JP2002501030A - ナマコカロテノイド脂質画分産物およびその使用方法 - Google Patents

ナマコカロテノイド脂質画分産物およびその使用方法

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Abstract

(57)【要約】 ナマコ組織の脂質画分の投与による炎症性自己免疫及び他の疾患の処置のための方法および組成物を記載する。水中給餌およびヒトの食餌に加えるのに有用な組成物も開示している。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の技術分野 この特許出願は、ヒトおよび動物の薬理学の一般医療分野においてリポキシゲ
ナーゼ経路の活性化がその病理学的状況に影響している、ある種の疾患状態を抑
制する治療薬および治療方法全般に関する。５−リポキシゲナーゼまたは１２−
リポキシゲナーゼ経路を抑制または調節する薬剤は、医療技術において有用であ
ることが知られている。毒性をほとんどまたは全くもたず、全身または皮膚の炎
症を抑制する薬剤は、治癒技術で有用である。この特許出願は、動物の肉中にま
たはその皮膚または殻上の何れかへ色素着色をもたらす目的で、着色成分を水中
飼料に配合しなければならない、水産養殖工業で有用な着色試薬の分野にも関し
ている。
【０００２】 さらに詳しくは、本発明は、ナマコ類(Holothuridea)またはナマコ、とりわけ
メイン州および北大西洋で発見されたCucumaria frondosa品種、から誘導される
一定の新規な脂質類に関係する。何れの種のナマコ類も、本発明の化合物を抽出
する原料として十分であろう。該ナマコのオイルは、何の種のものでも飼料への
配合により水生種の色素着色に使用でき、リポキシゲナーゼ酵素活性生成物また
はロイコトリエンの反応が病理学条件に影響している疾患の処置または回復にも
同様に使用できる。すなわち、ナマコ種の何れの類から誘導されるものでも、こ
の新規脂質類は、リポキシゲナーゼ酵素および/または結合ロイコトリエンレセ プターを阻害する。 リポキシゲナーゼ酵素は、アラキドン酸カスケードについ てよく知られている。レッドオイル"RED OIL"およびゴールドオイル"GOLD OIL" と命名したこれらのオイルは、免疫抑制の目的でそのまま使用することができ、
また、これらから、狼蒼またはリウマチ関節炎などの疾患における器官移植また
は自己免疫応答による、免疫応答を回復させるのに適した、免疫抑制剤の成分を
得るための原料を提供することができる。これらのオイル、または分子蒸留によ
り得られるそれらの誘導体は、そのままでも好適に、また、当分野で知られてい
る方法でさらに分画して、望ましくない免疫応答の減少、抑止、阻害、または予
防などで使用することができる（例えば免疫抑制を必要としているヒトまたは動
物で）。これらの状況の例としては、それに限定するものではないが、糖尿病、
狼瘡、および リウマチ関節炎などの自己免疫疾患の処置または予防が含まれる 。免疫抑制はまた、器官移植に関してもしばしば必要とされる。免疫抑制剤は、
ヒトまたは動物が、免疫システムの過剰刺激によって引き起こされることが知ら
れている超抗原または他の因子にさらされているときまたはその可能性があると
きでも、利用することができる。本発明の化合物は、他の推定免疫抑制剤の活性
を評価するときの標準としても有用である。本発明はさらに、これらの化合物を
含む医薬組成物に関している。 これらのオイルは、本発明によって、ヒヨコ絨 毛尿膜アッセイ(Knighton et al., 1977)でみられるとおり脈管形成を阻害する ことが分かった。本特許出願でレッドオイルとして命名したこの色素性オイルは
、カロテノイド、カンタキサンチンおよびアスタキサンチンを驚くべき量含んで
おり、それを必要とする特定種の肉または表皮に色素着色させる目的で市販用の
魚飼料に加えるのに適していることが分かった。
【０００３】背景技術 本発明は、５−および１２−リポキシゲナーゼ活性がその病理学的状況に影響
している疾患の処置用の新規化合物、医薬組成物および使用方法に関する。本発
明は、また、ナマコ組織の脂質画分から得られる免疫応答を改善する産物、およ
び、魚またはエビなどの肉または表皮を着色する目的で、水中給餌の中に配合し
てもよい産物にも関する。ある種の魚の海洋性脂質の、様々な関節炎に関連する
疾患の処置に関する文献が報告されているが、ナマコ脂質はこれまでのどの研究
にも全く含まれておらず、また哺乳類体系内で脊椎魚について知られている炎症
抑制メカニズムが本発明にも当てはまるとする文献証拠は何もない(DeLuca et a
l., 1995)。ある種の海洋性スポンジおよびホヤ類が、免疫調節性または免疫抑 制活性を有することも知られているが、ナマコ脂質が医療技術で有用な抑制活性
等を有することを発見したという海洋薬理学の分野での報告はない(Konig and W
right, 1995)。
【０００４】 さらに詳しくは、下記定義の化合物は、哺乳類の５−リポキシゲナーゼ経路お
よび１２−リポキシゲナーゼ経路を抑制する。ロイコトリエンＢ４、Ｃ４、Ｄ４
およびＥ４、５-ヒドロキシエイコサテトラエン酸、５-ヒドロペルオキシエイコ
サテトラエン酸および１２-ヒドロキシエイコサテトラエン酸などのリポキシゲ ナーゼ経路産物は、上記条件に適合する。本題の新規リポキシゲナーゼ阻害化合
物、それらの医薬組成物および本発明によるその使用についての特定条件は、ア
レルギー；喘息；関節炎；乾癬、アトピー性皮膚炎および靤を含む皮膚障害；炎
症を含む炎症性腸疾患または痛み；前立腺、肺、直腸、および皮膚の様々な癌；
および、心筋虚血および梗塞、アンギナ、不整脈、脳卒中、片頭痛およびアテロ
ーム性動脈硬化症を含む心血管障害、を含む。
【０００５】 本発明の化合物は、何れの種または亜門のナマコの脂質画分からでも；それら
の脂質画分の脱色素性画分からでも；当業者に知られている分子蒸留相からでも
；または同様のクロマトグラフィーカラム分離からでも；ナマコの呼吸系、性腺
、cuverian tubule細管またはポリアン気孔を含む、表皮、真皮、前側、後側、 または腸マス、からでも得られる。
【０００６】 各種のナマコは、医療技術で有用である医療的に活性な画分を提供する。特許
番号５，５１９，０１０では、脱重合化多糖類が抗凝血剤として有用であると教
示されている。特許番号５，７７０，２０５ (Collin)では、様々な方法で抽出 されたナマコ組織が、ヒトおよび動物の医療技術で有用である抗炎症性活性を有
すると教示されている。ナマコ器官由来の配糖体は、抗癌作用を含むと示されて
いる (Miyamoto et al., 1990)。上記のどれにもリポキシゲナーゼ経路または炎
症を抑制するナマコ由来の脂質について記されておらず、それらのナマコ由来薬
剤の何れの有用性（リポキシゲナーゼ産物、異性体、または代謝産物がこれらの
条件に寄与し、病理学疾患条件を抑制する有用性）についても記載していない。
上記の特許は、何れも、該脂質が哺乳動物に免疫調節性活性を与えるという技術
を示していない。
【０００７】 本発明は、色素に富む脂質物質および脱色脂質物質の両方を教示し、さらに、
着色性または非着色性の何れのナマコ脂質物質の分子蒸留により回収したライト
フェーズ(Light Phases)が、ヒト好中球中の５−リポキシゲナーゼ酵素活性およ
びヒト血小板中の１２−リポキシゲナーゼ酵素を阻害し得るものであることを教
示する。
【０００８】 近年、哺乳類のロイコトリエンおよび５−リポキシゲナーゼおよび１２−リポ
キシゲナーゼ経路を抑制すると称する因子を記述した特許がたくさんある。 こ れらの化合物の幾らかは有効であるが、幾らかは毒性副作用を有するかまたは費
用有効的に生産できないものである。本発明の目的は、軟膏剤、坐薬中に配合し
て経口投与または注射用薬剤または他の手段で投与する薬剤にし、哺乳類のロイ
コトリエン経路を調節するための費用効率よくまた容易に入手できる手段を提供
し、それにより、癌、乾癬、アトピー性皮膚炎等のロイコトリエン、ＬＴＢ４、
５−HＥＴＥおよび１２−HＥＴＥがその病理学状況に影響している疾患の医療的
処置に役立たせ得る、ナマコオイル類およびそれらの誘導体を生産することであ
る。
【０００９】本発明の目的 これらの新規化合物およびそれらを含む組成物の医療的適用は、現在または今
後における当業者に公知の、いかなる適切な医療方法および技術によっても成し
遂げられると考えられる。さらに、本発明の化合物は、さらに強力な活性を示す
、他の有用な化合物および組成物の調製用の出発物質または中間体として使用で
きる。
【００１０】 本発明の目的は、本明細書中に記載する新規化合物の１種またはそれ以上の有
効量を活性成分として含む、医薬組成物を当該技術に提供することである。本発
明の目的は、哺乳類のリポキシゲナーゼ経路の阻害活性を通じて、および哺乳類
免疫システム中のリンパ球増殖経路の阻害活性を通じて、免疫調節剤として有用
な、新規化合物を当該技術に提供すること、ならびに海洋性生物の色素着色用の
水中給餌として有用な成分を提供することである。天然にナマコ組織中にあり、
抽出ナマコオイルと称されるライトフェーズ(LIGHT PHASES)を含む、分子蒸留ま
たは他の分離技術による画分は、リポキシゲナーゼ経路の抑制を示す。また、こ
れらの同じオイルの分子蒸留由来のヘビーフェーズ(HEAVY PHASES)も同様の活性
を示す。これらの経路のさらに活性な部分の単離は、例えば、カラムクロマトグ
ラフィーあるいは例えば、脂質生化学の当業者によく知られている他の方法によ
り実施することができる。従って、より強力なまたはより特異的な画分が望まれ
る場合、そのような単離のための原料物質および活性中間体を提供することも本
発明の目的である。
【００１１】 本発明の化合物は、哺乳類の５−リポキシゲナーゼおよび１２−リポキシゲナ
ーゼ活性を阻害するが、この阻害活性は、抗アレルギー性、抗炎症性および抗過
剰増殖活性と関連するものである。従って、本発明の化合物は、上記のアレルギ
ー性疾患、上皮炎症性疾患、胸やけ、癌、および過剰増殖皮膚疾患の処置に有用
である。これらの化合物が、ヒト血液中でリンパ球の増殖を阻害することもみら
れる。
【００１２】 処置できる炎症性疾患には、関節炎, 滑液包炎,腱炎, 痛風および炎症性腸疾 患が含まれる。 “過剰増殖皮膚疾患”は、皮膚細胞生産の加速症状、フレーキング、スケール
または丘疹破壊の何れの状況をも意味する。過剰増殖皮膚疾患の例としては、例
えば、乾癬、苔蘚湿疹、ふけおよびその類似物がある。
【００１３】 本発明の化合物は、例えば局所的、経口、非経口、直腸、経皮, 吸入およびそ
れらの類型などいかなる慣用投薬形態でも投与することができる。経口または直
腸投薬形態には、カプセル、錠剤、丸剤、粉末、カシェ剤および坐薬などが含ま
れる。液状経口投薬形態としては、溶液および懸濁液がある。非経口製剤として
は、滅菌溶液および懸濁液が含まれる。吸入投与は、経鼻または経口スプレー、
またはガス注入の形態であり得る。局所的投薬形態は、クリーム、軟膏剤、ロー
ション、経皮デバイス(例えば従来型のパッチまたはマトリックス型)およびそれ
らの類似物でもよく、過剰増殖皮膚疾患の処置に好ましい。.
【００１４】 上記投薬形態で考えられる製剤および医薬組成物は、従来の医薬的に許容され
得る賦形剤および従来技術で使用する添加物を用いて調製できる。これらの医学
的に許容され得る賦形剤および添加物は、担体、結合剤、香料、緩衝液、増粘剤
、着色剤、安定化剤、乳化剤、分散剤、懸濁剤芳香剤、防腐剤、潤滑剤などを含
めることを意図としている。
【００１５】 医薬的に許容され得る適切な固体担体には、炭酸マグネシウム、ステアリン酸
マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、
ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセル
ロース、低融点ワックス、ココアバターおよびそれらの類似物などがある。 カ プセル剤は、活性化合物を担体として使用の医薬的に許容され得るカプセル中に
挿入して、調製することができる。本発明の活性化合物は、医薬的に許容され得
る賦形剤と混合することができ、あるいは細分化した粉末形態で、賦形剤を用い
ずカプセル中に含有させて使用してもよい。同様にして、カシェ剤は、当業者に
既知のリポソームなどとして含められる。
【００１６】 液状形態の製剤には、液剤、懸濁液剤および乳濁液剤が含まれる。一例として
、非経口注入用の水または水−ポリエチレングリコール溶液をあげられる。液体
製剤は、ポリエチレングリコールおよび/またプロピレングリコール溶液として 調剤でき、それらには水を含めてもよい。経口使用に適する水溶液は、水中に活
性成分と、所望なら適切な着色剤、香料、安定化剤、甘味料、可溶化および濃化
剤を加えて調製することができる。経口投与に適切な水性懸濁液は、水中油(O/W
)型エマルジョンとして当産業で公知であるＴＷＥＥＮ−８０などの乳化剤中に 、オイル形態で活性成分を分散させて調製できる。
【００１７】 例えば、過剰増殖皮膚疾患の処置で使用される局所的用途用の製剤は、上記液
体形態を含んでもよく、同様に、クリーム、エアゾール、スプレー、オイルが適
切な担体に混ぜてある粉末、ローションおよび軟膏剤であってもよく、これらは
、本発明の活性成分と、局所的製剤で一般に使用される従来の医薬的に許容され
得る希釈剤および担体とを配合して調製される。軟膏剤およびクリームは、例え
ば、水性または油性のベースを使用して、適切な濃化剤および/またはゲル化剤 を加えて調製することができる。これらのベースは、例えば、水および/または オイル、例えば液体パラフィンまたは蜜蝋、または植物性油脂、例えばピーナッ
ツ油並びにヒマシ油等を含んでもよい。ベースの性質に従って使用できる濃化剤
には、ソフトワックス、ステアリン酸アルミニウム、セトステアリルアルコール
、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ウールファット(woolfat) 、水素添加ラノリンなどが含まれる。
【００１８】 ローションは、水性または油性ベースの製剤でもよく、一般に、医薬的に許容
され得る安定化剤、乳化剤、分散剤、懸濁剤、濃化剤、着色剤、香料、およびそ
れらの類似物を、１種またはそれ以上含んでいてもよい。
【００１９】 局所的医薬組成物は、例えばメチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロ
キシベンゾアート、クロロクレゾール、ベンザルコニウムクロリドなどの防腐剤
または静菌剤を、１種またはそれ以上含んでいてもよい。
【００２０】 局所的医薬組成物は、本発明の活性化合物と、抗菌剤、部分抗菌剤、麻酔剤、
麻酔およびピリチオン亜鉛などの止痒剤等の他の活性成分とを一緒に含有してい
てもよい。
【００２１】 本発明の化合物を、経皮的に送達して全身分布させることもできる。かかる経
皮性組成物はクリーム、ローションおよび/または乳濁液の形態をとることがで き、該目的で、従来技術であるマトリックスまたはレザバー型の経皮性パッチ中
に含めてもよい。
【００２２】 本発明の化合物は、本発明の化合物の抗アレルギー性、抗炎症性または抗過剰
増殖そのような形態での有効量を用いる、通常の投与形態で投与してもよい。投
与量は、主治医の判断による患者の必要、処置する状況の厳しさ、および使用す
る特定化合物に応じて変化させ得る。特定の状況による適当な投与量の決定は、
当業者の技術の範囲内である。処置は、化合物の適量より少ない、より少量の投
与で開始できる。その後、投与量を、状況下で最適な効果に達するまで少量の増
分で増やす。必要なら、１日の総投与量を同１日の間に好適に分割投与すること
もできる。
【００２３】 このように、投与形態に応じて、１日あたり約０.１から約５００mg/kg体重ま
での用量を投与することができる。例えば、経口投与の場合、約０.５から約２ ００mg/kg体重まで、好ましくは約５０から約１００mg/kg体重までの用量で、抗
アレルギー活性が示される；吸入投与の場合は、化合物は０.１から５mg(吸入毎
)の投与量で抗アレルギー活性を示し、４時間毎に１ないし４吸入を行うことが できる。
【００２４】 本発明の化合物は、通常の何れの投与形態で投与することもでき、本発明の化
合物の抗炎症性有効量を使用することにより、抗炎症性活性を得ることができる
。抗炎症剤としての本発明の化合物は、１日あたり、約０.１から約５００mg/kg
体重、好ましくは１日あたり約５から約２００mg/kgの用量で投与できる。好ま しくは、総用量を１日あたり２ないし４分割用量に分けて投与する。例えば、１
日あたり約５mg/kg体重から１日あたり約５０mg/kg体重の範囲の経口用量を分割
し、約４時間間隔で使用してもよい。
【００２５】 過剰増殖皮膚疾患の処置に投与するとき、本発明の化合物は、局所的に、経口
で、直腸経由でまたは非経口で、好ましくは局所的に、投与することができる。
局所投与の場合、化合物の投与量は処置する皮膚の量により広い範囲で変えるこ
とができ、また、患部に塗布する活性成分の濃度によっても変えることができる
。好ましくは、局所的組成物は、約０.１０から約１０重量パーセントの活性成 分を含み、主治医の判断により必要なだけ塗布する。経口投与の場合、レッドオ
イルおよびゴールドオイル化合物は、過剰増殖皮膚疾患の処置において、約０. １mg/kgから約５００mg/kg体重の範囲、好ましくは約５mg/kgから約１００mg/kg
の１日用量で有効であり、この量は分割投与してもよい。直腸投与の場合、本発
明の化合物を約０.１mg/kgから約１００mg/kgの範囲の１日用量で投与すること ができる。
【００２６】 本発明の化合物の投与の結果、乾癬性患者のほとんどのケースにおける症状の
軽減が期待できる。従って、乾癬患者は、スケーリング、紅斑、プラークのサイ
ズ、掻痒、および乾癬に関連する他の症状の減少が期待できる。薬剤の各乾癬患
者への用量および有効な処置に要する期間は同じではないが、医学の当業者には
これらの変動を認識でき、治療方針をそれ相応に調節できるであろう。
【００２７】リポキシゲナーゼシステム アラキドン酸は、生理活性エイコサノイド類一群の生物学的前駆体として働く
。これらには、プロスタグランジン−Eおよび−F化合物、トロンボキサン、およ
びプロスタサイクリンなどのクラスのシクロオキシゲナーゼの作用で得られる産
物、およびヒドロキシ−およびヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸およびロ
イコトリエンなどのリポキシゲナーゼ酵素の作用で得られる産物が含まれる。
【００２８】 これらのリポキシゲナーゼ産物は、高度に強力な多形核白血球遊走または化学
走性、リソソーム酵素放出および脱顆粒の立体特異性誘導因子であることを示し
ている。さらに、これらの産物は、血管および肺組織などの平滑筋の収縮を起こ
し、トロンボキサンＡ２およびプロスタサイクリンなどの付加的炎症原(inflamm
ogens)の産生を引き起こす。リポキシゲナーゼ産物もまた、血管拡張プロスタノ
イドおよび他のメディエイターと相互作用し、炎症性応答の増強または増幅をも
たらす。
【００２９】 ロイコトリエン並びにヒドロキシおよびヒドロペルオキシエイコサテトラエン
酸は、多くの疾患状態の病原論で主要な役割を果たす。これらの化合物は、リウ
マチ様関節の滑液中で、乾癬患者の皮膚に含まれて、炎症した結腸組織中で、お
よび虚血性心筋組織中に高レベルで見出される。それらもまたアレルギー性およ
び喘息条件のメディエイターである。
【００３０】 多種の異なるタイプの腫瘍の成長刺激における５−HＥＴＥの役割が、最近、 いくつかの刊行物で説明されている。例えば、培養したヒト前立腺癌細胞にアラ
キドン酸を添加すると、細胞成長の有意な増加および５−ヒドロキシエイコサテ
トラエン酸(５−HＥＴＥ)の生合成の増加をもたらす(Ghosh and Myers, 1997)。
この増加した成長は、５−リポキシゲナーゼ(５−ＬＯ)インヒビターＡＡ６８１
およびＭＫ８８６で遮断されるが、１２−ＬＯインヒビター、バイカレインおよ
びＮ−ベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−５−フェニルペンタンアミド(ＢＨＰＰ)では
遮断されず、シクロオキシゲナーゼ(ＣＯＸ)インヒビターでも遮断されない。さ
らに、ロイコトリエンＢ４などの他の５−ＬＯ経路の産物ではなく、５−HＥＴ Ｅを細胞に添加すると、細胞成長を刺激するだけでなくＭＫ８８６の効果を無効
にした。近い結果が、他のタイプの癌細胞でも、インビボおよびインビトロ両方
で観測されている。例えば、ヒト乳癌(ＨＳ５７８Ｔ)細胞株、ＬＯインヒビター
ノルジヒドログアイアレチン酸(ＮＤＧＡ)およびエスクレチンは細胞成長を抑制
したが、ＣＯＸインヒビターピロキシカムは効果がなかった(Hotmanova et al.,
1996)。マウス腺癌細胞株(ＭＡＸ)および、ＭＡＣ細胞、５−ＬＯインヒビター
ＢＷＡ４Ｃ(一般式Ｒ−ＣＯＮＨＯＨのアセトヒドロキサム酸)およびＢＷＢ７０
Ｃ(アセトヒドロキサム酸誘導体)を移植したマウスは、腫瘍細胞成長と５−HＥ ＴＥ生産物を抑制した(Hussey and Tisdale, 1996)。さらに、ウレタンで誘発さ
れた腺腫を用いるＡ/Ｊマウスのインビボ研究で、ＮＤＧＡの投与で肺腺腫細胞 数が有意に減少し(Moody et al., 1998)、海洋性腺癌では、ＢＷＡ４ＣおよびＢ
ＷＢ７０Ｃで、５−および１２−HＥＴＥ生産物両方の効果により、ＭＡＣ２６ およびＭＡＣ１６細胞成長の減少がみられた(Hussey and Tisdale, 1996)。
【００３１】１２−HＥＴＥ 増加する徴候から、血小板および腫瘍細胞から生成する１２−HＥＴＥは、腫 瘍転移を促進する重要な分子であることが示唆される。これは、表面インテグリ
ンの発現の増加によって、腫瘍細胞誘発血小板凝集および腫瘍細胞の内皮基質に
対する接着を強め、内皮細胞反応を誘発し、腫瘍細胞運動性を増加する（これら
のすべては腫瘍細胞転移において重要な段階である(Hone et al., 1994)）。イ ンビトロ研究において、１２−LOインヒビターＢＨＰＰが、内生的および外生的
に加えた１２−HＥＴＥ両方の上記の作用をなくすことが判明した(Hone et al.,
1992； Chen et al., 1994)。１２−HＥＴＥ産生は腫瘍細胞転移性素質のよい 指示薬であると、説明されている。例えば、１２−HＥＴＥ ｍＲＮＡレベルは、
正常細胞と比較して前立腺癌細胞中では上昇し、このｍＲＮＡレベルの増加は、
癌細胞の進化した段階と低い分化と相関がある(Gao et al., 1995)。さらなる研
究で、ラットウォーカー(Walker)癌腫(Ｗ２５６)およびマウス黒色腫(Ｂ１６ａ)
細胞は、アラキドン酸 (ＡＡ)を１２−HＥＴＥおよび５−HＥＴＥに代謝し、実 験的転移において、ＢＨＰＰの利用が肺中のコロニー形成を減少させることが示
されている(Chen et al., 1994； Liu et al., 1994)。
【００３２】 本発明による化合物、医薬的および栄養補助組成物は、リポキシゲナーゼまた
はロイコトリエンの生合成または生化学作用を阻害し、従って、その病因がロイ
コトリエン生産、および５−HＥＴＥおよび１２−HＥＴＥなどの他のリポキシゲ
ナーゼ-誘導産物、およびロイコトリエンＢ４(ＬＴＢ４)と関連する、多種の疾 患の処置または回復に有用である。これらのリポキシゲナーゼインヒビターは、
白血球の浸透、組織を消化するリソソーム酵素の放出、平滑筋組織の透過性およ
び収縮状態の変化により起こる組織の損傷および炎症の予防を助ける。
【００３３】 本発明による、このようなリポキシゲナーゼ抑制またはロイコトリエン拮抗性
化合物および医薬組成物が有用な特異的状態には、アレルギー； 喘息； 関節炎
；乾癬および靤を含む皮膚障害；炎症；炎症性腸疾患、痛み、および心筋虚血お
よび梗塞、アンギナ、不整脈、脳卒中を含む心血管障害、アトピー性皮膚炎、ア
テローム性動脈硬化症、および前立腺、肺、皮膚および消化器の癌を含む各種病
因の癌が含まれる。
【００３４】本発明のレッドオイルおよびゴールドオイルによる脈管形成阻害 脈管形成の新たなインヒビターの探索に科学的な関心が持たれているが、それ
は新たな血管の阻害が、新たな脈管成長に基づく新生物形成腫瘍の成長を制限す
るという予想に基づく。正常細胞が固型腫瘍に発展するとき、一連の変化を受け
る。生理学上のレベルでは、成長が増強され、免疫が回避され、新血管形成が誘
発される。新血管形成または脈管形成は、腫瘍成長にとって必須条件であると考
えられる。実験用の固型腫瘍は、血液が供給されないと数ミリメートル以上の厚
さには成長できない。最も普通の固型腫瘍は、それに依存する新たな血管を引き
つける血管由来因子を合成する。従って、何が激しい毛細血管増殖を防ぐことが
でき、そして何が標準組織の毛細血管内皮細胞の静止状態を維持するのかという
疑問点に対して方向性を持った、継続的な研究努力がなされてきた。
【００３５】 本発明のさらなる目的は、その処置を必要としている温血動物に、脈管形成を
抑制する組成物および方法を提供することであり、それは該温血動物に対して、
単離したレッドオイル若しくはゴールドオイル、または下記のセクションで記述
する分子蒸留プロセスからのライト若しくはヘビーフェーズを含む、治療的に有
効量の組成物の投与を含む。
【００３６】ナマコ組織由来のカロテノイド ナマコ由来のカロテノイドは、種々の科学文献で述べられている。すなわち、
Matsunoら(1995)は、ナマコHolothuria leucospilotaおよびStichopus japonicu
sの生殖腺中の主なカロテノイドとしてアスタキサンチンの出現について報告し ており、そして、βカロテン、エキネノン、カンタキサンチンおよびゼアキサン
チンが、H. leucospilotaおよびS. japonicusの生殖腺から同定された。他方、 アスタキサンチンおよびエステル、カンタキサンチン、ホエニコキサンチン(pho
enicoxanthin)、およびエキネノンは、BullockおよびDawson(1970)より、Psolus
fabrichiiの赤色体壁から単離された。Tsushimaら(1996)は、ナマコCucumaria
japonicaの新規海洋性ジ-Ｚカロテノイド、ククマリアキサンチンＡ(cucumariax
anthinＡ)、ＢおよびＣについて報告した。Findlayら(1983a)は、Cucumaria fro
ndosa種のカンタキサンチンについて報告した。これらの報告のどれも、水産養 殖または医療または健康食品産業にそのカロテンを利用するいかなる手段をも提
供するものではなく、着色脂質画分を濃縮するいかなる方法を提供するものでも
ない。
【００３７】 Spinelli、StoutおよびNilssonによる米国特許出願番号４，６９２，２８０に
は、臨界超過二酸化炭素を用いる純粋魚油を得る(魚組織から最初に抽出した後)
方法について記載しており、それらは当該方法を記載する目的で引用によりこの
文書に加える。この特許は、特許に示す臨界超過精製方法論を介してナマコ脂質
画分精製を得る方法を開示するものではない。
【００３８】 そのため、効率的で大規模な脂質画分取り出しに関する先行技術はなく、ナマ
コ組織の有用なカロテノイドまたは非カルチノイド脂質画分を得ることを目的と
したものは全くない。
【００３９】 本発明は、ナマコ、特にCucumaria frondosa種の腸材料(intestinal gut mate
rial)および／または体壁からの、有用な着色脂質画分および色素不含脂質画分 を回収する方法を提供することを目的とする。更に、本発明は、当該回収方法に
より得られる着色脂質画分および脱着色脂質画分である組成物を開示することも
その目的である。このような着色脂質画分は、大豆油抽出の分野において使用さ
れるＣｒｏｗｎ２Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ(Crown Iron Works, Chicago, IL)のよう な市販の抽出装置でアセトンまたはアルコール溶媒抽出により得られ、カンタキ
サンチンおよびアスタキサンチンが約４，５００ｐｐｍも豊富な着色物質を提供
し、餌料成分として水産養殖産業において有用である。脂質抽出した後の、乾燥
脱脂質組織は、驚くべきレベルの必須アミノ酸を含む高タンパク質ミールまたは
加水分解物として利用され得る。
【００４０】 本発明の要約 本発明は、湿潤または乾燥した未加工素材状態のナマコの腸または体壁組織か
ら取得し得る、新規な着色および非着色脂質化合物の工業的抽出に関する方法お
よび組成物を記載する。本発明の化合物は、水中給餌用の着色用添加物として、
または哺乳類の医療治療剤として使用し得るものであり、分子蒸留技術、工業的
規模の溶媒抽出技術、カラムクロマトグラフィー技術により、および本明細書中
に記載の予備的高圧液体クロマトグラフィー技術を用いて製造される。
【００４１】 この発明の化合物は、炎症のネズミモデルにおける耳の重さの増加が局所適用
によると低パーセントであることにより、およびラットの後脚におけるアジュバ
ンド誘発性炎症の阻害の結果により、ならびにヒトのめざましい自覚的改善の報
告等から明らかとなった抗炎症活性を示す。
【００４２】 本発明の化合物、レッドオイルおよびゴールドオイルおよびそれらの分子蒸留
画分は、哺乳類(例えば、ヒトまたはイヌ)のアレルギーの処置に使用され、好ま
しい使用は、当該哺乳類の皮膚のアレルギー性慢性炎症の処置、および適当な経
皮性担体化合物を併用する関節炎の炎症の阻害剤としての処置への使用である( 該炎症では本発明のオイルは局所的なリポキシゲナーゼ活性化部位へ経皮的に輸
送される)。更に好ましい使用は、アレルギー性慢性閉塞肺疾患の処置へのもの である。本明細書で使用するとき慢性閉塞肺疾患とは、喘息、アレルギー性もし
くは季節性鼻炎および／または気管支炎などの場合のように肺の中へ入るおよび
肺から出る空気の通過を妨げるか減少させる病状を意味する。乾癬、座瘡、関節
炎、または癌の処置を、本発明の化合物を局所的化合物として使用することによ
り、および経口投与することにより行い得る。
【００４３】 そのため、本発明の更なる目的は、ナマコ組織から単離したレッドオイルおよ
びゴールドオイルおよびこれらの化合物の種々の誘導体および類似体の免疫抑制
的な使用に関する。これらの化合物は、望ましくない免疫応答の減少、抑制、阻
害または予防に使用され得る。有利なことに、免疫抑制は細胞毒性を伴わずに達
成できる。そのため、これらの化合物は、免疫抑制を必要とするヒトまたは動物
の処置に有用である。その状況の例には、糖尿病、狼瘡またはリュウマトイド関
節炎のような自己免疫疾患の処置または予防が含まれるがこれらに限定されない
。免疫抑制はまた、器官移植と関連してしばしば必要とされる。免疫抑制剤はま
た、免疫システムの過剰刺激の原因となると知られている超抗原または他の因子
にヒトまたは動物がさらされるとき、またはさらされ得るとき、利用され得る。
当該発明の化合物はまた、他の推定免疫抑制剤の活性の評価に標準としても有用
となる。更に、当該発明は、これらの化合物を含む医薬組成物にも関する。
【００４４】 着色添加物として、種々の着色オイルを、オイルのカロテン含量または所望の
着色強度特に着色餌を与えられる水中動物の種類に応じて種々の含有比で魚また
は小エビの餌に加え得る。
【００４５】 本発明の詳細な説明 ナマコの有用画分を調製する方法 ナマコの様々な画分を単離し、医療用にまたは水中給餌の一部の何れかとして
使用する。簡略に言えば、これらの画分を調製する方法の１つは、乾燥したナマ
コの腸または体壁を溶媒で抽出し、レッドオイルと呼ばれる着色オイルを製造す
ることを含む。色素はレッドオイルから除去して、ゴールドオイルと呼ばれる多
かれ少なかれ脱色したオイルとすることができ、更に赤色着色脂質濃縮物である
２番目の画分を得ることができる。レッドオイルおよびゴールドオイルは何れも
蒸留され、ライトフェーズおよびヘビーフェーズと呼ばれるものを含む種々の画
分を生ずる。他のアプローチは、乾燥組織よりむしろ湿潤ナマコ組織を用いるも
のである。これをアセトンまたはアルコールを用いて行うと、最初の溶媒抽出に
より、レッドグリースとして言及する産物を生ずる。ゴールドオイルを製造する
２番目の方法もまた記載する。この代替方法は、最初の抽出により赤色のすべて
または殆どを除去した後、任意の適当な方法で乾燥したナマコ組織の第２の溶媒
抽出を含む。最後に、ナマコの他の画分が、脱脂質化したナマコ組織を用い、処
理して、プロテインリッチ加水分解物を生ずることにより得られる。この加水分
解物は、食物添加物として有用であり、また種々の食料品に配合され得る。各画
分の調製方法および使用方法を下記に示す。下記の方法は、レッドオイルおよび
ゴールドオイルのような本発明の種々生成物それぞれを調製する一以上の方法を
示す。わずかに異なる各方法を記載しているが、それらの方法は、実質的に均等
な生成物を生成するものであり、かつ、当該生成物の名称は、本開示に記載した
いかなる方法を使用してその生成物を得たか、あるいは同様の活性または用途を
有する実質的に均等な生成物を生成させる他の方法で得たものであるかを問わな
いで生成物を包括的に意味する。
【００４６】 ナマコの有用画分の調製方法 ４６０キログラムのナマコCucumaria frondosaの腸の塊を、ナマコ産業の処理
廃棄物から収集した。当該腸の塊(３５２ポンド)を、通常の低温加熱のシーフー
ドドライヤー(Southwind、Nova Scotia、Canada)のスクリーンラック上において
３日間乾燥させ、１０５ポンドの乾燥材料を作成した。続いて、乾燥した腸の塊
を、通常の方法として大豆油の分野で既知のヘキサンにより(Crown Model 2 Ext
ractor, Crown Iron Works, Chicago, IL)抽出し、レッドオイルとして言及する
赤色脂質物質約４２ポンドを作成した。次いで、この脂質物質を、該オイルに水
１％を加えることにより“デガミング”し、３０分間放置して加水分解し、次い
で、１５０°Ｆ、８０００ｒｐｍで遠心分離した。続いて、この赤色デガミング
処理脂質物質を０．５％シリカゲルで前処理し、１８０°Ｆに加熱し、次いで、
６ミクロン濾紙で濾過した。色素の除去は、５％漂白クレイを前処理オイルに加
えることにより実施した。オイルを２２０°Ｆ、２０分間、２８インチＨｇの真
空で加熱した。生じたオイル(３４ポンド)は明黄色であり、殆どの色素を漂白ク
レイに吸着させた。色素のない腸の脂質を、“ゴールドオイル”と名付け、それ
は、リポキシゲナーゼ活性および抗炎症活性の阻害を更に評価する脂質画分の１
つである。
【００４７】 次いで、得られたクレイを、溶媒比がアセトン１：２(ｗ：ｗ)クレイとなるま
で抽出し、２回洗浄した。次いで、得られた溶液をＬｕｗａエバポレーターで９
０℃および２９インチＨｇ真空で脱溶媒し、８ポンドの赤色脂質画分濃縮物を回
収した。
【００４８】 ゴールドオイルを調製する他の方法は、クロロホルムで平衡化したケイ酸のカ
ラムにレッドオイルを通し、クロロホルムでカラムを洗浄するものである。ゴー
ルドオイルをクロロホルム洗浄で溶出する。次いで、濃縮レッドオイルを、カラ
ムにクロロホルム：メタノール(好ましくは６０％：４０％)混合物を通すことに
よりカラムから溶出させ得る。これにより、カラムにロードした、オリジナル物
質の約７０％がゴールドオイルとして回収され、３０％が濃縮レッドオイルとし
て回収される。
【００４９】 着色していないゴールドオイルおよび着色レッドオイルを、蒸発性画分を分離
するため両方とも分子蒸留する。２００℃および０．００５ｔｏｒｒで分子蒸留
器により３パスを調製した。すべてのパスにおいて各３画分を回収した。軽い相
(ライトフェーズＩ)を、約３０℃のコンデンサー温度で収集し、保持した。揮発
性画分をアルコール／ドライアイストラップ中に回収し、廃棄した。重い相(ヘ ビーフェーズＩ)は、蒸留器の底部において溶出し、当該プロセスにより蒸発し ない部分であった。続いて、ヘビーフェーズＩを分子蒸留器に再導入し、ライト
フェーズIIおよびヘビーフェーズIIを製造した。次いで、蒸留器の底部に溶出す
るヘビーフェーズIIを、蒸留器に再導入し、ライドフェーズIIIおよびヘビーフ ェーズIIIを製造する。全体として、これらの技術により、ライトフェーズＩ、I
IおよびIII、ヘビーフェーズＩ、IIおよびIII、ならびに廃棄する付加的揮発物 を得た。その後、各ライトフェーズを、リポキシゲナーゼ経路の阻害におけるそ
れらの活性について評価した。図１は、ライトフェーズの５-リポキシゲナーゼ 活性の阻害を示す。図２は、非蒸留ゴールドオイルの阻害性５-リポキシゲナー ゼ活性を示す。図３は、脱着色の前のレッドオイルの５-リポキシゲナーゼ阻害 活性を示す。図４は、１２-リポキシゲナーゼの活性におけるゴールドオイルお よびレッドオイルの効果ならびに１２-ＨＥＴＥの生成を示す。図９は、メタノ ール対照と比較して、１２-ＨＥＴＥ合成における１：１０００希釈のゴールド オイル ＬＩＧＨＴ ＰＨＡＳＥの効果を示す。
【００５０】 有用画分を調製する第２の方法 本発明の目的は、魚または小エビを着色する色素提供化合物としての、ナマコ
の腸または体壁組織由来の当該オイル画分の使用を含むものであるが、そのステ
ップが以下のものを組合せて含むプロセスを具体化することにより達成される。
ａ．手または機械によるプロセスでナマコから腸材料を分離すること。手による
分離は、動物をナイフでカッティングし、腸を物理的に取り出すことを含む。機
械カッティングには、自動化カッティングツールで動物を切り開き、腸を取り出
すことができる任意の機械化実施態様が含まれる。
【００５１】 ｂ．タンパク質性脂質腸材料を動物から分離後、前処理し、該材料のｐＨを十分
な酸で約４から約５．５、好ましくは約４．３から約４．７の範囲内に低下させ
ること。この操作により、微生物性崩壊を抑制し、腸塊を脱塩し、その後の溶媒
または溶媒の組合せを用いる抽出の間の赤色カロテノイド色素の全体的回収を改
善する。
【００５２】 ｃ．プロセシングのある方法では、タンパク質性脂質腸材料を、該材料に対する
溶媒の比３：１(ｖ：ｖ)でアセトン、アルコールまたは類似の溶媒と混合し、次
いで、２４時間または色素が腸材料から溶媒に十分放出されるまで、攪拌するこ
と。
【００５３】 ｄ．アセトンまたは他の溶媒を、腸材料を残しつつデカントし、続いて、腸材料
を洗浄溶液で４回またはそれ以上洗浄し、残ったカロテノイド含有脂質を取出す
こと。
【００５４】 ｅ．残存する腸脂質を遠心分離するか、または閉鎖容器中で加熱すること。この
操作により、残存溶媒を取り除くか、当分野に既知の脱溶媒機を用いる方法によ
り溶媒を再利用する。
【００５５】 ｆ．色素を含有するアセトンまたは溶媒をオイル化学分野に既知の“ワイプフィ
ルム”エバポレーターに吸出し、色素を保持し封鎖すること。溶媒は再利用する
。
【００５６】 ｇ．得られた脂質着色画分は、カンタキサンチンおよびアスタキサンチンを含む
混合カロテノイド含有脂質物質であり、それらを本明細書では“レッドグリース
”と呼ぶ。主なカロテノイドはCucumaria frondosaの実施例中のカンタキサンチ
ンである。
【００５７】 ｈ．得られた着色脂質画分は当分野に既知の抗酸化剤で安定化し得る。
【００５８】 ｉ．残存腸材料は、次いで、乾燥し、ヘキサン、ブタン、臨界超過二酸化炭素ま
たは同様の溶媒で抽出し、実質的に色素のない金色オイルを取り出す。実質的に
殆どカロテノイドを有さないこの金色オイルをゴールドオイルと呼ぶ。得られた
脂質を含まない残存乾燥タンパク質性物質は、タンパク質およびポリサッカライ
ドを多く含有し、必須アミノ酸を必要とする動物またはヒト食品添加物中への配
合に適している。このタンパク質性脱色ミールは、それが脱色されており、脱脂
質されている点で、本明細書に示す方法により水溶性とされ得る点で、有用タン
パク質および必須アミノ酸含量が高い点で、さらに、においのある汚染物が実質
的にない点で、海洋魚-ミール産業でユニークなものである。それらは、加水分 解物の分野の当業者に既知でありまた本明細書中に記載する方法により、容易に
粉末製品または加水分解物製品化される。
【００５９】 本発明の他の具体化プロセスでは、分離したナマコの腸を前記方法で記載した
ように酸性化した後乾燥する。この腸材料はまた、本発明の一般方法に逆影響す
ることなく酸性化に先立って、１５０°Ｆと沸点の間の水中で、１０分と３０分
との間の種々の時間加熱することもできる。乾燥プロセスは、低温加熱(６０-８
０°Ｆ)、または標的脂質画分またはカロテノイドに影響を与えない高温加熱(１
５０-２００°Ｆ)で行い得る。腸または組織材料を乾燥させることを含むこの具
体化プロセスは、さらに以下のものを組合せたステップによっても達成できる。
ａ．約１０％未満の水分を含有する乾燥腸材料に、乾燥した腸または組織材料を
１：１の比、１３０°Ｆで５分間混合し次いで廃液する、当業者に既知のヘキサ
ンまたは他の適当な溶媒を用いる標準“オイル-収集方法”を行うこと。この抽 出物は、次いで、３回新しい溶媒で洗浄する。カロテノイドを含む溶液は、９５
℃および２８インチＨｇ真空のワイプフィルムエバポレーター(Luwa and Pope) で脱溶媒する。
【００６０】 ｂ．その用途に設計されたコンテナー中に溶媒／脂質相を分離し、標準的な“ス
チームストリッピング”または“ワイプフィルム”オイル技術により、カロテノ
イド-オイル／溶媒相から該溶媒を分離させること。
【００６１】 ｃ．該オイル相を、当業者に既知の抗酸化剤、例えば、３００から６００ｐｐｍ
の６-エトキシ-１，２-ジヒドロ-２，２，４-トリメチルキノリン(Ethoxyquin,
Monsanto)または約１％のビタミンＥを用いて処理すること。 ｄ．このようにして得られた赤色着色オイルを、該オイルに水１％を加え、その
後、３０分間放置して加水分解し、次いで８０００ｒｐｍ、１５０°Ｆで遠心分
離することにより、デガミングするプロセスを行うこと。このオイルをレッドオ
イルと呼ぶ。
【００６２】 ｅ．以下の方法で濃縮色素を回収すること： デガミング処理したオイルを最初に０．５％シリカゲル(Trysil600, Grace Co.)
で前処理し、１８０°Ｆに加熱し、次いで６ミクロンフィルターペーパーを用い
濾過する。着色の回復は、５％漂白(活性化)クレイ(Englehard 105)を前処理オ イルに加え、次いでオイルを２２０°Ｆ、２８インチＨｇの真空で２０分間加熱
することにより実施する。処理したオイルは明黄色であり、殆どの色素が漂白ク
レイに吸着される。このオイルをゴールドオイルと呼ぶ。次いで、処理したクレ
イを溶媒比がアセトン１：２(ｗ：ｗ)クレイとなるまで抽出し、２回洗浄する。
次いで、得られた溶液をエバポレーター(Rotovap)で９０℃および２９インチＨ ｇ真空で脱溶媒する。
【００６３】 ｆ．当業者に既知の標準的ＨＰＬＣ方法により抽出濃縮物のカロテノイド成分を
測定すること。本発明により抽出した濃縮色素は、水中給餌への配合に適してお
り、原材料のカロテノイド含有に応じて２，０００と５，０００との間のｐｐｍ
のカロテノイドカンタキサンチンを含む。
【００６４】 ｇ．カロテノイド抽出操作(ゴールドオイル)で得た脱色脂質を、１ないし５(重 量)％のビタミンＥまたは当業者に既知の他の適当な抗酸化剤を添加することに より、安定化させること。 ｈ．ナマコの腸の塊のカロテノイド含有オイル抽出操作で得られる脱着色脂質画
分(ゴールドオイル)または着色オイル(レッドオイル)を、５００から１０００ミ
リグラムの“ソフト-ゲル”カプセル中にカプセル化するか、または哺乳類への 経口および局所投与に適したコンテナー中に包蔵させこと。局所投与用製品は、
特異的または一般的な症状へ所望効果に応じて、非着色脂質画分と組合せた皮膚
軟化薬の任意の組合せより得られ得る。
【００６５】 ｉ．カロテノイドのｐｐｍに応じて、当該着色脂質画分を、肉または皮膚中にカ
ロテノイド沈着を生ずるのに十分な、食物の割合で水中での餌に配合すること。
【００６６】 有用画分を調製する更なる方法 本発明は、さらに実質的にカロテノイドのないナマコ腸脂質画分を含む組成物
を開示することを目的とする。それは、比較的においが少なく、オメガ-３脂肪 酸、ＥＰＡ(エイコサペンタノン酸)を十分量含み、ビタミンＥを含む。
【００６７】 ガスクロマトグラフィー／マススペクトロメトリーを脱着色脂質画分について
実施した。ガスグロマトグラフのデータを図５に示す。図５は、活性化クレイ移
動の手段によるカロテノイドを抽出した後の、脱着色脂質画分のスペクトルであ
り、Hewlett-Packard Model 5890 Gas Chromatographおよび5971 Mass Selectiv
e Detector(マススペクトロメーター)を用いて実施した。分析で使用したカラム
は、長さが２５ｍｍのHP Ultra-1 Capillary GCカラムであった。脂質分析分野 では標準であるように、脱着色脂質画分を最初に鹸化し、メトキシドナトリウム
を用いて脂肪酸を遊離させ、次いで、酸性化し、次いでメチルエステルに変換し
た。次いで、調製した合成メチルエステルを、既知参照ライブラリーの脂肪酸の
標準プロフィールと比較した。表１は、ナマコ脱着色脂質画分の脂肪酸と既知脂
肪酸プロフィールとのマッチの割合を比較している。
【表１】
【表２】
【００６８】 本発明のさらなる目的は、本明細書に記載の方法により脱脂質されたナマコの
腸材料を含む組成物を開示することである。この材料は、実質的ににおいがなく
、高タンパク質であり、そして容易に実用的な粉末とし得る点で特徴的である。
以下に続く２つの実施例は、異なる技術および溶媒を用いて実施した多くのラン
(run)から選択される代表的なランを例示説明する。体壁組織は、腸の塊より少 ない脂質を含み、ナマコの腸材料について記載した方法と同じ方法で抽出する。
しかし、体壁組織の脂質画分含量は、腸材料よりも非常に少ないか、または体壁
組織の全乾燥重量の約１から２％である。
【００６９】 レッドグリースと呼ぶナマコの着色脂質画分を、肉または皮膚中にカロテノイ
ド沈着を生ずるのに十分な、食物の割合(カロテノイドのｐｐｍに応じて)で水中
での餌に配合する。本発明の目的は、環境因子に応じてアスタキサンチンおよび
カンタキサンチンを種々の割合およびｐｐｍ含む、ナマコの腸または体壁から得
られるカロテノイド脂質画分を含む物質の組成物を開示することである。レッド
グリースとして開示するカロテノイド脂質画分の１つは、分光測光法分析により
、カンタキサンチン４,７０６．５２ｐｐｍを含むと測定された。その吸収スペ クトルを図６として添付している。図６は、計算ｐｐｍ値４，７０６．５２のカ
ロテノイド含量を有する新鮮なナマコ腸材料のアセトン抽出カロテノイド脂質画
分のBeckman DU-800クロマトグラフから得られる吸収スペクトルを示す。アセト
ン抽出カロテノイド脂質画分２３ミリグラムを石油エーテル１０ｍＬで希釈し、
吸光率Ｅ＝２４００を有するカロテノイド物質について、カンタキサンチンを４
６７ｎｍで読んだ。
【００７０】 新鮮なナマコ腸材料および体組織は脂質化合物の供給源材料となり得、Meyers
and Chen(1982)の方法により熱い食用オイルで抽出し得る。また、Meyers and
Chenの特許番号４，５０５，９６３(引用によりこの文書に加える)により、産業
的手段が開示されており、それによれば、クラウフィッシュ(crawfish)カロテノ
イド色素が廃棄物利用熱オイルをプロセスして抽出される。この産業的方法の適
用性は、第一供給源として新鮮なナマコ腸材料を用いて実施可能な熱オイル方法
とは異なるけれども、そのプロセスは、両プロセスがカロテノイド含有脂質の熱
食用オイルへの移動に依存する点で実質的に同一である。Cucumaria frondosa( １ｋｇ)の新鮮な腸材料を１７０°Ｆに加熱した大豆油５キログラムの容器中に 置き、その後２０分間静置した。この組織を２００メッシュステンレススチール
スクリーンおよび通常の“コーヒーフィルター”ペーパーを介し濾取し、過剰の
オイルは、調理容器内へ大まかに絞り戻した。その後、腸材料１キログラムを容
器中に置き、この操作を新規バッチの腸材料で繰り返した。５つの新規バッチの
腸材料を上記方法でプロセスした後、調理容器中のオイルは、腸脂質によるオイ
ル混合物への移動により暗赤色に変わった。この方法の１つの例では、大豆油５
キログラムの出発量が製造され、その後、湿潤腸材料５キログラムを保持し、次
いで、約２０分後除去した。残存オイルの、そのように処理したあるプロセスサ
ンプル中の全カロテノイドの割合は、標準方法により測定すると５４０ｐｐｍで
あった。
【００７１】 脱脂質化タンパク質リッチ加水分解物の製造 ナマコの腸組織材料３００ｇを本明細書に記載のようにして取得し、乾燥し、
そして、ダイズ油の分野の当業者に既知のヘキサン抽出で脱脂質した。得られた
ナマコのミールを加熱および風乾により脱溶媒(desolventize)させ、得られたミ
ールを収集した。更に、ミールを蒸留水１リットルに入れて溶液とした。濃水酸
化ナトリウムを用い、ｐＨを１２に上げ、この溶液を３０分間攪拌した。この３
０分終了時点で、ｐＨをＨＣｌで下げｐＨ８．５に合せた。このｐＨとなって直
ぐに、溶液を１分間８０℃に加熱した。この溶液を２５℃まで放冷し、次いで、
１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、固体を不要物として廃棄し、上清を
ｐＨ３．０に調節した。タンパク質を溶液から沈殿させ、遠心分離およびディカ
ントにより溶液から採取した。次いで、タンパク質を最小量の水に溶解し、ｐＨ
を７．２に調節し、次いで、これを、凍結乾燥機を用い乾燥した。この液体加水
分解物は、当分野に既知の通常の噴霧乾燥に適していることがわかった。予備実
験では抽出効率は出発物質からすると７３％効率であった。上記プロトコールは
、食品科学およびタンパク質加水分解物産業に周知である機械装置を備えたより
大容量の容器中での製造ロットに適していることが判った。このようにして得ら
れた乾燥加水分解物は、水溶性であると判り、この物のアミノ酸プロフィールは
下記の通りである。 トリプトファン ０．８２％ アスパラギン酸 ８．１４ スレオニン ３．０１ セリン ２．６２ グルタミン酸 ８．６７ プロリン ２．６７ グリシン ４．２１ アラニン ４．３９ システイン ０．２１ バリン ４．３１ メチオニン １．００ イソロイシン ４．０３ ロイシン ３．３８ フェニルアラニン ４．３９ リシン ５．３１ ヒスチジン １．８８ アルギニン ５．９３
【００７２】 上記ナマコの加水分解物は、液体飲料、カプセル化食品サプリメント(encapsu
lated food supplement)、サラダドレッシング、肉汁、幼児用処方のミルク代替
品、プロテインバー、化粧品、ソフトドリンク、パスタ、パン、およびタンパク
質栄養摂取不良ヒト用栄養状況改善経口滋養剤中への、タンパク質または予備消
化したアミノ酸化合物としての含有に適した形態にある。本明細書ではこれらの
乾燥したまたは液体のアミノ酸リッチな粉末の配合についてどのような形態でま
たどのような割合で食品に配合するかの詳細説明はそれらの製剤型が食品科学分
野の当業者に熟知されている限りにおいて含める必要がない。
【００７３】 ナマコの各画分の使用方法 水産食品への着色脂質含有の例 Ａ)新鮮なナマコの腸材料１００ポンドを約５５ガロンのアセトンと混合し、 ３００ガロンの閉鎖容器中３時間室温で攪拌した。アセトンを混合物から閉じ込
め容器内へ排出させ、新たなアセトンで着色がわずかになるまで腸材料を洗浄し
た。アセトン分を、ワイプフィルムエバポレーター(Pope Still)を通して吸出し
、水をアセトン混合物中に含有させ、そしてアセトン分を、着色した脂質画分か
ら分離し、回収した。アセトン分を回収し、水相を捨てた。
【００７４】 生じた脂質画分(．６３ポンド)は油脂密度が高く、カロテノイドカンタキサン
チンは４，７００ｐｐｍであった。抗酸化剤、６-エトキシ-１，２-ジヒドロ-２
,２,４-トリメチルキノリン(Ethoxyquin, Monsanto)を１(重量)％脂質相に添加 し、混合した。
【００７５】 カロテノイド物質(レッドグリース)を含む重い脂質画分を、ＨＰＬＣで測定す
るとカンタキサンチン４，７００ｐｐｍを含むことが判り、その製造において排
除した市販用カロテノイド物質を含む標準の鑑賞用の魚の餌中に配合した。この
魚の餌はその製造者によりナマコ由来のカンタキサンチン８０ｐｐｍを最終的に
含むように製剤化したものである。クロウンフィッシュ(Clownfish)を２ヶ月間 この実験用の餌で飼育し、５人の審査員からなる審査員団が判断したところ平均
得点は８．５(着色が非常に認められる場合を“１０”とする１から１０の段階 において)であり、それらの皮膚に着色が認められた。
【００７６】 (Ｂ)Cucumaria frondosa種のナマコ群(1000)の内臓を手で取り出し、腸材料(3
52ポンド)を低温加熱手段で７０°Ｆで４日間、海産食物乾燥機(Southwind, Nov
a Scotia)中で乾燥した。乾燥前に、プロピオン酸７．２(重量)％を、新鮮な湿 潤ナマコの腸材料に添加した。得られた乾燥材料(１０５ポンド)には水分１０％
および脂質４１％が含まれていた。次いで、乾燥した腸材料を、ダイズ油産業に
用いられる方法と実質的に同じ方法で２００ガロン閉鎖容器中で産業標準による
脂質画分のヘキサン抽出をした。そして８．８％のエイコサペンタエン脂肪酸を
含むカンタキサンチンと判定されたカロテノイドを９２４．５ｐｐｍ含む赤色脂
質画分(４２ポンド)(下記ではレッドオイルとする)を製造した。この脂質画分は
また、１００ｇあたり３５ＩＵのｄ-α-トコフェロールを含んでいた。次いで、
赤色脂質画分(レッドオイル)を、該オイルに水１％を加え、次いで３０分間加水
分解させ、次いで１５０°Ｆ、８０００ｒｐｍで遠心分離することにより、デガ
ミングした。デガミングした物質もまた、用語“レッドオイル”に含まれる。
【００７７】 デガミングしたオイル(ナマコの腸脂質画分)を最初に０．５％シリカゲルで前
処理し、１８０°Ｆに加熱し、次いで６ミクロンフィルターペーパーを用いて濾
過した。色の回復は、５％漂白クレイを事前処理したオイルに加えることにより
、行った。オイルを２２０°Ｆに２０分間、２８インチＨｇの真空で加熱した。
得られたオイル(３４ポンド)は明黄色であり、殆どの色素が漂白クレイに吸着し
た。この画分をゴールドオイルと名付けた。次いで、このクレイを、溶媒比がア
セトン１：２(Ｗ：Ｗ)クレイとなるまで抽出し、２回洗浄した。次いで、得られ
た溶液をＬｕｗａエバポレーターで９０℃および２９インチＨｇ真空で脱溶媒し
、８ポンドの赤色脂質画分濃縮物を回収した。
【００７８】 当該プロセスにより３種の物質：黄色／金色オイル(ゴールドオイル)；濃縮赤
色カロテノイド脂質画分；および脂質不含乾燥タンパク質粉末が得られた。黄色
脂質画分(ゴールドオイル)は、実験に使用する局所用化粧品および経口“機能性
食品”海洋性“オメガ３脂質”試験製品に配合した。赤色濃縮脂質画分は、１月
間分の鑑賞用の魚の餌に配合し、それらの魚を適当に色付けするカロテノイド含
有脂質の効果を測定した。
【００７９】 ニワトリ胎児におけるレッドオイルによる血管形成阻害 レッドオイル １μｇを、マイクロピペットを使い直径１／４インチの６つの メチルセルロースディスクにそれぞれ置き、その後乾燥させた。ディスクを、６
つの１０日目のニワトリ胎児の漿尿膜にのせ、ヒドロコルチゾン／ヘパリン浸透
ディスクを、Knightonら(1977)が述べているように他の６つの卵の対照膜上に置
いた。レッドオイル処理膜では、血管増加のほぼ完全な阻害が見られ、ヘパリン
およびヒドロコルチゾンを用いる“陽性対照”よりも効果的に血管新生が阻害さ
れた。このアッセイはインビボアッセイであり、それは、腫瘍の血液供給の阻害
を通じて腫瘍増殖を阻害するように設計された化合物(Knighton et al., 1977) の臨床利用を示唆すると考えられる。
【００８０】 ラットにおけるレッドオイルによる添加物誘導性関節炎アッセイ 上記乾燥物質のヘキサン抽出によりCucumaria frondosaナマコ腸および体壁組
織から作成したレッドオイル、ヒドロコルチゾン、およびフェニルブタゾンを、
ラットにおける添加物関節炎モデルに使用し、それらの抗炎症性効果を研究した
(Winter and Nuss, 1966; Glenn, 1966; Langford et al., 1972)。
【００８１】 ラットを用いて開発した添加物関節炎は、ヒトのリュウマトイド関節炎の処置
に有用となる化合物のスクリーニングに有用であることがわかった。添加物誘導
性関節炎はステロイドおよび非ステロイドの両方に応答する。炎症の度合は、足
(paw)の重さおよび／または足の体積の何れかの増加を測定することにより評価 し得る。
【００８２】 方法 １６０-１８０ｇの重さのラットをB & K Universal, Inc., Kent, WA98032か ら購入した。それらはオスのSprague-Dawleyであった。それらの動物は個々にス
テンレススチールのかごの中に入れられており、水および餌を自由に口にできた
。光の周期(light cycle)は１２時間明るくし、１２時間暗くした。温度を２２ ±３℃に維持し、相対湿度を４０から７０％に維持した。餌はHarlan Teklan Ro
dent Dietであった。
【００８３】 試験品 試験物質を脱イオン水中に下記に示す用量で懸濁させた。全強制飼養量は２ｍ
Ｌであった。
【００８４】 試験物質 Ｌｏｔ＃ 用量、ｍｇ／体重ｋｇ 脱イオン水 12/4/98 ２ｍｌ ヒドロコルチゾン Spectrum, Lot# HH325 １０ フェニルブタゾン Sigma, Lot# 15H0063 １０ レッドオイル Coastside Research １０
【００８５】 実験計画 オスSprague-Dawleyラット(１６０−１８０ｇ)を、フロイント完全添加物(死 滅させたマイコバクテリウム結核菌の０．５％懸濁液(H37RA、ミネラルオイル中
Difco))を注入することにより感作する。０．０５ｍＬを、各ラットの右後脚の 足底に経皮的に投与した。
【００８６】 試験物質を0.5%メチルセルロース中経口的に(強制飼養により)与え、７日間１
日あたり１度与えた。投与感作の翌日から開始する。
【００８７】 各テストランにおける各グループの足の重さを平均した。活性は以下のように
計算した：((対照の平均の足の重さ−試験グループの平均の足の重さ)／(試験グ
ループの平均の足の重さ)×１００＝％抗炎症応答)。
【００８８】 結果および考察 生じた抗炎症応答を表２に示す。抗炎症応答は、非処理の足に比べたときの、
フロイント添加物で処理したラットの足の平均の足の重さの差異である。この研
究では、ヒドロコルチゾン対照は５９．０％の抗炎症応答を示し、フェニルブタ
ゾンは１５５．３％の応答を示した。これら２つの化合物は陽性対照である。レ
ッドオイルは、このアッセイにおいて１５８．６％の抗炎症応答を示した。
【表３】 表２ 足体積増加の平均に基づく％抗炎症応答
【００８９】 続いて、マウス耳浮腫におけるオイルの炎症阻害活性を測定してゴールドオイ
ルを評価した。
【００９０】 マウスの耳浮腫モデル 種々のホルボールエステルおよびアラキドン酸(ＡＡ)を含むクロトンオイルは
、マウスに局所的に適用するするときの標準の炎症誘導剤である。アラキドン酸
によるマウスの耳への複数局所的適用により、炎症および増殖性の変化が誘発さ
れる(Doherty et al., 1988)。ホルボールエステル、特にホルボールミリスチル
酢酸(ＰＭＡ)により、偏在する膜レセプター、プロテインキナーゼＣ(ＰＫＣ)の
１つまたはそれ以上のアイソザイムが活性化し、次いで、数種の代謝カスケード
が開始し、炎症が誘発する(Castagna et al., 1982)。ＡＡは、これらカスケー ドのうちの１つの基質であり、プロスタグランジンおよびロイコトリエン生成を
誘導する。これらは何れも炎症性がある。推定生物活性因子によるこれらの炎症
の阻害は、可能性のある薬理活性の一般化されたインディケーターと考えられる
。乳離れしたばかりのオスＢａｌｂ／ＣマウスをB&K Universal, Kent, WAから 購入し、実験に用いる前、１日研究室においた。ｔ＝０において、各マウスの両
耳の前方側に、アセトン中１０％クロトンオイル１０μＬ(ｎ＝１２の耳)または
アセトンに溶解した５％ゴールドオイル(ｎ＝８の耳)を局所的に適用した。当該
動物をｔ＝２４時間で頚椎脱臼により屠殺し、耳を切除し、バイオプシー(生体 標本)をそれぞれの耳から８ｍｍパンチで得た。バイオプシーの重さを4-place b
alanceですぐに計った。結果を図７に示す。ゴールドオイルにより、アセトンの
みで処理した耳と比べて肥大は５２％小さくなり(ｐ＜０．０５、Wilcoxin Rank
Sum test)、そして未処理の耳と比べて５０％小さくなった。
【００９１】 レッドオイルをアッセイし、上記実施例に記載のマウスの耳の浮腫を開始する
クロトンオイル中のオイルの炎症阻害活性を測定した。局所的な同用量において
、レッドオイルにより、アセトンのみで処理した耳と比べて肥大は８５％阻害さ
れた。結果を図８に示す。
【００９２】 ５-リポキシゲナーゼアッセイ ５-リポキシゲナーゼ(５-ＬＯ)は、多形核(ＰＭＮ)白血球を含む種々の細胞に
おいてロイコトリエンＢ4(ＬＴＢ4)およびヒドロキシエイコサテトラエン酸(５-
ＨＥＴＥ)に対し、アラキドン酸(ＡＡ)の代謝における鍵酵素であり(Henderson,
1994)、最近は前立腺および他の癌と結び付けられている(Ghosh and Myers, 19
97)。ＬＴＢ4は、組織損傷部位の血流からのＰＭＮの移動を含む化学毒性シグナ
ル剤(chemotaxic signaling agent)であり、それは、炎症応答の印である。通常
の志願者からの標準の方法により単離されたヒトＰＭＮを事前に３７℃に温めて
おき、時間＝０とし、超音波によりメタノール中に懸濁した試験化合物１０μＬ
、またはメタノールのみをＰＭＮ懸濁液１ｍｌに加えた。ｔ＝１０分では、２ｍ
Ｍ ＡＡ ５ｍＬを５-ＬＯ基質とする各懸濁液に加えた。ｔ＝１４分では、カル シウムイオノホアＡ２３１８７(５ｍＬ、１ｍＭ)を活性化酵素に添加した。反応
は、ｔ＝１９分に、１００ｍＭクエン酸 １００μＬにより停止させ、ｐＨ３． ０に維持した。プロスタグランジンＢ２および１５-ＨＥＴＥを、ＬＴＢ4および
５-ＨＥＴＥの高圧液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)定量の内部標準として加 えた。代謝産物および標準を、クロロホルム／メタノール(７：３)の懸濁液から
抽出した。クロロホルム層を蒸発させ、ＨＰＬＣ溶出液の可動層中に再構成した
。代謝産物を紫外線により検出し、標準曲線で定量した。
【００９３】 ＰＭＮ生成における統計学的有意なゴールドオイル用量依存性ＬＴＢ4、その ２つの異性体および５-ＨＥＴＥ還元は、図２に示したデータで明白である。こ れらの結果は細胞毒性以外の因子が原因であることが、１：１００および１：１
０００希釈のゴールドオイルに細胞を１０分間さらすと、８５％および９４％の
細胞生存力をそれぞれ生ずるという、観察から示唆されている。生存力は、当分
野の当業者に既知のトリパンブルー切除法(trypan blue exclusion method)によ
り測定された。
【００９４】 レッドオイルの各ＨＰＬＣ画分 レッドオイルを、分析高圧液体クロマトグラフィーにより、３０分間の１００
％ヘキサンから３０イソプロパノールへの直線勾配を用い、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ Ｓ ｉ ６０カラム、５μｍ、２５０×４．６ｍｍ中の１８画分に、分画した。流速 は、２．０ｍＬ／分であった。最初の２分間に回収した画分はなかった。画分は
その後、２分間おきに回収した。上記のセクションで記載したようにとっておい
た全画分をアッセイし、ヒト好中球の５リポキシゲナーゼ経路において阻害活性
の検出を行った。１４分と１８分の間にピークが含まれる画分７および８にロイ
コトリエンＢ4、６-トランス-ロイコトリエンＢ4および６-トランス-１２-エピ-
ロイコトリエンＢ4および５-ＨＥＴＥ(５(Ｓ)-ヒドロキシ-(Ｅ,Ｚ,Ｚ,Ｚ)-６,８
,１１,１４-エイコサテトラエン酸)の阻害活性があった。
【００９５】 １２-ＨＥＴＥアッセイ レッドオイルおよびゴールドオイルを、ヒト血小板を用い５-リポキシゲナー ゼのアッセイと同様の方法でアッセイした。多形核白血球を混合し、Ａ２３１８
７でチャレンジし、１２-ＨＥＴＥ生成を高圧液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ
)により測定した。１：１０，０００希釈のレッドオイルを反応物に加えること により、１２-ＨＥＴＥのレベルは、代謝対照の６５％となった。その一方、１ ：１０００希釈のゴールドオイルにより生じたレベルは対照の４６％であった。
【００９６】 マスト細胞顆粒消失 乳離れしたばかりのオスＢａｌｂ／ｃマウスを、チャレンジする前２４時間、
１２時間および５分間、ならびにチャレンジした後５分間および２０分間ヘキサ
ン中に溶解したゴールドオイルで処理した。各耳に、耳介の両端に適用するアセ
トン中の１０％アセトンオイル２０μｌをチャレンジした。８ミリメーターパン
チバイオプシーをチャレンジした後６時間で各耳から採取し、重さを計り、組織
学的分析のためにホルマリンに保存した。３つの５ミクロン片を、パラフィン固
定バイオプシーを介して１／３間隔で取り、トルイジンブルーで染色した。それ
はヒスタミン含有顆粒に特異的である。顆粒消失が見られるセクションと同様に
中段のセクションも数えた。結果を表３に示す。 表３ クロトンオイルを局所的にチャレンジしたマウスの耳マスト細胞の顆粒消失 処置 ％顆粒消失 賦形剤(ヘキサン) ７２．４(２．２) １０％ゴールドオイル ２０．４(３．５) １０％パラフィンオイル ６６．４(３．０)
【００９７】 各耳を、既述のように２４時間予防的に処置し、加えてその後２回チャレンジ
処置した。データを、顆粒消失したマスト細胞の平均(平均の＋／−標準誤差； ｎ＝４つの耳)パーセントとして得た。
【００９８】 リンパ球増殖アッセイ リンパ球増殖におけるゴールドオイルおよびレッドオイルの効果を、滴定(3Ｈ
)-チミジン吸収アッセイにより評価した。末梢血液を、ヒトの志願者またはヒツ
ジの何れかからの静脈穿刺により得、末梢血液の単核細胞(ＰＢＭＮＣ)を赤血球
および顆粒性白血球からＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離により分離した。遠心分
離後、ＰＢＭＮＣを吸引し、ＰＭＳで洗浄し、培地(１０％胎児ウシ血清(ＦＣＳ
)および２ｍＭグルタミンを含むＲＰＭＩ)中に再懸濁した。ＰＢＭＮＣを密度２
×１０6／ｍＬに調節し、１００μＬアリコート(２×１０5細胞)を９６ウェル丸
底プレートのウェル中にピペットした。各実験グループは５ウェルの複製からな
る。細胞を２４時間、ゴールドオイルまたはレッドオイルの何れかの存在下、希
釈の範囲でインキュベーションした。オイルの希釈は以下の通り行った：オイル
のミセル懸濁液を純粋エタノール中で濃度５％(ｖ／ｖ)にした。この５％溶液の
オイルを、１０％ＦＣＳを含む培地ＲＰＭＩ培地中に更に希釈し、希釈(０．０ ０６２、０．０１２５、０．０２５、０．０５、０．１％ ｖ／ｖ)の範囲を生じ
た。各希釈ステップは激しく攪拌し、オイルを懸濁状態に維持した。
【００９９】 各対照ウェルでは、細胞をオイルが全くない状態で培養した。２４時間のイン
キュベーション後、3Ｈ-チミジン １μキューリを、リンパ球を含む各ウェルに 添加し、更に１８時間インキュベーションし、3Ｈ-チミジンをリンパ球の複製Ｄ
ＮＡに組込んだ。細胞を、９６ウェルプレートから、放射活性的に標識したＤＮ
Ａをトラップしたガラスファイバーフィルター上に回収した。次いで、回収細胞
を含むフィルターを、当業者に既知の標準的方法に従いシンチレーションカウン
ターを用い3Ｈについてカウントした。
【０１００】 さらに、有糸分裂促進物質コンカナバリンＡ(Ｃｏｎ Ａ)を、濃度１０μｇ／ ｍＬでリンパ球に加えた。有糸分裂促進性刺激におけるオイルの効果を、オイル
とＣｏｎ Ａとの共インキュベーションにより評価した。コンカナバリンＡは、 α-Ｄ-マンノシルおよびα-グルコシル残基に親和性のあるCanavalia ensiformi
s(Jack Bean)由来のレクチンである。Ｃｏｎ Ａは、分子の集合体を形成する能 力に依存し、カルシウムおよび／またはマンガンイオンを必要とする有糸分裂促
進性活性を示す。
【０１０１】 結果および考察 非処理ＰＢＭＮＣ調製物は、3Ｈチミジンの低いベースラインの取り込みを示 した。しかし、ＰＢＭＮＣがＣｏｎ Ａで刺激されると、これらの細胞は、それ らのベースラインに比較して増加した3Ｈチミジン吸収により示されているよう に増殖の増加を示した。更に、ゴールドオイルまたはレッドオイルの何れかをＣ
ｏｎ Ａと共に共インキュベーションすると、ＰＢＭＮＣによる3Ｈ-チミジン取 り込みの減少により示されているように、増殖の用量応答性阻害が観察された。
Ｃｏｎ Ａ-刺激ヒトＰＢＭＮＣ増殖は、０．１％から０．０２５％の範囲の希釈
のゴールドオイルにおいて７１％から１２％が阻害され、ヒツジＰＢＭＮＣは同
じ希釈範囲で１００％から５７％が阻害された。レッドオイルの阻害効果は、ゴ
ールドオイルで観察される場合と同様の傾向を示した。レッドオイルは、ヒトＰ
ＢＭＮＣにおいて０．１％の希釈で８５％の阻害を生じ、ヒツジＰＢＭＮＣにお
いては、０．１％で９５％の阻害および０．０５％で５６％の阻害を示した。
【０１０２】 レッドオイルによる混合リンパ球反応 混合リンパ球反応(ＭＬＲ)は、非同族の２個体からのリンパ球の異種反応性に
より仲介されるリンパ球増殖のインビトロアッセイである。この増殖応答は、三
重水素化チミジンの取り込みにより測定される。本来、ＭＬＲにおいては、ある
個体由来の抗原提示細胞(ＡＰＣ)が、第２の個体のＴ細胞上にあるＴ細胞レセプ
ターに対しＭＨＣ分子を介して異種ペプチドを提供する。この反応をシグナル１
と名付ける。シグナル１に続いて、共刺激が、Ｔ細胞とＡＰＣ(例えばＣＤ２８-
Ｂ７)との間における、Ｔ細胞活性化および増殖を生ずる細胞接着分子の相互作 用により仲介される(シグナル２)。そのため、ＭＬＲは、対移植片性宿主病(骨 髄移植拒絶)および対宿主性移植片病(器官移植拒絶)の両方を生ずる異種反応性 のインビトロ表示となる。このアッセイは、異種反応性を予想するために、また
可能性ある免疫抑制剤を実験的にスクリーニングするために広く臨床的に使用さ
れている。レッドオイルは、現在免疫抑制剤として世界的に使用されているサイ
クロスポリンＡ(Cyclosporin A)に匹敵する。
【０１０３】 レッドオイルを用いるＭＬＲの手法 同族でない２ドナーの細胞を使用するＭＬＲを、２つの細胞群が相互に同時に
応答することに基づき研究し得る(すなわち、two-way MLR)。
【０１０４】 末梢血液を、同族でない２人のヒト志願者の静脈穿刺により得、末梢血液の単
核細胞(ＰＢＭＮＣ)を赤血球および顆粒性白血球からＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心
分離により分離した。遠心分離後、ＰＢＭＮＣを吸引し、ＰＢＳで洗浄し、１０
％ヒトＡＢ血清および２ｍＭグルタミンを含むＲＰＭＩ中に再懸濁した。３つの
ＭＬＲを、３対の同族でない個体由来のＰＢＭＮＣで実施し、統計的に相互に類
似であることがわかった。
【０１０５】 ある典型的な実験において、同族でない２個体のＰＢＭＮＣを細胞密度２×１
０6／ｍＬに調節し、それぞれからの５０μＬアリコート(すなわち、１×１０5 細胞)を９６ウェル丸底プレート中に混合した。各実験グループは５ウェルの複 製からなる。細胞を、希釈の範囲でサイクロスポリンＡまたはレッドオイルの何
れかの存在下でインキュベーションした。希釈は以下の通り行った：レッドオイ
ルのミセル懸濁液を純粋エタノール中で濃度５％(ｖ／ｖ)にした。この５％オイ
ル溶液を更に、１０％ヒトＡＢ血清を含むＲＰＭＩ培地中に希釈して、ある範囲
の希釈(０．００６２、０．０１２５、０．０２５、０．０５および０．０１％ ｖ／ｖ)を得た。各希釈ステップは、激しく攪拌し、オイルを懸濁状態に維持し た。サイクロスポリンＡを組織培養培地中に希釈し、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ
および５００ｎｇ／ｍＬとした。
【０１０６】 対照ウェル(未処置)では、細胞を試薬が全くない状態で培養した。９６時間の
インキュベーション後、3Ｈ-チミジン １μキューリを、混合リンパ球を含む各 ウェルに加え、更に１８時間インキュベーションし、3Ｈ-チミジンをリンパ球の
複製ＤＮＡに組込んだ。細胞を、９６ウェルプレートから、放射活性的に標識し
たＤＮＡをトラップしたガラスファイバーフィルター上に回収した。次いで、回
収細胞を含むフィルターを、シンチレーションカウンターを用い3Ｈについてカ ウントした。
【０１０７】 レッドオイルを用いるＭＬＲの結果 未処置ＭＬＲ調製物は、非同族の２種リンパ球群の間の異種活性を示す3Ｈ-チ
ミジンの高いベースライン取り込みを示した。
【０１０８】 ｍＬあたり１００ナノグラムおよびｍＬあたり５００ナノグラムのサイクロス
ポリンＡの存在下、3Ｈ-チミジン取り込みの減少により示される増殖の減少が観
察された。この阻害は、未処置ＭＬＲの割合として表された。ＭＬＲのサイクロ
スポリンＡ阻害は、１００ｎｇ／ｍＬでは３７-７５％の範囲であり、５００ｎ ｇ／ｍＬでは８１-９０％の範囲であった。これは、サイクロスポリンＡの既知 の免疫抑制性と一致する。サイクロスポリンＡはイムノフィリン(immunophilin)
と相互作用し、インターロイキン-２(ＩＬ-２、Ｔ細胞増殖因子)の転置に重要な
転写因子ＮＦ-ＡＴの核酸転座を防止する。
【０１０９】 レッドオイルは、3Ｈ-チミジン取り込みの減少により示されているように、Ｍ
ＬＲの用量依存性阻害が見られる。０．０２５％の希釈では、ＭＬＲの阻害は、
実施した３つのアッセイでは４０-５２％の範囲であり、そして０．０５％の希 釈では、この阻害は８２-９８％の範囲となった。当業界で既知のトリパンブル ー切除法(trypan blue exclusion method)により測定し細胞生存力は、０．０２
５％と０．０５％との間の希釈範囲では、７０-９９％の間の細胞生存力を有す ることを示し、これらの希釈ではレッドオイルの毒性を欠く可能性を示している
。希釈０．１％のレッドオイルでは細胞生存力の減少が見られた。
【０１１０】 これらアッセイで証明されたように、免疫抑制を示す化合物は、有用な治療特
性を有することが判明した。そのため、本発明は、レッドオイルおよびゴールド
オイルを、免疫調整活性を有する医薬化合物に組込むことを目的とする。免疫調
節化合物は、ある疾患および疾病に対する免疫を構築するか、または当該疾患お
よび疾病の回復開始のための免疫活性剤となり得る。逆に言えば、免疫調整剤は
、体外異物に対する身体の望ましくない免疫反応を防ぎ、また、自己免疫反応ま
たは疾患を予防または治癒する、免疫阻害剤または免疫抑制剤となり得る。
【０１１１】 免疫調節剤は、紅斑性狼瘡および糖尿病、ならびに免疫欠損疾患のような全身
性自己免疫疾患の処置に有用であることが判った。更に、免疫調節剤は、癌の免
疫治療、または移植の外来器官もしくは他の組織、例えば腎臓、肺、心臓、また
は骨髄の拒絶の防止に有用となり得る(Grover et al., 1997)。
【０１１２】 様々な免疫調節化合物が発見されており、それらには、ＦＫ５０６、ムラミリ
ックアシッド(muramylic acid)ジペプチド誘導体、レバミソール、ニリダゾール
、オキシスルラン(oxysuran)、フラジル(flagyl)、ならびにインターフェロン、
インターロイキン、ロイコトリエン、コルチコステロイドおよびサイクロスポリ
ンのグループからなる他のものも含まれる。しかし、これらの化合物の多くは、
望ましくない副作用および／または高い毒性を有することが知られている。その
ため、望ましくない副作用が最小で、より広範囲の各特異的領域に免疫調節機能
を供する新規免疫調節化合物が要望されている(Ishida et al., 1997)。
【０１１３】 このように、免疫調節は、人間にとって第一に重要なことであり、相当の研究
が免疫調節測定に投じられてきた。更なる方法および組成物が必要である。
【０１１４】 本発明は、原料素材としてナマコのオイルを利用すること、およびそれらが利
用可能になれば合成的製法により補うことを目的としている。本発明は、任意の
種の海洋ナマコの抽出物から単離され得る化合物を含む新規かつ有用な免疫調製
因子の発見により、免疫調節化合物のアーセナルを増加させるものである。
【０１１５】 そのため、本発明の更なる目的は、ナマコ組織から単離したレッドオイルおよ
びゴールドオイル、ならびにこれら化合物の様々な誘導体および類似体の免疫抑
制的使用に関する。これら化合物は、望まない免疫応答の減少、抑制、阻害また
は防止に使用し得る。有利なことに、この免疫抑制は細胞毒性なしに達成し得る
。そのため、これらの化合物は免疫抑制を必要とするヒトまたは動物の処置に有
用である。そのような状況の例には、糖尿病、狼瘡またはリュウマトイド関節炎
の処置または予防が含まれるがこれらには限定されない。免疫抑制はまた、器官
移植と関連してしばしば必要とされる。免疫抑制剤はまた、免疫システムの過剰
刺激の原因となることが知られている超抗原または他の因子にヒトまたは動物が
さらされるとき、またはさらされ得るとき、利用され得る。当該発明の化合物は
また、他の推定免疫抑制剤の活性を評価する際の標準としても有用となる。更に
、当該発明は、これらの化合物を含む医薬組成物にも適する。
【０１１６】 目的とする使用は、Ｔ細胞活性を介する修飾を必要とする免疫反応(インビト ロ／インビボ)用である。当該発明のある態様は、Ｔ細胞応答、例えば移植およ び自己免疫のヒトインビボ抑制に関係する。サイクロスポリンは乾癬の抑制の医
療分野において最近利用されているため、レッドオイルまたはゴールドオイルを
、乾癬患者の皮膚における免疫応答の修飾について記載する軟膏および局所的適
用に配合することが本発明の目的である。本発明の他のセクションで記載するよ
うに、乾癬患者が有する本発明により得られる有益な応答は、患者におけるＴ細
胞および／またはＢ細胞の局所的皮膚免疫抑制の結果となり得る。
【０１１７】 投与用量は、所望の免疫調節応答、関与する宿主の型、年齢、健康状態、体重
、最近の処置の種類、もしあるならば、治療の頻度、治療の割合および同様の考
慮すべき事項に依存する。有利なことに、投与活性成分の毎日の用量レベルは例
えば、皮膚−１から約５００ｍｇ／ｋｇ(動物の体重)、経口−０．０１から２０
０ｍｇ／ｋｇ(動物の体重)、経皮−０．０１から約１００ｍｇ／ｋｇ(動物の体 重)、およびエアロゾル−０．０１から約５０ｍｇ／ｋｇ(動物の体重)となり得 る。
【０１１８】 濃縮の間に抽出される本発明の活性成分は、皮膚的、鼻腔内的、気管支的、筋
肉内的、膣内的、静脈内的、経口的な局所的使用のための新規組成物中に存在し
得、濃度は、組成物約０．０１から約５０％ｗ／ｗであり、特に組成物約０．０
１から約３０％ｗ／ｗである。
【０１１９】 当該発明に利用する化合物は、本明細書に記載の種々の技術により単離され得
る。実施例には、既知の供給源、例えば化学品供給会社から商業的に入手可能な
物質および試薬の使用が含まれることが当業者には明らかである。本明細書に表
示した当該オイルを様々なカプセル、軟膏、ローション、石鹸およびシャンプー
に配合するための詳細以外については詳細は省く。
【０１２０】 変形の考察 本発明の範囲は、本明細書に関連する特定の実施例、方法および使用に限定さ
れない。それらの修飾が、本明細書により当業者に提供された一般的情報からの
範囲内で行い得るためである。
【０１２１】 下記製剤は、本発明の組成物の幾つかの剤形を示す。それぞれにおいて、「活
性化合物」なる語は、任意の種のナマコの組織由来の精製または未精製の、分画
または未分画の脂質化合物を意味する。
【０１２２】 経口投与 本明細書に記載のレッドオイルおよびゴールドオイルを機能性食品産業に既知
の基本型“ソフト-ゲル”カプセルにカプセル化する。本発明のオイルは、本産 業に既知の混合トコフェロールで安定化される。Cucumaria frondosa由来の乾燥
し安定化させたナマコの腸材料のヘキサン抽出物により製造したレッドオイルを
、当業者に既知の方法によりデガミングし、酸化を防止するために１％混合トコ
フェロール(Henkel Corporation, PAのCOVI-OX-T70)の添加により安定化させた 。本発明のレッドオイル各５００ミリグラムの基本型ソフト-ゲル１，０００ピ ース製造した。また、本明細書に記載のレッドオイルから誘導したゴールドオイ
ルを実験的使用のために基本型ソフト-ゲルカプセルに配合した。
【０１２３】 また、ゴールドオイルおよびレッドオイルを１：５(ｖ:ｖ)の割合でオレンジ ジュースに配合しオレンジジュースの水相への脂質の溶解性を促進するためにレ
シチンを添加した。
【０１２４】 局所的投与 本発明のレッドオイルおよびゴールドオイルを抗乾癬剤が採用され得る数種の
形態を例示する以下の形態の製剤とする。
【０１２５】 実施例Ａ 軟膏 成分 ｍｇ 活性化合物 １-２０ ベンジルアルコール、ＮＦ ２０．０ アーモンドオイルまたは他のオイル ３０．０ ホワイトペトロラタム、ＵＳＰ 総重量１．０ｇとする 製造の方法：１４０°Ｆで攪拌しながら、オイル成分をゆっくりとアルコール
成分にと合せる。
【０１２６】 実施例Ｂ クリーム 成分 ｍｇ 活性化合物 １．０-２０．０ ステアリン酸、ＵＳＰ ６０．０ グリセリルモノステアレート １００．００ プロピレングリコール、ＵＳＰ ５０．０ ポリエチレンソルビタンモノパルミテート ５０．０ ソルビトール溶液、ＵＳＰ ３０．０ ベンジルアルコール、ＮＦ １０．０ 純水 総重量１．０ｇとする 製造の方法：ステアリン酸、グリセリル、モノステアレートおよびポリエチレ
ンソルビタンモノパルミテートを７０℃に加熱する。別の容器中で、ソルビトー
ル溶液、ベンジルアルコール、水、および半量のプロピレングリコールを溶解し
、７０℃に加熱する。高速で攪拌しながら、水相を油相に加える。残存量のプロ
ピレングリコールに活性化合物を溶解し、エマルジョンの温度が３７-４０℃の とき上記エマルジョンに加える。攪拌で均一に混合し、室温に冷却する。
【０１２７】 実施例Ｃ 鼻腔吸入剤 経口または鼻腔吸入剤としての投与の場合では、プロピレングリコールのよう
な既知の不活性液体をビヒクルとして使用し得る。また、所望により分散剤、当
分野に既知のすべてのものの存在下、トリクロロフルオロメタンおよびジクロロ
ジフルオロメタンのような既知のプロペラントに入れて圧力吸入器により投与さ
れ得る。
【０１２８】 実施例Ｄ ゲル 成分 ｍｇ 活性化合物 １．０-２０．０ プロピレングリコール、ＵＳＰ ３００．０ ブチル化ヒドロキシトルエン ５．０ カルボマー９４０ ５．０ 水酸化ナトリウム ０．７ (プロピレングリコール中１％ｗ／ｗ溶液として加える) ポリエチレングリコール４００、ＵＳＰ 総重量１．０ｇとする 製造の方法：プロピレングリコール中水酸化ナトリウム１％溶液を調整する。
残存プロピレングリコールのおおよそ１／２およびポリエチレングリコール４０
０を適当な容器に加え混合する。この混合物中にブチル化ヒドロキシトルエンを
溶解する。上記混合物を激しく攪拌しその中にカルボマー９４０を分散させる。
高速攪拌しながら水酸化ナトリウム溶液を加えｐＨ７とし、濃厚なゲルが形成さ
れるまで混合する。残存プロピレングリコール中に活性化合物を溶解し、ゲルが
連続的に混合されるようにしながらゆっくりとゲルに添加する。
【０１２９】 実施例Ｅ ローション 成分 ｍｇ 活性化合物 １．０-２０．０ カルボマー９４０ ３．０ 水酸化ナトリウム ０．０５ (４％ｗ／ｗ水溶液として加える) イソプロピルアルコール ４０．０ 純水 総重量１．０ｇとする 製造の方法：水酸化ナトリウムの４％水溶液を調製する。純水を６０℃に加熱
する。カルボマー９４０を加え、分散するまで高速で混合する。上記混合物を室
温まで冷却し、均一なるまで水酸化ナトリウムをゆっくりと加える。８０％イソ
プロピルアルコールを混合しながら上記に加える。残存イソプロピルアルコール
に活性化合物を溶解する。これを攪拌しながら混合物に添加する。必要ならば水
酸化ナトリウムでｐＨ５．０から５．５に調節する。
【０１３０】 実施例Ｆ 組合せハーバル抗乾癬クリーム 成分 パーセント 活性化合物 １-２０ 緑茶濃縮物 １-５ Boswellia serrata抽出物 １-１０ シリマリン １-１０ フコシル化硫酸コンドロイチン １-２０ ビーワックス １-４０ ウコンオイル １-１０ occimum sanctumオイル １-１０ ショウガアルコール抽出物 １-１０ 水 １-３０ ＤＭＳＯ １-５ エミューオイル １-３０ チャノキオイル １-５ 製造の方法：有益な試薬を相乗的に合わせ乾癬の症状を改善する製剤の主成分
を提供することが本発明の目的である。乾癬疾患は、多くの炎症仲介物により仲
介されることが知られている。１２、１５-および５-リポキシゲナーゼ経路であ
るため、脈管形成はこの疾患の構成要素である。相補性活性化はまた、これら疾
患の仲介物である。リポキシゲナーゼ阻害剤としてレッドオイルまたはゴールド
オイル、脈管形成および相補的阻害剤としてフコシル化硫酸コンドロイチン、相
補的阻害剤としてBoswellia serrata抽出物、ならびに皮膚抗酸化剤として緑茶 抽出物、およびワックス担体マトリクス中のオルニチンデカルボキシラーゼ阻害
剤および他のハーバル製剤を組合せる軟膏により、乾癬の有効な局所的治療が提
供されることが本発明者により明らかとなった。ショウガ抽出物は、オルニチン
デカルボキシラーゼの阻害剤であり、乾癬炎症の共仲介物であることが示された
。これらの試薬を様々な割合で乳化剤および他の試薬と配合し、局所投与に適す
るようにする。活性剤の割合は、患者の病状および種々仲介物から得られる種々
の兆候のレベルに依存して変化させ得る。換言すると、多数の脈管形成性血管新
生を有する患者は、乾癬プラークがリポキシゲナーゼ経路の活性化の増加を示し
ている患者以上に、フコシル化硫酸コンドロイチンを必要とする。乾癬プラーク
が関連している種々の経路決定に熟練した臨床医ならば、実施例Ｅに挙げた試薬
の適当な組み合わせを処方し得る。例えば、乾癬患者の血清は膿疱性病巣におけ
るリポキシゲナーゼ経路の活性化についてアッセイされ得、膿疱性損傷における
Ｃ５ａおよびＣ３ａの相補的カスケード活性化は、当業者により容易に評価され
得る。従って、メカニズムに基づく乾癬兆候のターゲッティングが、当分野の技
術者である臨床医および製剤者により達成され得る。担体、皮膚軟化薬などのさ
らなる詳細は本明細書に含めるまでもないであろう。
【０１３１】 実施例Ｇ 年齢３４から６７歳の、様々な疾患形態を有する、投与と同時に様々に病状が
拡大する６人の乾癬患者に実施例Ｆの局所用軟膏を与え、１月間自分で投与し、
自覚される軟膏の治療効果を臨床医に報告するように告げた。６人のうち５人が
、乾癬の兆候が“顕著に改善した”または“完全に鎮静した”と報告した。
【０１３２】 アトピー性皮膚炎ならびに胴および尻尾-背中部分に“ホットスポット”を患 う品種不明の３匹のイヌに、６週間の“非調節”なアドリブ方法でそれぞれの飼
主により、実施例Ｆの局所投与を与えた。３匹のイヌの飼主はすべて、動物の兆
候の完全クリアランス、および処置領域を引っかいたり噛んだりすることを止め
たことを報告した。
【０１３３】 ４６から８１歳の、リュウマトイド関節炎を患う、臨床医に自己報告させる１
０人の男女に、３ヶ月間、一人あたり１日あたりおおよそ２，０００ミリグラム
のレッドオイルを経口的に投与した。これらの人のうち８人が、疾患の兆候が“
劇的に減少”し、腕および足の動く範囲が増加したと報告した。８１歳の一人の
女性は、肩および腕の痛みが完全になくなったと報告した。
【０１３４】 ５０から５６歳の３人の男性は、局所的“rub-on”痛覚調節製剤としてレッド
オイルの痛覚軽減能を試験するため、９．５重量％のレッドオイル、メタノール
、ジメチルスルフォキシド(ＤＭＳＯ)、エミューオイル、ヒメコウジのオイル、
アルコールおよびオリーブオイルを含む局所的化合物で自己処置した。痛みのあ
る肩、指または膝に４日間適用した後、２人の参加者は劇的であるとして特段の
自覚的改善を主張し、１人の男性は、自覚的改善が緩和であると主張した。
【０１３５】 自己報告した骨関節症を有する４人の女性には、２ヶ月間オレンジジュースお
よび乳化剤の溶液中のゴールドオイルを１日あたり２回１，５００ミリグラム与
えた。４人全員、化合物からの“利点が増加”したと報告し、３人が痛みの評価
全体において劇的に減少し、可動範囲が増加したと主張した。
【０１３６】 品種不明であり、右前足において跛行に関係するほどの関節炎を患う、１９歳
のウマ１匹を、２０％レッドオイルを含むゲルで、および本明細書に記載の実施
例Ｄと同様に処置した。ゲルを巻きつけ、２週間毎日替えた。２週間の最後には
、ウマの飼主は、動きの範囲が増え、跛行が少なくなったと主張した。
【０１３７】 獣医がイヌの狼瘡と診断した１匹のイヌに６月間、毎日レッドオイルを１，０
００ミリグラムづつ餌に混合して与えた。処置の全経過にわたって、疾患の兆候
が和らぎ、飼主はプレドニゾン医薬の動物の用量を従前のレベルの１／１０に減
少させることができた。
【０１３８】 通常の胸やけ(食道ほ炎症)を患う２人に、レシチン、ジュースおよび砂糖で乳
化したゴールドオイルを、ジュースで１日あたりゴールドオイル２，０００ミリ
グラム経口的に与えた。彼らは兆候が２分以内に和らいだと主張した。
【０１３９】 喘息を患う２２歳の患者は、２および半月の間、他の食物賦形剤と混合したレ
ッドオイル１，０００ミリグラムを毎日、食物供給として摂取した。その期間、
彼女は通常の吸入薬投与の必要性が減少したことおよび自覚的利点の他の指標を
報告した。
【０１４０】 顔に様々なにきびのみにくい病巣を有する３人の思春期の少年に、１月間、オ
レンジジュースおよびレシチンに混合したレッドオイルを１日あたり１，０００
ミリグラム投与した。彼らは、病状について吹出物が減少することによりめざま
しく証明されるとしてレッドオイルによる自覚的改善を報告した。
【０１４１】 抗癌アッセイ レッドオイルおよびゴールドオイルおよび種々の薄層クロマトグラフィー画分
を、インビトロでヒトセルラインに対して試験した。材料をまずジメチルスルホ
キシドに溶解し、次いで、組織培地中に希釈した。次に、各２３μｇ／ｍＬアリ
コートを、ＰＣ３(ヒト前立腺)、ＭＣＦ７(ヒト胸部アデノカルチノーマ)、ＨＴ
２９(ヒト結腸アデノカルチノーマ)またはＢＲＯ(ヒト黒色腫)セルラインに適用
した。これらの画分は、当業者により一般的に使用されているＭＴＴ実行可能染
色法により７２時間後に評価したとき、非処理対照細胞と相関する細胞増殖阻害
を仲介した。全セルラインにおいて、レッドオイルおよび種々の画分は、濃度依
存的に細胞増殖を阻害可能であった。Findlayら(1983b)の方法によりナマコ脂質
層から単離したある画分、プラストクロマノール８は、２０-５０μｇ／ｍＬが ＩＣ50(細胞増殖の５０％阻害濃度)と測定されたことから有望と考えられた。プ
ラストクロマノール８は、上記した５-リポキシゲナーゼアッセイでも分析され 、５-リポキシゲナーゼ、ＬＴＢ4および酵素の数種の異性体の劇的な阻害剤であ
ることが判った。プラストクロマノール８はまた、ヒト血小板における１２-リ ポキシゲナーゼ経路も阻害することが判った。
【０１４２】 プラストクロマノール８データ ヒト好中球中のメタノール制御の割合として表されるロイコトリエン合成にお
けるプラストクロマノール８の効果が見られる、Betts(1997)の方法による、ロ イコトリエン活性アッセイでは、プラストクロマノール８は、５-ＨＥＴＥ活性 を約６０％、ＬＴＢ4活性を約４０％、さらにＬＴＢ4の２つの６-トランス異性 体活性(６-トランス-ロイコトリエンＢ4および６-トランス-１２-エピロイコト リエンＢ4)を７５％阻害した。１０6ＰＭＮあたりのロイコトリエン合成として 表されるロイコトリエン合成へのプラストクロマノール８の効果の関連アッセイ
では、プラストクロマノール８は、５-ＨＥＴＥ産生の約７５％、ＬＴＢ4産生の
５０％、およびＬＴＢ4の２つの６-トランス異性体産生の約８０％を阻害した。
ヒト血小板を用いる同様のアッセイでは、プラストクロマノール８は１２-ＨＥ ＴＥ合成を約８０％阻害した。
【０１４３】 本発明を、本発明の好ましい実施態様の詳細への言及によりこの特許出願中で
開示しているが、本開示は、制限的意味まではなく例示的解説を意図していると
理解すべきである。本発明の修飾は、本発明の精神および添付の請求の範囲内に
おいて当業者には容易に生ずると予想されるからである。
【０１４４】参考文献
【表４】 米国特許番号 ４,４９５,２０７ 米国特許番号 ４,５０５,９６３ 米国特許番号 ４,６９２,２８０ 米国特許番号 ５,５１９,０１０ 米国特許番号 ５,７７０,２０５
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、対照と比較したときのＬＴＢ４の合成におけるゴールド
オイル ライトフェーズの効果を示す。
【図２】 図２は、ゴールドオイルの希釈による好中球の５-リポキシゲナ ーゼ代謝産物合成の阻害を示す。
【図３】 図３は、好中球の５-リポゲナーゼ代謝産物合成において１：１ ０，０００の希釈のレッドオイルの効果を示す。
【図４】 図４は、メタノール対照と比較したときの１２-ＨＥＴＥ合成に おけるレッドオイルおよびゴールドオイルの効果を示す。
【図５】 図５は、ゴールドオイルのガスクロマトグラフィーを示す。
【図６】 図６は、レッドオイルの吸収スペクトルを示す。
【図７】 図７は、アセトン対照と比較したときのクロトンオイルでチャレ
ンジしたマウスの耳における５％ゴールドオイルの効果を示す。
【図８】 図８は、アセトン対照と比較したときのクロトンオイルでチャレ
ンジしたマウスの耳におけるレッドオイルの効果を示す。
【図９】 図９は、メタノール対照と比較したときの１２-ＨＥＴＥ合成に おけるゴールドオイル ライトフェーズの効果を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年８月１１日（２０００．８．１１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 19/02 Ａ６１Ｐ 19/02 21/02 21/02 25/06 25/06 29/00 １０１ 29/00 １０１ 35/00 35/00 37/08 37/08 43/00 １１１ 43/00 １１１ // Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (41)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 カロテノイド含有脂質を含む生成物であって、当該生成物が
    乾燥ナマコ組織から当該組織を溶媒で抽出することにより単離されるものである
    生成物。
  2. 【請求項２】 当該溶媒が有機溶媒である請求項１に記載の生成物。
  3. 【請求項３】 当該組織が腸組織である請求項１に記載の生成物。
  4. 【請求項４】 当該生成物が、 ａ)ナマコから腸組織を分離すること、 ｂ)当該腸組織のｐＨを約４から約５．５の範囲に調節すること、 ｃ)ｐＨを約４から約５．５の範囲に調節した後、当該腸組織を乾燥すること、 ｄ)当該溶媒で当該腸組織を抽出すること、 ｅ)当該腸組織から当該溶媒を分離すること、および ｆ)当該溶媒を蒸発させること、 の各ステップを含み、そして、所望により、 ｇ)デガミングすること、 ｈ)シリカゲルで処理すること、 ｉ)加熱すること、および ｊ)濾過すること、 の各ステップを含ませ得る方法により単離されるものである、請求項１に記載の
    生成物。
  5. 【請求項５】 更に抗酸化剤を含む、請求項１に記載の生産物。
  6. 【請求項６】 ａ)乾燥ナマコ組織を溶媒で抽出して、抽出物を生成させる こと、 ｂ)色素を結合する吸着剤を当該抽出物と混合すること、および ｃ)当該吸着剤を除去すること、 の各ステップを含む方法により単離される、請求項１に記載の生成物[但し、当 該生成物は、当該吸着剤の除去後の残存物からなるものである]。
  7. 【請求項７】 当該吸着剤が、クロロホルムで平衡化したカラム内のケイ酸
    であり、そして当該生成物が、当該カラムにクロロホルムを通過させることによ
    り当該吸着剤から取り除かれるものである、請求項６に記載の生成物。
  8. 【請求項８】 当該吸着剤が、活性化クレイ、非活性化クレイ、木炭および
    シリカからなる群から選択される、請求項６に記載の生成物。
  9. 【請求項９】 更に抗酸化剤を含む、請求項６に記載の生成物。
  10. 【請求項１０】 ａ)乾燥ナマコ組織を溶媒で抽出して、抽出物を生成させ ること、 ｂ)色素を結合する吸着剤を当該抽出物に添加すること、および ｃ)当該吸着剤を除去すること、 ｄ)溶媒で当該吸着剤を抽出すること、 ｅ)当該溶媒を当該吸着剤から分離すること、および ｆ)当該溶媒を取り除き、それにより当該生成物を残すこと、 の各ステップを含む方法により単離される、請求項１に記載の生成物。
  11. 【請求項１１】 当該吸着剤が、活性化クレイ、非活性化クレイ、木炭、ケ
    イ酸およびシリカからなる群から選択される、請求項１０に記載の生成物。
  12. 【請求項１２】 ａ)乾燥ナマコ組織を溶媒で抽出して、抽出物を生成させ ること、 ｂ)当該抽出物を蒸留すること、および ｃ)約２５-３５℃のコンデンサー内に蒸留画分を収集すること、 を含む方法により単離される、請求項１に記載の生成物。
  13. 【請求項１３】 更に抗酸化剤を含む、請求項１２に記載の生成物。
  14. 【請求項１４】 ａ)乾燥ナマコ組織を溶媒で抽出して、抽出物を生成させ ること、 ｂ)色素を結合する吸着剤を当該抽出物と混合すること、 ｃ)当該吸着剤を除去して、金色オイルを生成させること、 ｄ)当該金色オイルを蒸留すること、および ｅ)約２５-３５℃のコンデンサー内に蒸留画分を収集すること、 を含む方法により単離される、請求項１に記載の生成物。
  15. 【請求項１５】 更に抗酸化剤を含む、請求項１４に記載の生成物。
  16. 【請求項１６】 ａ)ナマコから腸組織を分離すること、 ｂ)当該腸組織のｐＨを約４から約５．５の範囲に調節すること、 ｃ) 溶媒で当該腸組織を抽出すること、 ｅ)当該腸組織から当該溶媒を分離すること、および ｆ)当該溶媒を除去すること、 の各ステップを含む方法により単離される、新鮮なナマコ組織から精製した生成
    物[但し、当該生成物は、当該溶媒の除去後に残存するカロテノイド含有脂質物 質である]。
  17. 【請求項１７】 当該溶媒が有機溶媒である、請求項１６に記載の生成物。
  18. 【請求項１８】 ａ)請求項１６に記載のステップ(ｅ)の当該腸組織を乾燥 し、乾燥組織を調製すること、 ｂ)脂質を溶媒相に抽出する溶媒で当該乾燥組織を抽出すること、 ｃ)組織から当該溶媒相を分離すること、および ｄ)当該溶媒を除去すること、 により調製される、脂質を含む生成物[但し、当該生成物は、当該溶媒相から溶 媒を除去した後に残存する脂質物質である]。
  19. 【請求項１９】 当該溶媒が、ヘキサン、ブタン、液化プロパン、アルコー
    ル類、アセトン、クロロホルムおよび臨界超過二酸化炭素からなる群から選択さ
    れる、請求項１８に記載の生成物。
  20. 【請求項２０】 更に抗酸化剤を含む、請求項１８に記載の生成物。
  21. 【請求項２１】 ａ)請求項１６のステップ(ｅ)か、または請求項４のステ ップ(ｅ)に記載の当該腸組織を乾燥し、乾燥組織を調製すること、 ｂ)脂質を溶媒相に抽出する溶媒で当該乾燥組織を抽出すること、および ｃ)組織から当該溶媒相を分離すること、 により調製される、実質的に脂質を含まないタンパク質性物質を含む生成物[但 し、当該生成物は、ステップ(ｃ)に記載の当該組織である]。
  22. 【請求項２２】 当該生成物が、新鮮なナマコ腸材料を熱い食用オイル中に
    入れ、次いで当該オイルから当該腸材料を分離することにより調製されるもので
    ある、当該生成物が、当該オイルと当該腸材料から当該オイル中に抽出された脂
    質とを含むものである、カロテノイド含有脂質物質を含む生成物。
  23. 【請求項２３】 請求項１に記載の当該生成物、請求項６に記載の当該生成
    物、請求項１２に記載の当該生成物、請求項１４に記載の当該生成物、請求項１
    ８に記載の当該生成物、および請求項２２に記載の当該生成物からなる群から選
    択される有効量の生成物を投与することにより、リポキシゲナーゼ活性の阻害を
    必要とする哺乳類に同様の阻害をする方法。
  24. 【請求項２４】 請求項１に記載の当該生成物、請求項６に記載の当該生成
    物、請求項１２に記載の当該生成物、請求項１４に記載の当該生成物、請求項１
    ８に記載の当該生成物、および請求項２２に記載の当該生成物からなる群から選
    択される有効量の生成物を投与する[但し、当該生成物を、１日あたりｋｇあた り５ｍｇから５００ｍｇの間の割合で投与する]ことにより、免疫応答の阻害を 必要とする哺乳類に同様の阻害をする方法。
  25. 【請求項２５】 当該哺乳類が、乾癬、関節炎またはアトピー性皮膚炎を患
    うヒトである、請求項２３に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 当該哺乳類に移植拒絶のおそれがある、請求項２４に記載
    の方法。
  27. 【請求項２７】 動物が、アレルギー、関節炎、皮膚疾患、座瘡、乾癬、炎
    症性腸疾患、心臓血管疾患、アンギナ、発作、アトピー性皮膚炎、前立腺癌、肺
    癌、皮膚癌および消化管癌(digestive tract cancer)からなる群から選択される
    １種またはそれ以上の疾患を患う、請求項２３に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 動物が、糖尿病、リュウマトイド関節炎、骨関節症炎、強
    直性脊椎炎、偏頭痛、座瘡、胸やけ、狼瘡または癌の何れかを患い、そして本発
    明の有効な薬剤を１日あたりｋｇあたり５ｍｇから５００ｍｇの用量比を投与す
    る、請求項２４に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 当該免疫応答が尋常性座瘡(acne vulgaris)として現われ 、当該哺乳類がヒトである、請求項２４に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 任意の供給源から誘導されるか、または合成的に調製され
    る有効用量のプラストクロマノール８を、５-および／または１２-リポキシゲナ
    ーゼの阻害を必要とする動物に投与することにより、哺乳類の５-および１２-リ
    ポキシゲナーゼの活性を阻害する方法。
  31. 【請求項３１】 当該哺乳類が抗癌治療を必要とする、請求項３０に記載の
    方法。
  32. 【請求項３２】 請求項１に記載の当該生成物、請求項６に記載の当該生成
    物、請求項１２に記載の当該生成物、請求項１４に記載の当該生成物、請求項１
    ８に記載の当該生成物、および請求項２２に記載の当該生成物からなる群から選
    択される生成物を含み、更に、フコシル化硫酸コンドロイチン、抗酸化性緑茶抽
    出物、ショウガアルコール抽出物および付加的な相補的阻害剤としてBoswellia 抽出物を含む、組成物[但し、当該組成物は、動物およびヒトに適する適当な医 療用添加物を更に含む局所用軟膏である]。
  33. 【請求項３３】 請求項１０に記載の当該生成物を含む水中で使用する餌料
    。
  34. 【請求項３４】 請求項１６に記載の当該生成物を含む水中で使用する餌料
    。
  35. 【請求項３５】 ａ)手または機械でナマコの組織を取出すること、 ｂ)ナマコの組織材料がｐＨ４と５．５の間になるように当該組織を酸性化する こと、 ｃ)ステップ(ｂ)の当該組織を乾燥すること、および ｄ)ヘキサン、液化プロパン、臨界超過二酸化炭素、アセトン、アルコールまた は当該溶媒の組合せで、ステップ(ｃ)の当該組織から脂質画分を抽出すること、
    の各ステップを含む、ナマコ組織から脂質画分を大規模に抽出する方法。
  36. 【請求項３６】 当該粉末が、 ａ)ナマコ組織から脂質を取り除いて、脱脂質組織を取得すること、および ｂ)当該脱脂質組織を加水分解すること、 の各ステップを含む方法により調製されるものである、ヒトの食物、飲料および
    化粧品中への含有に適する必須アミノ酸含量が高い乾燥したにおいの少ない粉末
    。
  37. 【請求項３７】 当該粉末を調製する方法が、塩基性溶液または酵素で当該
    脱脂質組織を加水分解することを含む、請求項３６に記載の粉末。
  38. 【請求項３８】 ａ)ナマコの腸組織を乾燥し、乾燥組織を生成すること、 ｂ)当該乾燥組織の脂質を溶媒で抽出して、脱脂質組織を生成させること、 ｃ)当該溶媒を除去すること、 ｄ)当該脱脂質組織を水中に再懸濁すること、 ｅ)ステップ(ｄ)の当該組織のｐＨを約１２に調節すること、 ｆ)ステップ(ｅ)の材料のｐＨを約８．５に調節すること、 ｇ)加熱すること、 ｈ)冷却すること、 ｉ)遠心分離して、固体を除去し、上清相を残すこと、 ｊ)当該上清相のｐＨを約３．０に調節し、タンパク質を沈殿させること、 ｋ)溶液から沈殿タンパク質を分離すること、および ｌ)当該沈殿タンパク質を乾燥すること、 の各ステップを含む方法により調製される、請求項３６に記載の粉末[但し、当 該沈殿タンパク質は当該粉末である]。
  39. 【請求項３９】 当該方法が、 ａ)１種またはそれ以上の溶媒でナマコ組織を抽出して、脂質を取り除き、それ によって残渣を生成させること、および ｂ)当該残渣を水分１０％未満となるまで当該残渣を乾燥すること、 の各ステップを含む、乾燥した、脂質画分を含まない実質的に無味無臭のタンパ
    ク質性ナマコ組織ミールを得る方法。
  40. 【請求項４０】 請求項１に記載の当該生成物、請求項６に記載の当該生成
    物、請求項１２に記載の当該生成物、請求項１４に記載の当該生成物、請求項１
    ８に記載の当該生成物、および請求項２２に記載の当該生成物の有効量を、１日
    あたりキログラム体重あたり２０から５００ミリグラム投与することにより、血
    管新生が病状の一因となっている哺乳類の脈管形成を阻害する方法。
  41. 【請求項４１】 当該投与を、血管新生領域に局所的に接触させることによ
    り実施する、請求項４０に記載の方法。
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