JP2002221668A - 干渉顕微鏡及びその作動方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 物体領域において干渉を行う光の
位相状態を求めることを可能にし、それに基づいて干渉
顕微鏡の容易かつ低コストの調節（ないし制御）が可能
となる干渉顕微鏡及びその作動方法を提供すること。 【解決手段】 被検物（試料）に配される少な
くとも１つの被検物担持ユニットが設けられている干渉
顕微鏡、とりわけ４Ｐｉ-顕微鏡、ウェーブフィールド
（Wellenfeld）顕微鏡、Ｉ^２Ｍ-顕微鏡、Ｉ^３Ｍ-顕微鏡
又はＩ^５Ｍ-顕微鏡は、干渉顕微鏡の物体領域における
照明状態を求めるために、被検物担持ユニット（２２）
の少なくとも１つの面（２９）−好ましくは表面（２
９）−が光学顕微鏡的に検出可能に構成されていること
を特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、干渉顕微鏡（とり
わけ４Ｐｉ-顕微鏡、ウェーブフィールド（Wellenfel
d）-顕微鏡、Ｉ^２Ｍ-顕微鏡、Ｉ^３Ｍ-顕微鏡又はＩ^５Ｍ
-顕微鏡）及びその作動方法に関する。本発明は、更
に、被検物（ないし試料）に配される少なくとも１つの
被検物担持ユニットが設けられている干渉顕微鏡及びそ
の作動方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】この種の干渉顕微鏡は、実務上既知であ
る。例えば、EP 0 491 289 A1から、二重共焦点（doppe
lkonfokal）走査型顕微鏡ないし４Ｐｉ-顕微鏡が既知で
あるが、これらの顕微鏡では、被検物（ないし試料ない
し物体）は、互いに対向配置された２つの顕微鏡対物レ
ンズによって、点状（ないしスポット状）に照明され
る。被検物の両側からの照明及び／又は被検物から射出
される光の両側での検出によって、干渉パターンが形成
され、これによって、軸方向の分解能を高めることを図
ることができる。

【０００３】US 4,621,911からは、ウェーブフィールド
顕微鏡（Wellenfeldmikroskop）ないし定在波蛍光顕微
鏡（standing wave luminescence microscope）が既知
であるが、この顕微鏡では、コリメートされて進行する
２つの光線を重畳することによって、被検物の照明に利
用されるウェーブフィールド（定在波域）ないし干渉パ
ターン域が形成される。このウェーブフィールドは、顕
微鏡対物レンズの合焦面に平行に合わせられた、照明強
度が等しい複数の層状面（明るいアンチノーダルゾーン
と暗いノーダルゾーン）を有する。照明強度は、最大照
明強度値から最小照明強度値へと変化し、照明の交替的
変化が、顕微鏡対物レンズの光軸に沿って周期的に続い
て延在する。この干渉照明法によって、照明パターンに
応じて、蛍光（着色）物体（ないし被検物）から蛍光を
励起放射することができ、それによって同時に軸方向の
分解能を改善することができる。

【０００４】US 5,671,085からは、Ｉ^２Ｍ-顕微鏡、Ｉ
^３Ｍ-顕微鏡又はＩ^５Ｍ-顕微鏡が既知であるが、これら
の顕微鏡では、同様に、互いに対向配置する２つの顕微
鏡対物レンズを介し明視野投下照明によって被検物を励
起して蛍光を放射させる。この場合も、照明光及び／又
は検出光を干渉させることができ、それによって同様に
軸方向の分解能を改善することができる。

【０００５】干渉顕微鏡は、ごく一般的に、少なくとも
１つの光源の照明光路並びに少なくとも１つの検出器の
検出光路を有する。上述の干渉顕微鏡では、物体面の両
側にそれぞれ１つの対物レンズが配置されており、対物
レンズは互いに対向して配されている。照明光路／検出
光路には、照明光線を分割し該２つの対物レンズへ配す
るための少なくとも１つのビームスプリッタと、該対物
レンズを介して戻ってくる検出光を結合する光結合器が
設けられている。ビームスプリッタと光結合器は、同じ
部材で構成することができる。蛍光マーカによって特異
的に着色された被検物（とりわけ生物学的試料）は、通
常、上述の干渉顕微鏡によって検査（ないし観察）され
る。この場合、光源からの光は、蛍光マーカを励起する
ために利用され、この（励起放射された）蛍光のみが検
出器で検出される。

【０００６】この種の干渉顕微鏡は、その干渉のための
構造並びに対物レンズ合焦領域の小ささのため、震動、
揺動及び熱膨張（ないし熱変形）の影響を受けやすい。
とりわけ（２つの）干渉計分割光路間の光路長の相違の
調整は、干渉顕微鏡の効果的な作動に対し決定的な影響
を及ぼす。この場合、光路長の相違は、一方では、干渉
計分割光路を通過する２つの照明光が干渉することがで
きるほどに小さくなければならない、即ち、２つの干渉
計分割光路の光路長の相違は、照明光のコヒーレンス長
（可干渉距離、即ち、分割された２つの光波が干渉可能
な最大光路差）より小さくなければならない。他方、２
つの干渉計分割光路の光路長の相違は、干渉顕微鏡の物
体領域において構造上干渉が行われるように、互いに調
節されていなければならない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】干渉分割光路の調節
は、これまで実用化されてきた干渉顕微鏡では、実際
上、個々の物体領域を検出することによって行われる。
そのため、例えば、点状又は線状の被検物を通る軸方向
の光学的断面が撮像され、その強度信号推移に基づいて
干渉顕微鏡の調節（ないし制御）が行われる。軸方向の
強度信号推移から、物体領域において実際に存在する照
明状態（例えばポジティブ干渉（強め合う干渉）又は相
殺的干渉（弱め合う干渉）の存在）を帰納的に導き出す
ことができる。

【０００８】しかし、この調節には費用がかかり、干渉
顕微鏡の操作者が個別に行わなければならない。更に、
調節を効果的に行うためには操作者の熟練が不可欠であ
るので、結局、この種の干渉顕微鏡を利用できるのは、
一部の（熟練）操作者に限られ、そのためこれまでのと
ころ、問題の（例えば上述の如き）干渉顕微鏡の普及は
妨げられてきた。

【０００９】それゆえ、本発明の課題は、物体領域にお
いて干渉を行う光の位相状態を規定することを可能に
し、それに基づいて干渉顕微鏡を適性に調節（ないし制
御）できるようにした、この種の干渉顕微鏡及びそのよ
うな干渉顕微鏡の作動方法を提供しかつ更に発展させる
ことである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】この課題を解決するため
に、本発明の第一の視点において、被検物（ないし試
料）に配属される少なくとも１つの被検物担持ユニット
が設けられている、とりわけ４Ｐｉ-顕微鏡、ウェーブ
フィールド-顕微鏡、Ｉ^２Ｍ-顕微鏡、Ｉ^３Ｍ-顕微鏡又
はＩ^５Ｍ-顕微鏡等の干渉顕微鏡が提供される。この干
渉顕微鏡は、干渉顕微鏡の物体領域における照明状態を
規定するために、被検物担持ユニットの少なくとも１つ
の面−好ましくは表面−が光学顕微鏡的に検出可能に構
成されていることを特徴とする。更に、本発明の第二の
視点において、被検物（ないし試料）に配属される少な
くとも１つの被検物担持ユニットが設けられている、と
りわけ４Ｐｉ-顕微鏡、ウェーブフィールド-顕微鏡、Ｉ
^２Ｍ-顕微鏡、Ｉ^３Ｍ-顕微鏡又はＩ^５Ｍ-顕微鏡等の干
渉顕微鏡の作動方法が提供される。この方法は、干渉顕
微鏡の物体領域における照明状態が、被検物担持ユニッ
トの、光学顕微鏡的に検出可能に構成された少なくとも
１つの面−好ましくは表面−によって規定されること、
及び干渉顕微鏡の物体領域における照明状態の決定が、
該面で反射及び／又は励起放射された光によって行われ
るとともに、強度信号推移（ないし経過）が、該面の軸
方向位置に応じて検出されることを特徴とする。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下に本発明の好ましい実施の形
態を示すが、これらは従属請求項の対象でもある。干渉
顕微鏡は、更に、前記少なくとも１つの面において、光
を反射可能及び／又は励起放射可能であること、及び該
光を検出器によって検出可能であることが好ましい。干
渉顕微鏡は、更に、被検物担持ユニットの少なくとも１
つの表面が、ルミネセンス（とりわけ蛍光）を励起可能
な少なくとも１つの層を有することが好ましい。干渉顕
微鏡は、更に、被検物担持ユニットの面において、光を
非線形プロセスによって励起放射可能であることが好ま
しい。干渉顕微鏡は、更に、非線形プロセスが、ＣＡＲ
Ｓ（コヒーレント反ストークス・ラマン散乱：Coherent
-Anti-Stokes-Raman-Scattering）であることが好まし
い。干渉顕微鏡は、更に、前記少なくとも１つの面にお
いて反射及び／又は励起放射された光が、干渉顕微鏡の
検出器によって検出可能であることが好ましい。干渉顕
微鏡は、更に、干渉顕微鏡の物体領域における照明状態
の決定（ないし測定）が、少なくとも１つの付加的光源
の光（好ましくはレーザ光線）によって実行可能である
ことが好ましい。干渉顕微鏡の作動方法は、更に、軸方
向の強度信号推移を検出するために、被検物が、被検物
担持ユニットと共に１つ又は複数の対物レンズの光軸に
沿って移動させられること、及びその際、前記面から反
射及び／又は励起放射された光が検出されることが好ま
しい。干渉顕微鏡の作動方法は、更に、（軸方向の）強
度信号推移の検出開始時に、被検物担持ユニットの面が
干渉顕微鏡の対物レンズの合焦領域に配置しているよう
に、被検物が、被検物担持ユニットと共に位置決めされ
ることが好ましい。干渉顕微鏡の作動方法は、更に、軸
方向の強度信号推移の検出が、種々の波長の光に対し、
それぞれ行われることが好ましい。

【００１２】本発明によってまず確認されていること
は、参照物として、被検物担持ユニットの少なくとも１
つの適切に構成された面が利用されれば、位相状態を規
定するために個々の物体領域を検出することを不要とす
ることができるということである。これによって、とり
わけ蛍光（着色）被検物の場合に、検出されるべき蛍光
（着色）被検物が保護される（変性劣化ないし損傷が回
避される）。というのは、干渉を行う光の位相状態を求
めるために必要不可欠な測定を被検物担持ユニットの面
で行うことができるからである。そのため、位相決定目
的のみのための蛍光（着色）被検物の退色を避けること
ができる。というのは、干渉を行う光の位相状態を求め
るための測定を被検物担持ユニットの面の領域で行うこ
とができ、当該領域は、被検物から（光学的に）十分遠
くに離れて位置しており、そのため被検物は、全く励起
されないか或いはほとんど励起されず、蛍光を放射しな
いからである。所定の波長の光による被検物担持ユニッ
トの面での参照測定（基準測定）も考えられるであろ
う。このための当該所定波長（の光）は、蛍光マーカを
励起するためには適当ではないものとでき、また、被検
物は、一般に、吸収が非常に小さいので、被検物につい
てのコントラストの大きい測定信号を発生することもな
いであろう。

【００１３】従って、本発明では、被検物担持ユニット
の面は、光学顕微鏡的に検出可能に構成されている。こ
の場合、とりわけ、被検物担持ユニットの面は、当該面
において光を反射又は励起放射ないし発光（induzierba
r）可能であるように、構成ないし調整されている。

【００１４】光学顕微鏡的に検出可能に構成された被検
物担持ユニットの面は、被検物担持ユニットの表面の、
少なくとも部分的に反射可能な層ないし被膜（例えば、
片方の面が被膜されたカバーガラスの形態）によって構
成することができるであろう。或いは、被検物担持ユニ
ットは、２つのガラスプレートに挟まれた反射又はルミ
ネセンス（発光）層を有し、この層によって光学顕微鏡
的に検出可能に構成された面を提供することができるで
あろう。更に、互いに直接接触した状態にある、異なる
性質の材料からできた２つのガラスプレートも、光学顕
微鏡的に検出可能に構成された面を構成できるであろ
う。これは、例えば、当該２つのガラスプレートの屈折
率が異なれば、該プレート間での屈折率の変化によっ
て、当該（境界）面は、光学顕微鏡的に検出可能だから
である。更に、ホログラフィ層ないしホログラフィ素子
を有する結晶又はガラス小片を用いても、光学顕微鏡的
に検出可能に構成された面を形成できる。或いは、被検
物担持ユニットの表面を蛍光（着色）層で被膜し、この
表面において蛍光を励起放射（発光）可能に構成するこ
ともできるであろう。面は、通常、二次元の広がりを有
するものではあるが、ここでは、面を、１つの次元にお
ける空間的広がりは僅かなものではあるが、三次元の広
がりを持つ層又は物体と理解することもできる。

【００１５】これらの各手段の組み合わせも同様に考え
られる。この場合、反射層も蛍光層も設け、蛍光層は、
照明光によって励起されて蛍光を放射し（即ち、蛍光が
惹起され）、並びに、照明光は、反射層によって反射さ
れるように構成することもできるであろう。

【００１６】この励起放射光及び／又は反射光は、検出
器によって検出される。そして、検出信号に基づき、干
渉顕微鏡の物体領域での位相状態を直接帰納的に導き出
すことができ、これによって、干渉顕微鏡を適切に制御
ないし調節することができる。とりわけ好ましい態様で
は、干渉顕微鏡の物体領域における照明状態の決定につ
いてのこの措置により、再現可能でかつ同時に客観的な
測定を行うことができる。というのは、この測定の結果
は、厳密に調整された表面、ないし面の規定の性質のみ
に依存しており、かつ測定されるべき被検物に対し（測
定を）行う必要はないからである。更に、この措置は、
必然的に再現可能な結果を生じるが、これは、従来技術
から既知の措置（この場合、物体領域における照明状態
は、被検物それ自体において検出される）では、依然と
して不可能である。というのは、例えば、被検物は、照
明光の実際に存在する位相状態を帰納的に導き出すこと
ができるような好適な構造を有することができないから
である。

【００１７】被検物担持ユニットの少なくとも１つの面
は、部分的に反射可能に構成することができるであろ
う。更に、表面に被膜（フィルム）を形成することもで
きるであろう。とりわけ、表面が規定の反射率（好まし
くは、表面全体に亘って一定）を有するように、表面に
被膜を形成することができるであろう。表面の被膜は、
例えば、特定の波長の光のみが当該表面の被膜で反射さ
れるように、波長依存性とすることができるであろう。
種々の波長の光が反射されるように、被膜が形成される
ことも好ましい。表面の被膜としては、金属被膜又は誘
電体被膜が考えられるが、誘電体又は金属−誘電体ハイ
ブリッド（複合）被膜も考えられるであろう。

【００１８】更に有利な態様では、被検物担持ユニット
の少なくとも１つの表面は、ルミネセンス（とりわけ、
蛍光）を励起放射可能な少なくとも１つの層を有する。
このルミネセンス層は、単層（ないし単分子層：Monola
yer-Schicht）でありうるであろう。単層は、使用され
るルミネセンス分子の大きさ並びに表面上でのそれらの
配置によって与えられる規定の厚みを有する。そのた
め、単層は、ルミネセンスに好適な理想的な面状構造を
示す。

【００１９】とりわけ有利な態様では、被検物担持ユニ
ットの表面は、それぞれ異なるルミネセンス特性を示す
複数のルミネセンス層を有する。これらのルミネセンス
層は、異なる波長の光によって選択的にルミネセンスを
放射することができる。ルミネセンス層から放射されか
つ波長も同様にそれぞれ異なるルミネセンス光は、選択
的に検出することができる。好ましい一実施形態では、
表面被膜として、異なるルミネセンス特性を示す複数の
ルミネセンス放射単層が設けられる。１つ又は複数のル
ミネセンス層は、光源の光によってルミネセンスを励起
放射することができるものとする。光源は、干渉顕微鏡
の光源であるが、１つのルミネセンス層のみをルミネセ
ンス放射させる付加的な光源を使用することも同様に可
能である。理想的には、光源は、種々の波長の光を放射
し、この１つの光源の光によって、複数の異なるルミネ
センス層で被膜された表面を励起してルミネセンス放射
させることができるものとする。具体的には、例えば、
488nm、568nm及び647nmの波長の光を同時に放射するア
ルゴン−クリプトン−レーザである。ＨＢＯ−ランプの
使用も同様に可能であり、このランプの種々の波長の光
によっても、種々のルミネセンス層を励起してルミネセ
ンス放射させることができる。

【００２０】他の一実施形態では、被検物担持ユニット
の１つの面において、光が、非線形プロセス（nicht li
neare Prozesse）によって誘導放射される。とりわけ、
非線形プロセスとしては、ＣＡＲＳ（コヒーレント反ス
トークス・ラマン散乱：Coherent-Anti-Stokes-Raman-S
cattering）が考えられる。なお、蛍光、ラマン散乱、
ブリュアン散乱における放射光のうち、入射光より波長
の短いものを反ストークス線（アンチストークス線）と
もいう。ＣＡＲＳは、四波混合プロセス（Vier-Wellen-
Mischprozess）であり、これは、使用される光の強度の
２乗に比例する。ＣＡＲＳは、光学的非対称が存在する
位置でのみ生じる。光学的非対称は、例えば、被検物担
持ユニットの表面に存在する屈折率の跳躍的変化である
が、そこで屈折率が変化するのは、光学媒体が、ガラス
から、被検物を取り囲む液浸媒体へと移行するからであ
る。

【００２１】好ましい一実施形態では、面において反射
及び／又は励起放射される光は、干渉顕微鏡の検出器に
よって検出される。このことは、該面において反射及び
／又は励起放射（発光）される光が、被検物から出る検
出されるべき光とほぼ同じ出力（パワー）範囲並びに波
長範囲にあり、かつ干渉顕微鏡の検出器の検出領域に適
合させられていれば、とりわけ有利である。しかしなが
ら、該面において反射及び／又は励起放射される光が、
付加的な検出器によって検出可能であることも同様に考
えられる。更に、反射及び／又は励起放射される光は、
少なくとも１つの光学部材によって、干渉顕微鏡の検出
光路又は照明光路から離脱させられ、付加的検出器へ導
かれる。この場合、光学部材は、規定の反射率／透過率
を有する従来のガラスプレートでありうるであろう。ダ
イクロイックビームスプリッタ、フィルタ、プリズム、
格子及び／又はスペクトル感受性装置も、同様に、反射
／励起放射光の離脱のための光学部材として考えられる
であろう。とりわけ被検物担持ユニットの面から励起放
射される光が蛍光層からの蛍光であるならば、この蛍光
は、スペクトル感受性装置によって、スペクトル選択的
に検出器へ導かれうる。スペクトル感受性装置は、例え
ば、複数のレンズ、複数の絞り並びに１つのプリズム又
は１つの格子を含みうるであろう。

【００２２】被検物担持ユニットの面において反射及び
／又は励起放射される光の検出は、広域モード（Widefi
eld-Modus）で行うことができるであろう。広域モード
とは、例えば、ウェーブフィールド顕微鏡又はＩ^５Ｍ-
顕微鏡において見出されるような平面状の照明及び／又
は検出方法のことである。これに応じて、該面において
反射及び／又は励起放射される光を検出する検出器は、
例えば、ＣＣＤチップのような平面状の検出器として構
成することができるであろう。

【００２３】被検物担持ユニットの面において反射及び
／又は励起放射される光は、共焦点的に（ないしコンフ
ォーカルに）検出することができるであろう。この場
合、共焦点的照明が用いられる。即ち、照明に利用され
る光は、顕微鏡対物レンズの合焦面の一点で合焦する。
共焦点的な検出を行うために、検出器には、好ましくは
対物レンズの物体面と（光学的に）共役する面に配置さ
れるピンホール絞りが前置される。ピンホール絞りとし
て、干渉顕微鏡の照明用又は検出用ピンホール絞りを設
けることができるであろう。被検物担持ユニットの面に
おいて反射及び／又は励起放射される光が共焦点的検出
器によって検出されるならば、検出器に前置されるピン
ホール絞りは、干渉顕微鏡の検出用ピンホール絞りであ
る。ピンホール絞りとして照明用ピンホール絞りが用い
られる場合、光源と照明用ピンホール絞りとの間に配置
される光学部材は、被検物担持ユニットの面において反
射及び／又は励起放射される光を照明光路から離脱さ
せ、これに対応して設けられた検出器へと導くことがで
きるであろう。

【００２４】好ましい他の一実施形態では、干渉顕微鏡
の物体領域における照明状態は、少なくとも１つの付加
的光源の光によって規定される。光源としては、上述し
たのと同様に、レーザシステム、レーザ又はＨＢＯラン
プでありうる。

【００２５】具体的一実施形態では、被検物担持ユニッ
トはガラスから構成されている。被検物担持ユニットの
表面は、理想的には、高度な表面平坦性（Oberflaechen
planitaet）を有するが、これは、場合によって表面上
に形成される被膜（層）ないし蛍光層も有する。更に具
体的には、被検物担持ユニットは、カバーガラスとして
構成されうるであろう。これは、市場で入手可能なカバ
ーガラスでありうる。とりわけ好ましい一実施形態で
は、被検物は、２つの被検物担持ユニットの間に、有利
には、カバーガラスとして構成された２つの被検物担持
ユニットの間に配置される。有利には、被検物担持ユニ
ットの、被検物に配向している面は、反射又は放射（励
起蛍光）可能に構成される。

【００２６】本発明の作動方法に係る実施形態では、干
渉顕微鏡の物体領域における照明状態は、光学顕微鏡的
に検出可能に構成された少なくとも１つの面に基いて求
められる。とりわけ、該面において反射及び／又は励起
放射（発光）される光が検出される。更に、強度信号推
移が、該面の軸方向の位置に依存して検出される。軸方
向の強度信号推移を検出するために、被検物は、被検物
担持ユニットと共に１つ又は複数の対物レンズの光軸に
沿って移動させられ、その際、該面から反射及び／又は
励起放射された光が検出器によって検出される。被検物
と被検物担持ユニットの軸方向の位置決めは、連続的又
は段階的（ステップ的）に行うことができるであろう。
信号検出を実際に行うために、開始時において、被検物
と被検物担持ユニットは、被検物担持ユニットの面が干
渉顕微鏡の対物レンズの合焦領域に位置するように、位
置決めされる。これによって、一般に、該面において反
射及び／又は励起放射される光の信号を検出することが
できる。

【００２７】好ましくは、複数の軸方向強度推移が、と
りわけ合焦面の１つ及び／又は複数の点において検出さ
れる。二重共焦点走査型顕微鏡ないし４Ｐｉ顕微鏡の場
合、１つ又は複数の強度信号推移をそれぞれ検出するべ
き種々の点が、光線走査によって走査されうるであろ
う。これによって、有利には、合焦面の複数の点に対し
規定の位相関係が存在することを確実にすることによ
り、被検物を光線走査法によって照明ないし検出し、そ
の際種々の光線偏向角ないし走査角に対し同一の規定位
相関係が存在できるようにすることができるであろう。
光線走査法は、迅速な被検物検出に関して極めて有利で
ある。光線走査法の代替法としては、被検物走査法が考
えられるが、この方法は、位置固定された照明光線の合
焦点を通過するように被検物を例えばジグザグ走行させ
るものである。

【００２８】とりわけ、干渉顕微鏡の状態の変更（ない
し制御）の観点から、例えば、種々の時点において、干
渉顕微鏡の物体領域における照明状態を求めるために、
軸方向の強度信号推移の検出を複数行う。好ましくは、
強度信号推移の検出は、被検物の検出中にも行われる。
干渉顕微鏡の物体領域における照明状態を求めるために
種々の波長の光が利用される場合には、各々の波長の光
に対し、軸方向の強度信号推移の検出がそれぞれ行われ
る。それに応じて、面において反射／励起放射される種
々の波長の光は、それぞれ１つの検出器へ導かれ、当該
検出器によって検出されるであろう。この場合、種々の
波長の光を同時に検出することも可能であろう。また、
種々の波長の光をそれぞれ同一の検出器へ導くことも考
えられるが、この場合、単に、個々の波長の光を順次検
出することも可能であろう。

【００２９】方法に関する更なる実施形態では、検出さ
れた軸方向の強度信号推移は、アルゴリズムによって評
価される。このアルゴリズムは、第一に、干渉顕微鏡の
物体領域に存在する照明光ないし検出光の位相関係を求
めるために利用される。

【００３０】具体的には、アルゴリズムは、まず、軸方
向の強度信号推移の中心点（ないし中央点）を求める。
次に、該強度信号推移の中心点（ないし中央点）におけ
る信号の大きさ（ないし高さ）を求める。

【００３１】アルゴリズムは、付加的に又は選択的に、
強度信号推移の中心点（ないし中央点）から同程度に離
隔した２つの点の信号点（ないし大きさ）を比較するこ
ともできるであろう。中心点（ないし中央点）から同程
度に離隔した点（複数）は、例えば、４Ｐｉ-顕微鏡で
は、通常、副（二次）極大値（複数）又は２つの最初の
極小値が配される位置で生じうるであろう。更に、アル
ゴリズムは、この中心点（ないし中央点）に関する強度
信号推移のシンメトリ（ないし対称性）を分析すること
もできるであろう。

【００３２】更に、干渉顕微鏡は、物体領域における照
明状態に応じて調節（ないし制御）される。干渉顕微鏡
の調節（ないし制御）は、照明の合焦時にポジティブな
干渉を生じさせることを目的として行われる。これに加
えて、相応の調節を行うこともできるであろう。具体的
には、当該調節（ないし制御）には、干渉計分割光路の
光路長の変更が含まれうるであろう。これは、例えば、
相応のミラーの平行移動によって行うことができるであ
ろう。

【００３３】上述の検出及び調節過程は繰り返し行わ
れ、干渉顕微鏡のドリフト（挙動）に適合（ないし調
和）させられる。例えば、干渉顕微鏡が比較的大きな温
度の変動の影響下にあるならば、検出及び調節過程を頻
繁に繰り返すことが必要となるであろう。これは、つま
り、専らポジティブな干渉が生じるように照明合焦時の
照明状態を制御する必要があるからである。

【００３４】

【実施例】本発明の実施例を図面を参照して詳細に説明
する。なお、特許請求の範囲に付した図面参照符号は、
発明の理解のためであって、本発明を図示の態様に限定
することを意図しない。また、以下の実施例も発明の理
解の容易化のためであり、本発明は、本発明の技術的思
想を逸脱しない範囲において当業者により実施可能な修
正・変更を含むことも言うまでもない。

【００３５】図１には、４Ｐｉ-顕微鏡として構成され
ている干渉顕微鏡が示されている。光源１０からの光
は、励起用ピンホール絞り１１を通過し、ダイクロイッ
クビームスプリッタ１２によって光線偏向装置１３の方
向へ偏向される。光線偏向装置１３は、光線を実質的に
互いに垂直な２つの方向へ偏向して走査し、そのため物
体領域における照明の合焦点は、光線偏向装置１３の走
査運動によって、例えば合焦面の二次元領域をジグザグ
にスキャンないし走査する。図１に単に模式的に示され
た干渉モジュール１４は、図２に（詳細に）示されてい
る。図２で、参照符号８は、顕微鏡の接続面（ないしイ
ンターフェース）を表しているが、これは同時に干渉モ
ジュール１４の対物レンズの入射ひとみ面に対応する
（ないし（光学的に）共役する）面を表している。実線
１は、未偏向ないし未走査で進む光線を表している。破
線で表された光線２は、光線偏向装置１３によって引き
起こされた偏向された光線の推移を表している。光線１
ないし２は、ミラー３によってキューブビームスプリッ
タ５の方向へ反射される。キューブビームスプリッタ５
は、照明光線を分割して２つの分割光線とし、該２つの
分割光線は、ミラー３’によってそれぞれ対物レンズ６
の方向へ反射される。２つの対物レンズ６は、物体面２
６の両側にそれぞれ配されており、互いに向き合って
（対向して）いる。対物レンズ６の入射ひとみ７がそれ
ぞれ模式的に示されている。実線で表された光線１を偏
向することによって、物体面２６の、破線で表された光
線２が行うのとは異なる横方向位置を照明することを、
物体面２６に模式的に示された合焦領域から見出すこと
ができる。レンズ４は、対物レンズ６の入射ひとみ７の
ひとみ（位置）を移動させる作用も有するが、該ひとみ
は、従来の顕微鏡の場合よりも、干渉計モジュール１４
内においては、対物レンズの入射ひとみ面に対応（ない
し（光学的に）共役）する面８から更に遠い位置にあ
る。図２のひとみ（位置）の移動は、実際の中間結像
（ないし中間実像：reale Zwischenabbildung）を介し
て行われる。図２に示された光路は、光学素子と共に、
従来の顕微鏡に適合可能なモジュールに配されている。

【００３６】被検物から反射ないし励起放射された蛍光
は、対物レンズによって捕捉され、照明光路を（入射照
明光線と）反対方向へ進行する。そして、２つの干渉計
分割光路２７、２８を進行する光は、ビームスプリッタ
５で結合し、ミラー３で反射した後、顕微鏡の接続面
（インターフェース）８の方向へ進行する。具体的に
は、更に、被検物から励起放射された蛍光は、光線偏向
装置１３を同様に反対方向に通過し、その波長の性質に
基いてダイクロイックビームスプリッタ１２を通過す
る。２つの対物レンズ６の合焦領域からの蛍光のみが、
共焦点構成に基づき検出用ピンホール絞り１５を通過す
る。検出用ピンホール絞り１５に後置されたダイクロイ
ックビームスプリッタ１７は、被検物を特異的にマーキ
ングした種々の蛍光色素からの蛍光を３つの検出器１６
へ導き、これらの検出器は、所定の励起放射波長範囲の
蛍光をそれぞれ検出する。

【００３７】図３（ａ）には、従来の共焦点走査型顕微
鏡の、光軸に沿ったＺ座標ないし軸方向に応じた強度信
号推移が示されている。そのような強度信号推移は、例
えば、照明及び検出を行うために干渉計分割光路２８の
みが使用される場合、物体面に配された蛍光層に関して
検出される。図３（ｂ）には、二重共焦点走査型顕微鏡
ないし４Ｐｉ-顕微鏡の軸方向強度信号推移がＺ座標な
いし軸方向の関数として表されている。２つの対物レン
ズ６の、一点鎖線で表された合焦位置において、図３
（ｂ）の軸方向強度信号推移は、主（一次）極大値を有
する。干渉計モジュール１４の照明干渉パターンを形成
することにより、主極大値に隣接して、それぞれ凡そλ
／２だけ軸の正負両方向にずらされた２つの副（二次）
極大値（その強度は主極大値より小さい）が生じる。図
３（ｂ）に示された軸方向強度信号推移は、ポジティブ
干渉（強め合う干渉）が生じている場合の信号推移であ
る。この場合、２つの干渉計分割光路２７、２８を進行
する照明光線の位相関係が適切に形成され、合焦された
２つの分割光線がまさに物体面２６において強め合う。

【００３８】図３（ｃ）には、同様に、相殺的干渉（ネ
ガティブな弱め合う干渉）が存在する場合の、Ｚ座標な
いし軸方向に応じた軸方向強度信号推移が示されてい
る。そのため、２つの干渉計分割光路２７、２８を進行
する照明光線の位相関係は、それらの振幅が物体面にお
いて互いに弱め合う（ないし打ち消し合う）ように形成
され、一点鎖線で表されたＺ座標の位置において極小値
が生じる。

【００３９】図４には、２つの対物レンズ６の間の領域
が拡大されて示されている。図４から見出しうること
は、検査されるべき被検物が、カバーガラス（ないしス
ライドガラス）として構成された２つの被検物担持ユニ
ット２２（これらは、物体領域２３を画成している）の
間の領域に配置されていることである。カバーガラス２
２と対物レンズ６との間には、それぞれ液浸媒体２４が
充填されている。

【００４０】本発明によれば、干渉顕微鏡の物体領域２
３における照明状態を求めるために、カバーガラス２２
の表面２９の少なくとも１つが光学顕微鏡を介して検出
可能に構成されている。この場合、表面２９において反
射／励起放射された光は、検出器１６によって検出され
る。

【００４１】表面２９は、部分的に反射するように構成
されている。更に、表面２９は、金属被膜２５が形成さ
れ、一定の反射率を有する。金属被膜２５上には、蛍光
を励起・放射可能な２つの層（不図示）が形成されてお
り、これらの層は、それぞれ単層（ないし単分子層：Mo
nolayer-Schicht）の形態を取っている。２つの蛍光単
層は、種々の蛍光特性を有する。２つの蛍光層は、光源
１０の光によってそれぞれ蛍光を励起放射する。表面に
おいて反射／励起放射される光は、干渉顕微鏡の検出器
１６で検出される。この検出は、共焦点的検出であり、
検出器１６には検出用ピンホール絞り１５が前置されて
いる。検出用ピンホール絞り１５は、対物レンズ６に関
し物体面２６に（光学的に）対応（共役）する面に配置
されている。（図４では、）２つの被検物担持ユニット
２２は、カバーガラスであり、一方のみが層（ないし被
膜）２５を有する。この層（ないし被膜）は、カバーガ
ラスの、被検物に配向する表面に形成されている。

【００４２】作動方法の観点では、干渉顕微鏡の物体領
域２３における照明状態は、強度信号推移を表面２９の
軸方向位置に応じて測定することにより、表面２９にお
いて反射／励起放射される光に基づいて求められる。更
に、被検物はカバーガラス２２と共に対物レンズ６の光
軸に沿って移動させられ、表面２９において反射／励起
放射された光は、検出器１６によって検出される。

【００４３】軸方向強度信号推移は、まず第一に、カバ
ーガラス２２の一方の表面２９が対物レンズ６の合焦領
域に位置しているように、被検物がカバーガラス２２と
共に位置付けられるようにして検出される。複数の軸方
向強度信号推移が、合焦面（ないし物体面）２６内の複
数の点において検出される。合焦面の種々の点が、光線
偏向装置１３によって引き起こされる光線走査によって
走査される（図２参照）。

【００４４】カバーガラス２２の表面２９は、部分反射
性でかつ異なる２つの蛍光層によって被膜されているの
で、複数の検出器１６により、同時に、軸方向強度信号
推移が検出される。そして、部分反射性の層（ないし被
膜）２５において反射された照明光は、第１の検出器１
６へ導かれ、第一の蛍光層からの蛍光は第二の検出器へ
導かれ、第二の蛍光層からの蛍光は第三の検出器へ導か
れる。蛍光層の照明ないし励起に利用される光源１０の
光には、488nmと647nmの波長の光が含まれる。これに応
じて、第一の検出器１６は、反射層（ないし被膜）２５
において反射される488nmの光を検出する。488nmの波長
を有する照明光は、第一の蛍光層を励起して蛍光を放射
させ、647nmの波長を有する照明光は、第二の蛍光層を
励起して蛍光を放射させる。

【００４５】図５には、反射層（ないし被膜）２５にお
いて反射される波長488nmの光を検出する第一の検出器
１６で測定される軸方向強度信号推移のグラフが示され
ている。軸方向強度信号推移は、Ｚ座標ないし光軸に応
じてかつ使用された波長を単位として表示されている。
なお、強度の単位[ａ．ｕ．]は、任意の単位（arbitrar
y units）で表される。Ｚ座標０（ゼロ）は、ここで
は、物体面２６に対応している。図５に示された、測定
される強度信号推移は、ポジティブ干渉に対応してい
る。即ち、物体面２６において、干渉計分割光路２７、
２８を進行する照明光の振幅がポジティブに（ないし強
め合うように）互いに重なり合い極大値を生じる。この
ことは、まさに干渉計分割光路２７、２８の光路長が全
く同一の長さである場合に妥当しうるであろう。また、
これは、２つの干渉計分割光路２７、２８の光路長の差
がλ／２の倍数だけ異なる場合にも妥当しうるであろ
う。図５に示された、測定される軸方向強度信号推移
は、反射層（ないし被膜）２５で反射され検出器１６で
検出された光を表しているが、この光は、反射成分と透
過成分から構成され、これらの成分は、検出の際に重ね
合わされる。層（ないし被膜）２５の反射率は、この実
施例では、0.05である。図５に示された軸方向強度信号
推移は反射光なので、これは、二重（ないし２倍）の光
路差を受ける。というのは、この光は、反射条件の下、
２倍の経路を進むからである。それゆえ、一方の干渉計
分割光路の他方の干渉計分割光路に対する幾何学的経路
差がλ／２である場合、図５に示されているように、ポ
ジティブ干渉が生じる。２つの干渉計分割光路２７、２
８の間の幾何学的経路差が単にλ／４である場合は、図
６に示されているように、検出器において相殺的干渉が
生じる。これに対し、蛍光層から蛍光が放射される場合
は、２つの干渉計分割光路２７、２８の光路長の差がλ
／２であれば、相殺的干渉が生じる。

【００４６】とりわけ有利な方法では、反射された光並
びに２つの異なる蛍光層からの光についての、測定され
る軸方向強度信号推移は、同時に測定され、一緒に評価
される。測定される信号は異なる波長の光に由来するの
で、とりわけ有利な方法において、更に、２つの干渉計
分割光路２７、２８の光路長の完全な調節を行うことが
できる。なぜなら、もし波長が互いに有理数倍の関係が
なければ、光路差の絶対値がゼロの場合にのみ、異なる
波長の光は、同程度にポジティブに干渉するからであ
る。この場合、タイプＣの４Ｐｉ-顕微鏡が実現される
であろう。この顕微鏡では、照明光線のポジティブ干渉
並びに検出光線のポジティブ干渉が存在し、これによっ
て、軸方向の分解能が最適化されている。

【００４７】軸方向強度信号推移は、アルゴリズムによ
って評価される。このアルゴリズムは、一方では、強度
信号推移の中心点（ないし中央点）における信号の大き
さ（ないし高さ）を求めるが、この中心点は、図５及び
図６に示された測定される強度信号推移の場合、軸位置
（ないしＺ座標）０（ゼロ）上にある。更に、アルゴリ
ズムは、強度信号推移の中心点から同距離に離隔した位
置にある２つの点における信号の大きさを比較する。Ｚ
座標が０（ゼロ）の中心点から同距離に離隔した２つの
点は、Ｚ座標λ／２と−λ／２のところ、即ち、図３
（ｂ）に示されたポジティブ干渉のグラフの第一の副極
大値がまさに生じるべきところに位置している。

【００４８】干渉顕微鏡は、物体領域における照明状態
に応じて調節（ないし制御）される。この場合、測定さ
れる軸方向強度信号推移が、例えば図５のような、ポジ
ティブ干渉の典型的な信号推移を有するように、軸方向
強度信号推移の測定過程中に干渉計分割光路２７の光路
長を変化させる調節が行われる。この検出過程と調節過
程は、繰り返し実行され、干渉顕微鏡のドリフト（挙
動）、とりわけ干渉モジュール１４のドリフト（挙動）
に適合されている。

【００４９】前述の各実施形態及び実施例において、被
検物担持ユニットの少なくとも１つの面の光学的顕微鏡
的な検出は、対応する検出信号の評価手段（演算手段）
を備えた、プログラム化された制御ユニット（ＣＰＵユ
ニット）を介して、電子計算機的に具体化される。特に
第２の視点に示す作動方法の各ステップは、所定のプロ
グラム及び所与のメモリ機能を備えたコンピュータ制御
ユニットによって、自動的に遂行するよう、予め試行デ
ータを記憶させて、シミュレーション推移と対照比較す
ることにより、測定検出信号に基づき、直ちに各照明状
態を決定することができる。

【００５０】

【発明の効果】本発明の各独立請求項１及び８により、
対応する課題として掲げた効果がそれぞれ達成される。
即ち、本発明の干渉顕微鏡及びその作動方法により、物
体領域において干渉を行う光の位相状態を被検物担持ユ
ニットの少なくとも１つの面において、光学顕微鏡的に
求めることを可能にしたため、個々の物体領域の検出が
不要となり、干渉顕微鏡の容易かつ低コストの調節（な
いし制御）が可能となる。各従属請求項により、更に付
加的な効果がそれぞれ達成される。

【図面の簡単な説明】

【図１】４Ｐｉ顕微鏡の模式図。

【図２】図１の４Ｐｉ顕微鏡の光路の一部の模式図。

【図３】（ａ） 従来の共焦点走査型顕微鏡における軸
方向強度信号推移のグラフ。 （ｂ） ポジティブ干渉の場合の４Ｐｉ顕微鏡の軸方向
強度信号推移のグラフ。 （ｃ） 相殺的干渉の場合の４Ｐｉ顕微鏡の軸方向強度
信号推移のグラフ。

【図４】図２の２つの対物レンズの間の領域を表した模
式図。

【図５】被膜された表面の光軸に関する位置の関数とし
て表された、測定される軸方向強度信号推移のグラフ
（ポジティブ干渉のケース）。

【図６】被膜された表面の光軸に関する位置の関数とし
て表された、測定される軸方向強度信号推移のグラフ
（相殺的干渉のケース）。

フロントページの続き (72)発明者 ヒルマー グーゲル ドイツ連邦共和国 Ｄ−69221 ドッセン ハイム コンラート−アデナウアー−シュ トラーセ 23ｂ Ｆターム(参考） 2H052 AA04 AA08 AA09 AB24 AB26 AC04 AC15 AC29 AC34 AD02 AE05 AE06 AF07

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】被検物（試料）に配属される少なくとも１
   つの被検物担持ユニットが設けられている干渉顕微鏡に
   おいて、 干渉顕微鏡の物体領域における照明状態を規定するため
   に、被検物担持ユニット（２２）の少なくとも１つの面
   （２９）が光学顕微鏡的に検出可能に構成されているこ
   とを特徴とする干渉顕微鏡。
2. 【請求項２】前記面（２９）において光を反射可能及び
   ／又は励起放射可能であること、及び該光を検出器（１
   ６）によって検出可能であることを特徴とする請求項１
   に記載の干渉顕微鏡。
3. 【請求項３】前記被検物担持ユニット（２２）の少なく
   とも１つの表面（２９）は、ルミネセンスを励起可能な
   少なくとも１つの層を有することを特徴とする請求項１
   又は２に記載の干渉顕微鏡。
4. 【請求項４】前記被検物担持ユニット（２２）の面（２
   ９）において、光を非線形プロセスによって励起放射可
   能であることを特徴とする請求項１〜３の一に記載の干
   渉顕微鏡。
5. 【請求項５】前記非線形プロセスは、ＣＡＲＳ（コヒー
   レント反ストークス・ラマン散乱）であることを特徴と
   する請求項４に記載の干渉顕微鏡。
6. 【請求項６】前記面（２９）において反射及び/又は励
   起放射された光は、干渉顕微鏡の検出器（１６）によっ
   て検出可能であることを特徴とする請求項１〜５の一に
   記載の干渉顕微鏡。
7. 【請求項７】干渉顕微鏡の物体領域における照明状態の
   決定は、少なくとも１つの付加的光源の光によって実行
   可能であることを特徴とする請求項１〜６の一に記載の
   干渉顕微鏡。
8. 【請求項８】被検物（試料）に配属される少なくとも１
   つの被検物担持ユニットが設けられている干渉顕微鏡の
   作動方法において、 干渉顕微鏡の物体領域における照明状態は、被検物担持
   ユニット（２２）の、光学顕微鏡的に検出可能に構成さ
   れた少なくとも１つの面（２９）によって規定されるこ
   と、及び干渉顕微鏡の物体領域における照明状態の決定
   は、該面（２９）で反射及び／又は励起放射された光に
   よって行われるとともに、強度信号推移が、該面（２
   ９）の軸方向位置に応じて検出されることを特徴とする
   干渉顕微鏡の作動方法。
9. 【請求項９】前記軸方向の強度信号推移を検出するため
   に、被検物は、被検物担持ユニット（２２）と共に１つ
   又は複数の対物レンズ（６）の光軸に沿って移動させら
   れること、及びその際、前記面（２９）から反射及び／
   又は励起放射された光が検出されることを特徴とする請
   求項８に記載の作動方法。
10. 【請求項１０】前記（軸方向の）強度信号推移の検出開
    始時に、被検物担持ユニット（２２）の面（２９）が干
    渉顕微鏡の対物レンズ（６）の合焦領域に配置している
    ように、被検物は、被検物担持ユニット（２２）と共に
    位置決めされることを特徴とする請求項８又は９に記載
    の作動方法。
11. 【請求項１１】前記軸方向の強度信号推移の検出が、種
    々の波長の光に対し、それぞれ行われることを特徴とす
    る請求項８〜１０の一に記載の作動方法。