JP3790274B2 - Ｃ型肝炎ウイルスの検出のための試薬および方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は非Ａ非Ｂ肝炎の原因であるＣ型肝炎ウイルスの検出のための試薬および方法を提供するものである。試薬には特にウイルスＲＮＡゲノムの逆転写およびそれに続くポリメラーゼ連鎖反応による逆転写により作製されたｃＤＮＡの増幅の両者のためのオリゴヌクレオチドプライマーが含まれる。配列特異的オリゴヌクレオチドプローブは増幅されたＨＣＶの核酸配列の検出のために準備される。プライマーおよびプローブはＨＣＶ感染の検出のための診断試験に有効である。この診断試験は臨床および伝染病学的環境で重要な応用性をもつ。
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は非Ａ非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）の計り知れないほど多くの原因の一つである。原型ＨＣＶはＣｈｏｏらにより１９８９年にＳｃｉｅｎＣｅ、第２４４巻：３５９から３６２ページで報告されたように、感染チンパンジーの血漿から得られた血液由来のＮＡＮＢＨウイルスのｃＤＮＡクローンから同定された。この原型ＨＣＶの遺伝子のヌクレオチド配列は欧州特許公示第３１８，２１６号；第３８８，２３２号および第３９８，７４８号で記述されている。ＨＣＶゲノムのヌクレオチド配列はＣｈｏｏらの１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８８巻：２４５１から２４５５ページに報告され、関連ウイルスと比較された。
【０００３】
それ以来他の株の配列が報告されている。ＨＣＶのゲノムは単離株の間で非常に大きな核酸配列の不均一性を示す。ＨＣＶのＲＮＡゲノムのｃＤＮＡの分離がＫｕｂｏｅｔらの１９８９年、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第１７巻、１０３６７から１０３７２ページに報告された。著者らは上述のＣｈｏｏらが１９８９年に報告した配列に基づく逆転写プライマーを構築した。分離されたＨＣＶゲノムの断片は原型ＨＣＶの配列と７９．８％のホモロジーを示した。類似のプロトコールにより得られた三種の異なる領域の配列が、Ｔａｋｅｕｃｈｉらにより、１９９０年、Ｇｅｎｅ、第９１巻：２８７から２９１ページに報告された。原型配列との配列ホモロジーが一つの領域について７３．５％程度であることが報告された。
【０００４】
日本人患者から分離された株のＨＣＶのゲノム配列がＫａｔｏらにより１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８７巻：９５２４から９５２８ページに報告された。配列は比較された領域全体で原型ＨＣＶのゲノムと７７．４％のホモロジーを示した。Ｔａｋａｍｉｚａｗａらにより１９９１年にＪ．Ｖｉｒｏｌ．、第６５巻（第３号）：１１０５から１１１３ページに報告されたＨＣＶゲノムの全コーディング領域の配列は原型ＨＣＶ株と７７％のホモロジーを示した。
【０００５】
日本では、Ｋ１およびＫ２と命名された、ゲノムの４００ヌクレオチド領域に基づく二つの主たる株が観察されている。これらの株は原型ＨＣＶ配列と６７％程度の配列ホモロジーをもつ（Ｅｎｏｍｏｔｏらの１９９０年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第１７０巻（第３号）：１０２１から１０２５ページを参照せよ）。Ｋ２株はさらに、グループ間で約２０％のヌクレオチド変異およびそれぞれのグループ内で約５％のヌクレオチド変異をもつＫａおよびＫｂと命名された二つのグループに細分された。
【０００６】
原型ＨＣＶの配列と類似したレベルのホモロジーがＫａｔｏらにより１９９０年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、第８６巻：１７６４から１７６７ページに報告された。１５人の患者からｃＤＮＡ断片が増幅され、配列が決定された。原型の配列の３５２５から３５６１の位置に相当する増幅された３７ヌクレオチドの部分は原型ＨＣＶの配列と６８から７８％のホモロジーを示した。
【０００７】
ＨＣＶのゲノムＲＮＡは、ゲノムＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、ポリメラーゼ連鎖反応によりｃＤＮＡを増幅し、さらに配列特異的オリゴヌクレオチドで調査することにより血清に検出される。ＨＣＶ株間の配列の不均一性のために、プライマーおよびプローブは株の間で配列が保存される領域が見いだされない限り、株特異的である。そのような保存された領域の一つはＨＣＶゲノムの５’端である。
【０００８】
ＨＣＶゲノムの５’端の非コーディング配列は最初にＯｋａｍｏｔｏらにより１９９０年に、Ｊａｐａｎ Ｊ．ＥＸｐ．Ｍｅｄ．、第６０巻（第３号）：１６７から１７７ページで報告された。二つの株の間の比較は５’端の非コーディング配列が保存されていることを示唆した。ＨＣＶゲノムの５’端の非コーディング配列の保存された性質はまた、Ｈａｎらにより１９９１年に、ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８８巻：１７１１から１７１５ページに報告された。五大陸の個人から回収された１１のＨＣＶ単離株から得られた３４１ヌクレオチド領域の部分配列が比較された。七つの配列が原型配列と完全なホモロジーを示し、残りの四つが１から５個の塩基のミスマッチを示した。
【０００９】
Ｏｋａｍｏｔｏらの１９９０年、Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第６０巻（第３号）：２１５から２２２ページには、保存された５’非コーディング領域を含むＨＣＶゲノムの各種の領域に対するプライマーが記述された。保存された領域から選択されたプライマーはうまく試験された殆どの株の核酸を増幅し、不均一な領域から選択されたプライマーは株の小さな部分の核酸を増幅した。しかし、これらのプライマーを用いた増幅効率は低かった。参考文献では二段階ＰＣＲ増幅を記述しており、二回目の増幅は以前に増幅された標的領域について、第一のプライマーのセットにより増幅された領域内に入れ子になる第二のプライマーのセットを用いて行われた。
【００１０】
二つのセットのプライマーを用いる二回の増幅を必要とするＰＣＲ増幅はまたＧａｒｓｏｎらにより、１９９０年、Ｌａｎｃｅｔ、第３３５巻：１４１９から１４２２ページに報告された。非構造タンパク質（ＮＳ５）を暗号化する領域が増幅された。配列の不均一性のために、これらのプライマーにより認識されないＨＣＶ配列が存在する（Ｇａｒｓｏｎらの、１９９０年、Ｌａｎｃｅｔ、第３３６巻：８７８から８７９ページを参照せよ）。その結果として、保存された５’非コーディング領域のプライマーが試みられたが、充分な感度を得るために、入れ子になったプライマーのセットを用いた二段階増幅が依然として必要であった。入れ子プライマーを用いた二回の増幅による５’端領域の増幅はまた、Ｋａｎａｉらにより、１９９０年に、Ｌａｎｃｅｔ、第３３６巻：２４５ページに報告された。
【００１１】
入れ子プライマーでの二回の増幅を用いた増幅は非能率的であるだけでなく、汚染の可能性を大いに増加する。汚染の問題は技術的に良く知られており、増幅段階の間にプライマーを変え、試薬を加えるために反応チューブを開けることは少しでも可能ならば最も避けられるべきである。汚染の問題はさらに、最初の逆転写段階およびそれに続くＰＣＲ増幅の間で反応条件を変える必要があるために悪化する。
【００１２】
全て、または殆ど全ての株が増幅されるように保存された領域からそれぞれ選択されたＨＣＶの配列を増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドおよび一つのセットのプライマーでの増幅が充分であるような効果的な増幅方法の必要が依然として存在する。プライマーがハイブリダイズする二つの保存された領域間の保存された領域から選択された増幅されたｃＤＮＡの検出のためのプローブオリゴヌクレオチドの必要もまた存在する。同一試薬を使用し、それにより増幅過程中に反応チューブを開ける必要を除去するような逆転写およびＰＣＲを行わせる反応プロトコールおよび試薬が必要とされる。
【００１３】
さらに、ＮＡＮＢＨの例の１０％は原型のキャプシドおよびエンベロープ抗原とは非反応性である（Ｃｈａｕｄｈａｒｙらの１９９１年、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２９巻：２３２９から２３３０ページおよびＨｏｓｅｉｎらの１９９１年、ＰＮＡＳ、第８巻：３６４７から３６５１ページを参照せよ）。それ故、診断および新しい単離株により暗号化される抗原に基づくＰＣＲの開発は、血清学に基づく診断試験の信頼性を改善するであろう。本発明はＨＣＶを検出するためのプライマー、プローブおよび方法を提供することによりこれらの必要に応ずるものである。
【００１４】
提供される特異的プライマーおよび配列特異的オリゴヌクレオチドプローブは、ウイルスのＲＮＡゲノムの配列の増幅および検出を可能にする均一逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で使用される。本発明のプライマーおよび方法を用いる増幅の効率は、入れ子プライマーでの二回のＰＣＲ増幅の必要を除去し、その結果得られる試験の感度の高さは核酸の信頼できる検出を提供する。
【００１５】
本発明の一つの面は特異的オリゴヌクレオチドプライマーに関するものである。本発明はＨＣＶの核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを含む構成物を提供するものであり、前記プライマーはＪａｐａｎ、ＵＳおよびＣ９株からなるグループから選択されるＨＣＶ株またはその同型の核酸部分配列を増幅するのに適している。提供されるプライマーはウイルスのＲＮＡゲノムの逆転写およびそれに続くポリメラーゼ連鎖反応を用いた作製されたｃＤＮＡの増幅の両者で機能する。プライマーはＨＣＶゲノムの保存された領域の配列にハイブリダイズし、それ故、各種の株に結合する。提供されたプライマーを用いた増幅の効率は入れ子プライマーでの二回のＰＣＲ増幅の必要を除去するのに充分である。
【００１６】
本発明の別の面は株に関係のないＨＣＶゲノムの核酸の存在を検出することができるプローブに関するものである。プローブは株全体に保存される領域に相補的である。本発明のプローブを用いた診断試験は特異性を落すことなしに非常に多くのＨＣＶ株を検出できる。それ故、本発明はＣ型肝炎ウイルスの核酸の存在を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブを含む構成物を提供するものであり、前記プローブはＪａｐａｎ、ＵＳおよびＣ９原型株からなるグループから選択されるＨＣＶ株またはその変異株の核酸を検出するのに適している。
【００１７】
本発明の第三の面はキットに関するものである。これらのキットは各種の形態をとり、一つまたはそれ以上の逆転写、増幅または検出の試薬、例えばプライマー、プローブ、ポリメラーゼ、グリコシラーゼ、緩衝液およびヌクレオシド三リン酸を含むことができる。
【００１８
一つの具体例として、本発明は肝炎ウイルスのＣ９単離株に特異的な核酸の検出のためのキットを提供するものであり、キットは実質的にＨＣＶ−Ｃ９ウイルスの核酸部分配列に結合する核酸プローブを含むコンパートメントからなる。
【００１９】
本発明の別の面はＨＣＶのＲＮＡを増幅し、検出する方法に関するものである。
【００２０】
さらに、本発明は配列番号２９に実質的に相同なウイルス核酸配列を含む構成物に関するものである。ここでＣ９単離株を意味するそのようなウイルス配列を含むｃＤＮＡクローンであるＰＨＣＶ−Ｃ９は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、寄託番号７５２６５をもつ。
【００２１】
本発明はまた、Ｃ９単離株および関連の変異株に特異的な核酸配列を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを提供するものである。本発明のプローブは好ましくは次のグループ：
【化１】
から選択される部分配列を含む。
【００２２】
本発明はさらに、Ｃ９単離株に特異的な核酸配列の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーを提供するものである。特異的にＣ９変異株および関連の単離株を増幅するための本発明のプライマーは好ましくは次の下流プライマー：
【化２】
の一つを使用するために上流プライマーの次のグループ：
【化３】
から選択される核酸配列を含む。
【００２３】
本発明はまたＣ９単離株および以前に同定されたＣ型肝炎単離株の配列に実質的に結合するプローブを提供するものである。この範囲の好ましいプローブには
【化４】
が含まれる。本発明はさらに非Ｃ９−ＨＣＶの配列を検出するためのプローブを提供するものである。
【００２４】
本発明はＣ型肝炎のゲノム核酸の存在を検出する方法を提供するものであり、前記Ｃ型肝炎のゲノム核酸はＪａｐａｎ、ＵＳおよびＣ９原型株からなるグループから選択される核酸であって、（ａ）核酸部分配列を増幅すること；（ｂ）プローブが核酸部分配列に結合し、安定な雑種二重鎖を形成するような条件下で、増幅された核酸をその部分配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと混合すること；および（ｃ）その部分配列およびプローブの間に形成される雑種を検出することからなる。
【００２５】
別の具体例では、本発明は肝炎ウイルスのＣ９単離株を検出する方法を提供するものであり、その方法は（ａ）ＨＣＶ−Ｃ９の核酸配列を含むことが予想される試料をＨＣＶ−Ｃ９の核酸配列に相補的な部分をもつ核酸プローブと接触させること；および（ｂ）プローブの前記配列とのハイブリダイゼーションを検出することの段階を含む。
【００２６】
本方法はさらに、段階（ａ）の前に、ウイルスに特異的な配列の部分を増幅する段階を含む。増幅は好ましくはポリメラーゼ連鎖反応法の使用により行われる。上記のプライマーおよびプローブは好ましくは本発明の方法で使用される。
【００２７】
本発明はまた肝炎ウイルスのＣ９単離株に特異的な核酸の検出のためのキットを提供するものである。キットは核酸配列の核酸部分配列に実質的に結合する核酸プローブを含むコンパートメントからなる。プローブは好ましくは上掲のグループから選択される。
【００２８】
代替測定法は血清抗体のＣ９単離株のタンパク質またはウイルスライゼートとの反応または、ウイルス抗原に対して生じた免疫グロブリンのウイルスを含む生物学的試料との反応のような免疫学的反応に基づくものである。本発明はそれ故、Ｃ９単離株に対して生じた生物学的に純粋な免疫グロブリンを提供するものである。免疫グロブリンは好ましくは単クローン抗体である。
【００２９】
本発明を理解する目的のために、いくつかの用語が以下に定義される。
【００３０】
「増幅反応液」は、標的核酸を増幅するために使用される各種の試薬を含む水溶液を意味する。これらには酵素、水性緩衝液、塩、標的核酸およびデオキシヌクレオシド三リン酸が含まれる。内容に依存して、反応液は完全または不完全な増幅反応液となる。
【００３１】
「増幅反応システム」は、核酸の標的配列のコピーを増加させるための試験管内の手段を意味する。そのような方法には限定はされないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＤＮＡリガーゼ、ＱＢ ＲＮＡレプリカーゼおよびＲＮＡ転写に基づく増幅システムが含まれる。これらは複数の増幅試薬を含み、以下にさらに充分に記述される。
【００３２】
「増幅反応チューブ」は、増幅試薬を入れるのに適している容器を意味する。一般的にチューブは使用される増幅システムを阻害または干渉しないような不活性な素材でつくられる。システムが加熱および冷却の繰返しの熱サイクルを必要とする場合、チューブはサイクルの過程に耐え、典型的には正確にサーモサイクラーのウェルに適合しなければならない。
【００３３】
「増幅試薬」は、選択された増幅方法を実施するために使用される各種の緩衝液、酵素、プライマー、デオキシヌクレオシド三リン酸（通常の、および自由な）およびプローブを意味する。
【００３４】
典型的には標的核酸の「指数的な」増加を意味する「増幅すること」または「増幅」は、ここでは核酸の選択された標的配列の数の直線的および指数的な増加を記述するために用いられる。
【００３５】
「実質的な結合」は、オリゴヌクレオチドおよび標的配列の間の相補的なハイブリダイゼーションを意味し、ＰＣＲポリメラーゼの望みのプライミングまたはハイブリダイゼーション信号の検出を行うために、ハイブリダイゼーションの媒体の緊縮度を減少することにより調節される重要でないミスマッチを含む。
【００３６】
「生物学的に純粋な」という表現は、実質的にまたは本質的に、天然の状態では見いだされる通常一緒に存在するような成分が含まれない物質を意味する。例えば、アフィニティで精製された抗体または単クローン抗体は生物学的に精製された状態にある。
【００３７】
「ハイブリダイズすること」は、相補的な塩基の対合を介した二つの一本鎖核酸の結合を意味する。
【００３８】
「核酸」は、一本鎖または二重鎖いずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオシドポリマーを意味し、別に限定しない限り、天然に生ずるヌクレオチドと類似の様式で機能することができる既知の天然ヌクレオチドの類似体を含む。
【００３９】
「ヌクレオチドポリメラーゼ」は、ヌクレオシド三リン酸前駆体からＤＮＡまたはＲＮＡの合成を触媒できる酵素を意味する。本発明の増幅反応では、ポリメラーゼは鋳型依存性で、典型的には形成されるポリマーの３’端にヌクレオチドを付加する。最も好ましくはポリメラーゼは米国特許第４，８８９，８１８号および第５，０７９，３５２号に記述されているように熱安定性である。
【００４０】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、プライマー、プローブ、検出される核酸断片および核酸のコントロールのような二つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなる分子を意味する。オリゴヌクレオチドの正確な大きさは多くの因子およびオリゴヌクレオチドの最終的な機能または使用に依存する。オリゴヌクレオチドは、例えば適当な配列のクローニングおよび制限酵素による切断、およびＮａｒａｎｇらの１９７９年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第６８巻：９０から９９ページのホスホトリエステル法；ＢｒｏＷｎらの１９７９年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第６８巻：１０９から１５１ページのホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅらの１９８１年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、第２２巻：１８５９から１８６２ページのジエチルホスホアミダイド法および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法のような方法による直接的な化学合成を含む適当な方法により調製される。
【００４１】
「プライマー」という用語は、核酸の鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される、即ち、適当な緩衝液中に四種の異なるヌクレオシド三リン酸およびポリメリゼーションの薬品（即ち、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）が、適当な温度で存在するような条件下で、ＤＮＡ合成の開始点として作用できる天然または合成いずれかのオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは好ましくは一本鎖のオリゴデオキシリボヌクレオチドである。適当な長さのプライマーはプライマーの使用計画に依存するが、典型的には１５から２５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は一般的に鋳型と充分に安定な雑種複合体を形成するためにより低い温度が必要である。プライマーは鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズするために充分に相補的でなければならない。
【００４２】
本発明の公開された具体例では、配列特異的プライマーおよびプローブが提供される。これらの具体例で提供されるように、さらに配列特異的プライマーおよびプローブが、例えば５’または３’端に標的配列に相補的または非相補的なヌクレオチドを付加することにより調製されることは技術者には明かであろう。プライマー成分が標的配列の伸長の開始点として作用し、プライマーおよびプローブがこれらの例証される具体例の中に含まれる少なくとも１４の連続的なヌクレオチドで構成される限り、そのような成分は発明の範囲の中にある。
【００４３】
「プライマー」という用語は、特に増幅される標的領域の一方または両端についての情報にいくらかの曖昧さがある場合に一つ以上のプライマーを意味する。例えば、領域が母集団でかなりのレベルの多型を示すならば、代わりの配列を増幅するプライマーの混合液が調製される。望むならば、プライマーは比色的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的な手段により検出できる標識を取り込むことにより標識される。例えば、有効な標識には３２Ｐ、蛍光色素、電子密度試薬、（ＥＬＩＳＡに通常使用されるような）酵素、ビオチンまたはハプテンおよび抗血清または単クローン抗体が得られるタンパク質が含まれる。標識はまた、プライマーまたは増幅されたＤＮＡのようなプライマー伸長産物のいずれかを固体支持体へ固定化するのを容易にする陽にプライマー「捕捉する」ために使用される。
【００４４】
「プローブ」は、標的核酸の部分配列に相補的な塩基対を介して結合するオリゴヌクレオチドを意味する。プローブは典型的にはハイブリダイゼーション条件の緊縮度に依存して、プローブ配列と完全な相補性をもたない標的配列に実質的に結合することを技術者は理解するであろう。プローブは好ましくは同位元素を用いた場合のように直接的に、またはストレプトアビジン複合体が後に結合するビオチンを用いた場合のように間接的に標識される。プローブの有無を調べることにより、標的の有無を検出できる。
【００４５】
核酸プローブが引用される場合、「組換え体」は天然ゲノムの部分としてプローブ配列を天然に含む細胞から分離されたプローブに典型的に付随する天然のタンパク質および核酸を含まないオリゴヌクレオチドを意味する。組換え体プローブはＰＣＲのような増幅手段および細菌が組換え体プローブで形質転換されるような遺伝的クローニング法により作製されたプローブである。
【００４６】
「逆転写酵素」という用語は、リボ核酸の鋳型に相補的なプライマー伸長産物を形成するためのデオキシリボヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素を意味する。酵素はプライマーの３’端で合成を開始し、合成が停止するまで鋳型の５’端へ向って進行する。ＲＮＡ標的配列を相補的なコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列に変換する適当な重合剤の例は、トリ骨髄芽腫ウイルスの逆転写酵素および逆転写酵素活性をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼである。
【００４７】
「配列特異的オリゴヌクレオチド」および「ＳＳＯ」という用語は、検出される配列に正確に相補的な「ハイブリダイズする領域」と呼ばれる配列をもつオリゴヌクレオチドを意味し、「配列特異的な緊縮ハイブリダイゼーション条件下で」、正確に相補的な標的配列にのみハイブリダイズする特定の対立遺伝子または変異株に特徴的な典型的な配列である。ハイブリダイズ条件の緊縮度を緩和することにより、配列のミスマッチが許容されるようになる；許容されるミスマッチの程度はハイブリダイゼーション条件の適当な調整によりコントロールされる。解析される配列に依存して、一つまたはそれ以上の配列特異的オリゴヌクレオチドが使用される。「プローブ」および「ＳＳＯ」という用語は、ＳＳＯと互換的に使用される。
【００４８】
特定のウイルス単離株に「特異的な配列」は、単離株に独特の配列で、即ち他の以前に特徴付けされた単離株には共通しないものである。単離株に特異的な配列に相補的な部分を含むプローブは典型的には緊縮条件下（例えば、固体支持体を７０℃で２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄すること）で、他の単離株のゲノムの相当する部分にハイブリダイズしない。
【００４９】
特定の単離株に特異的な抗原またはエピトープは単離株に独特のもので、他の以前に特徴付けされた単離株とは共通しない。抗原またはエピトープに対して生じた免疫グロブリンはＥＬＩＳＡのような標準的な方法では以前に特徴付けされた単離株の抗原とは交差反応しない。
【００５０】
「実質的に同一な」という用語は、二つまたはそれ以上の配列がそれらの配列の大部分を共有することを指す。一般に、これはその配列の少なくとも約９０％で、好ましくは約９５％である。配列が実質的に同一であることの別の指示は、緊縮条件下で同一ヌクレオチド配列にそれらがハイブリダイズするかどうかである（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５を参照せよ）。緊縮条件は配列依存性で、異なる環境では異なるものとなる。一般に、緊縮条件は限定されたイオン強度およびｐＨで特異的な配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは標的配列の５０％が完全にマッチするプローブにハイブリダイズする（限定されたイオン強度およびｐＨでの）温度である。典型的には、緊縮条件は塩濃度がｐＨ７で少なくとも約０．２モルで、温度が少なくとも約６０℃である。
【００５１】
「部分配列」は核酸のより長い配列の部分を含む核酸の配列を意味する。
【００５２】
「標的領域」という用語は解析される核酸の領域を意味し、多型領域を含む。
【００５３】
「熱安定性ポリメラーゼ酵素」という用語は、比較的熱に安定で、標的配列の一方の核酸の鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成するためのヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素を意味する。酵素はプライマーの３’端で合成を開始し、合成が停止するまで鋳型の５’端へ向かって進行する。精製された熱安定性ポリメラーゼ酵素は米国特許第４，８８９，８１８号により充分に記述されている。
【００５４】
図１は新規変異株ＨＣＶの配列Ｃ９、四種の関連変異株および原型ＪａｐａｎおよびＵＳ ＨＣＶ単離株を並べたものである。
【００５５】
Ｃ型肝炎ウイルスは約１００００ヌクレオチドの長さの一本鎖の＋鎖のＲＮＡ分子を含む小さなＲＮＡウイルスである。ゲノムは単一の大きなポリタンパク質に翻訳され、続いて加工されると信じられている単一の、長い開かれた読み枠を含む。開かれた読み枠は未翻訳領域（ＵＴＲ）に続いて（原型ウイルスの番号付けのシステムを用いて）ヌクレオチドの３４３から始まる。５’ＵＴＲは比較的保存されており、ウイルスの複製および調節には重要である。コーディング領域の５’端もまた保存されている。本発明のあるプライマーおよびプローブはＨＣＶゲノムの５’端の保存された領域にハイブリダイズする。
【００５６】
本発明のプライマーおよびプローブのハイブリダイズする領域のオリゴヌクレオチド配列は以下に示される。プライマーのハイブリダイズする領域として使用されるオリゴヌクレオチド配列はまた、プローブのハイブリダイズする領域として使用されることを技術者は理解するであろう。プローブとして使用されるプライマーの適合性はプライマーのハイブリダイゼーション特性に依存する。同様に、プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドはプライマーとして使用される。
【００５７】
表１に示されたオリゴヌクレオチドは＋鎖（上流）のプライマーおよびプローブである。表はゲノム核酸にハイブリダイズした場合のオリゴヌクレオチドの３’端の位置に基づく順である。ゲノムの５’端に最も近いところにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは最初にあげられている。
【００５８】
【表１】
【００５９】
表２は−鎖（下流）のプライマーまたはプローブとして機能するオリゴヌクレオチドを示す。表１と同一の内部順が使用されている。
【００６０】
【表２】
【００６１】
いくつかのオリゴヌクレオチドは分子の５’端に制限酵素部位を含むように修飾されたハイブリダイズする領域をもつ。制限酵素部位はこれらのオリゴヌクレオチドの一つがプライマーとして使用された場合、増幅産物に導入される。最初のハイブリダイゼーション条件は制限酵素部位周辺の塩基対のミスマッチが許容されるように選択される。５’端付近のミスマッチはプライマーの３’付近のものよりも許容される。オリゴヌクレオチドＫＹ６５（配列番号１）、ＫＹ９８（配列番号３）、ＫＹ９６（配列番号４）およびＫＹ６７（配列番号１０）は上流プライマーで、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位を含む。オリゴヌクレオチドＫＹ９５（配列番号２０）、ＫＹ９９（配列番号２６）およびＫＹ６８（配列番号２７）は下流プライマーでＥｃｏＲＩ部位を含む。そのような制限酵素部位の増幅産物への導入は増幅産物のクローニングを容易にする。
【００６２】
本発明はまた新しいＨＣＶ単離株を提供する。殆どの単離株はＨＣＶの二株のうちの一つに関連する。第一は欧州公示第３１８，２１６号、第３８８，２３２号および第３９８，７４８号に記述されるＵＳ原型株である。第二は上述のＫａｔｏらにより記述された日本の株である。二つの株は推定上の非構造遺伝子の領域では３０％まで異なっているが、５’未翻訳領域では９８％以上のホモロジーを、キャプシドまたはコア遺伝子の５’部分では９２％のホモロジーを示す。
【００６３】
ここでＣ９と呼ばれる本発明の単離株は両株とは距離的により離れた関係にある。この新しい単離株は共通の５’未翻訳領域に９３％類似している。コア遺伝子領域の５’部分では原型または日本の株のいずれかと約８５％しかホモロジーをもたない（以下の表３を参照せよ）。
【００６４】
Ｃ９（配列番号２９）単離株および関連同型のＲ４５（配列番号３１）、Ｒ４３（配列番号３３）、Ｒ１１０（配列番号３２）およびＲ１１６（配列番号３０）（図１参照）は上述のようにＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＢＳ（＋）のＲＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限酵素部位にクローニングされた。変異株ウイルスは米国特許第４，８００，１５９号に記述されたように精製されたウイルスＤＮＡの標的およびＰＣＲクローニング法を用いてクローニングされた。得られたプラスミドは大腸菌ＤＧ１０１株（ＡＴＣＣ寄託番号４７０４３）に形質転換された。
【００６５】
原型Ｃ９単離株および四種の関連単離株の５’未翻訳配列およびキャプシド遺伝子の５’端のヌクレオチド配列はＣ９（配列番号２９）、Ｒ１１６（配列番号３０）、Ｒ４５（配列番号３１）、Ｒ１１０（配列番号３２）およびＲ４３（配列番号３３）で明らかにされ、以下に示される。示された配列はウイルス配列をクローニングし易くするために使用されるプライマーＫＹ９６（配列番号４）およびＫＹ９９（配列番号２６）を含まない。
【００６６】
【化５】
【００６７】
【化６】
【００６８】
【化７】
【００６９】
【化８】
【００７０】
【化９】
【００７１】
ウイルスの配列を含むクローンは以下のようにＭａｒｙｌａｎｄ州ＢａｌｔｉｍｏｒｅのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託された。
【００７２】
単離株 配列番号 プラスミド名 ＡＴＣＣ寄託番号 寄託年月日
Ｃ９ ２９ ｐＨＣＶ−Ｃ９ ７５２６５ １９９２年７月２日
Ｒ１１０ ３２ ｐＨＣＶ−Ｒ１１０ ７５２６６ １９９２年７月２日
【００７３】
プラスミドｐＨＣＶ−Ｃ９は新規変異株Ｃ９の配列を含む。Ｃ９配列の四種の関連変異株を並べたものが図１に示されている。既知の単離株の配列データの源は以下のようであった：ＨＣＶ−Ｊ１、ＨＣＶ−Ｊ４（Ｏｋａｍｏｔｏらの１９９０年、Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第６巻（第３号）：１６７から１７７ページ）；ＨＣＶ−Ｊ（Ｋａｔｏらの１９９０年、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、第７巻：４９５から５０１ページ）；ＨＣＶ−ＢＫ（Ｔａｋａｍｉｚａｗａらの１９９１年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、第６５巻：１１０５から１１１３ページ）；およびＨＣＶ−１ＵＳ−ＰＴ（Ｈａｎらの１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８７巻：９５２４から９５２８ページ）。
【００７４】
【表３】
【００７５】
それ故、本発明はＣ９単離株に特異的で、他の肝炎の単離株と区別するアッセイの物質および方法を提供するものである。いくつかの具体例では、本発明の方法は標的配列を増幅するためにＰＣＲを使用したまたは使用しない場合の核酸のハイブリダイゼーションに基づくものである。他の具体例では、本方法はＣ９単離株に特異的な免疫グロブリンを使用する。
【００７６】
Ｃ９に特異的なプライマーおよびプローブのオリゴヌクレオチド配列は以下の表４に示されている。
【００７７】
【表４】
【００７８】
ヌクレオチドを同定するために使用される番号付けのシステムは上述のＫａｔｏらの１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．のものである。
【００７９】
オリゴヌクレオチドＫＹ１５０（配列番号４３）はＣ９単離株および既知のＨＣＶ原型単離株の両者の検出に有効である。このオリゴヌクレオチドは次の配列：
【化１０】
５’−ＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴ−３’
をもつ。
【００８０】
表４に示される上流／下流いずれのプライマーの対もＣ９単離株および関連同型を特異的に増幅するのに適していることは技術者には明らかであろう。さらに、表４に提供されるヌクレオチドの位置を指標として用いて、増幅された核酸部分をハイブリダイズするのに適しているＣ９特異的プローブを選択することは明らかである。
【００８１】
好ましい具体例では、本発明のプライマーは標的核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅とともに使用される。ＨＣＶはＲＮＡウイルスであるので、増幅の第一段階は増幅される領域のＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）の合成である。逆転写は別個の段階として、または以下に記述されるようにＲＮＡを増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応を改良した均一逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で行われる。
【００８２】
ＰＣＲ過程は技術的に良く知られているが（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および第４，９６５，１８８号を参照せよ）、ある一般的なＰＣＲ情報はＰＣＲ過程に不慣れな者が本発明を明確にさらに充分に理解することを目的として以下のように提供される。
【００８３】
ＰＣＲにより試料中の標的核酸配列を増幅するために、配列は増幅システムの成分に影響され易くなければならない。一般に、この影響され易さは試料からの核酸の分離により保証される。生物学的試料からのリボ核酸の抽出のための各種の技術が技術的に知られている。例えば、「ＰＣＲ技術」（Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）中のＲｏｔｂａｒｔら（１９８９年）により、およびＨａｎらの１９８７年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２６巻：１６１７から１６２５ページに記述されたものを参照せよ。代わって、試料がかなり容易に壊れるならば、ＰＣＲ技術により増幅される前に核酸は精製される必要はない、即ち、試料が細胞、時に末梢血リンパ球または単球に含まれるならば、細胞内成分の溶解と分散は単に細胞を低調緩衝液に懸濁することにより行われる。
【００８４】
ＰＣＲのそれぞれのサイクルの第一段階は核酸二重鎖の分離を含む。もちろん、標的核酸が一本鎖である、即ち一本鎖ＲＮＡであるならば、第一サイクルに最初の分離段階は必要ない。鎖が分離されると、ＰＣＲの次の段階には標的配列に隣接したプライマーと分離した鎖をハイブリダイズすることが含まれる。プライマーはその後標的配列に相補的なコピーを形成するために伸長される。成功したＰＣＲ増幅では、プライマーはそれぞれのプライマーが二重鎖配列にハイブリダイズする位置が、一つのプライマーから合成される伸長産物が鋳型から分離される（相補的である）場合にもう一方のプライマーの伸長の鋳型として働くようにデザインされる。変性、ハイブリダイゼーションおよび伸長のサイクルが増幅された核酸が望みの量得られるまで必要な回数繰り返される。
【００８５】
ＰＣＲ過程の好ましい具体例では、鎖の分離は二重鎖の変性は引き起こすが、ポリメラーゼの非可逆的な変性は引き起こさないような充分な時間、充分に高温で反応液を熱することにより行われる（米国特許第４，９６５，１８８号を参照せよ）。典型的な熱変性は約８０℃から１０５℃の範囲の温度で、秒から分の範囲の時間で行われる。しかし、鎖の分離は物理的、化学的または酵素的手段を含む適当な変性方法により行われる。鎖の分離は例えばヘリカーゼまたはヘリカーゼ活性を示す酵素により誘導される。例えば、酵素ＲｅｃＡはＡＴＰ存在下でヘリカーゼ活性をもつ。ヘリカーゼによる鎖の分離に適した反応条件は技術的に知られている（Ｋｕｈｎ Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｂｅｒｌｉｎｇの１９７８年の、ＣＳＨ−Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４３巻：６３から６７ページおよびＲａｄｄｉｎｇの１９８２年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１６巻：４０５から４３６ページを参照せよ）。
【００８６】
ＰＣＲにおけるプライマーの鋳型依存性の伸長は、適当な塩、金属陽イオンおよびｐＨ緩衝システムからなる反応液中で、適当な量の四種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（典型的にはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）の存在下で、重合剤により触媒される。適当な重合剤は鋳型依存性のＤＮＡ合成を触媒することが知られている酵素である。Ｃ型肝炎はＲＮＡウイルスであるので、プライマー伸長の最初の鋳型はＲＮＡである。ＲＮＡ鋳型から相補的なコピ−ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成するのに適している重合剤は、トリ骨髄芽腫ウイルスＲＴ、Ｍｏｌｏｍｅｙネズミ白血病ウイルスＲＴ、またはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから市販される逆転写酵素活性をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）のＤＮＡポリメラーゼのような逆転写酵素（ＲＴ）である。典型的には、ゲノムＲＮＡ／ｃＤＮＡの二重鎖鋳型は、増幅の鋳型として得られるＤＮＡ鎖を残すために、最初の逆転写段階後の第一の変性段階の間に熱変性される。ＤＮＡ鋳型とともに使用される適当なポリメラーゼは例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩまたそのＫｌｅｎｏｗ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓから分離され、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅにより開発製造され、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから市販される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑポリメラーゼを含む。後者の酵素は核酸の増幅およびシークエンシングに広く使用される。Ｔａｑポリメラーゼを使用する反応条件は技術的に知られており、上述の「ＰＣＲ技術」（１９８９年）の中で、Ｇｅｌｆａｎｄにより記述される。
【００８７】
ＲＮＡが増幅される場合、最初の逆転写（ＲＴ）段階はＲＮＡのＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）を作製するために行われる。１９９１年７月１１日に公開されたＰＣＴ特許公示ＷＯ９１／０９９４４は、ＰＣＲ増幅においても機能する熱安定性ポリメラーゼによる高温逆転写について記述している。高温ＲＴはより高いプライマーの特異性および改良された効率を提供する。「均一ＲＴ−ＰＣＲ」では、同一プライマーおよびポリメラーゼが逆転写およびＰＣＲ増幅の両者に当てられ、反応条件は両反応が反応の交換なしに起きるように最適化される。逆転写酵素として機能できる熱安定性ポリメラーゼである。Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼは鋳型に関係なく全てのプライマー伸長段階で使用される。両過程は試薬を変えるまたは加えるために、チューブを開けることなしに行われる；温度プロフィールだけが最初のサイクル（ＲＮＡ鋳型）と残りの増幅サイクル（ＤＮＡ鋳型）の間で調整される。
【００８８】
ＨＣＶゲノムの５’末端はＭｏｌｏｎｅｙネズミ白血病ウイルスＲＴのような逆転写酵素を用いた逆転写をプライマーハイブリダイゼーションを干渉することにより阻害できる重要な二次構造をもつことが予想される。不幸にして、二次構造を変性するために反応温度を上げることはまた殆どの逆転写酵素を不活性化する。組換えＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ｒＴｔｈ）のＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性を使用することにより、ｃＤＮＡ合成が酵素の不活化なしに上昇した温度で起きる。本発明のプライマーはそのままこの上昇した逆転写温度でＲＮＡ鋳型にハイブリダイズする。
【００８９】
ＰＣＲ法はそれぞれの段階後、新しい試薬が添加される段階様式で、または全ての試薬が同時に添加される様式で、あるいは新鮮なまたは異なる試薬が与えられた数の段階後に添加される部分的な段階様式で行われる。例えば、鎖の分離が熱により誘導され、ポリメラーゼが熱感受性であるならば、その場合はポリメラーゼは鎖も分離の各循環後に添加されねばならない。しかし、例えば、ヘリカーゼが変性に使用されるか、または熱安定性ポリメラーゼが伸長に使用されるならば、全ての試薬は最初に添加され、あるいは代わって、試薬の分子比が反応に影響するならば、試薬は合成反応によりそれらが消費されるにつれ、定期的に補充される。
【００９０】
ＰＣＲ過程は熱安定性酵素を用いて自動過程で通常行われることを技術者は知るだろう。この過程で、反応液の温度は変性領域、プライマーアニーリング領域および伸長反応領域を循環する。代わって、アニーリングおよび伸長の温度は同一である。例に記述されるＲＴ−ＰＣＲはそのような二段階の温度循環を使用する。熱安定性酵素の使用に特異的に適している機械は商業的に購入できる。
【００９１】
技術者は以前の反応の増幅された核酸および非特異的な増幅によるＰＣＲの汚染の問題に気づくであろう。これらの問題を減少する方法は以前の反応の増幅されたＤＮＡの酵素学的分解を行わせ、非特異的増幅を減少する。ＰＣＲ増幅はｄＴＴＰに代わってｄＵＴＰの存在下で行われる。得られた二重鎖のウラシルを含む産物はウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）による分解を受けやすく、一方、通常のチミンを含むＤＮＡはＵＮＧにより分解されない。増幅前に増幅反応液にＵＮＧを添加することは標的として働く全てのウラシルを含むＤＮＡを分解するようになる。ウラシルを含むＤＮＡの唯一の材料が以前の反応の増幅された産物であるので、この方法は以前の反応の汚染（繰越）の問題を取り除くことにより、反応液を弱化する。ＵＮＧそれ自身は熱により一時的に不活化されるので、増幅手順のうちの変性段階はまたＵＮＧを不活化するように働く。ウラシルを取り込んだ新しい増幅産物は、それ故効果的にＵＮＧなしの環境で形成され、分解されない。
【００９２】
本発明の好ましい具体例は弱化段階を取り入れた均一ＲＴ／ＰＣＲ法を用いる。この一つのチューブでの試薬を添加しない反応は繰越の汚染を阻害し、ＲＮＡ標的を含む試料から増幅され、検出されるＰＣＲ産物を提供することにより、ＲＴ−ＰＣＲ反応を弱化するように働く。この方法は例６に例示される。
【００９３】
好ましい具体例はＲＴ−ＰＣＲ増幅を取り入れているが、試料中の標的配列の増幅は、標的配列がＳＳＯプローブへの核酸ハイブリダイゼーションにより検出されるように充分な増幅をそれぞれが提供するような、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅および自己配列複製のような既知の方法により行われる。代わって、Ｑβ−レプリカーゼ増幅のような検出できるレベルにプローブを増幅する方法が使用される。「プローブ」という用語は上述の方法で使用される配列特異的なオリゴヌクレオチドを意味し、例えばＬＣＲで使用される二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドは、たとえＬＣＲのいくつかの具体例が対立の存在を示すために、プローブの連結だけを必要とする場合でも本発明の目的の「プローブ」である。
【００９４】
配列特異的プローブハイブリダイゼーションは本発明の成功する実施の上で重要な段階である。本発明の配列特異的オリゴヌクレオチドプローブは特異的にＨＣＶゲノムの特定の断片にハイブリダイズし、他の生物の配列との不安定なミスマッチをもつ。充分な緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、プローブは特異的に正確に相補的な配列にのみハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件の緊縮度は配列のミスマッチの変化する量を許容するように緩和される。増幅産物の検出は、正しく増幅された標的だけの検出を保証し、それにより関連生物の相同配列の存在により引き起こされる誤りの陽性の機会を減少するようにこの配列特異的ハイブリダイゼーションを使用する。
【００９５】
ＳＳＯプローブおよび核酸配列の間で形成される雑種を検出する方法は、プローブはハイブリダイズする領域に加えてさらに特質を含むことを必要とする。例えば、下に記述される「リバース」ドットブロット法にしたがって、プローブが最初に固定化されるならば、プローブはまたＰＣＴ特許公示８９／１１５４８により詳細に記述される技術の照射によりナイロン支持体に固定されるポリｄＴの長いストレッチを含む。ドットブロット法で、固定化された標的は下に記述するように検出方法で使用される化合物を含むプローブでハイブリダイズされる。
【００９６】
本発明のプローブは上述のオリゴヌクレオチドを合成する技術を用いて、合成され、標識される。プローブはプローブを３２Ｐ−ＡＴＰおよびキナーゼとインキュベートすることにより、３２Ｐで５’端を標識される。ＳＳＯプローブの適当な非放射活性標識は西洋ワサビのパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。この標識を含むプローブを調製し、検出する方法は以下の例および米国特許第４，９１４，２１０号および第４，９６２，０２９号に記述される。そのような標識プローブの使用に関する付加的な情報については、米国特許第４，７８９，６３０号；Ｓａｉｋｉらの１９８８年、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３１９巻：５３７から５４１ページおよびＢｕｇａｗａｎらの１９８８年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第６巻：９４３から９４７ページを参照せよ。有効な色素原は赤色ロイコ染料および３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む。
【００９７】
本発明のプローブはＳＳＯプローブが試料中に存在するウイルスの配列に結合するかを決定することによりウイルスの配列が試料に存在するかを決定するために使用される。ＳＳＯプローブおよび試料中の核酸配列の間に形成される雑種を検出するための本発明の目的の適当な方法は技術的に知られている。例えば、検出は例に記述されるようにドットブロット法を用いて行われる。ドットブロット法では、未標識の増幅された試料は膜、適当なハイブリダイゼーション条件下で、標識プローブとインキュベートされた膜、洗浄により除去されたハイブリダイズしないプローブ、および結合プローブの存在をモニターされるフィルターのような固体支持体に結合される。複数の試料が単一のプローブで解析されるとき、ドットブロット法は全く有効である。多くの試料は単一の膜に別の位置に固定化され、同時にプローブ溶液に膜を浸すことによりハイブリダイズされる。
【００９８】
非常に多くの異なるプローブが用いられる場合に全く有効な別の方法は、増幅された配列が標識を含み、プローブが固体支持体に結合される「リバース」ドットブロット法である。この様式は、本発明の試験が同時に行われる試験の装置の一つとして使用されるならば有効である。この様式では、未標識ＳＳＯプローブは膜に結合され、適当な緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、標識試料にさらされる。ハイブリダイズしない標識試料はその後適当な緊縮条件下で洗浄することにより除去され、フィルターはその後結合配列の存在をモニターされる。
【００９９】
正逆両ドットブロット法はマイクロタイタープレートで簡便に行われる。プローブは例えば、マイクロタイタープレートに接着し、それによりプローブを固定化するウシ血清アルブミンに付与される。
【０１００】
別の適当なアッセイシステムでは、標識プローブはＰＣＲ増幅過程の間に添加される。それぞれの合成段階の間に標的ＤＮＡにハイブリダイズするいずれのＳＳＯプローブもポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性により分解される。プローブの分解産物はその後検出される。それ故、分解産物の存在はＳＳＯプローブおよび標的ＤＮＡの間のハイブリダイゼーションが起きたことを示す。
【０１０１】
上に提供されるヌクレオチド配列は本発明の重要な面である。配列の一方の鎖だけが示されているが、配列のもう一方の鎖は上記の情報から推論されることを技術者は認識する。この情報から発明の他のプローブおよびプライマーが構築される。
【０１０２】
本発明はまたキット、本方法を実施するための有効な成分を含むマルチコンテナユニットに関するものである。有効なキットはＣ型肝炎ウイルスの核酸を検出するためのＳＯプローブを含むことができる。ある場合では、ＳＳＯプローブは適当な支持膜に固定される。そのようなプライマーが発明の好ましい具体例に有効である場合、キットはまたＲＴ−ＰＣＲのためのプライマーを含むことができる。キットの他の付随的な成分は例えば、逆転写酵素またはポリメラーゼ、基質ヌクレオシド三リン酸、標識に使用される手段（例えば、標識がビオチンであるなら、アビジン−酵素コンジュゲートおよび酵素基質および色素原）および逆転写、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーション反応のための適当な緩衝液を含む。上記成分に加え、キットはまた本方法を実施するための指導書を含むことができる。
【０１０３】
ＰＣＲおよび核酸プローブの使用に加え、本発明はまた特定のＨＣＶ単離株に特異的な免疫グロブリンを産生する方法を提供する。これは典型的には最初にウイルスヌクレオチド配列を発現し、望みの単離株に特異的な抗体を産生するための発現タンパク質を用いることにより行われる。
【０１０４】
肝炎単離株のヌクレオチド配列は各種の組換え発現システムで使用される。この様式で、キャプシド遺伝子のような望みの遺伝子が発現される。原核生物または真核生物の宿主でのヌクレオチド配列の組換え発現は技術的に良く知られている（上述のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照せよ）。発現されたタンパク質は単離株に特異的な免疫グロブリンを産生するために使用される。免疫グロブリンはその後以下に記述するようにウイルスの存在を検出するアッセイに使用される。タンパク質はまたウイルスにさらされた患者の中の抗体の存在を検出するために使用される。
【０１０５】
望みのウイルスの配列は標準的な技術を用いて、発現のための哺乳動物、酵母または昆虫細胞系列に形質転換される前に適当なベクターに簡便に挿入される。原核生物は中間クローニング段階に好ましく用いられる。
【０１０６】
ウイルスの配列の発現のために宿主細胞に改変した遺伝物質を導入する際に用いられる特定の方法は特に重大ではない。外来ヌクレオチド配列を宿主細胞へ導入するための良く知られた方法のいずれかが使用される。これらにはリン酸カルシウムによるトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔法、リポソーム、微量注入、プラスミドベクター、ウイルスベクターおよびクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝物質を宿主細胞へ導入するための他の良く知られた方法のいずれかの使用が含まれる（上記のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照せよ）。用いられる特定の遺伝子工学の方法が、望みのウイルスタンパク質を発現することができる少なくとも一つの遺伝子を宿主細胞にうまく導入できることだけが必要である。
【０１０７】
細胞に遺伝情報を移送するために用いられる特定のベクターはまた特に重大ではない。真核細胞で組換えタンパク質を発現するために使用される通常のベクターのいずれかが使用される。
【０１０８】
発現ベクターは真核生物の転写単位または真核細胞でウイルスの核酸配列を発現させるために必要な全ての要素を含む発現カセットを含む。典型的な発現カセットはウイルスタンパク質および転写の効率的なポリアデニレーションに必要なシグナルを暗号化したＤＮＡ配列に操作できるように連結したプロモーターを含む。
【０１０９】
ベクターは通常ナトリウム、カリウムＡＴＰａｓｅ、チミジンキナーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＣＡＤ（リン酸カルバミル合成酵素、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼおよびジヒドロオロターゼ）、アデノシンデアミナーゼ、ＤＨＦＲおよびアスパラギン合成酵素およびウアバイン選択のような選択マーカーを含む。
【０１１０】
本発明の発現ベクターは典型的には哺乳動物細胞のような真核細胞でのみ発現される一つまたはそれ以上の真核生物の転写単位とともに細菌へのベクターのクローニングを促進する原核生物の配列を含む。ベクターは真核生物のレプリコンを含んだり、含まなかったりする。真核生物のレプリコンが存在するなら、ベクターは適当な選択マーカーを用いて真核細胞で増幅可能である。ベクターが真核生物のレプリコンを含まないなら、エピソーム増幅は可能ではない。その代わりに、プロモーターが望みの遺伝子の発現を支配する場合、トランスフェクトされたＤＮＡはトランスフェクト細胞のゲノムに組み込まれる。発現ベクターは典型的には異なる、良く特性が明かなウイルスまたは哺乳動物の遺伝子に由来する要素から構築される。培養哺乳動物細胞でのクローニングされた遺伝子の発現についての一般的な考察に関しては、上記のＳａｍｂｒｏｏｋらの第１６章を参照せよ。
【０１１１】
発現ベクターが細胞の導入された後、トランスフェクトされた細胞はウイルスのタンパク質を発現するのに好ましい条件下で培養され、タンパク質は標準的な技術を用いて培養から回収される。例えば、硫安沈殿、ゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィまたは親和性クロマトグラフィのようなタンパク質を精製するための多くの標準的な方法が使用される。一般的には、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓの「タンパク質の精製」（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２年））を参照せよ。
【０１１２】
望みのウイルスゲノムにより暗号化されるタンパク質の使用に加え、ウイルスに特異的なエピトープに真似たペプチドもまたウイルスに特異的な抗体を産生するために使用される。そのような技術は技術者には良く知られており、例えば、Ｇｅｙｓｅｎらの「Ｍｕｌｔｉｐｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」（Ｃｏｓｅｌｃｏ Ｍｉｍｏｔｙｐｅｓ，ＰＴＹ Ｌｔｄ．）に記述される。
【０１１３】
上で考察されるポリペプチドは標準的な技術を用いて抗体を産生するために使用される。免疫グロブリンは各種の応用に利用される。例えば、免疫グロブリンは生物学的試料中のウイルスの存在を調べるために、また例えば親和性クロマトグラフィを用いてウイルス抗原を精製するために使用される。それらはまたウイルス全体の感染性の阻害を含むそれに相当するタンパク質を中和するために使用される。技術者が得られる各種の免疫グロブリン分子の生産および操作に関する多くの技術はそれ故特定の単離株の診断および検出に有効な分子を生産するために容易に応用される。
【０１１４】
ここで使用されるように、「免疫グロブリン」という用語は本質的に免疫グロブリン遺伝子により暗号化される一つまたはそれ以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。認識される免疫グロブリン遺伝子は、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子同様、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミューの定常領域遺伝子を含む。免疫グロブリンは、単鎖だけでなく、例えばＦｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２を含む抗体とは別に各種の形態で存在する（例えば、Ｈｕｓｔｏｎらの１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８５巻：５８７９から５８８３ページ；Ｂｉｒｄらの１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４２巻：４２３から４２６ページ；およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒとＨｏｏｄの１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ、第３２３巻：１５から１６ページ）。免疫グロブリンの構造および機能の一般的な概観については「基礎免疫学」第二版（Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎｓ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年））を参照せよ。
【０１１５】
望みの単離株に特異的なエピトープに結合する抗体は各種の方法により生産される。ヒトではない、例えばネズミ、ウサギ、ウマ等の単クローン抗体の生産は良く知られており、例えば、ウイルスまたはその断片を含む試料を用いて動物を免疫することにより行われる。免疫動物から得られた抗体産生細胞は標準的な技術を用いて不死化され、スクリーニングされる。単クローン抗体の産生についての一般的手順の考察は、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅによる「抗体、研究室マニュアル」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８８年））を参照せよ。
【０１１６】
ある環境では、非ヒト抗体の抗原結合領域、例えばＦ（ａｂ’）２またはハイパー可変領域をヒト定常領域（Ｆｃ）または枠組み領域に、本質的にヒト分子を生産するための組換えＤＮＡ技術により移すことが望まれる。そのような方法は一般に技術的に知られており、例えば、米国特許第４，８１６，３９７号、ＥＰ公示第１７３，４９４号および第２３９，４００号に記述される。代わって、Ｈｕｓｅらにより１９８６年にＳｃｉｅｎｃｅ、第２４６巻：１２７５から１２８１ページに概略された一般的プロトコールにしたがって、ヒトＢ細胞のＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、望みの特異生をもつ抗体（または結合断片）を暗号化する配列をクローニングし、増幅することにより、ウイルスに特異的に結合するヒト単クローン抗体またはその部分を暗号化するＤＮＡ配列を単離する。
【０１１７】
上述のように産生される免疫グロブリンはその後肝炎の単離株の存在に対する各種の診断方法に使用される。例えば、Ｃ９ウイルスに特異的な標識された免疫グロブリンは、ウイルスを含むと予想される試料と免疫グロブリンを接触させ、複合体が形成されるかを検出することを含む方法で使用される。標識は技術的に良く知られる方法にしたがって、直接的にまたは間接的に免疫グロブリンに共役される。標識オリゴヌクレオチドの状況で記述されるように、広い範囲の各種の標識が使用される。いくつかの方法のいずれか一つにより成分は標識される。検出の通常の方法は３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ標識化合物などを用いたオートラジオグラフィの使用である。放射活性同位元素の選択は合成の容易さ、変化する安定性および選択した同位元素の半減期による研究の優先に依存する。非放射活性標識は標識抗体、フルオロフォア、化学発光剤および酵素に結合するリガンドを含む。標識の選択は必要とされる感度、化合物との結合の容易さ、安定性の必要度および得られる手段に依存する。
【０１１８】
非放射性標識はしばしば間接的な方法により付与される。一般的に、リガンド分子（例えば、ビオチン）は分子に共有結合される。リガンドはその後、検出可能な酵素、蛍光化合物または化学発光化合物のようなシグナルシステムを本来検出できる、またはそれらに共有結合する抗リガンド（例えば、ストレプトアビジン）分子に結合する。リガンドおよび抗リガンドは広く変化する。リガンドが天然の抗リガンド、例えば、ビオチン、スロキシンおよびコルチゾルをもつ場合、リガンドは標識された天然に生じる抗リガンドとともに使用される。代わって、ハプテンまたは抗原化合物が抗体と組合わされて使用される。
【０１１９】
分子はまたシグナル生成化合物に直接的に、例えば酵素またはフルオロフォアと連結することにより結合される。標識として興味ある酵素は主として加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシドレダクターゼ、特にパーオキシダーゼである。蛍光化合物はフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等を含む。化学発光化合物はルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタールアジンジオン、例えばルミノールを含む。使用される各種のシグナル生成システムの概観については、米国特許第４，３９１，９０４号を参照せよ。
【０１２０】
複合体の存在を検出するために、反応液は典型的に二次抗体、プロテインＡまたはプロテインＧのような免疫グロブリンのＦｃ領域に結合できるタンパク質と接触される。タンパク質は好ましくは固体表面上で固定化され、固体表面は望みのウイルスに特異的な未結合の免疫グロブリンを除去するために洗浄される。生体分子を固体表面に固定化する多くの方法が技術的に知られている。例えば、固体表面は膜（例えば、ニトロセルロース）、マイクロタイターディッシュ（例えば、ＰＶＣまたはポリスチレン）またはビーズである。望みの成分は非特異的結合を介して、共有結合または非共有的に接触される。標識はその後使用される特定の標識に適した標準的な技術を用いて検出される。
【０１２１】
上述の組換えにより発現されたタンパク質またはウイルスのライゼートはまた診断手順に使用される。これらの手順は典型的に抗体を含むと予想される生物学的試料（例えば、血清）にウイルスを接触させ、免疫学的反応を検出することを含む。反応は好ましくは上述のような標識したタンパク質を用いて検出される。そのような手順についての適当な方法は米国特許第５，０５５，３９１号に詳細に記述される。
【０１２２】
以下に示される本発明の例は例証の目的を提供するもので、発明の範囲を限定するものではない。例に従う請求項の範囲内の発明の多数の具体例は前述の主文および後述の例を読むことにより通常の技術者に明かにされるだろう。
【０１２３】
【実施例】
【０１２４】
例１
均一ＲＴ−ＰＣＲでは、同一のポリメラーゼが逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼとして機能する。これによりＨＣＶのゲノムＲＮＡの最初の逆転写およびそれに続くｃＤＮＡの増幅は試薬を変える段階の間にチューブを開けることなしに同一チューブで行われる。
【０１２５】
核酸はＭｉｃｒｏＰｒｏｂｅ社のＩｓｏＱｕｉｃｋＴＭ核酸抽出キットを用いて血清または血漿から分離された。全ての増幅は全反応容量２０μｌで、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＴＣ９６００サーモサイクラーＴＭおよびＭｉｃｒｏＡｍｐＴＭチューブを用いて行われた。それぞれの２０μｌの反応試薬は以下の表５にあげられている。
【０１２６】
【表５】
【０１２７】
ＴＣ９６００は次の反応温度プロフィールを与えるようにプログラムされた。７０℃で１分間の予熱の後、プログラムは反応チューブを挿入するのに充分の長さで中断され、プログラムは再開され、逆転写させるために反応は７０℃で１５分間保持された。反応温度はその後ＲＮＡ−ｃＤＮＡ複合体を変性するために１分間９５℃に上げられた。次に反応温度は９５℃１５秒間および６０℃２０秒間を二回、続いて９０℃１５秒間および６０℃２０秒間を３８回循環した。最終的に反応温度は最後の伸長段階のために６０℃で４分間保持され、１５℃に冷却され、増幅された試料の解析が行えるまで室温に放置された。
【０１２８】
例２
ドットブロット様式の検出法を用いるために、増幅されたＤＮＡの一部分が変性されナイロンフィルターにのせられた後、標識プローブにハイブリダイズされる。プローブがハイブリダイズする領域はＫＹ８８（配列番号１２）で、プローブは３２Ｐで放射活性標識される。代わって、プローブは色素原または化学蛍光基質存在下での非同位元素検出の手段を提供するために西洋ワサビのパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）に共有結合される。
【０１２９】
増幅反応は一般に例１に記述されたように行われる。ＰＣＲで増幅された産物はその後アルカリ処理により変性される。ＰＣＲ産物５μｌに対して、５μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、８μｌの５Ｎ水酸化ナトリウムおよび８２μｌの水が添加される。変性を完全にするために混合液は室温で１０分間放置される。
【０１３０】
ＢｉｏＤｙｎｅＴＭＢナイロンフィルター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．、ＧｌｅｎＣｏｖｅ、ＮＹ、ＵＳＡ）は５から１０分間水に浸すことにより準備され、さらにｄｏｔｂｌｏｔ ｍａｎｉｆｏｌｄ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社のＢｉｏ−Ｄｏｔ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）が設定された後２００μｌの水で洗浄された。変性後、１００μｌの試料溶液はドットブロット器を用いて真空下でナイロン膜にのせられる。それぞれのウェルはその後２００μｌの０．４Ｎ水酸化ナトリウムで洗浄され、フィルター全体が簡単に２ｘＳＳＣで洗浄され、液体が残らなくなるまで風乾される。ＤＮＡは固定化され、ナイロンフィルターにＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）ＵＶ光ボックス（「自動クロスリンク」設定）を用いて、１２００ｍＪ／ｃｍ２の紫外線照射によりクロスリンクされる。
【０１３１】
フィルターは熱シールできる袋の中で少なくとも３０分間、５０℃で（空気振盪機）、ハイブリダイゼーション緩衝液（５ｘＳＳＰＥ、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．１％ＳＤＳ、５０μｇ／ｍｌマス精子ＤＮＡ）に浸すことにより「プレハイブリダイズ」される。緩衝液はその後１−２ｘ１０５ｃｐｍ／ｍｌのプローブを含む等量の同一溶液に置き換えられ、フィルターは２時間から一晩の間５０℃でハイブリダイズされる。
【０１３２】
ハイブリダイゼーション後、フィルターは２ｘＳＳＰＥ／０．１％ ＳＤＳで三回；室温で２０分間二回、および高緊縮度の温度の６０℃で２０分間を一回洗浄される。フィルターはその後乾燥され、プラスチックラップに包まれ、一枚または二枚の増感スクリーンとともに−７０℃でＸ線フィルムに露光される。
【０１３３】
視覚化の代替法は、それぞれ参考としてこの中に入れられているが、ＬｅｖｅｎｓｏｎとＣｈａｎｇによる、１９８９年のＰＣＲプロトコール：方法と応用へのガイド（Ｉｎｎｉｓら（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）の９２から１１２ページ、およびＳａｉｋｉらの１９８８年の、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３１９巻：５３７から５４１ページで記述されたように調製された西洋ワサビのパーオキシダーゼを結合したオリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイズすることである。ハイブリダイゼーションは５ｍｌのハイブリダイゼーション溶液あたり２ｐｍｏｌのＨＲＰ−ＳＳＯプローブを用いて行われる。
【０１３４】
洗浄後、色素原染色基質で現像されたフィルターは１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で洗浄され、０．１ｍｇ／ｍｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｆｌｕｋａ）および０．００１５％過酸化水素を含む１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）に置き換えられ、緩やかに攪拌しながら１０から３０分間室温でインキュベートされる。現像されたフィルターは水で洗浄され、直ちに写真撮影される。ＴＭＢ検出システムは本質的にＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから市販されるＡｍｐｌｉＴｙｐｅ ＤＱａ ＤＮＡタイピングキットに記述されているように調製され、使用される。別の具体例では、化学蛍光検出システム（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いてフィルターは現像される。フィルターは５分間ＰＢＳで洗浄され、緩やかに攪拌しながら１分間ＥＣＬ溶液に入れられる。フィルターはその後室温で１から５分間Ｘ線フィルムに露光される。
【０１３５】
例３
本発明のこの具体例では、リバースドットブロット法が使用される。プローブのハイブリダイゼーション領域はＫＹ８８（配列番号１２）、ＫＹ１５０（配列番号４３）またはＭＹ１６０（配列番号３７）であり、プローブは膜に固定される。増幅された標的ＤＮＡは、それぞれ参考文献としてこの中に入れられているが、申請中の第１９７，０００号および第３４７，４９５号；Ｓａｉｋｉらの１９８９年の、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第８６巻：６２３０から６２３４ページ；およびＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから市販されるＡｍｐｌｉＴｙｐｅ ＤＱａｌｐｈａ ＤＮＡタイピングキットの製品案内に記述されているように膜結合プローブにハイブリダイズされる。膜結合プローブにハイブリダイズする増幅されたＤＮＡが容易に検出されるように、増幅プライマーはＬｅｖｅｎｓｏｎとＣｈａｎｇが１９８９年に上に記述したようにビオチン化される。
【０１３６】
具体的には、ストレプトアビジンを結合した西洋ワサビのパーオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）を膜結合プローブにハイブリダイズするビオチン化された増幅ＤＮＡと反応させることにより、検出は行われる。それ故ＨＲＰはＳＡ−ビオチン相互作用を介して、増幅されたＤＮＡに結合するようになり、テトラメチルベンジジンの酸化による有色化合物の生成のような各種の良く知られた手段により、信号を生成するために使用される（米国特許第４，７８９，６３０号を参照せよ）。
【０１３７】
プローブはいずれかの手段で膜に固定されるが、好ましい方法はさらに長いポリｄＴ配列をプローブのハイブリダイズする領域に付加することを含む。得られたポリｄＴ「テール」はプローブを共有結合で膜に固定するために、ナイロン膜のアミン基と反応される。この反応はＵＶ照射により促進される。
【０１３８】
市販のＤＮＡ合成機でテールを付加したプローブを合成することもできるが、プローブにポリｄＴテールを生成するために末端デオキシリボヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ、Ｒａｔｌｉｆｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；以下の反応に対して濃度約１２０単位／μｌ（１００ｐｍｏｌｅ／μｌ））が使用される。しかし、テールを付加したプローブの作製のためにＤＮＡ合成機を使用した場合、望ましくない未成熟な鎖停止がテール領域に最初に起きるように、プローブの５’端にテールを置くべきである。
【０１３９】
ＴｄＴ反応は１ｘＴｄＴ塩、２００ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチド、８００μＭ ＤＴＴおよび６０単位のＴｄＴを含む容量約１００μｌで行われるべきである。１０ｘＴｄＴ塩は１０００Ｍｍカコジル酸カリウム、１０ｍＭ塩化コバルト、２ｍＭジチオスレイトール、２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で、参考文献としてこの中に入れられているが、ＲｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙとＷｕの、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ１．、第６５巻：４３から６２ページに記述されるように調製される。８ｍＭ ｄＴＴＰの１０ｘ保存溶液が便宜上（水酸化ナトリウムでｐＨ７に中和されて）調製される。
【０１４０】
ＴｄＴ反応は３７℃で２時間行われ、その後１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を１００μｌ添加することにより停止される。テールを付加されたオリゴヌクレオチドの終濃度は１μＭ（１ｐｍｏｌｅ／μｌ）で、ホモポリマーのテールの長さは約４００残基である。テールの長さはｄＴＴＰのオリゴヌクレオチドに対する分子比を調整することにより変化させることができる。テールを付加したプローブは使用まで−２０℃で保存される。
【０１４１】
リバースドットブロット法に好ましいナイロン膜はＰａｌｌ製で、ＢｉｏＴｒａｎｓナイロン膜としてＩＣＮから市販されるポアサイズ０．４５ミクロンのＢｉｏｄｙｎｅ Ｂナイロン膜である。プローブはＢｉｏＲａｄ製のＢｉｏ−Ｄｏｔドットブロット器を用いて非常に簡便に膜上にスポットされる。それぞれのプロープは膜の独立の別個の位置にスポットされる。約２から１０ｐｍｏｌｅのそれぞれのテールを付加されたプローブはドットブロット器にのせる前に５０から１００μｌのＴＥ緩衝液に予め混合される。ドットブロット後、膜は過剰の液体をぬぐうために吸収紙の上に簡単に置かれる。膜はその後Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ製のＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ光ボックスのようなＵＶ光ボックスの中に置かれ、テールを付加したプローブをナイロン膜に固定するために、２５４ｎｍで５０から６０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶ光に露光される。未結合のプローブを除去するためにハイブリダイゼーション溶液で約１５分間簡単に洗浄した後、膜はビオチン化されたＰＣＲ産物とのハイブリダイゼーションに供せられる。
【０１４２】
増幅されたＰＣＲ産物は３から１０分間９５℃で熱処理することにより変性され、４０μｌの変性されたＰＣＲ産物はハイブリダイゼーションのためにそれぞれのプローブパネルに添加される。ハイブリダイゼーションは０．５ｘＳＳＰＥ、０．２５％ ＳＤＳおよび５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液（２０ｘＳＳＰＥが０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、０．２Ｍリン酸−ナトリウム、３．６Ｍ塩化ナトリウムを含み、０．１１Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ７．４に調整される）からなるハイブリダイゼーション緩衝液中で、振とう水浴を用いて、２０分間５７℃で行われる。ハイブリダイゼーション緩衝液は３．１ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液に２５μｌのＳＡ−ＨＲＰを含む溶液３ｍｌに置き換えられ、振とう水浴で５７℃２０分間インキュベートされる。
【０１４３】
洗浄は２ｘＳＳＰＥおよび０．１％ ＳＤＳの洗浄緩衝液中で行われる。１０ｍｌの洗浄緩衝液での膜の簡単な洗浄の後、１０ｍｌの緩衝液での１２分間のきつい洗浄が５７℃で行われる。さらに５分間の室温での洗浄が行われ、続いて、１０ｍｌの０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で５分間の洗浄が行われる。
【０１４４】
色素原の結合は５ｍｌの０．１Ｍクエン酸ナトリウム、５μｌの３％過酸化水素および０．２５ｍｌの色素原（Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒのＴＭＢ）からなる色素原溶液５ｍｌ中で室温、２５から３０分間行われる。蒸留水による１０分間の洗浄が三回室温で行われる。室温３０分間の１ｘＰＢＳによる後洗浄により信号の質を高めることができる。色素原を含むこれらの段階の間、膜はアルミ箔で覆うことにより遮光される。現像された膜は永久に記録するために写真撮影される。
【０１４５】
例４
本発明のこの具体例では、マイクロタイタープレート法が使用される。プローブはマイクロタイタープレートのウェルに固定される。増幅された標的ＤＮＡは上述のように結合プローブにハイブリダイズされる。前例のように、増幅プライマーは結合プローブにハイブリダイズする増幅されたＤＮＡの検出をさせるためにビオチン化される。
【０１４６】
ＢＳＡに結合した望みのプローブが最初に個々のウェルのプラスチック表面に吸着される。ウェルはその後ウシ血清アルブミンのようなタンパク質でブロックされる。好ましくはＣｏｒｎｉｎｇ製の９６ウェルのプレートが使用される。
【０１４７】
増幅が完了すると、ＰＣＲチューブはサーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製）から取り出される。１００μｌの変性溶液がそれぞれのＰＣＲチューブに添加される。それぞれのチューブに新しいピペットチップが使用される。一つの具体例では、検出は直ちには行われない。その場合、ＰＣＲチューブは２℃から８℃で一晩保存された。変性された増幅反応は２℃から８℃の保存で粘性をもつようになる。ピペットを容易にするために、チューブを開ける前に、チューブは簡単に２５℃から３０℃で温められる。
【０１４８】
適当数の８ウェルマイクロタイタープレートストリップ（最少で２ストリップ）が取り出され、マイクロタイタープレート枠にセットされた。１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液がマイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに添加された。
【０１４９】
変性溶液は０．４Ｍ水酸化ナトリウム、８０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．００５％チモールブルーを含む。ハイブリダイゼーション／中和緩衝液は２．５Ｍチオシアン化ナトリウム、８０ｍＭリン酸二ナトリウム、１０ｍＭリン酸一ナトリウムおよび０．１２５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む。使用前にｐＨが５．０＋／−０．２であることがチェックされる。
【０１５０】
複数チャンネルピペットについたチップを用いて、それぞれのＰＣＲチューブの変性された増幅反応液２５μｌがマイクロタイタープレートの相当する位置のウェルに入れられた。プレートは蓋で覆われ、緩やかに１０から１５秒側面をたたかれた。適正な試薬が入れられたウェルは黄色に着色する。無色または青色への単一な変化だけが注目されるなら、過剰のアンプリコンが添加される。正のＯＤ値は増加するが負のＯＤ値は影響されないように、試験は継続される。プレートは３７℃で６０分間インキュベートされた。
【０１５１】
インキュベーションに続き、プレートは洗浄溶液で五回洗浄された。プレートの洗浄は手動で、またはそれに応じてプログラムされた自動マイクロタイタープレート洗浄機を用いて行われる。洗浄には１ｘＰＣＲ洗浄緩衝液が使用された。１０ｘ濃度のＰＣＲ洗浄緩衝液は次のように調製された：９．９４ｇ／ｌのリン酸二ナトリウム；４．４１ｇ／ｌのリン酸一ナトリウム；３．７２２ｇ／ｌのＥＤＴＡ；８７．６６ｇ／ｌの塩化ナトリウム；１３．７ｇ／ｌのＴＷｅｅｎ２０および１０ｇ／ｌのＰｒｏ Ｃｌｉｎ ３００（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）。溶液はリン酸でｐＨ調整される（ｐＨ６．５から７．１が好ましい）。
【０１５２】
手動洗浄では、プレートの内容物は空にされ、乾燥された。３００μｌの洗浄溶液が試験されたプレートのそれぞれのウェルに添加され、プレートは１５から３０秒乾かされた。プレートは再び空にされ、乾燥された。この洗浄過程はさらに四回繰り返された。
【０１５３】
自動マイクロプレート洗浄機では、次の方法が使用された。ウェルの内容物は吸引された。試験されたプレートのそれぞれのウェルに３５０μｌの洗浄溶液が添加されるように洗浄機はプログラムされ、３０秒間浸された後、吸引された。これらの段階はさらに四回繰り返された。プレートはその後乾燥された。
【０１５４】
１００μｌのコンジュゲートが試験されるプレートのそれぞれのウェルに添加された。アビジン−ＨＲＰコンジュゲートは次のように調製される。希釈液は０．１モル；０．２５％ Ｅｍｕｌｓｉｔ２５（ＤＫＳ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）；１．０％ ＫａｔｈｏｎＣＧ（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）；０．１％フェノール；１．０％ウシγ−グロブリンを含む。溶液は濃塩酸でｐＨを７．３に調整された。この希釈液に対して、１０ｎＭのコンジュゲートアビジンが添加された（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）。プレートは蓋をされ、３７℃で５０分間インキュベートされた後、上述のように再び洗浄された。作業基質は８ウェルのマイクロタイタープレートストリップ二枚（１６検体）それぞれに対し２．０ｍ１の基質Ａおよび０．５ｍｌの基質Ｂを混合することにより調製された。基質Ａは３ｍＭ過酸化水素；６．５ｍＭクエン酸および０．１％ Ｋａｔｈｏｎ ＣＧを含む。基質Ｂは４．２ｍＭ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンおよび４０％ジメチルホルムアミドを含む。作業基質は使用前３時間以内に調製され、直射日光を避けて保存された。
【０１５５】
１００μｌの作業基質（基質ＡおよびＢの混合液）が試験されるプレートのそれぞれのウェルに添加された。プレートは蓋をされ、暗所で１０分間、室温（２０℃から２５℃）でインキュベートされた。１００μｌの停止試薬（５％硫酸）が試験されたそれぞれのウェルに添加された。それぞれのウェルの４５０ｎｍでの吸光度が停止試薬添加後１時間以内に読まれた。試料および対照の吸光度の値が記録された。
【０１５６】
例５
本発明のオリゴヌクレオチドはＨＣＶゲノムの配列の増幅および増幅産物の検出に使用される多くの組合わせのプライマーおよびプローブを提供する。非常に多くのオリゴヌクレオチドがＲＴ−ＰＣＲ増幅でのプライマーとしての効果について試験された。
【０１５７】
ＰＣＲ増幅反応は例１に記述された方法を用いて、各種のオリゴヌクレオチドの対で行われた。増幅産物はアガロースゲル電気泳動分離および染色の標準的な方法により検出された（上述のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照）。上流プライマーＫＹ６５（配列番号１）およびＫＹ９８（配列番号３）のそれぞれはＨＣＶ配列の増幅において、下流プライマーＫＹ６８（配列番号２７）、ＫＹ９５（配列番号２０）およびＫＹ９９（配列番号２６）のそれぞれと効果的に機能した。ＫＹ６７（配列番号１０）はＫＹ６８（配列番号２７）およびＫＹ９９（配列番号２６）の両者と効果的に機能した。上流プライマーＫＹ８０（配列番号５）、ＫＹ８３（配列番号７）、ＫＹ８４（配列番号８）、ＫＹ８５（配列番号９）およびＫＹ１４４（配列番号６）のそれぞれは下流プライマーＫＹ７８（配列番号１８）、ＫＹ９５（配列番号２０）、ＫＹ１４５（配列番号１９）、ＫＹ１４８（配列番号１７）およびＫＹ１４９（配列番号１６）のそれぞれと効果的に機能した。最後に、上流プライマーＫＹ８０（配列番号５）およびＫＹ８１（配列番号１１）のそれぞれはＫＹ１００（配列番号２１）と効果的に機能した。
【０１５８】
プライマーとしてＫＹ７８（配列番号１８）およびＫＹ８０（配列番号５）を用いたＰＣＲ増幅の増幅産物は上記の例２に記述される方法を用いて、ＫＹ８８（配列番号１２）、ＫＹ８４（配列番号８）およびＫＹ８５（配列番号９）のそれぞれで探索することにより検出された。
【０１５９】
プライマーＫＹ１５３（配列番号１５）、ＫＹ１４９（配列番号１６）およびＫＹ１４８（配列番号１７）はＫＹ８５の下流の上流プライマーのいずれとも使用できない。ＫＹ７８（配列番号１８）の３’端はＫＹ８８（配列番号１２）の３’端に隣接しており、これら二つのプライマーはプライマーの対として機能できるが、介在配列が欠如しているために独立した探索は不可能である。プライマーＫＹ８６（配列番号１３）はＫＹ１００（配列番号２１）、ＫＹ９９（配列番号２６）、ＫＹ１０９（配列番号２４）およびＫＹ１１１（配列番号２５）とだけ対となることができる。プライマーＫＹ８７（配列番号１４）はＫＹ９９（配列番号２６）、ＫＹ１０９（配列番号２４）およびＫＹ１１１（配列番号２５）とだけ対となることができる。
【０１６０】
上で討論されたＫＹ８４（配列番号８）、ＫＹ８５（配列番号９）、ＫＹ８７（配列番号１４）およびＫＹ１４８（配列番号１７）はＣ９単離株とは別の既知のＨＣＶ単離株の検出に有効である。表４に表されるプローブおよびプライマーはＨＣＶ−Ｃ９および関連変異株を増幅、検出し、ＪａｐａｎおよびＵＳのＨＣＶ原型を排除するために特異的である。
【０１６１】
特異的にＪａｐａｎおよびＵＳのＨＣＶ原型を増幅し、ＨＣＶ−Ｃ９は増幅しないプライマーはＫＹ８４（配列番号８）、ＫＹ８５（配列番号９）、ＫＹ１４８（配列番号１７）およびＫＹ８７（配列番号１４）により例示される。Ｊａｐａｎ、ＵＳおよびＣ９のＨＣＶ原型を増幅するためのプライマーはＫＹ６７（配列番号１０）、ＫＹ７８（配列番号１８）、ＫＹ８０（配列番号５）、ＫＹ８１（配列番号１１）、ＫＹ８３（配列番号７）、ＫＹ８６（配列番号１３）、ＫＹ８８（配列番号１２）、ＫＹ９５（配列番号２０）、ＫＹ１００（配列番号２１）、ＫＹ１４４（配列番号６）、ＫＹ１４５（配列番号１９）およびＫＹ１５３（配列番号１５）を含む。プライマーＫＹ６５（配列番号１）、ＫＹ６８（配列番号２７）、ＫＹ９８（配列番号３）、ＫＹ９９（配列番号２６）、ＫＹ１０９（配列番号２４）、ＫＹ１１１（配列番号２５）およびＫＹ１４９（配列番号１６）はＪａｐａｎおよびＵＳのＨＣＶ原型および関連変異単離株を増幅するために適しており、同様にＨＣＶ−Ｃ９および関連同型を検出する場合にも適している。
【０１６２】
Ｊａｐａｎ、ＵＳおよびＣ９のＨＣＶ原型および関連変異株を検出するためのプローブはＫＹ６７（配列番号１０）、ＫＹ７８（配列番号１８）、ＫＹ８１（配列番号１１）、ＫＹ８６（配列番号１３）、ＫＹ９５（配列番号２０）、ＫＹ１５０（配列番号４３）およびＫＹ１４５（配列番号１９）により例示される。Ｊａｐａｎ、ＵＳのＨＣＶ原型および関連変異株を検出し、ＨＣＶ−Ｃ９原型を検出しないプローブはＫＹ８３（配列番号７）、ＫＹ８７（配列番号１４）、ＫＹ８４（配列番号８）、ＫＹ８８（配列番号１２）、ＫＹ８５（配列番号９）、ＫＹ１００（配列番号２１）、ＫＹ１４８（配列番号１７）およびＫＹ１４９（配列番号１６）を含む。プローブＫＹ６５（配列番号１）、ＫＹ６８（配列番号２７）、ＫＹ８２（配列番号２８）、ＫＹ９９（配列番号２６）、ＫＹ１０９（配列番号２４）、ＫＹ１１１（配列番号２５）、ＫＹ８０（配列番号５）、ＫＹ１４４（配列番号６）およびＫＹ１５３（配列番号１５）はＪａｐａｎおよびＵＳのＨＣＶ原型および関連変異単離株を検出するのに適しており、同様にＨＣＶ−Ｃ９および関連変異株を検出する場合にも適している。
【０１６３】
例６
ＵＮＧ存在下でのＨＣＶ ＲＮＡの均一ＲＴ／ＰＣＲ増幅は好ましい方法である。例１に記述される均一ＲＴ−ＰＣＲ増幅法は弱化段階を含むように改められた。以下に記述されるプロトコールはＲＴおよびＰＣＲがｄＵＴＰを取り込むことを示す。弱化はＲＴ段階の前に５０℃で起きる。上昇したＲＴ−ＰＣＲ反応温度で、ＵＮＧは不活性で、ｄＵを含む産物は分解されない。２単位のＵＮＧ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）は１００００コピーのＨＣＶ ＲＮＡからつくられた１００μｌの増幅産物の０．２５μｌに相当する持ち越し分をうまく弱化した。例えば、１００μｌ反応あたり６単位までのより高い量のＵＮＧもまた敵している。反応系の成分は次の順で添加された：
【０１６４】
【０１６５】
＊１ｘ酵素保存緩衝液＝（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ〔ｐＨ７．５〕、１００ｍＭ塩化カリウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５％ ＴＷｅｅｎ２０〔Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｕｒｆａｔａｍｐｓ〕、５０％グリセロール〔ｖ／ｖ〕）。
【０１６６】
＊＊Ｐｈａｒｍａｃｉａ製の１ｍｇのポリｒＡホモポリマーＲＮＡ（Ｎｏ２７−ポリｒＡは平均Ｓ２０，ｗ＝８．８（６から１３の範囲）をもつ）またはアニーリング温度でいくつかの非特異的な産物を反応あたり２００ｎｇ以下の添加レベルで使用した。仔ウシ胸腺ＤＮＡ、ＰＢＬ ＤＮＡ、ヒト胎盤ＤＮＡおよび細胞系列Ｋ５６２のＤＮＡが試験され、同様であった。
【０１６７】
手順：
１．カバーを予め熱するためにＴＣ９６００サーモサイクラーをオンにする。
２．室温で反応液を準備する。
３．サーモサイクラーにチューブを入れ、サーモサイクラーを再始動するために「運転」を押す。
４．ファイル８で機械を始動する。
５．提案されたサーモサイクラーの条件：
ファイル１：５０℃で２分間保持（ＵＮＧ弱化段階）
ファイル２：７０℃で１５分間保持（逆転写段階）
ファイル３：９５℃で１分間保持
ファイル４：二段階温度、９５℃１５秒および６０℃１０から３０秒を二回
ファイル５：二段階温度、９０℃１５秒および６０℃１０から３０秒を３８回
ファイル６：７２℃で１時間保持
ファイル７：１５℃に保持、無制限
ファイル８：ファイル１、２、３、４、５、６および７を連結
【０１６８】
段階５のファイル２で、１５分の反応時間は反応効率を下げることなしに、５分まで減少できる。段階５のファイル５で、高Ｇ＋Ｃの鋳型の場合、変性温度を９５℃まで上げることが好ましい。マイクロタイタープレート法による反応産物の解析から一般に正の試料で０．８以上の、および負の試料で０．５より小さい吸収値という結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【図１】新規変異株ＨＣＶの配列Ｃ９、四種の関連変異株および原型ＪａｐａｎおよびＵＳ ＨＣＶ単離株を並列したものを示す。
【図２】新規変異株ＨＣＶの配列Ｃ９、四種の関連変異株および原型ＪａｐａｎおよびＵＳ ＨＣＶ単離株を並列したものを示す
本発明は非Ａ非Ｂ肝炎の原因であるＣ型肝炎ウイルスの検出のための試薬および方法を提供するものである。試薬には特にウイルスＲＮＡゲノムの逆転写およびそれに続くポリメラーゼ連鎖反応による逆転写により作製されたｃＤＮＡの増幅の両者のためのオリゴヌクレオチドプライマーが含まれる。配列特異的オリゴヌクレオチドプローブは増幅されたＨＣＶの核酸配列の検出のために準備される。プライマーおよびプローブはＨＣＶ感染の検出のための診断試験に有効である。この診断試験は臨床および伝染病学的環境で重要な応用性をもつ。
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は非Ａ非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）の計り知れないほど多くの原因の一つである。原型ＨＣＶはＣｈｏｏらにより１９８９年にＳｃｉｅｎＣｅ、第２４４巻：３５９から３６２ページで報告されたように、感染チンパンジーの血漿から得られた血液由来のＮＡＮＢＨウイルスのｃＤＮＡクローンから同定された。この原型ＨＣＶの遺伝子のヌクレオチド配列は欧州特許公示第３１８，２１６号；第３８８，２３２号および第３９８，７４８号で記述されている。ＨＣＶゲノムのヌクレオチド配列はＣｈｏｏらの１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８８巻：２４５１から２４５５ページに報告され、関連ウイルスと比較された。
【０００３】
それ以来他の株の配列が報告されている。ＨＣＶのゲノムは単離株の間で非常に大きな核酸配列の不均一性を示す。ＨＣＶのＲＮＡゲノムのｃＤＮＡの分離がＫｕｂｏｅｔらの１９８９年、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第１７巻、１０３６７から１０３７２ページに報告された。著者らは上述のＣｈｏｏらが１９８９年に報告した配列に基づく逆転写プライマーを構築した。分離されたＨＣＶゲノムの断片は原型ＨＣＶの配列と７９．８％のホモロジーを示した。類似のプロトコールにより得られた三種の異なる領域の配列が、Ｔａｋｅｕｃｈｉらにより、１９９０年、Ｇｅｎｅ、第９１巻：２８７から２９１ページに報告された。原型配列との配列ホモロジーが一つの領域について７３．５％程度であることが報告された。
【０００４】
日本人患者から分離された株のＨＣＶのゲノム配列がＫａｔｏらにより１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８７巻：９５２４から９５２８ページに報告された。配列は比較された領域全体で原型ＨＣＶのゲノムと７７．４％のホモロジーを示した。Ｔａｋａｍｉｚａｗａらにより１９９１年にＪ．Ｖｉｒｏｌ．、第６５巻（第３号）：１１０５から１１１３ページに報告されたＨＣＶゲノムの全コーディング領域の配列は原型ＨＣＶ株と７７％のホモロジーを示した。
【０００５】
日本では、Ｋ１およびＫ２と命名された、ゲノムの４００ヌクレオチド領域に基づく二つの主たる株が観察されている。これらの株は原型ＨＣＶ配列と６７％程度の配列ホモロジーをもつ（Ｅｎｏｍｏｔｏらの１９９０年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第１７０巻（第３号）：１０２１から１０２５ページを参照せよ）。Ｋ２株はさらに、グループ間で約２０％のヌクレオチド変異およびそれぞれのグループ内で約５％のヌクレオチド変異をもつＫａおよびＫｂと命名された二つのグループに細分された。
【０００６】
原型ＨＣＶの配列と類似したレベルのホモロジーがＫａｔｏらにより１９９０年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、第８６巻：１７６４から１７６７ページに報告された。１５人の患者からｃＤＮＡ断片が増幅され、配列が決定された。原型の配列の３５２５から３５６１の位置に相当する増幅された３７ヌクレオチドの部分は原型ＨＣＶの配列と６８から７８％のホモロジーを示した。
【０００７】
ＨＣＶのゲノムＲＮＡは、ゲノムＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、ポリメラーゼ連鎖反応によりｃＤＮＡを増幅し、さらに配列特異的オリゴヌクレオチドで調査することにより血清に検出される。ＨＣＶ株間の配列の不均一性のために、プライマーおよびプローブは株の間で配列が保存される領域が見いだされない限り、株特異的である。そのような保存された領域の一つはＨＣＶゲノムの５’端である。
【０００８】
ＨＣＶゲノムの５’端の非コーディング配列は最初にＯｋａｍｏｔｏらにより１９９０年に、Ｊａｐａｎ Ｊ．ＥＸｐ．Ｍｅｄ．、第６０巻（第３号）：１６７から１７７ページで報告された。二つの株の間の比較は５’端の非コーディング配列が保存されていることを示唆した。ＨＣＶゲノムの５’端の非コーディング配列の保存された性質はまた、Ｈａｎらにより１９９１年に、ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８８巻：１７１１から１７１５ページに報告された。五大陸の個人から回収された１１のＨＣＶ単離株から得られた３４１ヌクレオチド領域の部分配列が比較された。七つの配列が原型配列と完全なホモロジーを示し、残りの四つが１から５個の塩基のミスマッチを示した。
【０００９】
Ｏｋａｍｏｔｏらの１９９０年、Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第６０巻（第３号）：２１５から２２２ページには、保存された５’非コーディング領域を含むＨＣＶゲノムの各種の領域に対するプライマーが記述された。保存された領域から選択されたプライマーはうまく試験された殆どの株の核酸を増幅し、不均一な領域から選択されたプライマーは株の小さな部分の核酸を増幅した。しかし、これらのプライマーを用いた増幅効率は低かった。参考文献では二段階ＰＣＲ増幅を記述しており、二回目の増幅は以前に増幅された標的領域について、第一のプライマーのセットにより増幅された領域内に入れ子になる第二のプライマーのセットを用いて行われた。
【００１０】
二つのセットのプライマーを用いる二回の増幅を必要とするＰＣＲ増幅はまたＧａｒｓｏｎらにより、１９９０年、Ｌａｎｃｅｔ、第３３５巻：１４１９から１４２２ページに報告された。非構造タンパク質（ＮＳ５）を暗号化する領域が増幅された。配列の不均一性のために、これらのプライマーにより認識されないＨＣＶ配列が存在する（Ｇａｒｓｏｎらの、１９９０年、Ｌａｎｃｅｔ、第３３６巻：８７８から８７９ページを参照せよ）。その結果として、保存された５’非コーディング領域のプライマーが試みられたが、充分な感度を得るために、入れ子になったプライマーのセットを用いた二段階増幅が依然として必要であった。入れ子プライマーを用いた二回の増幅による５’端領域の増幅はまた、Ｋａｎａｉらにより、１９９０年に、Ｌａｎｃｅｔ、第３３６巻：２４５ページに報告された。
【００１１】
入れ子プライマーでの二回の増幅を用いた増幅は非能率的であるだけでなく、汚染の可能性を大いに増加する。汚染の問題は技術的に良く知られており、増幅段階の間にプライマーを変え、試薬を加えるために反応チューブを開けることは少しでも可能ならば最も避けられるべきである。汚染の問題はさらに、最初の逆転写段階およびそれに続くＰＣＲ増幅の間で反応条件を変える必要があるために悪化する。
【００１２】
全て、または殆ど全ての株が増幅されるように保存された領域からそれぞれ選択されたＨＣＶの配列を増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドおよび一つのセットのプライマーでの増幅が充分であるような効果的な増幅方法の必要が依然として存在する。プライマーがハイブリダイズする二つの保存された領域間の保存された領域から選択された増幅されたｃＤＮＡの検出のためのプローブオリゴヌクレオチドの必要もまた存在する。同一試薬を使用し、それにより増幅過程中に反応チューブを開ける必要を除去するような逆転写およびＰＣＲを行わせる反応プロトコールおよび試薬が必要とされる。
【００１３】
さらに、ＮＡＮＢＨの例の１０％は原型のキャプシドおよびエンベロープ抗原とは非反応性である（Ｃｈａｕｄｈａｒｙらの１９９１年、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２９巻：２３２９から２３３０ページおよびＨｏｓｅｉｎらの１９９１年、ＰＮＡＳ、第８巻：３６４７から３６５１ページを参照せよ）。それ故、診断および新しい単離株により暗号化される抗原に基づくＰＣＲの開発は、血清学に基づく診断試験の信頼性を改善するであろう。本発明はＨＣＶを検出するためのプライマー、プローブおよび方法を提供することによりこれらの必要に応ずるものである。
【００１４】
提供される特異的プライマーおよび配列特異的オリゴヌクレオチドプローブは、ウイルスのＲＮＡゲノムの配列の増幅および検出を可能にする均一逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で使用される。本発明のプライマーおよび方法を用いる増幅の効率は、入れ子プライマーでの二回のＰＣＲ増幅の必要を除去し、その結果得られる試験の感度の高さは核酸の信頼できる検出を提供する。
【００１５】
本発明の一つの面は特異的オリゴヌクレオチドプライマーに関するものである。本発明はＨＣＶの核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを含む構成物を提供するものであり、前記プライマーはＪａｐａｎ、ＵＳおよびＣ９株からなるグループから選択されるＨＣＶ株またはその同型の核酸部分配列を増幅するのに適している。提供されるプライマーはウイルスのＲＮＡゲノムの逆転写およびそれに続くポリメラーゼ連鎖反応を用いた作製されたｃＤＮＡの増幅の両者で機能する。プライマーはＨＣＶゲノムの保存された領域の配列にハイブリダイズし、それ故、各種の株に結合する。提供されたプライマーを用いた増幅の効率は入れ子プライマーでの二回のＰＣＲ増幅の必要を除去するのに充分である。
【００１６】
本発明の別の面は株に関係のないＨＣＶゲノムの核酸の存在を検出することができるプローブに関するものである。プローブは株全体に保存される領域に相補的である。本発明のプローブを用いた診断試験は特異性を落すことなしに非常に多くのＨＣＶ株を検出できる。それ故、本発明はＣ型肝炎ウイルスの核酸の存在を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブを含む構成物を提供するものであり、前記プローブはＪａｐａｎ、ＵＳおよびＣ９原型株からなるグループから選択されるＨＣＶ株またはその変異株の核酸を検出するのに適している。
【００１７】
本発明の第三の面はキットに関するものである。これらのキットは各種の形態をとり、一つまたはそれ以上の逆転写、増幅または検出の試薬、例えばプライマー、プローブ、ポリメラーゼ、グリコシラーゼ、緩衝液およびヌクレオシド三リン酸を含むことができる。
【００１８
一つの具体例として、本発明は肝炎ウイルスのＣ９単離株に特異的な核酸の検出のためのキットを提供するものであり、キットは実質的にＨＣＶ−Ｃ９ウイルスの核酸部分配列に結合する核酸プローブを含むコンパートメントからなる。
【００１９】
本発明の別の面はＨＣＶのＲＮＡを増幅し、検出する方法に関するものである。
【００２０】
さらに、本発明は配列番号２９に実質的に相同なウイルス核酸配列を含む構成物に関するものである。ここでＣ９単離株を意味するそのようなウイルス配列を含むｃＤＮＡクローンであるＰＨＣＶ−Ｃ９は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、寄託番号７５２６５をもつ。
【００２１】
本発明はまた、Ｃ９単離株および関連の変異株に特異的な核酸配列を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを提供するものである。本発明のプローブは好ましくは次のグループ：
【化１】
【００２２】
本発明はさらに、Ｃ９単離株に特異的な核酸配列の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーを提供するものである。特異的にＣ９変異株および関連の単離株を増幅するための本発明のプライマーは好ましくは次の下流プライマー：
【化２】
【化３】
【００２３】
本発明はまたＣ９単離株および以前に同定されたＣ型肝炎単離株の配列に実質的に結合するプローブを提供するものである。この範囲の好ましいプローブには
【化４】
【００２４】
本発明はＣ型肝炎のゲノム核酸の存在を検出する方法を提供するものであり、前記Ｃ型肝炎のゲノム核酸はＪａｐａｎ、ＵＳおよびＣ９原型株からなるグループから選択される核酸であって、（ａ）核酸部分配列を増幅すること；（ｂ）プローブが核酸部分配列に結合し、安定な雑種二重鎖を形成するような条件下で、増幅された核酸をその部分配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと混合すること；および（ｃ）その部分配列およびプローブの間に形成される雑種を検出することからなる。
【００２５】
別の具体例では、本発明は肝炎ウイルスのＣ９単離株を検出する方法を提供するものであり、その方法は（ａ）ＨＣＶ−Ｃ９の核酸配列を含むことが予想される試料をＨＣＶ−Ｃ９の核酸配列に相補的な部分をもつ核酸プローブと接触させること；および（ｂ）プローブの前記配列とのハイブリダイゼーションを検出することの段階を含む。
【００２６】
本方法はさらに、段階（ａ）の前に、ウイルスに特異的な配列の部分を増幅する段階を含む。増幅は好ましくはポリメラーゼ連鎖反応法の使用により行われる。上記のプライマーおよびプローブは好ましくは本発明の方法で使用される。
【００２７】
本発明はまた肝炎ウイルスのＣ９単離株に特異的な核酸の検出のためのキットを提供するものである。キットは核酸配列の核酸部分配列に実質的に結合する核酸プローブを含むコンパートメントからなる。プローブは好ましくは上掲のグループから選択される。
【００２８】
代替測定法は血清抗体のＣ９単離株のタンパク質またはウイルスライゼートとの反応または、ウイルス抗原に対して生じた免疫グロブリンのウイルスを含む生物学的試料との反応のような免疫学的反応に基づくものである。本発明はそれ故、Ｃ９単離株に対して生じた生物学的に純粋な免疫グロブリンを提供するものである。免疫グロブリンは好ましくは単クローン抗体である。
【００２９】
本発明を理解する目的のために、いくつかの用語が以下に定義される。
【００３０】
「増幅反応液」は、標的核酸を増幅するために使用される各種の試薬を含む水溶液を意味する。これらには酵素、水性緩衝液、塩、標的核酸およびデオキシヌクレオシド三リン酸が含まれる。内容に依存して、反応液は完全または不完全な増幅反応液となる。
【００３１】
「増幅反応システム」は、核酸の標的配列のコピーを増加させるための試験管内の手段を意味する。そのような方法には限定はされないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＤＮＡリガーゼ、ＱＢ ＲＮＡレプリカーゼおよびＲＮＡ転写に基づく増幅システムが含まれる。これらは複数の増幅試薬を含み、以下にさらに充分に記述される。
【００３２】
「増幅反応チューブ」は、増幅試薬を入れるのに適している容器を意味する。一般的にチューブは使用される増幅システムを阻害または干渉しないような不活性な素材でつくられる。システムが加熱および冷却の繰返しの熱サイクルを必要とする場合、チューブはサイクルの過程に耐え、典型的には正確にサーモサイクラーのウェルに適合しなければならない。
【００３３】
「増幅試薬」は、選択された増幅方法を実施するために使用される各種の緩衝液、酵素、プライマー、デオキシヌクレオシド三リン酸（通常の、および自由な）およびプローブを意味する。
【００３４】
典型的には標的核酸の「指数的な」増加を意味する「増幅すること」または「増幅」は、ここでは核酸の選択された標的配列の数の直線的および指数的な増加を記述するために用いられる。
【００３５】
「実質的な結合」は、オリゴヌクレオチドおよび標的配列の間の相補的なハイブリダイゼーションを意味し、ＰＣＲポリメラーゼの望みのプライミングまたはハイブリダイゼーション信号の検出を行うために、ハイブリダイゼーションの媒体の緊縮度を減少することにより調節される重要でないミスマッチを含む。
【００３６】
「生物学的に純粋な」という表現は、実質的にまたは本質的に、天然の状態では見いだされる通常一緒に存在するような成分が含まれない物質を意味する。例えば、アフィニティで精製された抗体または単クローン抗体は生物学的に精製された状態にある。
【００３７】
「ハイブリダイズすること」は、相補的な塩基の対合を介した二つの一本鎖核酸の結合を意味する。
【００３８】
「核酸」は、一本鎖または二重鎖いずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオシドポリマーを意味し、別に限定しない限り、天然に生ずるヌクレオチドと類似の様式で機能することができる既知の天然ヌクレオチドの類似体を含む。
【００３９】
「ヌクレオチドポリメラーゼ」は、ヌクレオシド三リン酸前駆体からＤＮＡまたはＲＮＡの合成を触媒できる酵素を意味する。本発明の増幅反応では、ポリメラーゼは鋳型依存性で、典型的には形成されるポリマーの３’端にヌクレオチドを付加する。最も好ましくはポリメラーゼは米国特許第４，８８９，８１８号および第５，０７９，３５２号に記述されているように熱安定性である。
【００４０】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、プライマー、プローブ、検出される核酸断片および核酸のコントロールのような二つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなる分子を意味する。オリゴヌクレオチドの正確な大きさは多くの因子およびオリゴヌクレオチドの最終的な機能または使用に依存する。オリゴヌクレオチドは、例えば適当な配列のクローニングおよび制限酵素による切断、およびＮａｒａｎｇらの１９７９年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第６８巻：９０から９９ページのホスホトリエステル法；ＢｒｏＷｎらの１９７９年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第６８巻：１０９から１５１ページのホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅらの１９８１年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、第２２巻：１８５９から１８６２ページのジエチルホスホアミダイド法および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法のような方法による直接的な化学合成を含む適当な方法により調製される。
【００４１】
「プライマー」という用語は、核酸の鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される、即ち、適当な緩衝液中に四種の異なるヌクレオシド三リン酸およびポリメリゼーションの薬品（即ち、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）が、適当な温度で存在するような条件下で、ＤＮＡ合成の開始点として作用できる天然または合成いずれかのオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは好ましくは一本鎖のオリゴデオキシリボヌクレオチドである。適当な長さのプライマーはプライマーの使用計画に依存するが、典型的には１５から２５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は一般的に鋳型と充分に安定な雑種複合体を形成するためにより低い温度が必要である。プライマーは鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズするために充分に相補的でなければならない。
【００４２】
本発明の公開された具体例では、配列特異的プライマーおよびプローブが提供される。これらの具体例で提供されるように、さらに配列特異的プライマーおよびプローブが、例えば５’または３’端に標的配列に相補的または非相補的なヌクレオチドを付加することにより調製されることは技術者には明かであろう。プライマー成分が標的配列の伸長の開始点として作用し、プライマーおよびプローブがこれらの例証される具体例の中に含まれる少なくとも１４の連続的なヌクレオチドで構成される限り、そのような成分は発明の範囲の中にある。
【００４３】
「プライマー」という用語は、特に増幅される標的領域の一方または両端についての情報にいくらかの曖昧さがある場合に一つ以上のプライマーを意味する。例えば、領域が母集団でかなりのレベルの多型を示すならば、代わりの配列を増幅するプライマーの混合液が調製される。望むならば、プライマーは比色的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的な手段により検出できる標識を取り込むことにより標識される。例えば、有効な標識には３２Ｐ、蛍光色素、電子密度試薬、（ＥＬＩＳＡに通常使用されるような）酵素、ビオチンまたはハプテンおよび抗血清または単クローン抗体が得られるタンパク質が含まれる。標識はまた、プライマーまたは増幅されたＤＮＡのようなプライマー伸長産物のいずれかを固体支持体へ固定化するのを容易にする陽にプライマー「捕捉する」ために使用される。
【００４４】
「プローブ」は、標的核酸の部分配列に相補的な塩基対を介して結合するオリゴヌクレオチドを意味する。プローブは典型的にはハイブリダイゼーション条件の緊縮度に依存して、プローブ配列と完全な相補性をもたない標的配列に実質的に結合することを技術者は理解するであろう。プローブは好ましくは同位元素を用いた場合のように直接的に、またはストレプトアビジン複合体が後に結合するビオチンを用いた場合のように間接的に標識される。プローブの有無を調べることにより、標的の有無を検出できる。
【００４５】
核酸プローブが引用される場合、「組換え体」は天然ゲノムの部分としてプローブ配列を天然に含む細胞から分離されたプローブに典型的に付随する天然のタンパク質および核酸を含まないオリゴヌクレオチドを意味する。組換え体プローブはＰＣＲのような増幅手段および細菌が組換え体プローブで形質転換されるような遺伝的クローニング法により作製されたプローブである。
【００４６】
「逆転写酵素」という用語は、リボ核酸の鋳型に相補的なプライマー伸長産物を形成するためのデオキシリボヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素を意味する。酵素はプライマーの３’端で合成を開始し、合成が停止するまで鋳型の５’端へ向って進行する。ＲＮＡ標的配列を相補的なコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列に変換する適当な重合剤の例は、トリ骨髄芽腫ウイルスの逆転写酵素および逆転写酵素活性をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼである。
【００４７】
「配列特異的オリゴヌクレオチド」および「ＳＳＯ」という用語は、検出される配列に正確に相補的な「ハイブリダイズする領域」と呼ばれる配列をもつオリゴヌクレオチドを意味し、「配列特異的な緊縮ハイブリダイゼーション条件下で」、正確に相補的な標的配列にのみハイブリダイズする特定の対立遺伝子または変異株に特徴的な典型的な配列である。ハイブリダイズ条件の緊縮度を緩和することにより、配列のミスマッチが許容されるようになる；許容されるミスマッチの程度はハイブリダイゼーション条件の適当な調整によりコントロールされる。解析される配列に依存して、一つまたはそれ以上の配列特異的オリゴヌクレオチドが使用される。「プローブ」および「ＳＳＯ」という用語は、ＳＳＯと互換的に使用される。
【００４８】
特定のウイルス単離株に「特異的な配列」は、単離株に独特の配列で、即ち他の以前に特徴付けされた単離株には共通しないものである。単離株に特異的な配列に相補的な部分を含むプローブは典型的には緊縮条件下（例えば、固体支持体を７０℃で２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄すること）で、他の単離株のゲノムの相当する部分にハイブリダイズしない。
【００４９】
特定の単離株に特異的な抗原またはエピトープは単離株に独特のもので、他の以前に特徴付けされた単離株とは共通しない。抗原またはエピトープに対して生じた免疫グロブリンはＥＬＩＳＡのような標準的な方法では以前に特徴付けされた単離株の抗原とは交差反応しない。
【００５０】
「実質的に同一な」という用語は、二つまたはそれ以上の配列がそれらの配列の大部分を共有することを指す。一般に、これはその配列の少なくとも約９０％で、好ましくは約９５％である。配列が実質的に同一であることの別の指示は、緊縮条件下で同一ヌクレオチド配列にそれらがハイブリダイズするかどうかである（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５を参照せよ）。緊縮条件は配列依存性で、異なる環境では異なるものとなる。一般に、緊縮条件は限定されたイオン強度およびｐＨで特異的な配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは標的配列の５０％が完全にマッチするプローブにハイブリダイズする（限定されたイオン強度およびｐＨでの）温度である。典型的には、緊縮条件は塩濃度がｐＨ７で少なくとも約０．２モルで、温度が少なくとも約６０℃である。
【００５１】
「部分配列」は核酸のより長い配列の部分を含む核酸の配列を意味する。
【００５２】
「標的領域」という用語は解析される核酸の領域を意味し、多型領域を含む。
【００５３】
「熱安定性ポリメラーゼ酵素」という用語は、比較的熱に安定で、標的配列の一方の核酸の鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成するためのヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素を意味する。酵素はプライマーの３’端で合成を開始し、合成が停止するまで鋳型の５’端へ向かって進行する。精製された熱安定性ポリメラーゼ酵素は米国特許第４，８８９，８１８号により充分に記述されている。
【００５４】
図１は新規変異株ＨＣＶの配列Ｃ９、四種の関連変異株および原型ＪａｐａｎおよびＵＳ ＨＣＶ単離株を並べたものである。
【００５５】
Ｃ型肝炎ウイルスは約１００００ヌクレオチドの長さの一本鎖の＋鎖のＲＮＡ分子を含む小さなＲＮＡウイルスである。ゲノムは単一の大きなポリタンパク質に翻訳され、続いて加工されると信じられている単一の、長い開かれた読み枠を含む。開かれた読み枠は未翻訳領域（ＵＴＲ）に続いて（原型ウイルスの番号付けのシステムを用いて）ヌクレオチドの３４３から始まる。５’ＵＴＲは比較的保存されており、ウイルスの複製および調節には重要である。コーディング領域の５’端もまた保存されている。本発明のあるプライマーおよびプローブはＨＣＶゲノムの５’端の保存された領域にハイブリダイズする。
【００５６】
本発明のプライマーおよびプローブのハイブリダイズする領域のオリゴヌクレオチド配列は以下に示される。プライマーのハイブリダイズする領域として使用されるオリゴヌクレオチド配列はまた、プローブのハイブリダイズする領域として使用されることを技術者は理解するであろう。プローブとして使用されるプライマーの適合性はプライマーのハイブリダイゼーション特性に依存する。同様に、プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドはプライマーとして使用される。
【００５７】
表１に示されたオリゴヌクレオチドは＋鎖（上流）のプライマーおよびプローブである。表はゲノム核酸にハイブリダイズした場合のオリゴヌクレオチドの３’端の位置に基づく順である。ゲノムの５’端に最も近いところにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは最初にあげられている。
【００５８】
【表１】
表２は−鎖（下流）のプライマーまたはプローブとして機能するオリゴヌクレオチドを示す。表１と同一の内部順が使用されている。
【００６０】
【表２】
いくつかのオリゴヌクレオチドは分子の５’端に制限酵素部位を含むように修飾されたハイブリダイズする領域をもつ。制限酵素部位はこれらのオリゴヌクレオチドの一つがプライマーとして使用された場合、増幅産物に導入される。最初のハイブリダイゼーション条件は制限酵素部位周辺の塩基対のミスマッチが許容されるように選択される。５’端付近のミスマッチはプライマーの３’付近のものよりも許容される。オリゴヌクレオチドＫＹ６５（配列番号１）、ＫＹ９８（配列番号３）、ＫＹ９６（配列番号４）およびＫＹ６７（配列番号１０）は上流プライマーで、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位を含む。オリゴヌクレオチドＫＹ９５（配列番号２０）、ＫＹ９９（配列番号２６）およびＫＹ６８（配列番号２７）は下流プライマーでＥｃｏＲＩ部位を含む。そのような制限酵素部位の増幅産物への導入は増幅産物のクローニングを容易にする。
【００６２】
本発明はまた新しいＨＣＶ単離株を提供する。殆どの単離株はＨＣＶの二株のうちの一つに関連する。第一は欧州公示第３１８，２１６号、第３８８，２３２号および第３９８，７４８号に記述されるＵＳ原型株である。第二は上述のＫａｔｏらにより記述された日本の株である。二つの株は推定上の非構造遺伝子の領域では３０％まで異なっているが、５’未翻訳領域では９８％以上のホモロジーを、キャプシドまたはコア遺伝子の５’部分では９２％のホモロジーを示す。
【００６３】
ここでＣ９と呼ばれる本発明の単離株は両株とは距離的により離れた関係にある。この新しい単離株は共通の５’未翻訳領域に９３％類似している。コア遺伝子領域の５’部分では原型または日本の株のいずれかと約８５％しかホモロジーをもたない（以下の表３を参照せよ）。
【００６４】
Ｃ９（配列番号２９）単離株および関連同型のＲ４５（配列番号３１）、Ｒ４３（配列番号３３）、Ｒ１１０（配列番号３２）およびＲ１１６（配列番号３０）（図１参照）は上述のようにＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＢＳ（＋）のＲＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限酵素部位にクローニングされた。変異株ウイルスは米国特許第４，８００，１５９号に記述されたように精製されたウイルスＤＮＡの標的およびＰＣＲクローニング法を用いてクローニングされた。得られたプラスミドは大腸菌ＤＧ１０１株（ＡＴＣＣ寄託番号４７０４３）に形質転換された。
【００６５】
原型Ｃ９単離株および四種の関連単離株の５’未翻訳配列およびキャプシド遺伝子の５’端のヌクレオチド配列はＣ９（配列番号２９）、Ｒ１１６（配列番号３０）、Ｒ４５（配列番号３１）、Ｒ１１０（配列番号３２）およびＲ４３（配列番号３３）で明らかにされ、以下に示される。示された配列はウイルス配列をクローニングし易くするために使用されるプライマーＫＹ９６（配列番号４）およびＫＹ９９（配列番号２６）を含まない。
【００６６】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
ウイルスの配列を含むクローンは以下のようにＭａｒｙｌａｎｄ州ＢａｌｔｉｍｏｒｅのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託された。
【００７２】
単離株 配列番号 プラスミド名 ＡＴＣＣ寄託番号 寄託年月日
Ｃ９ ２９ ｐＨＣＶ−Ｃ９ ７５２６５ １９９２年７月２日
Ｒ１１０ ３２ ｐＨＣＶ−Ｒ１１０ ７５２６６ １９９２年７月２日
【００７３】
プラスミドｐＨＣＶ−Ｃ９は新規変異株Ｃ９の配列を含む。Ｃ９配列の四種の関連変異株を並べたものが図１に示されている。既知の単離株の配列データの源は以下のようであった：ＨＣＶ−Ｊ１、ＨＣＶ−Ｊ４（Ｏｋａｍｏｔｏらの１９９０年、Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第６巻（第３号）：１６７から１７７ページ）；ＨＣＶ−Ｊ（Ｋａｔｏらの１９９０年、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、第７巻：４９５から５０１ページ）；ＨＣＶ−ＢＫ（Ｔａｋａｍｉｚａｗａらの１９９１年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、第６５巻：１１０５から１１１３ページ）；およびＨＣＶ−１ＵＳ−ＰＴ（Ｈａｎらの１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８７巻：９５２４から９５２８ページ）。
【００７４】
【表３】
それ故、本発明はＣ９単離株に特異的で、他の肝炎の単離株と区別するアッセイの物質および方法を提供するものである。いくつかの具体例では、本発明の方法は標的配列を増幅するためにＰＣＲを使用したまたは使用しない場合の核酸のハイブリダイゼーションに基づくものである。他の具体例では、本方法はＣ９単離株に特異的な免疫グロブリンを使用する。
【００７６】
Ｃ９に特異的なプライマーおよびプローブのオリゴヌクレオチド配列は以下の表４に示されている。
【００７７】
【表４】
ヌクレオチドを同定するために使用される番号付けのシステムは上述のＫａｔｏらの１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．のものである。
【００７９】
オリゴヌクレオチドＫＹ１５０（配列番号４３）はＣ９単離株および既知のＨＣＶ原型単離株の両者の検出に有効である。このオリゴヌクレオチドは次の配列：
【化１０】
５’−ＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴ−３’
をもつ。
【００８０】
表４に示される上流／下流いずれのプライマーの対もＣ９単離株および関連同型を特異的に増幅するのに適していることは技術者には明らかであろう。さらに、表４に提供されるヌクレオチドの位置を指標として用いて、増幅された核酸部分をハイブリダイズするのに適しているＣ９特異的プローブを選択することは明らかである。
【００８１】
好ましい具体例では、本発明のプライマーは標的核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅とともに使用される。ＨＣＶはＲＮＡウイルスであるので、増幅の第一段階は増幅される領域のＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）の合成である。逆転写は別個の段階として、または以下に記述されるようにＲＮＡを増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応を改良した均一逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で行われる。
【００８２】
ＰＣＲ過程は技術的に良く知られているが（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および第４，９６５，１８８号を参照せよ）、ある一般的なＰＣＲ情報はＰＣＲ過程に不慣れな者が本発明を明確にさらに充分に理解することを目的として以下のように提供される。
【００８３】
ＰＣＲにより試料中の標的核酸配列を増幅するために、配列は増幅システムの成分に影響され易くなければならない。一般に、この影響され易さは試料からの核酸の分離により保証される。生物学的試料からのリボ核酸の抽出のための各種の技術が技術的に知られている。例えば、「ＰＣＲ技術」（Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）中のＲｏｔｂａｒｔら（１９８９年）により、およびＨａｎらの１９８７年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２６巻：１６１７から１６２５ページに記述されたものを参照せよ。代わって、試料がかなり容易に壊れるならば、ＰＣＲ技術により増幅される前に核酸は精製される必要はない、即ち、試料が細胞、時に末梢血リンパ球または単球に含まれるならば、細胞内成分の溶解と分散は単に細胞を低調緩衝液に懸濁することにより行われる。
【００８４】
ＰＣＲのそれぞれのサイクルの第一段階は核酸二重鎖の分離を含む。もちろん、標的核酸が一本鎖である、即ち一本鎖ＲＮＡであるならば、第一サイクルに最初の分離段階は必要ない。鎖が分離されると、ＰＣＲの次の段階には標的配列に隣接したプライマーと分離した鎖をハイブリダイズすることが含まれる。プライマーはその後標的配列に相補的なコピーを形成するために伸長される。成功したＰＣＲ増幅では、プライマーはそれぞれのプライマーが二重鎖配列にハイブリダイズする位置が、一つのプライマーから合成される伸長産物が鋳型から分離される（相補的である）場合にもう一方のプライマーの伸長の鋳型として働くようにデザインされる。変性、ハイブリダイゼーションおよび伸長のサイクルが増幅された核酸が望みの量得られるまで必要な回数繰り返される。
【００８５】
ＰＣＲ過程の好ましい具体例では、鎖の分離は二重鎖の変性は引き起こすが、ポリメラーゼの非可逆的な変性は引き起こさないような充分な時間、充分に高温で反応液を熱することにより行われる（米国特許第４，９６５，１８８号を参照せよ）。典型的な熱変性は約８０℃から１０５℃の範囲の温度で、秒から分の範囲の時間で行われる。しかし、鎖の分離は物理的、化学的または酵素的手段を含む適当な変性方法により行われる。鎖の分離は例えばヘリカーゼまたはヘリカーゼ活性を示す酵素により誘導される。例えば、酵素ＲｅｃＡはＡＴＰ存在下でヘリカーゼ活性をもつ。ヘリカーゼによる鎖の分離に適した反応条件は技術的に知られている（Ｋｕｈｎ Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｂｅｒｌｉｎｇの１９７８年の、ＣＳＨ−Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４３巻：６３から６７ページおよびＲａｄｄｉｎｇの１９８２年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１６巻：４０５から４３６ページを参照せよ）。
【００８６】
ＰＣＲにおけるプライマーの鋳型依存性の伸長は、適当な塩、金属陽イオンおよびｐＨ緩衝システムからなる反応液中で、適当な量の四種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（典型的にはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）の存在下で、重合剤により触媒される。適当な重合剤は鋳型依存性のＤＮＡ合成を触媒することが知られている酵素である。Ｃ型肝炎はＲＮＡウイルスであるので、プライマー伸長の最初の鋳型はＲＮＡである。ＲＮＡ鋳型から相補的なコピ−ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成するのに適している重合剤は、トリ骨髄芽腫ウイルスＲＴ、Ｍｏｌｏｍｅｙネズミ白血病ウイルスＲＴ、またはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから市販される逆転写酵素活性をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）のＤＮＡポリメラーゼのような逆転写酵素（ＲＴ）である。典型的には、ゲノムＲＮＡ／ｃＤＮＡの二重鎖鋳型は、増幅の鋳型として得られるＤＮＡ鎖を残すために、最初の逆転写段階後の第一の変性段階の間に熱変性される。ＤＮＡ鋳型とともに使用される適当なポリメラーゼは例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩまたそのＫｌｅｎｏｗ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓから分離され、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅにより開発製造され、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから市販される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑポリメラーゼを含む。後者の酵素は核酸の増幅およびシークエンシングに広く使用される。Ｔａｑポリメラーゼを使用する反応条件は技術的に知られており、上述の「ＰＣＲ技術」（１９８９年）の中で、Ｇｅｌｆａｎｄにより記述される。
【００８７】
ＲＮＡが増幅される場合、最初の逆転写（ＲＴ）段階はＲＮＡのＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）を作製するために行われる。１９９１年７月１１日に公開されたＰＣＴ特許公示ＷＯ９１／０９９４４は、ＰＣＲ増幅においても機能する熱安定性ポリメラーゼによる高温逆転写について記述している。高温ＲＴはより高いプライマーの特異性および改良された効率を提供する。「均一ＲＴ−ＰＣＲ」では、同一プライマーおよびポリメラーゼが逆転写およびＰＣＲ増幅の両者に当てられ、反応条件は両反応が反応の交換なしに起きるように最適化される。逆転写酵素として機能できる熱安定性ポリメラーゼである。Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼは鋳型に関係なく全てのプライマー伸長段階で使用される。両過程は試薬を変えるまたは加えるために、チューブを開けることなしに行われる；温度プロフィールだけが最初のサイクル（ＲＮＡ鋳型）と残りの増幅サイクル（ＤＮＡ鋳型）の間で調整される。
【００８８】
ＨＣＶゲノムの５’末端はＭｏｌｏｎｅｙネズミ白血病ウイルスＲＴのような逆転写酵素を用いた逆転写をプライマーハイブリダイゼーションを干渉することにより阻害できる重要な二次構造をもつことが予想される。不幸にして、二次構造を変性するために反応温度を上げることはまた殆どの逆転写酵素を不活性化する。組換えＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ｒＴｔｈ）のＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性を使用することにより、ｃＤＮＡ合成が酵素の不活化なしに上昇した温度で起きる。本発明のプライマーはそのままこの上昇した逆転写温度でＲＮＡ鋳型にハイブリダイズする。
【００８９】
ＰＣＲ法はそれぞれの段階後、新しい試薬が添加される段階様式で、または全ての試薬が同時に添加される様式で、あるいは新鮮なまたは異なる試薬が与えられた数の段階後に添加される部分的な段階様式で行われる。例えば、鎖の分離が熱により誘導され、ポリメラーゼが熱感受性であるならば、その場合はポリメラーゼは鎖も分離の各循環後に添加されねばならない。しかし、例えば、ヘリカーゼが変性に使用されるか、または熱安定性ポリメラーゼが伸長に使用されるならば、全ての試薬は最初に添加され、あるいは代わって、試薬の分子比が反応に影響するならば、試薬は合成反応によりそれらが消費されるにつれ、定期的に補充される。
【００９０】
ＰＣＲ過程は熱安定性酵素を用いて自動過程で通常行われることを技術者は知るだろう。この過程で、反応液の温度は変性領域、プライマーアニーリング領域および伸長反応領域を循環する。代わって、アニーリングおよび伸長の温度は同一である。例に記述されるＲＴ−ＰＣＲはそのような二段階の温度循環を使用する。熱安定性酵素の使用に特異的に適している機械は商業的に購入できる。
【００９１】
技術者は以前の反応の増幅された核酸および非特異的な増幅によるＰＣＲの汚染の問題に気づくであろう。これらの問題を減少する方法は以前の反応の増幅されたＤＮＡの酵素学的分解を行わせ、非特異的増幅を減少する。ＰＣＲ増幅はｄＴＴＰに代わってｄＵＴＰの存在下で行われる。得られた二重鎖のウラシルを含む産物はウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）による分解を受けやすく、一方、通常のチミンを含むＤＮＡはＵＮＧにより分解されない。増幅前に増幅反応液にＵＮＧを添加することは標的として働く全てのウラシルを含むＤＮＡを分解するようになる。ウラシルを含むＤＮＡの唯一の材料が以前の反応の増幅された産物であるので、この方法は以前の反応の汚染（繰越）の問題を取り除くことにより、反応液を弱化する。ＵＮＧそれ自身は熱により一時的に不活化されるので、増幅手順のうちの変性段階はまたＵＮＧを不活化するように働く。ウラシルを取り込んだ新しい増幅産物は、それ故効果的にＵＮＧなしの環境で形成され、分解されない。
【００９２】
本発明の好ましい具体例は弱化段階を取り入れた均一ＲＴ／ＰＣＲ法を用いる。この一つのチューブでの試薬を添加しない反応は繰越の汚染を阻害し、ＲＮＡ標的を含む試料から増幅され、検出されるＰＣＲ産物を提供することにより、ＲＴ−ＰＣＲ反応を弱化するように働く。この方法は例６に例示される。
【００９３】
好ましい具体例はＲＴ−ＰＣＲ増幅を取り入れているが、試料中の標的配列の増幅は、標的配列がＳＳＯプローブへの核酸ハイブリダイゼーションにより検出されるように充分な増幅をそれぞれが提供するような、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅および自己配列複製のような既知の方法により行われる。代わって、Ｑβ−レプリカーゼ増幅のような検出できるレベルにプローブを増幅する方法が使用される。「プローブ」という用語は上述の方法で使用される配列特異的なオリゴヌクレオチドを意味し、例えばＬＣＲで使用される二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドは、たとえＬＣＲのいくつかの具体例が対立の存在を示すために、プローブの連結だけを必要とする場合でも本発明の目的の「プローブ」である。
【００９４】
配列特異的プローブハイブリダイゼーションは本発明の成功する実施の上で重要な段階である。本発明の配列特異的オリゴヌクレオチドプローブは特異的にＨＣＶゲノムの特定の断片にハイブリダイズし、他の生物の配列との不安定なミスマッチをもつ。充分な緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、プローブは特異的に正確に相補的な配列にのみハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件の緊縮度は配列のミスマッチの変化する量を許容するように緩和される。増幅産物の検出は、正しく増幅された標的だけの検出を保証し、それにより関連生物の相同配列の存在により引き起こされる誤りの陽性の機会を減少するようにこの配列特異的ハイブリダイゼーションを使用する。
【００９５】
ＳＳＯプローブおよび核酸配列の間で形成される雑種を検出する方法は、プローブはハイブリダイズする領域に加えてさらに特質を含むことを必要とする。例えば、下に記述される「リバース」ドットブロット法にしたがって、プローブが最初に固定化されるならば、プローブはまたＰＣＴ特許公示８９／１１５４８により詳細に記述される技術の照射によりナイロン支持体に固定されるポリｄＴの長いストレッチを含む。ドットブロット法で、固定化された標的は下に記述するように検出方法で使用される化合物を含むプローブでハイブリダイズされる。
【００９６】
本発明のプローブは上述のオリゴヌクレオチドを合成する技術を用いて、合成され、標識される。プローブはプローブを３２Ｐ−ＡＴＰおよびキナーゼとインキュベートすることにより、３２Ｐで５’端を標識される。ＳＳＯプローブの適当な非放射活性標識は西洋ワサビのパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。この標識を含むプローブを調製し、検出する方法は以下の例および米国特許第４，９１４，２１０号および第４，９６２，０２９号に記述される。そのような標識プローブの使用に関する付加的な情報については、米国特許第４，７８９，６３０号；Ｓａｉｋｉらの１９８８年、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３１９巻：５３７から５４１ページおよびＢｕｇａｗａｎらの１９８８年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第６巻：９４３から９４７ページを参照せよ。有効な色素原は赤色ロイコ染料および３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む。
【００９７】
本発明のプローブはＳＳＯプローブが試料中に存在するウイルスの配列に結合するかを決定することによりウイルスの配列が試料に存在するかを決定するために使用される。ＳＳＯプローブおよび試料中の核酸配列の間に形成される雑種を検出するための本発明の目的の適当な方法は技術的に知られている。例えば、検出は例に記述されるようにドットブロット法を用いて行われる。ドットブロット法では、未標識の増幅された試料は膜、適当なハイブリダイゼーション条件下で、標識プローブとインキュベートされた膜、洗浄により除去されたハイブリダイズしないプローブ、および結合プローブの存在をモニターされるフィルターのような固体支持体に結合される。複数の試料が単一のプローブで解析されるとき、ドットブロット法は全く有効である。多くの試料は単一の膜に別の位置に固定化され、同時にプローブ溶液に膜を浸すことによりハイブリダイズされる。
【００９８】
非常に多くの異なるプローブが用いられる場合に全く有効な別の方法は、増幅された配列が標識を含み、プローブが固体支持体に結合される「リバース」ドットブロット法である。この様式は、本発明の試験が同時に行われる試験の装置の一つとして使用されるならば有効である。この様式では、未標識ＳＳＯプローブは膜に結合され、適当な緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、標識試料にさらされる。ハイブリダイズしない標識試料はその後適当な緊縮条件下で洗浄することにより除去され、フィルターはその後結合配列の存在をモニターされる。
【００９９】
正逆両ドットブロット法はマイクロタイタープレートで簡便に行われる。プローブは例えば、マイクロタイタープレートに接着し、それによりプローブを固定化するウシ血清アルブミンに付与される。
【０１００】
別の適当なアッセイシステムでは、標識プローブはＰＣＲ増幅過程の間に添加される。それぞれの合成段階の間に標的ＤＮＡにハイブリダイズするいずれのＳＳＯプローブもポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性により分解される。プローブの分解産物はその後検出される。それ故、分解産物の存在はＳＳＯプローブおよび標的ＤＮＡの間のハイブリダイゼーションが起きたことを示す。
【０１０１】
上に提供されるヌクレオチド配列は本発明の重要な面である。配列の一方の鎖だけが示されているが、配列のもう一方の鎖は上記の情報から推論されることを技術者は認識する。この情報から発明の他のプローブおよびプライマーが構築される。
【０１０２】
本発明はまたキット、本方法を実施するための有効な成分を含むマルチコンテナユニットに関するものである。有効なキットはＣ型肝炎ウイルスの核酸を検出するためのＳＯプローブを含むことができる。ある場合では、ＳＳＯプローブは適当な支持膜に固定される。そのようなプライマーが発明の好ましい具体例に有効である場合、キットはまたＲＴ−ＰＣＲのためのプライマーを含むことができる。キットの他の付随的な成分は例えば、逆転写酵素またはポリメラーゼ、基質ヌクレオシド三リン酸、標識に使用される手段（例えば、標識がビオチンであるなら、アビジン−酵素コンジュゲートおよび酵素基質および色素原）および逆転写、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーション反応のための適当な緩衝液を含む。上記成分に加え、キットはまた本方法を実施するための指導書を含むことができる。
【０１０３】
ＰＣＲおよび核酸プローブの使用に加え、本発明はまた特定のＨＣＶ単離株に特異的な免疫グロブリンを産生する方法を提供する。これは典型的には最初にウイルスヌクレオチド配列を発現し、望みの単離株に特異的な抗体を産生するための発現タンパク質を用いることにより行われる。
【０１０４】
肝炎単離株のヌクレオチド配列は各種の組換え発現システムで使用される。この様式で、キャプシド遺伝子のような望みの遺伝子が発現される。原核生物または真核生物の宿主でのヌクレオチド配列の組換え発現は技術的に良く知られている（上述のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照せよ）。発現されたタンパク質は単離株に特異的な免疫グロブリンを産生するために使用される。免疫グロブリンはその後以下に記述するようにウイルスの存在を検出するアッセイに使用される。タンパク質はまたウイルスにさらされた患者の中の抗体の存在を検出するために使用される。
【０１０５】
望みのウイルスの配列は標準的な技術を用いて、発現のための哺乳動物、酵母または昆虫細胞系列に形質転換される前に適当なベクターに簡便に挿入される。原核生物は中間クローニング段階に好ましく用いられる。
【０１０６】
ウイルスの配列の発現のために宿主細胞に改変した遺伝物質を導入する際に用いられる特定の方法は特に重大ではない。外来ヌクレオチド配列を宿主細胞へ導入するための良く知られた方法のいずれかが使用される。これらにはリン酸カルシウムによるトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔法、リポソーム、微量注入、プラスミドベクター、ウイルスベクターおよびクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝物質を宿主細胞へ導入するための他の良く知られた方法のいずれかの使用が含まれる（上記のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照せよ）。用いられる特定の遺伝子工学の方法が、望みのウイルスタンパク質を発現することができる少なくとも一つの遺伝子を宿主細胞にうまく導入できることだけが必要である。
【０１０７】
細胞に遺伝情報を移送するために用いられる特定のベクターはまた特に重大ではない。真核細胞で組換えタンパク質を発現するために使用される通常のベクターのいずれかが使用される。
【０１０８】
発現ベクターは真核生物の転写単位または真核細胞でウイルスの核酸配列を発現させるために必要な全ての要素を含む発現カセットを含む。典型的な発現カセットはウイルスタンパク質および転写の効率的なポリアデニレーションに必要なシグナルを暗号化したＤＮＡ配列に操作できるように連結したプロモーターを含む。
【０１０９】
ベクターは通常ナトリウム、カリウムＡＴＰａｓｅ、チミジンキナーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＣＡＤ（リン酸カルバミル合成酵素、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼおよびジヒドロオロターゼ）、アデノシンデアミナーゼ、ＤＨＦＲおよびアスパラギン合成酵素およびウアバイン選択のような選択マーカーを含む。
【０１１０】
本発明の発現ベクターは典型的には哺乳動物細胞のような真核細胞でのみ発現される一つまたはそれ以上の真核生物の転写単位とともに細菌へのベクターのクローニングを促進する原核生物の配列を含む。ベクターは真核生物のレプリコンを含んだり、含まなかったりする。真核生物のレプリコンが存在するなら、ベクターは適当な選択マーカーを用いて真核細胞で増幅可能である。ベクターが真核生物のレプリコンを含まないなら、エピソーム増幅は可能ではない。その代わりに、プロモーターが望みの遺伝子の発現を支配する場合、トランスフェクトされたＤＮＡはトランスフェクト細胞のゲノムに組み込まれる。発現ベクターは典型的には異なる、良く特性が明かなウイルスまたは哺乳動物の遺伝子に由来する要素から構築される。培養哺乳動物細胞でのクローニングされた遺伝子の発現についての一般的な考察に関しては、上記のＳａｍｂｒｏｏｋらの第１６章を参照せよ。
【０１１１】
発現ベクターが細胞の導入された後、トランスフェクトされた細胞はウイルスのタンパク質を発現するのに好ましい条件下で培養され、タンパク質は標準的な技術を用いて培養から回収される。例えば、硫安沈殿、ゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィまたは親和性クロマトグラフィのようなタンパク質を精製するための多くの標準的な方法が使用される。一般的には、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓの「タンパク質の精製」（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２年））を参照せよ。
【０１１２】
望みのウイルスゲノムにより暗号化されるタンパク質の使用に加え、ウイルスに特異的なエピトープに真似たペプチドもまたウイルスに特異的な抗体を産生するために使用される。そのような技術は技術者には良く知られており、例えば、Ｇｅｙｓｅｎらの「Ｍｕｌｔｉｐｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」（Ｃｏｓｅｌｃｏ Ｍｉｍｏｔｙｐｅｓ，ＰＴＹ Ｌｔｄ．）に記述される。
【０１１３】
上で考察されるポリペプチドは標準的な技術を用いて抗体を産生するために使用される。免疫グロブリンは各種の応用に利用される。例えば、免疫グロブリンは生物学的試料中のウイルスの存在を調べるために、また例えば親和性クロマトグラフィを用いてウイルス抗原を精製するために使用される。それらはまたウイルス全体の感染性の阻害を含むそれに相当するタンパク質を中和するために使用される。技術者が得られる各種の免疫グロブリン分子の生産および操作に関する多くの技術はそれ故特定の単離株の診断および検出に有効な分子を生産するために容易に応用される。
【０１１４】
ここで使用されるように、「免疫グロブリン」という用語は本質的に免疫グロブリン遺伝子により暗号化される一つまたはそれ以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。認識される免疫グロブリン遺伝子は、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子同様、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミューの定常領域遺伝子を含む。免疫グロブリンは、単鎖だけでなく、例えばＦｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２を含む抗体とは別に各種の形態で存在する（例えば、Ｈｕｓｔｏｎらの１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８５巻：５８７９から５８８３ページ；Ｂｉｒｄらの１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４２巻：４２３から４２６ページ；およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒとＨｏｏｄの１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ、第３２３巻：１５から１６ページ）。免疫グロブリンの構造および機能の一般的な概観については「基礎免疫学」第二版（Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎｓ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年））を参照せよ。
【０１１５】
望みの単離株に特異的なエピトープに結合する抗体は各種の方法により生産される。ヒトではない、例えばネズミ、ウサギ、ウマ等の単クローン抗体の生産は良く知られており、例えば、ウイルスまたはその断片を含む試料を用いて動物を免疫することにより行われる。免疫動物から得られた抗体産生細胞は標準的な技術を用いて不死化され、スクリーニングされる。単クローン抗体の産生についての一般的手順の考察は、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅによる「抗体、研究室マニュアル」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８８年））を参照せよ。
【０１１６】
ある環境では、非ヒト抗体の抗原結合領域、例えばＦ（ａｂ’）２またはハイパー可変領域をヒト定常領域（Ｆｃ）または枠組み領域に、本質的にヒト分子を生産するための組換えＤＮＡ技術により移すことが望まれる。そのような方法は一般に技術的に知られており、例えば、米国特許第４，８１６，３９７号、ＥＰ公示第１７３，４９４号および第２３９，４００号に記述される。代わって、Ｈｕｓｅらにより１９８６年にＳｃｉｅｎｃｅ、第２４６巻：１２７５から１２８１ページに概略された一般的プロトコールにしたがって、ヒトＢ細胞のＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、望みの特異生をもつ抗体（または結合断片）を暗号化する配列をクローニングし、増幅することにより、ウイルスに特異的に結合するヒト単クローン抗体またはその部分を暗号化するＤＮＡ配列を単離する。
【０１１７】
上述のように産生される免疫グロブリンはその後肝炎の単離株の存在に対する各種の診断方法に使用される。例えば、Ｃ９ウイルスに特異的な標識された免疫グロブリンは、ウイルスを含むと予想される試料と免疫グロブリンを接触させ、複合体が形成されるかを検出することを含む方法で使用される。標識は技術的に良く知られる方法にしたがって、直接的にまたは間接的に免疫グロブリンに共役される。標識オリゴヌクレオチドの状況で記述されるように、広い範囲の各種の標識が使用される。いくつかの方法のいずれか一つにより成分は標識される。検出の通常の方法は３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ標識化合物などを用いたオートラジオグラフィの使用である。放射活性同位元素の選択は合成の容易さ、変化する安定性および選択した同位元素の半減期による研究の優先に依存する。非放射活性標識は標識抗体、フルオロフォア、化学発光剤および酵素に結合するリガンドを含む。標識の選択は必要とされる感度、化合物との結合の容易さ、安定性の必要度および得られる手段に依存する。
【０１１８】
非放射性標識はしばしば間接的な方法により付与される。一般的に、リガンド分子（例えば、ビオチン）は分子に共有結合される。リガンドはその後、検出可能な酵素、蛍光化合物または化学発光化合物のようなシグナルシステムを本来検出できる、またはそれらに共有結合する抗リガンド（例えば、ストレプトアビジン）分子に結合する。リガンドおよび抗リガンドは広く変化する。リガンドが天然の抗リガンド、例えば、ビオチン、スロキシンおよびコルチゾルをもつ場合、リガンドは標識された天然に生じる抗リガンドとともに使用される。代わって、ハプテンまたは抗原化合物が抗体と組合わされて使用される。
【０１１９】
分子はまたシグナル生成化合物に直接的に、例えば酵素またはフルオロフォアと連結することにより結合される。標識として興味ある酵素は主として加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシドレダクターゼ、特にパーオキシダーゼである。蛍光化合物はフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等を含む。化学発光化合物はルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタールアジンジオン、例えばルミノールを含む。使用される各種のシグナル生成システムの概観については、米国特許第４，３９１，９０４号を参照せよ。
【０１２０】
複合体の存在を検出するために、反応液は典型的に二次抗体、プロテインＡまたはプロテインＧのような免疫グロブリンのＦｃ領域に結合できるタンパク質と接触される。タンパク質は好ましくは固体表面上で固定化され、固体表面は望みのウイルスに特異的な未結合の免疫グロブリンを除去するために洗浄される。生体分子を固体表面に固定化する多くの方法が技術的に知られている。例えば、固体表面は膜（例えば、ニトロセルロース）、マイクロタイターディッシュ（例えば、ＰＶＣまたはポリスチレン）またはビーズである。望みの成分は非特異的結合を介して、共有結合または非共有的に接触される。標識はその後使用される特定の標識に適した標準的な技術を用いて検出される。
【０１２１】
上述の組換えにより発現されたタンパク質またはウイルスのライゼートはまた診断手順に使用される。これらの手順は典型的に抗体を含むと予想される生物学的試料（例えば、血清）にウイルスを接触させ、免疫学的反応を検出することを含む。反応は好ましくは上述のような標識したタンパク質を用いて検出される。そのような手順についての適当な方法は米国特許第５，０５５，３９１号に詳細に記述される。
【０１２２】
以下に示される本発明の例は例証の目的を提供するもので、発明の範囲を限定するものではない。例に従う請求項の範囲内の発明の多数の具体例は前述の主文および後述の例を読むことにより通常の技術者に明かにされるだろう。
【０１２３】
【実施例】
【０１２４】
例１
均一ＲＴ−ＰＣＲでは、同一のポリメラーゼが逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼとして機能する。これによりＨＣＶのゲノムＲＮＡの最初の逆転写およびそれに続くｃＤＮＡの増幅は試薬を変える段階の間にチューブを開けることなしに同一チューブで行われる。
【０１２５】
核酸はＭｉｃｒｏＰｒｏｂｅ社のＩｓｏＱｕｉｃｋＴＭ核酸抽出キットを用いて血清または血漿から分離された。全ての増幅は全反応容量２０μｌで、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＴＣ９６００サーモサイクラーＴＭおよびＭｉｃｒｏＡｍｐＴＭチューブを用いて行われた。それぞれの２０μｌの反応試薬は以下の表５にあげられている。
【０１２６】
【表５】
ＴＣ９６００は次の反応温度プロフィールを与えるようにプログラムされた。７０℃で１分間の予熱の後、プログラムは反応チューブを挿入するのに充分の長さで中断され、プログラムは再開され、逆転写させるために反応は７０℃で１５分間保持された。反応温度はその後ＲＮＡ−ｃＤＮＡ複合体を変性するために１分間９５℃に上げられた。次に反応温度は９５℃１５秒間および６０℃２０秒間を二回、続いて９０℃１５秒間および６０℃２０秒間を３８回循環した。最終的に反応温度は最後の伸長段階のために６０℃で４分間保持され、１５℃に冷却され、増幅された試料の解析が行えるまで室温に放置された。
【０１２８】
例２
ドットブロット様式の検出法を用いるために、増幅されたＤＮＡの一部分が変性されナイロンフィルターにのせられた後、標識プローブにハイブリダイズされる。プローブがハイブリダイズする領域はＫＹ８８（配列番号１２）で、プローブは３２Ｐで放射活性標識される。代わって、プローブは色素原または化学蛍光基質存在下での非同位元素検出の手段を提供するために西洋ワサビのパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）に共有結合される。
【０１２９】
増幅反応は一般に例１に記述されたように行われる。ＰＣＲで増幅された産物はその後アルカリ処理により変性される。ＰＣＲ産物５μｌに対して、５μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、８μｌの５Ｎ水酸化ナトリウムおよび８２μｌの水が添加される。変性を完全にするために混合液は室温で１０分間放置される。
【０１３０】
ＢｉｏＤｙｎｅＴＭＢナイロンフィルター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．、ＧｌｅｎＣｏｖｅ、ＮＹ、ＵＳＡ）は５から１０分間水に浸すことにより準備され、さらにｄｏｔｂｌｏｔ ｍａｎｉｆｏｌｄ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社のＢｉｏ−Ｄｏｔ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）が設定された後２００μｌの水で洗浄された。変性後、１００μｌの試料溶液はドットブロット器を用いて真空下でナイロン膜にのせられる。それぞれのウェルはその後２００μｌの０．４Ｎ水酸化ナトリウムで洗浄され、フィルター全体が簡単に２ｘＳＳＣで洗浄され、液体が残らなくなるまで風乾される。ＤＮＡは固定化され、ナイロンフィルターにＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）ＵＶ光ボックス（「自動クロスリンク」設定）を用いて、１２００ｍＪ／ｃｍ２の紫外線照射によりクロスリンクされる。
【０１３１】
フィルターは熱シールできる袋の中で少なくとも３０分間、５０℃で（空気振盪機）、ハイブリダイゼーション緩衝液（５ｘＳＳＰＥ、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．１％ＳＤＳ、５０μｇ／ｍｌマス精子ＤＮＡ）に浸すことにより「プレハイブリダイズ」される。緩衝液はその後１−２ｘ１０５ｃｐｍ／ｍｌのプローブを含む等量の同一溶液に置き換えられ、フィルターは２時間から一晩の間５０℃でハイブリダイズされる。
【０１３２】
ハイブリダイゼーション後、フィルターは２ｘＳＳＰＥ／０．１％ ＳＤＳで三回；室温で２０分間二回、および高緊縮度の温度の６０℃で２０分間を一回洗浄される。フィルターはその後乾燥され、プラスチックラップに包まれ、一枚または二枚の増感スクリーンとともに−７０℃でＸ線フィルムに露光される。
【０１３３】
視覚化の代替法は、それぞれ参考としてこの中に入れられているが、ＬｅｖｅｎｓｏｎとＣｈａｎｇによる、１９８９年のＰＣＲプロトコール：方法と応用へのガイド（Ｉｎｎｉｓら（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）の９２から１１２ページ、およびＳａｉｋｉらの１９８８年の、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３１９巻：５３７から５４１ページで記述されたように調製された西洋ワサビのパーオキシダーゼを結合したオリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイズすることである。ハイブリダイゼーションは５ｍｌのハイブリダイゼーション溶液あたり２ｐｍｏｌのＨＲＰ−ＳＳＯプローブを用いて行われる。
【０１３４】
洗浄後、色素原染色基質で現像されたフィルターは１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で洗浄され、０．１ｍｇ／ｍｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｆｌｕｋａ）および０．００１５％過酸化水素を含む１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）に置き換えられ、緩やかに攪拌しながら１０から３０分間室温でインキュベートされる。現像されたフィルターは水で洗浄され、直ちに写真撮影される。ＴＭＢ検出システムは本質的にＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから市販されるＡｍｐｌｉＴｙｐｅ ＤＱａ ＤＮＡタイピングキットに記述されているように調製され、使用される。別の具体例では、化学蛍光検出システム（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いてフィルターは現像される。フィルターは５分間ＰＢＳで洗浄され、緩やかに攪拌しながら１分間ＥＣＬ溶液に入れられる。フィルターはその後室温で１から５分間Ｘ線フィルムに露光される。
【０１３５】
例３
本発明のこの具体例では、リバースドットブロット法が使用される。プローブのハイブリダイゼーション領域はＫＹ８８（配列番号１２）、ＫＹ１５０（配列番号４３）またはＭＹ１６０（配列番号３７）であり、プローブは膜に固定される。増幅された標的ＤＮＡは、それぞれ参考文献としてこの中に入れられているが、申請中の第１９７，０００号および第３４７，４９５号；Ｓａｉｋｉらの１９８９年の、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第８６巻：６２３０から６２３４ページ；およびＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから市販されるＡｍｐｌｉＴｙｐｅ ＤＱａｌｐｈａ ＤＮＡタイピングキットの製品案内に記述されているように膜結合プローブにハイブリダイズされる。膜結合プローブにハイブリダイズする増幅されたＤＮＡが容易に検出されるように、増幅プライマーはＬｅｖｅｎｓｏｎとＣｈａｎｇが１９８９年に上に記述したようにビオチン化される。
【０１３６】
具体的には、ストレプトアビジンを結合した西洋ワサビのパーオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）を膜結合プローブにハイブリダイズするビオチン化された増幅ＤＮＡと反応させることにより、検出は行われる。それ故ＨＲＰはＳＡ−ビオチン相互作用を介して、増幅されたＤＮＡに結合するようになり、テトラメチルベンジジンの酸化による有色化合物の生成のような各種の良く知られた手段により、信号を生成するために使用される（米国特許第４，７８９，６３０号を参照せよ）。
【０１３７】
プローブはいずれかの手段で膜に固定されるが、好ましい方法はさらに長いポリｄＴ配列をプローブのハイブリダイズする領域に付加することを含む。得られたポリｄＴ「テール」はプローブを共有結合で膜に固定するために、ナイロン膜のアミン基と反応される。この反応はＵＶ照射により促進される。
【０１３８】
市販のＤＮＡ合成機でテールを付加したプローブを合成することもできるが、プローブにポリｄＴテールを生成するために末端デオキシリボヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ、Ｒａｔｌｉｆｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；以下の反応に対して濃度約１２０単位／μｌ（１００ｐｍｏｌｅ／μｌ））が使用される。しかし、テールを付加したプローブの作製のためにＤＮＡ合成機を使用した場合、望ましくない未成熟な鎖停止がテール領域に最初に起きるように、プローブの５’端にテールを置くべきである。
【０１３９】
ＴｄＴ反応は１ｘＴｄＴ塩、２００ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチド、８００μＭ ＤＴＴおよび６０単位のＴｄＴを含む容量約１００μｌで行われるべきである。１０ｘＴｄＴ塩は１０００Ｍｍカコジル酸カリウム、１０ｍＭ塩化コバルト、２ｍＭジチオスレイトール、２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で、参考文献としてこの中に入れられているが、ＲｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙとＷｕの、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ１．、第６５巻：４３から６２ページに記述されるように調製される。８ｍＭ ｄＴＴＰの１０ｘ保存溶液が便宜上（水酸化ナトリウムでｐＨ７に中和されて）調製される。
【０１４０】
ＴｄＴ反応は３７℃で２時間行われ、その後１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を１００μｌ添加することにより停止される。テールを付加されたオリゴヌクレオチドの終濃度は１μＭ（１ｐｍｏｌｅ／μｌ）で、ホモポリマーのテールの長さは約４００残基である。テールの長さはｄＴＴＰのオリゴヌクレオチドに対する分子比を調整することにより変化させることができる。テールを付加したプローブは使用まで−２０℃で保存される。
【０１４１】
リバースドットブロット法に好ましいナイロン膜はＰａｌｌ製で、ＢｉｏＴｒａｎｓナイロン膜としてＩＣＮから市販されるポアサイズ０．４５ミクロンのＢｉｏｄｙｎｅ Ｂナイロン膜である。プローブはＢｉｏＲａｄ製のＢｉｏ−Ｄｏｔドットブロット器を用いて非常に簡便に膜上にスポットされる。それぞれのプロープは膜の独立の別個の位置にスポットされる。約２から１０ｐｍｏｌｅのそれぞれのテールを付加されたプローブはドットブロット器にのせる前に５０から１００μｌのＴＥ緩衝液に予め混合される。ドットブロット後、膜は過剰の液体をぬぐうために吸収紙の上に簡単に置かれる。膜はその後Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ製のＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ光ボックスのようなＵＶ光ボックスの中に置かれ、テールを付加したプローブをナイロン膜に固定するために、２５４ｎｍで５０から６０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶ光に露光される。未結合のプローブを除去するためにハイブリダイゼーション溶液で約１５分間簡単に洗浄した後、膜はビオチン化されたＰＣＲ産物とのハイブリダイゼーションに供せられる。
【０１４２】
増幅されたＰＣＲ産物は３から１０分間９５℃で熱処理することにより変性され、４０μｌの変性されたＰＣＲ産物はハイブリダイゼーションのためにそれぞれのプローブパネルに添加される。ハイブリダイゼーションは０．５ｘＳＳＰＥ、０．２５％ ＳＤＳおよび５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液（２０ｘＳＳＰＥが０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、０．２Ｍリン酸−ナトリウム、３．６Ｍ塩化ナトリウムを含み、０．１１Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ７．４に調整される）からなるハイブリダイゼーション緩衝液中で、振とう水浴を用いて、２０分間５７℃で行われる。ハイブリダイゼーション緩衝液は３．１ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液に２５μｌのＳＡ−ＨＲＰを含む溶液３ｍｌに置き換えられ、振とう水浴で５７℃２０分間インキュベートされる。
【０１４３】
洗浄は２ｘＳＳＰＥおよび０．１％ ＳＤＳの洗浄緩衝液中で行われる。１０ｍｌの洗浄緩衝液での膜の簡単な洗浄の後、１０ｍｌの緩衝液での１２分間のきつい洗浄が５７℃で行われる。さらに５分間の室温での洗浄が行われ、続いて、１０ｍｌの０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で５分間の洗浄が行われる。
【０１４４】
色素原の結合は５ｍｌの０．１Ｍクエン酸ナトリウム、５μｌの３％過酸化水素および０．２５ｍｌの色素原（Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒのＴＭＢ）からなる色素原溶液５ｍｌ中で室温、２５から３０分間行われる。蒸留水による１０分間の洗浄が三回室温で行われる。室温３０分間の１ｘＰＢＳによる後洗浄により信号の質を高めることができる。色素原を含むこれらの段階の間、膜はアルミ箔で覆うことにより遮光される。現像された膜は永久に記録するために写真撮影される。
【０１４５】
例４
本発明のこの具体例では、マイクロタイタープレート法が使用される。プローブはマイクロタイタープレートのウェルに固定される。増幅された標的ＤＮＡは上述のように結合プローブにハイブリダイズされる。前例のように、増幅プライマーは結合プローブにハイブリダイズする増幅されたＤＮＡの検出をさせるためにビオチン化される。
【０１４６】
ＢＳＡに結合した望みのプローブが最初に個々のウェルのプラスチック表面に吸着される。ウェルはその後ウシ血清アルブミンのようなタンパク質でブロックされる。好ましくはＣｏｒｎｉｎｇ製の９６ウェルのプレートが使用される。
【０１４７】
増幅が完了すると、ＰＣＲチューブはサーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製）から取り出される。１００μｌの変性溶液がそれぞれのＰＣＲチューブに添加される。それぞれのチューブに新しいピペットチップが使用される。一つの具体例では、検出は直ちには行われない。その場合、ＰＣＲチューブは２℃から８℃で一晩保存された。変性された増幅反応は２℃から８℃の保存で粘性をもつようになる。ピペットを容易にするために、チューブを開ける前に、チューブは簡単に２５℃から３０℃で温められる。
【０１４８】
適当数の８ウェルマイクロタイタープレートストリップ（最少で２ストリップ）が取り出され、マイクロタイタープレート枠にセットされた。１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液がマイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに添加された。
【０１４９】
変性溶液は０．４Ｍ水酸化ナトリウム、８０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．００５％チモールブルーを含む。ハイブリダイゼーション／中和緩衝液は２．５Ｍチオシアン化ナトリウム、８０ｍＭリン酸二ナトリウム、１０ｍＭリン酸一ナトリウムおよび０．１２５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む。使用前にｐＨが５．０＋／−０．２であることがチェックされる。
【０１５０】
複数チャンネルピペットについたチップを用いて、それぞれのＰＣＲチューブの変性された増幅反応液２５μｌがマイクロタイタープレートの相当する位置のウェルに入れられた。プレートは蓋で覆われ、緩やかに１０から１５秒側面をたたかれた。適正な試薬が入れられたウェルは黄色に着色する。無色または青色への単一な変化だけが注目されるなら、過剰のアンプリコンが添加される。正のＯＤ値は増加するが負のＯＤ値は影響されないように、試験は継続される。プレートは３７℃で６０分間インキュベートされた。
【０１５１】
インキュベーションに続き、プレートは洗浄溶液で五回洗浄された。プレートの洗浄は手動で、またはそれに応じてプログラムされた自動マイクロタイタープレート洗浄機を用いて行われる。洗浄には１ｘＰＣＲ洗浄緩衝液が使用された。１０ｘ濃度のＰＣＲ洗浄緩衝液は次のように調製された：９．９４ｇ／ｌのリン酸二ナトリウム；４．４１ｇ／ｌのリン酸一ナトリウム；３．７２２ｇ／ｌのＥＤＴＡ；８７．６６ｇ／ｌの塩化ナトリウム；１３．７ｇ／ｌのＴＷｅｅｎ２０および１０ｇ／ｌのＰｒｏ Ｃｌｉｎ ３００（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）。溶液はリン酸でｐＨ調整される（ｐＨ６．５から７．１が好ましい）。
【０１５２】
手動洗浄では、プレートの内容物は空にされ、乾燥された。３００μｌの洗浄溶液が試験されたプレートのそれぞれのウェルに添加され、プレートは１５から３０秒乾かされた。プレートは再び空にされ、乾燥された。この洗浄過程はさらに四回繰り返された。
【０１５３】
自動マイクロプレート洗浄機では、次の方法が使用された。ウェルの内容物は吸引された。試験されたプレートのそれぞれのウェルに３５０μｌの洗浄溶液が添加されるように洗浄機はプログラムされ、３０秒間浸された後、吸引された。これらの段階はさらに四回繰り返された。プレートはその後乾燥された。
【０１５４】
１００μｌのコンジュゲートが試験されるプレートのそれぞれのウェルに添加された。アビジン−ＨＲＰコンジュゲートは次のように調製される。希釈液は０．１モル；０．２５％ Ｅｍｕｌｓｉｔ２５（ＤＫＳ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）；１．０％ ＫａｔｈｏｎＣＧ（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）；０．１％フェノール；１．０％ウシγ−グロブリンを含む。溶液は濃塩酸でｐＨを７．３に調整された。この希釈液に対して、１０ｎＭのコンジュゲートアビジンが添加された（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）。プレートは蓋をされ、３７℃で５０分間インキュベートされた後、上述のように再び洗浄された。作業基質は８ウェルのマイクロタイタープレートストリップ二枚（１６検体）それぞれに対し２．０ｍ１の基質Ａおよび０．５ｍｌの基質Ｂを混合することにより調製された。基質Ａは３ｍＭ過酸化水素；６．５ｍＭクエン酸および０．１％ Ｋａｔｈｏｎ ＣＧを含む。基質Ｂは４．２ｍＭ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンおよび４０％ジメチルホルムアミドを含む。作業基質は使用前３時間以内に調製され、直射日光を避けて保存された。
【０１５５】
１００μｌの作業基質（基質ＡおよびＢの混合液）が試験されるプレートのそれぞれのウェルに添加された。プレートは蓋をされ、暗所で１０分間、室温（２０℃から２５℃）でインキュベートされた。１００μｌの停止試薬（５％硫酸）が試験されたそれぞれのウェルに添加された。それぞれのウェルの４５０ｎｍでの吸光度が停止試薬添加後１時間以内に読まれた。試料および対照の吸光度の値が記録された。
【０１５６】
例５
本発明のオリゴヌクレオチドはＨＣＶゲノムの配列の増幅および増幅産物の検出に使用される多くの組合わせのプライマーおよびプローブを提供する。非常に多くのオリゴヌクレオチドがＲＴ−ＰＣＲ増幅でのプライマーとしての効果について試験された。
【０１５７】
ＰＣＲ増幅反応は例１に記述された方法を用いて、各種のオリゴヌクレオチドの対で行われた。増幅産物はアガロースゲル電気泳動分離および染色の標準的な方法により検出された（上述のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照）。上流プライマーＫＹ６５（配列番号１）およびＫＹ９８（配列番号３）のそれぞれはＨＣＶ配列の増幅において、下流プライマーＫＹ６８（配列番号２７）、ＫＹ９５（配列番号２０）およびＫＹ９９（配列番号２６）のそれぞれと効果的に機能した。ＫＹ６７（配列番号１０）はＫＹ６８（配列番号２７）およびＫＹ９９（配列番号２６）の両者と効果的に機能した。上流プライマーＫＹ８０（配列番号５）、ＫＹ８３（配列番号７）、ＫＹ８４（配列番号８）、ＫＹ８５（配列番号９）およびＫＹ１４４（配列番号６）のそれぞれは下流プライマーＫＹ７８（配列番号１８）、ＫＹ９５（配列番号２０）、ＫＹ１４５（配列番号１９）、ＫＹ１４８（配列番号１７）およびＫＹ１４９（配列番号１６）のそれぞれと効果的に機能した。最後に、上流プライマーＫＹ８０（配列番号５）およびＫＹ８１（配列番号１１）のそれぞれはＫＹ１００（配列番号２１）と効果的に機能した。
【０１５８】
プライマーとしてＫＹ７８（配列番号１８）およびＫＹ８０（配列番号５）を用いたＰＣＲ増幅の増幅産物は上記の例２に記述される方法を用いて、ＫＹ８８（配列番号１２）、ＫＹ８４（配列番号８）およびＫＹ８５（配列番号９）のそれぞれで探索することにより検出された。
【０１５９】
プライマーＫＹ１５３（配列番号１５）、ＫＹ１４９（配列番号１６）およびＫＹ１４８（配列番号１７）はＫＹ８５の下流の上流プライマーのいずれとも使用できない。ＫＹ７８（配列番号１８）の３’端はＫＹ８８（配列番号１２）の３’端に隣接しており、これら二つのプライマーはプライマーの対として機能できるが、介在配列が欠如しているために独立した探索は不可能である。プライマーＫＹ８６（配列番号１３）はＫＹ１００（配列番号２１）、ＫＹ９９（配列番号２６）、ＫＹ１０９（配列番号２４）およびＫＹ１１１（配列番号２５）とだけ対となることができる。プライマーＫＹ８７（配列番号１４）はＫＹ９９（配列番号２６）、ＫＹ１０９（配列番号２４）およびＫＹ１１１（配列番号２５）とだけ対となることができる。
【０１６０】
上で討論されたＫＹ８４（配列番号８）、ＫＹ８５（配列番号９）、ＫＹ８７（配列番号１４）およびＫＹ１４８（配列番号１７）はＣ９単離株とは別の既知のＨＣＶ単離株の検出に有効である。表４に表されるプローブおよびプライマーはＨＣＶ−Ｃ９および関連変異株を増幅、検出し、ＪａｐａｎおよびＵＳのＨＣＶ原型を排除するために特異的である。
【０１６１】
特異的にＪａｐａｎおよびＵＳのＨＣＶ原型を増幅し、ＨＣＶ−Ｃ９は増幅しないプライマーはＫＹ８４（配列番号８）、ＫＹ８５（配列番号９）、ＫＹ１４８（配列番号１７）およびＫＹ８７（配列番号１４）により例示される。Ｊａｐａｎ、ＵＳおよびＣ９のＨＣＶ原型を増幅するためのプライマーはＫＹ６７（配列番号１０）、ＫＹ７８（配列番号１８）、ＫＹ８０（配列番号５）、ＫＹ８１（配列番号１１）、ＫＹ８３（配列番号７）、ＫＹ８６（配列番号１３）、ＫＹ８８（配列番号１２）、ＫＹ９５（配列番号２０）、ＫＹ１００（配列番号２１）、ＫＹ１４４（配列番号６）、ＫＹ１４５（配列番号１９）およびＫＹ１５３（配列番号１５）を含む。プライマーＫＹ６５（配列番号１）、ＫＹ６８（配列番号２７）、ＫＹ９８（配列番号３）、ＫＹ９９（配列番号２６）、ＫＹ１０９（配列番号２４）、ＫＹ１１１（配列番号２５）およびＫＹ１４９（配列番号１６）はＪａｐａｎおよびＵＳのＨＣＶ原型および関連変異単離株を増幅するために適しており、同様にＨＣＶ−Ｃ９および関連同型を検出する場合にも適している。
【０１６２】
Ｊａｐａｎ、ＵＳおよびＣ９のＨＣＶ原型および関連変異株を検出するためのプローブはＫＹ６７（配列番号１０）、ＫＹ７８（配列番号１８）、ＫＹ８１（配列番号１１）、ＫＹ８６（配列番号１３）、ＫＹ９５（配列番号２０）、ＫＹ１５０（配列番号４３）およびＫＹ１４５（配列番号１９）により例示される。Ｊａｐａｎ、ＵＳのＨＣＶ原型および関連変異株を検出し、ＨＣＶ−Ｃ９原型を検出しないプローブはＫＹ８３（配列番号７）、ＫＹ８７（配列番号１４）、ＫＹ８４（配列番号８）、ＫＹ８８（配列番号１２）、ＫＹ８５（配列番号９）、ＫＹ１００（配列番号２１）、ＫＹ１４８（配列番号１７）およびＫＹ１４９（配列番号１６）を含む。プローブＫＹ６５（配列番号１）、ＫＹ６８（配列番号２７）、ＫＹ８２（配列番号２８）、ＫＹ９９（配列番号２６）、ＫＹ１０９（配列番号２４）、ＫＹ１１１（配列番号２５）、ＫＹ８０（配列番号５）、ＫＹ１４４（配列番号６）およびＫＹ１５３（配列番号１５）はＪａｐａｎおよびＵＳのＨＣＶ原型および関連変異単離株を検出するのに適しており、同様にＨＣＶ−Ｃ９および関連変異株を検出する場合にも適している。
【０１６３】
例６
ＵＮＧ存在下でのＨＣＶ ＲＮＡの均一ＲＴ／ＰＣＲ増幅は好ましい方法である。例１に記述される均一ＲＴ−ＰＣＲ増幅法は弱化段階を含むように改められた。以下に記述されるプロトコールはＲＴおよびＰＣＲがｄＵＴＰを取り込むことを示す。弱化はＲＴ段階の前に５０℃で起きる。上昇したＲＴ−ＰＣＲ反応温度で、ＵＮＧは不活性で、ｄＵを含む産物は分解されない。２単位のＵＮＧ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）は１００００コピーのＨＣＶ ＲＮＡからつくられた１００μｌの増幅産物の０．２５μｌに相当する持ち越し分をうまく弱化した。例えば、１００μｌ反応あたり６単位までのより高い量のＵＮＧもまた敵している。反応系の成分は次の順で添加された：
【０１６４】
＊１ｘ酵素保存緩衝液＝（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ〔ｐＨ７．５〕、１００ｍＭ塩化カリウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５％ ＴＷｅｅｎ２０〔Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｕｒｆａｔａｍｐｓ〕、５０％グリセロール〔ｖ／ｖ〕）。
【０１６６】
＊＊Ｐｈａｒｍａｃｉａ製の１ｍｇのポリｒＡホモポリマーＲＮＡ（Ｎｏ２７−ポリｒＡは平均Ｓ２０，ｗ＝８．８（６から１３の範囲）をもつ）またはアニーリング温度でいくつかの非特異的な産物を反応あたり２００ｎｇ以下の添加レベルで使用した。仔ウシ胸腺ＤＮＡ、ＰＢＬ ＤＮＡ、ヒト胎盤ＤＮＡおよび細胞系列Ｋ５６２のＤＮＡが試験され、同様であった。
【０１６７】
手順：
１．カバーを予め熱するためにＴＣ９６００サーモサイクラーをオンにする。
２．室温で反応液を準備する。
３．サーモサイクラーにチューブを入れ、サーモサイクラーを再始動するために「運転」を押す。
４．ファイル８で機械を始動する。
５．提案されたサーモサイクラーの条件：
ファイル１：５０℃で２分間保持（ＵＮＧ弱化段階）
ファイル２：７０℃で１５分間保持（逆転写段階）
ファイル３：９５℃で１分間保持
ファイル４：二段階温度、９５℃１５秒および６０℃１０から３０秒を二回
ファイル５：二段階温度、９０℃１５秒および６０℃１０から３０秒を３８回
ファイル６：７２℃で１時間保持
ファイル７：１５℃に保持、無制限
ファイル８：ファイル１、２、３、４、５、６および７を連結
【０１６８】
段階５のファイル２で、１５分の反応時間は反応効率を下げることなしに、５分まで減少できる。段階５のファイル５で、高Ｇ＋Ｃの鋳型の場合、変性温度を９５℃まで上げることが好ましい。マイクロタイタープレート法による反応産物の解析から一般に正の試料で０．８以上の、および負の試料で０．５より小さい吸収値という結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【図１】新規変異株ＨＣＶの配列Ｃ９、四種の関連変異株および原型ＪａｐａｎおよびＵＳ ＨＣＶ単離株を並列したものを示す。
【図２】新規変異株ＨＣＶの配列Ｃ９、四種の関連変異株および原型ＪａｐａｎおよびＵＳ ＨＣＶ単離株を並列したものを示す
Claims (10)
- Ｃ９のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸の存在を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブを含む組成物であって、
該プローブは、Ｃ９原型ＨＣＶ株または変異株の核酸を検出するためのものであり、かつ、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７と、それらの相補的な配列からなるグループから選択される核酸配列を有する、
上記組成物。 - Ｃ９のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを含む組成物であって、
該プライマーは、Ｃ９原型ＨＣＶ株または変異株の核酸を増幅するためのものであり、かつ、配列番号３８、配列番号３９および配列番号４２からなるグループから選択される核酸配列を有する、
上記組成物。 - Ｃ９のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸の存在を検出する方法であって、
（ａ） 核酸部分配列を増幅すること；
（ｂ） プローブが核酸部分配列に結合して安定な雑種（ハイブリッド）二重鎖を形成するような条件下で、増幅された核酸を請求項１記載のオリゴヌクレオチドプローブと混合すること；および
（ｃ） その部分配列およびプローブの間に形成される雑種を検出すること；
からなる、
上記方法。 - Ｃ９のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸の存在を検出する方法であって、
（ａ） 核酸部分配列を増幅することであって、増幅が請求項２記載の少なくとも１つのプライマーを用いることにより行われる；
（ｂ） プローブが核酸部分配列に結合して安定な雑種（ハイブリッド）二重鎖を形成するような条件下で、増幅された核酸をその部分配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと混合すること；および
（ｃ） その部分配列およびプローブの間に形成される雑種を検出すること；
からなる、
上記方法。 - 増幅がポリメラーゼ連鎖反応により行われる、請求項３または４に記載の方法。
- Ｃ９のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸の存在を検出するためのキットであって、Ｃ９原型ＨＣＶ株または変異株の核酸を検出するためのものである請求項１記載の少なくとも１つの核酸プローブを含む、上記キット。
- Ｃ型肝炎ウイルスのＣ９原型ＨＣＶ株または変異株に特異的な核酸を検出するための請求項６記載のキットであって、ＨＣＶ−Ｃ９ウイルスの核酸部分配列に実質的に結合する請求項１記載の少なくとも１つの核酸プローブを含む、上記キット。
- 配列番号２９、Ｒ１１６（配列番号３０）、Ｒ４５（配列番号３１）、Ｒ１１０（配列番号３２）またはＲ４３（配列番号３３）の核酸配列を有する核酸分子。
- ＡＴＣＣ寄託番号第７５２６５号として寄託された、配列番号２９の配列を含む核酸分子。
- ＡＴＣＣ寄託番号第７５２６６号として寄託された、配列番号３２の配列を含む核酸分子。
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