JP2002511496A - 細胞表面相互作用を調節するためのコームコポリマー - Google Patents

細胞表面相互作用を調節するためのコームコポリマー

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Abstract

(57)【要約】 制御された細胞応答を誘発する合成コームコポリマー、これらのポリマーを種々の表面に適用する方法、ならびに組織工学適用における生体材料表面の改変のためのポリマーの使用および薬物送達デバイスとしてのポリマーの使用の方法を提供する。コームコポリマーは、疎水性ポリマー骨格および細胞応答を導く細胞シグナル伝達性リガンドで末端キャップされ得る親水性の非細胞結合性側鎖からなる。非細胞結合性コームとリガンド保有コームとの混合によって、リガンドの１以上の型（接着ペプチドおよび増殖因子を含む）の表面濃度および空間分布は、所望の細胞応答を達成するために表面上で調整され得る。１つの実施態様において、コームは、ラテックスの分散ポリマー化のための安定化剤として使用される。このコーム安定化ラテックスは、生体調節表面を作製するために標準的なコーティング操作によって基質に適用され得るか、または薬物送達剤として使用され得る。別の実施態様において、コームは、少量で、疎水性マトリックスポリマーと混和され、そしてそのコームの表面分離をもたらすようにプロセスされ得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） 米国政府は、Ａｎｎｅ Ｍ．Ｍａｙｅｓに対するＮａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ助成金番号ＤＭＲ−９４００３３４、ＯＳＰ Ｐ
ｒｏｊｅｃｔ番号６２２７、およびＬ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈに対するＮａｔｉ
ｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ助成金番号ＢＥＳ ９６３２
７１４に基づき、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】 本出願は、１９９８年４月１３日に出願の米国特許出願第６０／０８１，５９
６号に対する優先権を主張する。
【０００３】 制御された細胞応答を誘発し、そして良好な力学的特性、光学的特性および／
または生分解性特性を有するポリマー性材料が、医用適用における使用のために
開示される。このようなポリマーが生体材料表面で局在化され得るプロセス方法
もまた、開示される。
【０００４】 現在、医用適用において使用されるポリマーは、一般に疎水性である傾向があ
る。本明細書中に定義される場合、疎水性とは、水をはじき（すなわち、２０℃
で、６０度より大きい水との静的接触角（ｓｔａｔｉｃ ｃｏｎｔａｃｔ ａｎ
ｇｌｅ）を示す）、そして３×１０-10ｃｍ3（ＳＴＰ）ｃｍ／（ｃｍ2ｓＰａ）
未満の水透過性Ｐを有する材料をいう。このことは、細胞と材料表面の吸着タン
パク質との間の制御されない相互作用を生じ、これは、移植の失敗を導き得そし
て腫瘍形成を促進さえし得る、慢性炎症性応答を生じ得る（Ｗａｒｓｏｎ，Ｔｈ
ｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｒｅｓｉｎ Ｅｍ
ｕｌｓｉｏｎｓ，Ｂｅｎｎ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９７２））。移植片適用において
使用される金属材料またはセラミック材料は、同様に所望しない細胞応答を誘発
し得る。
【０００５】 組織工学適用のために、細胞に対する生分解性足場を形成するために使用され
るポリマー材料は、十分な構造支持体を提供しながら、細胞接着、細胞移動、細
胞増殖および細胞分化を促進することが必須である。一般に使用される合成骨格
材料（例えば、ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）など、およびそれらのコ
ポリマー）は、適切な力学的特性、プロセス特性および生分解性特性を有するが
、これらの疎水性性質は、制御されない細胞応答を誘発する、材料表面上でのタ
ンパク質の吸着および変性を導く。
【０００６】 多くの生体材料適用のための理想的な表面は、タンパク質吸着を抑制し、その
上、細胞に、吸着、生存、増殖、移動および分化を導くための特異的な化学シグ
ナルを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「生体材料（ｂｉｏｍａｔ
ｅｒｉａｌ）」とは、生物学的な系と相互作用することが意図される、医用デバ
イスにおいて使用される生存不能の材料をいう。ポリ（エチレンオキシド）で改
変されたポリマー表面は、生体材料の表面でのタンパク質吸着の減少のために、
近年研究されている（Ｐａｉｎｅら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２３：３
１０４（１９９０））。これらの表面の改変スキームの目的は、細胞と移植片材
料との非特異的相互作用の排除である。特異的な化学シグナルが、表面で細胞に
中継され得る１つの方法は、細胞表面レセプターに対する係留リガンドを介する
ことである（Ｂａｒｒｅｔ，Ｂｒｉｔ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．５：２５９（１９７３
））。この様式におけるシグナルの送達は、可溶性因子の付加に対する利点を有
する。なぜなら、そのシグナルは、非常に局在化された様式で、拡散的な損失な
く制御された用量で提示されるからである（ＫｕｈｌおよびＧｒｉｆｆｉｔｈ，
Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２：１００２（１９９６））。さらに、係留
リガンドは、可溶性リガンドが細胞によって内部移行される場合に存在するダウ
ンレギュレーションを回避することによって、細胞に対してより一定の刺激を提
供し得る。表面上のリガンドの空間的分布にわたる制御はまた、細胞挙動を先導
する鍵となり得る。従って、局所的なリガンド密度の空間的制御、または表面上
でのリガンドのクラスターの作製、さらにリガンドの平均表面密度にわたる制御
の提供を可能にする系が、非常に望ましい（Ｋｏｒｎｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８３９２（１９９１））。
【０００７】 インテグリン（約６個の公知のβ鎖の１つと対形成した、約１０個の公知のα
鎖の１つを含む二量体接着レセプター）は、細胞と細胞外マトリックス（ＥＣＭ
）との間の広範囲の相互作用を媒介し、そして細胞挙動を、移動、増殖、および
分化と同じく多種多様に制御して、増殖因子の作用に許容な環境を提供する。多
くのインテグリンについて、マトリックスタンパク質へのインテグリンの結合の
特異性が、小さな、別個のペプチドドメインにマッピングされており、そして新
規な部位が解明され続けている（Ｒｏｕｓｌａｈｔｉ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２：６９７（１９９６）；Ｈｙｎｅｓ，Ｃｅｌｌ，
４８：５４９（１９８７））。このような特異性の原型の例は、フィブロネクチ
ンにおいて最初に同定され、続いて他のマトリックスタンパク質において同定さ
れたＲＧＤ部位である。ＲＧＤペプチドは、特定のインテグリンを発現する細胞
に、フィブロネクチンの接着機能の完全な置換を可能にする。
【０００８】 多くのデータは、インテグリンの占有およびクラスター化の両方が、インテグ
リンによって媒介される完全な細胞応答を誘発するために必要とされる概念を支
持する（ＣｌａｒｋおよびＢｒｕｇｇｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：２３３（１
９９５））。例えば、ＭＡＰキナーゼの完全なＥＧＦＲ活性化は、インテグリン
のクラスター化および占有を必要とする（Ｍｉｙａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．，１３５：１６３３（１９９６））。従って、この環境におけるリガ
ンドの空間的提示（すなわち、リガンドが、リガンドの結合したインテグリンの
クラスター化をもたらすのに十分に密接に間隔をあけられるか否か）は、インテ
グリンによって管理される細胞挙動に影響を及ぼし得る。実際に、基質に共有結
合した合成ＲＧＤリガンドの間隔は、細胞接着および細胞延展（ｓｐｒｅａｄｉ
ｎｇ）に対する影響を有することが示されている（ＭａｓｓｉａおよびＨｕｂｂ
ｅｌｌ，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１４：１０８９（１９９１））。同時に
、フィブロネクチンのような接着リガンドの表面濃度は、移動のようなインテグ
リン媒介性の挙動に対する実質的な影響を有することが示されている（ＤｉＭｉ
ｌｌａら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２２：７２９（１９９３））。１ミク
ロンの接着／非接着ドメインに模造された自己構築した単層を使用した最近の研
究によって、細胞生存に対する細胞延展およびレセプター占有の役割が実証され
た（Ｃｈｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１４２５（１９９７））。この研究
における長さの規模は、およそ限局的な接着複合体の規模（またはそれより大き
い）であったが、よりさらに小さい長さの規模（３〜１０個のインテグリン）に
わたるクラスター化もまた、生理学的に関連するようである。実際に、データは
、１００ｎｍ長未満の規模でのＲＧＤのクラスター化が、移動のインテグリン媒
介性の挙動に対する顕著な効果を有することを強く支持する。リガンドの濃度お
よび空間的分布の両方は、細胞応答に影響を及ぼすので、細胞応答を導くために
、これらの２つのパラメーターを独立して、そして広範な長さの規模（ナノメー
ター〜マイクロメーター）にわたって変更する手段を有することが望ましい。
【０００９】 インテグリンは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）のような増殖因子の細胞内シグナル
伝達カスケードと重複する細胞内シグナル伝達カスケードを開始し得る。接着レ
セプターと増殖因子レセプターとの間の相互連絡は、限局性接着内での直接的な
物理的会合により生じ得る。両方の型のレセプターは、これらの構造において集
中しており（Ｍｉｙａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１３５：１６３
３（１９９６）；Ｐｌｏｐｐｅｒら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、６：１３４
９（１９９５））、そして両方のレセプターは、ＭＡＰキナーゼのような分子に
対する同じ下流の効果のいくらかを刺激し得る。限局性接着の複合体における接
着レセプターおよび増殖因子レセプターの密接な近接は、この２つの間での正の
調節性シグナルおよび負の調節性シグナルの両方の自由な流れ（ｆｒｅｅ ｆｌ
ｏｗ）を提供する。多数のシグナル伝達分子が、この連鎖を形成するとして提唱
されており；トランス調節（ｔｒａｎｓｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）の１つの細胞内
機構は、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）のプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ
）媒介性の減弱を介する。また、ＥＧＦＲによるホスホリパーゼＣγ活性化また
はホスホリパーゼＤ活性化に対する二次的なＰＫＣ活性は、インテグリンベース
の下層の接合を変更させるようである（Ｗｅｌｓｈら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ
．１１４：５３３（１９９１）；Ａｎｄｏら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．
１５６：４８７（１９９３））。従って、２以上の型のシグナル伝達リガンド（
例えば、接着ペプチドおよび増殖因子）が制御された量および空間分布で生体材
料の表面に同時に位置決めされ得ることによる方法を有することが望ましい。
【００１０】 現在までに、あるとしてもごくわずかなモデル系がタンパク質抵抗性および細
胞シグナル伝達性表面の要件の両方を満たし得る一方で、臨床的に適用可能な材
料を使用するアプローチが、ヒドロゲルに焦点を当てた（ＨｅｒｎおよびＨｕｂ
ｂｅｌｌ、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．３９：２６６（１９８８）
）。これは、制限された物理的強度を有し、そして多数の適用に適切ではない。
医用の適用のためのより所望される表面組成物を達成する疎水性ポリマー材料ま
たは他の生体材料の表面を改変するための他のアプローチとしては、ブロックコ
ポリマーの吸着、表面へのポリマーの化学的グラフティング（ｇｒａｆｔｉｎｇ
）、および積層フィルムの血漿沈着が挙げられる。これらの方法の各々は、種々
の不利益を被る。例えば、吸着されたブロックコポリマーは、細胞により積極的
に再配置され得、グラフトされたポリマーは、表面上に高密度で適用することが
困難であり、そして血漿沈着は、制御された細胞シグナル伝達にあまり適切では
ないゲル様表面構造を生じる。これらの方法のいずれもが、複合三次構造（例え
ば、線維様組織またはスポンジ様組織の足場）の表面を改変するため、または種
々の濃度のクラスター化したリガンド分布を作製してかつ生体材料表面上で間隔
を空けるための手段を提供しない。
【００１１】 ポリマー材料および他の生体材料表面改変アプローチの不利益を克服するプロ
セス方法を提供することは、有利である。従って、本発明の目的は、タンパク質
の吸着を阻害し、そして適切な場合、生体材料表面上に細胞シグナル伝達性リガ
ンドの制御された濃度および空間分布を提示することによって、制御された細胞
表面相互作用を誘発するポリマー材料を提供することである。さらに本発明の目
的は、このようなポリマーが生体材料表面で配置され得るプロセス方法を提供す
ることである。さらに本発明の目的は、細胞応答を調節するために２以上の異な
る型のリガンドを提示する生体材料表面上に別個のナノメーターからマイクロメ
ーターの大きさのドメインを作製するために使用され得るポリマー材料を提供す
ることである。
【００１２】 （発明の要旨） 制御された細胞応答を誘発するコーム型コポリマー、このようなポリマーが表
面に局在され得る方法、および医用デバイスの表面を改変するためのこのような
ポリマーを使用する方法が、開示される。
【００１３】 このポリマーは、疎水性であり水に不溶性の骨格および低分子量の親水性の非
細胞結合性側鎖を含む。本明細書中に定義されるように、非細胞結合性とは、血
清含有培地での２４時間の標準的な細胞培養アッセイ後に、観察可能な細胞の付
着を示さない材料をいう。親水性側鎖の分子量は、好ましくは、２００ダルトン
よりも大きくかつ２０００ダルトンよりも小さい。骨格は、意図される適用に依
存して、生分解性または非生分解性であり得る。生分解性骨格は、ほとんどの組
織工学、薬物送達および創傷治癒デバイスの適用に好まれ、一方非生分解性骨格
は、永久インプラント、生体濾過（ｂｉｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、および細胞
培養プレートの適用に所望される。非細胞結合性側鎖の部分は、ポリマー表面に
より誘発される、細胞接着の程度、または他の細胞応答を制御するために細胞シ
グナル伝達性リガンドで末端キャップされ得る。好ましい実施態様において、コ
ームコポリマー全体は、鎖のもつれを介する融解状態においてポリマーに良好な
力学的特性を付与するために充分に大きい分子量を有するべきである。すなわち
、その分子量は、当業者により定義されるように、もつれの分子量よりも大きい
はずである。従って、コームコポリマーの分子量全体は、約１０，０００ダルト
ンよりも大きく、より好ましくは２０，０００ダルトンよりも大きく、そしてよ
り好ましくは３０，０００ダルトンよりもなお大きい。
【００１４】 コポリマーの骨格に沿う親水性側鎖の密度は、最終ポリマーの側鎖の長さおよ
び水溶性の特徴に依存する。親水性側鎖の総重量％は、総コポリマー組成のうち
の２０〜６０％の間であり、好ましくは、およそ４０重量％である。約３５０ダ
ルトンの分子量を有する親水性側鎖を組み込んでいるコームについて、親水性側
鎖を保有する骨格のセグメントのモル％は、３０％と高くあり得る。約２０００
ダルトンの分子量を有する親水性側鎖について、疎水性側鎖を保有する骨格のセ
グメントのモル％は、２％と低くあり得る。好ましい実施態様において、コーム
コポリマー全体は、水溶性ではない。本明細書中で定義する場合、用語水溶性と
は、１リットル当たり１グラムを超える水溶液における溶解度を有する材料をい
う。水溶液と接触する場合、親水性側鎖は、膨張し、タンパク質に反発する水和
した層を形成し、それ故、細胞接着に抵抗性である。
【００１５】 コームコポリマーの非細胞結合性側鎖は、制御された細胞応答を誘発するため
に、細胞シグナル伝達性化学リガンドで末端キャップされ得る。リガンド（例え
ば、接着ペプチドまたは増殖因子）は、細胞に対して特定の化学シグナルを提供
するために、公知の化学を使用して、側鎖の末端に共有結合的またはイオン的に
結合され得る。リガンド保有側鎖の規定された画分は、ポリマーへのリガンドの
カップリングの間に、適切な化学量論的な制御を使用することによって、リガン
ドで末端キャップされるべきでないリガンド保有側鎖上の末端基を保護すること
によって、またはこれらのアプローチを組み合せることによって、得られ得る。
生体材料の表面上のナノメーターまたは数十ナノメーターの長さの規模でリガン
ドをクラスター化することが望ましい適用については、１より多いリガンド（平
均で）が、単一のコームコポリマー鎖に共有結合され得る。ナノメーターから数
十ナノメーターの大きさの規模で、生体材料表面上の単一のクラスターにおいて
、２以上の型のリガンドを組み込むことが所望される適用において、１以上のそ
れぞれのリガンド型（例えば、接着ペプチドおよび増殖因子）は、公知の化学を
使用して、その側鎖を介して単一のコームコポリマー鎖に結合され得る。
【００１６】 接着ペプチドがコームコポリマーの側鎖に結合する場合、細胞は、コームコポ
リマー表面上に容易に付着し、そして広がる。従って、表面上に広がり、そして
増殖する細胞の量は、接着ペプチド保有コームコポリマーを非細胞結合性コーム
コポリマーと（例えば、その結果２０％未満のコームが接着ペプチドを保有する
ように）混合することによって、制御され得る。同様に、生体材料表面上のリガ
ンドクラスターの空間分布は、非細胞結合性コームコポリマーをコームコポリマ
ー（各鎖が平均でその側鎖に付着した１より多いリガンドを有する）と混合する
ことによって制御され得る。この場合において、リガンドクラスターの大きさ（
すなわち、リガンドが局在している空間領域）は、リガンド保有コームコポリマ
ーの特徴的な大きさにより指図され、そしてコームコポリマーの回転半径ＲG（
当業者により算定または実験的に決定され得る）から近似され得る。コームコポ
リマーの回転半径は、代表的には、総分子量、側鎖の長さ、およびポリマー鎖の
周囲の環境（例えば、他のポリマー鎖または水分子）に依存して、ナノメーター
から数十ナノメーターの間の範囲であり得る（Ｐ．−Ｇ．ｄｅＧｅｎｎｅｓ、Ｓ
ｃａｌｉｎｇ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｈｙｓｉｃｓ、Ｃ
ｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９７９）。従って、リガ
ンドクラスターの大きさ、ならびにクラスター当たりのリガンドの数および型は
、リガンド保有コームコポリマーの合成条件によって制御され得る。例えば、Ｒ G ＝４ｎｍでのコームコポリマーは、πＲG 2（すなわちおよそ５０ｎｍ2）のクラ
スター当たりの領域を有する。単位表面積当たりの表面上のクラスターの数（平
均）は、表面での非細胞結合性コームに対するリガンド保有コームの比により制
御され得る。ｄ（ｄ＞２ＲGの場合）のリガンドクラスター間の表面分離距離を
達成するために、リガンド保有コームの濃度は、およそΦ＝Ｖchain／（２ＲGｄ 2 ）であるべきであり、ここでＶchainは、単一のコームコポリマー鎖により占め
られる容積である。例えば、ＲG＝４ｎｍおよびＶchain＝４８ｎｍ3を有するコ
ームコポリマーでの、２０ｎｍのクラスター間の距離を達成するために、必要と
されるリガンド保有コームの見積もられた画分は、１．５容量％である。１０ｎ
ｍのクラスター間の距離は、６容量％のリガンド保有コームを必要とする。
【００１７】 多くの方法を使用して、種々の生体材料の表面にコームコポリマーまたはそれ
らの混合物を適用し得る。これらの方法は、浸液コーティング、スプレーコーテ
ィング、ブラッシュ（ｂｒｕｓｈ）コーティング、ロールコーティング、または
基材上へのフィルムのスピンキャスティング、代表的にこれらに続く、表面への
接着を促進する緩和な加熱が含まれる。固体自由形成プロセス（ｓｏｌｉｄ ｆ
ｒｅｅ ｆｏｒｍ ｐｒｏｃｅｓｓ）（例えば、三次元印刷技術（３ＤＰ））、
またはフリーズドライ法を使用して、複合三次元構造（多孔性構造を含む）を作
製し得る。全てのこれらのプロセスアプローチにおいて、適切な架橋剤が、フィ
ルムまたはデバイスの力学的な剛性を増強するために組み込まれ得る。
【００１８】 第２の疎水性または非細胞調節性ポリマーの表面を改変するために少量のコポ
リマーのみを使用することが所望される適用において、このコームコポリマーを
、第２のポリマーに少量添加し、そしてプロセスして、その表面に対してコーム
コポリマーの分離を達成し得る。好ましい実施態様において、このコームコポリ
マーは、１０重量％未満のポリマー混合物を含む。分離を達成するプロセス工程
は、表面分離を達成するために可動性を提供するポリマー成分のガラス転移を超
えるに充分な温度で、真空下、空気中、水中、蒸気中、ＣＯ2中または表面での
コーム成分に有利に働く他の環境において、混合物を加熱する工程を包含する。
第２のポリマー成分が半結晶性ポリマーである場合において、このアニーリング
温度は、ガラス転移を超えるが、ポリマーの融点未満であるべきであり、このデ
バイスの所望の形状が保持されることを保証する。好ましい実施態様において、
表面分離は、医用デバイスの製造における標準的なプロセス工程の間（例えば、
抽出、オートクレーブまたは滅菌のプロセスの間）に達成される。他の実施態様
において、分離は、デバイス製造後に、制御された環境（水など）におけるさら
なるアニーリング工程において達成される。このようなプロセス工程は、ほとん
ど専らコームコポリマーを含む、厚さがおよそ２ＲGの表面の層を作製する。こ
のようなアニールされた混合物の観察可能な表面特性は、純粋なコームコポリマ
ーの細胞表面特性と実質的に同一である。好ましい実施態様において、このコー
ムコポリマーは、第２のポリマーと混和性であり、バルクデバイスにおける相分
離（これは乏しい力学的特性または光学的特性を生じ得る）を回避する。
【００１９】 他の場合において、デバイスの表面へのコームコポリマーの局在化は、主に、
デバイス製造の他の工程の間に達成され得る、第２の疎水性または非細胞調節性
ポリマーから構成される。例えば、第２のポリマーから作製されるデバイスの表
面でのコームコポリマーの正確な配置は、３ＤＰ法により達成され得る。同様に
、一緒に混和した場合のコームコポリマーと第２のポリマーとの間の粘度の差異
は、線維、フィルムまたは他のデバイスの融解押出しの間に、表面にコームを位
置させるように活用され得る。コームコポリマーがその表面に存在する、多孔性
膜もしくは非多孔性膜、フィルム、線維もしくは中空線維は、相転換キャスティ
ングにより調製され得る。この方法において、コームコポリマー、第２のポリマ
ー、および相互の溶媒の溶液は、水性ベースの凝固浴中にキャスティングされ、
デバイスを形成する。キャスティングプロセスの間に、コームと凝固浴媒体との
間の好ましい相互作用は、フィルム、線維、または膜の外部表面へのコームコポ
リマーの分離を誘導する。創傷治癒の適用における一時的な障壁デバイスとして
有用な細胞調節性微小孔生分解性膜は、この様式で調製され得る。細胞調節性生
分解性縫合糸は、水性ベースの凝固浴中に溶液からの線維を紡ぐことによって同
様に調製され得る。このような表面改変線維はまた、生分解性材料または非生分
解性材料から調製され得、そして医用の適用（細胞調節性の一時的な障壁デバイ
スおよび生体濾過デバイスを含む）のための不織布品へと形成され得る。細胞調
節性内部表面を有する中空のナノ多孔性（ｎａｎｏｐｏｒｏｕｓ）線維は、調製
され得る。このような線維の一部に細胞をカプセル化することによって、線維内
部表面上の係留（ｔｅｔｈｅｒｄ）シグナルにより全体的または部分的に調節さ
れる量で、細胞の所望の産物を分泌する、長期の薬物送達インプラントが調製さ
れ得る。コームコポリマーが過剰である表面を有する、細胞調節性生分解性微小
多孔性の足場は、デバイスのバルクを形成する第２のポリマー成分と比較した場
合、コームコポリマー成分に対して優先的な親和性を有する昇華性溶媒を選択す
ることによって、フリーズドライ法により調製され得る。
【００２０】 コームコポリマーが、デバイスを調製するために第２のポリマーと共に使用さ
れる上記の全ての場合において、このコームコポリマーは、非細胞結合性コーム
、リガンド保有コーム、または以前に記載されたような所望の細胞応答を達成す
るこれらの混合物であり得る。
【００２１】 コームコポリマーが、医用の適用における細胞応答を制御するために使用され
得る、さらなる方法は、ラテックス粒子表面上にコームコポリマーを組み込むポ
リマーラテックスの調製を介する。このようなラテックスは、安定化剤としてコ
ームコポリマーを使用して、水含有媒体中での分散または乳化ポリマー化方法に
より調製され得る。このポリマー化は、水含有媒体中で所望のモノマー、コーム
安定化剤および開始剤を溶解または混合することによって達成される。このポリ
マーは、例えば、溶媒に熱を適用することによって開始される。分散媒体は、コ
ームコポリマーに対しては良好な溶媒であるが、伸長しているポリマーに対して
は乏しい溶媒である。疎水性コーム骨格は、合成されているポリマーと適合する
ように選択され、従って、伸長しているポリマーの粒子の表面に固定し、一方親
水性側鎖は、凝結に対してこの粒子を安定化する。ラテックス合成の終了の際に
、得られたラテックス粒子は、大きさが０．１〜１０μｍの範囲内であり、代表
的には分散媒体中で２０〜７０重量％のポリマー固体で分散する。これらの系は
、粒子表面に固定されたままであるコームコポリマーを介する細胞応答を制御す
る種々の方法において用いられ得る。
【００２２】 フィルムまたはコーティングは、任意の表面上にラテックスを浸液、ブラッシ
ング（ｂｒｕｓｈｉｎｇ）、ローリング（ｒｏｌｌｉｎｇ）またはキャスティン
グするような通常の方法によるラテックスの分散から調製され得る。細胞応答を
制御するための永久インプラントに適用されるコーティングについて、非生分解
性のラテックス粒子（例えば、アクリル）が好まれる。当業者によりラテックス
フィルムを形成するために使用される任意の標準的なコーティング方法（例えば
、ちょうど記載された方法）を用いることによって、制御された細胞応答を誘発
する不透明なコーティングが、調製され得る。あるいは、ポリマー粒子のガラス
転移を十分に超える温度でのフィルムの加熱処理によって、この粒子は、滑らか
で透明なフィルムへと融合する（ここでコームコポリマーは、その表面上に存在
する）。このコームコポリマーは、表面上に留まるエネルギーの傾向、または融
合したラテックスフィルムのバルク中へのコームの拡散のための可動性が充分で
はないので（例えば、このフィルムが融合のすぐ後にそのガラス転移未満に冷却
される場合）のいずれかに起因して、融合の際にその表面に局在したままである
。このラテックスフィルムは、コームコポリマー自体に類似する表面特性を示す
が、少量のコームコポリマーのみが使用され（代表的には、総ラテックスの１重
量％未満）、コーティングが水ベースの懸濁液から容易に適用され、そしてフィ
ルム形成特性がフィルム形成ポリマーの思慮深い選択により基材に接着するよう
に合わせられ得るという利点を有する。例えば、非細胞結合性コームコポリマー
により安定化されるアクリルラテックスは、それらを細胞付着に抵抗性にし、そ
れによって時間とともに曇ることを低下させるために、アクリル眼内レンズ上に
透明なアクリルコーティングを調製するために使用され得る。アクリルラテック
スはまた、制御された細胞応答が、永久の金属性、ガラス性またはセラミック性
のインプラントあるいは他のデバイス（細胞培養装置を含む）の表面で所望され
る適用に使用され得る。なぜなら、高密度の接着は、しばしば、酸化表面とアク
リルポリマーとの間で見出されるからである。ポリスチレン細胞表面培養プレー
トまたは他の装置については、細胞調節性ＰＳラテックスは、上記の様式におい
て、透明な細胞調節性コーティングを調製するために使用され得る。
【００２３】 ラテックスがコームコポリマーにより安定化される上記の全ての場合において
、このコームコポリマーは、上記で以前に記載されたように所望の細胞応答を達
成するための、非細胞結合性コーム、リガンド保有コーム、またはこれらの混合
物であり得る。あるいは、混合したラテックス分散物は、０．１〜１０マイクロ
メーターの大きさの表面上にクラスター化したリガンド領域を含むフィルムを調
製するために使用され得る。これは、非細胞結合性コームでコートしたラテック
ス粒子の分散物とリガンド保有コームでコートしたラテックス粒子の分散物とを
混合し、そして上記のようにこれらの混合した分散物のフィルムを作製すること
によって達成され得る。リガンドクラスターの大きさは、リガンド保有コームで
コートしたラテックス粒子のほぼ直径であり、一方単位表面積当たりの表面上の
クラスター数は、混合した分散物において、非細胞結合性ラテックス粒子に対す
るリガンド保有ラテックス粒子の比により制御され得る。
【００２４】 生分解性フィルムが好ましい適用において、生分解性ラテックスは、生分解性
骨格を有するコーム安定化剤を使用することによって調製され得る。このような
生分解ラテックスはまた、以下に記載のように、薬物送達ビヒクルとして用いら
れ得る。
【００２５】 （発明の詳細な説明） 調節された細胞応答を誘発するコーム型コポリマー、このようなポリマーが表
面で局在され得る方法、および医用デバイスの表面を改変するためにこのような
ポリマーを使用する方法が、開示される。これらのポリマーは、疎水性骨格ポリ
マーに対する親水性側鎖の型および比、係留細胞シグナル性リガンドの型および
数、分子量、ならびにプロセス条件の関数である特性により特徴付けられる。
【００２６】 （１．ポリマー組成物） （Ａ．ポリマー構築） ポリマーは、コーム型コポリマーであり、疎水性の水不溶性ポリマーで形成さ
れる骨格、および短く親水性の非細胞結合性ポリマーで形成される側鎖を有し、
２００〜２０００ダルトンの間の分子量を有する。この疎水性骨格は、所望の適
用に依存して、生分解性であってもよいし、または非生分解性であってもよい。
このコームコポリマー全体は、鎖のもつれによりポリマーに対して良好な機構的
特性を与えるように、溶融状態において十分に高い分子量を有するべきである。
すなわち、その分子量は、当業者によって規定されるように、上記のもつれの分
子量であるべきである。従って、このコームコポリマー全体の分子量は、約１０
，０００ダルトンより大きく、より好ましくは２０，０００ダルトンより大きく
、およびさらにより好ましくは３０，０００ダルトンより大きくあるべきである
。このコームコポリマーは、第２の疎水性モノマーと重合可能な鎖末端を含む、
親水性マクロモノマー（ｍａｃｒｏｍｏｎｏｍｅｒ）を共重合することによって
調製され得る。あるいは、疎水性モノマーは、その骨格にグラフトされ得る親水
性側鎖を介して、適切な反応基を含む第２のモノマーと共重合され得る。あるい
は、適切な反応性側鎖を有する疎水性モノマーが重合され得、そしてこれらのわ
ずかな反応性側鎖が、親水性側鎖をグラフトすることによって修飾され得る。非
細胞結合性側鎖の規定される割合は、特定の細胞性応答を誘発するために、適切
なリガンドを用いて末端キャップされ（ｅｎｄ−ｃａｐｐｅｄ）得る。
【００２７】 （Ｂ．疎水性ポリマー骨格） （１．生分解性疎水性ポリマー） コームコポリマーの骨格に対して生分解性特性に影響を与えるために使用され
る疎水性ポリマーは、好ましくは、インビボ条件下において加水分解性である。
適切な生分解性ポリマー単位は、非毒性であるかまたは体内の正常な代謝物とし
て存在する生分解性生成物を生じる、ヒドロキシ酸または他の生物学的に生分解
性なポリマーを含む。これらとしては、例えば、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水
物）、ポリ（オルトエステル）、およびポリ（リン酸エステル）が挙げられる。
ポリラクトン（例えば、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（δ−バレロラクト
ン）、ポリ（γ−ブチロラクトン）およびポリ（βヒドロキシブチレート））も
また、有用である。好ましいポリ（ヒドロキシ酸）は、ポリ（グリコール酸）、
ポリ（ＤＬ−乳酸）ならびにポリ（Ｌ−乳酸）、またはポリ（グリコール酸）お
よびポリ（乳酸）のコポリマーである。一般に、これらの材料は、インビボにお
いて、非酵素的加水分解および酵素的加水分解の両方によって、および表面浸食
またはバルク侵食によって、分解する。
【００２８】 生分解性領域は、エステル結合、ペプチド結合、無水物結合、オルトエステル
結合、およびリン酸エステル結合のような、生分解に影響を受けやすい結合を使
用して、モノマー、オリゴマー、またはポリマーから構築され得る。
【００２９】 （２．非生分解性疎水性ポリマー） コームコポリマーの骨格へ組み込まれ得る、代表的な非生分解性の疎水性ポリ
マーとしては、以下が挙げられる：ポリアルキレン（例えば、ポリエチレンおよ
びポリプロピレン）、ポリクロロプレン、ポリビニルエーテル、ポリビニルエス
テル（例えば、ポリ（酢酸ビニル））、ポリビニルハロゲン化物（例えば、ポリ
（塩化ビニル））、ポリシロキサン、ポリスチレン、ポリウレタンならびにそれ
らのコポリマー、ポリアクリレート(例えば、ポリ（メチル（メト（ｍｅｔｈ）
）アクリレート）、ポリ（エチル（メト）アクリレート）、ポリ（ブチル（メト
）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メト）アクリレート）、ポリ（ヘキシル
（メト）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メト）アクリレート）、ポリ（ラ
ウリル（メト）アクリレート）、ポリ（フェニル（メト）アクリレート）、ポリ
（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチ
ルアクリレート）、およびポリ（オクタデシルアクリレート）（本明細書中にお
いて、共に「ポリアクリレート」という））、ならびにそれらのコポリマーおよ
び混合物。これらのポリマーは、有用な誘導体（置換、化学基（例えば、アルキ
ル基、アルキレン基）の付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者によって慣
用的になされ得る他の修飾）を有するポリマーを含む。
【００３０】 好ましい非生分解性ポリマーとしては、エチレンビニルアセテート、ポリアク
リレート、ポリ（クロロプレン）、およびそれらのコポリマーおよび混合物が挙
げられる。
【００３１】 （Ｃ．非細胞結合性の親水性側鎖） 非細胞結合性側鎖は、骨格に結合していないときは、好ましくは水可溶性であ
り、そしてより好ましくは非イオン性である。適切なポリマーのブロックは、ポ
リ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、部分的または全体的に
加水分解されたポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、および
デキストランから調製されるものを含む。好ましくは、この側鎖は、ポリ（エチ
レングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、またはポリ（アクリル酸）から
作製される。
【００３２】 親水性側鎖は、元来生分解性であってもよいし、または体内で生分解性に乏し
いかもしくは効率的に非生分解性であってもよい。後者の２つの場合、側鎖は、
排泄を可能にするために十分に低分子量でなければならない。好ましい分子量の
範囲は、約２０００ダルトン未満、より好ましくは１０００ダルトン未満、およ
び最も好ましくは約５００ダルトン未満である。ポリマーがポリエチレングリコ
ールである場合、エチレンオキシドのモノマー単位の数は、約４と２０との間が
好ましい。
【００３３】 二重結合を含むモノマーがポリマー骨格を調製するために使用される場合、親
水性側鎖を組み込むための好ましい方法は、一端において反応性の二重結合を有
する親水性マクロモノマーを使用することであり、これは、遊離ラジカルまたは
他の付加重合の間にランダムに組み込まれ得る。このようなマクロモノマーの例
は、ＰＥＧ−メタクリレートである。ポリマー骨格に沿う、非細胞結合性の親水
性側鎖の密度は、使用されるＰＥＧ−メタクリレートまたは他の適切なマクロモ
ノマー単位の相対量を制御することによって制御される。
【００３４】 これらの実施態様において、側鎖は、細胞シグナル伝達性リガンドで末端キャ
ップされ、適切な官能基（例えば、−ＮＨ2、−ＯＨ、またはＣＯＯＨ）は、マ
クロモノマーの末端において含まれる。
【００３５】 （Ｄ．反応性官能基を有するモノマー） 本明細書中に記載される多くの実施態様において、ポリマー骨格を形成するた
めに使用されるモノマーは、ただ２つの反応性基を含む。これらの両方は、ポリ
マーを形成するために反応される。例えば、乳酸は、２つの反応性基（ヒドロキ
シル基およびカルボキシル基）を含む。−ＯＨは、好ましい反応性基である。ポ
リ乳酸ポリマーの末端はヒドロキシル基およびカルボキシル基を含むが、コーム
コポリマーを形成するために使用され得る最終的なポリマー鎖において、骨格に
沿って反応性基は存在しない。
【００３６】 １つ以上のさらなる反応性基を含まないモノマーがポリマー骨格を調製するた
めに使用される場合、これらの反応性基を含むモノマーは、コーム型コポリマー
を形成するために、好ましくはランダムな様式において、ポリマー骨格に組み込
まれる必要がある。これらの型のモノマーの例は、当業者に周知である。
【００３７】 適切な反応性モノマーに必要なことは、成長するポリマー鎖のように同じ型の
化学反応に関与することによって、成長するポリマー鎖に組み込まれ得ることで
ある。例えば、ラクチドがルイス酸触媒を使用して重合される場合、デプシペプ
チド（アミノ酸の環状二量体）は、リジンから調製され得、ここでεアミノ基が
、例えば、ｔ−ｂｏｃ保護基によって保護される。このリジンはポリマーへ組み
込まれ、そしてこの保護基は取り除かれ得る。得られるアミノ基は、脱離基（例
えば、トシレート、トレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、メシレート、トリフ
レートおよび当業者に周知の他の脱離基を含む親水性ポリマーと反応性がある。
【００３８】 あるいは、反応性モノマーは、親水性ポリマー上の求核基と置換され得る脱離
基を含み得る。例えば、エピクロロヒドリン（ｅｐｉｃｈｌｏｒｏｈｙｄｒｉｎ
）は、重合工程の間に使用され得る。モノマーは、ポリマー骨格に組み込まれ、
そしてクロリド基は、求核基との引き続く反応のためにこの骨格上に存在する。
求核基を含む適切な親水性ポリマーの例は、末端アミン基を有するＰＥＧである
。ＰＥＧ−ＮＨ2は、ポリマー骨格上のクロリド基と反応して、ポリマー骨格上
に所望の密度のＰＥＧ化（ＰＥＧ−ｙｌａｔｉｏｎ）を提供し得る。当業者の一
般的知識とともに、本明細書中に記載される化学を使用して、適切に官能基化さ
れる親水性ポリマーとの引き続くカップリング反応のために適切な脱離基または
求核基を含むポリマー骨格を調製し得る。
【００３９】 （Ｅ．細胞応答を制御するためのリガンド） 細胞接着を促進する多くの高分子が、公知である。これらは、アミノ酸、ペプ
チドまたは糖タンパク質であり得る。例示的な細胞結合リガンドは、アルギニン
−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）アミノ酸配列またはチロシン−イソロイ
シン−セリン−アルギニン−グリシン（ＹＩＳＲＧ）を有するペプチドを含む。
フィブロネクチンのようなタンパク質に存在するＲＧＤ配列は、細胞接着および
増殖を促進することにおいて能動的であることが示されている（Ｍａｓｓｉａ，
Ｓ．Ｐ．およびＨｕｂｂｅｌｌ，Ｊ．Ａ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１４
：１０８９（１９９１））。従って、コポリマー側鎖の末端でのＲＧＤ配列の組
込みは、細胞接着および成長を増強し得る。これは、基質が接着性でない場合（
例えば、ポリエステルは肝細胞のような細胞に対して乏しい接着性を示す）、特
に有用であり、次いで、これは、制御される様式において細胞性接着を促進する
ためにコームコポリマーを用いて修飾される。
【００４０】 生物学的に活性な分子はまた、インビボにおいて、特定の細胞型の接着および
増殖を促進するためにコポリマーへ組み込まれ得る。多くの増殖因子が公知であ
り、そしてＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯのよ
うな市販供給元から入手され得る。例えば、増殖因子としては、上皮増殖因子、
血管内皮増殖因子、線維芽増殖因子などが挙げられる。
【００４１】 （Ｆ．コーム成分の相対比） （１．親水性単位対疎水性単位の比） ポリマー骨格に沿う疎水性側鎖の密度は、ある程度、その側鎖の分子量に依存
する。コームコポリマーにおける親水性単位に対する疎水性単位の全パーセント
は、重量で２０〜６０パーセント、好ましくは重量で約４０パーセントである。
約３５０の分子量を有する親水性側鎖について、親水性側鎖を保有する骨格セグ
メントのモルパーセントは、約３０パーセントほど高くなり得る。約２０００の
分子量を有する親水性側鎖について、このモルパーセントは、約２パーセントほ
ど低くなり得る。
【００４２】 コームコポリマーにおいて適切な親水性単位対疎水性単位の比を決定する場合
に関連する考慮は、親水性側鎖が細胞シグナル伝達性リガンドを用いて末端キャ
ップされていない場合にポリマー全体が、規定される非細胞結合性特性を有し、
そして好ましくは水可溶性ではないということである。相対的に高い密度の、非
常に短い（ＭＷ ５００以下）親水性側鎖は、より低い密度の、より高い分子量
（例えば、ＭＷ １５００と２０００との間）の側鎖の場合の細胞性接着に対し
て同程度の耐性を提供し得る。当業者は、これらの因子を考慮に入れて、ポリマ
ーの分子量および密度を調整し得る。
【００４３】 （２．係留（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）リガンドの密度） コームコポリマーの非細胞結合性側鎖は、特定の細胞応答を誘発するために細
胞シグナル伝達性化学リガンドを用いて末端キャップされ得る。接着ペプチドま
たは増殖因子のようなリガンドは、特定の化学シグナルを細胞に提供するために
公知の化学的性質を使用して、側鎖の末端に共有的にまたはイオン的に結合され
得る。規定される一部分のリガンド保有側鎖は、側鎖の末端へのリガンド側鎖の
カップリングの間に適切な化学量論的な制御を使用することによってか、リガン
ドで末端キャップされるべきでない側鎖上の末端基を保護することによってか、
またはこれらのアプローチの組合せによって、得られ得る。適用に関して、生体
材料表面上で、ナノメートルまたは数十ナノメートルの長さスケールでのクラス
ターリガンドが望ましい場合、１を超えるリガンド（平均で）は、各コームコポ
リマーに結合され得る。適用に関して、ナノメートルから数十ナノメートルのサ
イズスケールの生体材料表面上での単一のクラスターにおいて２つ以上の型のリ
ガンドを組み込むことが望ましい場合、１つ以上の各リガンド型（例えば、接着
ペプチドおよび増殖因子）は、公知の特性を使用して各コームコポリマー鎖に（
平均で）結合され得る。従って、表面におけるリガンド（単数または複数）の提
示は、同じコームに結合するリガンドの数により、局所的密度に関してコーム分
子の多枝性質を開発することによって全体の表面密度に関して合わせて作製され
得る。細胞性接着または他の細胞機能を制御するためのポリマーの能力は、表面
で存在する細胞シグナル伝達性リガンドの密度を制御することによって調整され
得る。
【００４４】 （ＩＩ．ポリマー混合物） （Ａ．コームコポリマーの混合物） 接着ペプチドがコームコポリマー側鎖にカップリングされる場合、細胞は、コ
ームコポリマー表面上で容易に結合し、そして延展する。それらの表面上での細
胞の延展および増殖の量は、接着ペプチドを保有するコームコポリマーを非細胞
結合性コームコポリマーと混合することによって制御され得る。例えば、それに
よってコームの２０％未満、より代表的には２％未満が、接着ペプチドを保有す
る。同様に、生体材料表面上のリガンドクラスターの空間的な分布は、非細胞結
合性コームコポリマーを、各鎖において、平均で、その側鎖に結合される１を超
えるリガンドを有するコームコポリマーと混合することによって制御され得る。
【００４５】 リガンドクラスターのサイズ（すなわち、リガンドが局在される空間的な領域
）は、リガンドを保有するコームコポリマーの特徴的なサイズによって指向され
、そしてコームコポリマーの回転半径（ＲG）（これは、当業者によって計算さ
れ得るかまたは実験的に決定され得る）から概算され得る。コームコポリマーの
回転半径は、代表的に、ナノメートルと数十ナノメートルとの間の範囲であり得
、総分子量、側鎖長、およびポリマー鎖周囲の環境（例えば、他のポリマー鎖ま
たは水分子）に依存する。従って、リガンドクラスターのサイズ、ならびにクラ
スターあたりのリガンドの数および型は、リガンドを保有するコームコポリマー
の合成条件によって制御され得る。例えば、コームコポリマーのＲGは、クラス
ターのπＲG 2あたりの面積を有する。単位表面面積あたりの表面上のクラスター
の数（平均で）は、表面で非細胞結合性コームに対するリガンドを保有するコー
ムの比によって制御され得る。リガンドクラスター間の表面分離距離ｄ（ここで
、ｄ＞２ＲG）を達成するために、リガンドを保有するコームの濃度は、およそ
φ＝Ｖchain／（２ＲGｄ2）（ここで、Ｖchainは、単一のコームコポリマー鎖に
よって占有される容量である）であるべきである。
【００４６】 （Ｂ．コームコポリマーおよび他のポリマーの混合物） 本明細書中に記載されるコポリマーは、制御される細胞応答を誘発しない他の
コポリマーとブレンドされ得る。適用において、第２の疎水性または非細胞調節
性ポリマーの表面を修飾するためのコームコポリマーを使用することが望ましい
場合、このコームコポリマーは、第２のポリマーに対して少量添加され得、そし
て表面に対してコームの分離を達成するためにプロセスされ得る。コームコポリ
マーと他のポリマーとのブレンドは、コームコポリマーの重量で１〜９９％、好
ましくはコームコポリマーの２０重量％未満、およびより好ましくはコームコポ
リマーの１０重量％未満を含むブレンドを含む。コーム表面分離を達成するため
のプロセス工程は、減圧、空気中、水、水蒸気、超臨界ＣＯ2または表面でのコ
ーム成分に有利である他の環境下で、表面分離を達成する移動性を提供するため
に、ポリマー成分（マトリックスポリマーおよびコームコポリマー添加物）のガ
ラス転移より有意に高い温度において、混合物を加熱することを含む。第２のポ
リマー成分が半晶質ポリマーである場合において、アニーリング温度は、デバイ
スの所望の形状が保持されることを保証するために、ガラス転移点より高いがポ
リマーの溶融点より低くあるべきである。
【００４７】 好ましい実施態様において、表面分離は、医用デバイスの製造における標準的
なプロセス工程の間（例えば、抽出、オートクレービングまたは滅菌プロセスの
間）に達成される。他の実施態様において、分離は、デバイス製造後、制御され
る環境（水など）でのさらなるアニーリング工程において達成される。このよう
なプロセス工程は、ほとんどもっぱらコームコポリマーを含む、約２ＲGの厚さ
の表面層を作製する。このようなアニールされた混合物の観察可能な表面特性は
、純粋なコームコポリマーの特性と実質的に同一である。好ましい実施態様にお
いて、コームコポリマーは、バルクデバイスにおいて相分離を回避するために第
２のポリマーと混和性であり、これは、乏しい機構的または光学的特性を誘導し
得る。
【００４８】 他の場合において、主に第２の疎水性または非細胞調節性ポリマーから構成さ
れるデバイスの表面に対するコームコポリマーの局在化は、デバイス製造の他の
工程の間に達成され得る。例えば、第２のポリマーから作製されるデバイスの表
面におけるコームコポリマーの正確な配置は、３ＤＰ方法によって達成され得る
。 同様に、共にブレンドされる場合のコームコポリマーと第２のポリマーとの間の
粘性の差異は、線維、フィルムまたは他のデバイスの溶融抽出の間に表面にコー
ムを位置させるために活用され得る。コームコポリマーが表面に存在する多孔性
膜または非孔性膜、フィルム、線維または中空線維は、層転換成型（ｐｈａｓｅ
ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｃａｓｔｉｎｇ）によって調製され得る。この方法にお
いて、コームコポリマー、第２のポリマー、および共溶媒（ｍｕｔｕａｌ ｓｏ
ｌｖｅｎｔ）の溶液は、デバイスを形成するために水ベースの凝固槽へ成型され
る。成型工程の間、コームと凝固槽媒体との間の有利な相互作用は、フィルム、
線維、または膜の外表面に対してコームコポリマーの分離を誘導する。創傷治癒
適用における一時的なバリアデバイス（ｂａｒｒｉｅｒ ｄｅｖｉｃｅ）として
有用な細胞調節性微細孔生分解性膜は、この様式において調製され得る。細胞調
節性生分解性縫合糸は、溶液から水ベースの凝固槽へ線維を紡績することによっ
て、同様に調製され得る。このような表面修飾化線維はまた、生分解性材料また
は非生分解性材料から調製され得、そして細胞調節性の一時的なバリアデバイス
および生物濾過（ｂｉｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）デバイスを含む医用適用のため
の不織品を形成され得る。中空ナノ孔線維（ｈｏｌｌｏｗ ｎａｎｏｐｏｒｏｕ
ｓ ｆｉｂｅｒ）は、細胞調節性内表面を有するように調製され得る。このよう
な線維の一部に細胞をカプセル化することにより、長期間の薬物送達移植物は、
線維の内表面上に係留シグナルによって全体または一部が調節される量において
、細胞の望ましい産物を分泌するように調製され得る。表面過剰のコームコポリ
マーを有する細胞調節性生分解性微細孔骨格は、バルクのデバイスを形成する第
２のポリマー成分と比較した場合に、コームコポリマー成分に対して優先的な親
和性を有する溶媒の昇華を選択することによる凍結乾燥方法によって調製され得
る。
【００４９】 上記の全ての場合において、コームコポリマーを第２のコポリマーとの結合体
化に使用してデバイスを調製する場合、コームコポリマーは、以前に記載される
ような所望の細胞応答を達成するために、非細胞結合コーム、リガンド保有コー
ム、またはこれらの混合物であり得る。デバイスの観察可能な表面特性は、コー
ムコポリマーまたはコームコポリマー混合物自体の特性と実質的に同一である。
【００５０】 （ＩＩＩ．コームコポリマーを用いて調製されるラテックス） （Ａ．ラテックス合成） コームコポリマーが医用適用における細胞応答を制御するために使用され得る
さらなる方法は、コームコポリマーをラテックス粒子表面上に組込むポリマーラ
テックスの調製を介する。このようなラテックスは、含水性媒体において、コー
ムコポリマーを安定剤として使用し、分散重合方法または乳化重合方法により調
製され得る。重合は、含水性媒体中に所望のモノマー、コーム安定剤、および開
始剤を溶解することにより達成される。例えば、熱を溶媒に適用することによっ
て、ポリマーが開始する。この分散媒は、コームコポリマーにとっては良好な溶
媒であるが、成長するポリマーにとっては貧弱な溶媒である。疎水性コーム骨格
は、合成されるポリマーに適合するように選択され、従って成長するポリマー粒
子の表面に固定し、一方親水性側鎖は、フロキュレーションに対して粒子を安定
させる。ラテックス合成の完了の際、生じたラテックス粒子は、０．１〜１０μ
ｍの範囲のサイズであり、代表的には分散媒における重量で２０〜７０％ポリマ
ー固体で分散されている。これらの系は、粒子表面に固定されたままであるコー
ムコポリマーを通じた細胞応答を制御するための種々の方法において使用され得
る。
【００５１】 非生分解性適用のためにラテックス粒子として合成され得るポリマーには、ポ
リビニルエーテル、ポリビニルエステル（例えば、ポリ（ビニルアセテート））
、ポリビニルハロゲン化物（例えば、ポリ（塩化ビニル））、ポリスチレンおよ
びポリアクリレート（例えば、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）、ポリ（エ
チル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イ
ソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポ
リ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート
）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポ
リ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、およびポ
リ（オクタデシルアクリレート））、ならびにそれらのコポリマーおよび混合物
、ならびにこれらのポリマーの有用な誘導体（化学基（例えば、アルキル基、ア
ルキレン基）の置換、付加、水酸化、酸化、および当業者により慣用的になされ
る他の修飾を有するポリマーを含む）が挙げられる。
【００５２】 生分解性適用のためのラテックス粒子として合成され得るポリマーには、ポリ
（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、およびポリ（ホスホ
エステル）、ポリラクトン（例えば、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（δ−
バレロラクトン）、ポリ（γ−ブチロラクトン）およびポリ（β−ヒドロキシブ
チレート）、およびポリ（ヒドロキシ酸）（例えば、ポリ（グリコール酸）、ポ
リ（ＤＬ−乳酸）およびポリ（Ｌ−乳酸））、またはポリ（グリコール酸）とポ
リ（乳酸）のコポリマーが挙げられる。
【００５３】 （Ｂ．ラテックスフィルム） フィルムまたはコーティングは、任意の表面上にラテックスを浸漬、ブラッシ
ング（ｂｒｕｓｈｉｎｇ）、ローリング（ｒｏｌｌｉｎｇ）またはキャスティン
グするような通常の方法によりラテックスの分散物から調製され得る。細胞応答
を制御するための永久移植片に適用されるコーティングについて、非生分解性コ
ーム安定剤で調製された非生分解性ラテックス粒子が好ましい。生分解性フィル
ムが好ましい適用について、生分解性ラテックスは、生分解性骨格を有するコー
ム安定剤を用いて調製され得る。制御された細胞応答を誘発する不透明コーティ
ングは、ラテックスフィルム（例えば、ちょうど言及されたようなラテックスフ
ィルム）を形成するために用いられる任意の標準的なコーティング方法を使用す
ることにより調製され得る。あるいは、ポリマー粒子のガラス転移より十分高い
温度でフィルムを熱処理することによって、この粒子は癒着して、表面にコーム
コポリマーが存在する滑らかな、透明フィルムになる。コームコポリマーは、例
えば、フィルムが癒着後すぐそのガラス転移より低く冷却される場合、表面に残
るエネルギー傾向に起因するか、または癒着ラテックスフィルムの大部分へコー
ムの拡散について不十分な移動度が存在するためかのいずれかにより、癒着の際
、その表面で局在化したままである。
【００５４】 ラテックスフィルムは、コームコポリマーそれ自体の表面特性を示すが、ごく
わずかの量のコームコポリマーが必要とされる（代表的には、全ラテックス１重
量％より下）という利点を有し、コーティングは、水ベースの懸濁液から容易に
適用され得、そしてフィルム形成特性は、フィルム形成ポリマーの賢明な選択に
より基材へ接着するように調整され得る。例えば、アクリル性眼内レンズが細胞
付着に対して抵抗性になるように、それ故経時的により曇らなくするために、非
細胞結合コームコポリマーにより安定化されたアクリル性ラテックスを使用して
、アクリル性眼内レンズ上に透明性アクリルコーティングを調製し得る。アクリ
ル性ラテックスはまた、制御された細胞応答が、耐久性金属、ガラス、またはセ
ラミック移植片あるいは他のデバイス（細胞培養装置を含む）の表面で所望され
る適用において使用され得る。なぜならば、高い程度の接着がしばしば、酸化物
表面とアクリル性ポリマーとの間に見出されるからである。ポリスチレン細胞培
養プレートまたは他の装置について、細胞調節ＰＳラテックスは、透明な、細胞
調節コーティングを上記の様式において調製するために使用され得る。
【００５５】 ラテックスがコームコポリマーにより安定化される上記の全ての場合において
、このコームコポリマーは、先に記載したような所望の細胞応答を達成するため
に非細胞結合コーム、リガンド保有コーム、またはこれらの混合物であり得る。
あるいは、混合ラテックス分散物が、０．１〜１０μｍの大きさの表面上にクラ
スター化リガンド領域を含むフィルムを調製するために使用され得る。これは、
非細胞結合コームで被膜されたラテックス粒子の分散物およびリガンド保有コー
ムで被膜されたラテックス粒子の分散物をともに混合し、そして上記のようにこ
れらの混合した分散物のフィルムを作製することにより達成され得る。このリガ
ンドクラスターのサイズは、リガンド保有コームで被膜されたラテックス粒子の
おおよその直径であり、一方単位表面積あたりの表面上のクラスターの数は、混
合した分散物における非細胞結合ラテックス粒子に対するリガンド保有ラテック
ス粒子の割合によって制御され得る。
【００５６】 （ＩＶ．ポリマーの調製） 反応性モノマー単位を含む疎水性ポリマーを調製するための方法は公知である
。典型的な反応は、開環重合（ラクチド、グリコリド、および他の環状モノマー
単位のようなモノマーについて）、フリーラジカル重合（メチルメタクリレート
のような二重結合を含むモノマー単位について）、ならびにアニオン性または他
の付加重合である。
【００５７】 疎水性ポリマー骨格を調製するために使用されるモノマー（例えば、ラクチド
、グリコリド、カプロラクトン、およびトリメチレンカーボネート）は、適切な
触媒（例えば、Ｋｒｉｃｈｅｌｄｏｒｆ，Ｈ．Ｒ．、Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｂｉ
ｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ｂｙ Ｒｉｎｇ−Ｏｐｅｎｉｎｇ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａ
ｔｉｏｎ、Ｐｅｎｃｚｅｋ，Ｓ．編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏ
ｎ、１９９０、第１章；Ｋｒｉｃｈｅｌｄｏｒｆ，Ｈ．Ｒ．、α−Ａｍｉｎｏａ
ｃｉｄ−Ｎ−Ｃａｒｂｏｘｙ−Ａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ
Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ
、１９８７；ならびにＩｍａｎｉｓｈｉ，Ｙ．、Ｒｉｎｇ−Ｏｐｅｎｉｎｇ Ｐ
ｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、Ｉｖｉｎ，Ｋ．Ｊ．およびＳａｅｇｕｓａ，Ｔ．
編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８４、第２巻、第８章に記載される
ようなルイス酸）の存在下で、種々の重合開始剤（例えば、エチレングリコール
およびエタノールのようなアルコール、水ならびにアミン）と反応し得る。
【００５８】 ポリマー骨格上にグラフトされた細胞結合ポリマーの側鎖は、好ましくは親水
性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリア
クリル酸、デキストランおよびそれらの混合物）である。これらは、反応性官能
基、例えば、アミノ、カルボン酸、ハロ、スルフィド、グアニジノ、イミダゾー
ルおよび水酸基を含むように修飾され得る。これらの基は、このポリマー骨格に
親水性ポリマーをグラフトするための慣用的な求核性置換反応において、このポ
リマー骨格上の種々の反応基と反応し得る。側鎖ポリマーは、標準的な共有結合
反応またはイオン性カップリング反応により細胞結合リガンドで末端キャップ化
され得る。
【００５９】 （Ｖ．表面コーティングおよびデバイス組込みコームコポリマー） 多数の方法が使用されてコームコポリマー、コームコポリマー混合物、または
コームコポリマーと他のポリマーとの混合物を表面に適用し得る。これらの方法
は、基材上にフィルムを浸漬コーティング、スプレーコーティング、ブラッシュ
（ｂｒｕｓｈ）コーティング、ロールコーティング、またはスピンキャスティン
グし、続いて緩やかに加熱して表面への接着を促進する工程を含む。３ＤＰ、ま
たは凍結乾燥方法のような固体フリー形成（ｓｏｌｉｄ ｆｒｅｅ ｆｏｒｍ）
プロセスを使用して、複雑な三次元構造（多孔性構造を含む）を作製し得る。こ
れらの処理アプローチのすべてにおいて、適切な架橋剤を組込んで、コーティン
グまたはデバイスの力学的な剛性を増大し得る。
【００６０】 他のポリマーとのコームコポリマーの混合物が所望される適用において、コー
ム表面の分離を達成する処理工程は、真空で、大気中で、水、水蒸気、超臨界Ｃ
Ｏ2または表面にてコーム成分を助力する他の環境において、必要な移動度をコ
ームに提供するためにこのポリマーのガラス転移より十分高い温度でこの混合物
を加熱する工程を含む。第２のポリマー成分が半晶質ポリマーである場合、アニ
ーリングの温度は、所望の型のデバイスが保持されることを確実にするために、
ガラス転移より高いが、このポリマーの融点より低いべきである。
【００６１】 表面分離は、好ましくは医用デバイスの製造における標準的処理工程（例えば
、抽出、オートクレーブまたは滅菌処理）の間に達成され得るか、またはデバイ
スが製造された後の別のアニーリング工程において達成され得る。この型の処理
は、ほとんどコームコポリマーのみを含むデバイス上に表層を形成する。他の場
合、主に第２のポリマーから構成されるデバイスの表面へのコームポリマーの局
在化は、デバイスの製造の他の工程の間に達成され得る。例えば、コームポリマ
ーと第２のポリマーとの間の粘性における差異は、これらが共に混合される場合
、繊維、フィルム、または他のデバイスの融解押し出しの間にコームを表面に配
置させるために利用され得る。コームコポリマーがその表面に存在する、多孔性
または非多孔性膜、フィルム、繊維または中空繊維は、転相キャスティングによ
り調製され得る。この方法において、コームポリマーの溶液、第２のポリマー、
および交互溶媒を、水性ベースの凝固浴槽にキャスティングして、デバイスを形
成する。キャスティングプロセスの間、コームと凝固浴槽媒質との間との好まし
い相互作用は、フィルム、繊維または膜の外側表面へのコームコポリマーの分離
を誘導する。創傷治癒の適用において、一時的な障壁デバイスとして有用な細胞
調節性細孔生分解性膜は、この様式で調製され得る。細胞調節性生分解性縫合糸
は、溶液から水溶性ベースの凝固浴槽への繊維の紡績により、同様に調製され得
る。このような表面改変繊維はまた、生分解性材料または非生分解性材料から調
製され得、そして細胞調節性一時的障壁デバイスおよび生体濾過デバイスを含む
、医用適用のための不織布物に成形され得る。細胞調節性内側表面を有するナノ
孔中空繊維が、調製され得る。このような繊維の一部分における細胞のカプセル
化によって、繊維の内側表面上の係留シグナルにより、完全にまたは部分的に調
節された多量の所望の細胞産物を分泌する、長期薬物送達移植片が調製され得る
。表面の過剰なコームコポリマーを有する細胞調節性生分解性細孔足場は、デバ
イスの大部分を形成する第２のポリマー成分と比較して、コームコポリマー成分
に対する優先的な親和性を有する昇華溶液の選択による、凍結乾燥法により調製
され得る。
【００６２】 （Ｖ．医用適用） 本明細書中に記載されるコーム型コポリマーは、種々の医用適用（例えば、組
織工学における細胞増殖のための足場および支持体材料、医用移植片（例えば、
眼内レンズまたはポリマー材料、金属材料、ガラスまたはセラミック材料から作
製される他の永久移植片）のためのコーティング、および細胞培養プレート、ピ
ペットなどのような細胞培養装置のためのコーティング）において使用され得る
。このコーム型コポリマーは、創傷治癒での適用における縫合糸、一時的障壁フ
ィルムまたはファブリック、人工心臓および血管、カテーテル、血液または他の
体液用フィルター、ならびに標的化徐放薬物送達ビヒクルおよびカプセル化細胞
薬物送達系の表面特性を改変するために使用され得る。これらの材料は、組織工
学、創傷治癒、および標的化薬物送達の適用のために使用される場合、好ましく
は生分解性であり、そして移植片、細胞培養装置、濾過デバイス、および長期の
使用または移植目的の他のデバイスを改変するために使用される場合、好ましく
は非生分解性である。
【００６３】 （Ａ．組織工学） 組織工学の適用における使用について、コームコポリマーは、細胞接着分子お
よび増殖因子のような、有効な細胞−ポリマー相互作用を促進する生物学的に活
性な分子をその親水性側鎖の末端へ付着することにより、誘導体化され得る。コ
ームコポリマーを組込む細胞の播種または内殖に適切なマトリックスが、形成さ
れ得るか、あるいはステンレススチール、コラーゲン、または別のポリマーのよ
うな材料より形成されたマトリックスが、コームコポリマーにより被覆され得る
。次いで、このマトリックスは、細胞を播種されて移植されるか、またはそのマ
トリックスは組織内殖が生じるように移植されるかのいずれかである。これらの
材料は、コポリマーに付着した細胞接着ペプチドの型および密度における変化を
通じて種々の細胞型の特定の必要性に合うように調整され得る。このマトリック
ス上に播種され得る細胞型は、肝細胞、尿管内皮細胞（ｕｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌ
ｉａｌ ｃｅｌｌ）、皮膚細胞、筋肉細胞、神経細胞ならびに骨および／または
軟骨形成細胞のような実質細胞を含む。正常細胞、胎児細胞または一般的に遺伝
子操作された細胞は、このマトリックス上に播種され得る。
【００６４】 （Ｂ．薬物送達およびイメージング） コームコポリマーはまた、薬物送達系としての使用のためまたはイメージング
目的のためにマトリックスへと形成され得る。コームコポリマーで被覆された生
分解性ラテックスは、治療剤、予防剤または診断剤の標的化送達のために使用さ
れ得る。コームコポリマーまたはコームコポリマー混合物から構成される細胞性
調節内側表面を有するナノ孔中空繊維が、調製され得る。このような繊維の一部
分における細胞のカプセル化により、長期薬物送達移植片が、調製され得、これ
は、繊維内側表面上の係留シグナルにより完全にもしくは部分的に調節される量
で所望の細胞産物を分泌する。
【００６５】 薬物送達における使用について、治療剤または予防剤（例えば、アミノ酸、生
理活性ペプチドもしくはタンパク質、炭水化物、糖または多糖類、核酸またはポ
リ核酸、合成有機化合物または金属）は、当該分野において利用可能な方法を用
いてコームコポリマーの親水性側鎖の末端基を介して接着され得る。コームコポ
リマーは、改変されて、組込まれた薬剤のレベルを増加させ得る。送達される薬
剤のより高い安定性を提供する薬剤は、このコポリマーに共有結合的にまたはイ
オン結合的に接着され得る。コームコポリマーは、特定の結合部分（例えば抗体
、これは送達用のラテックス粒子を体内の特定の部位に標的化させる）により機
能的になり得る。親水性、疎水性、酸性、塩基性またはイオン性側鎖はまた、コ
ポリマーに付着されて、薬物用送達デバイスとしてのそれらの用途を拡大する。
改変された薬物含有コームコポリマーのマトリックスは、動物に経口的にまたは
非経口的に投与され、その薬物を、それが必要とされる動物の部位にインビボで
動物に送達し得る。
【００６６】 診断剤は、放射性材料、蛍光材料、酵素的材料、気体および磁気材料を含む。
【００６７】 （Ｃ．細胞反発的表面を提供する材料の使用） 医用移植片（例えば、眼内レンズ）と細胞および組織との相互作用を最小限に
することがしばしば所望される。これらの相互作用は、移植片の表面が非細胞結
合コポリマーで被覆される場合、最小限になる。いくつかの適用においては、こ
のコポリマーは非生分解性であることが好ましい。例えば、眼内レンズを移植す
る場合、そのレンズは長い間適切な場所に留まることが意図され、そして生分解
性は避けるべきである。
【００６８】 好ましい非分解性ポリマー材料は、アルキルアクリレート（すなわち、メチル
メタクリレート）とＰＥＧ−メタクリレートのコポリマーである。このコーティ
ングを表面に配置するための好ましい方法は、ラテックスフィルムの形成による
。
【００６９】 本発明は、以下の限定目的ではない実施例を参照することにより、さらに理解
される。ここで、以下の材料および装置が利用された。
【００７０】 （実施例１：生分解性コームコポリマーおよびそれらの混合物の調製、加工お
よび評価） （コームコポリマーの合成） ラクチド、エピクロロヒドリン、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテル
（ＭＰＥＧ、Ｍｗ約３５０ｇ／モル）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ、
Ｍｗ約４００ｇ／モル）、および無水トルエン（全てＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ．より入手）をそのまま使用した。テトラヒドロフラン（Ａｌｄ
ｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を使用前に蒸留した。ラクチドおよびエ
ピクロロヒドリン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を開環重合（
Ｓｈｅｎら、Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ、３１：
１３９３（１９９３））により、トリオクチルアンモニウム水触媒とともにトル
エン中で、１００℃で共重合した。インサイチュでＡｌＯｃｔ3：０．５Ｈ2Ｏ触
媒を、文献の手順の改変形を用いて調製した。簡単に言うと、ＡｌＯｃｔ3（ヘ
キサン中２５重量％、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）および希釈
したＴＨＦを窒素下で密封したフラスコ内で攪拌し、そしてドライアイス／アセ
トン浴中で−６８℃で平衡化した。ＡｌＯｃｔ3と水との間が１：０．５モル比
になるように、この混合物にＨ2Ｏを添加した。この混合物を、−６８℃で１５
分間、激しく攪拌し、次いで、ドライアイス浴中から取り出し、そして３０分か
けて室温まで戻した。次いで、この触媒溶液をラクチド、エピクロロヒドリン、
およびトルエンを含む密閉した反応フラスコに窒素下で注入し、そして１６時間
１００℃で反応させ得た。生じたＬＡ−ＥＯコポリマーを、石油エーテル中で繰
り返し沈殿させることによって精製した。
【００７１】 ＭＰＥＧおよびＰＥＧのＬＡ−ＥＯコポリマーへのグラフティングを、エチレ
ングリコール鎖の末端水酸基を骨格コポリマーのペンダントの塩素基と反応させ
る相間移動触媒（Ｏｂｅｒ、Ｍａｋｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．、Ｍａｃｒｏｍｏｌ
．Ｓｙｍｐ．３５：３６−８７（１９９０））により実行した。このＬＡ−ＥＯ
コポリマーを塩化メチレンに溶解させた。次いで、ＰＥＧ、ＭＰＥＧ、およびｐ
Ｈ８のＮａＨＣＯ3水溶液を勢いよく攪拌しながら添加した。この混合物を一晩
反応させた。未反応のグリコールを、メタノール中で繰り返し沈殿させることに
よってポリマーから除去した。最終的な非細胞結合コームコポリマーは、約４０
，０００ダルトンの分子量を有し、水に不溶性であり、そして親水性ＰＥＧの側
鎖を約４０重量％組込んでいた。
【００７２】 ペンタマーアミノ酸配列、Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ
（ＧｉｂｃｏからのＧＲＧＤＳＰ、本明細書中でＲＧＤとして呼ばれる）を用い
て、接着リガンド保有コームコポリマーを、ＲＧＤをＰＥＧ側鎖の官能基化末端
につなぐことによって作製した。ＲＧＤは、細胞膜の表面上でインテグリンとし
て公知であるレセプターと特異的に相互作用する。そしてＲＧＤ−インテグリン
カップリングは、インビボでそれらの周辺への細胞の接着を媒介する。公知のト
レシルクロリドケミストリー（ｔｒｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）（Ｏｂｅｌら、Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，Ｐｏｌｙｍ．Ｌｅｔｔ．Ｅ
ｄ．２３：１０３（１９８５））を用いて、ＲＧＤを、一級アミンを介して非細
胞結合コームコポリマーにカップリングした。コームコポリマーを、溶液中でト
レシルクロリド基で活性化させ、そして使用するまで−２０℃で保存した。ＲＧ
Ｄを、ＲＧＤのＰＢＳ溶液（２５μｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４）中で、５℃で３時間
浸漬することによってコームにカップリングさせた。ＰＢＳで系を複数回すすい
で未反応のＲＧＤを除去した。
【００７３】 （フィルム加工） この活性化されたコームコポリマーと非細胞結合コームコポリマーとの混合物
を、種々の比率で調製し、そしてトルエン中の溶液からガラススライド上にキャ
スティングした。その後フィルムを真空下で２４時間乾燥させて残存する溶媒を
除去した。続いてＲＧＤを、曝露された活性化コームポリマーにフィルムの表面
にて上記の様式でカップリングさせた。１００重量％、２５重量％および５重量
％トレシル活性化コームコポリマーを含む混合物について、表面のＲＧＤ密度は
、それぞれ９．５ｐｇ／ｃｍ2、２．５ｐｇ／ｃｍ2、および０．５ｐｇ／ｃｍ2
であった。
【００７４】 ポリラクチド（ＰＬＡ）ホモポリマーおよび少量の非細胞結合コームコポリマ
ーまたはＲＧＤ保有コームコポリマー（ＰＬＡに対して１０重量％以下）の混合
物をトルエン中に溶解させ、フィルムとしてガラス上にキャスティングした。続
いてフィルムを真空下で２４時間乾燥させ、残存する溶媒を除去した。いくつか
のコーム／ＰＬＡフィルムを続いて７０℃水浴中で９６時間アニールした。Ｘ線
光電子分光法研究は、アニールした混合物の表面でのコームコポリマーの有意な
濃縮を示した（１０％バルク濃度の場合、表面に約６０体積％のコームコポリマ
ー）。前進／後退接触角測定により、アニールされた混合フィルムが、ＰＬＡよ
り十分に低い水接触角を有し、そして水と接触した場合の表面でのＰＥＧ側鎖再
配向／水和の指標である大きなヒステリシスを提示することが同様に示される。
【００７５】 （細胞培養） ＮＲ６線維芽細胞を、血清含有培地中で、混合コームフィルム（ｍｉｘｅｄ
ｃｏｍｂ ｆｉｌｍ）、コーム／ＰＬＡブレンド、およびＰＬＡコントロールフ
ィルム上で培養した。最初に、ポリマーフィルムを、エタノール中での液浸によ
って滅菌した。野生型ＮＲ６線維芽細胞を、ウシ胎児血清を補充した改変イーグ
ル培地中で、ポリマーフィルム表面上に播種した。細胞を２４時間培養し、培地
を吸引し、そして位相差顕微鏡写真を撮る前に新鮮な培地を加えた。
【００７６】 非細胞結合コームのフィルムは、血清を添加した培地の存在下でさえも、２４
時間の期間にわたって、細胞の接着に対して完全に抵抗性であった。このことは
、フィルム表面の、ＰＥＧ側鎖の高密度な含水層の形成に起因すると考えられる
。混合コームフィルムにおいては、ＲＧＤの表面密度の増加が、このフィルム表
面上での細胞の接着および広がりを増加した。非官能基コームを有するフィルム
中のＲＧＤカップリングコームの重量割合における０〜１００％の変化は、この
表面に対する細胞の接着応答の変化を可能にした。０％のＲＧＤコームでは細胞
は接着せず、５％のＲＧＤコームでは細胞は固着したが丸みを帯びた形態を保持
し、そして１００％ＲＧＤコームでは細胞は強固に接着しそしてその表面上に広
がった。この結果は、コーム混合物が、細胞接着の上に、あるレベルの整調可能
なリガンド提示および制御を提示し得ることを実証する。このＲＧＤ保有表面は
、血清非存在下でさえも、細胞の接着および広がりを支持した。さらに、培地に
添加された可溶性ＲＧＤは、細胞の広がりを抑制し、そしてそれらの細胞を表面
から剥離した。これらの結果は、観察された効果が、細胞インテグリンとＲＧＤ
との間の特異的な相互作用に起因し、インテグリンとＲＧＤ上に吸着された血清
タンパク質との相互作用に起因しないことを示す。
【００７７】 アニール化ＰＬＡ／非細胞結合性コームブレンドの表面上では、タンパク質吸
着を阻害するコーム富化表面層の形成に起因して細胞接着は見出されなかった。
比較して、細胞接着は未修飾ＰＬＡ上、およびより少ない程度で非アニール化ブ
レンド上で観察され、これらは両方とも、細胞が制御されない様式で固着しそし
て広がることを可能にした。アニール化ＰＬＡ／ＲＧＤ保有コームブレンド上で
の細胞培養研究は、血清非存在下でさえも、ＲＧＤリガンドを介した、有意な制
御された細胞接着を示した。
【００７８】 細胞接着の程度の調節はまた、初代ラット肝細胞を用いた細胞培養実験におい
ても実証された。この細胞を、上記のように調製しそしてアニール化した、１０
％コーム／ＰＬＡブレンドフィルム中１％または１００％のいずれかのＲＧＤ保
有コームを含む基材上に、３０，０００細胞／ｃｍ2の密度でプレートした。肝
細胞は、１００％ ＲＧＤコームを含む基材上では高度な広がりを保持するが、
１％のみのコームがＲＧＤ保有であったブレンド上では凝集しそして回転楕円面
形態をとる。
【００７９】 （実施例２：コーム／ＰＬＡブレンドからの生分解性デバイスの調製） （多孔性足場） 組織工学用途のための基材として使用され得る、生分解性のＰＬＡ／コームコ
ポリマーのミクロ多孔性足場を、ジオキサン中１０％重量／容積のポリマーの溶
液を凍結乾燥することによって調製した。１０重量％の生分解性の非細胞結合性
コームコポリマーおよび９０重量％ ＰＬＡを含むブレンドをジオキサン中に溶
解しそして液体窒素中で凍結させる。これにより、ポリマーと溶媒との相分離が
生じる。ジオキサンの昇華に際して、多孔性生分解気泡が得られ、これを例えば
、オートクレーブまたは９０℃の脱イオン（ＤＩ）水中での加熱処理によってさ
らに処理して、孔外部表面上にコームコポリマーの高い適用範囲を達成し得た。
【００８０】 （一時バリア膜） 創傷治癒用途において一時バリアとして使用され得る、生分解性ＰＬＡ／コー
ムコポリマーミクロ多孔性膜を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中１
０〜２０％ポリマーの溶液からの転相キャスティングにより調製した。１０重量
％の生分解性の非細胞結合性コームコポリマーおよび９０重量％ ＰＬＡを含む
ブレンドをＤＭＦ中に溶解し、そしてドクターブレードを使用して洗浄されたガ
ラス基材上にキャストした。この基材を９０℃の脱イオン（ＤＩ）水の槽に即座
に浸して、不溶性ポリマーの沈殿の間に多孔性膜構造を作製した。一旦形成され
ると、この膜を取り出し、そして９０℃の第２のＤＩ槽中でリンスして微量の溶
媒不純物を取り除いた。
【００８１】 （実施例３：非生分解性コームコポリマーおよびそれらの混合物の調製および
評価） （コーム合成） 非生分解性コームポリマーを、７０℃のトルエン中でアゾ（ビス）イソブチロ
ニトリルにより開始させた、メタクリレートメチル（ＭＭＡ）の、メトキシポリ
（エチレングリコール）メタクリレート（ＭＰＥＧＭＡ）またはポリ（エチレン
グリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）いずれかと、あるいはこれらの混合
物とのフリーラジカル重合により合成した。１２〜１６時間後にこの反応を終結
させ、そしてこのポリマーを石油エーテル中で沈殿させた。得られたコームポリ
マーは、ＰＥＯ側鎖を有するＰＭＭＡバックボーンを有し（この側鎖はこのバッ
クボーンに沿ってほぼ無作為に分布する）、そして約２０，０００ｇ／モルの分
子量を有する。ＰＥＧＭＡマクロモノマーは、ヒドロキシル基で末端キャップさ
れた側鎖を提供する。これはペプチドの共有結合のために誘導体化され得る。一
方で、ＭＰＥＧＭＡ単位は非反応性メトキシ末端化ＰＥＧ側鎖を提供する。重量
で約４０％のＰＥＧ側鎖を含むコームは水に不溶性であるが、非常に親水性のタ
ンパク質抵抗性表面および細胞抵抗性表面を形成し、従って、これは非細胞結合
性であると考えられる。
【００８２】 接着リガンドを保有する非生分解性コームを得るために、ＲＧＤペプチドをＰ
ＥＧ側鎖のヒドロキシル末端基に結合させた。このコームを無水テトラヒドロフ
ラン（ＴＨＦ）中に溶解し、続いてトリエチルアミンおよび塩化トレシル（ｔｒ
ｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を添加し、そして９０分間反応させた。活性化し
たポリマーを無水メタノール中での沈殿によって回収し、そして使用するまで−
７０℃にて保存した。ＲＧＤを、活性化コームを乾燥ＴＨＦ中にまず溶解し、続
いてペプチド溶液（リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中１ｍｇ／ｍＬのＧＲＧ
ＤＳＰ）を１０：１のＴＨＦ：ＰＢＳの割合で添加することよって、一級アミン
を介して活性化コームにカップリングさせた。カップリングを５℃で３時間攪拌
することにより進行させた。得られたＲＧＤ−コームポリマーを、沈殿／脱イオ
ン水での洗浄により回収する。
【００８３】 （フィルム調製および細胞培養） 細胞培養のためのフィルムを、無水トルエンからガラス基材上にコームポリマ
ーをスピンコーティング（ｓｐｉｎ−ｃｏａｔｉｎｇ）することにより調製した
。完全に細胞抵抗性の表面を、非細胞結合コームの溶液をスピンコーティングす
ることにより調製し、一方、リガンド保有表面を、非細胞結合コームおよびＲＤ
Ｇ保有コームの両方を含む溶液をスピンコーティングすることにより作製した。
【００８４】 野生型ヒト表皮増殖因子レセプター（ＷＴ ＮＲ６）でトランスフェクトした
ＮＲ６線維芽細胞を、７．５％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸
、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン−ストレプトマイシン、およびゲンタマイ
シン抗生物質を補充した改変イーグル培地α（ＭＥＭ−α）中で培養した。細胞
をコームコポリマーフィルム上に２０，０００細胞／ｃｍ2で２４時間播種し、
続いて吸引して未接着の細胞を除き、そして新鮮な培地を加えた。次いで、細胞
の形態／フィルムへの接着を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００位相差顕
微鏡を使用して評価した。非細胞結合コームのフィルム上では、細胞接着は観察
されなかった。対照的に、ＲＤＧ保有コームのフィルムは接着を支持し、そして
フィブロネクチン上で観察された細胞形態に匹敵する細胞形態を生じた。
【００８５】 （実施例４：ＥＧＦ係留コームフィルムの調製および評価） （フィルム調製） 係留された表皮増殖因子リガンドを有する非生分解性コームを得るために、Ｐ
ＭＭＡバックボーンおよびＰＥＧ側鎖を有する細胞非結合コームを、実施例３に
記載されるように調製した。ＥＧＦをＰＥＧ側鎖のヒドロキシル末端基に、上記
の手順に続いてまずこの側鎖を塩化トレシルで活性化することによって結合させ
た。
【００８６】 トレシル（ｔｒｅｓｙｌ）活性化コームのフィルムを、０．０１ｇ／ｍｌのト
ルエン溶液から１０００ｒｐｍでスピンコーティングした。続いて、フィルムを
減圧下で乾燥させて残渣溶媒を除き、次いで、１時間のＵＶ照射によって滅菌し
た。このフィルム上でＥＧＦの５μｇ／ｍｌ滅菌ＰＢＳ溶液（１００ｍＭリン酸
）を５℃にて３時間インキュベートすることによって、ＥＧＦを表面にカップリ
ングさせた。溶液を吸引し、そしてサンプルを１００ｍＭ ｐＨ７の滅菌トリス
溶液で２０℃にて１時間ブロックした。コントロールをトリス存在下で加水分解
し、それによって、全てのトレシル部位をＥＧＦの代わりにトリスでキャッピン
グした。１つの加水分解したコントロールを、ＥＧＦカップリング工程をシュミ
レートする条件下でＥＧＦ溶液に曝して、ＥＧＦの非特異的な吸着について調べ
た。サンプルを滅菌ＰＢＳで複数回リンスした。このプロトコルは、フィルム表
面上に１．０±０．３ｎｇ／ｃｍ2の係留ＥＧＦを提供した。
【００８７】 （細胞培養） ＰＣ１２細胞を、表面に播種（培地：５％ ＦＢＳ、１０％ウマ血清熱失活ド
ナー集団（ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｈｅａｔ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｄｏ
ｎｏｒ ｈｅｒｄ）を含み、そしてペニシリン−ストレプトマイシンを補充した
ＲＭＰＩ １６４０）し、そして３日間培養した。この実験においてその表面に
結合されたＰＣ１２細胞を維持するために、培養する前に、表面を０．５ｍｇ／
ｍｌのラット尾コラーゲン溶液に５℃にて一晩曝した。ＰＣ１２は、特定の条件
下でニューロン表現型へ分化する、副腎腫瘍細胞型である。この分化は、一般的
に、神経突起の形成および伸展によって形態学的に特徴付けられている、ニュー
ロン細胞の分化に類似する。可溶性ＥＧＦの存在下で培養されたＰＣ１２細胞は
、増殖因子シグナルによって誘導される形態学的な変化を受けることが報告され
ている（細胞は、おそらく、インテグリンの下方制御またはＥＧＦシグナルによ
って誘導されるインテグリン−ＥＣＭ親和性の変化のいずれかに起因して接着表
面上に集まる）。このＥＧＦ保有コームフィルムは、細胞に対して非接着性であ
り、そしてコラーゲン処理は弱い細胞接着表面のみを導く。ＰＣ１２細胞を、上
記のように数週間培養した。３日目で、分化の開始の証拠が観察され、これは２
週間後には非常に明瞭になった。コントロール上では分化は観察されなかった。
【００８８】 （実施例５：複数のリガンド型を提示する表面の調製） ＰＭＭＡバックボーンおよびメトキシ末端化ＰＥＯ側鎖もしくはヒドロキシル
末端化ＰＥＯ側鎖を有する非細胞結合コームコポリマーを、実施例３に記載され
るように調製した。続いて、このコームを使用して、同時係留させた表皮増殖因
子（ＥＧＦ）およびＲＧＤを提示する基材を作製した。最初に、ＲＧＤ保有コー
ムを、実施例３に記載される様式で調製した。ＲＧＤ保有コームを、塩化トレシ
ルで活性化した非細胞結合コームとともにＴＨＦ中に溶解し、そしてフィルムを
、標準的なスピンコーティング手順を使用して洗浄したガラス基材上にキャスト
した。フィルムを減圧下で２４時間乾燥させて、残渣溶媒を除いた。次いで、こ
の基材をＥＧＦ溶液に曝して、ＥＧＦの末端アミン基を介してこの表面の活性化
されたコーム側鎖にＥＧＦを共有結合させることを可能にした。ＰＢＳ中１０ｎ
ｇ／ｍＬ ＦＧＦの溶液を、ＲＧＤコームと、または活性化していないコームを
含むコントロールと混合した活性化コームを含む表面上でインキュベートした。
これらの条件下でこの基材に共有結合したＥＧＦの量は、８．５±１．５ｎｇ／
ｃｍ2であった。比較のため、係留したＥＧＦ上で培養した初代ラット肝細胞に
おける最大のＤＮＡ合成応答は、１ｎｇ／ｃｍ2（１０００ＥＧＦ分子／μｍ2）
以下の密度で生じ、そして肝細胞またはＷＴ ＮＲ６の細胞表面上のレセプター
のおおよその密度は、１００〜４００分子／μｍ2である。従って、ＲＤＧ保有
基材上に共有結合され得るＥＧＦの量は、細胞応答に影響するために十分である
。さらに、このコーム表面上に非特異的に吸着したＥＧＦの量は、０．９±０．
３ｎｇ／ｃｍ2であり、これは共有結合された量に対して無視し得る量である。
ＷＴ ＮＲ６線維芽細胞を、前記したように、ＥＧＦ／ＲＤＧ基材上で２４時間
培養した。この混合リガンド表面上では、細胞が接着しそして広がっていること
が観察された。
【００８９】 （実施例６：コームコポリマー安定化ラテックス） （コーム合成） コームポリマースタビライザーを、溶液中でフリーラジカル合成した。メチル
メタクリレート（ＭＭＡ）、メトキシポリ（エチレングリコール）メタクリレー
ト（ＭＰＥＧＭＡ）、およびポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥ
ＧＭＡ）を、２つのＰＥＧマクロモノマーの均等な重量割合でベンゼンに、総モ
ノマー濃度０．６Ｍについて添加した。アゾ（ビス）イソブチロニトリルを、２
０：１の［モノマー］：［開始剤］のモル比で添加した。この溶液を窒素下で１
５分間脱気し、続いて６０℃で１６時間重合させた。このコームポリマーを、石
油エーテル中での反復沈殿により精製した。タンパク質抵抗性表面を有するラテ
ックスビーズを得るために、最初に、コームスタビライザーコポリマー中でのＭ
ＭＡ単位に対するＰＥＧＭＡ／ＭＰＥＧＭＡ単位の割合を、最適化した。初期研
究により、４０重量％のＰＥＧＭＡ／ＭＰＥＧＭＡ単位を含むコームが、血清の
存在下で細胞抵抗性であり、かつ同時に水ベース媒体中での溶解に対して抵抗性
であるフィルムを形成したことが見出された。この組成のコームは、５０／５０
の水／エタノールに可溶性であり、従って、ポリマーラテックスの調製のための
理想的なスタビライザーとして使用した。より多くのＰＦＧ割合（約５０％重量
％以上）を有するコームは、時間が経れば水に可溶性であった。このコームスタ
ビライザーは、ペプチドの付着前では約２３，０００Ｄａの総分子量を有した。
【００９０】 接着リガンド保有ラテックスを得るために、最初に、ＧＲＧＤＳＰ（Ｇｉｂｃ
ｏ）をコームのＰＥＧＭＡ単位の末端に溶液カップリングすることより、ＲＧＤ
保有コームを調製した。カップリングを、塩化トレシル活性化コームとペプチド
のＮ末端アミンとの反応を介して達成した。コームのＰＥＧＭＡ単位のヒドロキ
シル末端を、テトラヒドロフラン中の２，２，２−トリフルオロエタンスルホニ
ルクロライド（塩化トレシル）との反応により活性化した。このコームコポリマ
ー（１５０ｍｇ）を、２５ｍｌの乾燥ＴＨＦ中に５℃で溶解した。トリエチルア
ミン（２００μｌ）および塩化トレシル（２５０μｌ）を添加し、そして反応を
３時間進行させた。次いで、活性化されたポリマーを、石油エーテル中での濾過
および沈殿により回収した。１５０μｌのＧＲＧＳＰ溶液（ｐＨ７．４のリン酸
緩衝化生理食塩水中１ｍｇ／ｍｌ）を２．５ｍｌの活性化されたコーム溶液（Ｔ
ＨＦ中０．０２ｇ／ｍｌ）に５℃で添加し、そして３時間攪拌することによって
、ＧＲＧＤＳＰペプチドを活性化されたポリマーにカップリングした。ＲＧＤカ
ップリングしたコームを、脱イオン水中での一晩の沈殿により回収した。カップ
リングしたペプチドの量を、比色アッセイ（ｍｉｃｒｏＢＣＡ，Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）によって決定した。ＲＧＤ含有量は、０．３重量％
（約１０のコームポリマー分子あたり１ＲＧＤペプチド）であることが見出され
た。
【００９１】 （アクリルラテックス合成） メタクリルベースのポリマーラテックスおよびアクリルベースのポリマーラテ
ックスを、安定剤としてコームポリマーを使用する分散重合によって合成した。
異なる４つの組成のラテックスを、本研究において調製した：純粋なポリ（メチ
ルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート−ｃｏ−ブチルアクリレート
）、ポリ（エチルメタクリレート−ｃｏ−メチルアクリレート）、およびポリ（
エチルメタクリレート−ｃｏ−ブチルメタクリレート）。さらに、１つの細胞相
互作用ポリ（メチルメタクリレート）ラテックスを、ＲＧＤコーム安定剤を使用
して調製した。コーム安定剤を、エタノールおよび水の容量で１：１の混合物中
に溶解し、続いてメタクリレート／アクリレートモノマーおよび０．５７ｇの過
硫酸アンモニウムを添加した。反応を６０℃で１８時間攪拌しながら進行させた
。反応は１つの相、すなわち透明な溶液として開始し、そして重合の間に不透明
な白色の分散物になった。合成の完了の後、全てのラテックスを、反復遠心およ
び水／エタノール中での再分散により精製した。懸濁液は、２４時間以上の時間
にわたって安定であり、そして延長した保存の後に、超音波混合（ｕｌｔｒａｓ
ｏｎｉｃ ｍｉｘｉｎｇ）により再懸濁され得た。全てのラテックスを、使用す
る前に少なくとも３０分間超音波的に処理した。ラテックス粒子を含むこのポリ
マーの分子量は、約４００，０００Ｄａ〜１，０００，０００Ｄａの範囲にわた
った。この粒子のガラス転移温度は、重合に使用されるモノマー成分に依存して
、−２６℃〜１０５℃の範囲にわたった。
【００９２】 このラテックスビーズの形態を、ＪＥＯＬ６３２０電界放出走査型電子顕微鏡
（４．０ｋＶ加速電圧で操作する）を使用して、基材上にキャストされたビーズ
を試験することにより評価した。サンプルを、画像化の前に、金で影をつけた。
平均粒子直径を、各サンプルについて測定された少なくとも３００粒子を用いて
、ＳＥＭ顕微鏡写真から測定した。平均粒子サイズは、０．２〜１．８μｍの範
囲であった。全てのラテックスは、１．０６未満のサイズ多分散（ｓｉｚｅ ｐ
ｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ）を有した。各々の場合において、コーム安定剤は
、全ラテックスビーズ組成物の１重量％未満を占めた。
【００９３】 （ラテックスフィルムの調製および特徴付け） 粒子（水／エタノール中０．０２〜０．０３ｇ／ｍｌ）を、洗浄したガラス基
材上に１０００ｒｐｍでスピンコーティングすることにより、フィルムをラテッ
クス懸濁物から調製した。キャスト粒子から連続したフィルムを形成させるため
に、８００〜９００℃に設定した熱線銃により、サンプルに短い熱処理（３０〜
６０秒）を適用した。光学顕微鏡においてこの表面を検査することよって、粒子
の融合を確認した。細胞培養実験および接触角実験のために、ポリ（メチルメタ
クリレート）ホモポリマー（ラテックスではない）を、コントロール基材として
使用した。ＰＭＭＡ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，６８Ｋｇ／モル，ＭW／ＭN＝
１．０７）フィルムを、洗浄したガラスカバーガラス上に、０．０３ｇ／ｍｌト
ルエン溶液から１０００ｒｐｍでスピンコーティングし、続いて７０℃で２４時
間減圧中で乾燥させた。
【００９４】 融合したラテックスフィルム表面上、非細胞結合コームのフィルム上、および
ＰＭＭＡコントロールフィルム上の水の接触角を、ＶＣＡ２０００ビデオ接触角
システム（ＡＳＴ Ｉｎｃ．）を使用して測定した。前進／後退接触角を、シリ
ンジによって未使用表面上に置かれた脱イオン水滴のデジタル画像を捕捉し、そ
して画像から角度を測定することによって測定した。コントロール以外の全ての
場合において、前進接触角は、比較的定常でかつ滴下容積とは独立していること
が分かるが、後退角は、滴下サイズにより接触角において有意な変化を示す。全
てのラテックスフィルムは、これらの測定において、２５°以上のヒステリシス
を示したが、純粋なＰＭＭＡは、わずか約１０°の変化を表した。接触角ヒステ
リシスは多くの理由で生じ得るが、本実施例で観察された接触角ヒステリシスに
ついての最も有力な説明は、浸潤に際しての、フィルム表面上でのＰＥＧ側鎖の
再構築／水和である。コームコポリマーが水溶性でないことは、水浸漬の前およ
び後での、乾燥させたラテックスおよびコームフィルムの厚さのエリプソメトリ
ー測定（これは、検出可能なポリマー欠失を示さなかった）によって確認された
。これらの結果は、一旦ラテックス粒子が融合して均質なフィルムになると、コ
ーム安定剤が表面上に残存することの強い徴候を提供する。
【００９５】 （細胞培養） 全ての細胞培養試薬は、Ｇｉｂｃｏから購入した。野生型ヒト表皮増殖因子レ
セプター（ＷＴ ＮＲ６）でトランスフェクトしたＮＲ６線維芽細胞を、７．５
％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ペ
ニシリン−ストレプトマイシン、およびゲンタマイシン抗生物質を補充した改変
イーグル培地α（ＭＥＭ−α）中で培養した。
【００９６】 細胞結合研究を、非細胞結合性コームコポリマーフィルム上、融合ＰＭＭＡラ
テックスフィルム上、および２つのコントロール（組織培養ポリスチレン（ＴＣ
ＰＳ）および純粋なＰＭＭＡフィルム）上に２０，０００細胞／ｃｍ2を播種す
ることにより行った。細胞を１．５ｍｌの血清含有増殖培地に２４時間播種し、
続いて、結合していない細胞を吸引して除去し、そして新鮮な培地を加えた。次
いで、細胞の形態／ラテックスフィルムへの接着を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅ
ｒｔ １００位相差顕微鏡を使用して評価した。
【００９７】 ２４時間後、細胞は両方のコントロール上で結合しそして広がる。これは、お
そらく、これらの表面上に吸着したタンパク質層を介する。しかし、コームコポ
リマー安定剤のＰＥＧ側鎖は、これらのストリンジェントな条件下で、コームフ
ィルムに対して完全な細胞抵抗性を提供する。同様に、ＰＭＭＡラテックスフィ
ルムは、コーム安定剤は全ポリマーフィルムのわずか約１重量％を占めるのみで
あるにもかかわらず、基本的に等価な細胞抵抗性能力を有する表面を提示する。
この観察は、コームが融合の間フィルム表面に局在して残存することのさらなる
証拠である。
【００９８】 ＲＧＤ保有ＰＭＭＡラテックスから融合させたフィルムを調製し、そして前記
したようにしてＷＴ ＮＲ６細胞を播種した。非細胞結合性コームで安定化させ
たラテックスとは対照的に、ＲＧＤ保有ラテックスの融合フィルムは、細胞結合
および広がりを誘起した。明らかに、これらのラテックスフィルムについて得ら
れたＲＧＤリガンドの表面密度は、ラテックスフィルムが全ペプチドの１／１０
０ほどを含むにもかかわらず、純粋なＲＧＤ結合コームに匹敵する。細胞のＲＧ
Ｄ保有表面への接着の特異性は、培養培地に過剰量の可溶性ＧＲＧＤＳＰ（４５
ｍＭ）を添加することによって確認された。全ての細胞は、可溶性ＲＧＤ投与の
１時間以内に剥離することが観察された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 77 Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ａｖｅ ｎｕｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ 02139 ＵＳＡ (72)発明者 グリフィス， リンダ ジー． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02139， ケンブリッジ， アントリム ストリート 110 (72)発明者 アーバイン， ダレル ジェイ． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02141， ケンブリッジ， ゴア ストリ ート 120， アパートメント １ (72)発明者 バナージー， パラブ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02120， ボストン， トレモント スト リート ナンバー205 1575 (72)発明者 ジョンソン， テリー ディー． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02134， アルストン， ガードナー ス トリート 72， アパートメント ディー ５ Ｆターム(参考） 4C081 AA01 AB02 BA16 CA081 CA191 CC01 CD031 CD111 CD34 DA02 4J031 CA06 CA36 CB04 CD10 CD24

Claims (36)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 細胞調節性のコーム型コポリマーであって、以下： ａ）疎水性ポリマー骨格； ｂ）該ポリマー骨格にグラフトされた非細胞結合性の親水性ポリマー側鎖であ
    って、ここで、該側鎖は２００ダルトン〜２０００ダルトンの分子量を有する、
    ポリマー側鎖； を含み、 ここで、該非細胞結合性の親水性側鎖の０％〜１００％は、細胞結合性リガン
    ドまたは細胞シグナル伝達性リガンドで末端キャップされて、短い細胞結合性コ
    ポリマー側鎖を形成し、そして ここで、該側鎖は、全コポリマー重量の６０％未満を含む、 細胞調節性のコーム型コポリマー。
  2. 【請求項２】 １０，０００ダルトンより大きい全分子量を有する、請求項
    １に記載のコームコポリマー。
  3. 【請求項３】 前記骨格が、生分解性である、請求項１に記載のコームコポ
    リマー。
  4. 【請求項４】 前記骨格が、非生分解性である、請求項１に記載のコポリマ
    ー。
  5. 【請求項５】 前記側鎖が、５００ダルトン未満であって、かつ全コポリマ
    ー重量の６０％未満を構成する、請求項１に記載のコポリマー。
  6. 【請求項６】 親水性側鎖に結合される骨格セグメントのモル百分率が、２
    ％〜３０％である、請求項１に記載のコポリマー。
  7. 【請求項７】 細胞結合性リガンドまたは細胞シグナル伝達性リガンドに共
    有結合的にあるいはイオン結合的に結合され得る官能基を含む親水性側鎖の割合
    が、１％〜２０％である、請求項１に記載のコポリマー。
  8. 【請求項８】 前記非細胞結合性側鎖が、ポリエチレングリコール、ポリエ
    チレンオキシド、ポリアクリル酸およびデキストランからなる群より選択される
    、請求項１に記載のコポリマー。
  9. 【請求項９】 前記リガンドが、接着ペプチド、細胞シグナル伝達性ペプチ
    ドおよび増殖因子からなる群より選択される、請求項１に記載のコポリマー。
  10. 【請求項１０】 側鎖が細胞結合性リガンドまたは細胞シグナル伝達性リガ
    ンドで末端キャップされていない非細胞結合性のコームコポリマーをさらに含む
    、混合物中の請求項１に記載のコポリマー。
  11. 【請求項１１】 前記コームコポリマーの２０％未満が、細胞結合性リガン
    ドまたは細胞シグナル伝達性リガンドで末端キャップされる側鎖を含む、請求項
    １０に記載のコームコポリマー混合物。
  12. 【請求項１２】 前記コームコポリマーが、表面に対する細胞接着または細
    胞応答の調節において効果的である、請求項１〜１１のいずれかに記載のコーム
    コポリマーで形成されるかまたはコートされる、組織工学マトリックス、細胞培
    養マトリックス、医用デバイス、あるいは移植片。
  13. 【請求項１３】 実質細胞、皮膚細胞、筋肉細胞、軟骨細胞、神経細胞およ
    び骨細胞からなる群より選択される細胞を播種された、請求項１２に記載の組織
    工学マトリックス、細胞培養マトリックス、医用デバイスまたは移植片。
  14. 【請求項１４】 前記細胞調節性のコーム型コポリマーが、非細胞結合性で
    かつリガンド改変型細胞調節性のコーム型コポリマーの規定された混合物を含む
    、請求項１２に記載の組織工学マトリックス、細胞培養マトリックス、医用デバ
    イスまたは移植片。
  15. 【請求項１５】 前記表面が、非細胞結合性の疎水性側鎖のバックグラウン
    ドに対して単一のリガンド型の別個のナノドメインまたはクラスターを提示する
    、請求項１４に記載の組織工学マトリックス、細胞培養マトリックス、医用デバ
    イスまたは移植片。
  16. 【請求項１６】 各ナノドメインまたはクラスターが、０．０００１平方ミ
    クロン〜０．０１平方ミクロンの領域に、このようなドメインの端の間の全体間
    隔が３ｎｍ〜２００ｎｍの範囲で、２個〜５０個の細胞シグナル伝達性リガンド
    を含む、請求項１５に記載の組織工学マトリックス、細胞培養マトリックス、医
    用デバイスまたは移植片。
  17. 【請求項１７】 前記表面が、非細胞結合性の親水性側鎖のバックグラウン
    ドに対して２以上のリガンド型の別個のナノドメインまたはクラスターを提示す
    る、請求項１４に記載の組織工学マトリックス、細胞培養マトリックス、医用デ
    バイスまたは移植片。
  18. 【請求項１８】 各ナノドメインまたはクラスターが、０．０００１平方ミ
    クロン〜０．０１平方ミクロンの領域に、このようなドメインの端の間の全体間
    隔が３ｎｍ〜２００ｎｍの範囲で、２個〜５０個の細胞シグナル伝達性リガンド
    を含む、請求項１７に記載の組織工学マトリックス、細胞培養マトリックス、医
    用デバイスまたは移植片。
  19. 【請求項１９】 調節された細胞接着または細胞応答を有する組織工学マト
    リックス、細胞培養マトリックス、移植片または医用デバイスを作製する方法で
    あって、該方法は、コームコポリマーで、該マトリックス、移植片またはデバイ
    スをコーティングあるいは形成する工程を包含し、該コームコポリマーは、以下
    ： ａ）疎水性ポリマー骨格； ｂ）該ポリマー骨格にグラフトされた非細胞結合性の親水性ポリマー側鎖であ
    って、ここで、該側鎖は２００ダルトン〜２０００ダルトンの分子量を有する、 ポリマー側鎖； を含み、 ここで、該非細胞結合性の親水性側鎖の０％〜１００％は、細胞結合性リガン
    ドまたは細胞シグナル伝達性リガンドで末端キャップされて、短い細胞結合性コ
    ポリマー側鎖を形成し、そして ここで、該側鎖は、全コポリマー重量の６０％未満を含む、 コームコポリマー である、方法。
  20. 【請求項２０】 前記表面の前記コームコポリマーの非細胞結合性側鎖が、
    前記コーティング、マトリックス、デバイスまたは移植片が形成された後に、リ
    ガンドで末端キャップされる、請求項１９に記載の組織工学マトリックス、細胞
    培養マトリックス、医用デバイスまたは移植片を作製する方法。
  21. 【請求項２１】 組織を操作するための方法であって、該方法は、細胞調節
    性のコーム型コポリマーで、形成されるかまたはコートされる組織工学マトリッ
    クス上で細胞を増殖する工程を包含し、該細胞調節性のコーム型コポリマーは、
    以下： ａ）疎水性ポリマー骨格； ｂ）該ポリマー骨格にグラフトされた非細胞結合性の親水性ポリマー側鎖であ
    って、ここで、該側鎖は２００ダルトン〜２０００ダルトンの分子量を有する、 ポリマー側鎖； を含み、 ここで、該非細胞結合性の親水性側鎖の０％〜１００％は、細胞結合性リガン
    ドまたは細胞シグナル伝達性リガンドで末端キャップされて、短い細胞結合性コ
    ポリマー側鎖を形成し、そして ここで、該側鎖は、全コポリマー重量の６０％未満を含む、 細胞調節性のコーム型コポリマーであり、 ここで、該コームコポリマーは、表面に対する細胞接着または細胞応答の調節
    において効果的である、 方法。
  22. 【請求項２２】 細胞調節性のコーム型コポリマーによって安定化された、
    含水性の培地中に分散されたポリマー粒子を含むポリマーラテックスであって、
    該細胞調節性のコーム型コポリマーは、以下： ａ）疎水性ポリマー骨格； ｂ）該ポリマー骨格にグラフトされた非細胞結合性の親水性ポリマー側鎖であ
    って、ここで、該側鎖は２００ダルトン〜２０００ダルトンの分子量を有する、 ポリマー側鎖； を含み、 ここで、該非細胞結合性の親水性側鎖の０％〜１００％は、細胞結合性リガン
    ドまたは細胞シグナル伝達性リガンドで末端キャップされて、短い細胞結合性コ
    ポリマー側鎖を形成し、そして ここで、該側鎖は、全コポリマー重量の６０％未満を含む、 細胞調節性のコーム型コポリマーである、 ポリマーラテックス。
  23. 【請求項２３】 前記コームコポリマーが、前記ラテックス合成の間に安定
    化剤として働く、請求項２２に記載のポリマーラテックス。
  24. 【請求項２４】 前記コームコポリマーが、前記ラテックスの乾燥重量の１
    ％未満を含む、請求項２２に記載のポリマーラテックス。
  25. 【請求項２５】 側鎖が細胞結合性リガンドまたは細胞シグナル伝達性リガ
    ンドで末端キャップされていない非細胞結合性のコームコポリマーをさらに含む
    、請求項２２に記載のポリマーラテックス。
  26. 【請求項２６】 非細胞結合性でかつリガンド改変型細胞調節性のラテック
    ス粒子の規定された混合物を達成するために、非細胞結合性コームコポリマーに
    よって安定化されたラテックス粒子をさらに含む、請求項２２に記載のポリマー
    ラテックス。
  27. 【請求項２７】 前記粒子の前記表面の前記コームコポリマーの非細胞結合
    性側鎖が、前記ラテックス粒子が合成された後に、リガンドで末端キャップされ
    る、請求項２２に記載のポリマーラテックス。
  28. 【請求項２８】 ポリマーラテックスを鋳造することによって調製される、
    細胞挙動を調節するポリマーコーティングおよびポリマーフィルムであって、該
    ポリマーラテックスは、細胞調節性のコーム型コポリマーによって安定化される
    、含水性の培地中に分散されたポリマー粒子を含み、該細胞調節性のコーム型コ
    ポリマーは、以下： ａ）疎水性ポリマー骨格； ｂ）該ポリマー骨格にグラフトされた非細胞結合性の親水性ポリマー側鎖であ
    って、ここで、該側鎖は２００ダルトン〜２０００ダルトンの分子量を有する、 ポリマー側鎖； を含み、 ここで、該非細胞結合性の親水性側鎖の０％〜１００％は、細胞結合性リガン
    ドまたは細胞シグナル伝達性リガンドで末端キャップされて、短い細胞結合性コ
    ポリマー側鎖を形成し、そして ここで、該側鎖は、全コポリマー重量の６０％未満を含む、 細胞調節性のコーム型コポリマーである、 ポリマーコーティングおよびポリマーフィルム。
  29. 【請求項２９】 非細胞結合性でかつリガンド改変型細胞調節性のラテック
    ス粒子の規定された混合物を達成するために、非細胞結合性コームコポリマーに
    よって安定化された微粒子の混合ラテックスを鋳造することによって調製される
    、請求項２８に記載のポリマーフィルムおよびポリマーコーティング。
  30. 【請求項３０】 請求項２８に記載のポリマーフィルムおよびポリマーコー
    ティングであって、非細胞結合性の親水性側鎖のバックグラウンドに対して単一
    型細胞シグナル伝達性リガンドの別個のドメインを含み、ここで、該ドメインの
    大きさが、前記ラテックス粒子に類似する、ポリマーフィルムおよびポリマーコ
    ーティング。
  31. 【請求項３１】 前記ドメインの大きさが、直径０．１〜１０ミクロンであ
    る、請求項３０に記載のポリマーフィルムおよびポリマーコーティング。
  32. 【請求項３２】 請求項２８に記載のポリマーフィルムおよびポリマーコー
    ティングであって、非細胞結合性の親水性側鎖のバックグラウンドに対して複数
    の細胞シグナル伝達性リガンドの別個のドメインを含み、ここで、該ドメインの
    大きさが、前記ラテックス粒子に類似する、ポリマーフィルムおよびポリマーコ
    ーティング。
  33. 【請求項３３】 前記ドメインの大きさが、直径０．１〜１０ミクロンであ
    る、請求項３２に記載のポリマーフィルムおよびポリマーコーティング。
  34. 【請求項３４】 前記適用されたフィルムまたはコーティングの表面の前記
    コームコポリマーの非細胞結合性側鎖が、該コーティングまたはフィルムが調製
    された後に、リガンドで末端キャップされる、請求項２８に記載のポリマーフィ
    ルムおよびポリマーコーティング。
  35. 【請求項３５】 細胞挙動を調節するポリマーコーティングおよびポリマー
    フィルムを作製する方法であって、ポリマーラテックスを鋳造する工程を包含し
    、該ポリマーラテックスは、細胞調節性のコーム型コポリマーによって安定化さ
    れる、含水性の培地中に分散されたポリマー粒子を含み、該細胞調節性のコーム
    型コポリマーは、以下： ａ）疎水性ポリマー骨格； ｂ）該ポリマー骨格にグラフトされた非細胞結合性の親水性ポリマー側鎖であ
    って、ここで、該側鎖は２００ダルトン〜２０００ダルトンの分子量を有する、
    ポリマー側鎖； を含み、 ここで、該非細胞結合性の親水性側鎖の０％〜１００％は、細胞結合性リガン
    ドまたは細胞シグナル伝達性リガンドで末端キャップされて、短い細胞結合性コ
    ポリマー側鎖を形成し、そして ここで、該側鎖は、全コポリマー重量の６０％未満を含む、 細胞調節性のコーム型コポリマー である、方法。
  36. 【請求項３６】 前記表面の前記コームコポリマーの非細胞結合性側鎖が、
    前記コーティングまたはフィルムが調製された後に、リガンドで末端キャップさ
    れる、請求項３５に記載のポリマーフィルムおよびポリマーコーティングを作製
    する方法。
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