JP2002330780A

JP2002330780A - 診断アッセイ

Info

Publication number: JP2002330780A
Application number: JP2001213219A
Authority: JP
Inventors: Chong Jin Oon; チョン・ジン・オン; Wei Ning Chen; ウェイ・ニン・チェン
Original assignee: Government of The Republic of Singapore
Current assignee: Government of The Republic of Singapore
Priority date: 2000-07-18
Filing date: 2001-07-13
Publication date: 2002-11-19
Also published as: KR20020008069A; TWI248515B; US20030017450A1; CN1900320A; CN1680592A; AU5014001A; EP1174523A3; AU772692B2; CN1333378A; RU2228530C2; US20030077578A1; IL143739A; SG90149A1; NZ528214A; US20030165817A1; CN1223682C; HK1040096A1; TWI240005B; US20030077579A1; KR100602771B1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】Ｂ型肝炎ウイルスの存在を検出する方法の提
供。【解決手段】Ｂ型肝炎ウイルスの存在を検出するための
核酸をベースとしたアッセイに関する。より特定する
と、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス核酸配列を検出するた
めの１段階増幅アッセイを提供する。本発明のアッセイ
は、容易に自動化に適応でき、試験すべきサンプルの速
やかな処理を可能とする。本発明はさらに、Ｂ型肝炎ウ
イルス用の核酸をベースとした検出アッセイを実施する
に有用な因子および前記因子を含むキットを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、一般に、ウイルス
病原体、特にＢ型肝炎ウイルスの存在を検出するための
核酸をベースとしたアッセイに関する。より特定する
と、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス核酸配列を検出するた
めの１段階増幅アッセイを提供する。本発明のアッセイ
は、容易に自動化に適応でき、試験すべきサンプルの速
やかな処理を可能とする。本発明はさらに、Ｂ型肝炎ウ
イルス用の核酸をベースとした検出アッセイを実施する
に有用な因子および前記因子を含むキットを提供する。

【０００２】

【従来の技術】本明細書に数字で参照した刊行物の書誌
詳細は、明細書の最後に集めてある。

【０００３】Ｂ型肝炎ウイルス（以後「ＨＢＶ」と称す
る）は、衰弱疾病状態を引き起こすことがあり、急性肝
不全、肝硬変による出血および原発性肝癌に至ることが
ある。ＨＢＶは、年間、数百万の個体に感染し、少なく
とも毎年百万人の死亡の一因である。

【０００４】ＨＢＶは、ＲＮＡ中間体を介して複製する
ＤＮＡウイルスであり、その複製戦略に逆転写を使用す
る。ＨＢＶゲノムは、様々なウイルスタンパク質をコー
ド化する重複オープンリーディングフレームと共に部分
的に二本鎖ＤＮＡ構造を有する、複雑な性質である。

【０００５】ＨＢＶワクチンを利用できるにも関わら
ず、数億人の個体がウイルスの保因者である。ＨＢＶ
は、一般に、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ウイルス
コア抗原（ＨＢｃＡｇ）およびＨＢｅＡｇに対する抗体
（抗ＨＢｅＡｇ）の検出により同定される。

【０００６】ＨＢＶによる感染またはＨＢｓＡｇによる
ワクチン接種後、ＨＢｓＡｇに対する血清抗体（抗ＨＢ
ｓ）が出現する。これは、免疫をベースとしたＨＢｓＡ
ｇの検出の基礎である。この検出系で、ＨＢｓＡｇまた
は抗ＨＢｓをスクリーニングする。アッセイを使用し
て、ＨＢＶのために輸血する前に血液をスクリーニング
し、急性および慢性肝炎、肝硬変および原発性肝癌の患
者のＨＢＶ関連肝疾患、を検出し、移植レシピエントお
よびドナーなどにおけるＨＢＶ保因者についてスクリー
ニングする。

【０００７】ＨＢｓＡｇは、「ａ」決定基と称される抗
原性領域を含む（１）。「ａ」決定基は、複雑で、高次
構造的で、高度に保存されたシステイン残基の間のジス
ルフィド結合に依存する。「ａ」決定基の変化をもたら
す遺伝子変異が、従来のワクチンに対して生じる免疫応
答を回避する、ＨＢＶ変異体に関与する（２〜６）。１
つの特に共通した変異は、ＨＢｓＡｇのアミノ酸位置１
４５（Ｇ１４５Ｆ）でのグリシン（Ｇ）からアルギニン
（Ｒ）への置換である。この変異は「ａ」エピトープ領
域に影響を及ぼす。

【０００８】ＨＢＶ感染の処置または予防における化学
的および免疫学的介入の確実性の向上により、介入的治
療に耐性であるＨＢＶ変異形の出現の淘汰圧は上昇す
る。ＨＢＶの重複ゲノム構造のため、ＨＢＶ変異形は、
化学試薬またはワクチンの使用により直接的または間接
的に淘汰し得る。

【０００９】結果として、ＨＢｓＡｇ用の従来の抗体を
ベースとしたアッセイは、偽の陰性結果をもたらし得
る。これは、疾病の拡大の制御および患者の管理の点で
非常に深刻な意味を有し得る。

【００１０】本発明に導く研究において、発明者は、Ｈ
ＢＶ用の代替アッセイを探索した。本発明に従って、発
明者は、ＨＢＶ（これは免疫的に検出可能なウイルスマ
ーカーを示しても示さなくてもよい）からのＨＢＶ核酸
配列についてスクリーニングするための、１段階核酸増
幅アッセイを開発した。本発明の核酸をベースにしたア
ッセイは、ＨＢＶ因子についての診断アッセイを、特
に、かかる因子が、従来の免疫をベースとした診断試験
により検出できないかもしれない場合に提供する。さら
に、本発明のアッセイは、特異的免疫グロブリン（例え
ばＩｇＧ）およびＨＢＶ変異形間の保存領域に基づいた
ワクチンの開発を可能とする。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本明細書の全体を通じ
て、脈絡が他を要求しない場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉ
ｓｅ）」なる語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ
ｓ）」または「含んでいる」などの変形は、記述したエ
レメントまたは整数或いはエレメントまたは整数の群の
封入を意味すると理解し、任意の他のエレメントまたは
整数或いはエレメントまたは整数の群の除外ではない。

【００１２】本発明の１つの態様は、サンプル中のＨＢ
Ｖ由来核酸標的配列を検出する方法を提供し、前記方法
は、サンプルを変性条件にかけ、一本鎖形の前記標的配
列を生成し、変性サンプルを、少なくとも２つのプライ
マーを含む１セットのプライマーと接触させ、ここで
の、少なくとも１つのプライマーは、前記標的配列の１
つの鎖にハイブリッドでき、ここでの少なくとも１つの
他のプライマーは、前記の最初に記載した鎖に相補的な
鎖にハイブリッドでき、ここでの前記プライマーは、そ
の３’末端から伸長可能であり、前記の各プライマーが
ハイブリッドした鎖に相補的な伸長産物を形成し、そし
て、サンプルを、増幅を促進する条件にかけ、相補的伸
長産物を含む増幅産物を生成し、次いで、増幅産物の存
在について検出し、ここでの前記増幅産物の存在は、前
記ＨＢＶ由来核酸標的配列を示す、ことを含む。

【００１３】本発明の別の態様は、サンプル中のＨＢＶ
由来核酸標的配列を検出する方法を考え、前記方法は、
サンプルを変性条件にかけ、一本鎖形の前記標的配列を
生成し、変性サンプルを、少なくとも２つのプライマー
を含む１セットのプライマーと接触させ、ここでの、少
なくとも１つのプライマーは、前記標的配列の１つの鎖
にハイブリッドでき、ここでの少なくとも１つの他のプ
ライマーは、前記の最初に記載した鎖に相補的な鎖にハ
イブリッドでき、ここでの前記プライマーは、その３’
末端から伸長可能であり、前記の各プライマーがハイブ
リッドした鎖に相補的な伸長産物を形成し、ここでのプ
ライマーは、ＨＢｓＡｇをコードするヌクレオチド配列
内または一部の保存ヌクレオチド配列に対応するまたは
フランキングする領域にハイブリッドするように選択さ
れ、そして、サンプルを、増幅を促進する条件にかけ、
相補的伸長産物を含む増幅産物を生成し、次いで、増幅
産物の存在について検出し、ここでの前記増幅産物の存
在は、前記ＨＢＶ由来核酸標的配列を示す、ことを含
む。

【００１４】本発明のさらに別の態様は、サンプル中の
ＨＢＶ由来ＤＮＡ標的配列を検出する方法を考え、前記
方法は、所望により、前記サンプルを逆転写条件にか
け、ＨＢＶ由来ｍＲＮＡからの一本鎖または二本鎖ｃＤ
ＮＡ分子を生成し、サンプルを変性条件にかけ、前記標
的配列に対応する一本鎖ＤＮＡ分子を生成し、変性サン
プルを、少なくとも２つのプライマーを含む１セットの
プライマーと接触させ、ここでの、少なくとも１つのプ
ライマーは、前記標的配列の１つのＤＮＡ鎖にハイブリ
ッドでき、ここでの少なくとも１つの他のプライマー
は、前記の最初に記載した鎖に相補的な鎖にハイブリッ
ドでき、ここでの前記プライマーは、その３’末端から
伸長可能であり、前記の各プライマーがハイブリッドし
た鎖に相補的な伸長産物を形成し、そして、サンプル
を、増幅を促進する条件にかけ、相補的伸長産物を含む
増幅産物を生成し、次いで、増幅産物を検出し、ここで
の前記増幅産物の存在は、前記ＨＢＶ由来ＤＮＡ標的配
列を示す、ことを含む。

【００１５】本発明のさらに別の態様は、サンプル中の
ＨＢＶ由来ＤＮＡ標的配列を検出する方法を考え、前記
方法は、所望により、前記サンプルを逆転写条件にか
け、ＨＢＶ由来ｍＲＮＡからの一本鎖または二本鎖ｃＤ
ＮＡ分子を生成し、サンプルを変性条件にかけ、前記標
的配列に対応する一本鎖ＤＮＡ分子を生成し、変性サン
プルを、少なくとも２つのプライマーを含む１セットの
プライマーと接触させ、ここでの、少なくとも１つのプ
ライマーは、前記標的配列の１つのＤＮＡ鎖にハイブリ
ッドでき、ここでの少なくとも１つの他のプライマー
は、前記の最初に記載した鎖に相補的な鎖にハイブリッ
ドでき、ここでの前記プライマーは、その３’末端から
伸長可能であり、前記の各プライマーがハイブリッドし
た鎖に相補的な伸長産物を形成し、ここでの前記プライ
マーの１つは、同定可能なシグナルを与えることができ
るリポーター分子で標識され、前記プライマーの他方は
捕獲可能な部分で標識され、そして、前記サンプルを、
増幅を促進する条件にかけ、１つの鎖に同定可能なシグ
ナルを提供できるリポーター分子および他方の鎖に固相
支持体の捕獲可能な部分を有する、相補的伸長産物を含
む増幅産物を生成し、増幅産物を、その捕獲可能な部分
を介して固定し、次いで、検出可能なシグナルをスクリ
ーニングし、ここでのシグナルの存在は、増幅産物を示
し、よってＨＢＶ由来標的ＤＮＡ配列を示す、ことを含
む。

【００１６】本発明のさらにまた別の態様は、サンプル
中のＨＢＶ由来ＤＮＡ標的配列を検出する方法を考え、
前記方法は、前記サンプルを、固相支持体に固定したプ
ライマーおよび溶液相中の第二プライマーを有する反応
容器に導入し、ここでの両方のプライマーは、ＨＢＶゲ
ノム上の保存領域内、近位または隣接の領域のＨＢＶ由
来ＤＮＡの相補的一本鎖上の相補的ヌクレオチド配列に
ハイブリッドでき、ここでの溶液相プライマーは、同定
可能なシグナルを与えることができるリポーター分子で
標識され、反応容器を、増幅を促進する条件にかけ、次
いで、同定可能なシグナルの存在を検出し、ここでの前
記シグナルの存在は、ＨＢＶ由来ＤＮＡの存在を示す、
ことを含む。

【００１７】本発明のさらにまた別の態様は、ＨＢＶの
同じまたは異なる株または変異形からの１つ以上のＨＢ
Ｖ由来ＤＮＡ標的配列を検出する方法に関し、前記方法
は、一本鎖形のＨＢＶ由来ＤＮＡを推定上含むサンプル
を、反応容器の固相支持体に個々にまたはアレイで固定
された２つ以上のプライマーと接触させ、ここでの反応
容器は、さらに、固相支持体に固定した対を有する溶液
相プライマーを含み、ここでの固定プライマーおよびそ
の溶液相対プライマーは、ＨＢＶ由来ＤＮＡの領域を増
幅条件下で増幅でき、ここでの溶液相プライマーは、同
定可能なシグナルを与えることのできるリポーター分子
を有し、よって固相支持体上の規定された位置でのシグ
ナルの存在は、特定のＨＢＶ単離株または変異形の同定
を可能とする、ことを含む。

【００１８】本発明の別の態様は、固相支持体に固定し
た２つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーのアレイを
提供し、前記プライマーは、ＨＢＶ由来ＤＮＡからの相
補的ヌクレオチド配列にハイブリッドできる。

【００１９】本発明のさらに別の態様は、マトリックス
上の座標（ｘ_１ｙ_１）、（ｘ_２ｙ_２）．．．（ｘ
_ｎｙ_ｎ）を有する、式ａ_１ａ_２．．．ａ_ｎにより定義さ
れるオリゴヌクレオチドのアレイを含むマトリックスの
使用を提供し、ここでのａ_１ａ_２．．．ａ_ｎは、計ｎ個
のオリゴヌクレオチドの同じまたは異なるオリゴヌクレ
オチドを示し、各オリゴヌクレオチドは、格子座標（ｘ
_１ｙ_１）、（ｘ_２ｙ_２）．．．（ｘ_ｎｙ_ｎ）により定義
でき、ここでのオリゴヌクレオチドは、ｂ_１ｂ_１．．．
ｂ_ｎにより定義される増幅対を有し、よって、オリゴヌ
クレオチドａ_１ｂ_１、ａ_２ｂ_２．．．ａ_ｎｂ_ｎは、ＨＢ
Ｖ由来ＤＮＡの相補鎖にハイブリッドでき、ここでの介
在ＤＮＡは、ＨＢｓＡｇ変異形などの２つ以上のＨＢＶ
変異形間に保存されたヌクレオチド配列を含み、ここで
の前記マトリックスは、前記ＨＢＶ由来ＤＮＡの保存増
幅領域を有することにより定義される特定のＨＢＶ因子
を検出するのに有用である。

【００２０】

【発明の実施の形態】本発明は、一部、ＨＢＶ変異形間
に保存されるヌクレオチド配列の同定、並びに、ＨＢＶ
の増幅をベースとした診断アッセイ用のプライマーの開
発のためのその使用に基づく。

【００２１】数個の用語を明瞭化の目的で以下に定義す
る。

【００２２】「増幅混合物」は、標的ウイルス由来核酸
配列を増幅するに必要な様々な試薬を含む水溶液を意味
する。これらは、酵素、緩衝水、塩、標的核酸およびデ
オキシヌクレオシド三リン酸を含む。

【００２３】「増幅系」は、核酸の標的配列のコピーを
増幅するための任意のインビトロの手段を意味する。

【００２４】「増幅試薬」は、増幅に必要な、様々な緩
衝液、酵素、プライマーおよびデオキシヌクレオシド三
リン酸を意味する。

【００２５】「核酸」は、一本鎖または二本鎖形の、リ
ボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドポリマ
ーを意味する。

【００２６】「ポリメラーゼ」は、ヌクレオシド三リン
酸前駆体からＤＮＡの合成を触媒できる酵素を意味す
る。本発明のＰＣＲ増幅において、ポリメラーゼは、好
ましくは、鋳型依存性で、熱安定性であり、典型的に
は、伸長するＤＮＡポリマーの３’末端にヌクレオチド
を加える。

【００２７】「オリゴヌクレオチド」は、２つ以上のリ
ボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドからな
る分子を意味する。

【００２８】「プライマー」は、標的核酸鎖に相補的な
プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下で、ＤＮ
Ａ合成の開始点として作用できる、天然または合成の、
オリゴヌクレオチドを意味する。これらの条件は、適切
な緩衝液中および適切な温度での、４つの異なるヌクレ
オシド三リン酸およびポリメラーゼを含む。プライマー
は、好ましくは、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドで
ある。プライマーの適切な長さは、プライマーの使用の
目的および条件（標的核酸の配列保存、ＰＣＲサイクル
条件およびプライマーの組成物を含む）に依存する。

【００２９】本発明は、サンプル中のＨＢＶ由来核酸標
的配列を検出する方法を提供し、前記方法は、サンプル
を変性条件にかけ、一本鎖形の前記標的配列を生成し、
変性サンプルを、少なくとも２つのプライマーを含む１
セットのプライマーと接触させ、ここでの、少なくとも
１つのプライマーは、前記標的配列の１つの鎖にハイブ
リッドでき、ここでの少なくとも１つの他のプライマー
は、前記の最初に記載した鎖に相補的な鎖にハイブリッ
ドでき、ここでの前記プライマーは、その３’末端から
伸長可能であり、前記の各プライマーがハイブリッドし
た鎖に相補的な伸長産物を形成し、そして、サンプル
を、増幅を促進する条件にかけ、相補的伸長産物を含む
増幅産物を生成し、次いで、増幅産物の存在について検
出し、ここでの前記増幅産物の存在は、前記ＨＢＶ由来
核酸標的配列を示す、ことを含む。

【００３０】１つの実施形態において、標的配列は、Ｈ
ＢＶ変異形、特に、変化したＨＢｓＡｇを有するＨＢＶ
変異形間に保存されたＨＢＶゲノム上の領域に相当す
る。変化したＨＢｓＡｇは、ＨＢｓＡｇをコードするヌ
クレオチド配列の、単一または複数のヌクレオチド置
換、欠失および／または付加により生じた、単一または
複数のアミノ酸置換、欠失および／または付加を含み得
る。ＨＢＶゲノム内および特にＨＢｓＡｇをコードする
ヌクレオチド配列内の保存領域は、ＨＢｓＡｇの免疫学
的変化にも関わらず、比較的安定に留まると提唱され
る。結果として、免疫をベースとしたＨＢｓＡｇアッセ
イにもはや検出されないＨＢＶ変異形は、本発明に従っ
て、ＨＢｓＡｇ遺伝子の保存領域を介して依然として検
出可能であると提唱される。しかし、本発明は、修飾ま
たは新規エピトープ（例えばＨＢｓＡｇ上）が得られる
ものなどの、ＨＢＶゲノムの可変領域の同定における主
題の方法の使用におよぶ。

【００３１】ＨＢｓＡｇ変異形の言及は、ＤＮＡポリメ
ラーゼなどの他の重複遺伝子の変異形も包含する。

【００３２】本発明のこれおよび他の態様は、「コード
する核酸」、「コードするヌクレオチド配列」および
「コードする遺伝子配列」などの用語により包含され
る、「遺伝子」なる語により限定されない。

【００３３】「遺伝子」なる語は、その広義の意味で使
用され、遺伝子のエキソンに対応するｃＤＮＡを含む。
従って、本明細書の「遺伝子」の言及は：（ｉ）転写お
よび／または翻訳調節配列および／またはコード配列お
よび／または非翻訳配列（すなわち、イントロン、５’
および３’非翻訳配列）からなる、古典的ゲノム遺伝
子；または（ｉｉ）コード領域（すなわちエキソン）に
対応するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡおよび遺伝子の５’お
よび３’非翻訳配列を含むと捉えられる。

【００３４】「遺伝子」なる語はまた、発現産物の全て
または一部をコードする合成または融合分子を記載する
ために使用される。特定の実施形態において、「核酸分
子」および「遺伝子」なる語は、同義語として使用し得
る。

【００３５】従って、本発明の別の態様は、サンプル中
のＨＢＶ由来核酸標的配列を検出する方法を考え、前記
方法は、サンプルを変性条件にかけ、一本鎖形の前記標
的配列を生成し、変性サンプルを、少なくとも２つのプ
ライマーを含む１セットのプライマーと接触させ、ここ
での、少なくとも１つのプライマーは、前記標的配列の
１つの鎖にハイブリッドでき、ここでの少なくとも１つ
の他のプライマーは、前記の最初の鎖に相補的な鎖にハ
イブリッドでき、ここでの前記プライマーは、その３’
末端から伸長可能であり、前記の各プライマーがハイブ
リッドした鎖に相補的な伸長産物を形成し、ここでのプ
ライマーは、ＨＢｓＡｇをコードするヌクレオチド配列
内または一部の保存ヌクレオチド配列に対応するまたは
フランキングする領域にハイブリッドするように選択さ
れ、そして、サンプルを、増幅を促進する条件にかけ、
相補的伸長産物を含む増幅産物を生成し、次いで、増幅
産物の存在について検出し、ここでの前記増幅産物の存
在は、前記ＨＢＶ由来核酸標的配列を示す、ことを含
む。

【００３６】サンプルは、一般に、しかし専らではない
が、組織または組織抽出物、血液および排出物を含む液
体、或いは潜在的にＨＢＶ粒子またはＨＢＶＤＮＡ、
ｍＲＮＡまたはＲＮＡ複製中間体を含む任意の他の物質
を含む生物学的サンプルである。第一段階は、一般に、
それ故、好ましい実施形態において、ヒト被検者を含む
哺乳動物被検者からサンプルを単離することを含む。サ
ンプルはまた、環境的サンプルまたは可能性あるＨＢＶ
汚染源からのサンプルであり得る。

【００３７】本発明は、特に、「回避」ＨＢＶ変異形、
すなわち、少なくとも１つの形のＨＢｓＡｇに対する抗
体が実質的にもはや相互作用しない変異形に関するが、
本発明はさらに、ＨＢＶ変異形、特に臨床関連ＨＢＶ変
異形間で保存され、有用な標的配列として作用する、Ｈ
ＢＶゲノムの任意の領域に及ぶ。ＨＢＶゲノム上で考え
られる特に有用な領域は、新規エピトープまたはＨＢｓ
Ａｇをコードするものである。かかる領域は、診断目的
の組換えペプチドを作成するのに有用である。

【００３８】本発明は、それ故、ＨＢＶ由来核酸配列を
検出することにより、ＨＢＶを検出する手段を提供す
る。「ＨＢＶ由来」核酸配列は、ＨＢＶゲノムそれ自
体、その一本鎖ＤＮＡ形、ＲＮＡ複製中間体、並びに、
逆転写酵素を使用して調製したｃＤＮＡ一本鎖または二
本鎖分子を含む。後者に関して、ＨＢＶ由来ヌクレオチ
ド配列からのｍＲＮＡ転写物を、逆転写反応にかけて、
相補的ＤＮＡ鎖を生成し得る。次いで、後者の鎖および
／またはそのＤＮＡ相補物は、増幅反応の主題であり得
る。ＲＮＡ複製中間体および／またはＨＢＶ由来ｍＲＮ
Ａに対応するｃＤＮＡの検出もまた、活発なウイルス複
製を示す。

【００３９】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライゲ
ーション連鎖反応、核酸配列をベースとした増幅、Ｑレ
プリカーゼをベースとした増幅、鎖置換法、ローリング
サークル増幅、および再循環対立遺伝子特異的プライマ
ー伸長を含むがこれに限定されない、任意の形の増幅反
応を、本発明の実施に使用し得る。しかし、好ましく
は、ＰＣＲを使用する。

【００４０】従って、本発明の別の態様は、サンプル中
のＨＢＶ由来ＤＮＡ標的配列を検出する方法を考え、前
記方法は、所望により、前記サンプルを逆転写条件にか
け、ＨＢＶ由来ｍＲＮＡからの一本鎖または二本鎖ｃＤ
ＮＡ分子を生成し、サンプルを変性条件にかけ、前記標
的配列に対応する一本鎖ＤＮＡ分子を生成し、変性サン
プルを、少なくとも２つのプライマーを含む１セットの
プライマーと接触させ、ここでの、少なくとも１つのプ
ライマーは、前記標的配列の１つのＤＮＡ鎖にハイブリ
ッドでき、ここでの少なくとも１つの他のプライマー
は、前記の最初に記載した鎖に相補的な鎖にハイブリッ
ドでき、ここでの前記プライマーは、その３’末端から
伸長可能であり、前記の各プライマーがハイブリッドし
た鎖に相補的な伸長産物を形成し、そして、サンプル
を、増幅を促進する条件にかけ、相補的伸長産物を含む
増幅産物を生成し、次いで、増幅産物を検出し、ここで
の前記増幅産物の存在は、ＨＢＶ由来ＤＮＡ標的配列を
示す、ことを含む。

【００４１】特に好ましい実施形態において、プライマ
ーは、ＨＢｓＡｇをコードするヌクレオチド配列内から
選択される。最も好ましくは、プライマーは、＜４００
＞１［センスプライマー］および＜４００＞２［アンチ
センスプライマー］である。本発明はまた、＜４００＞
１または＜４００＞２に少なくとも約７０％の類似性を
有するオリゴヌクレオチドプライマー、並びに、厳密度
の低い条件下で＜４００＞１または＜４００＞２または
その相補物にハイブリッドできるプライマーにおよぶ。

【００４２】本明細書に使用した「類似性」なる語は、
ヌクレオチドレベルでの比較配列間の正確な同一性を含
む。ヌクレオチドレベルで同一でない場合、「類似性」
は、異なっているにも関わらず、互いに、構造的、機能
的、生化学的および／またはコンフォメーションレベル
で関連した、異なるアミノ酸をもたらす、配列間の差異
を含む。特に好ましい実施形態において、ヌクレオチド
配列比較は、類似性よりも同一性レベルで行う。

【００４３】２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペ
プチド間の配列関係を記載するために使用した用語は、
「参照配列」、「比較窓」、「配列類似性」、「配列同
一性」、「配列類似性％」、「配列同一性％」、「かな
りの類似性」および「かなりの同一性」を含む。「参照
配列」は、少なくとも１２、しかし頻繁には１５〜１
８、しばしば少なくとも２５またはそれ以上、例えば３
０モノマー単位のヌクレオチドおよびアミノ酸残基長を
含む。２つのポリヌクレオチドは、各々、（１）２つの
ポリヌクレオチド間で類似した配列（すなわち、完全ポ
リヌクレオチド配列の一部）、および（２）２つのポリ
ヌクレオチド間で異なる配列を含み得、２つ（またはそ
れ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的に
は、「比較窓」上での２つのポリヌクレオチドの配列の
比較により実施され、配列類似性の局所領域を同定およ
び比較する。「比較窓」は、参照配列と比較される、典
型的には１２の連続した残基の概念的セグメントを意味
する。比較窓は、２つの配列を最適にアラインメントさ
せると、参照配列（これは付加または欠失を含まない）
に比較して、約２０％またはそれ以下の付加または欠失
（すなわちギャップ）を含み得る。比較窓をアラインす
る上での最適の配列のアラインメントは、コンピュータ
ーによるアルゴリズムの実行（ウィスコンシン・ジェネ
ティクス・ソフトウェア・パッケージ・リリース７．
０、ジェネティクスコンピューターグループ、５７５サ
イエンスドライブマジソン、ＷＩ、米国の、ＧＡＰ、Ｂ
ＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、ま
たは、選択した任意の様々な方法により作成された検査
および最善のアラインメント（すなわち、比較窓上で最
も高い相同性％が得られる）により実施され得る。例え
ばＡｌｔｓｃｈｕｌ等（８）により開示されたＢＬＡＳ
Ｔプログラムファミリーも参照し得る。配列解析の詳細
な議論は、Ａｕｓｕｂｅｌ等（９）のユニット１９．３
に見出し得る。

【００４４】本明細書に使用した「配列類似性」および
［配列同一性」なる語は、比較窓上で、ヌクレオチド毎
に、同一或いは機能的または構造的に類似している程度
を意味する。従って、「配列同一性％」は、例えば、比
較窓上で、２つの最適にアラインさせた配列を比較し、
同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）が両方
の配列に存在する位置数を決定し、一致した位置の数を
出し、一致した位置の数を、比較窓の位置の全数（すな
わち窓サイズ）で割り、その結果を１００倍して、配列
同一性％を出すことにより決定する。本発明の目的で
は、「配列同一性」は、ソフトウェアに付属の参考マニ
ュアルに使用されるような標準的デフォールトを使用し
て、ＤＮＡＳＩＳコンピュータープログラム（ウィンド
ウ用バージョン２．５；日立ソフトウェアエンジニアリ
ング社、南サンフランシスコ、カリフォルニア、米国か
ら入手可能）により計算した「一致％」を意味すると理
解する。類似の解説を配列類似性に関しても適用する。

【００４５】本明細書の低い厳密性の言及は、ハイブリ
ダイゼーションにおいて、少なくとも約０から少なくと
も約１５％ｖ／ｖホルムアミドおよび少なくとも約１Ｍ
から少なくとも約２Ｍの塩、並びに、洗浄条件におい
て、少なくとも約１Ｍから少なくとも約２Ｍの塩を含む
および包含する。一般に、低い厳密性は、約２５〜３０
℃から約４２℃である。温度は変化し得、ホルムアミド
を取り替えるためにおよび／または別の厳密度条件を与
えるために、より高い温度を使用し得る。ハイブリダイ
ゼーションにおいて、少なくとも約１６％ｖ／ｖから少
なくとも約３０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくと
も約０．５Ｍから少なくとも約０．９Ｍの塩、並びに、
洗浄条件において、少なくとも約０．５Ｍから少なくと
も約０．９Ｍの塩を含むおよび包含する中程度の厳密
度、或いは、ハイブリダイゼーションにおいて、少なく
とも約３１％ｖ／ｖから少なくとも約５０％ｖ／ｖのホ
ルムアミドおよび少なくとも約０．０１Ｍから少なくと
も約０．１５Ｍの塩、および洗浄条件において少なくと
も約０．０１Ｍから少なくとも約０．１５Ｍの塩を含む
および包含する高い厳密度などの、別の厳密度条件も、
必要であれば適用し得る。一般に、洗浄は、Ｔ_ｍ＝６
９．３＋０．４１（Ｇ＋Ｃ）％で実施する（１０）。し
かし、二重鎖ＤＮＡのＴ_ｍは、ミスマッチ塩基対の数が
１％増加する毎に、１％減少する（１１）。ホルムアミ
ドは、これらのハイブリダイゼーション条件で随意であ
る。従って、特に好ましい厳密度レベルは、以下のよう
に定義される：低い厳密度は６×ＳＳＣ緩衝液、０．１
％ｗ／ｖＳＤＳで２５〜４２℃で；中程度の厳密度
は、２×ＳＳＣ緩衝液、０．１％ｗ／ｖＳＤＳで２０℃
から６５℃の範囲の温度で；高い厳密度は、０．１×Ｓ
ＳＣ緩衝液、０．１％ｗ／ｖＳＤＳで少なくとも６５℃
の温度である。

【００４６】本明細書の「プライマー」の言及は、構
造、サイズまたは機能に関して、任意の限定とは捉えな
い。プライマーは、増幅分子として使用しても、ハイブ
リダイゼーションの目的のプライマーとして使用しても
よい。好ましい分子の形は、増幅用の核酸プライマーで
ある。

【００４７】本明細書の「核酸プライマー」の言及は、
少なくとも３つのヌクレオチドを含む、デオキシリボヌ
クレオチドまたはリボヌクレオチドの配列の言及を含
む。一般に、核酸プライマーは、約３から約１００のヌ
クレオチド、好ましくは約５から約５０のヌクレオチ
ド、さらにより好ましくは約５から約２５のヌクレオチ
ドを含む。５０以下のヌクレオチドを有するプライマー
も、本明細書で「オリゴヌクレオチドプライマー」と称
し得る。本発明のプライマーは、例えば、ヌクレオチド
の段階的付加により合成的に製造しても、または、他の
ヌクレオチド酸分子の断片、部分、一部または伸長産物
でもよい。「プライマー」なる語は、最も一般的な意味
において使用され、増幅目的に使用する場合に、ＤＮＡ
ポリメラーゼによるＤＮＡ合成の開始のための遊離３’
ヒドロキシル基を提供できる、任意の長さのヌクレオチ
ドを含む。ＤＮＡ合成により、プライマーが伸長され、
プライマーがハイブリッドした核酸鎖に相補的なプライ
マー伸長産物が生成する。

【００４８】伸長産物を生成するハイブリッドしたプラ
イマーの伸長は、本明細書で「増幅」なる語に含まれ
る。増幅は、一般に、変性、次いでプライマーハイブリ
ダイゼーションおよび伸長のサイクルで起こる。本発明
は、約１サイクルから約１２０サイクル、好ましくは約
２から約７０サイクル、さらにより好ましくは、約１
０、１５、２０、２５および３０サイクルを含む約５か
ら約４０サイクルを包含する。

【００４９】増幅産物（アンプリマーとも称する）は、
任意の慣用的な手段により検出し得る。１つの実施形態
において、増幅産物は、電気泳動により分離し、次い
で、例えば、臭化エチジウム染色後に紫外線光を使用し
て可視化する。別法として、増幅産物を、ＨＰＬＣなど
の様々な形のクロマトグラフィー或いはＭＡＬＤＩ−Ｔ
ＯＦなどの分光法および質量分析を使用して分解し得
る。さらに別の選択肢は、リポーター分子で標識したプ
ライマーを使用する。後者に関して、プライマーの１つ
を、リポーター分子で標識し得、一方、他のプライマー
を、捕獲部分で標識し得、アンプリマーを固相支持体に
アンカーさせ、次いでそれをリポーターシグナルを介し
て同定する。この実施形態は、増幅に使用されるプライ
マーのセットを用いて、または第二のひとそろいの１セ
ットのプライマーを用いて実施し得る。しかし、好まし
い実施形態においては、単に１セットのプライマーを使
用し、よって、アッセイは１段階の増幅アッセイであ
る。

【００５０】従って、本発明の別の態様は、サンプル中
のＨＢＶ由来ＤＮＡ標的配列を検出する方法を考え、前
記方法は、所望により、前記サンプルを逆転写条件にか
け、ＨＢＶ由来ｍＲＮＡからの一本鎖または二本鎖ｃＤ
ＮＡ分子を生成し、サンプルを変性条件にかけ、前記標
的配列に対応する一本鎖ＤＮＡ分子を生成し、変性サン
プルを、少なくとも２つのプライマーを含む１セットの
プライマーと接触させ、ここでの、少なくとも１つのプ
ライマーは、前記標的配列の１つのＤＮＡ鎖にハイブリ
ッドでき、ここでの少なくとも１つの他のプライマー
は、前記の最初に記載した鎖に相補的な鎖にハイブリッ
ドでき、ここでの前記プライマーは、その３’末端から
伸長可能であり、前記の各プライマーがハイブリッドし
た鎖に相補的な伸長産物を形成し、前記プライマーの１
つは、同定可能なシグナルを与えることができるリポー
ター分子で標識され、前記プライマーの他方は捕獲可能
な部分で標識され、前記サンプルを増幅を促進する条件
にかけ、１つの鎖に同定可能なシグナルおよび他方の鎖
の固相支持体に捕獲可能な部分を提供できるリポーター
分子を有する、相補的伸長産物を含む増幅産物を生成
し、増幅産物を、その捕獲可能な部分を介して固定し、
次いで、検出可能なシグナルをスクリーニングし、ここ
でのシグナルの存在は、増幅産物を示し、よってＨＢＶ
由来標的ＤＮＡ配列を示す、ことを含む。

【００５１】上記のアッセイの多くの変形が当業者には
明らかである。例えば、増幅反応は、容器の壁またはウ
ェルに固定した捕獲分子を有する、容器またはマイクロ
タイターウェルで起こり得る。捕獲分子は、例えば、ア
ンプリマー内のヌクレオチド配列、または、プライマー
の１つの捕獲部分上の捕獲分子に相補的なヌクレオチド
配列にハイブリッドおよび捕獲できるプライマーであり
得る。別に、捕獲分子は、プライマーの１つの捕獲部分
を特異的に認識できるＤＮＡ結合タンパク質でもよい。
捕獲分子は、増幅反応に関与し得る。

【００５２】捕獲分子は、任意の慣用的な手段により固
相に固定し得る。固相は、核酸プライマーまたは他の捕
獲分子をアンカーするように誘導化できる表面を有する
任意の構造であり得る。好ましくは、固相は、マイクロ
タイターウェル面またはディップスティック面などの平
面物質である。

【００５３】本明細書で考える固相支持体は、典型的に
は、ガラス、或いは、セルロース、セラミック材料、ニ
トロセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリ
スチレンおよびその誘導体、ポリビニリデンジフルオラ
イド（ＰＶＤＦ）、メタクリレートおよびその誘導体、
ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンなどのこれに限定
されない、ポリマーである。ニトロセルロースが特に有
用である。固相支持体はまた、ガラスまたはポリマーマ
トリックス上に支持された、ニトロセルロースフィルム
などのハイブリッドでもよい。「ハイブリッド」の言及
は、上記に列挙した２つ以上のガラスまたはポリマー表
面の重層配置の言及を含む。固相支持体は、膜、チュー
ブ、ビーズ、ディスク、またはマイクロプレート、ディ
ップスティック、マイクロタイタートレイウェルの形ま
たはアッセイの実施に適した任意の他の表面であり得
る。

【００５４】１つの実施形態において、アンカーした核
酸は、ハイブリダイゼーションにより標的核酸分子を捕
獲し、随意、増幅反応に関与する。別に、アンカーした
核酸分子は、増幅した核酸分子を捕獲する。

【００５５】核酸分子を固相支持体に連結する方法は当
分野で公知である。プライマーを固相支持体に連結する
プロセスは、アミド結合、アミデート結合、チオエーテ
ル結合、および固相へのアミノ基の導入を含む。固相へ
の結合の例は、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ９２／００５
８７［ＷＯ９３／０９２５０］に見出し得る。

【００５６】アンカーしたプライマーは、増幅反応にお
いて溶液相プライマーと共に関与し得る。別に、標的配
列を含む核酸分子を増幅するために、「ジェネリック」
プライマーを固相支持体にアンカーする。次いで、標的
配列の特異的増幅は、溶液相プライマーにより達成でき
る。

【００５７】検出可能なシグナルを与える一連の標識を
使用し得る。標識は、特定の核酸分子またはヌクレオチ
ドに会合していても、または、核酸分子またはヌクレオ
チドに続けて結合する中間体に付着していてもよい。

【００５８】標識は、発色源、触媒、酵素、フルオロフ
ォア、発光分子、化学発光分子、ユーロピウム（Ｅｕ
^３４）などのランタニド、放射性同位体および直接的可
視標識を含む群から選択され得る。直接的可視標識の場
合、使用は、コロイド状金属または非金属粒子、色素粒
子、酵素または基質、有機ポリマー、ラテックス粒子、
リポソーム、または、シグナル発生基質等を含む他のベ
ヒクルからなり得る。標識として使用するに適した多く
の酵素が、米国特許第４，３６６，２４１号、第４，８
４３，０００号および第４，８４９，３３８号に開示さ
れている。本発明で有用な適切な酵素標識は、アルカリ
ホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ル
シフェラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ等を含
む。酵素標識は、単独で使用しても、溶液中の第二酵素
と組合せて使用してもよい。別に、本発明に従って適切
な標識として使用し得るフルオロフォアは、フルオレセ
イン、ローダミン、テキサスレッド、ルシファーイエロ
ーまたはＲ−フィコエリトリンを含むがこれに限定され
ない。

【００５９】別の実施形態において、プライマーの１つ
を、容器の壁またはマイクロタイターウェルなどの固相
支持体にアンカーし、他方のプライマーは溶液相にあ
る。溶液相プライマーは、一般に、リポーター分子で標
識する。増幅反応後、検出可能なシグナルの存在は、ア
ンプリマーを示す。

【００６０】従って、本発明の別の態様は、サンプル中
のＨＢＶ由来ＤＮＡ標的配列を検出する方法を考え、前
記方法は、前記サンプルを、固相支持体に固定したプラ
イマーおよび溶液相中の第二プライマーを有する反応容
器に導入し、ここでの両方のプライマーは、ＨＢＶゲノ
ム上の保存領域内、近位または隣接の領域のＨＢＶ由来
ＤＮＡの相補的一本鎖上の相補的ヌクレオチド配列にハ
イブリッドでき、ここでの溶液相プライマーは、同定可
能なシグナルを与えることができるリポーター分子で標
識され、反応容器を、増幅を促進する条件にかけ、次い
で、同定可能なシグナルの存在を検出し、ここでの前記
シグナルの存在は、ＨＢＶ由来ＤＮＡの存在を示す、こ
とを含む。

【００６１】さらに別の実施形態において、本発明は、
ＨＢＶゲノム上の保存領域または保存および可変領域な
どの、ＨＢＶゲノムの異なる領域にプライマーのアレイ
を使用する。これは、ＨＢＶを「分類」またはその可変
領域を同定する必要がある場合に特に有用である。１つ
の有用な実施形態において、ＨＢＶゲノムの異なる領域
に指向された複数のプライマーを、マイクロチップ、反
応容器壁、ディップスティック、スライドまたは他のマ
トリックスなどの固相支持体に固定する。プライマー
は、一般に、プライマーの同定のために特定の配座でア
レイに並べる。しかし、「アレイ」なる語は、任意の特
定の順序を意味せず、「アレイ」はまた、全体のパター
ン内のランダムな点も含み得る。

【００６２】いずれにしても、固定した各プライマー
は、一般に、溶液相第二プライマーを有し、よって、Ｈ
ＢＶゲノムの特定の領域を増幅のために標的化できる。
溶液相プライマーは、一般に、同定可能なシグナルを与
えることのできるリポーター分子を有する。増幅時に、
アレイ上の一定の位置内でのシグナルの存在は、特定の
ＨＢＶを分類するために使用できる。

【００６３】従って、本発明の別の態様は、ＨＢＶの同
じまたは異なる株または変異形からの１つ以上のＨＢＶ
由来ＤＮＡ標的配列を検出する方法に関し、前記方法
は、一本鎖形のＨＢＶ由来ＤＮＡを推定上含むサンプル
を、反応容器の固相支持体に個々にまたはアレイで固定
された２つ以上のプライマーと接触させ、ここでの反応
容器は、さらに、固相支持体に固定した対を有する溶液
相プライマーを含み、ここでの固定プライマーおよびそ
の溶液相対プライマーは、ＨＢＶ由来ＤＮＡの領域を増
幅条件下で増幅でき、ここでの溶液相プライマーは、同
定可能なシグナルを与えることのできるリポーター分子
を有し、よって固相支持体上の規定された位置でのシグ
ナルの存在は、特定のＨＢＶ単離株または変異形の同定
を可能とする、ことを含む。

【００６４】上記したように、好ましいプライマーは、
＜４００＞１および＜４００＞２或いは＜４００＞１ま
たは＜４００＞２に少なくとも約７０％の類似性を有す
るプライマー、並びに、厳密度の低い条件下で＜４００
＞１または＜４００＞２またはその相補体にハイブリッ
ドできるプライマーに示される。好ましくは、これら
は、化学合成により調製されるが、しかし、それらは制
限断片などの（しかしこれに限定されない）核酸分子の
断片として生成され得る。プライマーは、ＨＢｓＡｇの
主要親水性ループに変異を有するものなどの変異形を含
む、既知のＨＢＶ株の配列アラインメントに従って簡便
に選択される。約２０の連続したヌクレオチドが保存さ
れると示され、次いで、これらはＨＢＶゲノムの保存領
域のプライマー候補として選択される。

【００６５】本発明のさらに別の態様は、それ故、固相
支持体に固定した２つ以上のオリゴヌクレオチドプライ
マーのアレイを提供し、前記プライマーは、ＨＢＶ由来
ＤＮＡからの相補的ヌクレオチド配列にハイブリッドで
きる。

【００６６】好ましくは、プライマーがハイブリダイズ
する領域は、２つ以上のＨＢｓＡｇ変異形間に保存され
た約１０から約５０ヌクレオチドまでのヌクレオチド配
列内、近位または隣接である。

【００６７】好ましくは、アレイは、バイオチップまた
は他のマイクロ−マトリックス、マイクロタイターウェ
ルの壁、スライド、ディップスティックまたは他の適切
なマトリックスの形である。

【００６８】アレイはまた、検出可能なシグナルを提供
する固定アンプリマーの存在を検出できる、コンピュー
タープログラムによる解析に適応し得る。

【００６９】従って、本発明の別の態様は、ＨＢＶ由来
核酸配列を検出または同定するための、コンピューター
プログラムで補佐した方法を考え、前記方法は、（ｉ）
少なくとも２つのプライマーを含む１セットのプライマ
ーを使用した、増幅反応を実施するための手段（ここで
の、少なくとも１つのプライマーは、標的配列の１つの
鎖にハイブリッドでき、ここでの少なくとも１つの他の
プライマーは、前記の最初に記載した鎖に相補的な鎖に
ハイブリッドできる）；および（ｉｉ）同定可能なシグ
ナルの存在を記録するためのデータプロセシング手段を
含む。

【００７０】本発明のさらに別の態様は、マトリックス
上の座標（ｘ_１ｙ_１）、（ｘ_２ｙ_２）．．．（ｘ
_ｎｙ_ｎ）を有する、式ａ_１ａ_２．．．ａ_ｎにより定義さ
れるオリゴヌクレオチドのアレイを含むマトリックスの
使用を提供し、ここでのａ_１ａ_２．．．ａ_ｎは、計ｎ個
のオリゴヌクレオチドの同じまたは異なるオリゴヌクレ
オチドを示し、各オリゴヌクレオチドは、格子座標（ｘ
_１ｙ_１）、（ｘ_２ｙ_２）．．．（ｘ_ｎｙ_ｎ）により定義
でき、ここでのオリゴヌクレオチドは、ｂ_１ｂ_１．．．
ｂ_ｎにより定義される増幅対を有し、よって、オリゴヌ
クレオチドａ_１ｂ_１、ａ_２ｂ_２．．．ａ_ｎｂ_ｎは、ＨＢ
Ｖ由来ＤＮＡの相補鎖にハイブリッドでき、ここでの介
在ＤＮＡは、ＨＢｓＡｇ変異形などの２つ以上のＨＢＶ
変異形間に保存されたヌクレオチド配列を含み、ここで
のマトリックスは、ＨＢＶゲノムの保存増幅領域を有す
ることにより定義される特定のＨＢＶ因子を検出するの
に有用である。

【００７１】本発明のプライマーオリゴヌクレオチド
は、標的ＨＢＶ核酸のＰＣＲなどの増幅反応と共に使用
される。増幅プロセスは当分野で公知であるが、本発明
に従って使用するＰＣＲ手順に関するいくつかの一般的
情報が、明瞭化の目的で以下に強調されている。

【００７２】試験サンプル中の標的ＨＢＶ核酸配列を増
幅するために、配列は、増幅系の成分に到達できること
が必要である。これは、ＰＣＲ増幅の前に、サンプルか
らＨＢＶ標的核酸を単離することにより達成される。生
物学的サンプルから核酸分子を抽出する技術は、十分に
確立され広く使用されている（１２）。

【００７３】各ＰＣＲ増幅サイクルの第一段階は、例え
ば、サンプルを９５℃などの適切な温度で加熱すること
による、核酸二重鎖の分離を含む。一旦、鎖が分離する
と、ＰＣＲの次の段階は、分離した鎖を、標的配列にフ
ランキングするプライマーとハイブリッドさせることを
含む。次いで、プライマーを伸長して、相補的な標的鎖
のコピーを形成する。ＰＣＲ増幅のために、各プライマ
ーが二重配列に沿ってハイブリッドする位置が、１つの
プライマーから合成された伸長産物が、鋳型から分離し
た場合に、他のプライマーの伸長の鋳型として作用する
ように設計する。変性、ハイブリダイゼーションおよび
伸長のサイクルは、１サイクルから約１２０サイクルま
で、しかし一般には約３５サイクル反復し、ＰＣＲ増幅
により増幅産物に導入された変異の数を最小限にする。

【００７４】ＰＣＲ増幅における鋳型依存的プライマー
の伸長は、適切な量の４つのデオキシリボヌクレオシド
三リン酸（典型的には、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ
およびｄＴＴＰ）の存在下で、適切な塩、金属カチオン
およびｐＨ緩衝系を含む反応媒体中で、重合剤により触
媒される。適切な重合剤は、鋳型依存的ＤＮＡ合成を触
媒することが知られる酵素である。これらは、Ｔａｑポ
リメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓから
単離される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および高忠実
度Ｐｆｕポリメラーゼを含む。後者の酵素は、高い正確
度の増幅に広く使用される。ＰＣＲ増幅は、通常、熱安
定酵素を用いて自動プロセスとして実施される。このプ
ロセスでは、反応混合物の温度は、変性相、プライマー
アニーリング相および伸長反応相を通じて循環する。

【００７５】他の反応および非特異的増幅からの増幅核
酸によるＰＣＲ増幅の汚染を回避するために、実験測定
を行う。他の反応からの汚染を回避するために、適切な
塩、金属カチオンおよびｐＨ緩衝系、適切な量の４つの
デオキシリボヌクレオシド三リン酸（典型的には、ｄＡ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、ＤＮＡポリメ
ラーゼおよびプライマーオリゴヌクレオシドを含むが、
生物学的サンプルから単離されたウイルス標的核酸は除
外した、各反応混合物を、５分間、２６０ｎｍのＵＶ照
射にかける。この処理により、前増幅反応混合物中の全
ての潜在的な二本鎖ＤＮＡ分子は排除され、一方で、一
本鎖プライマーオリゴヌクレオチドおよび他の上記の反
応混合物の成分は無傷を維持する。一方、増幅ウイルス
核酸の配列解析は、非特異的増幅による汚染例を排除す
るだけでなく、増幅産物の性質、特に、現在の免疫をベ
ースとした診断アッセイを使用した検出からのウイルス
回避をもたらす、主要親水性ループ上のあり得る変異も
決定する。

【００７６】それ故、本発明は、本発明の方法に従って
同定したものなどの新規ＨＢＶ変異形を包含する。

【００７７】従って、本発明の別の態様は、一般に単離
形の、ＨＢＶ変異形を提供し、このＨＢＶ変異形は、Ｈ
ＢＶ由来核酸標的配列を検出する方法により同定され、
前記方法は、サンプルを変性条件にかけ、一本鎖形の前
記標的配列を生成し、変性サンプルを、少なくとも２つ
のプライマーを含む１セットのプライマーと接触させ、
ここでの、少なくとも１つのプライマーは、前記標的配
列の１つの鎖にハイブリッドでき、ここでの少なくとも
１つの他のプライマーは、前記の最初に記載した鎖に相
補的な鎖にハイブリッドでき、ここでの前記プライマー
は、その３’末端から伸長可能であり、前記の各プライ
マーがハイブリッドした鎖に相補的な伸長産物を形成
し、サンプルを、増幅を促進する条件にかけ、相補的伸
長産物を含む増幅産物を生成し、次いで、増幅産物の存
在について検出し、ここでの前記増幅産物の存在は、前
記ＨＢＶ由来核酸標的配列を示し、次いでかくして検出
した前記ＨＢＶを単離することを含む。

【００７８】本発明のさらに別の態様は、免疫学的マー
カーとして有用なペプチド、ポリペプチドまたはタンパ
ク質などの発現産物を同定するための、および／また
は、診断および／または治療法に使用する免疫グロブリ
ンを作成するための手段を提供する。

【００７９】本発明により同定されるＨＢＶのヌクレオ
チド配列は、様々な組換え発現系で使用できる。かかる
ヌクレオチド配列は、保存されていても可変でもよい。
後者の例は、ＨＢｓＡｇ上の修飾または新規エピトープ
である。かかる発現系により、所望の遺伝子、特に、Ｈ
ＢｓＡｇまたはその変異形をコードする遺伝子の適切な
発現が可能となる。原核生物および／または真核生物宿
主でのヌクレオチド配列の組換え発現は十分に確立され
ており、これらの発現されたタンパク質は、特定のＨＢ
ｓＡｇに特異的な免疫グロブリンを産生するのに使用さ
れる。次いで、免疫グロブリンは、ウイルスの存在を検
出するためのアッセイに使用できる。タンパク質はま
た、ＨＢＶに感染した患者における抗体の存在の検出に
も使用できる。

【００８０】所望のウイルス配列は、簡便には、発現用
の哺乳動物、酵母または昆虫細胞系に、標準的な技術を
使用して形質転換／トランスフェクションする前に、適
切なベクターに挿入する。原核生物が、好ましくは、中
間クローニング段階に使用されるが、所望のウイルス配
列の高レベルの誘導発現にも効率的に使用できる。

【００８１】変化した遺伝子物質を、ウイルス配列の発
現のために宿主細胞に導入するために使用する具体的な
手順は、特に重要ではない。外来ヌクレオチド配列を宿
主細胞に導入する公知の手順のいずれかを使用し得る。
これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、電
気穿孔法、リポソーム、プラスミドベクター、ウイルス
ベクターおよびクローン化ウイルスＤＮＡ、特に、試験
サンプル（これはウイルスマーカーを示しても示さなく
てもよく、免疫をベースとした診断試験により検出され
てもされなくてもよい）中で本発明により同定されるも
のの任意の他の十分に確立された導入法を含む。

【００８２】遺伝子情報を細胞に輸送するに使用される
具体的なベクターは、特に重要ではない。真核細胞での
組換えタンパク質の発現に使用される慣用的なベクター
のいずれかを使用し得る。

【００８３】発現ベクターは、真核細胞でウイルス核酸
配列の発現に必要な全てのエレメントを含む、真核生物
転写単位または発現カセットを含む。典型的な発現カセ
ットは、ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ配列に
作動可能に連結したプロモーターおよび転写ｍＲＮＡの
効率的なポリアデニル化に必要なシグナルを含む。

【００８４】本発明の発現ベクターは、典型的には、細
菌（例えばＥ．コリ）でのベクターのクローニングを容
易にする原核生物の配列、並びに、哺乳動物細胞などの
真核細胞でのみ発現される１つ以上の真核生物転写単位
の両方を含む。ベクターは、真核生物レプリコンを含ん
でも含まなくてもよい。かかるレプリコンが存在する場
合、次いで、ベクターを、適切な選択マーカーを使用し
て真核細胞で増幅できる。ベクターが真核生物レプリコ
ンを含まない場合、エピソーム的増幅は不可能である。
この条件下で、トランスフェクトされたＤＮＡは、宿主
細胞のゲノムに取込まれ、ウイルス遺伝子発現が、発現
ベクター上の同時に取り込まれた哺乳動物プロモーター
により駆動される。

【００８５】発現ベクターが細胞に導入された後、トラ
ンスフェクトされた細胞を、ウイルスタンパク質の発現
に好ましい条件下で培養し、タンパク質を標準的な技術
を使用して培養液から精製する。例えば、アフィニティ
ークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー
およびイオン交換クロマトグラフィーなどの、多くの標
準的なタンパク質精製手順が使用できる。

【００８６】所望のウイルスゲノムによりコードされる
タンパク質の使用に加えて、ウイルスに特異的なエピト
ープを模倣したペプチドもまた、ウイルスに特異的な抗
体の産生に使用できる。

【００８７】次いで、上記で議論した精製ポリペプチド
または合成ペプチドは、標準的な手順を使用して、抗体
の産生に使用される。免疫グロブリンは、様々な適用に
使用し得る。例えば、それらを使用して、試験サンプル
中のウイルスの存在をアッセイできるか、または例え
ば、アフィニティクロマトグラフィーを使用して、ウイ
ルス抗原を精製できる。またそれらを使用して、全ウイ
ルスの感染性の阻害を含む、対応するウイルスタンパク
質を中和し得る。従って、様々な免疫グロブリンの製造
および操作に利用できる多くの技術が、試験サンプル
（これはウイルスマーカーを示しても示さなくてもよ
く、免疫をベースとした診断試験により検出されてもさ
れなくてもよい）中の特定のＨＢＶ株の診断および検出
に有用な分子を産生するために容易に適用できる。

【００８８】所望のＨＢＶ株に特異的なエピトープに結
合する抗体は、様々な手段により産生し得る。非ヒトモ
ノクローナル抗体（例えばネズミ）の産生は公知であ
り、動物をウイルスまたはその断片を含む調製物で免疫
化することにより達成され得る。免疫化動物から得られ
た抗体産生細胞を不死化させ、標準的な技術を使用して
スクリーニングする。

【００８９】次いで、上記のように産生した免疫グロブ
リンは、試験サンプル（これはウイルスマーカーを示し
ても示さなくてもよく、免疫をベースとした診断試験に
より検出されてもされなくてもよい）中のＨＢＶ株の存
在についての様々な診断アッセイに使用できる。例え
ば、標識免疫グロブリンは、免疫グロブリンを、ＨＢＶ
株（これはウイルスマーカーを示しても示さなくてもよ
く、免疫をベースとした診断試験により検出されてもさ
れなくてもよい）を含むがことが疑われる試験サンプル
と接触させ、複合体が形成されたかを検出することを含
むアッセイに使用できる。様々な標識を使用して免疫グ
ロブリンに結合させ得る。一般的な検出法は、^１２５Ｉ
または^３５Ｓを用いたオートラジオグラフィーの使用で
ある。非放射性標識も使用し得る。かかる標識は、化学
発光剤および酵素を含む。これらの非放射性標識は、し
ばしば、間接的な手段により付着させる。一般に、リガ
ンド分子（例えばビオチン）は、分子に共有結合する。
次いで、リガンドを、本来検出可能であるかまたはシグ
ナル系、例えば検出可能な酵素、蛍光化合物または化学
発光化合物などに共有結合した抗リガンド（例えばスト
レプトアビジン）に結合する。

【００９０】分子はまた、例えば酵素とコンジュゲート
させることにより、シグナル発生化合物に直接的にコン
ジュゲートできる。標的としての目的の酵素は、ホスフ
ァターゼまたはペルオキシダーゼであり得る。

【００９１】複合体の存在を検出するために、混合物
を、二次抗体、プロテインＡまたはプロテインＧなど
の、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合できるタンパク質
と接触させる。タンパク質は、好ましくは、固相表面に
固定し、固相表面を洗浄して、所望のウイルスに特異的
な非結合免疫グロブリンを除去する。生体分子を固定す
る多くの方法を使用できる。例えば、固相表面は、膜
（例えばニトロセルロース）、マイクロタイター皿（例
えばポリスチレン）またはビーズであり得る。所望の成
分は、非特異的結合を介して、共有結合または非共有結
合し得る。次いで、標識を標準的な技術を使用し指向す
る。

【００９２】組換え発現および精製ウイルスタンパク質
またはウイルス溶解液も、診断手順に使用し得る。これ
らの手順は、典型的には、ＨＢＶに対する抗体を含むが
ことが疑われる生物学的サンプル（例えば血清）に接触
させ、免疫反応を検出することを含む。反応は、好まし
くは、上記の標識タンパク質を使用して検出する。

【００９３】それ故、本発明の方法は、ＨＢｓＡｇなど
のＨＢＶタンパク質の保存領域に対応し得る、ＨＢＶゲ
ノムの保存領域の同定に有用である。この方法はまた、
可変領域も同定し得る。結果として、保存領域に対応す
るペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、ワクチ
ン組成物としておよび診断試験に有用である。同様に、
可変領域を網羅するペプチド、ポリペプチドおよびタン
パク質は、特定のＨＢＶ変異形に特異的なワクチンにま
たは診断剤として有用であり得る。

【００９４】それ故、本発明は、２つ以上のＨＢＶ単離
株の間の保存アミノ酸配列を包含する、またはＨＢＶ野
生型とは異なる、アミノ酸配列を含む、組換えまたは化
学合成ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質または
誘導体、その相同体または類似体を提供する。ＨＢＶ野
生型は、ＨＢＶ遺伝子型ＥおよびＡからＦの、複合体ま
たは共通ヌクレオチドまたはアミノ酸配列を含むと考え
られる（１３）。

【００９５】「誘導体」は、単一または複数のアミノ酸
置換、付加および／または欠失を含むポリペプチドを含
むポリペプチドの一部、部分、断片、区分または領域を
含む。簡潔には、ペプチドおよびタンパク質は、「ポリ
ペプチド」なる語により包含される。

【００９６】本発明は、側鎖が修飾されたものおよび／
または非天然アミノ酸を取り込んだものを含む、主題ポ
リペプチドの化学的類似体に及ぶ。かかる化学的に修飾
されたまたは合成のポリペプチド類似体は、診断剤とし
て使用するのにまたは治療に使用するのに、より安定で
あり得る。

【００９７】本発明により考えられる側鎖修飾の例は、
アルデヒドとの反応、次いでＮａＢＨ_４での還元による
還元的アルキル化；メチルアセトイミデートを用いたア
ミド化；無水酢酸を用いたアシル化；シアネートを用い
たアミノ基のカルバモイル化；２，４，６−トリニトロ
ベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いたアミノ基のト
リニトロベンジル化；無水コハク酸および無水テトラヒ
ドロフタル酸を用いたアミノ基のアシル化；およびピリ
ドキサール−５−リン酸を用いたリジンのピリドキシル
化、次いでＮａＢＨ_４による還元などのアミノ基の修飾
を含む。

【００９８】アルギニン残基のグアニジン基は、２，３
−ブタンジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオ
キサールなどの試薬によるヘテロ環縮合生成物の形成に
より修飾し得る。

【００９９】カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソ尿素形
成を介したカルボジイミド活性化、続く、例えば対応す
るアミドへの誘導体化により修飾し得る。

【０１００】スルフヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨ
ードアセトアミドによるカルボキシメチル化；過ギ酸の
システイン酸への酸化；他のチオール成分による混合ジ
スルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または
他の置換マレイミドとの反応；４−クロロメルクリ安息
香酸、４−クロロメルクリフェニルスルホン酸、フェニ
ルメルクリクロリド、２−クロロメルクリ−４−ニトロ
フェノールおよび他の水銀を使用した水銀誘導体の形
成；アルカリ性ｐＨでのシアネートによるカルバモイル
化などの方法により修飾し得る。

【０１０１】トリプトファン残基は、例えば、Ｎ−ブロ
モスクシンイミドによる酸化またはインドール環の２−
ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミドまたはスルフ
ェニルハロゲン化物によるアルキル化により修飾し得
る。一方、チロシン残基は、テトラニトロメタンによる
ニトロ化により、３−ニトロチロシン誘導体を形成する
ことにより変化させ得る。

【０１０２】ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾
は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化またはジエチル
ピロカーボネートによるＮ−カルベトキシ化により達成
し得る。

【０１０３】ペプチド合成中の非天然アミノ酸および誘
導体の取込み例は、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、４
−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、
６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリ
ン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４−
アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、２−
チエニルアラニンおよび／またはアミノ酸のＤ−異性体
の使用を含むがこれに限定されない。本明細書で考えら
れる非天然アミノ酸のリストを表１に示す。

【０１０４】

【表１】

【０１０５】本発明のポリペプチドは、ＨＢＶまたはＨ
ＢＶ変異形に対してワクチン接種するために医薬組成物
に使用し得る。医薬組成物は、主題ポリペプチド並びに
１つ以上の医薬的に許容される担体および／または希釈
剤を含む。

【０１０６】医薬的に許容される担体および／または希
釈剤は、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティン
グ、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延
剤等を含む。医薬活性物質用のかかる媒体および薬剤の
使用は、当分野で公知である。任意の慣用的な媒体また
は薬剤が活性成分と適合性である限り、その治療組成物
における使用が考えられる。補助活性成分も、組成物に
取込むことができる。

【０１０７】医薬組成物はまた、標的細胞をトランスフ
ェクトできるベクターなどの遺伝分子を含み得、ここで
のベクターは、主題ポリペプチドをコードするまたはリ
ボザイムをコードする核酸分子、或いは、ＨＢＶ由来遺
伝子配列に対するアンチセンス分子を有する。ベクター
は、例えば、ウイルス性、細菌性または真核生物ベクタ
ーであり得る。

【０１０８】上記のように、本発明はさらに、主題ポリ
ペプチドに対する抗体におよぶ。抗体は、モノクローナ
ルまたはポリクローナルであり得る。かかる抗体は、治
療法および診断アッセイに有用である。

【０１０９】本発明の別の態様は、被検者からの生物学
的サンプル中のＨＢＶを検出する方法を考え、前記方法
は、前記生物学的サンプルを、ＨＢＶに特異的な抗体ま
たはその変異形と、抗体−ＨＢＶ複合体が形成するに十
分な時間および条件下で接触させ、次いで前記複合体を
検出することを含む。

【０１１０】ＨＢＶの存在は、ウェスタンブロットおよ
びエリザ手順により任意の数の方法で達成され得る。米
国特許第４，０１６，０４３号、第４，４２４，２７９
号、および第４，０１８，６５３号を参照して分かるよ
うに、多種多様なイムノアッセイ技術が利用可能であ
る。これらは、非競合型の単一点および二点の両方また
は「サンドイッチ」アッセイ、並びに、伝統的な競合結
合アッセイを含む。これらのアッセイはまた、標的への
標識抗体の直接的結合も含む。

【０１１１】サンドイッチアッセイは、最も有用で一般
的に使用されるアッセイの１つであり、本発明の使用に
好ましい。サンドイッチアッセイ技術の多くの変形が存
在し、全て本発明により包含されると捉える。簡潔に
は、典型的な正アッセイにおいて、非標識抗体を、固相
基質に固定し、試験すべきサンプルを結合分子と接触さ
せる。抗体−抗原複合体が形成されるに十分な期間、適
切な期間インキュベートした後、次いで、検出可能なシ
グナルを発生できるリポーター分子で標識した、抗原に
特異的な第二抗体を加え、抗体−抗原標識抗体の別の複
合体が形成されるに十分な期間、インキュベートする。
任意の非反応物質を洗浄して除去し、抗原の存在を、リ
ポーター分子により発生するシグナルの観察により決定
する。結果は、可視シグナルを単に観察することにより
定量し得るか、または、既知量のハプテンを含む対照ア
ンプルと比較することにより定量し得る。正アッセイの
変形は、サンプルおよび標識抗体の両方を同時に結合抗
体に加える、同時アッセイを含む。これらの技術は、当
業者には公知であり、任意の小さな変形も含まれること
は容易に理解される。本発明に従って、サンプルは、Ｈ
ＢＶまたはＨＢＶ由来ポリペプチドを含み得るものであ
り、細胞抽出物、組織生検またはおそらく血清、唾液、
粘膜分泌物、リンパ、組織液および呼吸器液を含む。そ
れ故、サンプルは、一般に、生物学的液体を含む生物学
的サンプルであるが、細胞培養液などからの発酵液およ
び上澄み液にもおよぶ。

【０１１２】典型的な正サンドイッチアッセイにおい
て、ＨＢＶに特異性を有する第一抗体またはその抗原性
部分は、固相表面に共有結合的にまたは受動的に結合し
ている。固相表面は、典型的には、ガラスまたはポリマ
ーであり、最も一般的に使用されるポリマーはセルロー
ス、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポ
リ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固相支持体
は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートのディスク、
またはイムノアッセイの実施に適した任意の他の表面の
形であり得る。結合プロセスは、当分野で公知であり、
一般に、架橋の共有結合的な結合または物理的吸着から
なり、試験サンプルの調製物中のポリマー−抗体複合体
を洗浄する。次いで、試験すべきサンプルのアリコート
を、固相複合体に加え、十分な期間（例えば、２〜４０
分間またはより簡便であれば一晩）および適切な条件下
（例えば、室温から約３７℃、例えば約２５℃）でイン
キュベートし、抗体に存在する全てのサブユニットを結
合させる。インキュベート期間後、抗体サブユニット固
相を洗浄し、乾燥させ、ハプテン部分に特異的な第二抗
体と共にインキュベートする。第二抗体は、ハプテンへ
の第二抗体の結合を示すために使用される、リポーター
分子に連結している。

【０１１３】代替の方法は、生物学的サンプル中の標的
分子を固定し、次いで、固定した標的を、特異的抗体
（これはリポーター分子で標識してもしていなくてもよ
い）に曝露することを含む。標的の量およびリポーター
分子シグナルの強度に応じて、結合した標的は、抗体で
直接的に標識することにより検出可能であり得る。

【０１１４】別法として、第一抗体に特異的な第二標識
抗体を、標的−第一抗体複合体に曝露し、標的−第一抗
体−第二抗体三次複合体を形成する。複合体は、リポー
ター分子により放出されるシグナルにより検出される。

【０１１５】本明細書に使用したような「リポーター分
子」により、その化学的性質により、抗原に結合した抗
体の検出を可能とする分析的に同定可能なシグナルを提
供する、分子を意味する。検出は定性的でも定量的でも
よい。この型のアッセイで最も一般的に使用されるリポ
ーター分子は、酵素、フルオロフォアまたは放射性核種
含有分子（すなわち放射性同位体）および化学発光分子
である。

【０１１６】酵素イムノアッセイの場合、酵素は、一般
に、グルタルアルデヒドまたはペリオデートにより、第
二抗体にコンジュゲートする。しかし、容易に認識され
るように、多種多様な異なるコンジュゲート技術が存在
し、当業者には容易に利用できる。一般的に使用される
酵素は、とりわけ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、
グルコースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼおよびアル
カリホスファターゼを含む。特定の酵素と共に使用され
る基質は、一般に、対応する酵素による加水分解時に、
検出可能な色変化を発生するものについて選択される。
適切な酵素の例は、アルカリホスファターゼおよびペル
オキシダーゼを含む。また、上記の化学原生基質ではな
く蛍光産物を生じる、蛍光原生基質も使用できる。全て
の場合において、酵素−標識抗体を第一抗体ハプテン複
合体に加え、結合させ、次いで、過剰の試薬を洗浄し除
去する。次いで、適切な基質を含む溶液を、抗体−抗原
−抗体の複合体に加える。基質は、第二抗体に連結した
酵素と反応し、可視シグナルを与え、これは、さらに、
通常、分光光学的に定量すると、サンプル中に存在した
ハプテンの量の指標が得られ得る。「リポーター分子」
はまた、ラテックスビーズ上の赤血球などの細胞凝集ま
たは凝集阻害の使用にもおよぶ。

【０１１７】別法として、フルオレセインおよびローダ
ミンなどの蛍光化合物は、その結合能を変化させること
なく、抗体に化学的に結合させ得る。特定の波長の光で
照射して活性化すると、蛍光色素標識抗体は、光エネル
ギーを吸収し、分子を励起状態に誘導し、次いで、特徴
的な色の発光を、光学顕微鏡で可視的に検出できる。Ｅ
ＩＡのように、蛍光標識抗体を、第一抗体−ハプテン複
合体に結合させる。非結合試薬を洗浄して除去した後、
次いで、残りの三次複合体を適切な波長の光に曝露し、
観察された蛍光は、目的のハプテンの存在を示す。免疫
蛍光およびＥＩＡ技術は、両方共、当分野で十分によく
確立されており、本発明の方法に特に好ましい。しか
し、放射性同位体、化学発光分子または生物発光分子な
どの、他のリポーター分子も使用し得る。

【０１１８】本発明は、以下の非制限的な実施例により
さらに説明される。

【０１１９】

【実施例】実施例１シンガポール人の成人および高い抗ＨＢｓレベルを有す
るが表面抗原については陰性であるワクチン接種した小
児における、ＨＢＶ表面抗原変異体の検出および同定シンガポール人の成人およびＨＢｓＡｇは陰性のワクチ
ン接種した小児における、ＨＢＶＤＮＡの存在を、本
発明に提供されるプライマーオリゴヌクレオチドを使用
して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により調べ
る。６３人の成人、並びに、４つの独立的な市販の免疫
をベースとした診断キットによりＨＢｓＡｇについて試
験して陰性であった、異なる民族グループからの１５人
のワクチン接種した小児（１５歳以下の年齢で、組換え
ワクチンを接種された）を選択する（表２）。彼等は全
員、ＨＢＶコア抗原に対する全抗体（抗ＨＢｃ）につい
て陽性である（Ｃｏｒｚｙｍｅ、アボット・ラボラトリ
ーズ、米国）。全員が、抗ＨＢｓにも陽性である（Ａｕ
ｓａｂ、アボット・ラボラトリーズ、米国）（表２）。
１００μｌの血清からのＤＮＡを、プロテイナーゼＫ処
理し、次いでクロロホルム／フェノール抽出およびエタ
ノール沈降により抽出する。本発明で提供されるオリゴ
ヌクレオチドを、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタ
ジーン、米国）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）増幅に利用する。増幅は、３５サイクル実施し、そ
れらの各々は、９４℃（１分間）の変性、５０℃（２分
間）のアニーリング、および７３℃（３分間）の伸長か
らなる。結果により、ＨＢＶＤＮＡは、本発明で提供
されるプライマーオリゴヌクレオチドを使用して、１５
人中３人の小児（２０％）および６３人中８人（１３
％）の成人において増幅されることが示される。このＨ
ＢｓＡｇ陰性小児のグループにおけるＨＢｓＡｇ変異体
の同定は、試験してＨＢｓＡｇ陽性であったワクチン接
種したシンガポールの小児におけるＨＢｓＡｇ変異体の
検出に関する我々の以前の報告と比較して、異なる状況
を示した。ＨＢＶＤＮＡは、このワクチン接種した小
児のグループにおいて、全サンプル中で本発明に提供さ
れるプライマーオリゴヌクレオチドを使用して増幅され
る。

【０１２０】増幅ＤＮＡ断片の直接的シークエンスによ
り、これらのサンプル中のＭＨＲの様々な位置の変異が
判明した（表２）。これらは、６例において、最も一般
的なワクチン回避Ｇ１４５Ｒを含む。また、一例の報告
においてラミブジン療法に関連していると近年判明し
た、Ｇ１３０Ｄ変異（表２）が３例ある。さらに、Ｔ１
３１Ｎ変異は、４例に同定される。ＨＢｓＡｇ上に同時
にＴ１１４Ｓを常に有する、報告された遺伝子型関連Ｔ
１３１Ｎ変異とは異なり、本発明で提供されるプライマ
ーオリゴヌクレオチドを使用して同定したＴ１３１Ｎ変
異は、残基１１４に野生型Ｓ（セリン）を有する。これ
は、次いで、それが欠失を回避できる変異形であり得る
ことを示唆する。

【０１２１】当業者は、本明細書に記載した本発明は、
具体的に記載したもの以外の変形および修飾を受けるこ
とができることを理解するだろう。本発明は、全てのか
かる変形および修飾を含むと理解される。本発明はま
た、個々にまたはまとめて、本明細書に言及したまたは
示した全ての段階、特徴、組成物および化合物、並び
に、任意の２つ以上の前記段階または特徴の任意および
全ての組合せを含む。

【０１２２】

【表２】

【０１２３】（参考文献） 1. Carmen et al. Gastroenterology 102:711-719, 199
2. 2. Carmen et al. Lancet 336:325-329, 1990. 3. Okamoto et al. Paediatric Research 32:264-268,
1992. 4. McMahon et al. Hepatology 15:757-766, 1992. 5. Fujii et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 18
4:1152-1157, 1992. 6. Harrison et al. Hepatol. 13:5105-5107, 1991. 7. Chen et al. FEBS Lett. 453:237-242, 1999. 8. Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389. 199
7. 9. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular
Biology"John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter
15. 10. Bonner and Laskey Eur. J. Biochem. 46: 83, 197
4. 11. Marmur and Doty J. Mol. Biol. 5: 109, 1962. 12. Oon et al. Vaccine 13: 699-702, 1999

【０１２４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> GOVERNMENT OF THE REPUBLIC OF SINGAPORE <120> DIAGNOSTIC ASSAY <130> SFP-5684 <140> <141> <150> SG 200004041-0 <151> 2000-7-18 <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 1 caaggtatgt tgcccgtttg t 21 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 2 tggctcagtt tactagtgcc att 23 <210> 3 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 3 gaattc 6

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＨＢＶ表面抗原の構造組織を示す概略
図である。（Ａ）保存「ａ」決定基を網羅する主要親水
性ループの位置（Ｃｈｅｎ等（７）から適応）。アミノ
酸残基の全長ＨＢｓＡｇのサイズが示される（１〜４０
０）。ｐｒｅＳ１（１〜１１８）、ｐｒｅＳ２（１１９
〜１７４）および主要ＨＢｓＡｇ（１７５〜４００）の
位置はボックスの下に示される。全長ＨＢｓＡｇに関連
した主要親水性ループの位置も示す。主要ＨＢｓＡｇ内
の主要親水性ループの対応する位置（ＳＨＢｓＡｇ）
は、アミノ酸１００〜１６０であり、保存「ａ」決定基
はＳＨＢｓＡｇ内の１２４〜１４７である。（Ｂ）ＳＨ
ＢｓＡｇをコードする領域のゲノム位置。コード領域の
５’および３’末端の位置はボックスの下に示す（ＨＢ
Ｖゲノムのそれぞれｎｔ１５６および８３５、位置１
は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｚ３５７１７の野生型ＨＢ
ＶのＥｃｏＲＩ部位−ＧＡＡＴＴＣ（＜４００＞３）の
最初のＡヌクレオチドとして定義する）。本発明で提供
されるプライマーオリゴヌクレオチドの位置（＜４００
＞１および＜４００＞２）も、ボックスの下に示す（Ｈ
ＢＶゲノムのそれぞれｎｔ４５６および６８９から始ま
る）。本発明のプライマーオリゴヌクレオチドを使用し
たＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片のサイズ（＜４００＞１および
＜４００＞２）は、ボックスの下に示したように、２３
３塩基対（ｂｐ）である。

【図２】図２は、本発明に提供されるプライマーオリゴ
ヌクレオチド（＜４００＞１および＜４００＞２）を使
用して、免疫をベースとした診断キットによりＨＢｓＡ
ｇについては陰性であるが、抗ＨＢｃおよび抗ＨＢｓに
ついては陽性である、試験サンプルからのＰＣＲ増幅Ｈ
ＢＶ断片の電気泳動パターンを示す写真図である。レー
ン４に示されるのは、分子サイズマーカーの移動位置で
ある（１００ｂｐラダー、ＭＢＩＦｅｒｍｅｎｔａ
ｓ）。レーン１は、表１の最初の試験サンプルに対応
し；レーン２は、表１の第二の試験サンプルに対応す
る。レーン６および９は、表１のそれぞれ第三および第
四の試験サンプルに対応する。類似のウイルスマーカー
（ＨＢｓＡｇについては陰性、抗ＨＢｃおよび抗ＨＢｓ
については陽性）を示す試験サンプルを示す、レーン
３、５、７および８には増幅産物は見られない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＭＣ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 33/576 Ｂ 33/566 Ｃ０７Ｋ 16/08 33/576 Ｃ１２Ｒ 1:93 // Ｃ０７Ｋ 16/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｑ 1/68 ＦＣ１２Ｒ 1:93） (72)発明者ウェイ・ニン・チェンシンガポール 080104 スポッティスウッデパークロードナンバー 22−114 ブロック 104 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA04 CA20 HA11 HA20 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ10 QQ34 QQ43 QR32 QR62 QR82 QS11 QS12 QS25 QS36 4B065 AA96Y CA46 4C085 AA13 AA14 CC32 DD62 EE01 GG01 4H045 AA11 AA20 DA75 EA53 FA72

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】サンプル中のＨＢＶ由来核酸標的配列を
検出する方法であって、前記方法は、サンプルを変性条
件にかけ、一本鎖形の前記標的配列を生成し、変性サン
プルを、少なくとも２つのプライマーを含む１セットの
プライマーと接触させ、ここでの、少なくとも１つのプ
ライマーは、前記標的配列の１つの鎖にハイブリッドで
き、ここでの少なくとも１つの他のプライマーは、前記
の最初に記載した鎖に相補的な鎖にハイブリッドでき、
ここでの前記プライマーは、その３’末端から伸長可能
であり、前記の各プライマーがハイブリッドした鎖に相
補的な伸長産物を形成し、そして、サンプルを、増幅を
促進する条件にかけ、相補的伸長産物を含む増幅産物を
生成し、次いで、増幅産物の存在について検出し、ここ
での前記増幅産物の存在は、前記ＨＢＶ由来核酸標的配
列を示す、ことを含む、前記方法。
【請求項２】プライマーは、ＨＢｓＡｇをコードする
ヌクレオチド配列内または一部のヌクレオチド配列に対
応するまたはフランキングする領域にハイブリッドす
る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】プライマーは、ＨＢｓＡｇをコードする
ヌクレオチド配列の一部内の保存ヌクレオチド配列に対
応するまたはフランキングする領域にハイブリッドす
る、請求項２に記載の方法。
【請求項４】最初に、サンプルを、逆転写条件にか
け、ＨＢＶ由来ｍＲＮＡからの一本鎖または二本鎖ｃＤ
ＮＡ分子を生成することをさらに含む、請求項１または
２または３に記載の方法。
【請求項５】前記プライマーの１つを、同定可能なシ
グナルを与えることができるリポーター分子で標識し、
前記プライマーの他方を捕獲可能な部分で標識する、請
求項１に記載の方法。
【請求項６】サンプル中のＨＢＶ由来ＤＮＡ標的配列
を検出する方法であって、前記方法は、前記サンプル
を、固相支持体に固定したプライマーおよび溶液相中の
第二プライマーを有する反応容器に導入し、ここでの両
方のプライマーが、ＨＢＶゲノム上の保存領域内、近位
または隣接の領域のＨＢＶ由来ＤＮＡの相補的一本鎖上
の相補的ヌクレオチド配列にハイブリッドでき、ここで
の溶液相プライマーは、同定可能なシグナルを与えるこ
とができるリポーター分子で標識され、反応容器を、増
幅を促進する条件にかけ、次いで、同定可能なシグナル
の存在を検出し、ここでの前記シグナルの存在は、ＨＢ
Ｖ由来ＤＮＡの存在を示す、ことを含む、前記方法。
【請求項７】ＨＢＶの同じまたは異なる株または変異
形からの１つ以上のＨＢＶ由来ＤＮＡ標的配列を検出す
る方法であって、前記方法は、一本鎖形のＨＢＶ由来Ｄ
ＮＡを推定上含むサンプルを、反応容器の固相支持体に
個々にまたはアレイで固定した２つ以上のプライマーと
接触させ、ここでの反応容器は、さらに、固相支持体に
固定した対を有する溶液相プライマーを含み、ここでの
固定プライマーおよびその溶液相対プライマーは、ＨＢ
Ｖ由来ＤＮＡの領域を増幅条件下で増幅でき、ここでの
溶液相プライマーは、同定可能なシグナルを与えること
のできるリポーター分子を有し、よって固相支持体上の
規定された領域でのシグナルの存在は、特定のＨＢＶ単
離株または変異形の同定を可能とする、ことを含む、前
記方法。
【請求項８】固相支持体に固定した２つ以上のオリゴ
ヌクレオチドプライマーのアレイであって、前記プライ
マーは、ＨＢＶ由来ＤＮＡからの相補的ヌクレオチド配
列にハイブリッドできる、前記アレイ。
【請求項９】アレイは、マトリックス上の座標（ｘ_１
ｙ_１）、（ｘ_２ｙ_２）．．．（ｘ_ｎｙ_ｎ）を有する、式
ａ_１ａ_２．．．ａ_ｎにより定義され、ここでのａ
_１ａ_２．．．ａ_ｎは、計ｎ個のオリゴヌクレオチドの同
じまたは異なるオリゴヌクレオチドを示し、各オリゴヌ
クレオチドは、格子座標（ｘ_１ｙ_１）、（ｘ
_２ｙ_２）．．．（ｘ_ｎｙ_ｎ）により定義でき、ここでの
オリゴヌクレオチドは、ｂ_１ｂ_１．．．ｂ_ｎにより定義
される増幅対を有し、よって、オリゴヌクレオチドａ_１
ｂ_１、ａ_２ｂ_２．．．ａ_ｎｂ_ｎは、ＨＢＶ由来ＤＮＡの
相補鎖にハイブリッドでき、ここでの介在ＤＮＡは、Ｈ
ＢｓＡｇ変異形などの２つ以上のＨＢＶ変異形間に保存
されたヌクレオチド配列を含み、ここでの前記マトリッ
クスは、前記ＨＢＶ由来ＤＮＡの保存増幅領域を有する
ことにより定義される特定のＨＢＶ因子を検出するのに
有用である、請求項８に記載のアレイ。
【請求項１０】プライマーは、＜４００＞１および＜
４００＞２またはそれに少なくとも７０％の類似性を有
するプライマーまたは厳密度の低い条件下で＜４００＞
１または＜４００＞２にハイブリッドできるプライマー
から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】一般に単離形である、ＨＢＶ変異形で
あって、前記ＨＢＶ変異形は、ＨＢＶ由来核酸標的配列
を検出する方法により同定され、前記方法は、サンプル
を、変性条件にかけ、一本鎖形の前記標的配列を生成
し、変性サンプルを、少なくとも２つのプライマーを含
む１セットのプライマーと接触させ、ここでの少なくと
も１つのプライマーは、前記標的配列の１つの鎖にハイ
ブリッドでき、ここでの少なくとも１つの他のプライマ
ーは、前記の最初に記載した鎖に相補的な鎖にハイブリ
ッドでき、ここでの前記プライマーは、その３’末端か
ら伸長可能であり、前記の各プライマーがハイブリッド
した鎖に相補的な伸長産物を形成し、そして、サンプル
を増幅産物の生成を促進する条件にかけ、相補的伸長産
物を含む増幅産物を生成し、次いで、増幅産物の存在を
検出し、ここでの前記増幅産物の存在は、前記ＨＢＶ由
来核酸標的配列を示し、次いでかくして検出した前記Ｈ
ＢＶを単離することを含む、前記ＨＢＶ変異形。
【請求項１２】免疫マーカーとして有用なペプチド、
ポリペプチドまたはタンパク質などの発現産物を同定す
るための、および／または、診断および／または治療法
に使用するための免疫グロブリンを生成するための手
段。