JP2001526561A

JP2001526561A - 自己集合タンパク質組成物及びシーラントとしての使用

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Publication number: JP2001526561A
Application number: JP53962698A
Authority: JP
Inventors: ダンカストロ; アルクーエン; ムーンハエサンウー
Original assignee: Boston Scientific Limited
Current assignee: Boston Scientific Limited
Priority date: 1997-03-10
Filing date: 1998-03-04
Publication date: 2001-12-18
Anticipated expiration: 2018-03-04
Also published as: AU6345998A; JP4408454B2; DE69815096D1; US6299639B1; US6177609B1; EP0977604B1; DE69815096T2; CA2283433C; WO1998040112A1; CA2283433A1; EP0977604A1

Abstract

(57)【要約】多孔性移植製品の表面上に体液密着障壁を形成する生体適合性水性スラリーが記載される。その水性スラリーは、実質的に均一な粒径を有する自己集合タンパク質粉砕物、生体適合性可塑剤及び水が含まれる。その水性スラリーは、25℃で約8,000〜約60,000センチポアズの粘度及び該スラリーに懸濁した該タンパク質を十分維持するだけのpHを有することを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】自己集合タンパク質組成物及びシーラントとしての使用発明の分野: 本発明は、移植製品用の改良された生体適合性体液密着障壁及び障壁組成物に関する。更に詳細には、本発明は、高度に制御可能な生体適合性水性スラリー組成物及びその組成物を血管移植片又は人工骨頭のような移植人工器官に被覆又は含浸する場合に体液密着障壁を形成する方法に関する。発明の背景合成の多孔性血管移植片のような移植製品の使用は、当該技術において十分に容認された診療である。移植製品のある種の性質を改良するために、かかる製品の１以上の表面を被覆することは既知である。そのコーティング組成物は、多くの異なる機能に貢献する。例えば、そのコーティングは多孔性移植製品を血液密着にすることができる。特に、Hoffman，Jr.らの米国特許第4,842,575号には、移植片の多孔性構造にコラーゲン製剤をマッサージすることにより合成血管移植片を血液密着にする方法が記載されている。また、そのコーティングは、移植製品上の標的領域にある種の医薬剤を送達するために用いられる。例えば、Jernbergの米国特許第5,290,271号には、充填材の表面に被覆される液体又はゲル中に分散した封入化学療法が記載されている。このようにして、化学療法剤が充填材上の標的領域に経時放出される。更に、移植製品に被覆されるコーティング及び/又は含浸組成物中に抗生物質、抗血栓形成剤等を混合することは当該技術において周知である。そのようなコーティングにより、例えば、感染症や凝血塊形成の恐れを減少させることによって移植製品の生体適合性が高められる。上記の移植製品用のコーティング及び含浸組成物は、種々の材料から製造される。その材料としては、例えば、生物分子含有組成物、ポリマー含有組成物及びハイブリッドポリマー-生物分子含有組成物が挙げられる。例えば、移植製品用の当該技術において既知のコーティング組成物としては、セグメント線状ポリマー(Koroscilの米国特許第3,804,812号)、ヘパリン化ポリウレタン(Boninらの米国特許第3,766,104号)及びポリシロキサンとポリウレタンのブロックコポリマー (Nyilasの米国特許第3,562,352号)が挙げられる。しかしながら、そのような組成物は生体内の望ましくない副反応に関与する未反応官能基を含み、例えば、血管移植片内への細胞生成を阻止することがある。その合併症は、移植部位に血栓形成、感染症等を生じる。生物分子含有コーティングとしては、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン及びヒアルロン酸のような細胞外マトリックスタンパク質が挙げられる。多孔性繊維移植片の多孔性を低下させるためのコラーゲンを含有するスラリー組成物の使用がHoffmanらの米国特許第4,842,575号及び同第5,108,424号に記載されている。両明細書の記載は本明細書に含まれるものとする。その従来技術のスラリーの処理中に、ミートグラインダを通過しかつメッシュサイズを連続的に小さくする一連のフィルターの篩を押出した予め処理した仔ウシ皮膚から適切なサイズと純度のコラーゲンが得られた。次いで、そのコラーゲンスラリーに可塑剤を添加し、その組成物を、例えば、多孔性血管移植片の表面に被覆した。次いで、該組成物を架橋及び乾燥した。かかるスラリーの使用は、血管移植片のような移植製品に許容しうる生体適合性及び血液密着性を与える。コラーゲン水性分散液を供給する点での工程として、例えば、ウシ皮の室温摩砕がSohdeらの米国特許第4,097,234号に記載されている。しかしながら、この特許には、例えば、単離すべきコラーゲンが容易に可溶化又は“膨潤”する範囲にウシ皮又は鍵の標品のpHがある場合に、該標品の強烈な撹拌又は機械的粉砕から生じる摩擦熱のためにコラーゲン繊維が不均一になり分解するようになることが教示されている。従って、Sohdeらには、ほぼ室温、即ち、20〜25℃において２連続工程でウシ真皮を刻んでからすりつぶすことが記載されている。得られた水性分散液は、従来技術の組成物と同様の直径4〜12μm、長さ2〜25mm及び粘度1/5 〜1/20のコラーゲン繊維を有することがクレイムされている。Sohdeらの方法の最終製品としては、人工血管や縫合糸として有用な不織布、薄膜、メンブラン、チューブ又はシートが挙げられている。しかしながら、Sohdeらによって記載された方法は、ウシ腱又は皮の摩砕が室温で行われるという欠点をもっている。これらの組織の室温での摩砕は、摩砕部位の微環境の温度を上げ、コラーゲンを変性させる。これにより、生成した媒体及び血流双方に溶解性の高いコラーゲンが生じる。その高い溶解性は、コーティングの早すぎる吸収をまねき、組織内への生成動力学に有害な影響を生じることがある。従って、部材の治癒特性を本質的に阻害する。かかる方法から得られたコラーゲンは、シーラント組成物中のコラーゲン粒子の一様でない又は不均一な分布の恐れのために多孔性血管移植片のような移植製品のシーラントとして望ましくないことは明らかである。更に、コラーゲンコーティングの早すぎる吸収により、例えば、シーラント被覆多孔性血管移植片から血液の望ましくない漏れが生じることがある。移植コラーゲンを調製する代替的方法としていくつかの文献にはコラーゲンの凍結摩砕が記載されている。例えば、Fallickの米国特許第5,256,140号には、陥凹がある皮膚を平らにするのに使用するための注入用コラーゲンの自己由来源の調製方法が記載されている。その方法においては、コラーゲン組成物を入れるべき患者の皮膚を、例えば、液体窒素を用いて-10〜-100°F(-3.8〜-37.8℃)に冷却することにより脆弱にする。次に、脆弱な皮膚をモルタルと乳棒を用いて粉砕するか又はフリーザーミルを用いて凍結摩砕する。次に、その標品を変性し、弱酸液中に抽出して患者に送達する変性コラーゲンを得る。同様に、Kelmanらの米国特許第5,332,802号には、形成外科又は眼科手術に有用な自己移植コラーゲンが記載されている。特に、所望のコラーゲン製剤を得るために、患者の皮膚試料を凍結状態の皮膚を微粉砕することにより、例えば、液体窒素で皮膚を凍結し、その凍結した皮膚をモルタルと乳棒を用いて又は凍結微粉砕ミルによって摩砕することによりブレンド又はホモジェナイズする。かかる処理は、混入物の溶解性を高めかつ製剤の全体の処理時間を短くするために用いられている。しかしながら、かかる凍結法は美容手術式適用に関し、多孔性移植製品と共に用いられるシーラント組成物に適しない。特に、かかる方法は、注入用コラーゲンの少量製剤に関する。更に、その組成物及び方法は、高度に制御された粘度範囲を有する均一なサイズの未変性コラーゲン製剤を製造するには不十分である。前述のように、コラーゲンはコーティング及び含浸組成物として広く用いられてきた。特に、血管移稙片や血管内移植片のような繊維人工器官の体液密着障壁としての使用は非常に成功してきた。しかしながら、コラーゲンの処理はその固有の性質のために多くの難点がある。例えば、再現性のあるコラーゲンスラリーを製造するためには原料のある種のコンシステンシー、及び処理工程とパラメーターが必要である。コラーゲンのような天然に存在する物質は、多くの固有の変化を有することは当然のことである。許容しうるシーラント組成物を製造するために、これらの変化は最小でなければならない。そのようにする方法は、制御された原料条件と処理条件による。血管移植片のような多孔性基質の再現性のあるシーラントを形成することができる信頼できかつ一貫した組成物を製造するそのような努力にもかかわらず、かかるシーラントの品質及び/又は再現性を妥協する傾向がある他の難点が存在する。例えば、コラーゲンがある温度、例えば、37 ℃より高い温度で変性することは周知である。変性が起こると、自然自己集合性が喪失する。結果として、架橋が選ばれ必要でもある。更に、原料のコラーゲンを個々の粒径に摩砕すると変性温度より高い局部的な熱が生じる。かかる変性は、初期の処理段階で気付かれずに進行し、結局最終生成物でわかる。従って、従来の摩砕法は、例えば、コラーゲンを摩擦摩砕力による過度の熱蓄積に暴露するために有用性を制限した。従来技術には、コラーゲンの架橋が効果的なシーラント組成物を形成するのに重要な工程であったことが教示されている。例えば、上記Hoffmanらの米国特許第4,842,575号及び同第5,108,424号を参照されたい。最近、変性の可能性を排除すること及び粒径を制御することにより、指定した粘度範囲で再現性のある良質のシーラントを形成するコラーゲン組成物が製造されることが本発明の過程で発見された。指定した粒径は、粉末化プロセスに適用された凍結技術の使用のために変性に関係なく得られる。均一な粒径はコーティングでの均一性を促進し、コラーゲンの自己集合性を高め、体液密着障壁の形成を促進させる。本発明の方法の結果として、効果的な良質の体液密着障壁がコラーゲンを架橋せずに得られる。要するに、上記引用文献は全て一般的には高度に制御可能な及び再現性のあるコラーゲン組成物を製造できない欠点がある。従って、改良された生体適合性水性スラリー組成物及び移植製品上に体液密着障壁を形成する方法が求められている。特に、均一な粒径を有する未変性コラーゲンを含むと共に高度に制御可能でかつ再現性のある粘度を有する改良されたコラーゲン組成物が求められている。本発明は、これらの及び他の要求を満たすものである。本発明の要約本発明は、移植製品の表面上に体液密着障壁を形成する生体適合性水性スラリー組成物に関する。本スラリー組成物は、実質的に均一な粒径を有する自己集合タンパク質粉砕物、生体適合性可塑剤及び水が含まれる。スラリー組成物は、また、25℃で約8,000〜約60,000センチポアズの粘度及び懸濁したタンパク質粉砕物を十分維持するだけのpHを有する。本発明の他の実施態様においては、体内に使用するための移植部材が記載される。その移植部材は、可撓性の多孔性高分子基質及びその多孔性基質と緊密に接触した水性シーラント組成物が含まれる。該シーラント組成物は、均一な粒径を有する自己集合タンパク質粉砕物、生体適合性可塑剤及び水を含有するスラリーが含まれる。そのシーラント組成物は、25℃で約8,000〜約60,000センチポアズの粘度及びスラリー中に懸濁したタンパク質粉砕物を十分維持するだけのpHを有することを特徴とする。本発明の他の実施態様においては、移植製品を体液密着にする生体適合性水性シーラントスラリーの製造方法が記載される。その方法は、（1）生分解性自己集合タンパク質を含むペーストを供給する工程、（2）該ペーストを低温で均一な粒径を有する粉末にすりつぶす工程、（3）該粉末と可塑剤及び水とを混合して25℃で約8,000〜約60,000センチポアズの粘度を有する上記水性シーラントスラリーを形成する工程及び(4)該スラリーを該ペーストの十分に等電点外のpHに維持して該スラリー中に懸濁した該タンパク質を維持する工程を含む。本発明の他の実施態様においては、体液密着移植製品の調製方法が記載される。その方法は、（1）均一な粒径を有する自己集合タンパク質粉砕物、生体適合性可塑剤及び水を含有する水性スラリーであって、25℃で約8,000〜約60,000センチポアズの粘度及び懸濁したタンパク質粉砕物を十分維持するだけのpHを有する、前記スラリーを供給する工程、(2)該スラリーを可撓性の多孔性高分子基質の表面に該タンパク質と該基質の多孔性構造との密接な会合を十分行わせるだけの力で被覆して該製品を密封する工程及び(3)該スラリーを該基質表面上で乾燥させる工程を含む。発明の詳細な説明: 本発明は多くの異なる形の実施態様によって満足させるが、本発明の好適実施態様が詳述される。本開示は、本発明の原理の例としてみなされるべきでありかつ本発明を例示及び記載された実施態様に限定するものでないことは理解される。本発明によれば、新規な体液密着障壁組成物が提供される。更に詳細には、多孔性移植基質を血液密着にする新規なコラーゲンシーラント組成物及び製造方法が提供される。本発明の実施態様においては、多孔性移植製品の表面上に体液密着障壁を形成する生体適合性水性スラリーが提供される。本発明のための“水性スラリー”とは、流動するのに十分な液体でありかつ１種以上の自己集合タンパク質を含む微細粒子の混合物を含む水がベースの組成物を意味する。その水性スラリーは、移植製品の表面と接触する場合に体液密着障壁を形成する。本発明のための“多孔性移植製品”は、体内に移植されるべき生体適合製品又はその基質表面を含み、特に多孔性管状人工器官を意味する。移植製品は、好ましくは編み又は織りポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)又はポリウレタン血管移植片又は血管内移植片のような高分子血管人工器官である。これらの製品は、既知の製造技術及び材料を用いてつくられる。本発明の血管移植片は、商標DACRONやPTFEとして市販されているポリエチレンテレフタレートのような生物学的に適合する繊維又は糸から製造され、PTFEやポリウレタン移植片を製造するのに用いられるもののような既知の押出し及び膨張手法によっても製造される。ポリウレタンのような種々のポリマー中の浸漬型マンドレルが有効である。更に、移植片は編まれても織られていてもよく、モノフィラメント又はマルチフィラメント糸でもよい。本明細書で用いられる“血管人工器官”という語は、全ての移植片タイプ、及び人工骨頭、移植片/ステント及び血管内/ステント併用、網状及びヘルニア栓及び貼布を包含する。本発明の生体適合性スラリーは、実質的に均一な粒径を有する自己集合タンパク質粉砕物、生体適合性可塑剤及び水が含まれる。本発明のための“自己集合タンパク質”という語は、水溶液中にある場合に自己会合することができるタンパク質を包含することを意味する。かかるタンパク質は、治癒を助けかつ本発明の移植製品内に組織を生成することを促進ために経時体内によって吸収される能力に基づいて選ばれる。適切な自己集合タンパク質としては、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、ラミニン、ヒアルロン酸、テナシン、インテグリン、カドヘリン、及びその混合物のようなタンパク質の細胞外マトリックスファミリーの多くの種類が挙げられるがこれらに限定されない。これらの自己集合タンパク質は、適切な哺乳動物種から得られる。好ましくは、本発明の自己集合タンパク質は、現在約15種類を含む細胞外マトリックス分子のコラーゲンファミリーに属するものである。自己集合するほかに、コラーゲンはプロコラーゲン分子からコラーゲン原繊維のコラーゲン分子に自己構築することができる。有効なコラーゲン型としては、コラーゲンI〜XV型が挙げられる。例えば、Bruce Alberts，Dennis Bray，Julian Lewis，Martin Raf f，Keith Roberts & James D．Watson Molecular Biology of the Cell，3rded ．pgs.963-1,000(1994)を参照されたい。この文献の記載は本願明細書に含まれるものとする。本発明の自己集合タンパク質は、好ましくはウシＩ型コラーゲンである。本発明のための自己集合タンパク質は、スラリーを移植製品に簡便にかつ一様に被覆させると共に体液密着障壁を十分形成させる濃度でスラリー組成物中に存在するものである。自己集合タンパク質は、好ましくは約1〜約３重量％の濃度で存在する。自己集合タンパク質は、更に好ましくは約1.1〜約2.0重量％の濃度で存在する。 “粉砕物”とは、自己集合タンパク質が、例えば、摩擦、衝撃、粉砕、摩砕、摩耗、製粉、化学法及びその組合わせにより実質的に均一な粒径の粉末まで小さくし、続いて所望のメッシュサイズに選別又は篩過するか又はこれが含まれることを意味する。微粒子を製造することができる他の手法も企図される。粉砕物にする前に、自己集合タンパク質を凍結処理して水性ペーストから固形物を形成する。次に、固形物を所望の粒径に粉砕する。局部的な熱の蓄積や変性の原因となる摩擦力は、凍結固化物質に有害に影響しない。従って、自己集合タンパク質の粒径は、変性した場合のコラーゲンのようなタンパク質に通常起こる固有の自己集合性の喪失に関係なく制御される。これは、本発明に必要とされる小さな粒径が変性をまねくことになる厳密な粉末化を必要とすることから重要な特徴である。自己集合タンパク質は、凍結製粉法により均一な粒径に小さくすることが好ましい。詳述されるように、この凍結製粉法は、自己集合タンパク質を含有する原料のペーストを用い、例えば、ミートグラインダによって押出して便利で使用可能なサイズを得、押出した材料を低温で凍結し、その材料を粉末に摩砕しつつ低温で維持し、該粉末を篩過し、均一なサイズの粒子を収集することにより達成される。ミートグラインダ又は類似の機械を通過させるとタンパク質構造に影響するのに十分な熱を発生しない。本発明のための極低温凍結手段は、液体窒素に浸すことによるほとんど瞬時の凍結を意味する。当該技術において既知の他の適切な凍結法は、自己集合タンパク質が所望の粒径への粉末化中に変性点より低い温度で維持される限り企図される。本発明の凍結製粉法の使用により、凍結した自己集合タンパク質ペーストはタンパク質を変性する恐れがなく均一な粒径の粉末に小さくされる。特に、タンパク質は製粉過程全体に低温で継続して維持するために、局部的な製粉表面でさえ変性温度、即ち、37℃を超える温度を受ける恐れがない。従って、この方法で処理したタンパク質から生成されたシーラント組成物は、容易に制御可能であり、直径が非常に均一な粒子を含み、容易に再現性のある障壁特性を有する。本発明のための“均一な粒径”は、自己集合タンパク質から得られた凍結製粉及び篩過粒子が実質的に同じ直径を有することを意味する。更に、本凍結製粉自己集合タンパク質を篩過するスクリーンサイズは、約0.020〜約0.062インチ(0.5 〜1.55mm)の範囲内である。単一スクリーンサイズはたいてい具体的なコーティング組成物について選ばれるので粒径の均一性は最終コーティングに存在する。スクリーンサイズのこの範囲は、選ばれたスクリーンサイズによって直径が約5 〜約750μmの自己集合タンパク質粒子を生じる。本発明に用いられる粒子のサイズは、最終スラリー組成物の粘度を制御するために用いられる要素である。特定の理論に縛られたくないが、均一なサイズの未変性小粒子は本発明の操作に重要であると考えられる。特に、これらの粒子の上記の性質が速やかな結合を可能にしかつ従来技術の組成物より強く粘着性のシーラント組成物を架橋せずに形成することを可能にすると考えられる。従って、自己集合タンパク質の凍結製粉に続いてタンパク質粉砕物を篩過することにより粘度、タンパク質分散及び再現性を含む細胞スラリー組成物の物理的性質について前例のないレベルの制御が当業者によって示される。かかる制御は、安全で信頼できかつ一貫した障壁性をもつ移植片及び内部移植片のような血管人工器官を製造するのに重要である。上で示したように、水性スラリーの粘度は注意して制御されなければならない。特に、水性スラリーの粘度は、処理した多孔性血管人工器官を介して、例えば、血液の望まない漏れを防止する有効な障壁コーティング又は含浸を形成するように十分な自己集合粒子が存在するようにしなければならない。しかしながら、同時に水性スラリーは、多孔性基質に簡便に被覆されるように十分な流れがなければならない。従って、これらの一般的な制約に適合する粘度が本発明に用いられる。自己集合タンパク質を含む水性スラリー組成物の25℃での粘度は、好ましくは約8,000〜約60,000センチポアズ(cps)である。水性スラリー組成物の粘度は、更に好ましくは25℃で約30,000〜約50,000cpsである。上記のように水性スラリー中のタンパク質の粒径は粘度に影響する。しかしながら、スラリー組成物の粘度を制御するために他のパラメーターも用いられる。例えば、スラリー組成物の温度とpH、スラリー組成物が受ける混合の量及び最終スラリー組成物中の自己集合タンパク質の最終濃度は最終粘度に影響する要素である。水性スラリーのpHは、水性状態に保つことを行わせるためにモニターされなければならない。原料の等電点に基づいて、例えば、含有する自己集合タンパク質の等電点に基づいて適切なpHを選ぶことは当業者の知識の範囲内である。例えば、スラリーのpHは、原料の等電点から離れて0.3pH単位以上を維持しなければならない。等電点が4.2である石灰処理したウシ皮膚Ｉ型コラーゲンの場合、水性スラリーのpHは約3.5〜約3.9の範囲に維持されることが好ましい。上記のように、本発明の水性スラリー組成物は、移植製品の可撓性や取り扱い特性を高めるために生物学的に許容しうる可塑剤を含む。適切な可塑剤としては、例えば、グリセロール、ソルビトール及びマンニトールを含む多価アルコールが挙げられる。可塑剤は、水性スラリーの好ましくは約8〜約30重量％である。更に、任意の試薬が本水性スラリー組成物に添加される。それらの試薬は、汚染微生物数の制御のために又はスラリーの流動性を変化させるために用いられる。かかる試薬の使用は、透過性の低い部材を生じることができる。従って、かかる物質は、以後“透過性低下組成”と呼ぶ。そのような試薬の例はエタノールである。更に、エタノールのような試薬が用いられる場合には、制菌剤として機能する追加の利点を与える。浸透性低下組成が用いられる場合には、水性スラリー組成物の好ましくは約24重量％までである。生物活性剤も本水性スラリー組成物に添加される。かかる試薬は、本発明の移植製品の移植に伴う感染症又は血栓形成の恐れを減少させるためにスラリー組成物に添加される。適切な生物活性剤としては、例えば、抗生物質、抗凝固剤、抗菌剤及びその混合物が挙げられる。上記のように、本発明の水性スラリー組成物は、移植製品を体液密着にする。本発明のための“体液密着”は、多孔性移植製品が、例えば、血液のような液体の実質的に透過できなくすることを意味する。所望のレベルの液体密着性を得るために、本発明の水性スラリーは多孔性移植製品と緊密に接触して配置される。血管移植片の場合、水性スラリー組成物はコーティング又は含浸法によって緊密に接触して配置される。かかる方法としては、移植片内に水性スラリー組成物を配置する工程及びスラリー組成物を移植片の表面に被覆させるか又は孔や間隙に浸透させるのに十分な力で移植片の孔を進める工程が含まれる。スラリー組成物を多孔性製品に分配するために用いられる力は、機械的ローラー等の圧力手段、又は流体圧力によって供給される。本水性スラリー組成物は移植製品に複数回被覆される。水性スラリー組成物は移植製品に好ましくは3〜6回被覆される。水性スラリー組成物の各被覆の間にスラリー被覆充填材は乾燥される。その乾燥は、約25〜約35℃の温度で約45〜75分間炉中で行われる。効果的な体液障壁を形成するために架橋を必要としないことは従来技術を超えた本発明の利点であるが、所望される場合には架橋剤が水性スラリー組成物に添加されてもよい。その場合、スラリー組成物中の自己集合タンパク質は、例えば、スラリー被覆血管移植片を乾燥する前に架橋される。生体適合性架橋剤は、本発明の自己集合タンパク質を架橋するために用いられる。適切な架橋剤としては、例えば、ホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドが挙げられる。架橋剤は、好ましくは約0〜約500ppm水性スラリー組成物中に存在する。また、架橋剤はスラリーの被覆後に溶液か又はガス状で導入される。本発明の他の実施態様においては、体内に使用する移植部材が提供される。その移植部材としては、上記の可撓性の多孔性高分子基質が含まれる。水性シーラント組成物は、多孔性基質と緊密に接触している。そのシーラント組成物としては、自己集合タンパク質粉砕物、生体適合性可塑剤及び水のスラリーが含まれる。そのスラリーの各成分は上で別個に記載されている。更に、上で示したように、シーラント組成物の粘度は約8,000〜約60,000cpsに維持される。更に、シーラント組成物のpHはスラリー中に懸濁したタンパク質を維持するために制御される。好適実施態様においては、上記の多孔性血管移植片は本発明のシーラント組成物で被覆及び/又は含浸されて体液密着障壁を形成する。本発明の他の実施態様においては、移植製品を体液密着にする生体適合性水性シーラントスラリーの製造方法が開示される。詳細に示されるように、その方法は、（1）生体吸収性自己集合タンパク質を含むペーストを供給する工程、（2）該ペーストを均一な粒径を有する粉末に低温ですりつぶす工程、（3）該粉末と可塑剤及び水とを混合して25℃の粘度が約8,000〜約60,000センチポアズの上記水性シーラントスラリーを形成する工程及び(4)該スラリーを該ペーストの十分に等電点外のpHに維持して該スラリー中に分散した該自己集合タンパク質を維持する工程が含まれる。本発明の他の実施態様においては、体液密着移植製品の調製方法が提供される。その方法は、（1）上記水性スラリーを供給する工程、（2）該スラリーを可撓性の多孔性高分子基質の表面にタンパク質と該基質の多孔性構造との密接な会合を十分行わせるだけの力で被覆する工程、及び(3)該スラリーを乾燥する工程が含まれる。本発明のスラリー及び体液密着移植製品の調製方法を具体的に説明するために下記の実施例を示す。これらの実施例は、例示のためだけに示され決して限定するものではない。実施例１自己集合タンパク質ペーストの調製本発明の自己集合タンパク質を細胞及び器官培養物、及び全器官の体外移植組織を含む適切な原料から調製する。コラーゲンＩ型及びIII型の場合には、新しい仔ウシ皮膚を若い仔ウシ、胎児又は死産児の死体から機械的に剥離し、回転容器内で冷たい流水でその水が表面のごみ、血液及び/又は組織がないことが認められるまで洗浄する。皮下組織を機械的に洗浄して脂肪や血管のような混入している組織を除去する。次に、皮膚を約12cm幅の細長い切片に縦方向に切断し、皮革工業において一般に用いられる木製又はプラスチック製容器に入れる。皮膚を1MのCa(OH)₂のフラッシャ液で25時間脱毛する。また、皮膚は機械的手段又は化学的及び機械的手段の併用により脱毛される。脱毛後、皮膚を約1”×1 ”片に切断し、冷水で洗浄する。洗浄後、120kgのウシ皮膚を260リットルの水、２リットルのNaOH(50%)及び0.4 リットルのH₂O₂(35%)を含む容器に入れる。これらの成分を4℃で12〜15時間ゆっくりと混合し、過剰量の水道水で30分間洗浄して部分的に精製した皮膚を得る。これらの皮膚を260リットルの水、1.2リットルのNaOH(50%)及び1.4kgのCaCO₃の溶液中で５分間ゆっくりと混合しながら石灰処理する。この処理を１日２回25日間続ける。この石灰処理法は、上記のように0〜8日間続けることが好ましい。この処理後、溶液を傾瀉し、捨てる。次に、皮膚を過剰量の水道水で90分間絶えず撹拌しながら洗浄する。皮膚を70リットルの水中14kgのHCl(35%)を含む溶液中で激しく撹拌しながら酸性にする。その酸を皮膚に約６時間浸透させる。酸性にした後、皮膚を過剰量の水道水で約４時間又はpH約５に達するまで洗浄する。次に、皮膚のpHを0.5％の防腐剤を含む酢酸を用いて3.3〜3.4に調整する。次に、精製した皮膚をミートグラインダで摩砕し、摩砕した皮膚を加圧下で連続的に小さくなるメッシュサイズの一連のフィルターの篩によって押出すことにより原料のペーストにする。最終生成物は純粋なウシ皮膚由来Ｉ型コラーゲンの白色の滑らかな均一ペーストである。この原料コラーゲンペーストを使用するまで0〜25℃で貯蔵する。実施例２凍結製粉法任意のある種の製粉機械のサイズに適合させるために、原料のペーストをミートグラインダによって押出すことにより25kgの実施例１の原料のペーストを処理可能なサイズのカードにする。ミートグラインダに孔のある押出プレートを取付け、原料ペーストを押出す。孔は直径が好ましくは約1/8〜約3/8”である。原料のペーストが押出されるにつれて、例えば、液体窒素を含む低温浴に落ちる。押出し物が低温浴に達すると直ちに凍結し、カード状の形を得る。次に、そのカードを、例えば、SPEX 6700フリーザー/ミル(Spex Industries社、ニュージャージー州エジソン)で低温で粉末状コンシステンシーに製粉する。この凍結製粉末を篩過し、篩過した材料を収集する。この篩過した材料の各粒子の直径は極めて均一である。篩過スクリーンのメッシュ又はスクリーンサイズは約0.020〜約0.062インチ(0.5〜1.55cm)に変動してもよい。スクリーンサイズのその範囲は、用いられるスクリーンによって直径が約5〜約750μmの均一な粒子を生じる。この粉末を、団塊を防止するために好ましくは0℃より低い温度で貯蔵する。実施例３スラリーの調製及び移植片の形成ウシコラーゲンＩ型の水性スラリーを1.6重量％のコラーゲン粉末、8〜30重量％のグリセリンと残りの水を用いて実施例２に従って調製する。このスラリーの粘度を25℃で測定する。粘度が約8,000〜約60,000cpsのコラーゲンスラリー標品だけを処理するために残す。スラリーの粘度範囲は、好ましくは約30,000〜約50 ,000cpsである。次に、この粘度基準を満たす水性スラリーを約15psiの圧力下に多孔性血液移植片に被覆する。この圧力は、スラリーを移植片の内部多孔性構造と緊密に接触させる。次に、移植片を約25〜約35℃の炉内で約45〜約 75分間乾燥する。スラリーが複数回移植片に被覆される。好ましくは3〜6回スラリーが移植片に被覆され、続いて各被覆の間にここに記載された乾燥サイクルが行われる。次に、最終移植片がγ照射を用いて殺菌される。任意の0〜24％のエタノールを、最終移植片の透過性を低下させるためにスラリーに添加する。スラリー中のコラーゲン粒子は、血管移植片に適用する前に任意の0〜500ppmのホルムアルデヒドで架橋される。生物活性剤もコラーゲンスラリーに任意に添加される。その生物活性剤としては、例えば、抗生物質、抗凝固剤及び抗菌剤が挙げられる。コラーゲンスラリーの抗血栓形成性を高めるためにスラリーにヘパリンを添加することが好ましい。この方法で製造された移植片の多孔度は実質的に０である。即ち、移植片は透過性が十分低く、移植前に前凝固を必要としない。実施例４多孔性血管移植片の多孔性試験本発明の、例えば、コラーゲン処理布移植片の多孔性は、次のように３回被覆した後約1％未満まで低下させる。移植片の水多孔性を測定するために用いられる標準水多孔性試験は次の通りである。120mmHg圧に等価なカラムの水をオリフィス上に移植片試料を有する0.5cm²のオリフィスに１分間流し込む。１分間に収集した水の量を測定し、多孔度を計算し、ml/min/cm²として表す。各試料について数回読取る。未処理マイクロベル移植布(Meadox Medicals社、ニュージャージー州フランクリンレイク)の水多孔度は約1,900ml/min/cm²であった。移植片を本発明の組成物で処理後の多孔度は次の通りである。各例のコラーゲンコーティングは、実施例３に記載された組成物に従って調製したウシ皮膚由来可塑化スラリーである。表Ｉの結果に基づいてコラーゲン含浸移植片は本スラリー組成物を少なくとも３回の被覆で処理することが好ましく、各被覆の間に乾燥しつつ４回又は５回被覆することが最も好ましい。実施例５コラーゲンII型スラリー組成物の調製コラーゲンＩ型をコラーゲンII型に置き換える以外は実施例３に記載されたようにスラリーを製造する。スラリー被覆移植片の性質は可撓性、取り扱い及び体液密着性が実施例３と実質的に同じである。実施例６コラーゲンIII型スラリー組成物の調製コラーゲンＩ型をコラーゲンIII型に置き換える以外は実施例３に記載されたようにスラリーを製造する。スラリー被覆移植片の性質は可撓性、取り扱い及び体液密着性が実施例３と実質的に同じである。実施例７コラーゲンIV型スラリー組成物の調製コラーゲンＩ型をコラーゲンIV型に置き換える以外は実施例３に記載されたようにスラリーを製造する。スラリー被覆移植片の性質は可撓性、取り扱い及び体液密着性が実施例３と実質的に同じである。実施例８コラーゲンV型スラリー組成物の調製コラーゲンＩ型をコラーゲンV型に置き換える以外は実施例３に記載されたようにスラリーを製造する。スラリー被覆移植片の性質は可撓性、取り扱い及び体液密着性が実施例３と実質的に同じである。実施例９コラーゲンVI型スラリー組成物の調製コラーゲンＩ型をコラーゲンVI型に置き換える以外は実施例３に記載されたようにスラリーを製造する。スラリー被覆移植片の性質は可撓性、取り扱い及び体液密着性が実施例３と実質的に同じである。実施例10 コラーゲンVII型スラリー組成物の調製コラーゲンＩ型をコラーゲンVII型に置き換える以外は実施例３に記載されたようにスラリーを製造する。スラリー被覆移植片の性質は可撓性、取り扱い及び体液密着性が実施例３と実質的に同じである。実施例11 コラーゲンVIII型スラリー組成物の調製コラーゲンＩ型をコラーゲンVIII型に置き換える以外は実施例３に記載されたようにスラリーを製造する。スラリー被覆移植片の性質は可撓性、取り扱い及び体液密着性が実施例３と実質的に同じである。実施例12 コラーゲンIX型スラリー組成物の調製コラーゲンＩ型をコラーゲンIX型に置き換える以外は実施例３に記載されたようにスラリーを製造する。スラリー被覆移植片の性質は可撓性、取り扱い及び体液密着性が実施例３と実質的に同じである。実施例13 コラーゲンＸ型スラリー組成物の調製コラーゲンＩ型をコラーゲンＸ型に置き換える以外は実施例３に記載されたようにスラリーを製造する。スラリー被覆移植片の性質は可撓性、取り扱い及び体液密着性が実施例３と実質的に同じである。実施例14 コラーゲンXI型スラリー組成物の調製コラーゲンＩ型をコラーゲンXI型に置き換える以外は実施例３に記載されたようにスラリーを製造する。スラリー被覆移植片の性質は可撓性、取り扱い及び体液密着性が実施例３と実質的に同じである。実施例15 コラーゲンXII型スラリー組成物の調製コラーゲンＩ型をコラーゲンXII型に置き換える以外は実施例３に記載されたようにスラリーを製造する。スラリー被覆移植片の性質は可撓性、取り扱い及び体液密着性が実施例３と実質的に同じである。実施例16 コラーゲンXIII型スラリー組成物の調製コラーゲンＩ型をコラーゲンXIII型に置き換える以外は実施例３に記載されたようにスラリーを製造する。スラリー被覆移植片の性質は可撓性、取り扱い及び体液密着性が実施例３と実質的に同じである。実施例17 コラーゲンXIV型スラリー組成物の調製コラーゲンＩ型をコラーゲンXIV型に置き換える以外は実施例３に記載されたようにスラリーを製造する。スラリー被覆移植片の性質は可撓性、取り扱い及び体液密着性が実施例３と実質的に同じである。実施例18 コラーゲンXV型スラリー組成物の調製コラーゲンＩ型をコラーゲンXV型に置き換える以外は実施例３に記載されたようにスラリーを製造する。スラリー被覆移植片の性質は可撓性、取り扱い及び体液密着性が実施例３と実質的に同じである。実施例19 フィブロネクチンスラリー組成物の調製コラーゲンＩ型をフィブロネクチンに置き換える以外は実施例３に記載されたようにスラリーを製造する。スラリー被覆移植片の性質は可撓性、取り扱い及び体液密着性が実施例３と実質的に同じである。実施例20 ビトロネクチンスラリー組成物の調製コラーゲンＩ型をビトロネクチンに置き換える以外は実施例３に記載されたようにスラリーを製造する。スラリー被覆移植片の性質は可撓性、取り扱い及び体液密着性が実施例３と実質的に同じである。実施例21 プロテオグリカンスラリー組成物の調製コラーゲンＩ型をプロテオグリカンに置き換える以外は実施例３に記載されたようにスラリーを製造する。スラリー被覆移植片の性質は可撓性、取り扱い及び体液密着性が実施例３と実質的に同じである。実施例22 ラミニンスラリー組成物の調製コラーゲンＩ型をラミニンに置き換える以外は実施例３に記載されたようにスラリーを製造する。スラリー被覆移植片の性質は可撓性、取り扱い及び体液密着性が実施例３と実質的に同じである。実施例23 ヒアルロン酸スラリー組成物の調製コラーゲンＩ型をヒアルロン酸に置き換える以外は実施例３に記載されたようにスラリーを製造する。スラリー被覆移植片の性質は可撓性、取り扱い及び体液密着性が実施例３と実質的に同じである。実施例24 テナシンスラリー組成物の調製コラーゲンＩ型をテナシンに置き換える以外は実施例３に記載されたようにスラリーを製造する。スラリー被覆移植片の性質は可撓性、取り扱い及び体液密着性が実施例３と実質的に同じである。実施例25 インテグリンスラリー組成物の調製コラーゲンＩ型をインテグリンに置き換える以外は実施例３に記載されたようにスラリーを製造する。スラリー被覆移植片の性質は可撓性、取り扱い及び体液密着性が実施例３と実質的に同じである。実施例26 カドヘリンスラリー組成物の調製コラーゲンＩ型をカドヘリンに置き換える以外は実施例３に記載されたようにスラリーを製造する。スラリー被覆移植片の性質は可撓性、取り扱い及び体液密着性が実施例３と実質的に同じである。実施例27 トライアングルテストにおいては、従来技術の移植片と本発明の移植片の物理的性質を比較するために当該分野における専門家に尋ねた。本実験において用いた専門の回答者はSTS会議、カリフォルニア州パームストリングス，Jan.29-Feb. 1,1995に出席している47人の胸部外科医(全て従来のコラーゲン被覆血管移植片の使用者)から構成された。本試験には30mmの織り血管移植片を用いた。トライアングルテストは、血管移植片の３試料を各回答者に同時に又は連続して提示することが含まれた。各回答者に提示した移植片の２つは同じ組成物で必ず被覆され、第３の移植片は異なる組成物で被覆された。各回答者には、異なっていると考えられる試料を選ぶことが要求された。異なる試料を巧く選んだ後、回答者に好ましい２つのタイプの移植片を尋ねた。順序と提示の偏りを中立化するために、従来技術の組成物で被覆した移植片と本組成物で被覆した移植片を共に異なる試料として同じようにしばしば用いた( 即ち、回答者の半数は本組成物で被覆した２つの移植片と１つの従来試料を評価するために与えられ、半数は２つの従来試料と１つの本発明の試料を評価するために与えられた)。更に、試料を全て１番目、２番面及び３番目の位置に同じ回数提示した。上記スクリーニングの要求を満たした後、各回答者は取り扱い特性を評価するために３試料が与えられた。回答者に試料を切断及び縫合すること及び異なる試料であることを同定することを指示した。選定を行った後、好ましい試料を選定しその選択の理由を示すように尋ねた。異なる試料を正確に同定した回答者のみ選択分析に含めた。トライアングル実験と選択分析の結果から、専門家の80％が従来技術の組成物で被覆した血管移植片と本発明の組成物で被覆した血管移植片を区別することができることが示された。更に、２つの試料を区別することができる専門家の87％が本発明の組成物で被覆した移植片を選んだ。本発明の組成物で被覆した移植片を選ぶ理由として専門家によって次の特性:優れた柔軟性(71%);優れた可撓性(56 %);優れた飽和性(38%)が言及された。まとめとして、トライアングルテスト及び選択分析が示すように、本発明の組成物は良好な取り扱い特性、即ち、軟らかい感じと可撓性が一貫して得られることを含む最終移植片生成物の反復可能でかつ均一な特性を可能にする。これは、本発明範囲内の制御粒径を使用せず、かつ“手”での変化を含む最終製品の幅のある変化を引き起こす従来法と対照的である。本発明はこのように記載されるが、多くの方法で変えられることは明らかである。そのような変更は本発明の真意及び範囲からの逸脱とはみなされず、そのような変更は全て次の請求の範囲の範囲内に包含されるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者クーエンアルアメリカ合衆国ニュージャージー州 07470 ウェインクレアモントアベニュー 34 (72)発明者サンウームーンハエアメリカ合衆国ニュージャージー州 07675 オールドタパンレイクヴィュードライヴ 28

Claims

【特許請求の範囲】１．実質的に均一な粒径を有する自己集合タンパク質粉砕物、生体適合性可塑剤、及び水を含む、多孔性移植製品の表面上に体液密着障壁を形成する生体適合性水性スラリー組成物であって、25℃で約8,000〜約60,000センチポアズの粘度及び懸濁した前記タンパク質粉砕物を十分維持するだけのpHを有する、前記生体適合性スラリー組成物。２．前記自己集合タンパク質が約1〜約３重量％の濃度で前記スラリー中に存在する、請求項１記載の生体適合性スラリー組成物。３．前記自己集合タンパク質がコラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、ラミニン、ヒアルロン酸、テナシン、インテグリン、カドヘリン及びその混合物からなる群より選ばれる、請求項１記載の生体適合性スラリー組成物。４．前記自己集合タンパク質がウシコラーゲンＩ型である、請求項３記載の生体適合性スラリー組成物。５．透過性低下組成を更に含む、請求項１記載の生体適合性スラリー組成物。６．前記透過性低下組成が約0〜約24％のエタノールである、請求項５記載の生体適合性スラリー組成物。７．前記粒径が約5〜約750μmである、請求項１記載の生体適合性スラリー組成物。８．前記粘度が約30,000〜約50,000センチポアズである、請求項１記載の生体適合性スラリー組成物。９．前記pHが前記タンパク質粉砕物の十分に等電点外の範囲にあり前記タンパク質を水性状態で維持する、請求項１記載の生体適合性スラリー組成物。 10．前記pHが約3.5〜約3.9である、請求項９記載の生体適合性スラリー組成物。 11．前記可塑剤がグリセロール及びソルビトールの１種である、請求項１記載の生体適合性スラリー組成物。 12．前記可塑剤が約8〜約30重量％で前記スラリー組成物中に存在する、請求項１記載の生体適合性スラリー組成物。 13．前記自己集合タンパク質が架橋される、請求項１記載の生体適合性スラリー組成物。 14．前記自己集合タンパク質がホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドの１種で架橋される、請求項13記載の生体適合性スラリー組成物。 15．生物活性剤を更に含む、請求項１記載の生体適合性スラリー組成物。 16．前記生物活性剤が抗生物質、抗凝固剤、抗菌剤及びその混合物からなる群より選ばれる、請求項15記載の生体適合性スラリー組成物。 17．多孔性高分子移植製品と緊密に接触して配置され、前記製品を実質的に体液密着にする、請求項１記載の生体適合性スラリー組成物。 18．可撓性の多孔性高分子基質;及び下記成分を含む、前記多孔性基質と緊密に接触している水性シーラント組成物: 均一な粒径を有する自己集合タンパク質粉砕物のスラリー、生体適合性可塑剤、及び水を含む体内で使用するための移植部材であって、前記シーラント組成物が25℃で約8,000〜約60,000センチポアズの粘度及び懸濁した前記タンパク質粉砕物を十分維持するだけのpHを有する、前記移植部材。 19．前記自己集合タンパク質が約1〜約３重量％の濃度で前記シーラント組成物中に存在する、請求項18記載の移植部材。 20．前記自己集合タンパク質がコラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、ラミニン、ヒアルロン酸、テナシン、インテグリン、カドヘリン及びその混合物からなる群より選ばれる、請求項18記載の移植部材。 21．前記自己集合タンパク質がウシコラーゲンＩ型である、請求項20記載の移植部材。 22．前記シーラント組成物が透過性低下組成を更に含む、請求項18記載の移植部材。 23．前記透過性低下組成が約0〜約24％のエタノールである、請求項22記載の移植部材。 24．前記可塑剤がグリセロール及びソルビトールの１種である、請求項18記載の移植部材。 25．前記可塑剤が約8〜約30重量％で前記シーラント組成物中に存在する、請求項24記載の移植部材。 26．前記集合タンパク質が架橋される、請求項18記載の移植部材。 27．前記タンパク質がホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドの１種で架橋される、請求項26記載の移植部材。 28．前記シーラント組成物が生物活性剤を更に含む、請求項18記載の移植部材。 29．前記生物活性剤が抗生物質、抗凝固剤、抗菌剤及びその混合物からなる群より選ばれる、請求項28記載の移植部材。 30．前記粘度が約30,000〜約50,000センチポアズである、請求項18記載の移植部材。 31．前記pHが前記タンパク質粉砕物の十分に等電点外の範囲にあり前記タンパク質を水性状態で維持する、請求項18記載の移植部材。 32．前記pHが約3.5〜約3.9である、請求項18記載の移植部材。 33．移植製品を体液密着にする生体適合性水性シーラントスラリーの製造方法であって、 a）生体吸収性自己集合タンパク質を含むペーストを供給する工程; b）前記ペーストを均一な粒径を有する粉末に低温ですりつぶす工程; c）前記粉末と可塑剤及び水とを混合して25℃で約8,000〜約60,000センチポアズの粘度を有する前記水性シーラントスラリーを形成する工程;及び d）前記ペーストの十分に等電点外のpHで前記スラリーを維持して前記スラリー中に懸濁した前記タンパク質を維持する工程を含む、前記方法。 34．前記均一粒径が約5〜約750μmである、請求項33記載の方法。 35．前記pHが約3.5〜3.9である、請求項33記載の方法。 36．前記シーラントスラリーの粘度が約30,000〜約50,000センチポアズである、請求項33記載の方法。 37．体液密着移植製品の調製方法であって、 a）均一な粒径を有する自己集合タンパク質粉砕物、生体適合性可塑剤及び水を含む水性スラリーであって、約8,000〜約60,000センチポアズの粘度及び前記スラリー中に懸濁した前記タンパク質を十分維持するだけのpHを有する、前記スラリーを供給する工程; b）前記スラリーを可撓性の多孔性高分子基質の表面に前記タンパク質と前記基質の前記多孔性構造との密接な会合を十分行わせるだけの力で被覆する工程;及び c）前記スラリーを前記基質表面上で乾燥させる工程を含む、前記方法。 38．前記タンパク質が前記乾燥工程前に架橋される、請求項37記載の方法。 39．前記均一な粒径が約5〜約750μmである、請求項37記載の方法。 40．前記pHが約3.5〜3.9である、請求項37記載の方法。 41．前記シーラントスラリーの粘度が約30,000〜約50,000センチポアズである、請求項37記載の方法。 42．前記力が圧力である、請求項37記載の方法。