JP2002195949A

JP2002195949A - 蛍光検出装置

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Publication number: JP2002195949A
Application number: JP2000393381A
Authority: JP
Inventors: Shin Nakamura; 伸中村
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2000-12-25
Filing date: 2000-12-25
Publication date: 2002-07-10
Anticipated expiration: 2020-12-25
Also published as: JP3636070B2

Abstract

(57)【要約】【課題】蛍光検出装置の検出信号のＳ／Ｎを向上させ
る。【解決手段】励起光源レーザ装置１９からの励起光を
ビームエキスパンダ２１、ビームスキャニング素子２
３、ダイクロイックミラー２５及び対物レンズ２７によ
り励起光を検出領域に照射する。検出領域からの光を対
物レンズ２７により集光し、平行光にしてダイクロイッ
クミラー２５を介して除去フィルター３１に送る。フィ
ルター３１はダイクロイックミラー２５からの光のう
ち、励起光成分を除去してレンズ３３に送る。レンズ３
３はフィルター３１からの蛍光をスリット３５の長穴に
集光する。スリット３５の長穴を通過した蛍光は凹面ホ
ログラフィックグレーティング３７に照射される。グレ
ーティング３７はスリット３５からの蛍光を分光し、Ｃ
ＣＤ３９の受光面に結像する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、検出領域の蛍光を
検出する蛍光検出装置に関するものである。このような
蛍光検出装置は、例えば、極微量のタンパクや核酸、薬
物などを高速かつ高分解能に分析する電気泳動装置の検
出装置として用いられる。

【０００２】

【従来の技術】極微量のタンパク質や核酸などを分析す
る場合には、従来から電気泳動装置が用いられている。
電気泳動装置としては、内径が１００μｍ以下のガラス
キャピラリーを用いるものや、基板内に幅寸法１００μ
ｍ程度、深さ５０μｍ程度の溝を形成したチップデバイ
スを用いるものがある。電気泳動装置での検出は、サン
プルを予め蛍光標識しておき、蛍光光度法を用いるのが
一般的である。

【０００３】図３はチップデバイスを用いた電気泳動装
置に適用された従来の蛍光検出装置を示す斜視図であ
る。チップデバイス１には複数の分析流路４３が形成さ
れており、それらの分析流路４３の所定位置に複数の分
析流路４３にまたがる帯状の検出領域２９が設けられて
いる。チップデバイス１の側方に設けられたレーザ装置
４９により、検出領域２９に励起光が照射されて複数の
分析流路４３に励起光が同時に照射される。

【０００４】チップデバイス１の上方に設けられた集光
レンズ５１により、検出領域２９内の特定の分析流路４
３からの光を集光して平行光にする。その平行光を、レ
ーザ光を除去するための除去フィルター５３を介して、
透過型回折格子５５に送る。透過型回折格子５５により
除去フィルター５３からの平行光を分光し、結像レンズ
５７を介して、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）５９
に結像する。各波長の光はＣＣＤ５９の異なる位置に結
像される。ＣＣＤ５９の検出信号に基づいて所定の蛍光
波長の強度を算出する。蛍光波長の強度を調べることに
より、検出領域２９におけるその蛍光波長の蛍光を発す
る蛍光物質の有無を判断できる。

【０００５】図３の蛍光検出装置では、集光レンズ５
１、除去フィルター５３、透過型回折格子５５、結像レ
ンズ５７及びＣＣＤ５９を含む光学系又はチップデバイ
ス１を検出領域２９方向に移動させることにより、複数
の分析流路４３について検出領域２９で蛍光検出を順次
行なう。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】透過型回折格子を用い
た蛍光検出装置では、透過型回折格子の回折効率（入射
光に対する回折光の強度の割合）が低いので、検出信号
のＳ／Ｎ（ノイズに対する検出信号の強度の割合）が低
いという問題があった。また、複数の分析流路にまたが
る帯状の検出領域で蛍光検出を行なう場合、透過型回折
格子の空間周波数特性により、隣接する分析流路からの
蛍光が光学系に入射する現象（クロストークという）に
より誤検出を起こすという問題があった。そこで本発明
は、検出信号の高いＳ／Ｎを実現できる蛍光検出装置を
提供することを目的とするものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明にかかる蛍光検出
装置は、検出領域内の蛍光を検出する蛍光検出装置であ
って、検出領域からの光をスリットの穴に結像する第１
の光学系と、少なくとも反射型回折格子を備え、スリッ
トの穴からの光を分光し、検出素子に結像する第２の光
学系とを備えているものである。

【０００８】第１の光学系により検出領域からの光をス
リットの穴に結像する。反射型回折格子を備えた第２の
光学系により、スリットの穴からの光を分光し、検出素
子に結像する。反射型回折格子は透過型回折格子に比較
して回折効率が高いので、検出素子の検出信号について
高いＳ／Ｎを実現できる。さらに、反射型回折格子は結
像特性がよいので、複数の分析流路にまたがる帯状の検
出領域で蛍光検出を行なう場合であっても、クロストー
クを低減することができる。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明にかかる蛍光検出装置にお
いて、反射型回折格子として反射型凹面格子を備え、第
２の光学系は反射型凹面格子のみによって構成されてい
ることが好ましい。反射型凹面格子を用いることによ
り、凹面鏡などの光学系を用いることなく、スリットの
穴からの光を分光して検出素子に結像することができ
る。これにより、装置の構成を簡単にすることができ
る。

【００１０】

【実施例】図１は本発明にかかる蛍光検出装置の一実施
例を備えた電気泳動装置を示す斜視図である。図２は、
図１の電気泳動装置に装着される多数の分離用流路が形
成されたチップデバイスを表す図であり、（Ａ）は一方
の基板の上面図、（Ｂ）は他方の基板の上面図、（Ｃ）
は両基板を重ね合わせた状態での上面図、（Ｄ）は
（Ｃ）の円で囲まれた部分を拡大して示す上面図、
（Ｅ）は（Ｃ）の分析流路部分を示す断面図である。

【００１１】まず、図２に示すチップデバイスについて
説明する。チップデバイス１は、一対の透明板状の無機
材料（例えばガラス、石英、シリコンなど）又はプラス
チックからなる基板１ａ，１ｂにより構成される。基板
１ａ，１ｂの厚さは１.１ｍｍである。一方の基板１ｂ
の表面には、半導体フォトリソグラフィー技術又はマイ
クロマシニング技術により、互いに交差するサンプル導
入用流路４１及び分離用流路４３の組が１６組形成され
ている。サンプル導入用流路４１及び分離用流路４３の
寸法は幅が１００μｍ程度、深さが５０μｍ程度であ
る。１６組の流路４１，４３は、他の組の流路と交差し
ないように、サンプル導入用流路４１と交差する側とは
反対側の分離用流路４３の一端側を要として扇型に配置
されている。

【００１２】他方の基板１ａには流路４１，４３の端に
対応する位置にアノードリザーバ４５ａ、カソードリザ
ーバ４５ｃ、サンプルリザーバ４５ｓ、ウエイストリザ
ーバ４５ｗとしての貫通穴が形成されている。リザーバ
４５ｓ，４５ｗは流路４１，４３の組ごとに設けられて
いる。アノードリザーバ４５ａは扇型配置の要側の各組
の分離用流路４３の一端側で共通である。カソードリザ
ーバ４５ｃは長穴により構成され、各組の分析流路４３
の他端側で共通である。図２（Ｄ）に示すように、サン
プルリザーバ４５ｓからのサンプル導入用流路４１とウ
エイストリザーバ４５ｗからのサンプル導入用流路４１
は１００μｍの間隔をもって分析流路４３に接続されて
いる。

【００１３】チップデバイス１は、両基板１ａ，１ｂを
重ねて接合した状態で使用される。チップデバイス１で
の分離サンプルの検出領域２９は、扇型配置の要側の各
組の分離用流路４３の一端側付近である。このようなチ
ップデバイスは、多数の分離用流路が形成されているこ
とから、Multi-channel Micro-chipとも呼ばれる。

【００１４】図１を用いて電気泳動装置について説明す
る。チップデバイス１はリザーバが形成された表面を上
方にしてチップデバイス保持台３に保持されている。チ
ップデバイス保持台３にはチップデバイス１の温度を調
節するためのペルチエ式温調機構５が備えられている。
ペルチエ式温調機構５に対向する位置にペルチエ式温調
機構５に送風するためのファン７が設けられている。チ
ップデバイス保持台３のチップデバイス１が保持された
表面を覆う泳動チャンバー蓋９が設けられている。

【００１５】チップデバイス保持台３の付近に、チップ
デバイス保持台３に保持されたチップデバイス１の流路
及びリザーバに泳動媒体としてのポリマーを充填するた
めのポリマー充填ポート１１及びポリマー充填用シリン
ジ１３が設けられている。チップデバイス保持台３のチ
ップデバイス１が保持された表面側に、チップデバイス
１のリザーバ４５ａ，４５ｃ，４５ｓ，４５ｗに収容さ
れた液に電圧を印加するための電極１５がリザーバ４５
ａ，４５ｃ，４５ｓ，４５ｗごとに設けられている。各
電極１５は電極１５に電圧を供給するための高電圧供給
部１７に電気的に接続されている。

【００１６】電気泳動装置の検出装置として蛍光検出装
置が備えられている。蛍光検出装置の光源として、励起
光源レーザ装置１９が設けられている。レーザ装置１９
としては、例えばアルゴン（Ａｒ）レーザやクリプトン
（Ｋｒ）レーザ、ヘリウムネオン（Ｈｅ-Ｎｅ）レー
ザ、ネオジム（Ｎｄ）-ＹＡＧ（Ｙ₃Ａｌ₅Ｏ₁₂）などの
Ｎｄイオン固体レーザ、半導体レーザ（Laser Diode：
ＬＤ）、光第２高調波発生（ＳＨＧ）現象を利用した固
体レーザなど、種々のレーザ装置を用いることができ
る。

【００１７】レーザ装置１９からの励起光の光路にはそ
の励起光を平行光にするビームエキスパンダ２１が設け
られている。ビームエキスパンダ２１からの励起光の光
路には、ガルバノミラーやＡＯＤ（Acousto-Optics Dev
ice）などの励起光を走査するためのビームスキャニン
グ素子２３が設けられている。ビームスキャニング素子
２３からの励起光の光路には、ビームスキャニング素子
２３からの励起光をチップデバイス１側へ反射するダイ
クロイックミラー２５が設けられている。ダイクロイッ
クミラー２５は励起光を反射し、チップデバイス１側か
らの蛍光を透過するような波長特性のものを用いる。

【００１８】ダイクロイックミラー２５に反射された励
起光の光路には、その励起光を泳動チャンバー蓋９に設
けられた開口を介してチップデバイス１の分離用流路４
３の検出領域２９（図２も参照）に集光する対物レンズ
２７が設けられている。ダイクロイックミラー２５の対
物レンズ２７とは反対側に、励起光成分を除去する除去
フィルター３１が設けられている。除去フィルター３１
を透過した蛍光の光路にはその蛍光を、チップデバイス
１の検出領域２９に対応して長穴が形成されたスリット
３５に結像するためのレンズ３３が設けられている。

【００１９】スリット３５の長穴からの蛍光の光路に
は、その蛍光を分光して冷却ＣＣＤ３９の受光面に結像
するための凹面ホログラフィックグレーティング（反射
型凹面格子）３７が設けられている。冷却ＣＣＤ３９に
は、冷却ＣＣＤ３９の動作を制御し、冷却ＣＣＤ３９の
検出信号を処理するための演算装置（図示は省略）が電
気的に接続されている。蛍光検出装置は、チップデバイ
ス１の分離用流路４３の検出領域２９における蛍光を検
出して分離したサンプルを検出するものである。グレー
ティング３７により検出領域２９からの蛍光を分光する
ことにより、複数種類の蛍光波長を検出することができ
る。

【００２０】この実施例において、本発明にかかる蛍光
検出装置は、励起光源レーザ装置１９、ビームエキスパ
ンダ２１、ビームスキャニング素子２３、ダイクロイッ
クミラー２５、対物レンズ２７、除去フィルター３１、
レンズ３３、スリット３５、グレーティング３７及び冷
却ＣＣＤ３９により構成され、第１の光学系は、ダイク
ロイックミラー２５、対物レンズ２７、除去フィルター
３１、レンズ３３、スリット３５により実現され、第２
の光学系はグレーティング３７により実現されている。

【００２１】図１及び図２を参照してこの電気泳動装置
の動作を説明する。泳動チャンバー蓋９が開けられ、チ
ップデバイス保持台３の所定位置にチップデバイス１が
配置された後、ポリマー充填ポート１１を移動させてチ
ップデバイス１のリザーバ４５ａに接合させる。シリン
ジ１３内に収容されたポリマーを押し出して、ポリマー
充填ポート１１及びリザーバ４５ａを介して分析流路４
３及びサンプル導入流路４１に充填する。リザーバ４５
ａ，４５ｃ，４５ｗにバッファが注入され、サンプルリ
ザーバ４５ｓにサンプルが注入され、各リザーバ４５
ａ，４５ｃ，４５ｓ，４５ｗに電極１５が配置された
後、泳動チャンバー蓋９が閉じられる。ペルチエ式温調
機構５及びファン７を作動させ、チップデバイス１及び
泳動チャンバー内を所定の温度に温調する。

【００２２】泳動用高圧電源１７により各電極１５に所
定の電圧を印加してサンプルリザーバ４５ｓに収容され
たサンプルをサンプル導入用流路４１内に導入した後、
各電極１５への印加電圧を切り換えて、サンプル導入用
流路４１と分析流路４３の交差部にあるサンプルを分析
流路４３内に導入する。その後、分析流路４３に導入し
たサンプルをアノードリザーバ４５ａ側へ泳動させて分
離させる。

【００２３】励起光源レーザ装置１９を作動させ、励起
光をビームエキスパンダ２１及びビームスキャニング素
子２３を介してダイクロイックミラー２５に照射する。
ダイクロイックミラー２５により励起光を対物レンズ２
７側に反射し、対物レンズ２７により励起光を検出領域
２９内に照射する。このとき、ビームスキャニング素子
２３により、検出領域２９内で分析流路４３が並ぶ方向
（図１中矢印参照）に励起光が走査されるように、ダイ
クロイックミラー２５への励起光の照射位置を走査す
る。

【００２４】検出領域２９からの光を対物レンズ２７に
より集光し、平行光にしてダイクロイックミラー２５へ
送る。ダイクロイックミラー２５は対物レンズ２７から
の光を透過して除去フィルター３１に送る。除去フィル
ター３１はダイクロイックミラー２５からの光のうち、
励起光成分を除去し、所定の波長の蛍光のみを透過して
レンズ３３に送る。レンズ３３は除去フィルター３１か
らの蛍光をスリット３５の長穴に集光する。スリット３
５の長穴を通過した蛍光はグレーティング３７に照射さ
れる。グレーティング３７はスリット３５からの蛍光を
分光し、冷却ＣＣＤ３９の受光面に結像する。冷却ＣＣ
Ｄ３９の検出信号に基づいて、蛍光標識されたサンプル
を検出する。

【００２５】図１に示す一実施例としての蛍光検出装置
では、透過型回折格子を用いた従来の蛍光検出装置とは
異なり、反射型回折格子である凹面ホログラフィックグ
レーティング３７を用いているので、回折効率がよく、
従来の蛍光検出装置に比べて冷却ＣＣＤ３９の検出信号
のＳ／Ｎを向上させることができる。また、結像特性が
よいことから、隣接する分析流路４３間のクロストーク
を低減することができる。

【００２６】図１では、一実施例としての蛍光検出装置
を電気泳動装置に適用しているが、本発明はこれに限定
されるものではなく、蛍光検出を行なう他の装置にも適
用できるし、蛍光検出装置単体として用いることもでき
る。例えば、サンプルを収容するための複数の凹部が配
列されたマイクロタイタープレート用の蛍光検出装置と
して用いることができる。

【００２７】本発明にかかる蛍光検出装置の構成は図１
に示すものに限定されるものではない。すなわち、第１
の光学系は検出領域からの光をスリットの穴に結像する
ことができ、第２の光学系は少なくとも反射型回折格子
を備え、スリットの穴からの光を分光し、検出素子に結
像することができる構成であればどのような構成であっ
てもよい。また、光源を含む励起光を照射する光学系は
どのような構成であってもよく、例えば光源としてＬＥ
Ｄ（Light Emitting Diode）を用いてもよい。

【００２８】また、図１に示した蛍光検出装置では、第
２の光学系として反射型凹面格子である凹面ホログラフ
ィックグレーティングのみを用いているが、本発明を構
成する第２の光学系はこれに限定されるものではなく、
凹面鏡と反射型平面格子の組み合わせであってもよい。
また、図１に示した蛍光検出装置では、検出領域に励起
光を照射する光学系として、ビームスキャニング素子を
用いて検出領域内で励起光を走査するものを用いている
が、本発明はこれに限定されるものではなく、検出領域
内にライン状の励起光を照射する光学系や、チップデバ
イスの側面から検出領域に励起光を照射する光学系な
ど、検出領域に励起光を照射できる光学系であればどの
ような光学系であってもよい。

【００２９】

【発明の効果】本発明の蛍光検出装置では、検出領域か
らの光をスリットの穴に結像する第１の光学系と、少な
くとも反射型回折格子を備え、スリットの穴からの光を
分光し、検出素子に結像する第２の光学系とを備え、透
過型回折格子に比較して回折効率が高い反射型回折格子
により検出領域からの光を分光するようにしたので、検
出素子の検出信号について高いＳ／Ｎを実現できる。さ
らに、複数の検出位置にまたがる検出領域で蛍光検出を
行なう場合であっても、反射型回折格子の高い結像特性
により、クロストークを低減することができる。

【００３０】本発明にかかる蛍光検出装置において、反
射型回折格子として反射型凹面格子を備え、第２の光学
系は反射型凹面格子のみによって構成されているように
すれば、装置の構成を簡単にすることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明にかかる蛍光検出装置の一実施例を備え
た電気泳動装置を示す斜視図である。

【図２】図１の電気泳動装置に装着されるチップデバイ
スを表す図であり、（Ａ）は一方の基板の上面図、
（Ｂ）は他方の基板の上面図、（Ｃ）は両基板を重ね合
わせた状態での上面図、（Ｄ）は（Ｃ）の円で囲まれた
部分を拡大して示す上面図、（Ｅ）は（Ｃ）の分析流路
部分を示す断面図である。

【図３】チップデバイスを用いた電気泳動装置に適用さ
れた従来の蛍光検出装置を示す斜視図である。

【符号の説明】

１チップデバイス３チップデバイス保持台５ペルチエ式温調機構７ファン９泳動チャンバー蓋１１ポリマー充填ポート１３ポリマー充填用シリンジ１５電極１７高電圧供給部１９励起光源レーザ装置２１ビームエキスパンダ２３ビームスキャニング素子２５ダイクロイックミラー２７対物レンズ２９検出領域３１除去フィルター３３レンズ３５スリット３７凹面ホログラフィックグレーティング（反射
型凹面格子）３９冷却ＣＣＤ

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Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】検出領域内の蛍光を検出する蛍光検出装
置において、前記検出領域からの光をスリットの穴に結像する第１の
光学系と、少なくとも反射型回折格子を備え、前記スリットの穴か
らの光を分光し、検出素子に結像する第２の光学系とを
備えたことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項２】前記反射型回折格子として反射型凹面格
子を備え、前記第２の光学系は前記反射型凹面格子のみ
によって構成されている請求項１に記載の蛍光検出装
置。