JPH0686700A

JPH0686700A - Ｃ型肝炎ウイルスの検出のための試薬および方法

Info

Publication number: JPH0686700A
Application number: JP4270718A
Authority: JP
Inventors: Robert M Resnick; エム．レスニックロバート; Karen K Y Young; ケイ．ワイ．ヤングカレン
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1991-08-27
Filing date: 1992-08-27
Publication date: 1994-03-29
Anticipated expiration: 2021-06-28
Also published as: CN1134666C; CA2076793A1; NO311730B1; EP0787807A3; US5527669A; AU665952B2; US5580718A; JP3790274B2; EP0787807A2; DE69223562T2; EP0787807B1; DE69223562D1; NO923341L; PT787807E; JP2006180884A; JP4164098B2; ATE241704T1; EP0529493A2; NZ244071A; DK0787807T3

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明はＵＳ、ＪａｐａｎおよびＨＣＶ−Ｃ
９原型ウイルスの核酸を増幅し、検出するための試薬、
方法およびキットを提供することを目的とする。【構成】オリゴヌクレオチドプライマーはｃＤＮＡを
作製するためのウイルスゲノムＲＮＡの逆転写およびそ
れに続くポリメラーゼ連鎖反応によるｃＤＮＡの増幅を
含む方法において、Ｃ型肝炎ウイルスの核酸を増幅し、
検出するために使用される。オリゴヌクレオチドプロー
ブはハイブリダイゼーションによる増幅されたＤＮＡの
存在の検出に使用される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は非Ａ非Ｂ肝炎の原因であるＣ型肝
炎ウイルスの検出のための試薬および方法を提供するも
のである。試薬には特にウイルスＲＮＡゲノムの逆転写
およびそれに続くポリメラーゼ連鎖反応による逆転写に
より作製されたｃＤＮＡの増幅の両者のためのオリゴヌ
クレオチドプライマーが含まれる。配列特異的オリゴヌ
クレオチドプローブは増幅されたＨＣＶの核酸配列の検
出のために準備される。プライマーおよびプローブはＨ
ＣＶ感染の検出のための診断試験に有効である。この診
断試験は臨床および伝染病学的環境で重要な応用性をも
つ。

【０００２】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は非Ａ非Ｂ肝
炎（ＮＡＮＢＨ）の計り知れないほど多くの原因の一つ
である。原型ＨＣＶはＣｈｏｏらにより１９８９年にＳ
ｃｉｅｎＣｅ、第２４４巻：３５９から３６２ページで
報告されたように、感染チンパンジーの血漿から得られ
た血液由来のＮＡＮＢＨウイルスのｃＤＮＡクローンか
ら同定された。この原型ＨＣＶの遺伝子のヌクレオチド
配列は欧州特許公示第３１８，２１６号；第３８８，２
３２号および第３９８，７４８号で記述されている。Ｈ
ＣＶゲノムのヌクレオチド配列はＣｈｏｏらの１９９１
年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、
第８８巻：２４５１から２４５５ページに報告され、関
連ウイルスと比較された。

【０００３】それ以来他の株の配列が報告されている。
ＨＣＶのゲノムは単離株の間で非常に大きな核酸配列の
不均一性を示す。ＨＣＶのＲＮＡゲノムのｃＤＮＡの分
離がＫｕｂｏｅｔらの１９８９年、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．、第１７巻、１０３６７から１０３７２ペー
ジに報告された。著者らは上述のＣｈｏｏらが１９８９
年に報告した配列に基づく逆転写プライマーを構築し
た。分離されたＨＣＶゲノムの断片は原型ＨＣＶの配列
と７９．８％のホモロジーを示した。類似のプロトコー
ルにより得られた三種の異なる領域の配列が、Ｔａｋｅ
ｕｃｈｉらにより、１９９０年、Ｇｅｎｅ、第９１巻：
２８７から２９１ページに報告された。原型配列との配
列ホモロジーが一つの領域について７３．５％程度であ
ることが報告された。

【０００４】日本人患者から分離された株のＨＣＶのゲ
ノム配列がＫａｔｏらにより１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８７巻：９５２
４から９５２８ページに報告された。配列は比較された
領域全体で原型ＨＣＶのゲノムと７７．４％のホモロジ
ーを示した。Ｔａｋａｍｉｚａｗａらにより１９９１年
にＪ．Ｖｉｒｏｌ．、第６５巻（第３号）：１１０５か
ら１１１３ページに報告されたＨＣＶゲノムの全コーデ
ィング領域の配列は原型ＨＣＶ株と７７％のホモロジー
を示した。

【０００５】日本では、Ｋ１およびＫ２と命名された、
ゲノムの４００ヌクレオチド領域に基づく二つの主たる
株が観察されている。これらの株は原型ＨＣＶ配列と６
７％程度の配列ホモロジーをもつ（Ｅｎｏｍｏｔｏらの
１９９０年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第１７０巻（第３号）：１０２１
から１０２５ページを参照せよ）。Ｋ２株はさらに、グ
ループ間で約２０％のヌクレオチド変異およびそれぞれ
のグループ内で約５％のヌクレオチド変異をもつＫａお
よびＫｂと命名された二つのグループに細分された。

【０００６】原型ＨＣＶの配列と類似したレベルのホモ
ロジーがＫａｔｏらにより１９９０年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｉｎｖｅｓｔ．、第８６巻：１７６４から１７６７ペー
ジに報告された。１５人の患者からｃＤＮＡ断片が増幅
され、配列が決定された。原型の配列の３５２５から３
５６１の位置に相当する増幅された３７ヌクレオチドの
部分は原型ＨＣＶの配列と６８から７８％のホモロジー
を示した。

【０００７】ＨＣＶのゲノムＲＮＡは、ゲノムＲＮＡか
らｃＤＮＡを作製し、ポリメラーゼ連鎖反応によりｃＤ
ＮＡを増幅し、さらに配列特異的オリゴヌクレオチドで
調査することにより血清に検出される。ＨＣＶ株間の配
列の不均一性のために、プライマーおよびプローブは株
の間で配列が保存される領域が見いだされない限り、株
特異的である。そのような保存された領域の一つはＨＣ
Ｖゲノムの５’端である。

【０００８】ＨＣＶゲノムの５’端の非コーディング配
列は最初にＯｋａｍｏｔｏらにより１９９０年に、Ｊａ
ｐａｎＪ．ＥＸｐ．Ｍｅｄ．、第６０巻（第３号）：
１６７から１７７ページで報告された。二つの株の間の
比較は５’端の非コーディング配列が保存されているこ
とを示唆した。ＨＣＶゲノムの５’端の非コーディング
配列の保存された性質はまた、Ｈａｎらにより１９９１
年に、ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、第８８巻：１７１１から１７１５ページに報告され
た。五大陸の個人から回収された１１のＨＣＶ単離株か
ら得られた３４１ヌクレオチド領域の部分配列が比較さ
れた。七つの配列が原型配列と完全なホモロジーを示
し、残りの四つが１から５個の塩基のミスマッチを示し
た。

【０００９】Ｏｋａｍｏｔｏらの１９９０年、Ｊａｐａ
ｎＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第６０巻（第３号）：２１
５から２２２ページには、保存された５’非コーディン
グ領域を含むＨＣＶゲノムの各種の領域に対するプライ
マーが記述された。保存された領域から選択されたプラ
イマーはうまく試験された殆どの株の核酸を増幅し、不
均一な領域から選択されたプライマーは株の小さな部分
の核酸を増幅した。しかし、これらのプライマーを用い
た増幅効率は低かった。参考文献では二段階ＰＣＲ増幅
を記述しており、二回目の増幅は以前に増幅された標的
領域について、第一のプライマーのセットにより増幅さ
れた領域内に入れ子になる第二のプライマーのセットを
用いて行われた。

【００１０】二つのセットのプライマーを用いる二回の
増幅を必要とするＰＣＲ増幅はまたＧａｒｓｏｎらによ
り、１９９０年、Ｌａｎｃｅｔ、第３３５巻：１４１９
から１４２２ページに報告された。非構造タンパク質
（ＮＳ５）を暗号化する領域が増幅された。配列の不均
一性のために、これらのプライマーにより認識されない
ＨＣＶ配列が存在する（Ｇａｒｓｏｎらの、１９９０
年、Ｌａｎｃｅｔ、第３３６巻：８７８から８７９ペー
ジを参照せよ）。その結果として、保存された５’非コ
ーディング領域のプライマーが試みられたが、充分な感
度を得るために、入れ子になったプライマーのセットを
用いた二段階増幅が依然として必要であった。入れ子プ
ライマーを用いた二回の増幅による５’端領域の増幅は
また、Ｋａｎａｉらにより、１９９０年に、Ｌａｎｃｅ
ｔ、第３３６巻：２４５ページに報告された。

【００１１】入れ子プライマーでの二回の増幅を用いた
増幅は非能率的であるだけでなく、汚染の可能性を大い
に増加する。汚染の問題は技術的に良く知られており、
増幅段階の間にプライマーを変え、試薬を加えるために
反応チューブを開けることは少しでも可能ならば最も避
けられるべきである。汚染の問題はさらに、最初の逆転
写段階およびそれに続くＰＣＲ増幅の間で反応条件を変
える必要があるために悪化する。

【００１２】全て、または殆ど全ての株が増幅されるよ
うに保存された領域からそれぞれ選択されたＨＣＶの配
列を増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドおよ
び一つのセットのプライマーでの増幅が充分であるよう
な効果的な増幅方法の必要が依然として存在する。プラ
イマーがハイブリダイズする二つの保存された領域間の
保存された領域から選択された増幅されたｃＤＮＡの検
出のためのプローブオリゴヌクレオチドの必要もまた存
在する。同一試薬を使用し、それにより増幅過程中に反
応チューブを開ける必要を除去するような逆転写および
ＰＣＲを行わせる反応プロトコールおよび試薬が必要と
される。

【００１３】さらに、ＮＡＮＢＨの例の１０％は原型の
キャプシドおよびエンベロープ抗原とは非反応性である
（Ｃｈａｕｄｈａｒｙらの１９９１年、Ｊ．Ｃｌｉｎｉ
ｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２９巻：２３２
９から２３３０ページおよびＨｏｓｅｉｎらの１９９１
年、ＰＮＡＳ、第８巻：３６４７から３６５１ページを
参照せよ）。それ故、診断および新しい単離株により暗
号化される抗原に基づくＰＣＲの開発は、血清学に基づ
く診断試験の信頼性を改善するであろう。本発明はＨＣ
Ｖを検出するためのプライマー、プローブおよび方法を
提供することによりこれらの必要に応ずるものである。

【００１４】提供される特異的プライマーおよび配列特
異的オリゴヌクレオチドプローブは、ウイルスのＲＮＡ
ゲノムの配列の増幅および検出を可能にする均一逆転写
−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で使用され
る。本発明のプライマーおよび方法を用いる増幅の効率
は、入れ子プライマーでの二回のＰＣＲ増幅の必要を除
去し、その結果得られる試験の感度の高さは核酸の信頼
できる検出を提供する。

【００１５】本発明の一つの面は特異的オリゴヌクレオ
チドプライマーに関するものである。本発明はＨＣＶの
核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを
含む構成物を提供するものであり、前記プライマーはＪ
ａｐａｎ、ＵＳおよびＣ９株からなるグループから選択
されるＨＣＶ株またはその同型の核酸部分配列を増幅す
るのに適している。提供されるプライマーはウイルスの
ＲＮＡゲノムの逆転写およびそれに続くポリメラーゼ連
鎖反応を用いた作製されたｃＤＮＡの増幅の両者で機能
する。プライマーはＨＣＶゲノムの保存された領域の配
列にハイブリダイズし、それ故、各種の株に結合する。
提供されたプライマーを用いた増幅の効率は入れ子プラ
イマーでの二回のＰＣＲ増幅の必要を除去するのに充分
である。

【００１６】本発明の別の面は株に関係のないＨＣＶゲ
ノムの核酸の存在を検出することができるプローブに関
するものである。プローブは株全体に保存される領域に
相補的である。本発明のプローブを用いた診断試験は特
異性を落すことなしに非常に多くのＨＣＶ株を検出でき
る。それ故、本発明はＣ型肝炎ウイルスの核酸の存在を
検出するためのオリゴヌクレオチドプローブを含む構成
物を提供するものであり、前記プローブはＪａｐａｎ、
ＵＳおよびＣ９原型株からなるグループから選択される
ＨＣＶ株またはその変異株の核酸を検出するのに適して
いる。

【００１７】本発明の第三の面はキットに関するもので
ある。これらのキットは各種の形態をとり、一つまたは
それ以上の逆転写、増幅または検出の試薬、例えばプラ
イマー、プローブ、ポリメラーゼ、グリコシラーゼ、緩
衝液およびヌクレオシド三リン酸を含むことができる。

【００１８【００１８一つの具体例として、本発明は肝炎ウイルスのＣ９単離
株に特異的な核酸の検出のためのキットを提供するもの
であり、キットは実質的にＨＣＶ−Ｃ９ウイルスの核酸
部分配列に結合する核酸プローブを含むコンパートメン
トからなる。【００１９】本発明の別の面はＨＣＶのＲ
ＮＡを増幅し、検出する方法に関するものである。

【００２０】さらに、本発明は配列番号２９に実質的に
相同なウイルス核酸配列を含む構成物に関するものであ
る。ここでＣ９単離株を意味するそのようなウイルス配
列を含むｃＤＮＡクローンであるＰＨＣＶ−Ｃ９は、Ａ
ｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎに寄託され、寄託番号７５２６５をもつ。

【００２１】本発明はまた、Ｃ９単離株および関連の変
異株に特異的な核酸配列を検出するためのオリゴヌクレ
オチドプローブおよびプライマーを提供するものであ
る。本発明のプローブは好ましくは次のグループ：

【化１】から選択される部分配列を含む。

【００２２】本発明はさらに、Ｃ９単離株に特異的な核
酸配列の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーを
提供するものである。特異的にＣ９変異株および関連の
単離株を増幅するための本発明のプライマーは好ましく
は次の下流プライマー：

【化２】の一つを使用するために上流プライマーの次のグルー
プ：

【化３】から選択される核酸配列を含む。

【００２３】本発明はまたＣ９単離株および以前に同定
されたＣ型肝炎単離株の配列に実質的に結合するプロー
ブを提供するものである。この範囲の好ましいプローブ
には

【化４】が含まれる。本発明はさらに非Ｃ９−ＨＣＶの配列を検
出するためのプローブを提供するものである。

【００２４】本発明はＣ型肝炎のゲノム核酸の存在を検
出する方法を提供するものであり、前記Ｃ型肝炎のゲノ
ム核酸はＪａｐａｎ、ＵＳおよびＣ９原型株からなるグ
ループから選択される核酸であって、（ａ）核酸部分配
列を増幅すること；（ｂ）プローブが核酸部分配列に結
合し、安定な雑種二重鎖を形成するような条件下で、増
幅された核酸をその部分配列に特異的なオリゴヌクレオ
チドプローブと混合すること；および（ｃ）その部分配
列およびプローブの間に形成される雑種を検出すること
からなる。

【００２５】別の具体例では、本発明は肝炎ウイルスの
Ｃ９単離株を検出する方法を提供するものであり、その
方法は（ａ）ＨＣＶ−Ｃ９の核酸配列を含むことが予想
される試料をＨＣＶ−Ｃ９の核酸配列に相補的な部分を
もつ核酸プローブと接触させること；および（ｂ）プロ
ーブの前記配列とのハイブリダイゼーションを検出する
ことの段階を含む。

【００２６】本方法はさらに、段階（ａ）の前に、ウイ
ルスに特異的な配列の部分を増幅する段階を含む。増幅
は好ましくはポリメラーゼ連鎖反応法の使用により行わ
れる。上記のプライマーおよびプローブは好ましくは本
発明の方法で使用される。

【００２７】本発明はまた肝炎ウイルスのＣ９単離株に
特異的な核酸の検出のためのキットを提供するものであ
る。キットは核酸配列の核酸部分配列に実質的に結合す
る核酸プローブを含むコンパートメントからなる。プロ
ーブは好ましくは上掲のグループから選択される。

【００２８】代替測定法は血清抗体のＣ９単離株のタン
パク質またはウイルスライゼートとの反応または、ウイ
ルス抗原に対して生じた免疫グロブリンのウイルスを含
む生物学的試料との反応のような免疫学的反応に基づく
ものである。本発明はそれ故、Ｃ９単離株に対して生じ
た生物学的に純粋な免疫グロブリンを提供するものであ
る。免疫グロブリンは好ましくは単クローン抗体であ
る。

【００２９】本発明を理解する目的のために、いくつか
の用語が以下に定義される。

【００３０】「増幅反応液」は、標的核酸を増幅するた
めに使用される各種の試薬を含む水溶液を意味する。こ
れらには酵素、水性緩衝液、塩、標的核酸およびデオキ
シヌクレオシド三リン酸が含まれる。内容に依存して、
反応液は完全または不完全な増幅反応液となる。

【００３１】「増幅反応システム」は、核酸の標的配列
のコピーを増加させるための試験管内の手段を意味す
る。そのような方法には限定はされないが、ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＤＮＡリガーゼ、ＱＢＲＮＡ
レプリカーゼおよびＲＮＡ転写に基づく増幅システムが
含まれる。これらは複数の増幅試薬を含み、以下にさら
に充分に記述される。

【００３２】「増幅反応チューブ」は、増幅試薬を入れ
るのに適している容器を意味する。一般的にチューブは
使用される増幅システムを阻害または干渉しないような
不活性な素材でつくられる。システムが加熱および冷却
の繰返しの熱サイクルを必要とする場合、チューブはサ
イクルの過程に耐え、典型的には正確にサーモサイクラ
ーのウェルに適合しなければならない。

【００３３】「増幅試薬」は、選択された増幅方法を実
施するために使用される各種の緩衝液、酵素、プライマ
ー、デオキシヌクレオシド三リン酸（通常の、および自
由な）およびプローブを意味する。

【００３４】典型的には標的核酸の「指数的な」増加を
意味する「増幅すること」または「増幅」は、ここでは
核酸の選択された標的配列の数の直線的および指数的な
増加を記述するために用いられる。

【００３５】「実質的な結合」は、オリゴヌクレオチド
および標的配列の間の相補的なハイブリダイゼーション
を意味し、ＰＣＲポリメラーゼの望みのプライミングま
たはハイブリダイゼーション信号の検出を行うために、
ハイブリダイゼーションの媒体の緊縮度を減少すること
により調節される重要でないミスマッチを含む。

【００３６】「生物学的に純粋な」という表現は、実質
的にまたは本質的に、天然の状態では見いだされる通常
一緒に存在するような成分が含まれない物質を意味す
る。例えば、アフィニティで精製された抗体または単ク
ローン抗体は生物学的に精製された状態にある。

【００３７】「ハイブリダイズすること」は、相補的な
塩基の対合を介した二つの一本鎖核酸の結合を意味す
る。

【００３８】「核酸」は、一本鎖または二重鎖いずれか
の形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオ
シドポリマーを意味し、別に限定しない限り、天然に生
ずるヌクレオチドと類似の様式で機能することができる
既知の天然ヌクレオチドの類似体を含む。

【００３９】「ヌクレオチドポリメラーゼ」は、ヌクレ
オシド三リン酸前駆体からＤＮＡまたはＲＮＡの合成を
触媒できる酵素を意味する。本発明の増幅反応では、ポ
リメラーゼは鋳型依存性で、典型的には形成されるポリ
マーの３’端にヌクレオチドを付加する。最も好ましく
はポリメラーゼは米国特許第４，８８９，８１８号およ
び第５，０７９，３５２号に記述されているように熱安
定性である。

【００４０】「オリゴヌクレオチド」という用語は、プ
ライマー、プローブ、検出される核酸断片および核酸の
コントロールのような二つまたはそれ以上のデオキシリ
ボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなる分子を
意味する。オリゴヌクレオチドの正確な大きさは多くの
因子およびオリゴヌクレオチドの最終的な機能または使
用に依存する。オリゴヌクレオチドは、例えば適当な配
列のクローニングおよび制限酵素による切断、およびＮ
ａｒａｎｇらの１９７９年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．、第６８巻：９０から９９ページのホスホトリエス
テル法；ＢｒｏＷｎらの１９７９年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ．、第６８巻：１０９から１５１ページのホス
ホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅらの１９８１年、Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．、第２２巻：１８５
９から１８６２ページのジエチルホスホアミダイド法お
よび米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法の
ような方法による直接的な化学合成を含む適当な方法に
より調製される。

【００４１】「プライマー」という用語は、核酸の鎖に
相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される、即
ち、適当な緩衝液中に四種の異なるヌクレオシド三リン
酸およびポリメリゼーションの薬品（即ち、ＤＮＡポリ
メラーゼまたは逆転写酵素）が、適当な温度で存在する
ような条件下で、ＤＮＡ合成の開始点として作用できる
天然または合成いずれかのオリゴヌクレオチドを意味す
る。プライマーは好ましくは一本鎖のオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドである。適当な長さのプライマーはプラ
イマーの使用計画に依存するが、典型的には１５から２
５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は一
般的に鋳型と充分に安定な雑種複合体を形成するために
より低い温度が必要である。プライマーは鋳型の正確な
配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズす
るために充分に相補的でなければならない。

【００４２】本発明の公開された具体例では、配列特異
的プライマーおよびプローブが提供される。これらの具
体例で提供されるように、さらに配列特異的プライマー
およびプローブが、例えば５’または３’端に標的配列
に相補的または非相補的なヌクレオチドを付加すること
により調製されることは技術者には明かであろう。プラ
イマー成分が標的配列の伸長の開始点として作用し、プ
ライマーおよびプローブがこれらの例証される具体例の
中に含まれる少なくとも１４の連続的なヌクレオチドで
構成される限り、そのような成分は発明の範囲の中にあ
る。

【００４３】「プライマー」という用語は、特に増幅さ
れる標的領域の一方または両端についての情報にいくら
かの曖昧さがある場合に一つ以上のプライマーを意味す
る。例えば、領域が母集団でかなりのレベルの多型を示
すならば、代わりの配列を増幅するプライマーの混合液
が調製される。望むならば、プライマーは比色的、光化
学的、生化学的、免疫化学的または化学的な手段により
検出できる標識を取り込むことにより標識される。例え
ば、有効な標識には３２Ｐ、蛍光色素、電子密度試薬、
（ＥＬＩＳＡに通常使用されるような）酵素、ビオチン
またはハプテンおよび抗血清または単クローン抗体が得
られるタンパク質が含まれる。標識はまた、プライマー
または増幅されたＤＮＡのようなプライマー伸長産物の
いずれかを固体支持体へ固定化するのを容易にする陽に
プライマー「捕捉する」ために使用される。

【００４４】「プローブ」は、標的核酸の部分配列に相
補的な塩基対を介して結合するオリゴヌクレオチドを意
味する。プローブは典型的にはハイブリダイゼーション
条件の緊縮度に依存して、プローブ配列と完全な相補性
をもたない標的配列に実質的に結合することを技術者は
理解するであろう。プローブは好ましくは同位元素を用
いた場合のように直接的に、またはストレプトアビジン
複合体が後に結合するビオチンを用いた場合のように間
接的に標識される。プローブの有無を調べることによ
り、標的の有無を検出できる。

【００４５】核酸プローブが引用される場合、「組換え
体」は天然ゲノムの部分としてプローブ配列を天然に含
む細胞から分離されたプローブに典型的に付随する天然
のタンパク質および核酸を含まないオリゴヌクレオチド
を意味する。組換え体プローブはＰＣＲのような増幅手
段および細菌が組換え体プローブで形質転換されるよう
な遺伝的クローニング法により作製されたプローブであ
る。

【００４６】「逆転写酵素」という用語は、リボ核酸の
鋳型に相補的なプライマー伸長産物を形成するためのデ
オキシリボヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素
を意味する。酵素はプライマーの３’端で合成を開始
し、合成が停止するまで鋳型の５’端へ向って進行す
る。ＲＮＡ標的配列を相補的なコピーＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ）配列に変換する適当な重合剤の例は、トリ骨髄芽腫
ウイルスの逆転写酵素および逆転写酵素活性をもつ熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼである。

【００４７】「配列特異的オリゴヌクレオチド」および
「ＳＳＯ」という用語は、検出される配列に正確に相補
的な「ハイブリダイズする領域」と呼ばれる配列をもつ
オリゴヌクレオチドを意味し、「配列特異的な緊縮ハイ
ブリダイゼーション条件下で」、正確に相補的な標的配
列にのみハイブリダイズする特定の対立遺伝子または変
異株に特徴的な典型的な配列である。ハイブリダイズ条
件の緊縮度を緩和することにより、配列のミスマッチが
許容されるようになる；許容されるミスマッチの程度は
ハイブリダイゼーション条件の適当な調整によりコント
ロールされる。解析される配列に依存して、一つまたは
それ以上の配列特異的オリゴヌクレオチドが使用され
る。「プローブ」および「ＳＳＯ」という用語は、ＳＳ
Ｏと互換的に使用される。

【００４８】特定のウイルス単離株に「特異的な配列」
は、単離株に独特の配列で、即ち他の以前に特徴付けさ
れた単離株には共通しないものである。単離株に特異的
な配列に相補的な部分を含むプローブは典型的には緊縮
条件下（例えば、固体支持体を７０℃で２ｘＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳで洗浄すること）で、他の単離株のゲノ
ムの相当する部分にハイブリダイズしない。

【００４９】特定の単離株に特異的な抗原またはエピト
ープは単離株に独特のもので、他の以前に特徴付けされ
た単離株とは共通しない。抗原またはエピトープに対し
て生じた免疫グロブリンはＥＬＩＳＡのような標準的な
方法では以前に特徴付けされた単離株の抗原とは交差反
応しない。

【００５０】「実質的に同一な」という用語は、二つま
たはそれ以上の配列がそれらの配列の大部分を共有する
ことを指す。一般に、これはその配列の少なくとも約９
０％で、好ましくは約９５％である。配列が実質的に同
一であることの別の指示は、緊縮条件下で同一ヌクレオ
チド配列にそれらがハイブリダイズするかどうかである
（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、
ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８５を参照せよ）。緊縮条件は
配列依存性で、異なる環境では異なるものとなる。一般
に、緊縮条件は限定されたイオン強度およびｐＨで特異
的な配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように
選択される。Ｔｍは標的配列の５０％が完全にマッチす
るプローブにハイブリダイズする（限定されたイオン強
度およびｐＨでの）温度である。典型的には、緊縮条件
は塩濃度がｐＨ７で少なくとも約０．２モルで、温度が
少なくとも約６０℃である。

【００５１】「部分配列」は核酸のより長い配列の部分
を含む核酸の配列を意味する。

【００５２】「標的領域」という用語は解析される核酸
の領域を意味し、多型領域を含む。

【００５３】「熱安定性ポリメラーゼ酵素」という用語
は、比較的熱に安定で、標的配列の一方の核酸の鎖に相
補的なプライマー伸長産物を形成するためのヌクレオシ
ド三リン酸の重合を触媒する酵素を意味する。酵素はプ
ライマーの３’端で合成を開始し、合成が停止するまで
鋳型の５’端へ向かって進行する。精製された熱安定性
ポリメラーゼ酵素は米国特許第４，８８９，８１８号に
より充分に記述されている。

【００５４】図１は新規変異株ＨＣＶの配列Ｃ９、四種
の関連変異株および原型ＪａｐａｎおよびＵＳＨＣＶ
単離株を並べたものである。

【００５５】Ｃ型肝炎ウイルスは約１００００ヌクレオ
チドの長さの一本鎖の＋鎖のＲＮＡ分子を含む小さなＲ
ＮＡウイルスである。ゲノムは単一の大きなポリタンパ
ク質に翻訳され、続いて加工されると信じられている単
一の、長い開かれた読み枠を含む。開かれた読み枠は未
翻訳領域（ＵＴＲ）に続いて（原型ウイルスの番号付け
のシステムを用いて）ヌクレオチドの３４３から始ま
る。５’ＵＴＲは比較的保存されており、ウイルスの複
製および調節には重要である。コーディング領域の５’
端もまた保存されている。本発明のあるプライマーおよ
びプローブはＨＣＶゲノムの５’端の保存された領域に
ハイブリダイズする。

【００５６】本発明のプライマーおよびプローブのハイ
ブリダイズする領域のオリゴヌクレオチド配列は以下に
示される。プライマーのハイブリダイズする領域として
使用されるオリゴヌクレオチド配列はまた、プローブの
ハイブリダイズする領域として使用されることを技術者
は理解するであろう。プローブとして使用されるプライ
マーの適合性はプライマーのハイブリダイゼーション特
性に依存する。同様に、プローブとして使用されるオリ
ゴヌクレオチドはプライマーとして使用される。

【００５７】表１に示されたオリゴヌクレオチドは＋鎖
（上流）のプライマーおよびプローブである。表はゲノ
ム核酸にハイブリダイズした場合のオリゴヌクレオチド
の３’端の位置に基づく順である。ゲノムの５’端に最
も近いところにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
は最初にあげられている。

【００５８】

【表１】

【００５９】表２は−鎖（下流）のプライマーまたはプ
ローブとして機能するオリゴヌクレオチドを示す。表１
と同一の内部順が使用されている。

【００６０】

【表２】

【００６１】いくつかのオリゴヌクレオチドは分子の
５’端に制限酵素部位を含むように修飾されたハイブリ
ダイズする領域をもつ。制限酵素部位はこれらのオリゴ
ヌクレオチドの一つがプライマーとして使用された場
合、増幅産物に導入される。最初のハイブリダイゼーシ
ョン条件は制限酵素部位周辺の塩基対のミスマッチが許
容されるように選択される。５’端付近のミスマッチは
プライマーの３’付近のものよりも許容される。オリゴ
ヌクレオチドＫＹ６５（配列番号１）、ＫＹ９８（配列
番号３）、ＫＹ９６（配列番号４）およびＫＹ６７（配
列番号１０）は上流プライマーで、ＨｉｎｄＩＩＩ部
位を含む。オリゴヌクレオチドＫＹ９５（配列番号２
０）、ＫＹ９９（配列番号２６）およびＫＹ６８（配列
番号２７）は下流プライマーでＥｃｏＲＩ部位を含む。
そのような制限酵素部位の増幅産物への導入は増幅産物
のクローニングを容易にする。

【００６２】本発明はまた新しいＨＣＶ単離株を提供す
る。殆どの単離株はＨＣＶの二株のうちの一つに関連す
る。第一は欧州公示第３１８，２１６号、第３８８，２
３２号および第３９８，７４８号に記述されるＵＳ原型
株である。第二は上述のＫａｔｏらにより記述された日
本の株である。二つの株は推定上の非構造遺伝子の領域
では３０％まで異なっているが、５’未翻訳領域では９
８％以上のホモロジーを、キャプシドまたはコア遺伝子
の５’部分では９２％のホモロジーを示す。

【００６３】ここでＣ９と呼ばれる本発明の単離株は両
株とは距離的により離れた関係にある。この新しい単離
株は共通の５’未翻訳領域に９３％類似している。コア
遺伝子領域の５’部分では原型または日本の株のいずれ
かと約８５％しかホモロジーをもたない（以下の表３を
参照せよ）。

【００６４】Ｃ９（配列番号２９）単離株および関連同
型のＲ４５（配列番号３１）、Ｒ４３（配列番号３
３）、Ｒ１１０（配列番号３２）およびＲ１１６（配列
番号３０）（図１参照）は上述のようにＳｔｒａｔａｇ
ｅｎｅのｐＢＳ（＋）のＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵
素部位にクローニングされた。変異株ウイルスは米国特
許第４，８００，１５９号に記述されたように精製され
たウイルスＤＮＡの標的およびＰＣＲクローニング法を
用いてクローニングされた。得られたプラスミドは大腸
菌ＤＧ１０１株（ＡＴＣＣ寄託番号４７０４３）に形質
転換された。

【００６５】原型Ｃ９単離株および四種の関連単離株の
５’未翻訳配列およびキャプシド遺伝子の５’端のヌク
レオチド配列はＣ９（配列番号２９）、Ｒ１１６（配列
番号３０）、Ｒ４５（配列番号３１）、Ｒ１１０（配列
番号３２）およびＲ４３（配列番号３３）で明らかにさ
れ、以下に示される。示された配列はウイルス配列をク
ローニングし易くするために使用されるプライマーＫＹ
９６（配列番号４）およびＫＹ９９（配列番号２６）を
含まない。

【００６６】

【化５】

【００６７】

【化６】

【００６８】

【化７】

【００６９】

【化８】

【００７０】

【化９】

【００７１】ウイルスの配列を含むクローンは以下のよ
うにＭａｒｙｌａｎｄ州ＢａｌｔｉｍｏｒｅのＡｍｅｒ
ｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎに寄託された。

【００７２】単離株配列番号プラスミド名ＡＴＣＣ寄託番号寄託年月日Ｃ９２９ｐＨＣＶ−Ｃ９７５２６５１９９２年７月２日Ｒ１１０３２ｐＨＣＶ−Ｒ１１０７５２６６１９９２年７月２日

【００７３】プラスミドｐＨＣＶ−Ｃ９は新規変異株Ｃ
９の配列を含む。Ｃ９配列の四種の関連変異株を並べた
ものが図１に示されている。既知の単離株の配列データ
の源は以下のようであった：ＨＣＶ−Ｊ１、ＨＣＶ−Ｊ
４（Ｏｋａｍｏｔｏらの１９９０年、ＪａｐａｎＪ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第６巻（第３号）：１６７から１７
７ページ）；ＨＣＶ−Ｊ（Ｋａｔｏらの１９９０年、Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、第７巻：４９５から５０１
ページ）；ＨＣＶ−ＢＫ（Ｔａｋａｍｉｚａｗａらの１
９９１年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、第６５巻：１１０５から
１１１３ページ）；およびＨＣＶ−１ＵＳ−ＰＴ（Ｈａ
ｎらの１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．，Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８７巻：９５２４から９５２８ペー
ジ）。

【００７４】

【表３】

【００７５】それ故、本発明はＣ９単離株に特異的で、
他の肝炎の単離株と区別するアッセイの物質および方法
を提供するものである。いくつかの具体例では、本発明
の方法は標的配列を増幅するためにＰＣＲを使用したま
たは使用しない場合の核酸のハイブリダイゼーションに
基づくものである。他の具体例では、本方法はＣ９単離
株に特異的な免疫グロブリンを使用する。

【００７６】Ｃ９に特異的なプライマーおよびプローブ
のオリゴヌクレオチド配列は以下の表４に示されてい
る。

【００７７】

【表４】

【００７８】ヌクレオチドを同定するために使用される
番号付けのシステムは上述のＫａｔｏらの１９９０年、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．のものであ
る。

【００７９】オリゴヌクレオチドＫＹ１５０（配列番号
４３）はＣ９単離株および既知のＨＣＶ原型単離株の両
者の検出に有効である。このオリゴヌクレオチドは次の
配列：

【化１０】５’−ＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴ−３’ をもつ。

【００８０】表４に示される上流／下流いずれのプライ
マーの対もＣ９単離株および関連同型を特異的に増幅す
るのに適していることは技術者には明らかであろう。さ
らに、表４に提供されるヌクレオチドの位置を指標とし
て用いて、増幅された核酸部分をハイブリダイズするの
に適しているＣ９特異的プローブを選択することは明ら
かである。

【００８１】好ましい具体例では、本発明のプライマー
は標的核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅とと
もに使用される。ＨＣＶはＲＮＡウイルスであるので、
増幅の第一段階は増幅される領域のＤＮＡコピー（ｃＤ
ＮＡ）の合成である。逆転写は別個の段階として、また
は以下に記述されるようにＲＮＡを増幅するためにポリ
メラーゼ連鎖反応を改良した均一逆転写−ポリメラーゼ
連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で行われる。

【００８２】ＰＣＲ過程は技術的に良く知られているが
（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２
０２号および第４，９６５，１８８号を参照せよ）、あ
る一般的なＰＣＲ情報はＰＣＲ過程に不慣れな者が本発
明を明確にさらに充分に理解することを目的として以下
のように提供される。

【００８３】ＰＣＲにより試料中の標的核酸配列を増幅
するために、配列は増幅システムの成分に影響され易く
なければならない。一般に、この影響され易さは試料か
らの核酸の分離により保証される。生物学的試料からの
リボ核酸の抽出のための各種の技術が技術的に知られて
いる。例えば、「ＰＣＲ技術」（Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｓｔ
ｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ）中のＲ
ｏｔｂａｒｔら（１９８９年）により、およびＨａｎら
の１９８７年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２６巻：
１６１７から１６２５ページに記述されたものを参照せ
よ。代わって、試料がかなり容易に壊れるならば、ＰＣ
Ｒ技術により増幅される前に核酸は精製される必要はな
い、即ち、試料が細胞、時に末梢血リンパ球または単球
に含まれるならば、細胞内成分の溶解と分散は単に細胞
を低調緩衝液に懸濁することにより行われる。

【００８４】ＰＣＲのそれぞれのサイクルの第一段階は
核酸二重鎖の分離を含む。もちろん、標的核酸が一本鎖
である、即ち一本鎖ＲＮＡであるならば、第一サイクル
に最初の分離段階は必要ない。鎖が分離されると、ＰＣ
Ｒの次の段階には標的配列に隣接したプライマーと分離
した鎖をハイブリダイズすることが含まれる。プライマ
ーはその後標的配列に相補的なコピーを形成するために
伸長される。成功したＰＣＲ増幅では、プライマーはそ
れぞれのプライマーが二重鎖配列にハイブリダイズする
位置が、一つのプライマーから合成される伸長産物が鋳
型から分離される（相補的である）場合にもう一方のプ
ライマーの伸長の鋳型として働くようにデザインされ
る。変性、ハイブリダイゼーションおよび伸長のサイク
ルが増幅された核酸が望みの量得られるまで必要な回数
繰り返される。

【００８５】ＰＣＲ過程の好ましい具体例では、鎖の分
離は二重鎖の変性は引き起こすが、ポリメラーゼの非可
逆的な変性は引き起こさないような充分な時間、充分に
高温で反応液を熱することにより行われる（米国特許第
４，９６５，１８８号を参照せよ）。典型的な熱変性は
約８０℃から１０５℃の範囲の温度で、秒から分の範囲
の時間で行われる。しかし、鎖の分離は物理的、化学的
または酵素的手段を含む適当な変性方法により行われ
る。鎖の分離は例えばヘリカーゼまたはヘリカーゼ活性
を示す酵素により誘導される。例えば、酵素ＲｅｃＡは
ＡＴＰ存在下でヘリカーゼ活性をもつ。ヘリカーゼによ
る鎖の分離に適した反応条件は技術的に知られている
（ＫｕｈｎＨｏｆｆｍａｎ−Ｂｅｒｌｉｎｇの１９７
８年の、ＣＳＨ−ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＢｉｏｌ
ｏｇｙ、第４３巻：６３から６７ページおよびＲａｄｄ
ｉｎｇの１９８２年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ、第１６巻：４０５から４３６ページを参照せよ）。

【００８６】ＰＣＲにおけるプライマーの鋳型依存性の
伸長は、適当な塩、金属陽イオンおよびｐＨ緩衝システ
ムからなる反応液中で、適当な量の四種のデオキシリボ
ヌクレオシド三リン酸（典型的にはｄＡＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）の存在下で、重合剤によ
り触媒される。適当な重合剤は鋳型依存性のＤＮＡ合成
を触媒することが知られている酵素である。Ｃ型肝炎は
ＲＮＡウイルスであるので、プライマー伸長の最初の鋳
型はＲＮＡである。ＲＮＡ鋳型から相補的なコピ−ＤＮ
Ａ（ｃＤＮＡ）を合成するのに適している重合剤は、ト
リ骨髄芽腫ウイルスＲＴ、Ｍｏｌｏｍｅｙネズミ白血病
ウイルスＲＴ、またはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから市
販される逆転写酵素活性をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼであるＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
（Ｔｔｈ）のＤＮＡポリメラーゼのような逆転写酵素
（ＲＴ）である。典型的には、ゲノムＲＮＡ／ｃＤＮＡ
の二重鎖鋳型は、増幅の鋳型として得られるＤＮＡ鎖を
残すために、最初の逆転写段階後の第一の変性段階の間
に熱変性される。ＤＮＡ鋳型とともに使用される適当な
ポリメラーゼは例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩま
たそのＫｌｅｎｏｗ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ
ｔｈポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉ
ｃｕｓから分離され、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃ
ｈｅにより開発製造され、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒか
ら市販される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑ
ポリメラーゼを含む。後者の酵素は核酸の増幅およびシ
ークエンシングに広く使用される。Ｔａｑポリメラーゼ
を使用する反応条件は技術的に知られており、上述の
「ＰＣＲ技術」（１９８９年）の中で、Ｇｅｌｆａｎｄ
により記述される。

【００８７】ＲＮＡが増幅される場合、最初の逆転写
（ＲＴ）段階はＲＮＡのＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）を作
製するために行われる。１９９１年７月１１日に公開さ
れたＰＣＴ特許公示ＷＯ９１／０９９４４は、ＰＣＲ増
幅においても機能する熱安定性ポリメラーゼによる高温
逆転写について記述している。高温ＲＴはより高いプラ
イマーの特異性および改良された効率を提供する。「均
一ＲＴ−ＰＣＲ」では、同一プライマーおよびポリメラ
ーゼが逆転写およびＰＣＲ増幅の両者に当てられ、反応
条件は両反応が反応の交換なしに起きるように最適化さ
れる。逆転写酵素として機能できる熱安定性ポリメラー
ゼである。Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
のＤＮＡポリメラーゼは鋳型に関係なく全てのプライマ
ー伸長段階で使用される。両過程は試薬を変えるまたは
加えるために、チューブを開けることなしに行われる；
温度プロフィールだけが最初のサイクル（ＲＮＡ鋳型）
と残りの増幅サイクル（ＤＮＡ鋳型）の間で調整され
る。

【００８８】ＨＣＶゲノムの５’末端はＭｏｌｏｎｅｙ
ネズミ白血病ウイルスＲＴのような逆転写酵素を用いた
逆転写をプライマーハイブリダイゼーションを干渉する
ことにより阻害できる重要な二次構造をもつことが予想
される。不幸にして、二次構造を変性するために反応温
度を上げることはまた殆どの逆転写酵素を不活性化す
る。組換えＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
（ｒＴｔｈ）のＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性を
使用することにより、ｃＤＮＡ合成が酵素の不活化なし
に上昇した温度で起きる。本発明のプライマーはそのま
まこの上昇した逆転写温度でＲＮＡ鋳型にハイブリダイ
ズする。

【００８９】ＰＣＲ法はそれぞれの段階後、新しい試薬
が添加される段階様式で、または全ての試薬が同時に添
加される様式で、あるいは新鮮なまたは異なる試薬が与
えられた数の段階後に添加される部分的な段階様式で行
われる。例えば、鎖の分離が熱により誘導され、ポリメ
ラーゼが熱感受性であるならば、その場合はポリメラー
ゼは鎖も分離の各循環後に添加されねばならない。しか
し、例えば、ヘリカーゼが変性に使用されるか、または
熱安定性ポリメラーゼが伸長に使用されるならば、全て
の試薬は最初に添加され、あるいは代わって、試薬の分
子比が反応に影響するならば、試薬は合成反応によりそ
れらが消費されるにつれ、定期的に補充される。

【００９０】ＰＣＲ過程は熱安定性酵素を用いて自動過
程で通常行われることを技術者は知るだろう。この過程
で、反応液の温度は変性領域、プライマーアニーリング
領域および伸長反応領域を循環する。代わって、アニー
リングおよび伸長の温度は同一である。例に記述される
ＲＴ−ＰＣＲはそのような二段階の温度循環を使用す
る。熱安定性酵素の使用に特異的に適している機械は商
業的に購入できる。

【００９１】技術者は以前の反応の増幅された核酸およ
び非特異的な増幅によるＰＣＲの汚染の問題に気づくで
あろう。これらの問題を減少する方法は以前の反応の増
幅されたＤＮＡの酵素学的分解を行わせ、非特異的増幅
を減少する。ＰＣＲ増幅はｄＴＴＰに代わってｄＵＴＰ
の存在下で行われる。得られた二重鎖のウラシルを含む
産物はウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）による
分解を受けやすく、一方、通常のチミンを含むＤＮＡは
ＵＮＧにより分解されない。増幅前に増幅反応液にＵＮ
Ｇを添加することは標的として働く全てのウラシルを含
むＤＮＡを分解するようになる。ウラシルを含むＤＮＡ
の唯一の材料が以前の反応の増幅された産物であるの
で、この方法は以前の反応の汚染（繰越）の問題を取り
除くことにより、反応液を弱化する。ＵＮＧそれ自身は
熱により一時的に不活化されるので、増幅手順のうちの
変性段階はまたＵＮＧを不活化するように働く。ウラシ
ルを取り込んだ新しい増幅産物は、それ故効果的にＵＮ
Ｇなしの環境で形成され、分解されない。

【００９２】本発明の好ましい具体例は弱化段階を取り
入れた均一ＲＴ／ＰＣＲ法を用いる。この一つのチュー
ブでの試薬を添加しない反応は繰越の汚染を阻害し、Ｒ
ＮＡ標的を含む試料から増幅され、検出されるＰＣＲ産
物を提供することにより、ＲＴ−ＰＣＲ反応を弱化する
ように働く。この方法は例６に例示される。

【００９３】好ましい具体例はＲＴ−ＰＣＲ増幅を取り
入れているが、試料中の標的配列の増幅は、標的配列が
ＳＳＯプローブへの核酸ハイブリダイゼーションにより
検出されるように充分な増幅をそれぞれが提供するよう
な、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅および自己
配列複製のような既知の方法により行われる。代わっ
て、Ｑβ−レプリカーゼ増幅のような検出できるレベル
にプローブを増幅する方法が使用される。「プローブ」
という用語は上述の方法で使用される配列特異的なオリ
ゴヌクレオチドを意味し、例えばＬＣＲで使用される二
つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドは、たとえＬＣ
Ｒのいくつかの具体例が対立の存在を示すために、プロ
ーブの連結だけを必要とする場合でも本発明の目的の
「プローブ」である。

【００９４】配列特異的プローブハイブリダイゼーショ
ンは本発明の成功する実施の上で重要な段階である。本
発明の配列特異的オリゴヌクレオチドプローブは特異的
にＨＣＶゲノムの特定の断片にハイブリダイズし、他の
生物の配列との不安定なミスマッチをもつ。充分な緊縮
ハイブリダイゼーション条件下で、プローブは特異的に
正確に相補的な配列にのみハイブリダイズする。ハイブ
リダイゼーション条件の緊縮度は配列のミスマッチの変
化する量を許容するように緩和される。増幅産物の検出
は、正しく増幅された標的だけの検出を保証し、それに
より関連生物の相同配列の存在により引き起こされる誤
りの陽性の機会を減少するようにこの配列特異的ハイブ
リダイゼーションを使用する。

【００９５】ＳＳＯプローブおよび核酸配列の間で形成
される雑種を検出する方法は、プローブはハイブリダイ
ズする領域に加えてさらに特質を含むことを必要とす
る。例えば、下に記述される「リバース」ドットブロッ
ト法にしたがって、プローブが最初に固定化されるなら
ば、プローブはまたＰＣＴ特許公示８９／１１５４８に
より詳細に記述される技術の照射によりナイロン支持体
に固定されるポリｄＴの長いストレッチを含む。ドット
ブロット法で、固定化された標的は下に記述するように
検出方法で使用される化合物を含むプローブでハイブリ
ダイズされる。

【００９６】本発明のプローブは上述のオリゴヌクレオ
チドを合成する技術を用いて、合成され、標識される。
プローブはプローブを３２Ｐ−ＡＴＰおよびキナーゼと
インキュベートすることにより、３２Ｐで５’端を標識
される。ＳＳＯプローブの適当な非放射活性標識は西洋
ワサビのパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。この標識
を含むプローブを調製し、検出する方法は以下の例およ
び米国特許第４，９１４，２１０号および第４，９６
２，０２９号に記述される。そのような標識プローブの
使用に関する付加的な情報については、米国特許第４，
７８９，６３０号；Ｓａｉｋｉらの１９８８年、Ｎ．Ｅ
ｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３１９巻：５３７から５４１ペ
ージおよびＢｕｇａｗａｎらの１９８８年、Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第６巻：９４３から９４７ページ
を参照せよ。有効な色素原は赤色ロイコ染料および３，
３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を
含む。

【００９７】本発明のプローブはＳＳＯプローブが試料
中に存在するウイルスの配列に結合するかを決定するこ
とによりウイルスの配列が試料に存在するかを決定する
ために使用される。ＳＳＯプローブおよび試料中の核酸
配列の間に形成される雑種を検出するための本発明の目
的の適当な方法は技術的に知られている。例えば、検出
は例に記述されるようにドットブロット法を用いて行わ
れる。ドットブロット法では、未標識の増幅された試料
は膜、適当なハイブリダイゼーション条件下で、標識プ
ローブとインキュベートされた膜、洗浄により除去され
たハイブリダイズしないプローブ、および結合プローブ
の存在をモニターされるフィルターのような固体支持体
に結合される。複数の試料が単一のプローブで解析され
るとき、ドットブロット法は全く有効である。多くの試
料は単一の膜に別の位置に固定化され、同時にプローブ
溶液に膜を浸すことによりハイブリダイズされる。

【００９８】非常に多くの異なるプローブが用いられる
場合に全く有効な別の方法は、増幅された配列が標識を
含み、プローブが固体支持体に結合される「リバース」
ドットブロット法である。この様式は、本発明の試験が
同時に行われる試験の装置の一つとして使用されるなら
ば有効である。この様式では、未標識ＳＳＯプローブは
膜に結合され、適当な緊縮ハイブリダイゼーション条件
下で、標識試料にさらされる。ハイブリダイズしない標
識試料はその後適当な緊縮条件下で洗浄することにより
除去され、フィルターはその後結合配列の存在をモニタ
ーされる。

【００９９】正逆両ドットブロット法はマイクロタイタ
ープレートで簡便に行われる。プローブは例えば、マイ
クロタイタープレートに接着し、それによりプローブを
固定化するウシ血清アルブミンに付与される。

【０１００】別の適当なアッセイシステムでは、標識プ
ローブはＰＣＲ増幅過程の間に添加される。それぞれの
合成段階の間に標的ＤＮＡにハイブリダイズするいずれ
のＳＳＯプローブもポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメ
ラーゼの５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性により
分解される。プローブの分解産物はその後検出される。
それ故、分解産物の存在はＳＳＯプローブおよび標的Ｄ
ＮＡの間のハイブリダイゼーションが起きたことを示
す。

【０１０１】上に提供されるヌクレオチド配列は本発明
の重要な面である。配列の一方の鎖だけが示されている
が、配列のもう一方の鎖は上記の情報から推論されるこ
とを技術者は認識する。この情報から発明の他のプロー
ブおよびプライマーが構築される。

【０１０２】本発明はまたキット、本方法を実施するた
めの有効な成分を含むマルチコンテナユニットに関する
ものである。有効なキットはＣ型肝炎ウイルスの核酸を
検出するためのＳＯプローブを含むことができる。ある
場合では、ＳＳＯプローブは適当な支持膜に固定され
る。そのようなプライマーが発明の好ましい具体例に有
効である場合、キットはまたＲＴ−ＰＣＲのためのプラ
イマーを含むことができる。キットの他の付随的な成分
は例えば、逆転写酵素またはポリメラーゼ、基質ヌクレ
オシド三リン酸、標識に使用される手段（例えば、標識
がビオチンであるなら、アビジン−酵素コンジュゲート
および酵素基質および色素原）および逆転写、ＰＣＲま
たはハイブリダイゼーション反応のための適当な緩衝液
を含む。上記成分に加え、キットはまた本方法を実施す
るための指導書を含むことができる。

【０１０３】ＰＣＲおよび核酸プローブの使用に加え、
本発明はまた特定のＨＣＶ単離株に特異的な免疫グロブ
リンを産生する方法を提供する。これは典型的には最初
にウイルスヌクレオチド配列を発現し、望みの単離株に
特異的な抗体を産生するための発現タンパク質を用いる
ことにより行われる。

【０１０４】肝炎単離株のヌクレオチド配列は各種の組
換え発現システムで使用される。この様式で、キャプシ
ド遺伝子のような望みの遺伝子が発現される。原核生物
または真核生物の宿主でのヌクレオチド配列の組換え発
現は技術的に良く知られている（上述のＳａｍｂｒｏｏ
ｋらを参照せよ）。発現されたタンパク質は単離株に特
異的な免疫グロブリンを産生するために使用される。免
疫グロブリンはその後以下に記述するようにウイルスの
存在を検出するアッセイに使用される。タンパク質はま
たウイルスにさらされた患者の中の抗体の存在を検出す
るために使用される。

【０１０５】望みのウイルスの配列は標準的な技術を用
いて、発現のための哺乳動物、酵母または昆虫細胞系列
に形質転換される前に適当なベクターに簡便に挿入され
る。原核生物は中間クローニング段階に好ましく用いら
れる。

【０１０６】ウイルスの配列の発現のために宿主細胞に
改変した遺伝物質を導入する際に用いられる特定の方法
は特に重大ではない。外来ヌクレオチド配列を宿主細胞
へ導入するための良く知られた方法のいずれかが使用さ
れる。これらにはリン酸カルシウムによるトランスフェ
クション、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔
法、リポソーム、微量注入、プラスミドベクター、ウイ
ルスベクターおよびクローニングされたゲノムＤＮＡ、
ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝物質を宿主細
胞へ導入するための他の良く知られた方法のいずれかの
使用が含まれる（上記のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照せ
よ）。用いられる特定の遺伝子工学の方法が、望みのウ
イルスタンパク質を発現することができる少なくとも一
つの遺伝子を宿主細胞にうまく導入できることだけが必
要である。

【０１０７】細胞に遺伝情報を移送するために用いられ
る特定のベクターはまた特に重大ではない。真核細胞で
組換えタンパク質を発現するために使用される通常のベ
クターのいずれかが使用される。

【０１０８】発現ベクターは真核生物の転写単位または
真核細胞でウイルスの核酸配列を発現させるために必要
な全ての要素を含む発現カセットを含む。典型的な発現
カセットはウイルスタンパク質および転写の効率的なポ
リアデニレーションに必要なシグナルを暗号化したＤＮ
Ａ配列に操作できるように連結したプロモーターを含
む。

【０１０９】ベクターは通常ナトリウム、カリウムＡＴ
Ｐａｓｅ、チミジンキナーゼ、アミノグリコシドホスホ
トランスフェラーゼ、ヒグロマイシンＢホスホトランス
フェラーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ、ＣＡＤ（リン酸カルバミル合成酵素、
アスパラギン酸トランスカルバミラーゼおよびジヒドロ
オロターゼ）、アデノシンデアミナーゼ、ＤＨＦＲおよ
びアスパラギン合成酵素およびウアバイン選択のような
選択マーカーを含む。

【０１１０】本発明の発現ベクターは典型的には哺乳動
物細胞のような真核細胞でのみ発現される一つまたはそ
れ以上の真核生物の転写単位とともに細菌へのベクター
のクローニングを促進する原核生物の配列を含む。ベク
ターは真核生物のレプリコンを含んだり、含まなかった
りする。真核生物のレプリコンが存在するなら、ベクタ
ーは適当な選択マーカーを用いて真核細胞で増幅可能で
ある。ベクターが真核生物のレプリコンを含まないな
ら、エピソーム増幅は可能ではない。その代わりに、プ
ロモーターが望みの遺伝子の発現を支配する場合、トラ
ンスフェクトされたＤＮＡはトランスフェクト細胞のゲ
ノムに組み込まれる。発現ベクターは典型的には異な
る、良く特性が明かなウイルスまたは哺乳動物の遺伝子
に由来する要素から構築される。培養哺乳動物細胞での
クローニングされた遺伝子の発現についての一般的な考
察に関しては、上記のＳａｍｂｒｏｏｋらの第１６章を
参照せよ。

【０１１１】発現ベクターが細胞の導入された後、トラ
ンスフェクトされた細胞はウイルスのタンパク質を発現
するのに好ましい条件下で培養され、タンパク質は標準
的な技術を用いて培養から回収される。例えば、硫安沈
殿、ゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィ、サイ
ズ排除クロマトグラフィまたは親和性クロマトグラフィ
のようなタンパク質を精製するための多くの標準的な方
法が使用される。一般的には、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓの「タ
ンパク質の精製」（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、
Ｎ．Ｙ．（１９８２年））を参照せよ。

【０１１２】望みのウイルスゲノムにより暗号化される
タンパク質の使用に加え、ウイルスに特異的なエピトー
プに真似たペプチドもまたウイルスに特異的な抗体を産
生するために使用される。そのような技術は技術者には
良く知られており、例えば、Ｇｅｙｓｅｎらの「Ｍｕｌ
ｔｉｐｉｎＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ａ
Ｒｅｖｉｅｗ」（ＣｏｓｅｌｃｏＭｉｍｏｔｙｐｅ
ｓ，ＰＴＹＬｔｄ．）に記述される。

【０１１３】上で考察されるポリペプチドは標準的な技
術を用いて抗体を産生するために使用される。免疫グロ
ブリンは各種の応用に利用される。例えば、免疫グロブ
リンは生物学的試料中のウイルスの存在を調べるため
に、また例えば親和性クロマトグラフィを用いてウイル
ス抗原を精製するために使用される。それらはまたウイ
ルス全体の感染性の阻害を含むそれに相当するタンパク
質を中和するために使用される。技術者が得られる各種
の免疫グロブリン分子の生産および操作に関する多くの
技術はそれ故特定の単離株の診断および検出に有効な分
子を生産するために容易に応用される。

【０１１４】ここで使用されるように、「免疫グロブリ
ン」という用語は本質的に免疫グロブリン遺伝子により
暗号化される一つまたはそれ以上のポリペプチドからな
るタンパク質を意味する。認識される免疫グロブリン遺
伝子は、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子同様、カ
ッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン
およびミューの定常領域遺伝子を含む。免疫グロブリン
は、単鎖だけでなく、例えばＦｖ、ＦａｂおよびＦ（ａ
ｂ）２を含む抗体とは別に各種の形態で存在する（例え
ば、Ｈｕｓｔｏｎらの１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８５巻：５８７９か
ら５８８３ページ；Ｂｉｒｄらの１９８８年、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、第２４２巻：４２３から４２６ページ；および
ＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒとＨｏｏｄの１９８６年、Ｎａ
ｔｕｒｅ、第３２３巻：１５から１６ページ）。免疫グ
ロブリンの構造および機能の一般的な概観については
「基礎免疫学」第二版（Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅ
ｎｓＰｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年））を参照せ
よ。

【０１１５】望みの単離株に特異的なエピトープに結合
する抗体は各種の方法により生産される。ヒトではな
い、例えばネズミ、ウサギ、ウマ等の単クローン抗体の
生産は良く知られており、例えば、ウイルスまたはその
断片を含む試料を用いて動物を免疫することにより行わ
れる。免疫動物から得られた抗体産生細胞は標準的な技
術を用いて不死化され、スクリーニングされる。単クロ
ーン抗体の産生についての一般的手順の考察は、Ｈａｒ
ｌｏｗとＬａｎｅによる「抗体、研究室マニュアル」
（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｕｂｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８８年））を参照せ
よ。

【０１１６】ある環境では、非ヒト抗体の抗原結合領
域、例えばＦ（ａｂ’）２またはハイパー可変領域をヒ
ト定常領域（Ｆｃ）または枠組み領域に、本質的にヒト
分子を生産するための組換えＤＮＡ技術により移すこと
が望まれる。そのような方法は一般に技術的に知られて
おり、例えば、米国特許第４，８１６，３９７号、ＥＰ
公示第１７３，４９４号および第２３９，４００号に記
述される。代わって、Ｈｕｓｅらにより１９８６年にＳ
ｃｉｅｎｃｅ、第２４６巻：１２７５から１２８１ペー
ジに概略された一般的プロトコールにしたがって、ヒト
Ｂ細胞のＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、望み
の特異生をもつ抗体（または結合断片）を暗号化する配
列をクローニングし、増幅することにより、ウイルスに
特異的に結合するヒト単クローン抗体またはその部分を
暗号化するＤＮＡ配列を単離する。

【０１１７】上述のように産生される免疫グロブリンは
その後肝炎の単離株の存在に対する各種の診断方法に使
用される。例えば、Ｃ９ウイルスに特異的な標識された
免疫グロブリンは、ウイルスを含むと予想される試料と
免疫グロブリンを接触させ、複合体が形成されるかを検
出することを含む方法で使用される。標識は技術的に良
く知られる方法にしたがって、直接的にまたは間接的に
免疫グロブリンに共役される。標識オリゴヌクレオチド
の状況で記述されるように、広い範囲の各種の標識が使
用される。いくつかの方法のいずれか一つにより成分は
標識される。検出の通常の方法は３Ｈ、１２５Ｉ、３５
Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ標識化合物などを用いたオート
ラジオグラフィの使用である。放射活性同位元素の選択
は合成の容易さ、変化する安定性および選択した同位元
素の半減期による研究の優先に依存する。非放射活性標
識は標識抗体、フルオロフォア、化学発光剤および酵素
に結合するリガンドを含む。標識の選択は必要とされる
感度、化合物との結合の容易さ、安定性の必要度および
得られる手段に依存する。

【０１１８】非放射性標識はしばしば間接的な方法によ
り付与される。一般的に、リガンド分子（例えば、ビオ
チン）は分子に共有結合される。リガンドはその後、検
出可能な酵素、蛍光化合物または化学発光化合物のよう
なシグナルシステムを本来検出できる、またはそれらに
共有結合する抗リガンド（例えば、ストレプトアビジ
ン）分子に結合する。リガンドおよび抗リガンドは広く
変化する。リガンドが天然の抗リガンド、例えば、ビオ
チン、スロキシンおよびコルチゾルをもつ場合、リガン
ドは標識された天然に生じる抗リガンドとともに使用さ
れる。代わって、ハプテンまたは抗原化合物が抗体と組
合わされて使用される。

【０１１９】分子はまたシグナル生成化合物に直接的
に、例えば酵素またはフルオロフォアと連結することに
より結合される。標識として興味ある酵素は主として加
水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼおよび
グリコシダーゼ、またはオキシドレダクターゼ、特にパ
ーオキシダーゼである。蛍光化合物はフルオレセインお
よびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシ
ル、ウンベリフェロン等を含む。化学発光化合物はルシ
フェリンおよび２，３−ジヒドロフタールアジンジオ
ン、例えばルミノールを含む。使用される各種のシグナ
ル生成システムの概観については、米国特許第４，３９
１，９０４号を参照せよ。

【０１２０】複合体の存在を検出するために、反応液は
典型的に二次抗体、プロテインＡまたはプロテインＧの
ような免疫グロブリンのＦｃ領域に結合できるタンパク
質と接触される。タンパク質は好ましくは固体表面上で
固定化され、固体表面は望みのウイルスに特異的な未結
合の免疫グロブリンを除去するために洗浄される。生体
分子を固体表面に固定化する多くの方法が技術的に知ら
れている。例えば、固体表面は膜（例えば、ニトロセル
ロース）、マイクロタイターディッシュ（例えば、ＰＶ
Ｃまたはポリスチレン）またはビーズである。望みの成
分は非特異的結合を介して、共有結合または非共有的に
接触される。標識はその後使用される特定の標識に適し
た標準的な技術を用いて検出される。

【０１２１】上述の組換えにより発現されたタンパク質
またはウイルスのライゼートはまた診断手順に使用され
る。これらの手順は典型的に抗体を含むと予想される生
物学的試料（例えば、血清）にウイルスを接触させ、免
疫学的反応を検出することを含む。反応は好ましくは上
述のような標識したタンパク質を用いて検出される。そ
のような手順についての適当な方法は米国特許第５，０
５５，３９１号に詳細に記述される。

【０１２２】以下に示される本発明の例は例証の目的を
提供するもので、発明の範囲を限定するものではない。
例に従う請求項の範囲内の発明の多数の具体例は前述の
主文および後述の例を読むことにより通常の技術者に明
かにされるだろう。

【０１２３】

【実施例】

【０１２４】例１均一ＲＴ−ＰＣＲでは、同一のポリメラーゼが逆転写酵
素およびＤＮＡポリメラーゼとして機能する。これによ
りＨＣＶのゲノムＲＮＡの最初の逆転写およびそれに続
くｃＤＮＡの増幅は試薬を変える段階の間にチューブを
開けることなしに同一チューブで行われる。

【０１２５】核酸はＭｉｃｒｏＰｒｏｂｅ社のＩｓｏＱ
ｕｉｃｋ^ＴＭ核酸抽出キットを用いて血清または血漿か
ら分離された。全ての増幅は全反応容量２０μｌで、Ｐ
ｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社のＴＣ９６００サーモサイク
ラー^ＴＭおよびＭｉｃｒｏＡｍｐ^ＴＭチューブを用いて
行われた。それぞれの２０μｌの反応試薬は以下の表５
にあげられている。

【０１２６】

【表５】

【０１２７】ＴＣ９６００は次の反応温度プロフィール
を与えるようにプログラムされた。７０℃で１分間の予
熱の後、プログラムは反応チューブを挿入するのに充分
の長さで中断され、プログラムは再開され、逆転写させ
るために反応は７０℃で１５分間保持された。反応温度
はその後ＲＮＡ−ｃＤＮＡ複合体を変性するために１分
間９５℃に上げられた。次に反応温度は９５℃１５秒間
および６０℃２０秒間を二回、続いて９０℃１５秒間お
よび６０℃２０秒間を３８回循環した。最終的に反応温
度は最後の伸長段階のために６０℃で４分間保持され、
１５℃に冷却され、増幅された試料の解析が行えるまで
室温に放置された。

【０１２８】例２ドットブロット様式の検出法を用いるために、増幅され
たＤＮＡの一部分が変性されナイロンフィルターにのせ
られた後、標識プローブにハイブリダイズされる。プロ
ーブがハイブリダイズする領域はＫＹ８８（配列番号１
２）で、プローブは３２Ｐで放射活性標識される。代わ
って、プローブは色素原または化学蛍光基質存在下での
非同位元素検出の手段を提供するために西洋ワサビのパ
ーオキシダーゼ（ＨＲＰ）に共有結合される。

【０１２９】増幅反応は一般に例１に記述されたように
行われる。ＰＣＲで増幅された産物はその後アルカリ処
理により変性される。ＰＣＲ産物５μｌに対して、５μ
ｌの０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、８μｌの５Ｎ
水酸化ナトリウムおよび８２μｌの水が添加される。変
性を完全にするために混合液は室温で１０分間放置され
る。

【０１３０】ＢｉｏＤｙｎｅ^ＴＭＢナイロンフィルター
（ＰａｌｌＣｏｒｐ．、ＧｌｅｎＣｏｖｅ、ＮＹ、Ｕ
ＳＡ）は５から１０分間水に浸すことにより準備され、
さらにｄｏｔｂｌｏｔｍａｎｉｆｏｌｄ（ＢｉｏＲ
ａｄ社のＢｉｏ−Ｄｏｔ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、Ｕ
ＳＡ）が設定された後２００μｌの水で洗浄された。変
性後、１００μｌの試料溶液はドットブロット器を用い
て真空下でナイロン膜にのせられる。それぞれのウェル
はその後２００μｌの０．４Ｎ水酸化ナトリウムで洗浄
され、フィルター全体が簡単に２ｘＳＳＣで洗浄され、
液体が残らなくなるまで風乾される。ＤＮＡは固定化さ
れ、ナイロンフィルターにＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ、Ｕ
ＳＡ）ＵＶ光ボックス（「自動クロスリンク」設定）を
用いて、１２００ｍＪ／ｃｍ^２の紫外線照射によりクロ
スリンクされる。

【０１３１】フィルターは熱シールできる袋の中で少な
くとも３０分間、５０℃で（空気振盪機）、ハイブリダ
イゼーション緩衝液（５ｘＳＳＰＥ、５ｘＤｅｎｈａｒ
ｄｔ溶液、０．１％ＳＤＳ、５０μｇ／ｍｌマス精子Ｄ
ＮＡ）に浸すことにより「プレハイブリダイズ」され
る。緩衝液はその後１−２ｘ１０^５ｃｐｍ／ｍｌのプロ
ーブを含む等量の同一溶液に置き換えられ、フィルター
は２時間から一晩の間５０℃でハイブリダイズされる。

【０１３２】ハイブリダイゼーション後、フィルターは
２ｘＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳで三回；室温で２０分
間二回、および高緊縮度の温度の６０℃で２０分間を一
回洗浄される。フィルターはその後乾燥され、プラスチ
ックラップに包まれ、一枚または二枚の増感スクリーン
とともに−７０℃でＸ線フィルムに露光される。

【０１３３】視覚化の代替法は、それぞれ参考としてこ
の中に入れられているが、ＬｅｖｅｎｓｏｎとＣｈａｎ
ｇによる、１９８９年のＰＣＲプロトコール：方法と応
用へのガイド（Ｉｎｎｉｓら（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ）の９２から１１２
ページ、およびＳａｉｋｉらの１９８８年の、Ｎ．Ｅｎ
ｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３１９巻：５３７から５４１ペー
ジで記述されたように調製された西洋ワサビのパーオキ
シダーゼを結合したオリゴヌクレオチドプローブを用い
てハイブリダイズすることである。ハイブリダイゼーシ
ョンは５ｍｌのハイブリダイゼーション溶液あたり２ｐ
ｍｏｌのＨＲＰ−ＳＳＯプローブを用いて行われる。

【０１３４】洗浄後、色素原染色基質で現像されたフィ
ルターは１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）
で洗浄され、０．１ｍｇ／ｍｌの３，３’，５，５’−
テトラメチルベンジジン（Ｆｌｕｋａ）および０．００
１５％過酸化水素を含む１００ｍＭクエン酸ナトリウム
（ｐＨ５．０）に置き換えられ、緩やかに攪拌しながら
１０から３０分間室温でインキュベートされる。現像さ
れたフィルターは水で洗浄され、直ちに写真撮影され
る。ＴＭＢ検出システムは本質的にＰｅｒｋｉｎＥｌｍ
ｅｒから市販されるＡｍｐｌｉＴｙｐｅＤＱａＤＮ
Ａタイピングキットに記述されているように調製され、
使用される。別の具体例では、化学蛍光検出システム
（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨ
ｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いてフィルターは現
像される。フィルターは５分間ＰＢＳで洗浄され、緩や
かに攪拌しながら１分間ＥＣＬ溶液に入れられる。フィ
ルターはその後室温で１から５分間Ｘ線フィルムに露光
される。

【０１３５】例３本発明のこの具体例では、リバースドットブロット法が
使用される。プローブのハイブリダイゼーション領域は
ＫＹ８８（配列番号１２）、ＫＹ１５０（配列番号４
３）またはＭＹ１６０（配列番号３７）であり、プロー
ブは膜に固定される。増幅された標的ＤＮＡは、それぞ
れ参考文献としてこの中に入れられているが、申請中の
第１９７，０００号および第３４７，４９５号；Ｓａｉ
ｋｉらの１９８９年の、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．、第８６巻：６２３０から６２３４ペー
ジ；およびＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから市販されるＡ
ｍｐｌｉＴｙｐｅＤＱａｌｐｈａＤＮＡタイピング
キットの製品案内に記述されているように膜結合プロー
ブにハイブリダイズされる。膜結合プローブにハイブリ
ダイズする増幅されたＤＮＡが容易に検出されるよう
に、増幅プライマーはＬｅｖｅｎｓｏｎとＣｈａｎｇが
１９８９年に上に記述したようにビオチン化される。

【０１３６】具体的には、ストレプトアビジンを結合し
た西洋ワサビのパーオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）を膜
結合プローブにハイブリダイズするビオチン化された増
幅ＤＮＡと反応させることにより、検出は行われる。そ
れ故ＨＲＰはＳＡ−ビオチン相互作用を介して、増幅さ
れたＤＮＡに結合するようになり、テトラメチルベンジ
ジンの酸化による有色化合物の生成のような各種の良く
知られた手段により、信号を生成するために使用される
（米国特許第４，７８９，６３０号を参照せよ）。

【０１３７】プローブはいずれかの手段で膜に固定され
るが、好ましい方法はさらに長いポリｄＴ配列をプロー
ブのハイブリダイズする領域に付加することを含む。得
られたポリｄＴ「テール」はプローブを共有結合で膜に
固定するために、ナイロン膜のアミン基と反応される。
この反応はＵＶ照射により促進される。

【０１３８】市販のＤＮＡ合成機でテールを付加したプ
ローブを合成することもできるが、プローブにポリｄＴ
テールを生成するために末端デオキシリボヌクレオチド
転移酵素（ＴｄＴ、ＲａｔｌｉｆｆＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ；以下の反応に対して濃度約１２０単位／μｌ
（１００ｐｍｏｌｅ／μｌ））が使用される。しかし、
テールを付加したプローブの作製のためにＤＮＡ合成機
を使用した場合、望ましくない未成熟な鎖停止がテール
領域に最初に起きるように、プローブの５’端にテール
を置くべきである。

【０１３９】ＴｄＴ反応は１ｘＴｄＴ塩、２００ｐｍｏ
ｌｅのオリゴヌクレオチド、８００μＭＤＴＴおよび
６０単位のＴｄＴを含む容量約１００μｌで行われるべ
きである。１０ｘＴｄＴ塩は１０００Ｍｍカコジル酸カ
リウム、１０ｍＭ塩化コバルト、２ｍＭジチオスレイト
ール、２５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）
で、参考文献としてこの中に入れられているが、Ｒｏｙ
ｃｈｏｕｄｈｕｒｙとＷｕの、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
１．、第６５巻：４３から６２ページに記述されるよう
に調製される。８ｍＭｄＴＴＰの１０ｘ保存溶液が便
宜上（水酸化ナトリウムでｐＨ７に中和されて）調製さ
れる。

【０１４０】ＴｄＴ反応は３７℃で２時間行われ、その
後１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８）を１００μｌ添加する
ことにより停止される。テールを付加されたオリゴヌク
レオチドの終濃度は１μＭ（１ｐｍｏｌｅ／μｌ）で、
ホモポリマーのテールの長さは約４００残基である。テ
ールの長さはｄＴＴＰのオリゴヌクレオチドに対する分
子比を調整することにより変化させることができる。テ
ールを付加したプローブは使用まで−２０℃で保存され
る。

【０１４１】リバースドットブロット法に好ましいナイ
ロン膜はＰａｌｌ製で、ＢｉｏＴｒａｎｓナイロン膜と
してＩＣＮから市販されるポアサイズ０．４５ミクロン
のＢｉｏｄｙｎｅＢナイロン膜である。プローブはＢ
ｉｏＲａｄ製のＢｉｏ−Ｄｏｔドットブロット器を用い
て非常に簡便に膜上にスポットされる。それぞれのプロ
ープは膜の独立の別個の位置にスポットされる。約２か
ら１０ｐｍｏｌｅのそれぞれのテールを付加されたプロ
ーブはドットブロット器にのせる前に５０から１００μ
ｌのＴＥ緩衝液に予め混合される。ドットブロット後、
膜は過剰の液体をぬぐうために吸収紙の上に簡単に置か
れる。膜はその後Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ製のＳｔｒａｔａ
ｌｉｎｋｅｒ光ボックスのようなＵＶ光ボックスの中に
置かれ、テールを付加したプローブをナイロン膜に固定
するために、２５４ｎｍで５０から６０ｍＪ／ｃｍ^２の
ＵＶ光に露光される。未結合のプローブを除去するため
にハイブリダイゼーション溶液で約１５分間簡単に洗浄
した後、膜はビオチン化されたＰＣＲ産物とのハイブリ
ダイゼーションに供せられる。

【０１４２】増幅されたＰＣＲ産物は３から１０分間９
５℃で熱処理することにより変性され、４０μｌの変性
されたＰＣＲ産物はハイブリダイゼーションのためにそ
れぞれのプローブパネルに添加される。ハイブリダイゼ
ーションは０．５ｘＳＳＰＥ、０．２５％ＳＤＳおよ
び５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液（２０ｘＳＳＰＥが０．０
２ＭＥＤＴＡ、０．２Ｍリン酸−ナトリウム、３．６
Ｍ塩化ナトリウムを含み、０．１１Ｍ水酸化ナトリウム
でｐＨ７．４に調整される）からなるハイブリダイゼー
ション緩衝液中で、振とう水浴を用いて、２０分間５７
℃で行われる。ハイブリダイゼーション緩衝液は３．１
ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液に２５μｌのＳＡ
−ＨＲＰを含む溶液３ｍｌに置き換えられ、振とう水浴
で５７℃２０分間インキュベートされる。

【０１４３】洗浄は２ｘＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤ
Ｓの洗浄緩衝液中で行われる。１０ｍｌの洗浄緩衝液で
の膜の簡単な洗浄の後、１０ｍｌの緩衝液での１２分間
のきつい洗浄が５７℃で行われる。さらに５分間の室温
での洗浄が行われ、続いて、１０ｍｌの０．１Ｍクエン
酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で５分間の洗浄が行われ
る。

【０１４４】色素原の結合は５ｍｌの０．１Ｍクエン酸
ナトリウム、５μｌの３％過酸化水素および０．２５ｍ
ｌの色素原（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒのＴＭＢ）から
なる色素原溶液５ｍｌ中で室温、２５から３０分間行わ
れる。蒸留水による１０分間の洗浄が三回室温で行われ
る。室温３０分間の１ｘＰＢＳによる後洗浄により信号
の質を高めることができる。色素原を含むこれらの段階
の間、膜はアルミ箔で覆うことにより遮光される。現像
された膜は永久に記録するために写真撮影される。

【０１４５】例４本発明のこの具体例では、マイクロタイタープレート法
が使用される。プローブはマイクロタイタープレートの
ウェルに固定される。増幅された標的ＤＮＡは上述のよ
うに結合プローブにハイブリダイズされる。前例のよう
に、増幅プライマーは結合プローブにハイブリダイズす
る増幅されたＤＮＡの検出をさせるためにビオチン化さ
れる。

【０１４６】ＢＳＡに結合した望みのプローブが最初に
個々のウェルのプラスチック表面に吸着される。ウェル
はその後ウシ血清アルブミンのようなタンパク質でブロ
ックされる。好ましくはＣｏｒｎｉｎｇ製の９６ウェル
のプレートが使用される。

【０１４７】増幅が完了すると、ＰＣＲチューブはサー
モサイクラー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製）から取り
出される。１００μｌの変性溶液がそれぞれのＰＣＲチ
ューブに添加される。それぞれのチューブに新しいピペ
ットチップが使用される。一つの具体例では、検出は直
ちには行われない。その場合、ＰＣＲチューブは２℃か
ら８℃で一晩保存された。変性された増幅反応は２℃か
ら８℃の保存で粘性をもつようになる。ピペットを容易
にするために、チューブを開ける前に、チューブは簡単
に２５℃から３０℃で温められる。

【０１４８】適当数の８ウェルマイクロタイタープレー
トストリップ（最少で２ストリップ）が取り出され、マ
イクロタイタープレート枠にセットされた。１００μｌ
のハイブリダイゼーション緩衝液がマイクロタイタープ
レートのそれぞれのウェルに添加された。

【０１４９】変性溶液は０．４Ｍ水酸化ナトリウム、８
０ｍＭＥＤＴＡおよび０．００５％チモールブルーを
含む。ハイブリダイゼーション／中和緩衝液は２．５Ｍ
チオシアン化ナトリウム、８０ｍＭリン酸二ナトリウ
ム、１０ｍＭリン酸一ナトリウムおよび０．１２５％
Ｔｗｅｅｎ２０を含む。使用前にｐＨが５．０＋／−
０．２であることがチェックされる。

【０１５０】複数チャンネルピペットについたチップを
用いて、それぞれのＰＣＲチューブの変性された増幅反
応液２５μｌがマイクロタイタープレートの相当する位
置のウェルに入れられた。プレートは蓋で覆われ、緩や
かに１０から１５秒側面をたたかれた。適正な試薬が入
れられたウェルは黄色に着色する。無色または青色への
単一な変化だけが注目されるなら、過剰のアンプリコン
が添加される。正のＯＤ値は増加するが負のＯＤ値は影
響されないように、試験は継続される。プレートは３７
℃で６０分間インキュベートされた。

【０１５１】インキュベーションに続き、プレートは洗
浄溶液で五回洗浄された。プレートの洗浄は手動で、ま
たはそれに応じてプログラムされた自動マイクロタイタ
ープレート洗浄機を用いて行われる。洗浄には１ｘＰＣ
Ｒ洗浄緩衝液が使用された。１０ｘ濃度のＰＣＲ洗浄緩
衝液は次のように調製された：９．９４ｇ／ｌのリン酸
二ナトリウム；４．４１ｇ／ｌのリン酸一ナトリウム；
３．７２２ｇ／ｌのＥＤＴＡ；８７．６６ｇ／ｌの塩化
ナトリウム；１３．７ｇ／ｌのＴＷｅｅｎ２０および１
０ｇ／ｌのＰｒｏＣｌｉｎ３００（Ｒｏｈｍａｎ
ｄＨａａｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）。溶
液はリン酸でｐＨ調整される（ｐＨ６．５から７．１が
好ましい）。

【０１５２】手動洗浄では、プレートの内容物は空にさ
れ、乾燥された。３００μｌの洗浄溶液が試験されたプ
レートのそれぞれのウェルに添加され、プレートは１５
から３０秒乾かされた。プレートは再び空にされ、乾燥
された。この洗浄過程はさらに四回繰り返された。

【０１５３】自動マイクロプレート洗浄機では、次の方
法が使用された。ウェルの内容物は吸引された。試験さ
れたプレートのそれぞれのウェルに３５０μｌの洗浄溶
液が添加されるように洗浄機はプログラムされ、３０秒
間浸された後、吸引された。これらの段階はさらに四回
繰り返された。プレートはその後乾燥された。

【０１５４】１００μｌのコンジュゲートが試験される
プレートのそれぞれのウェルに添加された。アビジン−
ＨＲＰコンジュゲートは次のように調製される。希釈液
は０．１モル；０．２５％Ｅｍｕｌｓｉｔ２５（ＤＫ
ＳＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｔｏｋｙ
ｏ、Ｊａｐａｎ）；１．０％ＫａｔｈｏｎＣＧ（Ｒｏ
ｈｍａｎｄＨａａｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、
ＰＡ）；０．１％フェノール；１．０％ウシγ−グロブ
リンを含む。溶液は濃塩酸でｐＨを７．３に調整され
た。この希釈液に対して、１０ｎＭのコンジュゲートア
ビジンが添加された（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ、Ｂｕｒ
ｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）。プレートは蓋をされ、３７℃
で５０分間インキュベートされた後、上述のように再び
洗浄された。作業基質は８ウェルのマイクロタイタープ
レートストリップ二枚（１６検体）それぞれに対し２．
０ｍ１の基質Ａおよび０．５ｍｌの基質Ｂを混合するこ
とにより調製された。基質Ａは３ｍＭ過酸化水素；６．
５ｍＭクエン酸および０．１％ＫａｔｈｏｎＣＧを
含む。基質Ｂは４．２ｍＭ３，３’，５，５’−テトラ
メチルベンジジンおよび４０％ジメチルホルムアミドを
含む。作業基質は使用前３時間以内に調製され、直射日
光を避けて保存された。

【０１５５】１００μｌの作業基質（基質ＡおよびＢの
混合液）が試験されるプレートのそれぞれのウェルに添
加された。プレートは蓋をされ、暗所で１０分間、室温
（２０℃から２５℃）でインキュベートされた。１００
μｌの停止試薬（５％硫酸）が試験されたそれぞれのウ
ェルに添加された。それぞれのウェルの４５０ｎｍでの
吸光度が停止試薬添加後１時間以内に読まれた。試料お
よび対照の吸光度の値が記録された。

【０１５６】例５本発明のオリゴヌクレオチドはＨＣＶゲノムの配列の増
幅および増幅産物の検出に使用される多くの組合わせの
プライマーおよびプローブを提供する。非常に多くのオ
リゴヌクレオチドがＲＴ−ＰＣＲ増幅でのプライマーと
しての効果について試験された。

【０１５７】ＰＣＲ増幅反応は例１に記述された方法を
用いて、各種のオリゴヌクレオチドの対で行われた。増
幅産物はアガロースゲル電気泳動分離および染色の標準
的な方法により検出された（上述のＳａｍｂｒｏｏｋら
を参照）。上流プライマーＫＹ６５（配列番号１）およ
びＫＹ９８（配列番号３）のそれぞれはＨＣＶ配列の増
幅において、下流プライマーＫＹ６８（配列番号２
７）、ＫＹ９５（配列番号２０）およびＫＹ９９（配列
番号２６）のそれぞれと効果的に機能した。ＫＹ６７
（配列番号１０）はＫＹ６８（配列番号２７）およびＫ
Ｙ９９（配列番号２６）の両者と効果的に機能した。上
流プライマーＫＹ８０（配列番号５）、ＫＹ８３（配列
番号７）、ＫＹ８４（配列番号８）、ＫＹ８５（配列番
号９）およびＫＹ１４４（配列番号６）のそれぞれは下
流プライマーＫＹ７８（配列番号１８）、ＫＹ９５（配
列番号２０）、ＫＹ１４５（配列番号１９）、ＫＹ１４
８（配列番号１７）およびＫＹ１４９（配列番号１６）
のそれぞれと効果的に機能した。最後に、上流プライマ
ーＫＹ８０（配列番号５）およびＫＹ８１（配列番号１
１）のそれぞれはＫＹ１００（配列番号２１）と効果的
に機能した。

【０１５８】プライマーとしてＫＹ７８（配列番号１
８）およびＫＹ８０（配列番号５）を用いたＰＣＲ増幅
の増幅産物は上記の例２に記述される方法を用いて、Ｋ
Ｙ８８（配列番号１２）、ＫＹ８４（配列番号８）およ
びＫＹ８５（配列番号９）のそれぞれで探索することに
より検出された。

【０１５９】プライマーＫＹ１５３（配列番号１５）、
ＫＹ１４９（配列番号１６）およびＫＹ１４８（配列番
号１７）はＫＹ８５の下流の上流プライマーのいずれと
も使用できない。ＫＹ７８（配列番号１８）の３’端は
ＫＹ８８（配列番号１２）の３’端に隣接しており、こ
れら二つのプライマーはプライマーの対として機能でき
るが、介在配列が欠如しているために独立した探索は不
可能である。プライマーＫＹ８６（配列番号１３）はＫ
Ｙ１００（配列番号２１）、ＫＹ９９（配列番号２
６）、ＫＹ１０９（配列番号２４）およびＫＹ１１１
（配列番号２５）とだけ対となることができる。プライ
マーＫＹ８７（配列番号１４）はＫＹ９９（配列番号２
６）、ＫＹ１０９（配列番号２４）およびＫＹ１１１
（配列番号２５）とだけ対となることができる。

【０１６０】上で討論されたＫＹ８４（配列番号８）、
ＫＹ８５（配列番号９）、ＫＹ８７（配列番号１４）お
よびＫＹ１４８（配列番号１７）はＣ９単離株とは別の
既知のＨＣＶ単離株の検出に有効である。表４に表され
るプローブおよびプライマーはＨＣＶ−Ｃ９および関連
変異株を増幅、検出し、ＪａｐａｎおよびＵＳのＨＣＶ
原型を排除するために特異的である。

【０１６１】特異的にＪａｐａｎおよびＵＳのＨＣＶ原
型を増幅し、ＨＣＶ−Ｃ９は増幅しないプライマーはＫ
Ｙ８４（配列番号８）、ＫＹ８５（配列番号９）、ＫＹ
１４８（配列番号１７）およびＫＹ８７（配列番号１
４）により例示される。Ｊａｐａｎ、ＵＳおよびＣ９の
ＨＣＶ原型を増幅するためのプライマーはＫＹ６７（配
列番号１０）、ＫＹ７８（配列番号１８）、ＫＹ８０
（配列番号５）、ＫＹ８１（配列番号１１）、ＫＹ８３
（配列番号７）、ＫＹ８６（配列番号１３）、ＫＹ８８
（配列番号１２）、ＫＹ９５（配列番号２０）、ＫＹ１
００（配列番号２１）、ＫＹ１４４（配列番号６）、Ｋ
Ｙ１４５（配列番号１９）およびＫＹ１５３（配列番号
１５）を含む。プライマーＫＹ６５（配列番号１）、Ｋ
Ｙ６８（配列番号２７）、ＫＹ９８（配列番号３）、Ｋ
Ｙ９９（配列番号２６）、ＫＹ１０９（配列番号２
４）、ＫＹ１１１（配列番号２５）およびＫＹ１４９
（配列番号１６）はＪａｐａｎおよびＵＳのＨＣＶ原型
および関連変異単離株を増幅するために適しており、同
様にＨＣＶ−Ｃ９および関連同型を検出する場合にも適
している。

【０１６２】Ｊａｐａｎ、ＵＳおよびＣ９のＨＣＶ原型
および関連変異株を検出するためのプローブはＫＹ６７
（配列番号１０）、ＫＹ７８（配列番号１８）、ＫＹ８
１（配列番号１１）、ＫＹ８６（配列番号１３）、ＫＹ
９５（配列番号２０）、ＫＹ１５０（配列番号４３）お
よびＫＹ１４５（配列番号１９）により例示される。Ｊ
ａｐａｎ、ＵＳのＨＣＶ原型および関連変異株を検出
し、ＨＣＶ−Ｃ９原型を検出しないプローブはＫＹ８３
（配列番号７）、ＫＹ８７（配列番号１４）、ＫＹ８４
（配列番号８）、ＫＹ８８（配列番号１２）、ＫＹ８５
（配列番号９）、ＫＹ１００（配列番号２１）、ＫＹ１
４８（配列番号１７）およびＫＹ１４９（配列番号１
６）を含む。プローブＫＹ６５（配列番号１）、ＫＹ６
８（配列番号２７）、ＫＹ８２（配列番号２８）、ＫＹ
９９（配列番号２６）、ＫＹ１０９（配列番号２４）、
ＫＹ１１１（配列番号２５）、ＫＹ８０（配列番号
５）、ＫＹ１４４（配列番号６）およびＫＹ１５３（配
列番号１５）はＪａｐａｎおよびＵＳのＨＣＶ原型およ
び関連変異単離株を検出するのに適しており、同様にＨ
ＣＶ−Ｃ９および関連変異株を検出する場合にも適して
いる。

【０１６３】例６ＵＮＧ存在下でのＨＣＶＲＮＡの均一ＲＴ／ＰＣＲ増
幅は好ましい方法である。例１に記述される均一ＲＴ−
ＰＣＲ増幅法は弱化段階を含むように改められた。以下
に記述されるプロトコールはＲＴおよびＰＣＲがｄＵＴ
Ｐを取り込むことを示す。弱化はＲＴ段階の前に５０℃
で起きる。上昇したＲＴ−ＰＣＲ反応温度で、ＵＮＧは
不活性で、ｄＵを含む産物は分解されない。２単位のＵ
ＮＧ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）は１００００コピー
のＨＣＶＲＮＡからつくられた１００μｌの増幅産物
の０．２５μｌに相当する持ち越し分をうまく弱化し
た。例えば、１００μｌ反応あたり６単位までのより高
い量のＵＮＧもまた敵している。反応系の成分は次の順
で添加された：

【０１６４】 μｌ／反応５０％グリセロール１６．００１０ｘＲＴ反応緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、９００ｍＭ塩化カリウム）１０．００ｄＧＴＰ（１０ｍＭ）；終濃度２００μＭ２．００ｄＡＴＰ（１０ｍＭ）；終濃度２００μＭ２．００ｄＵＴＰ（１０ｍＭ）；終濃度２００μＭ２．００ｄＣＴＰ（１０ｍＭ）；終濃度２００μＭ２．００ＫＹ８０（配列番号５）；１５μＭ（最終反応あたり１５ｐｍｏｌｅ）；ビオチン化（＋）鎖プライマー１．００ＫＹ７８（配列番号１８）；１５μＭ（最終反応あたり１５ｐｍｏｌｅ）；ビオチン化（−）鎖ＲＴプライマー１．００ＵＮＧ：１単位／μｌ２．００ｒＴｈＤＮＡポリメラーゼ：２．５単位／μｌ（１ｘ酵素保存緩衝液＊）４．００ＭｎＣｌ_２（１０ｍＭ）；終濃度０．９ｍＭ９．００チューブあたりのマスター混合液５０．００ＲＮＡ（キャリア＊＊とともに水に溶解）５０．００全反応容量１００．００

【０１６５】＊１ｘ酵素保存緩衝液＝（２０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ〔ｐＨ７．５〕、１００ｍＭ塩化カリウ
ム、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、０．５％
ＴＷｅｅｎ２０〔ＰｉｅｒｃｅＳｕｒｆａｔａｍｐ
ｓ〕、５０％グリセロール〔ｖ／ｖ〕）。

【０１６６】＊＊Ｐｈａｒｍａｃｉａ製の１ｍｇのポリ
ｒＡホモポリマーＲＮＡ（Ｎｏ２７−ポリｒＡは平均Ｓ
２０，ｗ＝８．８（６から１３の範囲）をもつ）または
アニーリング温度でいくつかの非特異的な産物を反応あ
たり２００ｎｇ以下の添加レベルで使用した。仔ウシ胸
腺ＤＮＡ、ＰＢＬＤＮＡ、ヒト胎盤ＤＮＡおよび細胞
系列Ｋ５６２のＤＮＡが試験され、同様であった。

【０１６７】手順：１．カバーを予め熱するためにＴＣ９６００サーモサイ
クラーをオンにする。２．室温で反応液を準備する。３．サーモサイクラーにチューブを入れ、サーモサイク
ラーを再始動するために「運転」を押す。４．ファイル８で機械を始動する。５．提案されたサーモサイクラーの条件：ファイル１：５０℃で２分間保持（ＵＮＧ弱化段階）ファイル２：７０℃で１５分間保持（逆転写段階）ファイル３：９５℃で１分間保持ファイル４：二段階温度、９５℃１５秒および６０℃１
０から３０秒を二回ファイル５：二段階温度、９０℃１５秒および６０℃１
０から３０秒を３８回ファイル６：７２℃で１時間保持ファイル７：１５℃に保持、無制限ファイル８：ファイル１、２、３、４、５、６および７
を連結

【０１６８】段階５のファイル２で、１５分の反応時間
は反応効率を下げることなしに、５分まで減少できる。
段階５のファイル５で、高Ｇ＋Ｃの鋳型の場合、変性温
度を９５℃まで上げることが好ましい。マイクロタイタ
ープレート法による反応産物の解析から一般に正の試料
で０．８以上の、および負の試料で０．５より小さい吸
収値という結果が得られた。

【図面の簡単な説明】

【図１】新規変異株ＨＣＶの配列Ｃ９、四種の関連変異
株および原型ＪａｐａｎおよびＵＳＨＣＶ単離株を並
列したものを示す。

【図２】新規変異株ＨＣＶの配列Ｃ９、四種の関連変異
株および原型ＪａｐａｎおよびＵＳＨＣＶ単離株を並
列したものを示す

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/51

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｃ型肝炎ウイルス核酸の存在を検出する
ためのオリゴヌクレオチドプローブを含む構成物で、前
記プローブはＪａｐａｎ、ＵＳおよびＣ９の原型株から
なるグループから選択されるＨＣＶ株または変異株の核
酸を検出するのに適している構成物。
【請求項２】前記プローブがＪａｐａｎ、ＵＳおよび
Ｃ９のＨＣＶ株を検出するのに適している請求項１に記
載の構成物。
【請求項３】前記プローブが、ＫＹ６７（配列番号１
０）、ＫＹ７８（配列番号１８）、ＫＹ８１（配列番号
１１）、ＫＹ８６（配列番号１３）、ＫＹ９５（配列番
号２０）、ＫＹ１５０（配列番号４３）およびＫＹ１４
５（配列番号１９）とその相補的な配列からなる核酸成
分のグループから選択される配列内に含まれる少なくと
も１４ヌクレオチドとハイブリダイズする核酸部分配列
を含む請求項２に記載の構成物。
【請求項４】前記プローブがＪａｐａｎおよびＵＳの
ＨＣＶ原型ウイルスの核酸を検出するのに適している請
求項１に記載の構成物で、前記プローブはＫＹ８３（配
列番号７）、ＫＹ８７（配列番号１４）、ＫＹ８４（配
列番号８）、ＫＹ８８（配列番号１２）、ＫＹ８５（配
列番号９）、ＫＹ１００（配列番号２１）、ＫＹ１４８
（配列番号１７）、ＫＹ１４９（配列番号１６）、ＫＹ
６５（配列番号１）、ＫＹ６８（配列番号２７）、ＫＹ
８２（配列番号２８）、ＫＹ９９（配列番号２６）、Ｋ
Ｙ１０９（配列番号２４）、ＫＹ１１１（配列番号２
５）、ＫＹ８０（配列番号５）、ＫＹ１４４（配列番号
６）およびＫＹ１５３（配列番号１５）とその相補的な
配列からなるグループから選択される配列内に含まれる
少なくとも１４ヌクレオチドにハイブリダイズする核酸
部分配列を含む構成物。
【請求項５】前記プローブがＪａｐａｎおよびＵＳの
ＨＣＶ原型ウイルスの核酸を検出するのに適しており、
さらに前記プローブがＨＣＶ−Ｃ９原型ウイルスの核酸
を検出しない請求項１に記載の構成物。
【請求項６】請求項５に記載の構成物で、前記プロー
ブはＫＹ８３（配列番号７）、ＫＹ８７（配列番号１
４）、ＫＹ８４（配列番号８）、ＫＹ８８（配列番号１
２）、ＫＹ８５（配列番号９）、ＫＹ１００（配列番号
２１）、ＫＹ１４８（配列番号１７）およびＫＹ１４９
（配列番号１６）とその相補的な配列からなるグループ
から選択される配列内に含まれる少なくとも１４ヌクレ
オチドとハイブリダイズする核酸部分配列を含む構成
物。
【請求項７】前記プローブがＨＣＶ−Ｃ９原型ウイル
スの核酸を検出するのに適しており、さらに前記プロー
ブがＪａｐａｎおよびＵＳのＨＣＶ原型ウイルスの核酸
を検出しない請求項１に記載の構成物。
【請求項８】前記プローブが配列番号３４、配列番号
３５、配列番号３６および配列番号３７とその相補的な
配列からなるグループから選択される配列内に含まれる
少なくとも１４ヌクレオチドにハイブリダイズする核酸
部分配列を含む請求項７に記載の構成物。
【請求項９】ＨＣＶの核酸を増幅するためのオリゴヌ
クレオチドプライマーを含む構成物で、前記プライマー
はＪａｐａｎ、ＵＳおよびＣ９株からなるグループから
選択されるＨＣＶ株または同型の核酸部分配列を増幅す
るのに適している構成物。
【請求項１０】前記プライマーがＪａｐａｎ、ＵＳお
よびＣ９のＨＣＶ株を増幅するのに適している請求項９
に記載の構成物。
【請求項１１】請求項１０に記載の構成物で、前記プ
ライマーがＫＹ６７（配列番号１０）、ＫＹ７８（配列
番号１８）、ＫＹ８０（配列番号５）、ＫＹ８１（配列
番号１１）、ＫＹ８３（配列番号７）、ＫＹ８６（配列
番号１３）、ＫＹ８８（配列番号１２）、ＫＹ９５（配
列番号２０）、ＫＹ１００（配列番号２１）、ＫＹ１４
４（配列番号６）、ＫＹ１５３（配列番号１５）および
ＫＹ１４５（配列番号１９）からなるグループから選択
される核酸部分配列を含む構成物。
【請求項１２】請求項９に記載の構成物で、前記プラ
イマーがＪａｐａｎおよびＵＳのＨＣＶ原型ウイルスの
核酸を増幅するのに適しており、さらにＫＹ６５（配列
番号１）、ＫＹ６８（配列番号２７）、ＫＹ９８（配列
番号３）、ＫＹ９９（配列番号２６）、ＫＹ１０９（配
列番号２４）、ＫＹ１１１（配列番号２５）およびＫＹ
１４９（配列番号１６）からなるグループから選択され
る核酸部分配列を含む構成物。
【請求項１３】前記プライマーがＪａｐａｎおよびＵ
ＳのＨＣＶ原型ウイルスの核酸を増幅するのに適してお
り、さらにＨＣＶ−Ｃ９原型ウイルスの核酸は増幅しな
い請求項９に記載の構成物。
【請求項１４】前記プライマーがＫＹ８７（配列番号
１４）、ＫＹ８４（配列番号８）、ＫＹ１４８（配列番
号１７）およびＫＹ８５（配列番号９）からなるグルー
プから選択される核酸部分配列を含む請求項１３に記載
の構成物。
【請求項１５】前記プライマーがＨＣＶ−Ｃ９原型ウ
イルスの核酸を増幅するのに適しており、さらにＪａｐ
ａｎおよびＵＳのＨＣＶ原型ウイルスの核酸を増幅しな
い請求項９に記載の構成物。
【請求項１６】前記プライマーが配列番号３８、配列
番号３９、配列番号４０、配列番号４１および配列番号
４２からなるグループから選択される核酸部分配列を含
む請求項１５に記載の構成物。
【請求項１７】Ｃ型肝炎のゲノム核酸の存在を検出す
る方法であって、前記Ｃ型肝炎のゲノム核酸はＪａｐａ
ｎ、ＵＳおよびＣ９原型株からなるグループから選択さ
れる核酸であって、（ａ）核酸部分配列を増幅すること；（ｂ）プローブが核酸部分配列に結合し、安定な雑種
二重鎖を形成するような条件下で、増幅された核酸をそ
の部分配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと混
合すること；および（ｃ）その部分配列およびプローブの間に形成される
雑種を検出すること；からなる方法。
【請求項１８】肝炎ウイルスのＣ９単離株を検出する
方法であって、その方法は（ａ）ＨＣＶ−Ｃ９の核酸配列を含むことが予想され
る試料をＨＣＶ−Ｃ９の核酸配列に相補的な部分配列を
もつ核酸プローブと接触させること；および（ｂ）プローブの前記配列とのハイブリダイゼーショ
ンを検出すること；の段階からなる方法。
【請求項１９】請求項１８に記載の方法であって、さ
らに段階（ａ）の前に、前記ＨＣＶ−Ｃ９の核酸配列の
部分配列を増幅する段階を含む方法。
【請求項２０】請求項１７または請求項１８に記載の
方法であって、請求項１に記載のプローブが使用される
方法。
【請求項２１】請求項１７または請求項１９に記載の
方法であって、増幅が請求項９に記載の少なくとも一つ
のプライマーを使用して行われる方法。
【請求項２２】請求項１７または請求項１９に記載の
方法であって、増幅がポリメラーゼ連鎖反応により行わ
れる方法。
【請求項２３】Ｃ型肝炎ウイルスの核酸の存在を検出
するためのキットであって、Ｊａｐａｎ、ＵＳおよびＣ
９原型株からなるグループから選択されるＨＣＶ株また
は変異株の核酸を検出するのに適している請求項１に記
載の少なくとも一つの核酸プローブを含むキット。
【請求項２４】Ｃ型肝炎ウイルスのＣ９単離株に特異
的な核酸を検出するための請求項２３に記載のキットで
あって、ＨＣＶ−Ｃ９ウイルスの核酸部分配列に実質的
に結合する少なくとも一つの核酸プローブを含むキッ
ト。
【請求項２５】Ｃ型肝炎ウイルスのＣ９単離株に特異
的な核酸を検出するための請求項２３に記載のキットで
あって、請求項７に記載の少なくとも一つの核酸プロー
ブを含むキット。
【請求項２６】配列番号２９またはその変異種と実質
的に同一である核酸配列を含む単離されたＣ型肝炎ウイ
ルス。
【請求項２７】変異核酸配列がＲ１１６（配列番号３
０）、Ｒ４５（配列番号３１）、Ｒ１１０（配列番号３
２）またはＲ４３（配列番号３３）と実質的に同一であ
る請求項２６に記載の単離されたＣ型肝炎ウイルス。
【請求項２８】ＡＴＣＣ寄託番号第７５２６５号の単
離されたＣ型肝炎ウイルス。
【請求項２９】ＡＴＣＣ寄託番号第７５２６６号の単
離されたＣ型肝炎ウイルス。