragosaリパーゼのアルブミン被覆架橋結晶マイクロス
フェアおよびアルブミン被覆非架橋結晶マイクロスフェアの両方のSDS−PA
GEイムノブロットの結果は、アルブミンと同じ分子量を有する単一の免疫反応
種を示した。
【0360】 Candida ragosaリパーゼのアルブミン被覆架橋結晶マイクロス
フェアおよびアルブミン被覆非架橋結晶マイクロスフェアのサンプルを、ウシ血
清アルブミンを特異的に認識しかつ結合する蛍光標識抗BSA抗体と共にインキ
ュベートした。次いで、過剰な抗体を、リン酸緩衝液を用いて洗浄することで取
り除いた。蛍光顕微鏡下での、これらの蛍光性標識アルブミン被覆結晶マイクロ
スフェアの顕微鏡検査は、マイクロスフェアの特異的蛍光標識を示した。非被覆
リパーゼ結晶をコントロールとして用い、そしてこれらは抗体の特異的結合を示
さなかった。
【0361】 本発明者らは、上に本発明の多くの実施態様を記載したが、本発明者らの基礎
的な構築物を変化させて、本発明のプロセスおよび組成物を利用する他の実施態
様を提供し得ることは明白である。従って、本発明の範囲は、例示の目的で上に
示した特定の実施態様によってよりはむしろ、ここに添付される特許請求の範囲
によって定義されるべきであることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、Candida rugosaリパーゼの以下の分子状態の相対的な
安定性を示す:架橋アモルファス、液体、20%有機溶媒における結晶、20%
有機溶媒における架橋結晶、有機溶媒を伴わない架橋結晶(「Xlinke p
pt」は、架橋沈殿物を示す)。
【図2】 図2は、40℃での可溶性リパーゼの比活性を経時的に示す。
【図3】 図3は、40℃および湿度75%で方法1によって乾燥させたリパーゼ結晶処
方物の貯蔵安定性を示す。
【図4】 図4は、40℃および湿度75%で方法4によって乾燥させたリパーゼ結晶処
方物の貯蔵安定性を示す。
【図5】 図5は、初期時間0においてポリエチレンオキシドを用いて処方したリパーゼ
結晶を示す。
【図6】 図6は、40℃および湿度75%で、129日間インキュベーションした後に
、ポリエチレンオキシドを用いて処方したリパーゼ結晶を示す。
【図7】 図7は、初期時間0においてゼラチンを用いて処方したヒト血清アルブミン結
晶を示す。
【図8】 図8は、50℃にて4日間インキュベーションした後にゼラチンを用いて処方
したヒト血清アルブミン結晶を示す。
【図9】 図9は、55℃での可溶性ペニシニンアシラーゼの比活性を経時的に示す。
【図10】 図10は、55℃での種々の乾燥ペニシリンアシラーゼ結晶処方物の貯蔵安定
性を示す。
【図11】 図11は、可溶性グルコースオキシダーゼの比活性を経時的に示す。
【図12】 図12は、50℃での種々の乾燥グルコースオキシダーゼ結晶処方物の貯蔵安
定性を示す。
【図13】 図13は、初期時間0にてラクチトールを用いて処方したグルコースオキシダ
ーゼ結晶を示す。
【図14】 図14は、50℃にて13日間インキュベーションした後にラクチトールを用
いて処方したグルコースオキシダーゼ結晶を示す。
【図15】 図15は、初期時間0にてトレハロースを用いて処方したグルコースオキシダ
ーゼ結晶を示す。
【図16】 図16は、50℃にて13日間のインキュベーション後にトレハロースを用い
て処方したグルコースオキシダーゼ結晶を示す。
【図17】 図17は、Candida rugosa由来のリパーゼのカプセル化し架橋
した酵素結晶を示す。
【図18】 図18は、Candida rugosa由来のリパーゼのカプセル化し架橋
していない酵素結晶を示す。
【図19】 図19は、Escherichia coli由来のペニシリンアシラーゼの
カプセル化し架橋した酵素結晶を示す。
【図20】 図20は、Escherichia coli由来のペニシリンアシラーゼの
カプセル化し架橋していない酵素結晶を示す。
【図21】 図21は、Aspergillus niger由来のグルコースオキシダー
ゼのカプセル化し架橋した酵素結晶を示す。
【図22】 図22は、Aspergillus niger由来のグルコースオキシダー
ゼのカプセル化し架橋していない酵素結晶を示す。
【図23】 図23は、Pseudomonas cepacia由来のリパーゼの架橋さ
れていない酵素結晶のカプセル化した水性スラリーを示す。
【図24】 図24は、Pseudomonas cepacia由来のリパーゼの架橋さ
れていない酵素結晶を示す。
【手続補正書】特許協力条約第34条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成12年5月19日(2000.5.19)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0019
【補正方法】変更
【補正内容】
【0019】 Jensenらは、インスリンの気道送達における使用のために吸収エンハン
サーとともにインスリンを共沈殿させた(PCT特許出願WO98/42368
を参照のこと)。ここでは、吸収エンハンサーは、界面活性物質(例えば、脂肪
酸の塩または胆汁酸塩)として記載された。直径10マイクロメートル未満であ
り、かつ亜鉛を欠くインスリン結晶は、S.Havelundによって作製され
た(PCT特許出願WO98/42749を参照のこと)。同様に、結晶はまた
、肺投与を増強するために界面活性剤の存在下で作製された。 CA−A−1 196 864は、インスリンの結晶および生分解性ポリマー
の生分解性マトリックスを含む組成物に関する。この生分解性ポリマーは、有機
溶媒に溶解しそれとのマトリックスの形成を可能にする任意の都合のよい生分解
性ポリマーとしてさらに規定される。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0021
【補正方法】変更
【補正内容】
【0021】 分子量は、高分子のすべての特性(その高分子の体積、水和、粘度、拡散、移
動度、および安定性を含む)に著しい効果を有する。(Cantor,C.R.
およびSchimmel,P.R.,Biophysical Chemist
ry,W.H.Freeman and Co.,New York,1980
)。 WO96/18417は、結晶性タンパク質およびポリエチレングリコールま
たは薬学的に受容可能な植物油を含む薬学的組成物に関する。この発明は、結晶
性タンパク質がPEG溶液もしくはゲル、または植物油に懸濁される場合、得ら
れる予期せぬ高制御放出特性として著者らにより記載されている。この著者らは
、特に、以下からなる群から選択される結晶性タンパク質を含む組成物をクレー
ムしている:結晶性エリトロポイエチン(EPO)、結晶性顆粒球コロニー刺激
因子(G−CSF)、結晶性インスリン、および結晶性性顆粒球マクロファージ
コロニー刺激因子(GM−CSF)。 WO−A−9 641 873は、凍結保護化合物で安定化され、そして凍結
乾燥されるポリヌクレオチド複合体の処方物に関する。次いで、この凍結乾燥さ
れた処方物は、ポリヌクレオチド複合体を送達するために用いられ得る乾燥粉末
処方物へと粉末化されるかまたは篩にかけられる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61K 38/44 A61K 47/40 38/45 C12N 9/04 38/46 9/20 38/52 9/86 38/53 A61K 37/02 39/395 37/24 47/26 37/36 47/34 37/50 47/40 37/52 B01J 13/12 37/54 C12N 9/04 37/58 9/20 37/60 9/86 B01J 13/02 J (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,UG,ZW),E A(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ,BA ,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CU, CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB,GD,G E,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS ,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK, LR,LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,M N,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU ,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM, TR,TT,UA,UG,US,UZ,VN,YU,Z A,ZW (72)発明者 カラフ, ナゼル ケイ. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01602, ワーススター, ローフ スト リート 14 (72)発明者 セント クレア, ナンシー エル. アメリカ合衆国 ノース キャロライナ 27707, ダーハム, イースト フォレ スト ヒル ブールバード 806 (72)発明者 レイクストロー, スコット エル. アメリカ合衆国 デラウェア 19711− 2826, ニューアーク, スプリング ヒ ル レーン 8 (72)発明者 シェノイ, バミ シー. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01801, ウォバーン, ティー−6, ウエストゲート ドライブ 16 Fターム(参考) 4B050 CC07 CC08 KK18 LL01 4C076 AA31 AA53 AA61 AA94 BB01 BB02 BB13 BB14 BB15 BB16 BB21 BB22 BB24 BB25 BB27 BB29 BB31 BB40 CC04 CC29 CC30 CC40 DD67A EE06 EE09 EE13 EE16 EE23A EE24 EE30A EE31 EE36 EE41 EE42 EE43 EE48 FF31 FF36 FF63 GG05 GG06 GG21 GG50 4C084 AA03 BA03 DA12 DA36 DA39 DA46 DA50 DB22 DB52 DB60 DC22 DC23 DC25 DC27 DC28 MA37 MA38 MA52 MA55 MA56 MA57 MA58 MA59 MA60 MA63 MA66 MA70 NA03 NA12 4C085 AA02 EE05 EE10 GG02 GG03 GG08 GG10 4G005 AA01 AB25 BA12 BB06 BB08 BB09 BB12 BB22 BB24 DB05X DB05Z DB06Z DB08Z DB12Y DB12Z DB13Z DB22X DB24X DB25X DC12W DC61W DD05Y DD05Z DD08Z DD12Z DD23Z DD27Z DD57Z DD58Z DD59Z DD65Z DD66Z DD67Z DD72Z EA01 EA02 EA03

Claims (66)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 マイクロスフェアを含む処方物であって、該マイクロスフェ
    アが、以下: (a)少なくとも1つの成分、および (b)少なくとも1つのタンパク質結晶、 を含む処方物であって、ここで該処方物は以下の工程: i)有機溶媒に溶解させたポリマーキャリアに該タンパク質結晶を懸濁する工
    程であって、ここで該ポリマーに対する該タンパク質結晶の重量比は、0.02
    〜20である、工程; ii)該懸濁液を、凝集を可能にしないが、該マイクロスフェアの形成を可能
    にする条件下で、0.5分〜30分間維持する工程;および iii)該懸濁液を、乳化剤を含有する、より大容量の水溶液に移すことによ
    り該処方物を生成する工程であって、この結果、該有機溶媒を、マイクロスフェ
    アからエバポレートさせるか、または拡散させる、工程; を包含する方法により生成される、処方物であって、 ここで該処方物は、T1/2で測定した場合、非処方物化形態の該タンパク質結晶
    を40℃かつ湿度75%で貯蔵した場合よりも、処方物を40℃かつ湿度75%
    で貯蔵した場合に、少なくとも59倍より長い有効期限で特徴付けられ、そして
    ここで該タンパク質結晶はインスリンではない、処方物。
  2. 【請求項2】 マイクロスフェアを含む処方物であって、該マイクロスフェ
    アが、以下: (a)少なくとも1つの成分、および (b)少なくとも1つのタンパク質結晶、 を含む処方物であって、ここで該処方物は以下の工程: i)有機溶媒に溶解されるポリマーキャリアに該タンパク質結晶を懸濁する工
    程であって、ここで該ポリマーに対する該タンパク質結晶の重量比は、0.02
    〜20である、工程; ii)該懸濁液を、凝集を可能にしないが、該マイクロスフェアの形成を可能
    にする条件下で、0.5分〜30分間維持する、工程;および iii)該懸濁液を、乳化剤を含有する、より大容量の水溶液に移すことによ
    り該処方物を生成する工程であって、この結果、該有機溶媒を、該マイクロスフ
    ェアからエバポレートさせるか、または拡散させる、工程; を包含する方法により生成される、処方物であって、 ここで該処方物は、T1/2で測定した場合、非処方物化形態の該タンパク質結晶
    を50℃で貯蔵した場合よりも、該処方物を50℃で貯蔵した場合に、少なくと
    も60%より長い有効期限で特徴付けられ、そしてここで該タンパク質結晶は、
    インスリンではない、処方物。
  3. 【請求項3】 マイクロスフェアを含む処方物であって、該マイクロスフェ
    アが、以下: (a)少なくとも1つの成分、および (b)少なくとも1つのタンパク質結晶、 を含む処方物であって、ここで該処方物は以下の工程: i)有機溶媒に溶解させたポリマーキャリアに該タンパク質結晶を懸濁する工
    程であって、ここで該ポリマーに対する該タンパク質結晶の重量比は、0.02
    〜20である、工程; ii)該懸濁液を、凝集を可能にしないが、該マイクロスフェアの形成を可能
    にする条件下で、0.5分〜30分間維持する工程;および iii)該懸濁液を、乳化剤を含有する、より大容量の水溶液に移すことによ
    り該処方物を生成する工程であって、この結果、該有機溶媒を、該マイクロスフ
    ェアからエバポレートさせるか、または拡散させる、工程; を包含する方法により生成される、処方物であって、 ここで該処方物は、4日間50℃で貯蔵した後、該タンパク質のαヘリックス構
    造含量の20%未満の消失により特徴付けられ、ここで、6時間の50℃での貯
    蔵後、FTIRで測定した場合、該タンパク質の可溶性形態がαヘリックス構造
    含量の50%より多くを消失しており;そしてここで該タンパク質結晶はインス
    リンではない、処方物。
  4. 【請求項4】 マイクロスフェアを含む処方物であって、該マイクロスフェ
    アが、以下: (a)少なくとも1つの成分、および (b)少なくとも1つのタンパク質結晶、 を含む処方物であって、ここで該処方物は以下の工程: i)有機溶媒に溶解させたポリマーキャリアに該タンパク質結晶を懸濁する工
    程であって、ここで該ポリマーに対する該タンパク質結晶の重量比は、0.02
    〜20である、工程; ii)該懸濁液を、凝集を可能にしないが、該マイクロスフェアの形成を可能
    にする条件下で、0.5分〜30分間維持する工程;および iii)該懸濁液を、乳化剤を含有する、より大容量の水溶液に移すことによ
    り該処方物を生成する工程であって、この結果、該有機溶媒を、該マイクロスフ
    ェアからエバポレートさせるか、または拡散させる、工程; を包含する方法により生成される、処方物であって、 ここで該処方物は、4日間50℃で貯蔵した後、該タンパク質のαヘリックス構
    造含量の20%未満の消失により特徴付けられ、ここで、6時間の50℃での貯
    蔵後、FTIRで測定した場合、該タンパク質の可溶性形態がαヘリックス構造
    含量の50%より多くを消失しており、そしてここで該処方物は、T1/2で測定
    した場合、50℃の溶液中の該タンパク質の可溶性形態よりも、50℃で貯蔵し
    た場合、少なくとも60倍より長い有効期限で特徴付けられ;そして該タンパク
    質結晶はインスリンではない、処方物。
  5. 【請求項5】 マイクロスフェアを含む処方物であって、該マイクロスフェ
    アが、以下: (a)少なくとも1つの成分、および (b)少なくとも1つのタンパク質結晶、 を含む処方物であって、ここで該処方物は以下の工程: i)有機溶媒に溶解させたポリマーキャリアに該タンパク質結晶を懸濁する工
    程であって、ここで該ポリマーに対する該タンパク質結晶の重量比は、0.02
    〜20である、工程; ii)該懸濁液を、凝集を可能にしないが、該マイクロスフェアの形成を可能
    にする条件下で、0.5分〜30分間維持する工程;および iii)該懸濁液を、乳化剤を含有する、より大容量の水溶液に移すことによ
    り該処方物を生成する工程であって、この結果、該有機溶媒を、該マイクロスフ
    ェアからエバポレートさせるか、または拡散させる、工程; を包含する方法により生成される、処方物であって、 ここで該処方物は、T1/2で測定した場合、50℃の溶液中の該タンパク質の可
    溶性形態よりも、該処方物を50℃で貯蔵した場合、少なくとも60倍より長い
    有効期限で特徴付けられ;そしてここで該タンパク質結晶はインスリンではない
    、処方物。
  6. 【請求項6】 請求項1〜5のいずれか1項に記載の処方物であって、ここ
    で該処方物は、薬学的処方物、食品処方物、飼料処方物、獣医用処方物、診断用
    処方物、化粧用処方物、および個人医療用処方物からなる群から選択される、処
    方物。
  7. 【請求項7】 前記タンパク質が酵素である、請求項1〜5のいずれか1項
    に記載の処方物。
  8. 【請求項8】 前記酵素が、ヒドロラーゼ(加水分解酵素)、イソメラーゼ
    、リアーゼ、リガーゼ、アデニル酸シクラーゼ、トランスフェラーゼ、およびオ
    キシドレダクターゼからなる群から選択される、請求項7に記載の処方物。
  9. 【請求項9】 前記酵素が、リパーゼ、グルコースオキシダーゼおよびペニ
    シリンアシラーゼからなる群から選択される、請求項8に記載の処方物。
  10. 【請求項10】 前記タンパク質が治療用タンパク質である、請求項1〜5
    のいずれか1項に記載の処方物。
  11. 【請求項11】 請求項10に記載の処方物であって、ここで前記治療用タ
    ンパク質が抗体、ヒト血清アルブミン、ヒト成長ホルモン、神経成長ホルモン、
    骨形態形成ホルモン、妊孕ホルモン、白血球マーカー、組織適合抗原、ムチン、
    インテグリン、接着分子、セレクチン、インターロイキン、インターロイキンレ
    セプター、ケモカイン、成長因子、成長因子レセプター、インターフェロンレセ
    プター、免疫グロブリン、T細胞レセプター、血液因子、白血球マーカー、CD
    2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD11a、CD11
    b、CD11c、CD13、CD14、CD18、CD19、CE20、CD2
    2、CD23、CD27、CD28、B7.1、B7.2、B7.3、CD29
    、CD30、CD40、gp39、CD44、CD45、Cdw52、CD56
    、CD58、CD69、CD72、CTLA−4、LFA−1、TCR、組織適
    合性抗原、MHCクラスI、MHCクラスII、SLex、SLey、SLea
    、SLeb、VLA−1、VLA−2、VLA−3、VLA−4、VLA−5、
    VLA−6、LFA−1、Mac−1、p150、p95、L−セレクチン、P
    −セレクチン、E−セレクチン、VCAM−1、ICAM−1、ICAM−2、
    LFA−3、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、
    IL−7、IL−8、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL
    −14、IL−15、IL−1R、IL−2R、IL−4R、IL−5R、IL
    −6R、IL−7R、IL−8R、IL−10R、IL−11R、IL−12R
    、IL−13R、IL−14R、IL−15R、PF4、RANTES、MIP
    1α、MCP1、NAP−2、Groα、Groβ、およびIL−8、TNFα
    、TGFβ、TSH、VEGF/VPF、PTHrP、EGFファミリー、EG
    F、PDGFファミリー、エンドセリン、ガストリン放出ペプチド(GRP)、
    TNFαR、RGFβR、TSHR、VEGFR/VPFR、FGFR、EGF
    R、PTHrPR、PDGFRファミリー、EPO−R、GCSF−R、IFN
    αR、IFNβR、IFNγR、IgE、FceRI、FceRII、補体C3
    b、補体C5a、補体C5b−9、Rh因子、フィブリノーゲン、フィブリン、
    ならびにミエリン関連増殖インヒビターからなる群から選択される、処方物。
  12. 【請求項12】 前記成分が賦形剤である、請求項1〜5のいずれか1項に
    記載の処方物。
  13. 【請求項13】 前記賦形剤がスクロース、トレハロース、ラクチトール、
    ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メトキシポリエチレ
    ングリコールおよびポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項
    12に記載の処方物。
  14. 【請求項14】 哺乳動物を処置する方法であって、該方法は、請求項1〜
    13のいずれか1項に記載の処方物の有効量を該哺乳動物に投与する工程を包含
    する、方法。
  15. 【請求項15】 前記処方物が、経口経路、筋肉内経路、静脈内経路、肺吸
    引経路および非経口経路からなる群より選択される経路により投与される、請求
    項14に記載の方法。
  16. 【請求項16】 タンパク質の放出のための組成物であって、該組成物は、
    以下: (a)請求項1〜5のいずれか1項に記載のタンパク質結晶;および (b)少なくとも1つのポリマーキャリア、 を含む組成物であって、ここで該組成物は、該ポリマーキャリアのマトリックス
    内にカプセル化される、組成物。
  17. 【請求項17】 前記タンパク質が酵素である、請求項16に記載の組成物
  18. 【請求項18】 請求項17に記載の組成物であって、ここで前記酵素は、
    ヒドロラーゼ(加水分解酵素)、イソメラーゼ、リアーゼ、リガーゼ、アデニル
    酸シクラーゼ、トランスフェラーゼ、およびオキシドレダクターゼからなる群か
    ら選択される、請求項17に記載の組成物。
  19. 【請求項19】 前記酵素が、リパーゼ、グルコースオキシダーゼおよびペ
    ニシリンアシラーゼからなる群から選択される、請求項18に記載の組成物。
  20. 【請求項20】 前記タンパク質が治療用タンパク質である、請求項16に
    記載の組成物。
  21. 【請求項21】 請求項20に記載の組成物であって、ここで前記治療用タ
    ンパク質が、抗体、ヒト血清アルブミン、ヒト成長ホルモン、神経成長ホルモン
    、骨形態形成ホルモン、妊孕ホルモン、白血球マーカー、組織適合抗原、ムチン
    、インテグリン、接着分子、セレクチン、インターロイキン、インターロイキン
    レセプター、ケモカイン、成長因子、成長因子レセプター、インターフェロンレ
    セプター、免疫グロブリン、T細胞レセプター、血液因子、以下のような白血球
    マーカー、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD1
    1a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD18、CD19、C
    E20、CD22、CD23、CD27、CD28、B7.1、B7.2、B7
    .3、CD29、CD30、CD40、gp39、CD44、CD45、Cdw
    52、CD56、CD58、CD69、CD72、CTLA−4、LFA−1、
    TCR、組織適合性抗原、MHCクラスI、MHCクラスII、SLex、SL
    ey、SLea、SLeb、VLA−1、VLA−2、VLA−3、VLA−4
    、VLA−5、VLA−6、LFA−1、Mac−1、p150、p95、L−
    セレクチン、P−セレクチン、E−セレクチン、VCAM−1、ICAM−1、
    ICAM−2、LFA−3、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−
    5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−10、IL−11、IL−12、I
    L−13、IL−14、IL−15、IL−1R、IL−2R、IL−4R、I
    L−5R、IL−6R、IL−7R、IL−8R、IL−10R、IL−11R
    、IL−12R、IL−13R、IL−14R、IL−15R、PF4、RAN
    TES、MIP1α、MCP1、NAP−2、Groα、Groβ、IL−8、
    TNFα、TGFβ、TSH、VEGF/VPF、PTHrP、EGFファミリ
    ー、EGF、PDGFファミリー、エンドセリン、ガストリン放出ペプチド(G
    RP)、TNFαR、RGFβR、TSHR、VEGFR/VPFR、FGFR
    、EGFR、PTHrPR、PDGFRファミリー、EPO−R、GCSF−R
    、IFNαR、IFNβR、IFNγR、IgE、FceRI、FceRII、
    補体C3b、補体C5a、補体C5b−9、Rh因子、フィブリノーゲン、フィ
    ブリン、ならびにミエリン関連増殖インヒビターからなる群から選択される、組
    成物。
  22. 【請求項22】 前記成分が賦形剤である、請求項16に記載の組成物。
  23. 【請求項23】 前記賦形剤がスクロース、トレハロース、ラクチトール、
    ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メトキシポリエチレ
    ングリコールおよびポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項
    22に記載の組成物。
  24. 【請求項24】 前記ポリマーキャリアが生体分解性ポリマーである、請求
    項16に記載の組成物。
  25. 【請求項25】 前記ポリマーキャリアが生体適合性ポリマーである、請求
    項16に記載の組成物。
  26. 【請求項26】 請求項16に記載の組成物であって、ここで前記ポリマー
    キャリアがポリ(アクリル酸)、ポリ(シアノアクリレート)、ポリ(アミノ酸
    )、ポリ(無水物)、ポリ(デプシペプチド)、ポリ(エステル)、ポリ(乳酸
    )、ポリ(乳酸−コ−グリコール酸)すなわちPLGA、ポリ(β−ヒドロキシ
    酪酸)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(ジオキサノン);ポリ(エチレングリ
    コール)、ポリ((ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド)、ポリ[(オルガ
    ノ)ホスファゼン]、ポリ(オルソエステル)、ポリ(ビニルアルコール)、ポ
    リ(ビニルピロリドン)、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテルコポリマー
    、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギナート、セルロースおよびセル
    ロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴサッ
    カライド、グリカアミノグリカン、硫酸化ポリサッカライド、それらの混合物お
    よびコポリマーからなる群の1つ以上から選択されるポリマーである、組成物。
  27. 【請求項27】 哺乳動物を処置する方法であって、該方法は、請求項16
    に記載の組成物の有効量を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
  28. 【請求項28】 前記組成物が、経口経路、筋肉内経路、静脈内経路、肺吸
    引経路および非経口経路からなるから選択される経路により投与される、請求項
    27に記載の方法。
  29. 【請求項29】 タンパク質結晶組成物であって、以下: (a)少なくとも1つのポリマーキャリア、および (b)少なくとも1つのタンパク質結晶、 を含む組成物であって、ここで該タンパク質結晶は、該ポリマーキャリアのマト
    リックス内にカプセル化され、そして該カプセル化は、以下の工程: i)有機溶媒に溶解させたポリマーキャリアに該タンパク質結晶を懸濁する工
    程であって、ここで該ポリマーに対する該タンパク質結晶の重量比は、0.02
    〜20である、工程; ii)該懸濁液を、凝集を可能にしないが、新生のマイクロスフェアの形成を
    可能にする条件下で、0.5分〜30分間維持する、工程;および iii)該懸濁液を、乳化剤を含有する、より大容量の水溶液に移すことによ
    り該組成物を生成する工程であって、この結果、該有機溶媒を、新生のマイクロ
    スフェアからエバポレートさせるか、または拡散させる、工程; を包含する方法により生成される、組成物であって、 ここで該タンパク質がインスリンではない、組成物。
  30. 【請求項30】 前記タンパク質が、糖タンパク質、酵素、ホルモン、抗体
    、サイトカインおよびペプチドからなる群から選択される、請求項29に記載の
    タンパク質結晶組成物。
  31. 【請求項31】 前記ポリマーキャリアが生体分解性ポリマーである、請求
    項29に記載のタンパク質結晶組成物。
  32. 【請求項32】 前記ポリマーキャリアが生体適合性ポリマーである、請求
    項29に記載のタンパク質結晶組成物。
  33. 【請求項33】 請求項29に記載のタンパク質結晶組成物であって、ここ
    で前記ポリマーキャリアが、ポリ(アクリル酸)、ポリ(シアノアクリラート)
    、ポリ(アミノ酸)、ポリ(無水物)、ポリ(デプシペプチド)、ポリ(エステ
    ル)、ポリ(乳酸)、ポリ(乳酸−コ−グリコール酸)すなわちPLGA、ポリ
    (β−ヒドロキシ酪酸)、ポリ(カプロカクトン)およびポリ(ジオキサノン)
    ;ポリ(エチレングリコール)、ポリ((ヒドロキシプロピル)メタクリルアミ
    ド)、ポリ[(オルガノ)ホスファゼン]、ポリ(オルソエステル)、ポリ(ビ
    ニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、無水マレイン酸−アルキルビニ
    ルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギンナート
    、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒ
    アルロン酸、オリゴサッカライド、グリカアミノグリカン、硫酸化ポリサッカラ
    イド、その混合物ならびにコポリマーからなる群の1つ以上から選択されるポリ
    マーである、タンパク質結晶。
  34. 【請求項34】 前記ポリマーキャリアがコポリマーである、請求項33に
    記載のタンパク質結晶組成物。
  35. 【請求項35】 前記組成物が薬学的に徐放性の組成物である、請求項29
    に記載のタンパク質結晶組成物。
  36. 【請求項36】 前記組成物が、経口経路、肺経路、経鼻経路、口内経路、
    肛門経路、皮膚経路、眼内経路、静脈内経路、筋肉内経路、動脈内経路、腹膜内
    経路、粘膜経路、舌下経路、皮下経路または頭蓋内経路による投与のために処方
    される、請求項35に記載の、薬学的に徐放性の組成物。
  37. 【請求項37】 タンパク質結晶の結晶化度を維持しながら、タンパク質結
    晶をカプセル化することによりマイクロスフェアを生成するプロセスであって、
    以下の工程: (a)有機溶媒に溶解されるポリマーキャリアに該タンパク質結晶を懸濁し、
    該懸濁液中にコートされた結晶を生成する、工程 (b)該懸濁液のコートされた結晶、ポリマーキャリアおよび有機溶媒を、乳
    化剤を含有する水溶液に移す工程;ならびに (c)該乳化剤の存在下で該有機溶媒をエバポレートさせることにより、該ポ
    リマーキャリアを硬化し、該マイクロスフェアを生成する工程; を包含する、プロセス。
  38. 【請求項38】 前記タンパク質が、糖タンパク質、酵素、ホルモン、抗体
    およびペプチドからなる群から選択される、請求項37に記載のプロセス。
  39. 【請求項39】 前記ポリマーキャリアが生体分解性ポリマーである、請求
    項37に記載のプロセス。
  40. 【請求項40】 前記ポリマーキャリアが生体適合性ポリマーである、請求
    項37に記載のプロセス。
  41. 【請求項41】 前記ポリマーキャリアがコポリマーである、請求項37に
    記載のプロセス。
  42. 【請求項42】 請求項37に記載のプロセスであって、ここで前記ポリマ
    ーキャリアが、ポリ(アクリル酸)、ポリ(シアノアクリラート)、ポリ(アミ
    ノ酸)、ポリ(無水物)、ポリ(デプシペプチド)、ポリ(エステル)、ポリ(
    乳酸)、ポリ(乳酸−コ−グリコール酸)すなわちPLGA、ポリ(β−ヒドロ
    キシ酪酸)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(ジオキサノン)、ポリ(エチレン
    グリコール)、ポリ((ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド)、ポリ[(オ
    ルガノ)ホスファゼン]、ポリ(オルソエステル)、ポリ(ビニルアルコール)
    、ポリ(ビニルピロリドン)、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテルコポリ
    マー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギナート、セルロースおよび
    セルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ
    サッカライド、グリカアミノグリカン、硫酸化ポリサッカライド、その混合物な
    らびにコポリマーからなる群の1つ以上から選択されるポリマーである、プロセ
    ス。
  43. 【請求項43】 前記乳化剤がポリ(ビニルアルコール)である、請求項3
    7に記載のプロセス。
  44. 【請求項44】 前記乳化剤が界面活性剤である、請求項37に記載のプロ
    セス。
  45. 【請求項45】 前記有機溶媒がメチレンクロライドである、請求項37に
    記載のプロセス。
  46. 【請求項46】 前記タンパク質結晶が微結晶である、請求項37に記載の
    プロセス。
  47. 【請求項47】 前記タンパク質微結晶が前記ポリマーキャリアにマイクロ
    カプセル化されている、請求項46に記載のプロセス。
  48. 【請求項48】 前記タンパク質結晶が架橋されている、請求項37に記載
    のプロセス。
  49. 【請求項49】 前記タンパク質結晶が多官能性架橋剤または二官能性架橋
    剤で架橋されている、請求項37に記載のプロセス。
  50. 【請求項50】 前記多官能性架橋剤が、グルタルアルデヒド、スクシンア
    ルデヒド、オクタンジアルデヒドおよびグリオキサールからなる群から選択され
    る、請求項49に記載のプロセス。
  51. 【請求項51】 請求項29に記載のタンパク質結晶組成物を含む、タンパ
    ク質送達系。
  52. 【請求項52】 請求項29に記載のタンパク質結晶組成物を前記被験体に
    投与する工程を含む、該被験体にタンパク質を送達するための方法。
  53. 【請求項53】 乾燥した、非架橋タンパク質結晶を生成するための方法で
    あって、以下の工程: (a)タンパク質結晶を形成するために、タンパク質分子を結晶化する工程; (b)有機溶媒または液体ポリマーを用いて、該タンパク質結晶を洗浄する工
    程; (c)該タンパク質結晶から該有機溶媒を除去する工程;および (d)該タンパク質結晶を乾燥する工程、 を包含する、方法。
  54. 【請求項54】 乾燥した、非架橋タンパク質結晶を生成するための方法で
    あって、以下の工程: (a)タンパク質結晶を形成するために、タンパク質分子を結晶化する工程;
    および (b)有機溶媒または液体ポリマー中で、該タンパク質結晶を洗浄および懸濁
    する工程; を包含する、方法。
  55. 【請求項55】 請求項53に記載の乾燥した、非架橋タンパク質結晶を生
    成するための方法であって、ここで、該方法は、工程(b)の後、かつ工程(c
    )の前に、工程(b)において用いられる前記有機溶媒と異なる有機溶媒中で該
    タンパク質結晶を洗浄する工程をさらに包含する、方法。
  56. 【請求項56】 請求項53に記載の乾燥した、非架橋タンパク質結晶を生
    成するための方法であって、ここで、該方法は、工程(d)の後に、薬学的成分
    を有する適切な緩衝液または処方物中で、該タンパク質結晶を溶解する工程をさ
    らに包含する、方法。
  57. 【請求項57】 請求項53または54のいずれかに記載の乾燥した、非架
    橋タンパク質結晶を生成するための方法であって、ここで、工程(b)において
    、該結晶は、アセトン、メチルアルコール、メチルイソブチルケトン、エタノー
    ル、クロロホルム、イソプロパノール、2−プロパノール、アセトニトリル、ブ
    タノール、シクロヘキサン、ジオキサン、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、
    ジクロロエタン、ヘキサン、イソオクタン、メチレンクロライド、t−ブチルア
    ルコール、トルエン、四塩化炭素、およびそれらの組み合わせからなる群から選
    択される有機溶媒で洗浄される、方法。
  58. 【請求項58】 請求項53または54のいずれかに記載の乾燥した、非架
    橋タンパク質結晶を生成するための方法であって、ここで、該結晶が、以下:窒
    素、アルゴン、ヘリウム、二酸化炭素、空気およびそれらの組み合わせからなる
    群から選択されるガス流を通過する工程により乾燥される、方法。
  59. 【請求項59】 前記結晶が酵素である、請求項53または54のいずれか
    に記載の乾燥した、非架橋タンパク質結晶を生成するための、方法。
  60. 【請求項60】 請求項59に記載の乾燥した、非架橋タンパク質結晶を生
    成するための方法であって、ここで、該タンパク質が酵素、ホルモン、治療用タ
    ンパク質、および抗体からなる群から選択されるタンパク質である、方法。
  61. 【請求項61】 請求項59に記載の乾燥した、非架橋タンパク質結晶を生
    成するための方法であって、ここで、該乾燥した、非架橋タンパク質結晶が、以
    下:ヒドロラーゼ(加水分解酵素)、イソメラーゼ、リアーゼ、リガーゼ、多剤
    耐性タンパク質、アデニル酸シクラーゼ、トランスフェラーゼ、オキシドレダク
    ターゼ、ヒト成長ホルモン、神経成長ホルモン、骨形態形成ホルモン、妊孕ホル
    モン、白血球マーカー、組織適合抗原、ムチン、インテグリン、接着分子、セレ
    クチン、インターロイキン、インターロイキンレセプター、ケモカイン、成長因
    子、成長因子レセプター、インターフェロンレセプター、免疫グロブリン、T細
    胞レセプター、血液因子、ウイルス表面タンパク質、HIV−1エンベロープ糖
    タンパク質、RSVエンベロープ糖タンパク質、HSVエンベロープ糖タンパク
    質、EBVエンベロープ糖タンパク質、VZVエンベロープ糖タンパク質、HP
    Vエンベロープ糖タンパク質、肝炎ファミリー表面抗原;ウイルス構造タンパク
    質、ウイルス酵素、寄生生物タンパク質、寄生生物糖タンパク質、寄生生物酵素
    、細菌タンパク質、腫瘍抗原、アレルゲンおよび毒素からなる群から選択される
    、方法。
  62. 【請求項62】 乾燥した、非架橋タンパク質結晶。
  63. 【請求項63】 請求項53または54のいずれかに記載の方法により生成
    された、乾燥した、非架橋タンパク質結晶。
  64. 【請求項64】 前記結晶がタンパク質結晶である、請求項62または63
    のいずれかに記載の乾燥した、非架橋タンパク質結晶。
  65. 【請求項65】 請求項64に記載の乾燥した、非架橋タンパク質結晶であ
    って、ここで、該結晶が、酵素、ホルモン、治療用タンパク質、抗体、ウイルス
    のタンパク質、細菌のタンパク質および腫瘍細胞抗原タンパク質からなる群から
    選択されるタンパク質結晶である、タンパク質結晶。
  66. 【請求項66】 マイクロスフェアであって、以下: (a)少なくとも1つの成分;および (b)少なくとも1つのタンパク質結晶、 を含み、ここで該タンパク質結晶はインスリンでない、マイクロスフェア。
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