JP2002005935A - 抗原又は抗体の高感度検出法 - Google Patents
抗原又は抗体の高感度検出法Info
- Publication number
- JP2002005935A JP2002005935A JP2000180856A JP2000180856A JP2002005935A JP 2002005935 A JP2002005935 A JP 2002005935A JP 2000180856 A JP2000180856 A JP 2000180856A JP 2000180856 A JP2000180856 A JP 2000180856A JP 2002005935 A JP2002005935 A JP 2002005935A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antigen
- antibody
- detection method
- measurement
- viologen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明の目的は、抗原抗体反応を利用した抗原
又は抗体の高感度検出法を提供することにある。就中、
抗体としてモノクローナル抗体を使用した場合の各種抗
原又は抗体の高感度検出法を提供することにある。 【解決手段】本発明は、抗原抗体反応を利用した抗原の
検出法であって、該抗原に対するモノクローナル抗体
と、該モノクローナル抗体と結合し得る多官能性抗原と
を用いることを特徴とする抗原の高感度検出法である。
また、本発明は、抗原抗体反応を利用した抗体の検出法
であって、該抗体に対する抗原として該抗原から調製し
得る多官能性抗原を用いることを特徴とする抗体の高感
度検出法の発明である。
又は抗体の高感度検出法を提供することにある。就中、
抗体としてモノクローナル抗体を使用した場合の各種抗
原又は抗体の高感度検出法を提供することにある。 【解決手段】本発明は、抗原抗体反応を利用した抗原の
検出法であって、該抗原に対するモノクローナル抗体
と、該モノクローナル抗体と結合し得る多官能性抗原と
を用いることを特徴とする抗原の高感度検出法である。
また、本発明は、抗原抗体反応を利用した抗体の検出法
であって、該抗体に対する抗原として該抗原から調製し
得る多官能性抗原を用いることを特徴とする抗体の高感
度検出法の発明である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗原抗体反応を利
用した抗原又は抗体の高感度検出法に関する。詳しくは
モノクローナル抗体を用いる同高感度検出法に関する。
用した抗原又は抗体の高感度検出法に関する。詳しくは
モノクローナル抗体を用いる同高感度検出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】モノクローナル抗体は、特定の抗原のみ
を認識するため、その特定の抗原の検出に広く用いられ
ているが、モノクローナル抗体を用いた測定法は一般に
感度が低く、その検出感度の増大が望まれている。一
方、代表的な除草剤であり、光合成系の電子受容体とし
ても広く用いられているビオロゲンを特異的に認識する
モノクローナル抗体は毒物であるビオロゲンを無毒化す
る医薬としての応用が期待でき、また電子受容体に抗体
が結合することによって、電子供与体から電子移動によ
って生じたラジカルを捕足することが可能になると考え
られるため、電子供与体から受容体への電子移動を制御
する材料としての利用も期待されている。ビオロゲンを
特異的に認識するモノクローナル抗体に関しては、これ
までにZ.Niewola等［Clinica Chimica Acta,148,149-15
6(1985)］や M.R.Bowles等［Int.J. Immunopharmacol.,
10,537-545(1988)］によって抗ビオロゲンモノクローナ
ル抗体が得られているが、これらの抗体の評価について
は、ビオロゲンとの結合親和性について検討されている
のみで、それ以上の、或いはそれ以外の検討は殆どなさ
れておらず、抗ビオロゲンモノクローナル抗体を用いた
ビオロゲンの高感度検出法について言及している文献は
これまでのところ殆ど見当たらない。
を認識するため、その特定の抗原の検出に広く用いられ
ているが、モノクローナル抗体を用いた測定法は一般に
感度が低く、その検出感度の増大が望まれている。一
方、代表的な除草剤であり、光合成系の電子受容体とし
ても広く用いられているビオロゲンを特異的に認識する
モノクローナル抗体は毒物であるビオロゲンを無毒化す
る医薬としての応用が期待でき、また電子受容体に抗体
が結合することによって、電子供与体から電子移動によ
って生じたラジカルを捕足することが可能になると考え
られるため、電子供与体から受容体への電子移動を制御
する材料としての利用も期待されている。ビオロゲンを
特異的に認識するモノクローナル抗体に関しては、これ
までにZ.Niewola等［Clinica Chimica Acta,148,149-15
6(1985)］や M.R.Bowles等［Int.J. Immunopharmacol.,
10,537-545(1988)］によって抗ビオロゲンモノクローナ
ル抗体が得られているが、これらの抗体の評価について
は、ビオロゲンとの結合親和性について検討されている
のみで、それ以上の、或いはそれ以外の検討は殆どなさ
れておらず、抗ビオロゲンモノクローナル抗体を用いた
ビオロゲンの高感度検出法について言及している文献は
これまでのところ殆ど見当たらない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、抗原
抗体反応を利用した抗原又は抗体の高感度検出法を提供
することにある。就中、抗体としてモノクローナル抗体
を使用した場合の各種抗原又は抗体の高感度検出法を提
供することにある。
抗体反応を利用した抗原又は抗体の高感度検出法を提供
することにある。就中、抗体としてモノクローナル抗体
を使用した場合の各種抗原又は抗体の高感度検出法を提
供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、抗原抗体反応
を利用した抗原の検出法であって、該抗原に対するモノ
クローナル抗体と、該モノクローナル抗体と結合し得る
多官能性抗原とを用いることを特徴とする抗原の高感度
検出法である。
を利用した抗原の検出法であって、該抗原に対するモノ
クローナル抗体と、該モノクローナル抗体と結合し得る
多官能性抗原とを用いることを特徴とする抗原の高感度
検出法である。
【０００５】また、本発明は、抗原抗体反応を利用した
抗体の検出法であって、該抗体に対する抗原として該抗
原から調製し得る多官能性抗原を用いることを特徴とす
る抗体の高感度検出法の発明である。
抗体の検出法であって、該抗体に対する抗原として該抗
原から調製し得る多官能性抗原を用いることを特徴とす
る抗体の高感度検出法の発明である。
【０００６】即ち、本発明者らは、モノクローナル抗体
による抗原の検出をバイオセンサーなどで行うとき、抗
原を多官能性にすることにより、抗原の検出感度を増大
させ得るのではないかと考え、最も多用される除草剤成
分であるビオローゲンのモノクローナル抗体によりビオ
ローゲンをバイオセンサーにより検出する際、ビオロー
ゲンダイマー（メチレン鎖で結合したもの）を用いたと
ころ、応答シグナルが大きく増大し、また、ダイマーと
抗体の添加の繰り返しによりさらにシグナルの増大が図
れることを見出し、更に、本技術は、ビオローゲンに限
らず多官能にすることのできる全ての抗原に利用し得る
ものであり、バイオセンサーのみならずＥＬＩＳＡ法
（酵素標識抗体測定法）などにも利用できるものである
との確信を得、本発明を完成するに到った。本技術は、
診断薬としての利用を始めとして、多くの化合物のモノ
クローナル抗体による高感度検出法等に利用価値のある
興味ある技術である。
による抗原の検出をバイオセンサーなどで行うとき、抗
原を多官能性にすることにより、抗原の検出感度を増大
させ得るのではないかと考え、最も多用される除草剤成
分であるビオローゲンのモノクローナル抗体によりビオ
ローゲンをバイオセンサーにより検出する際、ビオロー
ゲンダイマー（メチレン鎖で結合したもの）を用いたと
ころ、応答シグナルが大きく増大し、また、ダイマーと
抗体の添加の繰り返しによりさらにシグナルの増大が図
れることを見出し、更に、本技術は、ビオローゲンに限
らず多官能にすることのできる全ての抗原に利用し得る
ものであり、バイオセンサーのみならずＥＬＩＳＡ法
（酵素標識抗体測定法）などにも利用できるものである
との確信を得、本発明を完成するに到った。本技術は、
診断薬としての利用を始めとして、多くの化合物のモノ
クローナル抗体による高感度検出法等に利用価値のある
興味ある技術である。
【０００７】本発明で用いられる多官能性抗原として
は、二官能性抗原、三官能性抗原、四官能性抗原等が挙
げられるが、二官能性抗原が比較的合成し易く、より一
般的であり好ましい。二官能性抗原としては抗原ダイマ
ーが合成のし易さ等から好ましく用いられる。抗原ダイ
マーは、官能性のある抗原をダイマー化したものである
が、そのとき、元素数５〜１５の屈曲性連鎖を含む分子
鎖で結合したものが好ましい。そのような分子鎖として
は、例えば炭素数５〜１５のメチレン鎖などが好ましい
ものとして挙げられる。本発明で用いられるモノクロー
ナル抗体は、常法、即ちケラーとミルシュタインによる
モノクローナル抗体の作製法に準じて適宜作製したもの
を用いることで足りる。即ち、例えば抗ビオロゲンモノ
クローナル抗体を作製する場合を例にして述べると、先
ず、抗原決定基として下式
は、二官能性抗原、三官能性抗原、四官能性抗原等が挙
げられるが、二官能性抗原が比較的合成し易く、より一
般的であり好ましい。二官能性抗原としては抗原ダイマ
ーが合成のし易さ等から好ましく用いられる。抗原ダイ
マーは、官能性のある抗原をダイマー化したものである
が、そのとき、元素数５〜１５の屈曲性連鎖を含む分子
鎖で結合したものが好ましい。そのような分子鎖として
は、例えば炭素数５〜１５のメチレン鎖などが好ましい
ものとして挙げられる。本発明で用いられるモノクロー
ナル抗体は、常法、即ちケラーとミルシュタインによる
モノクローナル抗体の作製法に準じて適宜作製したもの
を用いることで足りる。即ち、例えば抗ビオロゲンモノ
クローナル抗体を作製する場合を例にして述べると、先
ず、抗原決定基として下式
【０００８】
【化１】
【０００９】で示される化合物（以下、Ｃ１ＶＣ５と略
す。）を下記合成ルート
す。）を下記合成ルート
【００１０】
【化２】
【００１１】により合成し、これを貝類のタンパク質
（キーホール リンペット ヘモシアニン、ＫＬＨ）に
導入して免疫用抗原を作製する。次にこれを実験用動物
マウスに１週間間隔で免役した後、脾臓細胞を摘出す
る。次いで、該脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞とをポリエ
チレングリコールを用いて融合し、Ｃ１ＶＣ５に対する
抗体を産生する細胞を選別する。それらの細胞をそれぞ
れマウス腹腔内で増殖して腹水を得、これを精製するこ
とにより目的とするモノクローナル抗体が得られる。本
発明で用いられる多官能性抗原の合成法は、抗原の種類
により自ずから異なり一様ではないが、例えば下式
（キーホール リンペット ヘモシアニン、ＫＬＨ）に
導入して免疫用抗原を作製する。次にこれを実験用動物
マウスに１週間間隔で免役した後、脾臓細胞を摘出す
る。次いで、該脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞とをポリエ
チレングリコールを用いて融合し、Ｃ１ＶＣ５に対する
抗体を産生する細胞を選別する。それらの細胞をそれぞ
れマウス腹腔内で増殖して腹水を得、これを精製するこ
とにより目的とするモノクローナル抗体が得られる。本
発明で用いられる多官能性抗原の合成法は、抗原の種類
により自ずから異なり一様ではないが、例えば下式
【００１２】
【化３】
【００１３】で示されるビオロゲンダイマーの合成法を
反応スキームで示すと下記の通りである。
反応スキームで示すと下記の通りである。
【００１４】
【化４】
【００１５】本発明に係る抗体の高感度検出法において
用いられるモノクローナル抗体は、常法、即ちケラーと
ミルシュタインによるモノクローナル抗体の作製法に準
じて適宜作製したものを用いることで足りる。また、該
抗体に対する抗体、即ち第２抗体が用いられる場合の該
第２抗体としては、通常、自体公知の方法により容易に
得られる抗イムノグロブリン抗体が用いられる。
用いられるモノクローナル抗体は、常法、即ちケラーと
ミルシュタインによるモノクローナル抗体の作製法に準
じて適宜作製したものを用いることで足りる。また、該
抗体に対する抗体、即ち第２抗体が用いられる場合の該
第２抗体としては、通常、自体公知の方法により容易に
得られる抗イムノグロブリン抗体が用いられる。
【００１６】本発明に係る抗原の高感度検出法を実施す
る場合の一般的な手法としては、例えば下記の如き方法
が挙げられる。 （１）表面プラズモン共鳴法を検出原理とするバイオセ
ンサーによる測定の場合 先ず、測定対象抗原に対するモノクローナル抗体をセン
サーチップ（例えば、カルボキシメチル化デキストラン
修飾金基板等）に固定し、これに抗原ダイマー等の多官
能性抗原を添加反応させた後、測定対象抗原を含む試料
と測定対象抗原に対するモノクローナル抗体（前記モノ
クローナル抗体と同じモノクローナル抗体でも、異なる
モノクローナル抗体でもどちらでも良い。）を加えて反
応させ、応答シグナルの変化を見る。
る場合の一般的な手法としては、例えば下記の如き方法
が挙げられる。 （１）表面プラズモン共鳴法を検出原理とするバイオセ
ンサーによる測定の場合 先ず、測定対象抗原に対するモノクローナル抗体をセン
サーチップ（例えば、カルボキシメチル化デキストラン
修飾金基板等）に固定し、これに抗原ダイマー等の多官
能性抗原を添加反応させた後、測定対象抗原を含む試料
と測定対象抗原に対するモノクローナル抗体（前記モノ
クローナル抗体と同じモノクローナル抗体でも、異なる
モノクローナル抗体でもどちらでも良い。）を加えて反
応させ、応答シグナルの変化を見る。
【００１７】（２）ＥＬＩＳＡ法（酵素標識抗体測定
法）による測定の場合 先ず、測定対象抗原に対するモノクローナル抗体を不溶
性担体（例えば、ガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、
ポリスチレン製マイクロプレート、試験管等）に固定
し、これに抗原ダイマー等の多官能性抗原を添加反応さ
せた後、測定対象抗原を含む試料と、酵素（例えば、ペ
ルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼ等）で標識した、測定対象抗原に対するモノ
クローナル抗体（前記モノクローナル抗体と同じモノク
ローナル抗体でも、異なるモノクローナル抗体でもどち
らでも良い。）を加えて反応させ、しかる後、固相の酵
素活性を測定する。ここにおいて、酵素活性を測定する
方法自体は、通常この分野で行われている自体公知の酵
素活性測定法に準じて、用いた酵素に応じて適宜適当な
方法を選択しこれを行うことで足りる。即ち、例えば酵
素がペルオキシダーゼの場合には、過酸化水素と被酸化
性呈色試薬（例えば、４−アミノアンチピリンとアニリ
ン誘導体又はフェノール誘導体との組み合わせ等）を用
いて発色系に導き、発色の度合いを測定する等の方法に
よりこれを行えば良いし、また、酵素がアルカリホスフ
ァターゼの場合には、基質としてｐ−ニトロフェニルリ
ン酸を用い、酵素により加水分解されて生じるｐ−ニト
ロフェノールの吸収を測定する等の方法によりこれを行
えば良い。
法）による測定の場合 先ず、測定対象抗原に対するモノクローナル抗体を不溶
性担体（例えば、ガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、
ポリスチレン製マイクロプレート、試験管等）に固定
し、これに抗原ダイマー等の多官能性抗原を添加反応さ
せた後、測定対象抗原を含む試料と、酵素（例えば、ペ
ルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼ等）で標識した、測定対象抗原に対するモノ
クローナル抗体（前記モノクローナル抗体と同じモノク
ローナル抗体でも、異なるモノクローナル抗体でもどち
らでも良い。）を加えて反応させ、しかる後、固相の酵
素活性を測定する。ここにおいて、酵素活性を測定する
方法自体は、通常この分野で行われている自体公知の酵
素活性測定法に準じて、用いた酵素に応じて適宜適当な
方法を選択しこれを行うことで足りる。即ち、例えば酵
素がペルオキシダーゼの場合には、過酸化水素と被酸化
性呈色試薬（例えば、４−アミノアンチピリンとアニリ
ン誘導体又はフェノール誘導体との組み合わせ等）を用
いて発色系に導き、発色の度合いを測定する等の方法に
よりこれを行えば良いし、また、酵素がアルカリホスフ
ァターゼの場合には、基質としてｐ−ニトロフェニルリ
ン酸を用い、酵素により加水分解されて生じるｐ−ニト
ロフェノールの吸収を測定する等の方法によりこれを行
えば良い。
【００１８】また、本発明に係る抗体の高感度検出法を
実施する場合の一般的な手法としては、例えば下記の如
き方法が挙げられる。（１）表面プラズモン共鳴法を検
出原理とするバイオセンサーによる測定の場合 先ず、測定対象のモノクローナル抗体をセンサーチップ
（例えば、カルボキシメチル化デキストラン修飾金基板
等）に固定し、これに抗原ダイマー等の多官能性抗原を
添加反応させた後、測定対象抗体を含む試料と、測定対
象抗体に対する抗体（第２抗体、抗イムノグロブリン抗
体）を加えて反応させ、応答シグナルの変化を見る。
実施する場合の一般的な手法としては、例えば下記の如
き方法が挙げられる。（１）表面プラズモン共鳴法を検
出原理とするバイオセンサーによる測定の場合 先ず、測定対象のモノクローナル抗体をセンサーチップ
（例えば、カルボキシメチル化デキストラン修飾金基板
等）に固定し、これに抗原ダイマー等の多官能性抗原を
添加反応させた後、測定対象抗体を含む試料と、測定対
象抗体に対する抗体（第２抗体、抗イムノグロブリン抗
体）を加えて反応させ、応答シグナルの変化を見る。
【００１９】（２）ＥＬＩＳＡ法（酵素標識抗体測定
法）による測定の場合 先ず、測定対象のモノクローナル抗体を不溶性担体（例
えば、ガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、ポリスチレ
ン製マイクロプレート、試験管等）に固定し、これに抗
原ダイマー等の多官能性抗原を添加反応させた後、測定
対象抗体を含む試料と、酵素（例えば、ペルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ
等）で標識した、測定対象抗体に対する抗体（第２抗
体、抗イムノグロブリン抗体）を加えて反応させ、しか
る後、固相の酵素活性を測定する。ここにおいて、酵素
活性を測定する方法自体は、通常この分野で行われてい
る自体公知の酵素活性測定法に準じて、用いた酵素に応
じて適宜適当な方法を選択しこれを行うことで足りる。
即ち、例えば酵素がペルオキシダーゼの場合には、過酸
化水素と被酸化性呈色試薬（例えば、４−アミノアンチ
ピリンとアニリン誘導体又はフェノール誘導体との組み
合わせ等）を用いて発色系に導き、発色の度合いを測定
する等の方法によりこれを行えば良いし、また、酵素が
アルカリホスファターゼの場合には、基質としてｐ−ニ
トロフェニルリン酸を用い、酵素により加水分解されて
生じるｐ−ニトロフェノールの吸収を測定する等の方法
によりこれを行えば良い。
法）による測定の場合 先ず、測定対象のモノクローナル抗体を不溶性担体（例
えば、ガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、ポリスチレ
ン製マイクロプレート、試験管等）に固定し、これに抗
原ダイマー等の多官能性抗原を添加反応させた後、測定
対象抗体を含む試料と、酵素（例えば、ペルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ
等）で標識した、測定対象抗体に対する抗体（第２抗
体、抗イムノグロブリン抗体）を加えて反応させ、しか
る後、固相の酵素活性を測定する。ここにおいて、酵素
活性を測定する方法自体は、通常この分野で行われてい
る自体公知の酵素活性測定法に準じて、用いた酵素に応
じて適宜適当な方法を選択しこれを行うことで足りる。
即ち、例えば酵素がペルオキシダーゼの場合には、過酸
化水素と被酸化性呈色試薬（例えば、４−アミノアンチ
ピリンとアニリン誘導体又はフェノール誘導体との組み
合わせ等）を用いて発色系に導き、発色の度合いを測定
する等の方法によりこれを行えば良いし、また、酵素が
アルカリホスファターゼの場合には、基質としてｐ−ニ
トロフェニルリン酸を用い、酵素により加水分解されて
生じるｐ−ニトロフェノールの吸収を測定する等の方法
によりこれを行えば良い。
【００２０】本発明に係る抗原の高感度測定法は、モノ
クローナル抗体が得られ、多官能性抗原を生成しうる全
ての抗原の測定に利用可能である。また、本発明に係る
抗体の高感度測定法は、多官能性抗原を生成しうる抗原
に対する抗体であって、モノクローナル抗体の取得が可
能な全ての抗体の測定に利用可能である。本発明の測定
法は、表面プラズモン共鳴法を検出原理とするバイオセ
ンサーによる測定法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光スペクトル法
など種々の方法に適用することが出来る。
クローナル抗体が得られ、多官能性抗原を生成しうる全
ての抗原の測定に利用可能である。また、本発明に係る
抗体の高感度測定法は、多官能性抗原を生成しうる抗原
に対する抗体であって、モノクローナル抗体の取得が可
能な全ての抗体の測定に利用可能である。本発明の測定
法は、表面プラズモン共鳴法を検出原理とするバイオセ
ンサーによる測定法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光スペクトル法
など種々の方法に適用することが出来る。
【００２１】
【実施例】次に、実地例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定され
るものではない。
明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定され
るものではない。
【００２２】実施例１：ビオロゲンの抗原決定基（Ｃ１
ＶＣ５）に対するモノクローナル抗体の作製 Ｃ１ＶＣ５を水溶性カルボニルジイミダゾールの存在
下、貝類の蛋白質（キーホール リンペット ヘモシアニ
ン）に導入し、免疫用抗原を合成した。得られた免疫用
抗原を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し
た免疫用抗原溶液と０．０１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ
７．０、０．９％ＮａＣｌ含有）とを等量で混合した水
溶液０．４ｍＬ／匹をＢａｌｂ／ｃマウス（雌８週齢）
に免疫した。２回目以降はアジュバントと抗原溶液を混
合したエマルジョンを１週間間隔で免疫（×５回）した
後、マウスの脾臓細胞を摘出した。マウス骨髄腫細胞と
脾臓細胞をポリエチレングリコールを用いて融合した。
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）とＣ１ＶＣ５を結合した検
定用抗原（ＢＳＡ：Ｃ１ＶＣ５＝１：１）を用いて、Ｃ
１ＶＣ５に対する抗体を産生する細胞を選別した。種々
の細胞をそれぞれマウス腹腔内で増殖し、腹水を得た。
マウスモノクローナル抗体のクラス・サブクラスを決定
した結果、４種のモノクローナル抗体はそれぞれＩｇＧ
１（２種、９Ｂ２、１０Ｄ５）、ＩｇＧ２ａ（１種、７
Ｂ１０）、ＩｇＭ（１種、１Ｄ８）であることが判った
（９Ｂ２、１０Ｄ５、７Ｂ１０、１Ｄ８は抗体の種類を
表す。）。ＩｇＧ抗体はプロテインＡカラムにより腹水
から精製した。抗体作製スキームを図１に示す。
ＶＣ５）に対するモノクローナル抗体の作製 Ｃ１ＶＣ５を水溶性カルボニルジイミダゾールの存在
下、貝類の蛋白質（キーホール リンペット ヘモシアニ
ン）に導入し、免疫用抗原を合成した。得られた免疫用
抗原を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し
た免疫用抗原溶液と０．０１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ
７．０、０．９％ＮａＣｌ含有）とを等量で混合した水
溶液０．４ｍＬ／匹をＢａｌｂ／ｃマウス（雌８週齢）
に免疫した。２回目以降はアジュバントと抗原溶液を混
合したエマルジョンを１週間間隔で免疫（×５回）した
後、マウスの脾臓細胞を摘出した。マウス骨髄腫細胞と
脾臓細胞をポリエチレングリコールを用いて融合した。
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）とＣ１ＶＣ５を結合した検
定用抗原（ＢＳＡ：Ｃ１ＶＣ５＝１：１）を用いて、Ｃ
１ＶＣ５に対する抗体を産生する細胞を選別した。種々
の細胞をそれぞれマウス腹腔内で増殖し、腹水を得た。
マウスモノクローナル抗体のクラス・サブクラスを決定
した結果、４種のモノクローナル抗体はそれぞれＩｇＧ
１（２種、９Ｂ２、１０Ｄ５）、ＩｇＧ２ａ（１種、７
Ｂ１０）、ＩｇＭ（１種、１Ｄ８）であることが判った
（９Ｂ２、１０Ｄ５、７Ｂ１０、１Ｄ８は抗体の種類を
表す。）。ＩｇＧ抗体はプロテインＡカラムにより腹水
から精製した。抗体作製スキームを図１に示す。
【００２３】実施例２：抗体と種々のビオロゲン誘導体
との結合親和力の測定と超分子形成 実施例１で得られた４種類のモノクローナル抗体とメチ
ルビオロゲンあるいはＣ１ＶＣ５との結合力を、ＥＬＩ
ＳＡ及びバイオセンサー（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｘ）により
決定した。抗体１Ｄ８、７Ｂ１０と９Ｂ２はＣ１ＶＣ５
と１０−６から１０−７Ｍの解離定数をもって結合する
ことが判った。一方、抗体１０Ｄ５は検定用抗原と特異
的に、且つ強く結合するにも拘わらずＣ１ＶＣ５の阻害
反応が見られなかった（［Ｃ１ＶＣ５］＜１０
−４Ｍ）。メチルビオロゲンに対しては抗体１Ｄ８、９
Ｂ２ともに１０−６Ｍの解離定数をもって結合する。し
かし、抗体７Ｂ１０と１０Ｄ５は［メチルビオロゲン］
＜１０−４Ｍ存在下における競争反応では阻害効果が見
られなかった。
との結合親和力の測定と超分子形成 実施例１で得られた４種類のモノクローナル抗体とメチ
ルビオロゲンあるいはＣ１ＶＣ５との結合力を、ＥＬＩ
ＳＡ及びバイオセンサー（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｘ）により
決定した。抗体１Ｄ８、７Ｂ１０と９Ｂ２はＣ１ＶＣ５
と１０−６から１０−７Ｍの解離定数をもって結合する
ことが判った。一方、抗体１０Ｄ５は検定用抗原と特異
的に、且つ強く結合するにも拘わらずＣ１ＶＣ５の阻害
反応が見られなかった（［Ｃ１ＶＣ５］＜１０
−４Ｍ）。メチルビオロゲンに対しては抗体１Ｄ８、９
Ｂ２ともに１０−６Ｍの解離定数をもって結合する。し
かし、抗体７Ｂ１０と１０Ｄ５は［メチルビオロゲン］
＜１０−４Ｍ存在下における競争反応では阻害効果が見
られなかった。
【００２４】前記ビオロゲンダイマーと種々の抗体との
結合をＥＬＩＳＡにより観察した結果、ビオロゲンダイ
マー存在下において、抗体のみの系よりもＥＬＩＳＡの
発色が強くなる現象が確認された。同様にビオロゲンダ
イマーと抗体１０Ｄ５との錯体形成を、表面プラズモン
共鳴法を検出原理とするバイオセンサー（ＢＩＡｃｏｒ
ｅ Ｘ）により観察した。カルボキシメチル化デキスト
ランをコートした金基板に抗体１０Ｄ５をアミンカップ
リング法により固定した。ビオロゲンダイマーをμＭの
オーダーで注入し、更に抗体１０Ｄ５を添加した。その
結果、抗体１０Ｄ５ビオロゲンダイマーは１０−７Ｍの
解離定数をもって結合し、最初に金基板に固定化した量
（１４０００ＲＵ，（１ＲＵ＝１ｐｇ／ｍｍ２））とほ
ぼ同量の抗体がビオロゲンダイマーを介して基板に固定
されていることがわかった。このセンサーシグナルの増
大はビオロゲンダイマーと抗体を交互の添加により実現
され、図２のような構造が形成されたことに由来してい
ると考えられる。
結合をＥＬＩＳＡにより観察した結果、ビオロゲンダイ
マー存在下において、抗体のみの系よりもＥＬＩＳＡの
発色が強くなる現象が確認された。同様にビオロゲンダ
イマーと抗体１０Ｄ５との錯体形成を、表面プラズモン
共鳴法を検出原理とするバイオセンサー（ＢＩＡｃｏｒ
ｅ Ｘ）により観察した。カルボキシメチル化デキスト
ランをコートした金基板に抗体１０Ｄ５をアミンカップ
リング法により固定した。ビオロゲンダイマーをμＭの
オーダーで注入し、更に抗体１０Ｄ５を添加した。その
結果、抗体１０Ｄ５ビオロゲンダイマーは１０−７Ｍの
解離定数をもって結合し、最初に金基板に固定化した量
（１４０００ＲＵ，（１ＲＵ＝１ｐｇ／ｍｍ２））とほ
ぼ同量の抗体がビオロゲンダイマーを介して基板に固定
されていることがわかった。このセンサーシグナルの増
大はビオロゲンダイマーと抗体を交互の添加により実現
され、図２のような構造が形成されたことに由来してい
ると考えられる。
【００２５】実施例３：ビオロゲンに対するモノクロー
ナル抗体を用いた高感度ビオロゲン誘導体検出法 ［実験操作］ １．モノクローナル抗体１０Ｄ５をセンサーチップ（カ
ルボキシメチル化デキストラン修飾金基板）に固定 ２．ビオロゲンダイマー２２μＭを添加 ３．更に、モノクローナル抗体１０Ｄ５を９μＭ添加 ４．２及び３の操作を再度繰り返す ［結果］結果を図３に示す。図３中、（ａ）は、ビオロ
ゲンダイマー２２μＭを添加したときの応答シグナル強
度変化量を示し、（ｂ）は、（ａ）に続き抗体１０Ｄ５
を９μＭ添加したときの応答シグナル強度変化量を示
し、（ｃ）は、（ａ）及び（ｂ）の操作を２回連続した
場合の応答シグナル強度変化量を示す。図３から明らか
なように、ビオロゲンダイマーのみを添加したときのシ
グナル強度に比べ、抗体を更に添加することにより１０
倍のシグナル強度でビオロゲンダイマーを検出できた。
また、実験操作２及び３を繰り返すことにより更に大き
く応答シグナルを増幅できることが判った。
ナル抗体を用いた高感度ビオロゲン誘導体検出法 ［実験操作］ １．モノクローナル抗体１０Ｄ５をセンサーチップ（カ
ルボキシメチル化デキストラン修飾金基板）に固定 ２．ビオロゲンダイマー２２μＭを添加 ３．更に、モノクローナル抗体１０Ｄ５を９μＭ添加 ４．２及び３の操作を再度繰り返す ［結果］結果を図３に示す。図３中、（ａ）は、ビオロ
ゲンダイマー２２μＭを添加したときの応答シグナル強
度変化量を示し、（ｂ）は、（ａ）に続き抗体１０Ｄ５
を９μＭ添加したときの応答シグナル強度変化量を示
し、（ｃ）は、（ａ）及び（ｂ）の操作を２回連続した
場合の応答シグナル強度変化量を示す。図３から明らか
なように、ビオロゲンダイマーのみを添加したときのシ
グナル強度に比べ、抗体を更に添加することにより１０
倍のシグナル強度でビオロゲンダイマーを検出できた。
また、実験操作２及び３を繰り返すことにより更に大き
く応答シグナルを増幅できることが判った。
【００２６】実施例４：ビオロゲンを３つ有する分子を
用いたときのバイオセンサーにおける感度について 下式
用いたときのバイオセンサーにおける感度について 下式
【００２７】
【化５】
【００２８】で示されるビオロゲンを３つ有する化合物
を用いて、バイオセンサーにおける感度について調べ
た。結果を図４に示す。図４から明らかなように、この
場合も三官能性抗原のみを添加したときのシグナル強度
に比べ、抗体を更に添加した場合には、シグナル強度が
著しく増大していることが判る。
を用いて、バイオセンサーにおける感度について調べ
た。結果を図４に示す。図４から明らかなように、この
場合も三官能性抗原のみを添加したときのシグナル強度
に比べ、抗体を更に添加した場合には、シグナル強度が
著しく増大していることが判る。
【００２９】
【発明の効果】本発明の方法によれば、モノクローナル
抗体が得られ、多官能性抗原を生成しうる全ての抗原を
高感度に測定することが出来、また、多官能性抗原を生
成しうる抗原に対する抗体であって、モノクローナル抗
体の取得が可能な全ての抗体を高感度に測定することが
出来、且つ、表面プラズモン共鳴法を検出原理とするバ
イオセンサーによる測定法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光スペク
トル法など種々の方法に適用することが出来るので斯業
に貢献するところ極めて大である。
抗体が得られ、多官能性抗原を生成しうる全ての抗原を
高感度に測定することが出来、また、多官能性抗原を生
成しうる抗原に対する抗体であって、モノクローナル抗
体の取得が可能な全ての抗体を高感度に測定することが
出来、且つ、表面プラズモン共鳴法を検出原理とするバ
イオセンサーによる測定法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光スペク
トル法など種々の方法に適用することが出来るので斯業
に貢献するところ極めて大である。
【図１】図１は、実施例１における抗体作製スキームを
示す。
示す。
【図２】図２は、バイオセンサーの基板表面にカルボキ
シメチル化デキストランを介して抗体を固定化したとこ
ろにビオロゲンダイマー及び抗体を段階的に積層させた
ところを図示したものである。
シメチル化デキストランを介して抗体を固定化したとこ
ろにビオロゲンダイマー及び抗体を段階的に積層させた
ところを図示したものである。
【図３】図３は、抗ビオロゲンモノクローナル抗体１０
Ｄ５を固定したセンサーチップにビオロゲンダイマー及
び抗体を添加したときの表面プラズモン共鳴シグナルの
変化を示し、（ａ）は、ビオロゲンダイマーを添加した
ときの、（ｂ）は、（ａ）に続き抗体１０Ｄ５を添加し
たときの、（ｃ）は、（ａ）及び（ｂ）の操作を二回連
続した場合の表面プラズモン共鳴シグナルの変化をそれ
ぞれ示す。
Ｄ５を固定したセンサーチップにビオロゲンダイマー及
び抗体を添加したときの表面プラズモン共鳴シグナルの
変化を示し、（ａ）は、ビオロゲンダイマーを添加した
ときの、（ｂ）は、（ａ）に続き抗体１０Ｄ５を添加し
たときの、（ｃ）は、（ａ）及び（ｂ）の操作を二回連
続した場合の表面プラズモン共鳴シグナルの変化をそれ
ぞれ示す。
【図４】図４は、抗ビオロゲンモノクローナル抗体１０
Ｄ５を固定したセンサーチップにビオロゲンを３つ有す
る化合物（三官能性抗原）及び抗体１０Ｄ５を添加した
ときの表面プラズモン共鳴シグナルの変化を示す。
Ｄ５を固定したセンサーチップにビオロゲンを３つ有す
る化合物（三官能性抗原）及び抗体１０Ｄ５を添加した
ときの表面プラズモン共鳴シグナルの変化を示す。
Claims (14)
- 【請求項１】 抗原抗体反応を利用した抗原の検出法で
あって、該抗原に対するモノクローナル抗体と、該モノ
クローナル抗体と結合し得る多官能性抗原とを用いるこ
とを特徴とする抗原の高感度検出法。 - 【請求項２】 多官能性抗原が抗原ダイマーである請求
項１に記載の高感度検出法。 - 【請求項３】 抗原ダイマーが元素数５〜１５の屈曲性
連鎖を含む分子鎖で結合しているものである請求項２に
記載の高感度検出法。 - 【請求項４】 元素数５〜１５の屈曲性連鎖が炭素数５
〜１５のメチレン鎖である請求項３に記載の高感度検出
法。 - 【請求項５】 抗原がビオロゲン誘導体であり、多官能
性抗原がビオロゲンダイマーである請求項１〜４の何れ
かに記載の高感度検出法。 - 【請求項６】 表面プラズモン共鳴法を検出原理とする
バイオセンサーにより測定を行う請求項１〜５の何れか
に記載の高感度検出法。 - 【請求項７】 ＥＬＩＳＡ法（酵素標識抗体測定法）に
より測定を行う請求項１〜５の何れかに記載の高感度検
出法。 - 【請求項８】 蛍光スペクトル法により測定を行う請求
項１〜５の何れかに記載の高感度検出法。 - 【請求項９】 抗原抗体反応を利用した抗体の検出法で
あって、該抗体に対する抗原として該抗原から調製し得
る多官能性抗原を用いることを特徴とする抗体の高感度
検出法。 - 【請求項１０】 更に、該抗体のモノクローナル抗体を
用いる請求項９に記載の高感度検出法。 - 【請求項１１】 更に、該抗体に対する抗体（第二抗
体）を用いる請求項１０に記載の高感度検出法。 - 【請求項１２】 表面プラズモン共鳴法を検出原理とす
るバイオセンサーにより測定を行う請求項９〜１１の何
れかに記載の高感度検出法。 - 【請求項１３】 ＥＬＩＳＡ法（酵素標識抗体測定法）
により測定を行う請求項９〜１１の何れかに記載の高感
度検出法。 - 【請求項１４】 蛍光スペクトル法により測定を行う請
求項９〜１１の何れかに記載の高感度検出法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000180856A JP3907919B2 (ja) | 2000-06-16 | 2000-06-16 | 抗原又は抗体の高感度検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000180856A JP3907919B2 (ja) | 2000-06-16 | 2000-06-16 | 抗原又は抗体の高感度検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002005935A true JP2002005935A (ja) | 2002-01-09 |
| JP3907919B2 JP3907919B2 (ja) | 2007-04-18 |
Family
ID=18681863
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000180856A Expired - Fee Related JP3907919B2 (ja) | 2000-06-16 | 2000-06-16 | 抗原又は抗体の高感度検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3907919B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009099149A1 (ja) * | 2008-02-07 | 2009-08-13 | Shiseido Company, Ltd. | 抗ｄ－アミノ酸モノクローナル抗体及び、抗ｄ－アミノ酸モノクローナル抗体を用いたｄ－アミノ酸の免疫学的分析方法 |
| EP3627154A1 (en) * | 2018-09-20 | 2020-03-25 | Mikrogen GmbH | Process for increasing the sensitivity of an immunological test for detecting an antigen in a sample |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102156193B (zh) * | 2011-03-31 | 2013-12-11 | 中国科学院植物研究所 | 一种检测植物中目标蛋白的方法及其专用spr生物传感器 |
-
2000
- 2000-06-16 JP JP2000180856A patent/JP3907919B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009099149A1 (ja) * | 2008-02-07 | 2009-08-13 | Shiseido Company, Ltd. | 抗ｄ－アミノ酸モノクローナル抗体及び、抗ｄ－アミノ酸モノクローナル抗体を用いたｄ－アミノ酸の免疫学的分析方法 |
| JP2009184981A (ja) * | 2008-02-07 | 2009-08-20 | Shiseido Co Ltd | 抗ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体及び、抗ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を用いたｄ−アミノ酸の免疫学的分析方法 |
| EP3627154A1 (en) * | 2018-09-20 | 2020-03-25 | Mikrogen GmbH | Process for increasing the sensitivity of an immunological test for detecting an antigen in a sample |
| WO2020058213A1 (en) * | 2018-09-20 | 2020-03-26 | Mikrogen Gmbh | Process for increasing the sensitivity of an immunological test for detecting an antigen in a sample |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3907919B2 (ja) | 2007-04-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4661444A (en) | Homogeneous immunoassays employing double antibody conjugates comprising anti-idiotype antibody | |
| JP2731739B2 (ja) | 四級アンモニウム免疫原接合体およびイムノアッセイ試薬 | |
| KR20090034999A (ko) | 응집 저해 측정법 및 응집 저해 측정용 시약 | |
| ES2308824T3 (es) | Eliminacion de interferencias de los inmunoanalisis por medio de sustancias derivadas de las regiones marco que abarcan anticuerpos. | |
| US11726085B2 (en) | Immunoassay controls and the use thereof | |
| JPH05203652A (ja) | 抗体酵素免疫分析法 | |
| JP3907919B2 (ja) | 抗原又は抗体の高感度検出法 | |
| JP2022528465A (ja) | 対称性ジメチル化アルギニン分析物に対する抗体及びその用途 | |
| JPH05508770A (ja) | 膵臓エラスターゼ１特異性抗体、その獲得方法および該抗体を含有するテストキット | |
| Pavlinkova et al. | Site-specific photobiotinylation of immunoglobulins, fragments and light chain dimers | |
| JPH11503521A (ja) | 生物体液中のバンコマイシンの検出および定量化用試薬および方法 | |
| KR101159011B1 (ko) | 햅텐 화합물 및 항체 | |
| JP5026761B2 (ja) | ハプテン化合物および抗体 | |
| JP2968910B2 (ja) | １α，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３に対する抗体及びその用途 | |
| JPH02501859A (ja) | 固相非分離酵素分析 | |
| JP3920458B2 (ja) | 免疫的測定法 | |
| JP4711509B2 (ja) | 生物学的流体中のバンコマイシンの検出および定量化 | |
| AP81A (en) | Agglutination assay | |
| WO2006004039A1 (ja) | 免疫測定装置及び方法 | |
| JPH0348765A (ja) | 免疫的検出用物質及び免疫的検出法 | |
| JPH0427867A (ja) | 蛍光標識された物質 | |
| JPH08114594A (ja) | 酵素免疫測定法 | |
| EP2124055A1 (en) | Kit for immunoassay of bsh, and method for measurement of bsh | |
| JPH0458155A (ja) | 免疫学的測定用ｂｆ分離法 | |
| JPH0763755A (ja) | メタンフェタミン検出用固定化抗原およびそれを用いた検知方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20031031 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20040129 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041028 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20060530 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060606 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060804 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20061010 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061205 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070116 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070117 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100126 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110126 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120126 Year of fee payment: 5 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |