WO2015125918A1 - 微小粒子測定装置 - Google Patents

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伊知郎 石丸
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Definitions

  • the present invention relates to a fine particle measuring apparatus used for a flow cytometer, a cell sorter, or the like.
  • a flow cytometer as one of the devices for analyzing the type, size, shape, structure, etc. of fine particles such as cells, microorganisms, and microbeads.
  • fine particles are flowed in a line in a flow path, and light is irradiated to the fine particles when the fine particles pass through a predetermined region.
  • the characteristic of this microparticle is optically measured by detecting the scattered light, fluorescence, etc. which are emitted from a microparticle (refer nonpatent literature 1).
  • cells labeled with a fluorescent dye are irradiated with excitation light such as laser light, and thereby the fluorescence emitted from the fluorescent dye is converted into a wavelength selection element such as a bandpass filter or a dichroic mirror. Detect through.
  • a wavelength selection element such as a bandpass filter or a dichroic mirror.
  • the number of wavelength selection elements and light receivers corresponding to the number of fluorescent wavelength bands to be measured are required. Therefore, when the number of fluorescent wavelength bands increases, the number of wavelength selection elements and light receivers increases correspondingly, and an optical path from the wavelength selection elements to the light receivers must be secured accordingly, resulting in an increase in the size of the apparatus.
  • the combination of the excitation light wavelength band and the fluorescence wavelength band is determined for each fluorescent dye, usually, by selecting a fluorescent dye whose excitation light wavelength does not overlap with the fluorescence wavelength band of another fluorescent dye, The fluorescence emitted from each fluorescent dye is separated from the excitation light of another fluorescent dye as well as its own excitation light.
  • the fluorescence wavelength band of one fluorescent dye and the excitation wavelength band of another fluorescent dye may overlap, making it difficult to separate and detect only the fluorescence intensity.
  • the microparticles are flowed in a line in a single flow path, and light is irradiated to individual microparticles that pass through a predetermined detection region. Processing capacity is low. Although it is conceivable to increase the flow rate of the microparticles flowing in the flow path in order to increase the processing capability, there is a limit to increasing the flow rate because the microparticles are damaged or destroyed as the flow rate increases.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a microparticle measuring apparatus capable of simultaneously measuring the optical characteristics of a plurality of microparticles at high speed.
  • the fine particle measuring apparatus of the present invention made to solve the above problems is a) a translucent sample container for holding a sample containing fine particles; b) a light irradiation means for irradiating the sample held in the sample container with linear light; c) a splitting optical system that splits the measurement light emitted from the microparticles irradiated with the light from the light irradiation means into a first measurement light and a second measurement light; d) optical path length difference providing means for providing an optical path length difference between the first measurement light and the second measurement light; e) a cylindrical lens that collects and interferes with the first measurement light and the second measurement light on the same straight line; f) a detector for detecting a longitudinal intensity distribution of the interference light of the first measurement light and the second measurement light; g) A processing unit that obtains an interferogram of light emitted from the microparticles based on the intensity distribution of the interference light detected by the detection unit, and obtains a spectrum by Fourier transforming the inter
  • the splitting optical system includes a first transmission part whose incident surface and output surface are parallel, and an incident surface and output which are arranged side by side with the first transmission part. Emitted from an optical member having a wedge-shaped second transmitting portion whose other surface is inclined with respect to one of the surfaces, a non-transmitting portion that does not transmit light, and fine particles irradiated with light from the light irradiation means
  • the measurement light to be converted into parallel rays is made incident on both the incident surface of the first transmission part and the incident surface of the second transmission part, and the light that has passed through the sample container as the light from the light irradiation means
  • the division prevention unit is configured by the non-transmission part
  • the optical path length difference provision unit is configured by the first transmission unit and the optical transmission unit. It is comprised from a 2nd permeation
  • the splitting optical system is configured such that the entrance surface and the exit surface are parallel to each other, and the entrance surface in which the entrance surface and the exit surface are arranged side by side.
  • An optical element that is collimated into light and incident on both the incident surface of the first transmissive portion and the incident surface of the second transmissive portion, and the division preventing means includes the incident surface of the first transmissive portion and It can comprise from the filter which interrupts
  • the optical path length difference providing unit includes the first transmission unit and the second transmission unit.
  • the light (excitation light) emitted from the light irradiation means applied to the sample held in the sample container passes without hitting the fine particles, and the light generated by the interaction between the fine particles and the excitation light.
  • Light having the same wavelength as that of the excitation light is blocked by the filter, and light having a wavelength different from that of the excitation light, such as Raman scattered light or fluorescence, passes through the filter and enters the first transmission part and the second transmission part. . Therefore, in the above configuration, the light transmitted from the microparticles and transmitted through the first transmission part is the first measurement light, and the light transmitted through the second transmission part is the second measurement light.
  • the filter examples include an edge filter (short-pass filter, long-pass filter) that blocks light on a longer wavelength side than a specific wavelength or light on a short wavelength side, a notch filter that blocks light in a specific wavelength range, and a specific wavelength. Any one or a combination of bandpass filters that transmit light in a range can be used.
  • the split optical system includes a first reflective surface having a first non-reflective region and a second reflective surface having a second non-reflective region. Reflective optical member and measurement light emitted from microparticles irradiated with light from the light irradiating means are converted into parallel rays and divided and incident on both the first reflecting surface and the second reflecting surface, An optical element that makes the light from the light irradiation means that has passed through the sample container incident on the first non-reflective region and the second non-reflective region, and in this case, The division preventing means includes the first non-reflective region and the second non-reflective region.
  • the optical path length difference providing unit may be configured by a moving unit that relatively moves the first reflecting surface and the second reflecting surface, and the optical path length difference providing unit may include the first reflecting surface and the second reflecting surface. It can be realized by tilting either one with respect to a plane perpendicular to the optical axis of the measurement light. In this case, the measurement light reflected by the first reflection unit becomes the first measurement light, and the measurement light reflected by the second reflection unit becomes the second measurement light.
  • the light irradiated to the sample from the light irradiation means is preferably light having a width substantially the same as the size of the fine particles.
  • the sample container may be configured to include a measurement flow path in which a plurality of flow paths having a size that flows in a state where the fine particles are arranged one by one are arranged in parallel.
  • the light irradiating means irradiates linear light to a linear region extending over a plurality of measurement channels.
  • the sample container may be constituted by a disc-shaped holding plate having an upper surface to which a sample containing fine particles is applied, and a rotating means for rotating the holding plate about the center of the disc may be provided.
  • the light irradiation means may irradiate light on a linear region extending in the radial direction from the rotation center of the holding plate toward the outer peripheral edge. According to such a structure, light can be irradiated to the whole sample apply
  • the sample held in the sample container is irradiated with linear light, and thus a plurality of microparticles existing in the irradiation region are irradiated with light collectively. Can do.
  • the light transmitted from the light irradiation means and transmitted through the sample container is prevented from being divided by the splitting optical system, only the measurement light emitted from each of the plurality of microparticles is used as the first measurement light and the second measurement light.
  • the intensity distribution of the interference light of the first and second measurement lights can be detected by dividing the measurement light.
  • the detected intensity distribution of the interference light of the first and second measurement lights obtains an interferogram, and a spectrum is obtained by Fourier transforming the interferogram. Therefore, in the present invention, the optical characteristics of a plurality of fine particles can be measured simultaneously and at high speed.
  • the microparticle measurement apparatus In the microparticle measurement apparatus according to the first aspect of the present invention, light such as scattered light and fluorescence emitted from the microparticles is converted into parallel rays by the optical element and continuously transmitted through the first transmission unit and the second transmission unit. The optical path length difference is given. Then, the light is condensed on the same straight line by the cylindrical lens, and the intensity distribution in the longitudinal direction of the interference light is detected by the detection unit. Therefore, an interferogram is obtained from the intensity distribution, and the spectrum of light emitted from the microparticles can be obtained by Fourier transforming the interferogram.
  • the light transmitted from the light irradiating means, the light transmitted through the sample container, and the light emitted from the microparticles in the sample from the light irradiating means Light of the same wavelength is removed by the filter. For this reason, light having a wavelength different from that of light emitted from the light irradiation means, such as Raman scattered light and fluorescence, can be detected with high sensitivity.
  • light such as scattered light and fluorescence emitted from the microparticles is collimated by the optical element, reflected by the first reflecting surface and the second reflecting surface, and the optical path length.
  • a continuous optical path length difference is given by the difference giving means. Then, since the light is condensed on the same straight line by the cylindrical lens and the intensity distribution of the interference light is detected by the detection unit, an interferogram is obtained from the intensity distribution, and the interferogram is subjected to Fourier transform to obtain a microparticle. The spectrum of the light emitted from can be obtained.
  • the light transmitted through the sample container out of the light irradiated from the light irradiation means is incident on the first non-reflective region and the second non-reflective region, and therefore is not reflected by the first and second reflective surfaces. . Therefore, the light from the light irradiation means that passes through the sample container as it is without being irradiated to the microparticles is not detected by the detection unit, and only the spectrum of the light emitted from the microparticles is obtained. Can do. Thus, in the third aspect of the present invention, only the spectrum of the light emitted from the microparticles can be obtained. Therefore, means for separating the light emitted from the microparticles for each wavelength, excitation light and fluorescence A means for separating is not required, and an increase in size of the apparatus can be suppressed.
  • FIG. It is an optical path explanatory drawing of excitation light, (a) is a top view, (b) is a perspective view, (c) is a side view. It is optical path explanatory drawing of the light (measurement light) emitted from the microparticle, Comprising: (a) is a top view, (b) is a perspective view, (c) is a side view.
  • FIG. 5 is a diagram schematically showing a microparticle measuring apparatus according to a third embodiment of the present invention, where (a) is a top view, (a-1) is a front view of the first reflecting surface, and (a-2) is a top view.
  • the front view of a 2nd reflective surface, (b) is a side view which abbreviate
  • FIG. 4 is an explanatory diagram of an optical path of excitation light, where (a) is a top view, (a-1) is a front view of the first reflecting surface, (a-2) is a front view of the second reflecting surface, and (b) is a cylindrical surface.
  • FIG. 1 shows a schematic configuration diagram of a microparticle measuring apparatus according to a first embodiment of the present invention.
  • 1A is a top view and FIG. 1B is a side view.
  • This optical characteristic measuring apparatus includes a light source 10, a cylindrical lens 12, a multi-channel 14, an objective lens 16, a transmission phase shifter 18, a cylindrical lens 20 as an imaging lens, and a two-dimensional array device 22 such as a two-dimensional CCD camera. (Corresponding to the detection unit of the present invention).
  • the multi-channel 14 corresponds to the sample container of the present invention, and is composed of a rectangular plate 142 having a plurality of channels 141 having a fine width as shown in FIG.
  • the width of each channel 141 is set to an appropriate value according to the size of the target microparticle.
  • the plurality of channels 141 are parallel to each other, and one detection window 143 is formed in each channel 141.
  • the detection window 143 is formed of a light-transmitting material such as glass or plastic.
  • the detection windows 143 of the plurality of flow paths 141 are located on the same straight line, and the light from the light source 10 is collected by the cylindrical lenses 12 on the plurality of detection windows 143 so that the cylindrical lenses 12 and the multi-flow paths 14 are collected.
  • the arrangement is set. As described above, in this embodiment, linear light is irradiated to the multi-channel 14, and the light source 10 and the cylindrical lens 12 constitute light irradiation means.
  • a sample supply unit (not shown) for supplying a liquid sample containing microparticles in the flow channel 141 is disposed upstream of the multi-flow channel 14.
  • the sample supply unit introduces the sheath liquid together with the sample containing the microparticles so that a laminar flow maintained at a constant flow rate is formed in each channel 141 of the multi-channel 14.
  • the two-dimensional array device 22 is composed of, for example, a two-dimensional CCD camera, and is arranged so that the light receiving surface of the two-dimensional array device 22 is positioned on the imaging surface of the cylindrical lens 20.
  • the detection signal of the two-dimensional array device 22 is input to the processing unit 24.
  • the processing unit 24 obtains an interferogram from the detection signal from the two-dimensional array device 22. This interferogram is mathematically Fourier-transformed by the calculation unit 26, and as a result, spectral characteristics (spectrum) that is relative intensity for each wavelength of the measurement light are obtained.
  • the transmission type phase shifter 18 is composed of a substantially rectangular plate-like optical member as a whole having a first transmission part 181 and a second transmission part 182 which are transmission type optical members.
  • the first transmission part 181 is made of an optical member having a constant thickness with the entrance surface and the exit surface parallel to each other.
  • the second transmissive portion 182 has a wedge-shaped optical member having an incident surface that is inclined with respect to the incident surface of the first transmissive portion 181 and an output surface that is flush with the output surface of the first transmissive portion 181. Consists of.
  • the incident surface of the second transmission part 182 is such that the thickness of the second transmission part 182 at the boundary surface between the first transmission part 181 and the second transmission part 132 gradually decreases from one side to the other side. It is inclined to become.
  • the inclination angle of the incident surface of the second transmission unit 182 is determined by the phase shift amount determined by the wave number resolution and the sampling interval for each pixel of the two-dimensional array device 22, but there is no problem even if they are slightly shifted.
  • the 1st transmission part 181 and the 2nd transmission part 182 may each be comprised from another optical member, and the 2nd transmission part 182 in which the incident surface inclines by processing the lower half part of a rectangular plate-shaped optical member. It is also good.
  • a light shielding plate 30 is disposed in the vicinity of the boundary on the incident surface side of the first transmission part 181 and the second transmission part 182 of the transmission type phase shifter 18.
  • the light shielding plate 30 has a very small width of several mm to several tens of ⁇ m that covers the vicinity of the boundary between the first transmission part 181 and the second transmission part 182, and is formed of a member that does not transmit light from the light source 10. .
  • the light shielding plate 30 corresponds to the division preventing means (non-transmissive portion) of the present invention.
  • FIGS. 3 and 4 an optical path of light (excitation light) emitted from the light source toward the cylindrical lens 12 will be described with reference to FIGS. 3 and 4 in which the light shielding plate 30 is removed from the measurement apparatus.
  • the light emitted from the light source 10 and incident on the cylindrical lens 12 is collected on the detection window 143 of the multi-channel 14.
  • a measurement light beam such as fluorescence or scattered light is emitted from the microparticles P (see FIG. 2) passing through the detection window 143, and the measurement light beam is incident on the objective lens 16 and then converted into a parallel light beam so as to be a transmission type phase.
  • the light enters the first transmission part 181 and the second transmission part 182 of the shifter 18.
  • a part of the light incident on the detection window 143 passes through the flow path 141 as it is without hitting the fine particles and enters the objective lens 16.
  • the light incident on the objective lens 16 is condensed near the boundary between the first transmission part 181 and the second transmission part 182 by the objective lens 16, and then transmitted through the first transmission part 181 and the second transmission part 182 to be diffused light.
  • Is incident on the cylindrical lens 20 As a result, it is incident on the light receiving surface as diffuse light having a width without being condensed by the cylindrical lens 20 (see FIG. 3). Therefore, the objective lens 16 corresponds to the optical element of the present invention.
  • the measurement light beam transmitted through the first transmission unit 181 and the second transmission unit 182 enters the cylindrical lens 20 as the first measurement light beam and the second measurement light beam, respectively.
  • the incident surface and the exit surface of the first transmission unit 181 are parallel, the first measurement light beam incident on the cylindrical lens 20 is collinear with the light receiving surface of the two-dimensional array device 22 in phase.
  • the incident surface of the second transmission part 182 is inclined with respect to the exit surface, the second measurement light beam is incident on the cylindrical lens 20 with its wavefront inclined along the incident surface. Also on the light receiving surface of the two-dimensional array device 22, the light is condensed on the same straight line with the wave front inclined (see FIG. 4). In FIG.
  • the measurement light emitted from the microparticles and the other light are incident on the light receiving surface of the two-dimensional array device 22 without being separated.
  • FIG. 7 is a diagram showing the spectral relative intensity and spectral absorption characteristics of the fine particles (component A to component C) measured by the measuring apparatus.
  • the spectral relative intensity has been described above, the spectral absorption characteristics can be similarly obtained.
  • FIG. 8 shows an example of a spectroscopic measurement result obtained based on signals from the pixels 1 to n of the two-dimensional array device respectively corresponding to the detection windows (1 to n) of the multi-channel.
  • the spectral relative intensity or / and spectral absorption characteristics of each component are stored in advance in the storage unit 28 in association with the type of component, and the spectral measurement result and storage unit of each pixel of the two-dimensional light receiving device 22 are stored. From the comparison with the spectral relative intensity stored in 28, the component that has passed through each detection window 143 is specified.
  • FIG. 9 is a diagram showing a schematic configuration of a microparticle measuring apparatus according to the second embodiment of the present invention.
  • the second embodiment is different from the first embodiment in the arrangement of the light source 10 and the cylindrical lens 12 with respect to the multi-channel 14.
  • the optical path from the multi-channel 14 to the objective lens 16 and the transmissive phase shifter 18 and the optical path from the light source 10 to the multi-channel 14 through the cylindrical lens 12 intersect each other.
  • a light source 10 and a cylindrical lens 12 are disposed.
  • the light that has passed through the multi-channel 14 without hitting the fine particles out of the light that has entered the multi-channel 14 from the light source 10 through the cylindrical lens 12 does not enter the objective lens 16. Accordingly, it is possible to prevent light other than the measurement light emitted from the microparticles from entering the transmissive phase shifter 18.
  • the reflection type phase shifter 50 is disposed at the subsequent stage of the objective lens 16 and includes a beam splitter 51, a first reflection surface 52, and a second reflection surface 53.
  • the side surface of the beam splitter 51 that faces the incident surface is slightly inclined with respect to the incident surface, and the first reflecting surface 52 is provided on the inclined side surface.
  • a second reflecting surface 53 is provided on a side surface located between the incident surface of the beam splitter 51 and the first reflecting surface 52.
  • the first reflecting surface 52 and the second reflecting surface 53 are formed by evaporating a metal film or the like on the side surface of the beam splitter 51, for example.
  • the first reflecting surface 52 is vertically divided into two, and a first non-reflecting region 521 is formed between the upper reflecting surface and the lower reflecting surface.
  • the second reflecting surface 53 is also divided into upper and lower portions, and a second non-reflecting region 531 is formed between the upper reflecting surface and the lower reflecting surface.
  • non-reflective areas 521 and 531 are formed by not depositing a metal film or the like on the side surface of the beam splitter 51, and the light beam incident on the non-reflective areas 521 and 531 passes through the non-reflective area.
  • the measurement apparatus In the measurement apparatus, light emitted from a light source (not shown) and incident on the cylindrical lens 12 is collected on the detection window 143 of the multi-channel 14. As a result, the sample solution passing through the plurality of detection windows 143 is irradiated with linear light, and as a result, measurement light such as fluorescence and scattered light is emitted from the microparticles P (see FIG. 2).
  • the measurement light is incident on the objective lens 16, converted into parallel rays, and incident on the beam splitter 51 of the reflective phase shifter 50. Part of the measurement light incident on the beam splitter 51 (first measurement light) is transmitted through the joint surface of the beam splitter 51 toward the first reflection surface 52, and the rest (second measurement light) is transmitted from the beam splitter 51.
  • the first measurement light directed toward the first reflecting surface 52 is reflected by the first reflecting surface 52, is then reflected again by the joint surface of the beam splitter 51, and enters the cylindrical lens 20.
  • the second measurement light directed toward the second reflecting surface 53 is reflected by the second reflecting surface 53, then passes through the joint surface of the beam splitter 51 and enters the cylindrical lens 20. Since the first reflection surface 52 is inclined, the first measurement light incident on the cylindrical lens 20 is condensed on a straight line with the wave front inclined on the light receiving surface of the two-dimensional array device 22.
  • the second measurement light incident on the cylindrical lens 20 is collinear with the first measurement light beam in a state where the phase is aligned with the light receiving surface of the two-dimensional array device 22 because the second reflecting surface 53 is not inclined. Condensate.
  • a part of the light incident on the detection window 143 passes through the flow path 141 as it is without hitting the fine particles, enters the objective lens 16, and enters the beam splitter 51.
  • the light that has passed through the objective lens 16 from the light source through the detection window 143 is condensed in the first non-reflective region 521 of the first reflective surface 52 and the second non-reflective region 531 of the second reflective surface 53.
  • the position of the joint surface of the beam splitter 51 of the reflection type phase shifter 50 is set.
  • a part of the light from the light source that is transmitted through the detection window 143 as it is and incident on the objective lens 16 is transmitted through the joint surface of the beam splitter 51, passes through the first non-reflective region 521, and the first reflective surface. Exit 52. Further, part of the light from the light source that is transmitted through the detection window 143 as it is and incident on the objective lens 16 is reflected by the joint surface of the beam splitter 51 and passes through the second non-reflective region 531 to be second reflected. It escapes behind the surface 53. For this reason, only the measurement light emitted by the fine particles is directed to the cylindrical lens 20 and is detected by the two-dimensional light receiving device 22 as in the first embodiment.
  • FIG. 12 shows the overall configuration of a microparticle measuring apparatus according to the fourth embodiment of the present invention.
  • This embodiment is characterized in that a disk-shaped sample container 60 is used.
  • the sample container 60 is formed of a light-transmitting member such as plastic or glass, and is configured to be rotated by a drive motor (not shown).
  • a sample containing fine particles is applied to the upper surface of the sample container 60.
  • a multi-condensing illumination 62 is disposed below the sample container 60, and irradiates linear light to a region extending in the radial direction from the center of the lower surface of the sample container 60.
  • a measuring device 64 that measures scattered light emitted from microparticles in the sample applied to the upper surface of the sample container 60 is disposed on the upper part of the sample container 60.
  • the measurement device 64 includes an objective lens, first and second transmission parts, a cylindrical lens, and a detection part as described in the first embodiment, for example, and can measure the spectral characteristics of scattered light.
  • the fourth embodiment is suitable as a device for detecting malaria parasite-infected erythrocytes contained in blood, for example.
  • Malaria is one of the infectious diseases developed by overseas travelers, and is a disease in which malaria parasites invade the body through an anopheles vector.
  • malaria parasite-infected erythrocytes are detected, but in the early stage of infection, the ratio of infected erythrocytes in the total erythrocytes is very low, about 1-2%, and is difficult to detect.
  • the mortality rate increases as the proportion of infected red blood cells increases, detection of infected red blood cells in the early diagnosis of infection is desired.
  • the spectral characteristics of red blood cells contained in blood can be efficiently measured by applying blood to the upper surface of the sample container 60 in the form of a film having a thickness of about one red blood cell.
  • FIG. 13 shows an example of the result of measuring blood containing malaria parasite-infected erythrocytes with the measuring apparatus according to the present example.
  • FIG. 13 shows that specific light absorption, which is not found in normal erythrocytes, is observed in plasmodium-infected erythrocytes.
  • a microparticle measurement apparatus is a Raman analyzer that detects and quantifies fine particles by detecting Raman scattered light emitted from fine particles contained in a liquid sample.
  • a filter 70 is arranged on the incident surface side of the transmission phase shifter 18 instead of the light shielding plate 30 (see FIG. 1). Other configurations are the same as those of the first embodiment.
  • the filter 70 is disposed on the optical path between the objective lens 16 and the phase shifter 18, and faces the entire incident surface of the first transmission unit 181 and the second transmission unit 182 that constitute the phase shifter 18. It has a size and shape.
  • the light traveling from the detection window 143 of the multi-channel 14 through the objective lens 16 toward the first transmission unit 181 and the second transmission unit 182 enters the filter 70, and the light transmitted through the filter 70 is first transmitted.
  • the light enters the part 181 and the second transmission part 182.
  • the filter 70 is a notch filter that blocks light (excitation light) incident on the detection window 143 of the multi-channel 14 from the light source and transmits light of other wavelengths. For this reason, among the light emitted from the light source, the light having the same wavelength as that of the excitation light passing through the detection window 143 of the multi-channel 14 and the light emitted from the microparticles irradiated with the excitation light is blocked. Then, Raman scattered light having a wavelength different from that of the excitation light enters the phase shifter 18. As described above, the light emitted from the microparticles enters the incident surfaces of both the first transmission unit 181 and the second transmission unit 182 as scattered light having a width. Characteristics can be acquired.
  • Raman scattered light is a type of scattered light generated by the interaction between a substance and light. Most of the scattered light is Rayleigh scattered light having the same wavelength as the excitation light, but some of the scattered light includes Raman scattered light having a wavelength different from that of the excitation light. Since the energy corresponding to the difference between the wavelength of the Raman scattered light and the wavelength of the excitation light reflects the energy of the natural vibration of the material, the material can be specified by obtaining the energy. Moreover, a substance can be quantified from the intensity of Raman scattered light. Therefore, if the Raman scattered light generated from the microparticles in the sample is detected by irradiating the sample with excitation light and the spectral characteristics thereof are acquired, the qualitative and quantitative determination of the microparticles can be performed. Since the Raman scattered light is very weak compared to the Rayleigh scattered light and the excitation light, the detection sensitivity of the Raman scattered light can be increased by removing the excitation light and the Rayleigh scattered light by the filter 70.
  • a laser light source that emits monochromatic light for example, a solid-state laser such as a YAG laser or a YVO4 laser, or a gas laser such as an Ar laser is preferable.
  • a two-dimensional array device 22 composed of the CCD camera shown in the first embodiment a two-dimensional array device composed of a photomultiplier tube can be used as the detector.
  • a notch filter is used as the filter 70, but an edge filter may be used.
  • an edge filter (long-pass filter) that transmits light on the longer wavelength side than the lower limit value of the wavelength band of Raman scattered light and an edge filter that transmits light on the shorter wavelength side than the upper limit value of the wavelength band of Raman scattered light ( The excitation light may be removed by using a combination of a short pass filter.
  • microparticle measuring apparatus is also applied to a fluorescence spectroscopic measuring apparatus that performs qualitative and quantitative determination of microparticles based on spectral characteristics of fluorescence emitted from microparticles in a sample when irradiated with excitation light.
  • Fluorescence emission refers to a phenomenon in which when a substance is irradiated with excitation light of a specific wavelength, energy that has absorbed the energy of excitation light is released as light when returning from the excited state to the ground state.
  • the substance can be specified by obtaining the fluorescence wavelength, and the substance can be quantified from the fluorescence intensity. it can. Therefore, when the sample contains cells or microorganisms labeled with a fluorescent dye, minerals that have a fluorescent emission action, etc., the fluorescence generated from the microparticles in the sample is detected by irradiating the sample with excitation light, and the spectrum is detected. If the characteristics are acquired, the qualitative and quantitative determination of the fine particles can be performed. Since the fluorescence wavelength is generally longer than the excitation wavelength, the sensitivity of fluorescence detection can be increased by using an edge filter (long pass filter) that blocks light on the shorter wavelength side than the excitation wavelength as the filter 70.
  • edge filter long pass filter
  • the present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications can be made.
  • the light from the light source 10 is converted into linear light by the cylindrical lens 12, but the light from the light source is converted into linear light by using a concave mirror instead of the cylindrical lens. You may make it convert into.
  • an optical member such as a cylindrical lens or a concave mirror that collects light from the light source on the detection window 143 is not essential.
  • an area other than the detection window 143 of the multi-channel 14 is used. May be shielded so that light from the light source 10 does not enter the region.
  • a light source that emits linear light having a shape equivalent to that of the detection window 143 may be used.
  • FIG. 15A shows a vertical side view of the multi-channel 14 used in the first to fifth embodiments
  • FIG. 15B shows a vertical side view of the multi-channel 14A according to the modification.
  • the light incident side end surface of the partition member 145 that divides the inside into a plurality of channels 141 is a flat surface, but in the multi-channel 14A, the incident side of the partition member 145A The end surface is curved. Due to such a difference in configuration, scattered light generated when the incident light hits the end face of the partition member 145A is reduced in the multi-channel 14A compared to the multi-channel 14.
  • the filter 70 may be disposed on the optical path between the reflective phase shifter 50 and the objective lens 16.
  • the non-reflective areas 521 and 531 provided on the first reflecting surface 52 and the second reflecting surface 53 can be omitted.
  • a microparticle measuring device has been described. However, a means for sorting microparticles contained in a sample for each spectral characteristic and a microparticle after sorting are classified after each microparticle measuring device. If a means to take is provided, it can be configured as a flow cytometer or a cell sorter.
  • SYMBOLS 10 Light source 12 ... Cylindrical lens 14 ... Multi flow path 141, 141A ... Flow path 142 ... Plate 143 ... Detection window 16 ... Objective lens 18 ... Transmission type phase shifter 181 ... 1st transmission part 182 ... 2nd transmission part 20 ... Cylindrical Lens (imaging lens) DESCRIPTION OF SYMBOLS 22 ... Two-dimensional light receiving device 24 ... Processing part 26 ... Operation part 28 ... Memory

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Abstract

本発明の課題は、複数の微小粒子の光学的特性を同時に且つ高速で測定することができる微小粒子測定装置を提供することである。本発明の微小粒子測定装置では、マルチ流路（１４）の各流路に試料を流し、所定の直線領域に光を照射する。このとき、試料中の微小粒子から発する散乱光や蛍光等の測定光（物体光）は対物レンズ（１６）によって平行光線化され、第１透過部（１８１）と第２透過部（１８２）を透過する。両者を透過した光はそれぞれ第１測定光と第２測定光としてシリンドリカルレンズ（２０）によって同一直線上に集光され、その干渉光強度が検出器（２２）で検出される。一方、試料中の微小粒子に当たることなくマルチ流路（２２）を透過した光源からの光は、対物レンズ（１６）を経て非透過部（３０）に入射し、シリンドリカルレンズに向かうことはない。従って、検出器（２２）には、測定光の干渉光のみが入射するため、精度良く測定光の干渉光強度を測定することができる。

Description

微小粒子測定装置
　本発明は、フローサイトメーターやセルソーター等に用いられる微小粒子測定装置に関する。
　細胞や微生物、マイクロビーズ等の微小粒子の種類や大きさ、形状、構造等を解析する装置の一つにフローサイトメーターがある。フローサイトメーターでは、流路内に微小粒子を一列に整列させた状態で流し、所定の領域を微小粒子が通過する際に該微小粒子に光を照射する。そして、微小粒子から発せられる散乱光や蛍光等を検出することによって該微小粒子の特性を光学的に測定する（非特許文献１参照）。
　例えば細胞から発せられる蛍光を検出する場合は、蛍光色素で標識した細胞にレーザ光等の励起光を照射し、これにより蛍光色素から発せられた蛍光をバンドパスフィルタやダイクロイックミラー等の波長選択素子を通して検出する。このとき、選択波長帯の異なる複数の波長選択素子を用い、各波長選択素子によって選択された光を別個の受光器で検出するようにすれば、波長帯の異なる複数の蛍光を測定することができる。したがって、細胞の種類毎に異なる蛍光波長帯の蛍光色素で標識すれば、細胞の種類毎の光学的特性を測定することができる。
"サイトメトリー"、[online]、ベックマンコールター（Beckman Coulter）、[平成２５年９月３０日検索]、インターネット<URL:http://www.bc-cytometry.com/cytometry.html>
　上記従来の方法においては、測定対象となる蛍光波長帯の数に応じた数の波長選択素子や受光器が必要である。そのため、蛍光波長帯の数が増えるとその分、波長選択素子や受光器の数が増え、それに伴い波長選択素子から受光器までの光路を確保しなければならず、装置が大型化する。
　また、蛍光色素毎に励起光波長帯と蛍光波長帯の組み合わせが決まっているため、通常は、励起光波長が別の蛍光色素の蛍光波長帯と重複しないような蛍光色素を選択することにより、各蛍光色素から発せられる蛍光を、それ自身の励起光はもちろん、別の蛍光色素の励起光とも分離している。ところが、測定対象となる蛍光色素が増えると、ある蛍光色素の蛍光波長帯と別の蛍光色素の励起波長帯が重複する場合があり、蛍光強度のみを分離して検出することが難しくなる。
　さらに、従来のフローサイトメーターでは、１個の流路内に微小粒子を一列に整列させた状態で流し、所定の検出領域を通過する個々の微小粒子に対して光を照射しているため、処理能力が低い。処理能力を上げるために流路内を流れる微小粒子の流速を上げることが考えられるが、流速が大きくなるほど微小粒子が傷ついたり破壊したりするため、流速の高速化には限界がある。
　本発明が解決しようとする課題は、複数の微小粒子の光学的特性を同時に且つ高速で測定することができる微小粒子測定装置を提供することである。
　上記課題を解決するために成された本発明の微小粒子測定装置は、
　a) 微小粒子を含む試料を保持する透光性を有する試料容器と、
　b) 前記試料容器に保持された試料に対して直線状の光を照射する光照射手段と、
　c) 前記光照射手段からの光が照射された微小粒子から発せられる測定光を第１測定光と第２測定光に分割する分割光学系と、
　d) 前記第１測定光と前記第２測定光の間に光路長差を付与する光路長差付与手段と、
　e) 前記第１測定光と前記第２測定光を同一直線上に集光させて干渉させるシリンドリカルレンズと、
　f) 前記第１測定光と前記第２測定光の干渉光の長手方向の強度分布を検出する検出部と、
　g) 前記検出部で検出される前記干渉光の強度分布に基づき前記微小粒子から発せられた光のインターフェログラムを求め、このインターフェログラムをフーリエ変換することによりスペクトルを取得する処理部と
　を備え、
　前記光照射手段からの光であって前記試料容器を透過した光が前記分割光学系により分割されることを阻止する分割阻止手段を備えることを特徴とする。
　本発明の第１態様の微小粒子測定装置においては、前記分割光学系を、入射面及び出射面が平行な第１透過部と、該第１透過部と並んで配置された、入射面及び出射面のうちの一方に対して他方が傾斜するくさび形の第２透過部と、光を透過させない非透過部とを有する光学部材と、前記光照射手段からの光が照射された微小粒子から発せられる測定光を平行光線化して前記第１透過部の入射面及び前記第２透過部の入射面の両方に入射させ、前記光照射手段からの光であって前記試料容器を通過した光を前記非透過部に入射させる光学素子とを備えて構成することができ、この場合、前記分割阻止手段が、前記非透過部から構成され、前記光路長差付与手段が、前記第１透過部及び前記第２透過部から構成される。
　上記構成においては、前記第１透過部を透過した測定光が第１測定光となり、前記第２透過部を透過した測定光が第２測定光となる。
　また、本発明の第２態様の微小粒子測定装置においては、前記分割光学系を、入射面及び出射面が平行な第１透過部と、該第１透過部と並んで配置された、入射面及び出射面のうちの一方に対して他方が傾斜するくさび形の第２透過部とを有する光学部材と、前記光照射手段からの光が照射されることにより前記微小粒子から発せられる測定光を平行光線化して前記第１透過部の入射面及び前記第２透過部の入射面の両方に入射させる光学素子とを備えて構成し、前記分割阻止手段を、前記第１透過部の入射面及び前記第２透過部の入射面と前記光学素子との間に配置された前記光照射手段からの光を遮断するフィルタから構成することができる。この場合、前記光路長差付与手段は、前記第１透過部及び前記第２透過部から構成される。
　上記構成においては、試料容器に保持された試料に照射された光照射手段からの光（励起光）のうち微小粒子に当たることなく通過した光、及び微小粒子と励起光の相互作用により発生する光のうち励起光の波長と同じ波長の光はフィルタで遮断され、励起光とは波長が異なる光、例えばラマン散乱光や蛍光はフィルタを通過して第１透過部及び第２透過部に入射する。従って、上記構成においては、微小粒子から発せられる光のうち第１透過部を透過した光が第１測定光となり、第２透過部を透過した光が第２測定光となる。
　前記フィルタとしては、特定波長よりも長波長側の光、或いは短波長側の光を遮断するエッジフィルタ（ショートパスフィルタ、ロングパスフィルタ）、特定の波長範囲の光を遮断するノッチフィルタ、特定の波長範囲の光を透過させるバンドパスフィルタのいずれか一つ、或いは複数を組み合わせて用いることができる。
　さらに、本発明の第３態様の微小粒子測定装置においては、前記分割光学系を、第１非反射領域を有する第１反射面と、第２非反射領域を有する第２反射面とを備えた反射型の光学部材と、前記光照射手段からの光が照射された微小粒子から発せられる測定光を平行光線化して前記第１反射面及び前記第２反射面の両方に分割して入射させ、前記光照射手段からの光であって前記試料容器を通過した光を前記第１非反射領域及び前記第２非反射領域に入射させる光学素子とを備えて構成することができ、この場合、前記分割阻止手段は、前記第１非反射領域及び前記第２非反射領域から構成される。
　また、前記光路長差付与手段は、前記第１反射面及び前記第２反射面を相対的に移動させる移動手段から構成しても良く、前記第１反射面及び前記第２反射面のうちのいずれか一方を測定光の光軸に垂直な面に対して傾斜させることで実現することができる。
　この場合、前記第１反射部で反射された測定光が第１測定光となり、前記第２反射部で反射された測定光が第２測定光となる。
　光照射手段から試料に対して照射される光は、微小粒子の大きさとほぼ同じ幅を有する光が好ましい。
　試料容器は、前記微小粒子が１個ずつ並んだ状態で流れる大きさの複数の流路を並列に配置して成る測定用流路を備えた構成とすることができる。このとき、光照射手段は、複数の測定用流路にまたがる直線状の領域に対して直線状の光を照射することが好ましい。
　また、試料容器を、微小粒子を含む試料が塗布される上面を有する円板状の保持板から構成し、円板の中心を軸に前記保持板を回転させる回転手段を設けても良い。このとき、光照射手段は、前記保持板の回転中心から外周縁部に向かって径方向に延びる直線上の領域に光を照射すると良い。このような構成によれば、回転手段によって保持板を１回転することにより、保持板の上面に塗布された試料の全体に光を照射することができる。
　本発明の微小粒子測定装置では、試料容器に保持された試料に対して直線状の光を照射するようにしたため、その照射領域に存在する複数の微小粒子に対してまとめて光を照射することができる。しかも、光照射手段からの光であって試料容器を透過した光が分割光学系によって分割されることを阻止したため、複数の微小粒子の各々から発せられる測定光のみを第１測定光と第２測定光に分割し、該第１及び第２測定光の干渉光の強度分布を検出することができる。検出された第１及び第２測定光の干渉光の強度分布は、インターフェログラムを求め、該インターフェログラムをフーリエ変換することによりスペクトルが取得される。従って、本発明では、複数の微小粒子の光学的特性を同時に且つ高速で測定することができる。
　本発明の第１態様の微小粒子測定装置では、微小粒子から発せられた散乱光や蛍光等の光は光学素子によって平行光線化され、第１透過部及び第２透過部を透過することによって連続的な光路長差が付与される。そして、シリンドリカルレンズによって同一直線上に集光され、検出部によって干渉光の長手方向の強度分布が検出される。従って、その強度分布からインターフェログラムを求め、該インターフェログラムをフーリエ変換することにより、微小粒子から発せられた光のスペクトルを求めることができる。このとき、光照射手段から照射された光のうち試料容器を透過した光は非透過部に入射するため、第１及び第２透過部を透過することが阻止される。従って、光照射手段からの光であって微小粒子に照射されることなくそのまま試料容器を通過した光が検出部で検出されることがなく、微小粒子から発せられた光のスペクトルのみを求めることができる。このように、本発明の第１態様では、微小粒子から発せられた光のスペクトルのみを求めることができるため、微小粒子から発せられた光を波長毎に分離する手段や、励起光と蛍光を分離する手段が不要となり、装置の大型化を抑えることができる。
　本発明の第２態様の微小粒子測定装置においては、光照射手段から照射された光のうち試料容器を透過した光、試料中の微小粒子から発せられた光のうち光照射手段からの光と同じ波長の光は、フィルタによって除去される。このため、微小粒子から発せられる光のうちラマン散乱光や蛍光等、光照射手段から照射される光とは波長が異なる光を高感度で検出することができる。
　本発明の第３態様の微小粒子測定装置では、微小粒子から発せられた散乱光や蛍光等の光は光学素子によって平行光線化され、第１反射面及び第２反射面で反射され、光路長差付与手段によって連続的な光路長差が付与される。そして、シリンドリカルレンズによって同一直線上に集光され、検出部によって干渉光の強度分布が検出されるため、その強度分布からインターフェログラムを求め、該インターフェログラムをフーリエ変換することにより、微小粒子から発せられた光のスペクトルを求めることができる。このとき、光照射手段から照射された光のうち試料容器を透過した光は第１非反射領域及び第２非反射領域に入射するため、第１及び第２反射面で反射されることがない。従って、光照射手段からの光であって微小粒子に照射されることなくそのまま試料容器を通過した光が検出部で検出されることがなく、微小粒子から発せられた光のスペクトルのみを求めることができる。このように、本発明の第３態様では、微小粒子から発せられた光のスペクトルのみを求めることができるため、微小粒子から発せられた光を波長毎に分離する手段や、励起光と蛍光を分離する手段が不要となり、装置の大型化を抑えることができる。
本発明の第１実施例に係る微小粒子測定装置を模式的に示す図であって、（ａ）は上面図、（ｂ）は側面図。 マルチ流路の全体構成図。 励起光の光路説明図であって、（ａ）は上面図、（ｂ）は斜視図、（ｃ）は側面図。 微小粒子から発せられた光（測定光）の光路説明図であって、（ａ）は上面図、（ｂ）は斜視図、（ｃ）は側面図。 励起光が途中で遮断される場合の励起光の光路説明図であって、（ａ）は上面図、（ｂ）は側面図。 励起光を途中で遮断される場合の測定光の光路説明図であって、（ａ）は上面図、（ｂ）は側面図。 本実施例の微小粒子測定装置による微小粒子の分光相対強度（蛍光強度）、および、分光吸光特性の測定結果のイメージ図。 画素毎の測定結果のイメージ図。 本発明の第２実施例に係る微小粒子測定装置を模式的に示す図であって、（ａ）は上面図、（ｂ）は側面図。 本発明の第３実施例に係る微小粒子測定装置を模式的に示す図であって、（ａ）は上面図、（ａ－１）は第１反射面の正面図、（ａ－２）は第２反射面の正面図、（ｂ）はシリンドリカルレンズ２０および２次元アレイデバイス２２を省略して示す側面図、（ｂ－１）は第１反射面の正面図。 励起光の光路説明図であって、（ａ）は上面図、（ａ－１）は第１反射面の正面図、（ａ－２）は第２反射面の正面図、（ｂ）はシリンドリカルレンズ２０および２次元アレイデバイス２２を省略して示す側面図、（ｂ－１）は第１反射面の正面図。 本発明の第４実施例に係る微小粒子測定装置の斜視図。 測定結果を示す図であり、（ａ）は近赤外画像、（ｂ）は干渉強度像、（ｃ）は可視画像、（ｄ）は散乱光スペクトル。 本発明の第５実施例に係る微小粒子測定装置を模式的に示す図であって、（ａ）は上面図、（ｂ）は側面図。 マルチ流路の変形例を示す図。
　以下、本発明の具体的な実施例について図面を参照しながら説明する。
　図１は本発明の第１実施例に係る微小粒子測定装置の概略構成図を示している。図１（ａ）は上面図、図１（ｂ）は側面図である。この光学的特性測定装置は、光源１０、シリンドリカルレンズ１２、マルチ流路１４、対物レンズ１６、透過型位相シフタ１８、結像レンズであるシリンドリカルレンズ２０、２次元ＣＣＤカメラなどの２次元アレイデバイス２２（本発明の検出部に相当）から構成されている。
　マルチ流路１４は本発明の試料容器に相当し、図２に示すように、微細な幅の複数の流路１４１を有する矩形状のプレート１４２から構成されている。各流路１４１の幅は、目的とする微小粒子の大きさに応じて適宜の値に設定される。複数の流路１４１は互いに平行であり、該流路１４１にはそれぞれ１個の検出窓１４３が形成されている。検出窓１４３はガラスやプラスチック等、透光性を有する材料から形成されている。複数の流路１４１の検出窓１４３は同一直線上に位置しており、光源１０からの光はシリンドリカルレンズ１２によって複数の検出窓１４３上に集光するようにシリンドリカルレンズ１２及びマルチ流路１４の配置が設定されている。このように、本実施例では、マルチ流路１４に対して直線状の光が照射され、光源１０及びシリンドリカルレンズ１２が光照射手段を構成する。
　マルチ流路１４の上流には、流路１４１内に微小粒子を含む液体試料を供給する試料供給部（図示せず）が配置されている。試料供給部は、マルチ流路１４の各流路１４１内に一定の流速に保たれた層流が形成されるように微小粒子を含む試料と共にシース液を導入する。
　２次元アレイデバイス２２は例えば２次元ＣＣＤカメラから成り、シリンドリカルレンズ２０の結像面に２次元アレイデバイス２２の受光面が位置するように配置されている。２次元アレイデバイス２２の検出信号は処理部２４に入力されるようになっている。処理部２４は、２次元アレイデバイス２２からの検出信号からインターフェログラムを求める。このインターフェログラムは演算部２６によって数学的にフーリエ変換され、その結果、測定光の波長毎の相対強度である分光特性（スペクトル）が得られる。
　透過型位相シフタ１８は、透過型光学部材である第１透過部１８１と第２透過部１８２とを有する、全体としてほぼ矩形板状の光学部材から成る。第１透過部１８１は、入射面及び出射面が平行な厚さ一定の光学部材から成る。一方、第２透過部１８２は、第１透過部１８１の入射面に対して傾斜する入射面と、第１透過部１８１の出射面と同一面上にある出射面とを有するくさび形の光学部材から成る。本実施例では、第２透過部１８２の入射面は、第１透過部１８１と第２透過部１３２の境界面における第２透過部１８２の厚さが一方側から他方側に向かって徐々に小さくなるように傾斜している。
　第２透過部１８２の入射面の傾斜角度は、波数分解能により決まる位相シフト量と、２次元アレイデバイス２２の画素毎のサンプリング間隔により決まるが、多少ずれても問題はない。
　なお、第１透過部１８１と第２透過部１８２はそれぞれ別の光学部材から構成しても良く、矩形板状の光学部材の下半部を加工して入射面が傾斜する第２透過部１８２としても良い。
　透過型位相シフタ１８の第１透過部１８１及び第２透過部１８２の入射面側の境界付近には遮光板３０が配置されている。遮光板３０は、第１透過部１８１と第２透過部１８２の境界付近を覆う数mm～数十μmほどの微小な幅を有し、光源１０からの光を透過しない部材から形成されている。遮光板３０は本発明の分割阻止手段（非透過部）に相当する。
　上記測定装置の光学的作用について図３～図６を参照して説明する。
　まず、上記測定装置から遮光板３０を除いた図３及び図４を参照して光源からシリンドリカルレンズ１２に向けて発せられた光（励起光）の光路について説明する。光源１０から放射されシリンドリカルレンズ１２に入射した光は、マルチ流路１４の検出窓１４３上に集光する。これにより、検出窓１４３を通過する微小粒子Ｐ（図２参照）から蛍光や散乱光等の測定光束が発せられ、該測定光束は対物レンズ１６に入射した後、平行光線化されて透過型位相シフタ１８の第１透過部１８１及び第２透過部１８２に入射する。一方、検出窓１４３に入射した光の一部は、微小粒子に当たることなくそのまま流路１４１を通過して対物レンズ１６に入射する。対物レンズ１６に入射した光は、対物レンズ１６によって第１透過部１８１と第２透過部１８２の境界付近に集光した後、第１透過部１８１及び第２透過部１８２を透過し、拡散光としてシリンドリカルレンズ２０に入射する。この結果、シリンドリカルレンズ２０によって集光されることなく、幅を持った拡散光として受光面に入射する（図３参照）。従って、対物レンズ１６は本発明の光学素子に相当する。
　これに対して、第１透過部１８１及び第２透過部１８２を透過した測定光束はそれぞれ第１測定光束及び第２測定光束としてシリンドリカルレンズ２０に入射する。このとき、第１透過部１８１の入射面と出射面は平行であるため、シリンドリカルレンズ２０に入射した第１測定光束は、２次元アレイデバイス２２の受光面に位相が揃った状態で同一直線上に集光する。一方、第２透過部１８２は出射面に対して入射面が傾斜しているため、第２測定光束はその波面が該入射面に沿って傾斜した状態でシリンドリカルレンズ２０に入射し、同様に、２次元アレイデバイス２２の受光面においても波面が傾斜した状態で同一直線上に集光する（図４参照）。
　尚、図４では、説明の便宜上、１個の検出窓１４３を通過する微小粒子からの測定光の光路のみを示したが、複数の検出窓１４３を同時に微小粒子が通過する場合、該複数の検出窓１４３をそれぞれ通過する微小粒子から発せられる測定光は、上記した測定光と同じような光路をたどる。
　このように、微小粒子から発せられた測定光とそれ以外の光は分離されることなく、２次元アレイデバイス２２の受光面に入射する。
　これに対して、図５に示すように、第１透過部１８１と第２透過部１８２の境界付近に遮光板３０が配置されていると、対物レンズ１６を通過した励起光は遮光板３０によってその後の進行が阻止され、第１透過部１８１及び第２透過部１８２に入射しない。一方、図６に示すように、測定光の一部は遮光板３０によって進行が阻止されるものの、多くは第１透過部１８１及び第２透過部１８２に入射し、上記した遮光板３０がない場合と同様に、２次元受光デバイス２２の受光面に第１測定光束と第２測定光束のみが入射する。２次元受光デバイス２２の受光面に第１及び第２測定光束が入射すると、両測定光の干渉光の強度に応じた電気信号が処理部２４に入力され、該処理部２４によってインターフェログラムが求められる。このインターフェログラムは演算部２６によって数学的にフーリエ変換され、測定光の波長毎の相対強度である分光特性（分光相対強度）が得られる。
　図７は、上記測定装置によって測定される微小粒子（成分Ａ～成分Ｃ）の分光相対強度及び分光吸光特性を示す図である。上記では分光相対強度について説明したが、分光吸光特性についても同様に求めることができる。
　一方、図８は、マルチ流路の各検出窓（１～ｎ）にそれぞれ対応する２次元アレイデバイスの画素１～画素ｎからの信号に基づき得られた分光測定結果の例を示す。
　本実施例では、各成分の分光相対強度又は／及び分光吸光特性が成分の種類に対応づけて記憶部２８に予め記憶されており、２次元受光デバイス２２の各画素の分光測定結果と記憶部２８に記憶された分光相対強度との比較から、各検出窓１４３を通過した成分が特定される。
　図９は本発明の第２実施例に係る微小粒子測定装置の概略構成を示す図である。第２実施例は、マルチ流路１４に対する光源１０及びシリンドリカルレンズ１２の配置が第１実施例と異なる。具体的には、第２実施例では、マルチ流路１４から対物レンズ１６、透過型位相シフタ１８に至る光路と、光源１０からシリンドリカルレンズ１２を経てマルチ流路１４に至る光路が交差するように、光源１０及びシリンドリカルレンズ１２が配置されている。このような配置により、光源１０からシリンドリカルレンズ１２を経てマルチ流路１４に入射した光のうち微小粒子に当たることなくそのままマルチ流路１４を通過した光が対物レンズ１６に入射しない。従って、微小粒子から発せられた測定光以外の光が透過型位相シフタ１８に入射することを阻止することができる。
　図１０及び図１１は本発明の第３実施例に係る微小粒子測定装置を示す。この実施例は、透過型位相シフタに代えて反射型位相シフタ５０を用いた点が第１実施例と異なる。反射型位相シフタ５０は対物レンズ１６の後段に配置されており、ビームスプリッタ５１と、第１反射面５２及び第２反射面５３とを備えている。
　ビームスプリッタ５１の入射面と対向する側面は該入射面に対して少し傾斜しており、この傾斜側面に第１反射面５２が設けられている。また、ビームスプリッタ５１の入射面と第１反射面５２の間に位置する側面には第２反射面５３が設けられている。第１反射面５２及び第２反射面５３は、例えばビームスプリッタ５１の側面に金属膜等を蒸着することにより形成されている。
　図１０（ａ－１）に示すように第１反射面５２は上下に２分割されており、上反射面と下反射面の間は第１非反射領域５２１となっている。同様に図１０（ａ－２）に示すように第２反射面５３も上下に分割されており、上反射面と下反射面の間は第２非反射領域５３１とされている。本実施例では、ビームスプリッタ５１の側面に金属膜等を蒸着しないことにより非反射領域５２１、５３１が形成されており、該非反射領域５２１、５３１に入射した光束は該非反射領域を通過する。
　上記測定装置においては、光源（図示せず）から放射されシリンドリカルレンズ１２に入射した光は、マルチ流路１４の検出窓１４３上に集光する。これにより、複数の検出窓１４３を通過する試料液に対して直線状の光が照射され、その結果、微小粒子Ｐ（図２参照）から蛍光や散乱光等の測定光が発せられる。該測定光は対物レンズ１６に入射した後、平行光線化されて反射型位相シフタ５０のビームスプリッタ５１に入射する。ビームスプリッタ５１に入射した測定光の一部（第１測定光）は該ビームスプリッタ５１の接合面を透過して第１反射面５２に向かい、残り（第２測定光）は該ビームスプリッタ５１の接合面で反射されて第２反射面５３に向かう。第１反射面５２に向かった第１測定光は該第１反射面５２で反射された後、再びビームスプリッタ５１の接合面で反射されてシリンドリカルレンズ２０に入射する。同様に、第２反射面５３に向かった第２測定光は該第２反射面５３で反射された後、ビームスプリッタ５１の接合面を透過してシリンドリカルレンズ２０に入射する。シリンドリカルレンズ２０に入射した第１測定光は、第１反射面５２が傾斜しているため、２次元アレイデバイス２２の受光面においても波面が傾斜した状態で直線上に集光する。一方、シリンドリカルレンズ２０に入射した第２測定光は、第２反射面５３が傾斜していないため、２次元アレイデバイス２２の受光面に位相が揃った状態で第１測定光束と同一直線上に集光する。
　一方、図１１に示すように、検出窓１４３に入射した光の一部は、微小粒子に当たることなくそのまま流路１４１を通過して対物レンズ１６に入射し、ビームスプリッタ５１に入射する。このとき、光源から検出窓１４３を経て対物レンズ１６を透過した光は、第１反射面５２の第１非反射領域５２１および第２反射面５３の第２非反射領域５３１で集光するように反射型位相シフタ５０のビームスプリッタ５１の接合面の位置が設定されている。
　従って、光源からの光のうち検出窓１４３をそのまま透過し対物レンズ１６に入射した光の一部は、ビームスプリッタ５１の接合面を透過し、第１非反射領域５２１を通って第１反射面５２の後方に抜ける。また、光源からの光のうち検出窓１４３をそのまま透過し対物レンズ１６に入射した光の一部は、ビームスプリッタ５１の接合面で反射されて第２非反射領域５３１を通過して第２反射面５３の後方に抜ける。このため、微小粒子で発せられた測定光のみがシリンドリカルレンズ２０に向かい、第１実施例と同様に、２次元受光デバイス２２によって検出される。
　図１２は本発明の第４実施例に係る微小粒子測定装置の全体構成を示している。この実施例では、円板状の試料容器６０を用いた点に特徴を有する。この試料容器６０は、プラスチックやガラスなどの透光性を有する部材から形成され、図示しない駆動モータにより回転されるように構成されている。微小粒子を含む試料は試料容器６０の上面に塗布される。
　試料容器６０の下部にはマルチ集光照明６２が配置されており、試料容器６０の下面の中心から径方向に延びる領域に直線状の光を照射する。試料容器６０の上部には、試料容器６０の上面に塗布された試料中の微小粒子から発せられる散乱光を測定する測定装置６４が配置されている。該測定装置６４は、例えば第１実施例で説明したような、対物レンズ、第１及び第２透過部、シリンドリカルレンズ、検出部を備えており、散乱光の分光特性を測定することができる。
　この第４実施例は、例えば、血液中に含まれるマラリア原虫感染赤血球を検出する装置として好適である。マラリアは、海外渡航者が発症する感染症の一つであり、ハマダラカの媒介によってマラリア原虫が体内に侵入し感染する病気である。その診断方法として、マラリア原虫感染赤血球の検出があるが、感染初期は全赤血球に占める感染赤血球の割合が１～２％程度と非常に低く、検出が難しい。しかし、感染赤血球の割合が上昇すると死亡率が上昇するため、感染初期の診断における感染赤血球の検出が望まれている。
　本実施例では、試料容器６０の上面に赤血球１個程度の大きさの厚みを有する膜状に血液を塗布することにより、血液中に含まれる赤血球の分光特性を効率よく測定することができる。
　本実施例に係る測定装置で、マラリア原虫感染赤血球を含む血液を測定した結果の一例を図１３に示す。図１３より、マラリア原虫感染赤血球には、正常赤血球にはない、特異的な光吸収が観察されることが分かる。
　本発明の第５実施例に係る微小粒子測定装置について図１４を参照しながら説明する。本実施例は、液体試料に含まれる微小粒子から発せられるラマン散乱光を検出して微小粒子の定量、定性を行うラマン分析装置である。本実施例では、透過型位相シフタ１８の入射面側に、遮光板３０（図１参照）に代えてフィルタ７０を配置している。その他の構成は第１実施例の微小粒子測定装置と同じである。
　フィルタ７０は、対物レンズ１６と位相シフタ１８の間の光路上に配置されており、位相シフタ１８を構成する第１透過部１８１の入射面及び第２透過部１８２の入射面の全体と対向する大きさ及び形状を有している。このため、マルチ流路１４の検出窓１４３から対物レンズ１６を経て第１透過部１８１及び第２透過部１８２に向かう光は、フィルタ７０に入射し、該フィルタ７０を透過した光が第１透過部１８１及び第２透過部１８２に入射する。
　フィルタ７０は、光源からマルチ流路１４の検出窓１４３に入射した光（励起光）を遮断し、それ以外の波長の光を透過するノッチフィルタが用いられている。このため、光源から発せられた光のうちマルチ流路１４の検出窓１４３をそのまま通過した励起光及び励起光が照射された微小粒子から発せられる光のうち該励起光と同じ波長の光は遮断され、励起光とは異なる波長であるラマン散乱光が位相シフタ１８に入射する。上述したように、微小粒子から発せられる光は幅を持った散乱光として第１透過部１８１及び第２透過部１８２の両方の入射面に入射するため、本実施例では、ラマン散乱光の分光特性を取得することができる。
　ラマン散乱光は、物質と光との相互作用に発生する散乱光の一種である。散乱光の大部分は励起光と波長が同じレイリー散乱光であるが、一部、励起光と波長が異なるラマン散乱光が含まれる。ラマン散乱光の波長と励起光の波長の差に対応するエネルギーは物質の固有振動のエネルギーを反映していることから、そのエネルギーを求めることにより物質を特定することができる。また、ラマン散乱光の強度から物質を定量することができる。従って、試料に励起光を照射することにより試料中の微小粒子から発生するラマン散乱光を検出し、その分光特性を取得すれば、該微小粒子の定性や定量を行うことができる。
　ラマン散乱光はレイリー散乱光や励起光に比べると非常に微弱な光であるため、フィルタ７０によって励起光やレイリー散乱光を除去することにより、ラマン散乱光の検出感度を上げることができる。
　本実施例に係る微小粒子測定装置では、光源としては単色光を出射するレーザ光源、例えばＹＡＧレーザやＹＶＯ４レーザなどの固体レーザやＡｒレーザなどの気体レーザが好適である。また、検出器としては第１実施例で示したＣＣＤカメラから成る２次元アレイデバイス２２の他、光電子倍増管から成る２次元アレイデバイスを用いることができる。
　なお、上記実施例では、フィルタ７０としてノッチフィルタを用いたが、エッジフィルタを用いても良い。例えば、ラマン散乱光の波長帯の下限値よりも長波長側の光を透過させるエッジフィルタ（ロングパスフィルタ）とラマン散乱光の波長帯の上限値よりも短波長側の光を透過させるエッジフィルタ（ショートパスフィルタ）を組み合わせて用いることにより、励起光を除去しても良い。
　また、本実施例に係る微小粒子測定装置は、励起光が照射されることにより試料中の微小粒子から発せられる蛍光の分光特性に基づき微小粒子の定性及び定量を行う蛍光分光測定装置にも適用可能である。
　蛍光発光とは、特定波長の励起光を物質に照射したときに励起光のエネルギーを吸収した電子が励起状態から基底状態に戻る際にエネルギーを光として放出する現象をいう。励起波長と蛍光波長の差は励起状態と基底状態の差に対応するエネルギーを反映していることから、蛍光波長を求めることにより物質を特定することができ、蛍光強度から物質を定量することができる。従って、蛍光色素で標識された細胞や微生物、蛍光発光作用を有する鉱物等が試料に含まれる場合、試料に励起光を照射することにより試料中の微小粒子から発生する蛍光を検出し、その分光特性を取得すれば、該微小粒子の定性や定量を行うことができる。一般に蛍光波長は励起波長よりも長いことから、フィルタ７０として励起波長よりも短波長側の光を遮断するエッジフィルタ（ロングパスフィルタ）を用いることにより、蛍光の検出感度を上げることができる。
　さらに、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、種々の変形が可能である。例えば、上述の第１～第５実施例では、シリンドリカルレンズ１２によって光源１０からの光を直線状の光に変換したが、シリンドリカルレンズに代えて凹面鏡を用いて光源からの光を直線状の光に変換するようにしても良い。
　また、第２及び第５実施例では、シリンドリカルレンズや凹面鏡等の、光源からの光を検出窓１４３に集光させる光学部材は必須ではなく、例えば、マルチ流路１４の検出窓１４３以外の領域を遮光して光源１０からの光が該領域に入射しないようにしても良い。さらに、検出窓１４３と同等の形状である直線状の光を照射する光源を用いても良い。
　図１５（ａ）は、上述の第１～第５実施例で用いたマルチ流路１４の縦断側面図を、（ｂ）は変形例に係るマルチ流路１４Ａの縦断側面図を示している。図１５から分かるように、マルチ流路１４では、その内部を複数の流路１４１に区画する区画部材１４５の光の入射側端面が平坦面だが、マルチ流路１４Ａでは、区画部材１４５Ａの入射側端面が曲面状である。このような構成の違いにより、マルチ流路１４に比べてマルチ流路１４Ａの方が、入射した光が区画部材１４５Ａの端面に当たったときに発生する散乱光が低減する。
　反射型位相シフタ５０を用いた第３実施例において、該反射型位相シフタ５０と対物レンズ１６の間の光路上にフィルタ７０を配置しても良い。この場合は、第１反射面５２及び第２反射面５３に設けた非反射領域５２１、５３１を省略することができる。
　
　また、上記では、微小粒子測定装置としての実施例を示したが、各微小粒子測定装置の後段に、試料に含まれる微小粒子をその分光特性毎に選別する手段や選別後の微小粒子を分取する手段を設ければ、フローサイトメーターやセルソーターとして構成することができる。
１０…光源
１２…シリンドリカルレンズ
１４…マルチ流路
　１４１、１４１Ａ…流路
　１４２…プレート
　１４３…検出窓
１６…対物レンズ
１８…透過型位相シフタ
　１８１…第１透過部
　１８２…第２透過部
２０…シリンドリカルレンズ（結像レンズ）
２２…２次元受光デバイス
２４…処理部
２６…演算部
２８…記憶部
５１…ビームスプリッタ
５２…第１反射面
　５２１…第１非反射領域
５３…第２反射面
　５３１…第２非反射領域
６０…試料容器
７０…フィルタ
Ｐ…微小粒子

Claims (7)

  1. 　a) 微小粒子を含む試料を保持する透光性を有する試料容器と、
    　b) 前記試料容器に保持された試料に対して直線状の光を照射する光照射手段と、
    　c) 前記光照射手段からの光が照射された微小粒子から発せられる測定光を第１測定光と第２測定光に分割する分割光学系と、
    　d) 前記第１測定光と前記第２測定光の間に光路長差を付与する光路長差付与手段と、
    　e) 前記第１測定光と前記第２測定光を同一直線上に集光させて干渉させるシリンドリカルレンズと、
    　f) 前記第１測定光と前記第２測定光の干渉光の長手方向の強度分布を検出する検出部と、
    　g) 前記検出部で検出される前記干渉光の強度分布に基づき前記微小粒子から発せられた光のインターフェログラムを求め、このインターフェログラムをフーリエ変換することによりスペクトルを取得する処理部と
    　を備え、
    　前記光照射手段からの光であって前記試料容器を透過した光が前記分割光学系により分割されることを阻止する分割阻止手段を備えることを特徴とする微小粒子測定装置。
  2. 　請求項１に記載の微小粒子測定装置において、
    　前記分割光学系が、
    　入射面及び出射面が平行な第１透過部と、該第１透過部と並んで配置された、入射面及び出射面のうちの一方に対して他方が傾斜するくさび形の第２透過部と、光を透過させない非透過部とを有する光学部材と、
    　前記光照射手段からの光が照射された微小粒子から発せられる測定光を平行光線化して前記第１透過部の入射面及び前記第２透過部の入射面の両方に入射させ、前記光照射手段からの光であって前記試料容器を通過した光を前記非透過部に入射させる光学素子とを備えて構成され、
    　前記分割阻止手段が、前記非透過部から構成され、
    　前記光路長差付与手段が、前記第１透過部及び前記第２透過部から構成されることを特徴とする微小粒子測定装置。
  3. 　請求項１に記載の微小粒子測定装置において、
    　前記分割光学系が、
    　入射面及び出射面が平行な第１透過部と、該第１透過部と並んで配置された、入射面及び出射面のうちの一方に対して他方が傾斜するくさび形の第２透過部とを有する光学部材と、
    　前記光照射手段からの光が照射されることにより前記微小粒子から発せられる測定光を平行光線化して前記第１透過部の入射面及び前記第２透過部の入射面の両方に入射させる光学素子とを備えて構成され、
    　前記分割阻止手段が、前記第１透過部の入射面及び前記第２透過部の入射面と前記光学素子との間に配置された前記光照射手段からの光を遮断するフィルタから構成され、
    　前記光路長差付与手段が、前記第１透過部及び前記第２透過部から構成されることを特徴とする微小粒子測定装置。
  4. 　請求項１に記載の微小粒子測定装置において、
    　前記分割光学系が、第１非反射領域を有する第１反射面と、第２非反射領域を有する第２反射面とを備えた反射型の光学部材と、前記光照射手段からの光が照射された微小粒子から発せられる測定光を平行光線化して前記第１反射面及び前記第２反射面の両方に分割して入射させ、前記光照射手段からの光であって前記試料容器を通過した光を前記第１非反射領域及び前記第２非反射領域に入射させる光学素子とを備えて構成され、
    　前記分割阻止手段が、前記第１非反射領域及び前記第２非反射領域から構成され、
    　前記光路長差付与手段が、前記第１反射面及び前記第２反射面を相対的に移動させる移動手段から構成されることを特徴とする微小粒子測定装置。
  5. 　請求項１に記載の微小粒子測定装置において、
    　前記分割光学系が、第１非反射領域を有する第１反射面と、第２非反射領域を有する第２反射面とを備えた反射型の光学部材と、前記光照射手段からの光が照射された微小粒子から発せられる測定光を平行光線化して前記第１反射面及び前記第２反射面の両方に分割して入射させ、前記光照射手段からの光であって前記試料容器を通過した光を前記第１非反射領域及び前記第２非反射領域に入射させる光学素子とを備えて構成され、
    　前記分割阻止手段が、前記第１非反射領域及び前記第２非反射領域から構成され、
    　前記光路長差付与手段が、前記第１反射面及び前記第２反射面のうちのいずれか一方を測定光の光軸に垂直な面に対して傾斜させたものであることを特徴とする微小粒子測定装置。
  6. 　前記試料容器は、前記微小粒子が１個ずつ並んだ状態で流れる大きさの複数の流路を並列に配置して成る測定用流路を備え、
    　前記光照射手段は、前記複数の測定用流路にまたがる直線状の領域に対して直線状の光を照射することを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
  7. 　前記試料容器が、前記微小粒子を含む試料が塗布される上面を有する円板状の保持板からなり、
    　該保持板を円板の中心を軸として回転する回転手段をさらに備え、
    　前記光照射手段は、前記保持板の回転中心から外周縁部に向かって径方向に延びる直線状の領域に対して直線状の光を照射することを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
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