JP2016523635A - Vi型コラーゲンを含む医用デバイス - Google Patents
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Abstract
Description
(i)組織接触表面を有する非生分解性基材を準備すること、
(ii)任意に、リンカー分子を前記組織接触表面に結合させること、および
(iii)前記組織接触表面の少なくとも一部を、VI型コラーゲンのミクロフィブリルを含む溶液と接触させて、前記VI型コラーゲンのミクロフィブリルを前記表面および/または前記リンカー分子に結合させること
を含む方法を提供する。
(ii−a)リンカー分子および溶媒を含む溶液を物品の表面に適用すること、および
(ii−b)前記溶媒を除去すること
によって実施され得る。
(iii−a)VI型コラーゲンのミクロフィブリルおよび溶媒を含む溶液を前記表面に適用すること、
(iii−b)前記表面に前記溶液を適用させた基材をインキュベートすること、および
(iii−c)前記溶媒を除去すること
によって実施され得る。
工程iii−b)は、物品を4〜40℃の範囲の温度に少なくとも10分間、保持することによって実施され得る。
聴覚デバイス(骨固定型補聴器とも称される)が挙げられる。インプラントの一部のみが軟組織と接触することが意図される場合には、VI型コラーゲンを含むコーティングは、少なくとも軟組織接触表面の一部に施されることが好ましい。
A.材料および方法
1.細菌
Streptococcus mitis、Actinomyces naeslundii、Fusobacterium nucleatumおよびPrevotella intermediaは、Julia DaviesおよびGunnel Svensaeter(Department of Oral Biology, Faculty of Odontology, Malmoe University, Malmoe, Sweden)から恵与を受けた。S.mitisおよびA.naeslundiiは、5%CO2を含む湿潤雰囲気中37℃で、Todd−Hewittブロス(THB)中で一夜増殖させた。F.nucleatumおよびP.intermediaは、嫌気性条件下の湿潤雰囲気中37℃で、ペプトン酵母グルコース(PYG)培地中で増殖させた。
VI型コラーゲンはAbdillahiら(2012)が記載したようにしてウシ角膜からコラゲナーゼ消化によって分離した。仔ウシの眼を近傍の屠畜場から入手した。角膜を細切し、コラゲナーゼで抽出し、続いてSepharose CL−2Bによってゲル濾過した。
箔から直径5mmのチタン円環をパンチで切り出した。円環を最初にクロロホルムで、次いで蒸留水で洗浄する。風乾後、ポリ−L−リジン(0.2mg/ml)50μLを所望のチタン片に適用した。次いで片を60℃で2時間、インキュベートしなければならない。その後、チタンを再び蒸留水で洗浄し、風乾する。その間に、12ウェルプレートのウェルにVI型コラーゲン溶液1mLを適用する。最後に所望のチタン円環をVI型コラーゲン溶液に浸漬して4℃で一夜インキュベートする。翌朝、チタンを風乾し、分析を行った。
付着分析のため、S.mitisおよびA.naeslundiiは10mLのTHB中で一夜、F.nucleatumおよびP.intermediaは嫌気性条件下、PYG培地で増殖させ、翌日、4℃、3500rpmで10分間ペレット化した。嫌気性菌種であるFusobacterium nucleatumおよびPrevotella intermediaについては、嫌気箱の中で手順を実施した。次いでペレットを10mLのPBSTで希釈し、OD600を測定した。OD600は1に調整し、PBSTで2倍に希釈しなければならない。細菌溶液500μLを、調製したチタン円環を入れた各ウェルに適用し、5%CO2、37℃で0、30および240分間、インキュベートした。
5.1 FACSのためのBacLight
フローサイトメトリー分析によって単細胞の性質を決定することができる。本研究において細菌細胞を染色するためにBacLight染色を用いた。それにより、一集団中における生菌と死菌の量を区別することができる。
SEMを用いて、被覆されたチタン表面への細菌の付着を精査することができる。
チタン表面上でVI型コラーゲンがどの程度長期に活性であるかを検討するため、実験装置に毎日、新たな細菌を適用した。
歯科インプラントをγ線照射で工業的に滅菌する。照射がVI型コラーゲンに影響するかを検討するため、長期研究を行った。通常通りチタンを被覆し、γ線照射で処理した。
生来の免疫系が歯科インプラント上で増殖する口腔内細菌とどのように反応するかを精査するため、チタンスクリューおよび支台をPLLまたはpLL/cVIのいずれかで被覆し、S.mitisまたはA.naeslundiiとインキュベートした。
スクリューおよび支台を最初にクロロホルム、続いて脱イオン水で洗浄し、24ウェルプレートに適用した。インプラントが覆われるまで、500μLのポリ−L−リジンを加えた。pLLが乾燥するまでインプラントを60℃でインキュベートした。次いでインプラントを脱イオン水で洗浄して未結合のpLLを除いた。VI型コラーゲンで被覆されたスクリューおよび支台を1.5mLの反応チューブに適用した。インプラントが完全に覆われるまでVI型コラーゲンを加え、次いで4℃で一夜インキュベートした。翌日、VI型コラーゲンを除き、インプラントを風乾した。
細菌を標準的条件下、THB中で一夜増殖させた。翌日、細菌溶液1mLを9mLの新鮮なTHBに加えた。OD600が0.4に達するまで、細菌を増殖させた。次いで4℃、3500rpm、10分間で細菌をペレット化した。上清を廃棄し、冷却した10mLのTG緩衝液でペレットを希釈した。ODを測定し、細菌溶液を2度目にペレット化した。上清を廃棄した後、冷却したTG緩衝液で細菌量を1%に調整した。好中球を分離するまで、細菌を氷上に保存した。
好中球を分離するため、20mLのpolymorph−prep(商標)を50mLのファルコンチューブにピペットで入れた。健常供血者の血液をヘパリン入りの6mLのチューブに採集し、室温で30分間インキュベートした。分画を混合することなく、20mLの血液の上にpolymorph−prepの層を重ねた。種々の血液成分を分離するため、ファルコンチューブを500×g、20℃で60分間遠心した。遠心の後、種々の層が見られた。好中球層を取り出し、新しいファルコンチューブに移した。次いで好中球を2倍量の1×PBSで洗浄し、500×g、20℃で10分間遠心した。次いで混在する赤血球を2.7mLの無菌ミリポア水で10秒間、溶解させた。300μLの10×PBSで反応を停止させた。体積を15mLに調整し、試料を250×g、20℃で5分間遠心した。全ての赤血球が溶解するまで、この工程を繰り返さなければならない。ペレットを500mLのナトリウム培地(5.6mMのグルコース、127mMのNaCl、10.8mMのKCl、2.4mMのKH2PO4、1.6mMのMgSO4、10mMのHepes、および1.8mMのCaCl2を含み、NaOHでpHを7.3に調整した)で希釈し、Luna(商標)自動細胞計数器を用いて細胞を計数した。試料あたりの細胞の量を計算し、対応する体積の好中球懸濁液を、スクリュー、支台および細菌溶液を含む1.5mLの反応チューブごとに加えた。試料を0、30、60および120分間インキュベートし、1mLのEM−fix(0.15Mカコジル酸ナトリウム中の2.5%グルタルアルデヒド)に移した。SEMのための調製は熟練した技師が行った。
ExcelおよびGraphPad Prism 6.0を用いてデータを解析した。実験は少なくとも2回、独立に行った。クリスタルバイオレットを用いる殺菌分析は3重試験、蛍光顕微鏡によるBacLight生菌計数は2重試験を行った。クリスタルバイオレットを用いる殺菌分析および蛍光顕微鏡によるBacLightのデータについて、一元配置分散分析(ANOVA)を用いた。被覆していないウェルでインキュベートした細菌から得られたデータを陽性対照とした。有意差はp<0.0001について****と表す。
1.細菌の付着
付着の程度を試験するため、被覆したチタン表面上で細菌をインキュベートし、走査電子顕微鏡で解析した。4時間のインキュベーションの後、Streptococcus mitisとActinomyces naeslundiiの両方の検出できる細菌量がいくらか増加していた。異なったコーティングの間では、目視できる細菌の付着には差異がない。嫌気性菌種であるFusobacterium nucleatumおよびPrevotella intermediaは、表面上で同程度の付着を示した。これらの結果に鑑み、殺菌分析において付着の程度を適切にするため、細菌を2時間インキュベートした。
2.1 FACSのためのBacLight
生菌量を決定するため、FACSを用いる生存率解析を行った。死菌を染色するため、ヨウ化プロピジウム(PI)を用いた。VI型コラーゲンで処理したS.mitisについては、低いSTYO9シグナルが検出された。インキュベーションの0分後のみ、160μLのコラーゲンで処理した細菌の約15%が生存している。PIについては、VI型コラーゲンで処理した細菌のシグナルは、160、200および500μLで処理した細菌における約80%の最大値まで経時的に増大した。
種々のコーティングを有するチタン表面における殺菌を、48時間にわたって走査電子顕微鏡によって解析した。種々の菌種についての代表的な画像を、図1〜図4に示す。
VI型コラーゲンの長期活性を、γ線照射で処理した試験表面についても5日間、観察した。毎日、新鮮な0.1%の細菌溶液を適用した。VI型コラーゲンによる処理がない場合には、96時間のインキュベーションの間、S.mitisとA.naeslundiiの両方において細菌量は大幅に増加する。これと比較して、VI型コラーゲンの存在によって僅か2時間のインキュベーションの後に殺菌が惹起される。生残したいくらかの細菌がその後、分裂を開始するが、VI型コラーゲンで処理しなかった細菌と同様ではない。γ線照射で工業的に滅菌した、被覆したチタン上で同じ実験を行った場合、通常の被覆チタンと比較して差異は観察されなかった。VI型コラーゲンを含む設定においては、2時間後に殺菌が観察された。
好中球の存在下、独立した実験で、チタンスクリュー上(図8、下行)および支台上(図8、上行)でそれぞれ、S.mitisおよびA.naeslundiiをインキュベートした。図9および図10A−Bにおいて、口腔内病原菌に対する好中球の効果を詳細に観察することができる。図10A(スクリュー)および図10B(支台)は、S.mitisの殺滅およびNETの形成を示す(NETは図中の矢印で示す)。VI型コラーゲンの存在下で、死滅する細菌が即時に(インキュベーション0分)見られた。効果は120分のインキュベーションの間に増強され、広範囲の膜の気泡形成および細胞質の浸出によって可視化される。病原菌をVI型コラーゲンで処理しない場合には、120分後にNETosisによる殺滅が観察されるが、その程度はかなり少ない(図10)。A.naeslundiiについてもVI型コラーゲンによるコーティングの同様の効果が見られる。スクリューと支台の表面では差異は見られなかった。
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Claims (21)
- 生体内への挿入を意図した医用デバイスであって、前記医用デバイスが、組織接触表面を有する非生分解性基材を含み、前記組織接触表面がVI型コラーゲンのミクロフィブリルによって少なくとも部分的に被覆されている、医用デバイス。
- 前記VI型コラーゲンが未変性のミクロフィブリルとして存在する、請求項1に記載の医用デバイス。
- 前記未変性のミクロフィブリルが、保存されたN−およびC−末端の球状ドメインを含む、請求項2に記載の医用デバイス。
- 前記非生分解性基材が、金属、セラミックまたはプラスチック材料から選択される生体適合性材料を含む、請求項1に記載の医用デバイス。
- 前記非生分解性基材が、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、バナジウム、ニオブ、タンタル、コバルトおよびイリジウム、ならびにそれらの合金からなる群から選択される金属材料を含む、請求項4に記載の医用デバイス。
- 前記非生分解性基材がセラミック材料を含む、請求項4に記載の医用デバイス。
- 前記医用デバイスが、耐荷重性インプラントである、請求項1に記載の医用デバイス。
- 前記医用デバイスが歯科インプラントまたはその部品である、請求項1に記載の医用デバイス。
- 前記歯科インプラントまたはその部品が、歯科固定具、歯科支台およびワンピース歯科インプラントから選択される、請求項8に記載の医用デバイス。
- 前記医用デバイスが骨に固定された聴覚デバイスである、請求項1から6のいずれか一項に記載の医用デバイス。
- 前記医用デバイスがステントである、請求項1から6のいずれか一項に記載の医用デバイス。
- 前記医用デバイスがシャントである、請求項1から6のいずれか一項に記載の医用デバイス。
- 前記医用デバイスが整形外科インプラントである、請求項1から7のいずれか一項に記載の医用デバイス。
- 前記表面が1nm〜50nm、たとえば5nm〜50nmの範囲の層厚を有するVI型コラーゲンの層で被覆された、請求項1に記載の医用デバイス。
- 前記VI型コラーゲンがリンカー分子を介して前記表面に結合している、請求項1に記載の医用デバイス。
- 医用デバイスの表面を被覆する方法であって、
(i)組織接触表面を有する非生分解性基材を準備すること、
(ii)任意に、リンカー分子を前記組織接触表面に結合させること、および
(iii)前記組織接触表面の少なくとも一部を、VI型コラーゲンのミクロフィブリルを含む溶液と接触させて、前記VI型コラーゲンのミクロフィブリルを前記表面および/または前記リンカー分子に結合させること
を含む方法。 - 工程ii)が、
(ii−a)前記リンカー分子および溶媒を含む溶液を物品の表面に適用すること、および
(ii−b)前記溶媒を除去すること
によって実施される、請求項16に記載の方法。 - 前記リンカー分子がポリ−L−リジン(PLL)を含む、請求項16または17に記載の方法。
- 工程iii)が、
(iii−a)VI型コラーゲンのミクロフィブリルおよび溶媒を含む溶液を前記表面に適用すること、
(iii−b)前記表面に前記溶液を適用させた前記基材をインキュベートすること、および
(iii−c)前記溶媒を除去すること
によって実施される、請求項16に記載の方法。 - VI型コラーゲンのミクロフィブリルを含む前記溶液が、10nM〜10μMの範囲のコラーゲンフィブリル濃度を有する、請求項19に記載の方法。
- 前記VI型コラーゲンが未変性のミクロフィブリルとして存在する、請求項16に記載の方法。
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