JP2001525419A - ペプチドをベースにしたジェミニ化合物 - Google Patents

ペプチドをベースにしたジェミニ化合物

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アンドレアス・クレマー
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スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー
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Abstract

(57)【要約】 ２本の結合した鎖を含むペプチドをベースにしたジェミニ化合物（ａ）を開示する。各鎖は、（１）１個またはそれ以上のアミノ酸および／またはアミンから形成される、正に帯電した親水性頭部Ｑ1またはＱ2；（２）ポリペプチド骨格を有する中央部Ｐ1またはＰ2；ならびに（３）疎水性尾部Ｒ1またはＲ2を有し、各鎖の中央部はブリッジＹによりＰ1およびＰ2を介して結合している。それらの製造方法および使用も開示する。かかる使用は、インビボおよびインビトロにおける細胞中へのポリヌクレオチドのトランスフェクションを包含する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、新たに同定された、ペプチドをベースにしたジェミニ（gemini）表
面活性剤化合物、かかる化合物の使用ならびにそれらの製造に関する。また本発
明は、ドラッグデリバリーのために化合物を細胞中に導入しやすくするための、
ペプチドをベースにしたジェミニ化合物の使用にも関する。
【０００２】 表面活性剤は、低濃度でさえも、液体の界面特性に著しい影響を与える物質で
ある。例えば、表面活性剤は、水または水溶液に溶解された場合、表面張力を有
意に低下させ、２種の液体または液体と固体間の界面張力を低下させる。界面活
性分子のこの特性は工業的に、特にデタージェント工業および油脂工業において
広く開発されている。１９７０年代に、新たなクラスの表面活性剤分子が報告さ
れ、疎水性ブリッジにより結合された、極性頭部を有する２個の疎水性の鎖によ
って特徴づけられた（Deinega, Y. et al., Kolloidn. Zh. 36, 649, 1974）。 これらの分子は「ジェミニ」と呼ばれ（Menger, FM and Littau, CA, J. Am. Ch
em. Soc., 113, 1451, 1991）、それらのモノマー等価物に優る非常に望ましい 特性を有する。例えば、それらは液体をベースとした油および水間の界面張力の
低下に非常に有効であり、非常に低い臨界ミセル濃度を有する。
【０００３】 カチオン性表面活性剤は、とりわけ、培養細胞中へのポリヌクレオチドのトラ
ンスフェクションに使用されており、遺伝子工学の科学者に市販されているかか
る薬剤の例としては、Promega Corp. WI, USAから市販されている、真核細胞の トランスフェクション用のTfxTM-50がある。
【０００４】 遺伝子治療またはアンチセンス療法のためのインビボにおけるＤＮＡの細胞へ
の有効なデリバリーは、ここ数年間の主要な目標である。デリバリービヒクルと
してのウイルスの使用、例えば、呼吸管上皮細胞へのアデノウイルスの適用は、
シスチックフィブロシス（ＣＦ）の修正的遺伝子治療への見通しを伴うものであ
る。しかしながら、ＣＦ患者における遺伝子導入成功の証拠がいくつかあるが、
アデノウイルス経由は炎症性副作用およびトランスフェクション遺伝子の限定さ
れた一時的発現による問題がある。カチオン性表面活性剤を用いる研究を包含す
るインビボでの遺伝子デリバリーのためのいくつかの別法が検討されている。Ga
o, X et al, (1995) Gene Ther. 2, 710-722は、アミン担持カチオン性脂質を用
いてＣＦトランスメンブランコンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）に関す
る正常ヒト遺伝子をＣＦマウスの呼吸器上皮に導入する、このアプローチの実行
可能性を示した。このグループは、その後リポソームＣＦ遺伝子治療を試みたと
ころ、部分的に成功し、ヒトにおけるこのアプローチの可能性が示された（Calp
en, NJ. et al., Nature Medicine, 1, 39-46, 1995）。より最近になって、他 のグループは、遺伝子治療のための他のカチオン性脂質、例えばコレステロール
誘導体の可能性を検討した（Oudrhiri, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 94, 1651-1656, 1997）。この限定された研究は、これらのコレステロールを ベースにした化合物の、インビトロおよびインビボにおける上皮細胞への遺伝子
導入を容易ならしめる能力を示し、それゆえ、このアプローチの正当性が支持さ
れた。
【０００５】 これらの研究および他の研究は、インビトロでの細胞を用いたトランスフェク
ション実験ならびにインビボでの遺伝子治療およびアンチセンス療法のために、
ポリヌクレオチドを細胞中に効果的に導入することを容易ならしめる、毒性の低
い新規な表面活性剤分子を開発することが、研究の新たな分野において必要であ
り続けている、ということを示す。本発明は、現存の化合物により示される困難
性を克服することを目的とするものである。
【０００６】 本発明は、２本の結合した鎖を含むペプチドをベースにしたジェミニ化合物：
【化９】 ［式中、各鎖は、 （１）１個またはそれ以上のアミノ酸および／またはアミンから形成される、正
に帯電した親水性頭部Ｑ1またはＱ2； （２）ポリペプチド骨格を有する中央部Ｐ1またはＰ2； （３）疎水性尾部Ｒ1またはＲ2 を有し、各鎖の中央部はブリッジＹによりＰ1およびＰ2を介して結合している。
］に関する。
【０００７】 好ましくは、中央部は２個または３個のアミノ酸Ｐa（存在していてもよい） 、ＰbおよびＰcから構成されており、ＰaはＤ−またはＬ−アミノ酸、好ましく は、スレオニンまたはセリンのごとき親水性アミノ酸である。好ましくは、Ｐb はＤ−またはＬ−システイン、セリンまたはスレオニンであり、好ましくは、Ｐ c はＤ−またはＬ−セリンまたはスレオニンであり、Ｒ1またはＲ2に結合してい る。
【０００８】 本発明の好ましい化合物は、式（Ｉ）：
【化１０】 ［式中、Ａ1およびＡ5は同じであっても異なっていてもよく、直鎖状または分枝
状に結合された、好ましくはアミド結合（ＣＯＮＨ）により結合された１個また
はそれ以上のアミノ酸またはアミンから構成される正に帯電した基であり； Ａ2／Ａ6ＣＨ（ＮＨ）ＣＯは同じであっても異なっていてもよく、アミノ酸、
好ましくはセリンから誘導されるものであり； ｐおよびｑは同じであっても異なっていてもよく、０または１であり； Ｘ1／Ｘ2ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ）ＣＯは同じであっても異なっていてもよく、シス テインから誘導されるか（Ｘ1／Ｘ2＝Ｓ）、あるいはセリンまたはメチオニンか
ら誘導され（Ｘ1／Ｘ2＝Ｏ）； Ａ4／Ａ8ＣＨ（ＮＨ）ＣＯは同じであっても異なっていてもよく、セリンまた
はスレオニンから誘導され； Ｙはリンカー基であり、好ましくは（ＣＨ2）mであり、ｍは１ないし６の整数
、最も好ましくは２であり、Ｘ1およびＸ2がそれぞれＳである場合にはＹはジス
ルフィド結合であってもよく； Ｒ1およびＲ2はＣ(10-20)飽和または不飽和アルキル基であり； ＷおよびＺはＮＨ、Ｏ、ＣＨ2またはＳである］で示される化合物；またはそ の塩、好ましくはその医薬上許容される塩を包含する。
【０００９】 好ましくは、化合物は対称であり、すなわち、Ａ1およびＡ5が同じであり、Ａ 2 およびＡ6が同じであり、Ａ4およびＡ8が同じであり、Ｒ1およびＲ2が同じであ
り、ＷおよびＺが同じである。
【００１０】 Ａ1／Ａ5の典型例は、アルギニン、リジン、オルニチンおよびヒスチジンから
選択されるＤ−またはＬ−アミノ酸であり、好ましくは、リジンであるか、ある
いはスペリミンまたはスペルミジンのごときアミンである。７個までのアミノ酸
および／またはアミンが直鎖状または分枝状に連結されてもよい。好ましい例は
、２個または３個のリジンまたはオルニチン、またはリジン、オルニチン、アル
ギニンおよびヒスチジンの組み合わせを有する基を包含し、例えば、 ＣＯＣＨ（ＮＨＲ）（ＣＨ2）4ＮＨＣＯ（ＮＨ2）（ＣＨ2）4ＮＨ2 または ＣＯＣＨ（ＮＨＲ）（ＣＨ2）3ＮＨＣＯ（ＮＨ2）（ＣＨ2）3ＮＨ2 または ＣＯＣＨ（ＮＨＲ）（ＣＨ2）4ＮＨＣＯ（ＮＨ2）（ＣＨ2）3ＮＨ2 であり、ここにＲはＨまたはＮＨＣＯ（ＮＨ2）（ＣＨ2）4ＮＨ2またはＮＨＣＯ
（ＮＨ2）（ＣＨ2）3ＮＨ2であり、 好ましくは、−Ｘ1−Ｙ−Ｘ2−は−ＳＣＨ2ＣＨ2Ｓ−または−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ
−である。 好ましくは、Ｒ1およびＲ2はそれぞれＣ12−Ｃ20アルキル基であり、例えば、
Ｃ12である。 好ましくは、ＷおよびＺはＮＨであり、そのことによりさらなるアミド（ＣＯ
ＮＨ）結合が形成される。
【００１１】 本発明化合物は、当業者によく知られた合成ペプチド化学を用いて、容易に入
手できる出発物質から製造できる。本発明の好ましい化合物のための、有用な中
間体は下記化合物：
【化１１】 であり、多段階プロセスで合成される。該多段階プロセスは、例えば、ジ−シス
テイン部分を構築することから開始され、ついで、標準的ペプチド化学を用いて
各システイン部分のカルボキシル基にセリン部分を結合させることにより親水性
頭部を構築し、ついで、当業者によく知られたアミド形成反応を用いてセリン部
分のカルボキシル基に炭化水素鎖を結合させることにより行われる。ついで、こ
の中間体を、システイン残基の窒素におけるさらなる反応により、式（Ｉ）の化
合物に変換することができる。
【００１２】 本発明のもう１つの態様は、ペプチドをベースにしたジェミニ化合物の使用方
法に関する。かかる使用は、アンチセンスとしてのオリゴヌクレオチドおよびポ
リヌクレオチドの細胞への導入、生物の全身的な遺伝子治療ならびに遺伝学的免
疫（抗体の生成）を包含する。他の使用は、遺伝子導入が必要な場合、例えば、
特に遺伝子発現の研究およびアンチセンス対照実験において、培養細胞中へのポ
リヌクレオチドの導入を容易ならしめるための本発明化合物の使用を包含する。
ポリヌクレオチドを化合物と混合し、細胞に添加し、インキュベーションしてポ
リヌクレオチドを取り込ませる。ＤＮＡまたは該ＤＮＡからのｍＲＮＡレベルを
、ノーザンブロッティングまたはＰＣＲをベースにした定量方法、例えばTaqman
(登録商標)法（Perkin Elmer, Conneticut, USA）を用いて調べることができる 。本発明の化合物によれば、従前の技術における化合物と比較すると、培養細胞
のＤＮＡ取り込み効率が有意に改善され、典型的には３ないし６倍改善される。
トランスフェクションプロトコルにおいて、ジェミニ化合物を１種またはそれ以
上の添加物質とともに使用してトランスフェクション効率を上昇させてもよい。
かかる添加物質は、例えば、下記のものから選択してもよい： （ｉ）中性担体、例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰ
Ｅ）（Farhood, H. et al., (1985) Biochim. Biophys. Acta 1235 289）； （ｉｉ）複合体形成剤、例えば、市販されているＰＬＵＳ試薬（Life Technolog
ies Inc. Maryland, USA）またはポリリジンもしくはポリオルニチンペプチドの
ごときペプチドまたは主に（他を排するのではない）リジン、オルニチンおよび
／もしくはアルギニンのごとき塩基性アミノ酸を含有するペプチド 上記リストはすべてを網羅したのではなく、トランスフェクション効率を上昇
させる他の添加物質も本発明の範囲内に含まれる。
【００１３】 さらにもう１つの態様において、本発明は、本発明化合物を用いる、遺伝子治
療における遺伝学的材料の導入に関する。 本発明のさらにもう１つの態様は、本発明化合物を用いる、ヌクレオチドをベ
ースにしない薬剤化合物のインビトロおよびインビボでの細胞への導入に関する
。
【００１４】 以下の定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするた
めのものである。 「アミノ酸」は、+Ｈ3ＮＣＨ（Ｒ）ＣＯ2 -形態の双極イオン（双性イオン）を
いう。それらは基Ｒの性質により分類され、Ｒが水素とは異なる場合、それらは
非対称であってもよく、ＤおよびＬ体を形成する。２０種の天然アミノ酸があり
、例えば、Ｒ基は無極性（例えば、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン）ま
たは極性（例えば、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニンおよびリジン）であ
る。非天然アミノ酸において、Ｒは天然アミノ酸中に見出されない他の基であっ
てもよい。
【００１５】 「ポリヌクレオチド」は、一般的には、ポリリボオチドまたはポリデオキシリ
ボヌクレオチドをいい、それらは未修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡ
もしくはＤＮＡであってもよい。「ポリヌクレオチド」は、１本鎖および２本鎖
ＤＮＡ、１本鎖および２本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖および２本鎖Ｒ
ＮＡ、ならびに１本鎖および２本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲ
ＮＡを含むハイブリッド分子（１本鎖であってもよく、あるいはより典型的には
２本鎖または１本鎖もしくは２本鎖領域の混合物）を包含するが、これらに限ら
ない。さらに、「ポリヌクレオチド」はＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡもし
くはＤＮＡの両方を含む３本鎖領域もいう。用語「ポリヌクレオチド」は、１個
またはそれ以上の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいは安定性または他
の理由で骨格が修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡも包含する。「修飾」塩基は、例
えば、トリチル化塩基およびイノシンのごとき通常でない塩基を包含する。種々
の修飾がＤＮＡおよびＲＮＡになされていてもよく、「ポリヌクレオチド」は、
天然に見出されるポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された
形態、ならびに油および細胞の特徴づけるＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包
含する。また「ポリペプチド」は比較的短いポリヌクレオチドを包含し、それら
はしばしばオリゴヌクレオチドといわれる。 「トランスフェクション」は、化学的または物理的手段のいずれかによる細胞
膜の修飾を含む方法を用いる、ポリヌクレオチドの培養細胞中への導入をいう。
かかる方法は、例えば、Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY M
ANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
N.Y. (1989)に記載されている。ポリヌクレオチドは直鎖状または環状、１本鎖
または２本鎖であってよく、ポリヌクレオチドの複製あるいはポリヌクレオチド
の一部を含んでいてもよい同種または異種遺伝子の発現を制御するエレメントを
含んでいてもよい。 下記の記載例および実施例を用いて本発明を説明する。
【００１６】 記載例 記載例１ ビスチオエーテル ３ 撹拌機、還流コンデンサーおよび滴下漏斗を装備した３つ首フラスコに、コン
デンサーを通してＮ2を直接入れる。１００ｍｌ中の３１．３ｇ（０．２０ｍｏ ｌｅ）のＬ−システイン塩酸塩・ｘＨ2Ｏ（１）（超音波で１０分間脱気）をフ ラスコに添加した。３００ｍｌのＨ2Ｏ中の３４ｇ（０．４０ｍｏｌｅ）のＮａ ＨＣＯ3の脱気された溶液を添加し、次いで、１００ｍｌ ＥｔＯＨ中の１８．８
ｇ（８．６ｍｌ；０．１０ｍｏｌｅ）の１，２−ジブロモエタン（２）の脱気さ
れた溶液を滴下した。さらに３０分後、やはりＮ2雰囲気下で混合物を６５〜７ ０℃に加熱し、さらに３時間撹拌した（１分以内に沈殿開始）。混合物を２０℃
まで冷却し、濾過し、３０ｍｌのＨ2Ｏおよび１００ｍｌのアセトン（２回）で すすいだ。乾燥後、１９．４ｇの白色固体を得たが、それはいくらかの遊離シス
テインを含有していた（1Ｈ ＮＭＲ）。固体を２５０ｍｌの２．５％ ＮＨ4ＯＨ
に懸濁し、透明溶液が得られるまで２５％のＮＨ4ＯＨを添加した。この溶液に １５ｍｇのＫＣＮを添加し、５℃に冷却しながら混合物を３０分撹拌した。固体
を集め、Ｈ2Ｏ（１００ｍｌ）、アセトン（２ｘ１００ｍｌ）ですすぎ、乾燥さ せ、１８．１ｇ（６８％）の３を白色固体として得た。
【００１７】 記載例２ Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン ５ １９．７ｇ（０．１５ｍｏｌｅ）のＬ−ロイシン４を２００ｍｌのＨ2Ｏに溶 解し、６．７５ｇ（０．１７ｍｏｌｅ）のＮａＯＨを添加した。透明溶液を＜１
０℃まで冷却し、３６ｇ（０．１６５ｍｏｌｅ）の１００ｍｌ ＴＨＦ中の（Ｂ ＯＣ）２Ｏの溶液を、温度を１０℃未満に維持しながら滴下した（３０分間）。
室温で４時間撹拌後、１Ｎ ＨＣｌを添加することにより混合物を酸性にし、ｐ Ｈ２とした。混合物をＥｔＯＡｃ（２５０、１００、ついで１００ｍｌ）で抽出
し、一緒にした有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、蒸発させて４０ｇ（＞１００％
）の５を無色油状物質として得たところ、いくぶんかのＴＨＦを含有していたが
、そのまま使用した。
【００１８】 記載例３ Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン−ＯＳｕｃ ７ Ｎ2雰囲気下で４０ｇの粗５（最大０．１５ｍｏｌｅ）を４００ｍｌのＴＨＦ （使用前にＬＡＨから蒸留）に溶解した。１７．３ｇ（０．１５ｍｏｌｅ）のＮ
−ヒドロキシサクシンイミド（６）および３０．９ｇ（０．１５ｍｏｌｅ）のＤ
ＣＣを添加後、混合物を室温で３．５時間撹拌した。混合物をＰ２ガラスフィル
ターで濾過し、フィルターを５０ｍｌのＴＨＦですすぎ、濾液を蒸発させた。残
渣を４００ｍｌの還流イソプロピルエーテルに溶解し、溶液を熱濾過し、濾液を
４℃に２０時間置いた。固体を集め、５０ｍｌのＩＰＥですすぎ、乾燥させ、３
２ｇ（６５％）の７を白色固体として得た。
【００１９】 記載例４ 化合物８ ８．０５ｇ（３０ｍｍｏｌｅ）の３を２００ｍｌのＨ2Ｏに懸濁し、８．３ｇ （６０ｍｍｏｌｅ）のＫ2ＣＯ3を添加後、混合物を加熱して透明溶液を得た。室
温まで冷却、２００ｍｌのＴＨＦ中の１９．７ｇ（６０ｍｍｏｌｅ）の７の溶液
を一度に添加した。混合物を室温で２０時間撹拌し、ついで、酸性にし、ｐＨ６
とした（３０％ ＨＣｌ）。濾過後、濾液を酸性にし（３０％ ＨＣｌで）、ｐＨ
２〜３とし、ＣＨＣｌ3（２５０、１００、ついで１００ｍｌ）で抽出した。一 緒にした有機層をブライン（５０ｍｌ）で１回洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、
蒸発させて２３ｇの粗８を白色泡状物質として得て、そのまま使用した。
【００２０】 記載例５ 化合物９ ２３ｇの粗８を２００ｍｌのＥｔＯＡｃに溶解し、０℃まで冷却し、ＨＣｌ気
体を１時間吹き込み、ついで、この温度でさらに１時間撹拌した。固体を集め、
エーテルですすぎ、ＫＯＨ上で減圧乾燥した。これにより１５．４ｇ（９１％）
の９をほとんど白色の吸湿性固体として得た。
【００２１】 記載例６ 化合物１０ １７．０ｇ（３０ｍｍｏｌｅ）の９を２５０ｍｌのＨ2Ｏに溶解し、氷水浴中 で１０℃未満まで冷却後、７．２ｇ（１８０ｍｍｏｌｅ）のＮａＯＨを添加した
。室温で１０分間撹拌後、５０ｍｌのＴＨＦ中の１４．４ｇ（６６ｍｍｏｌｅ）
の塩化ラウロイルの溶液を５分間かけて添加した。混合物を２０時間撹拌し、ヘ
キサン（２ｘ１５０ｍｌ）で抽出した。３層系が形成され、下の２つの層を酸性
にし、ｐＨ１〜２とし（１Ｎ ＨＣｌ）、エーテル（２００、１００、１００、 ついで５０ｍｌ）で抽出した。一緒にしたエーテル層をＭｇＳＯ4で乾燥させ、 蒸発させ、２４ｇ（９３％）の１０を油状／泡状物質として得た。
【００２２】 記載例７ 化合物１１ Ｎ2雰囲気下で２４ｇ（最大２７．５ｍｍｏｌｅ）の１０を４００ｍｌのＴＨ Ｆ（ＬＡＨから蒸留）に溶解した。６．３３ｇ（５５ｍｍｏｌｅ）のＮ−ヒドロ
キシサクシンイミド（６）および１１．３３ｇ（５５ｍｏｌｅ）のＤＣＣを添加
後、混合物を室温で２０時間撹拌した。混合物を大型のＰ２ガラスフィルターで
濾過し、さらに２５０ｍｌのＴＨＦを添加して濾過を加速した。さらに１００ｍ
ｌのＴＨＦでフィルターをすすいだ。濾液を蒸発させ、４０ｇの白色固体を得て
、この粗物質を４００ｍｌのＩＰＡから再結晶させた。０℃で１時間撹拌し、結
晶を集めた。乾燥後、２２．３ｇ（７７％）の１１を白色固体として得た。
【００２３】 記載例８ 化合物１３ ５４２ｍｇ（２．２ｍｍｏｌｅ）のＨ.Ａｒｇ.ＮＨ2・２ＨＣｌ（１２）を１５
ｍｌのＨ２Ｏに溶解し、３０４ｍｇ（２．２ｍｍｏｌｅ）のＫ2ＣＯ3を添加した
。１５ｍｌのＴＨＦ中の１．０５ｇ（１．０ｍｍｏｌｅ）の１１の溶液を一度に
添加し、混合物を室温で２０時間撹拌した。大部分のＴＨＦを蒸発させると、水
層中に油状物質が生成した。懸濁液をエーテル（６ｘ５０ｍｌ）で抽出し、一緒
にしたエーテル層をＭｇＳＯ4で乾燥させ、蒸発させて、９５００ｍｇ（８２％ ）の１３遊離アミンを黄色固体として得た。この物質をＥｔＯＡｃ／ＣＨ2Ｃｌ2 中においてＨＣｌ気体で処理して１３を黄色固体として得た。
【００２４】 記載例９ 化合物１５ ５．２５ｇ（５．０ｍｍｏｌｅ）の１１を５０ｍｌのＴＨＦに溶解し（いくぶ
ん加熱が必要）５０ｍｌのＨ2Ｏ中の１．３１ｇ（１０．５ｍｍｏｌｅ）のタウ リン（１４）および１．４５ｇ（１０．５ｍｍｏｌｅ）のＫ2ＣＯ3の溶液を一度
に添加した。室温で２０時間撹拌後、大部分のＴＨＦを蒸発させることにより除
去し、３００ｍｌのＭｅＯＨを添加した。混合物を−２０℃に２０時間置き、固
体を集め、ＭｅＯＨですすぎ、乾燥させた。これにより、Ｎ−ヒドロキシサクシ
ンイミドを含有する３．３ｇの１５が得られ、これを、さらなる反応で得た７０
０ｍｇの不純な物質と一緒にした。この４．０ｇを２００ｍｌのＭｅＯＨ＋５０
ｍｌのＨ2Ｏから再結晶させた。いくぶんかの固体を濾過により除去し、透明濾 液を−２０℃に２時間置き、固体を集め、ＭｅＯＨですすぎ、乾燥させた。これ
により、２．０ｇの１５をわずかに灰色がかった白色の固体として得た。８００
ｍｇの第２クロップを濾液から得た。
【００２５】 記載例１０ 化合物１６ １．０５（１．０ｍｍｏｌｅ）の１１を２０ｍｌのＴＨＦに溶解し、２０ｍｌ
のＨ2Ｏ中の２７５ｍｇ（２．２ｍｏｌｅ）の２−アミノエチルホスホン酸およ び３００ｍｇ（２．２ｍｍｏｌｅ）のＫ2ＣＯ3の溶液を一度に添加した。室温で
２０時間撹拌後、大部分のＴＨＦを蒸発させることにより除去し、水溶液を凍結
乾燥した。これにより白色固体を得て、これを２０ｍｌのＭｅＯＨから再結晶さ
せ、−２０℃で２０時間置いた。固体を集め、乾燥させて１５０ｍｇを得た。1 Ｈ ＮＭＲにより、それがＮ−ヒドロキシサクシンイミドであることが示された 。濾液を蒸発させ、残存する黄色油状物質を１０ｍｌの還流ＭｅＯＨに溶解し、
２０ｍｌのＩＰＡを添加後、−２０℃に４時間置いた。固体を集め、乾燥させ、
２６０ｍｇを得た。 濾液を蒸発させ、２０ｍｌのＥｔＯＡｃに溶解し、−２０℃に２０時間置いた
。 固体を集めた。
【００２６】 記載例１１ 化合物１７ １．０５ｇ（１．０ｍｍｏｌｅ）の１１を２０ｍｌのＴＨＦに溶解し、２０ｍ
ｌのＨ2Ｏ中の３１０ｍｇ（２．２ｍｍｏｌｅ）のＯ−ホスホコラミンおよび３ ００ｍｇ（２．２ｍｍｏｌｅ）のＫ2ＣＯ3の溶液を一度に添加した。室温で２０
時間撹拌後、大部分のＴＨＦを蒸発させることにより除去し、水溶液を凍結乾燥
した。白色固体を２０ｍｌのＭｅＯＨから再結晶させ、−２０℃に２０時間置い
た。固体を集め、ＭｅＯＨですすぎ、乾燥させた。これにより３１０ｍｇの白色
固体を得た。生成物は存在しなかった。濾液を蒸発させ、残存している黄色固体
を１０ｍｌのＭｅＯＨに溶解し、２０ｍｌのＩＰＡを添加し、混合物を−２０℃
に２０時間置いた。固体（２０〜３０ｍｇ）を集めた。 濾液を蒸発させ、残渣を２５ｍｌのＥｔＯＡｃに溶解し、−２０℃に２０時間
置き、その後固体を集めた。
【００２７】 記載例１２ Ｂｏｃ−グリシンＢｏｃ−グリシン １９ １８．８ｇ（０．２５ｍｏｌｅ）のグリシン１８を２５０ｍｌのＨ2Ｏに懸濁 し、１１ｇ（０．２７５ｍｏｌｅ）のＮａＯＨを添加した。透明溶液を１０℃未
満まで冷却し、２５０ｍｌのＴＨＦ中の６０ｇ（０．１６５ｍｏｌｅ）の（ＢＯ
Ｃ）2Ｏの溶液を、温度を１０℃未満に保ちながら滴下した（２０分間）。室温 で２０時間撹拌後、１Ｎ ＨＣｌを添加することにより混合物を酸性にし、ｐＨ １とした。混合物をＥｔＯＡｃ（２５０、１００、ついで１００ｍｌ）で抽出し
、一緒にした有機層をＭｇＳＯ4で乾燥し、蒸発させ、４７．５ｇ（＞１００％ ）の１９を無色油状物質として得たところ、いくぶんかのＴＨＦを含有していた
が、そのまま使用した。
【００２８】 記載例１３ Ｂｏｃ−グリシン−ＯＳｕｃ ２０ Ｎ2雰囲気下で７．５ｇの粗１９（最大０．２５ｍｏｌｅ）を５００ｍｌのＴ ＨＦ（使用前にＬＡＨから蒸留）に溶解した。３０ｇ（０．２６ｍｏｌｅ）のＮ
−ヒドロキシサクシンイミド（６）および５３．５ｇ（０．２６ｍｏｌｅ）のＤ
ＣＣを１０℃未満において添加後、混合物を室温で２０時間撹拌した。Ｐ２ガラ
スフィルター上の１ｃｍのセライトで混合物を濾過し、フィルターを２００ｍｌ
のＴＨＦですすぎ、濾液を蒸発させた。粗物質（５６ｇ）を還流イソプロピルエ
ーテル／ＴＨＦ（６００ｍｌ １：１）から再結晶させ、溶液を熱濾過し、濾液
を０℃で３時間撹拌した。固体を集め、５０ｍｌのＩＰＥですすぎ、乾燥させ、
１６．４ｇ（２４％）の２０を白色固体として得た。濾液を蒸発させ、保存した
。
【００２９】 記載例１４ 化合物２１ ８．０５ｇ（３０ｍｍｏｌｅ）の３を２００ｍｌのＨ2Ｏに懸濁し、８．３ｇ （６０ｍｍｏｌｅ）のＫ2ＣＯ3を添加後、混合物を加熱して透明溶液を得た。４
０℃未満まで冷却後、２００ｍｌのＴＨＦ中の１６．３ｇ（６０ｍｍｏｌｅ）の ２０ の溶液を４回に別けて２分間で添加した。混合物を室温で７２時間撹拌し、
ついで、酸性にし、ｐＨ６した（３０％ ＨＣｌで）。濾過後、濾液を酸性にし 、ｐＨ２〜３とし（３０％ ＨＣｌで）、ＣＨＣｌ3（２５０、１００、ついで１
００ｍｌ）で抽出した。一緒にした有機層をブライン（５０ｍｌ）で１回洗浄し
、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、蒸発させ、１５．８ｇ（９０％）の２１を白色泡状物 質として得て、そのまま使用した。
【００３０】 記載例１５ 化合物２２ １５．８ｇ（２７ｍｍｏｌｅ）の粗２１を３００ｍｌのＥｔＯＡｃに溶解し、
ＨＣｌ気体を１時間吹き込み、ついで、氷水浴中０℃で撹拌し、５０ｍｌのＴＨ
Ｆ中の１２．２ｇ（５６ｍｍｏｌｅ）の塩化ラウロイルの溶液を一度に添加した
。混合物を２０時間撹拌し、ヘキサン（２ｘ１００ｍｌ）で抽出した。水層を酸
性にし、ｐＨ１〜２とし（１Ｎ ＨＣｌで）、エーテル（３ｘ１５０ｍｌ）で抽 出した。抽出中に生じた固体を集め、乾燥させた。７．５ｇ（３９％）の２３が
白色固体として得られた。 濾液を蒸発させ、残存スラリーを２５０ｍｌのＥｔ2Ｏ中で撹拌した。固体を 集めることができず、２５ｍｌのＭｅＯＨを添加して透明溶液を得た。この溶液
を−２０℃に２０時間置いた。固体を集め、エーテルですすぎ、乾燥させた。
【００３１】 記載例１６ 化合物２４ Ｎ2雰囲気下で７．４７ｇ（１０ｍｍｏｌｅ）の２３を２００ｍｌのＴＨＦ（ ＬＡＨから蒸留）に溶解した。２．５３ｇ（２２ｍｍｏｌｅ）のＮ−ヒドロキシ
サクシンイミド（６）および４．５３ｇ（２２ｍｍｏｌｅ）のＤＣＣを添加後、
混合物を室温で７２時間撹拌した。混合物を、Ｐ２ガラスフィルター上の１ｃｍ
のセライトで濾過した（非常に遅い）。濾液を蒸発させて１．９０ｇの２４を泡
状物質として得た。 フィルターを３００ｍｌのジオキサンですすぎ、濾液を蒸発させて６．９ｇの ２４ を泡状物質として得た。全収量８．８ｇ（９４％）。
【００３２】 記載例１７ 化合物２５ ５４２ｍｇ（２．２ｍｍｏｌｅ）のＨ.Ａｒｇ.ＮＨ2・２ＨＣｌ（１２）を１５
ｍｌのＨ2Ｏに溶解し、７５０ｍｇ（５．４ｍｍｏｌｅ）のＫ2ＣＯ3を添加した 。１５ｍｌのＴＨＦ中の９４１ｍｇ（１．０ｍｍｏｌｅ）の２４の溶液を一度に
添加し、混合物を室温で２０時間撹拌した。大部分のＴＨＦを蒸発させ、水層を
ＥｔＯＡｃ（２ｘ５０ｍｌ）で抽出し、一緒にしたＥｔＯＡｃ層をＭｇＳＯ4で 乾燥させ、蒸発させて、１５０ｍｇの２５遊離アミンを泡状物質として得た。両
方の部分を一緒にし、ＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、７５ｍｌのＥｔＯＡｃを添加後、Ｈ
Ｃｌ気体を１．５時間吹き込んだ。混合物を０℃まで冷却し、さらに２時間撹拌
した。固体を集めることができなかったので、１００ｍｌのエーテルを添加し、
混合物を室温で２０時間撹拌した。固体を集め、エーテルですすぎ、乾燥させ、
５２０ｍｇの２５をわずかに褐色の固体として得た。
【００３３】 記載例１８ 化合物２６ ２５０ｍｇ（２．０ｍｍｏｌｅ）のタウリン（１４）を１５ｍｌのＨ2Ｏに溶 解し、２８０ｍｇ（２．０ｍｍｏｌｅ）のＫ2ＣＯ3を添加した。１５ｍｌのＴＨ
Ｆ中の９４１ｍｇ（１．０ｍｍｏｌｅ）の２４の溶液を一度に添加し、混合物を
室温で２０時間撹拌した。大部分のＴＨＦを蒸発させ、水溶液を凍結乾燥させた
。得られた白色固体を３０ｍｌのＭｅＯＨから再結晶させ、０℃で３時間撹拌し
、固体を集め、エーテルですすぎ、乾燥させた。 これにより２２５ｍｇの２６を白色固体として得た。 濾液の一部を蒸発させ、−２０℃に２０時間置いた。固体を集め、エーテルで
すすぎ、乾燥させて２１０ｍｇの２６を白色固体として得た。両方の部分を一緒
にした。
【００３４】 記載例１９ 化合物２７ ２６．８ｇ（０．１ｍｏｌｅ）の３を３００ｍｌのＨ2Ｏに懸濁し、９．６ｇ （０．２４ｍｏｌｅ）のＮａＯＨを添加した。５分以内に透明溶液が得られ、混
合物を１０℃未満まで冷却し、３００ｍｌのＴＨＦ中の４３．６ｇ（０．２ｍｏ
ｌｅ）のＢＯＣ2Ｏの溶液を３０分かけて滴下した。混合物を室温で一晩撹拌し た。２５ｍｌのＨ2Ｏ中の２．５ｇ（０．０６ｍｏｌｅ）のＮａＯＨの溶液およ び７５ｍｌのＴＨＦ中の１５ｇ（０．０７ｍｏｌｅ）のＢＯＣ2Ｏの溶液を滴下 し、混合物をさらに１８時間撹拌した。 ２Ｎ ＨＣｌを添加することにより混合物を酸性にし、ｐＨ２とし、３００ｍ ｌのブラインを添加後、ＴＨＦ（３ｘ４００ｍｌ）、ついで、ＥｔＯＡｃ（２ｘ
３００ｍｌ）で抽出した。一緒にした有機層をＭｇＳＯ4で乾燥し、蒸発させ、 ４２ｇの白色固体を得た。この固体をＭＥＫ／ペンタンから再結晶させ、室温で
２時間撹拌し、ついで、−２０℃に２０時間置いた。この固体を集め、乾燥させ
、３７．８ｇ（８１％）の２７を白色固体として得た。
【００３５】 記載例２０ 化合物２８ Ｎ2雰囲気下で８．９ｇ（１９ｍｍｏｌｅ）の２７を３００ｍｌのＴＨＦ（Ｌ ＡＨから蒸留）に溶解し、４．３７ｇ（３８ｍｍｏｌｅ）の６および７．３８ｇ
（３８ｍｍｏｌｅ）のＤＣＣを添加した。室温で１８時間撹拌後、混合物を１ｃ
ｍのセライトで濾過し、さらに３００ｍｌのＴＨＦでフィルターをすすぎ、濾液
を蒸発させて１１．１ｇ（８８％）の２８を白色固体として得た。
【００３６】 記載例２１ 化合物２９ ２．７ｇ（２０．６ｍｍｏｌｅ）のＬ−ロイシン（４）および２．８ｇ（２０
．３ｍｍｏｌｅ）のＫ2ＣＯ3を１００ｍｌのＨ2Ｏに溶解し、５０ｍｌのジオキ サン中の６．６ｇ（１０ｍｍｏｌｅ）の２８の懸濁液を添加した。混合物を室温
で２０時間撹拌し、ジオキサンの大部分を蒸発させることにより除去した。水溶
液を５０ｍｌのエーテルで抽出し、３０％ ＨＣｌを添加することにより酸性に し、ｐＨ１とした。混合物をＣＨＣｌ3（１５０、１００、ついで５０ｍｌ）で 抽出し、一緒にし有機層をブライン（２００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥 させ、蒸発させ、白色泡状物質を得て、それをＴＨＦで剥がして７．５ｇ（＞１
００％）の２９を固体白色泡状物質として得た。
【００３７】 記載例２２ 化合物３０ Ｎ2雰囲気下で７．５ｇの粗２９（最大１０ｍｍｏｌｅ）を１００ｍｌのＴＨ Ｆ（ＬＡＨから蒸留）に溶解した。２．３ｇ（２０ｍｍｏｌｅ）のＮ−ヒドロキ
シサクシンイミド（６）および４．１２ｇ（２０ｍｍｏｌｅ）のＤＣＣを添加し
、混合物を室温で２０時間撹拌した。混合物を１ｃｍのセライトで濾過し、フィ
ルターをＴＨＦですすぎ、濾液を蒸発させ、９．５ｇの白色泡状物質を得て、こ
れを７５ｍｌのＩＰＡから再結晶させ、−２０℃に３時間置いた。固体を集めた
が、ガラスフィルター上で即座に液化した。油状物質を２０ｍｌのＴＨＦに溶解
し、６．５ｇ（７３％）の３０を固体白色泡状物質として得た。
【００３８】 記載例２３ 化合物３１ ６．５ｇ（７．３ｍｍｏｌｅ）の３０を１００ｍｌのＴＨＦに溶解し、２．７
８ｇ（１５ｍｍｏｌｅ）のドデシルアミンを添加後、混合物を室温で１８時間撹
拌した。蒸発後、泡状物質を得て、これを１００ｍｌのＣＨＣｌ3に溶解した。 溶液をＨ2Ｏ（２ｘ７５ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、蒸発させ、７．
５ｇ（１００％）の３１を固体泡状物質として得た。
【００３９】 記載例２４ 化合物３２ ７．５ｇ（７．３ｍｍｏｌｅ）の粗３１を２５０ｍｌのＥｔＯＡｃに加熱しな
がら溶解し、ついで、室温まで冷却後、ＨＣｌ気体を２時間吹き込んだ。撹拌を
０℃で３時間継続した。これにより４．０ｇ（６０％）の３２を白色固体として
得た。
【００４０】 記載例２５ 化合物３３ ９０３ｍｇ（１．０ｍｍｏｌｅ）の３２を１０ｍｌのＨ2Ｏに加熱しながら溶 解し（ゲルが生成）、ついで、室温まで冷却後、２ｍｌのＨ2Ｏに溶解した８０ ｍｇ（２．０ｍｍｏｌｅ）のＮａＯＨを添加した。懸濁液が得られ、透明溶液が
得られるまでＴＨＦを添加した。５ｍｌのＴＨＦ中の５７２ｍｇ（２ｍｍｏｌｅ
）のＢＯＣ−β−ａｌａＯＳｕｃ（４２）の溶液を添加し、混合物を室温で５時
間撹拌した。大部分のＴＨＦを蒸発させることにより除去し、さらに３０ｍｌの
Ｈ2Ｏを添加し、さらに１時間撹拌後、固体を集め、１０ｍｌのＨ2Ｏですすぎ、
乾燥させた。これにより１．０ｇ（８５％）の３３をわずかに灰色がかった白色
の固体として得た。
【００４１】 記載例２６ 化合物３４ １．０ｇ（０．８５ｍｍｏｌｅ）の３３を２５ｍｌのＥｔＯＡｃに懸濁し、２
５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2を添加して透明溶液を得た。ＨＣｌ気体を１．５時間吹き込
み、０℃でさらに２時間撹拌した。固体が生成しなかったので、大部分のＣＨ2 Ｃｌ2を蒸発させることにより除去し、０℃でさらに３０分間撹拌を継続した。 乾燥後の３４の全収量は８１０ｍｇ（９１％）であり、黄色固体として得られた
。
【００４２】 記載例２７ 化合物３６ ４．２ｇ（４０ｍｍｏｌｅ）のＬ−セリン３５および５．５３（４０ｍｍｏｌ
ｅ）のＫ2ＣＯ3を３００ｍｌのＨ2Ｏに溶解し、３００ｍｌのＴＨＦ中の１２． ８ｇ（最大１９ｍｍｏｌｅ）の２８の懸濁液を添加した。混合物を室温で７２時
間撹拌し、大部分のを蒸発させることにより除去した。１Ｎ ＨＣｌを添加する ことにより水溶液を酸性にし、ｐＨ１とした。混合物をＣＨ2Ｃｌ2＋１５％ Ｍ ｅＯＨ（２５０、１００、ついで１００ｍｌ）で抽出し、一緒にした有機層をＭ
ｇＳＯ4で乾燥させ、蒸発させ、８．５ｇ（７０％）の３６を白色固体泡状物質 として得て、そのまま使用した。
【００４３】 記載例２８ 化合物３７ Ｎ2雰囲気下で８．５ｇ（最大１３．２ｍｍｏｌｅ）の３６を２００ｍｌのＴ ＨＦ（ＬＡＨから蒸留）に溶解し、３．４６ｇ（３０ｍｍｏｌｅ）のＮ−ヒドロ
キシサクシンイミド（６）および６．２ｇ（３０ｍｍｏｌｅ）のＤＣＣを添加後
、混合物を室温で２４時間撹拌した。混合物を１ｃｍのセライトで濾過し、フィ
ルターを５０ｍｌのＴＨＦですすぎ、蒸発さた。これにより１２．５ｇ（＞１０
０％）の３７を白色泡状物質として得て、これをそのまま使用した。
【００４４】 記載例２９ 化合物３８ １２．５ｇの粗（最大１３．２ｍｍｏｌｅ）３７を２００ｍｌのＴＨＦに溶解
し、５．０ｇ（２７ｍｍｏｌｅ）のドデシルアミンとともに室温で４８時間撹拌
した。蒸発させることによりＴＨＦを除去し、残渣を２５０ｍｌのＣＨＣｌ３に
溶解し、ブライン（２ｘ１５０ｍｌ）で抽出した。一緒にしたブライン層をＭｇ
ＳＯ4で乾燥させ、蒸発させた。これにより１５．４ｇ（＞１００％）の３８を ほとんど白色の固体として得て、これをそのまま使用した。
【００４５】
【実施例】
実施例１ 化合物３９ ２−アミノ−３−｛２−［２−アミノ−２−（１−ドデ
シルカルバモイル−２−ヒドロキシエチルカルバモイル）−エチルスルファニル
］−エチルスルホニル｝−Ｎ−（１−ドデシルカルバモイル−２−ヒドロキシ−
エチル）−プロピオンアミド １５．４ｇ（最大１３．２ｍｍｏｌｅ）の３８を４００ｍｌのＥｔＯＡｃに溶
解し、ＨＣｌ気体を１．５時間吹き込んだ混合物を０℃で２時間撹拌し、固体を
集め、エーテルですすぎ、乾燥させ、９．９ｇ（８８％）の３９を白色固体とし
て得た。
【化１２】
【００４６】 実施例２ 化合物４０ ４．２５ｇ（５ｍｍｏｌｅ）の３９を１００ｍｌのＨ2Ｏに加熱しながら溶解 し、０℃未満まで冷却後、、１０ｍｌのＨ2Ｏ中の４６０ｍｇ（１０ｍｍｏｌｅ ）のＮａＯＨの溶液を添加した。懸濁液が得られ、透明溶液となるまでＴＨＦを
添加した（１５０ｍｌ）。ついで、２．８６ｇ（１０ｍｍｏｌｅ）のＢＯＣ−β
−ａｌａＯＳｕ（４２）を添加し、混合物を室温で２０時間撹拌した。大部分の
ＴＨＦを蒸発させることにより除去し、さらに１００ｍｌのＨ2Ｏを添加し、混 合物を０℃で３時間撹拌した。固体を集め、２０ｍｌのＨ2Ｏですすぎ、乾燥さ せた。これにより５．２ｇ（９３％）の４０をほとんど白色の固体として得た。
【００４７】 実施例３ 化合物４１ ５．２ｇ（４．６ｍｍｏｌｅ）の４０を１００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、２
００ｍｌのＥｔＯＡｃを添加した。ＨＣｌ気体を１．５時間吹き込み、０℃で２
時間撹拌を継続した。固体を集め、エーテルですすぎ、乾燥させて、４．７ｇ（
１００％）の４１をわずかに灰色がかった白色の固体として得た。
【００４８】 実施例４ 化合物４２および４３ メタノール中２当量のＮａＯＨを用いて化合物３４および４１を中和後、Ｎ2 雰囲気下で両方の化合物を（ＣＨ2Ｏ）nおよびＮａＣＮＢＨ3で１８時間処理し た。両方の反応において、好ましくはアミド窒素のアルキル化により複合体混合
物を得る。
【００４９】 実施例５ 化合物４４ ３３２ｍｇ（０．３９ｍｍｏｌｅ）の３９を１５ｍｌのＨ２Ｏに加熱しながら
溶解し、４０℃未満にまで冷却後、、１ｍｌのＨ2Ｏ中の３３ｍｇ（０．８３ｍ ｍｏｌｅ）の溶液を添加した。白色懸濁液が得られ、透明溶液となるまでＴＨＦ
を添加した（２５ｍｌ）。この溶液に、４９９ｍｇ（０．７８ｍｍｏｌｅ）のＢ
ＯＣ−Ａｒｇ（Ｚ）2−ＯＳｕ（４７）を添加し、混合物を室温で２０時間撹拌 した。大部分のＴＨＦを蒸発させ、さらに１５ｍｌのＨ2Ｏを添加した。２時間 撹拌後、固体を集め、Ｈ2Ｏですすぎ、乾燥させ、７００ｍｇ（９８％）の４４ を白色固体として得た。
【００５０】 実施例６ 化合物４５ １００ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌｅ）の４４を２０ｍｌのＨＯＡｃに溶解し、炭
素上１０％Ｐｄ（０．５ｍｍｏｌｅ Ｐｄ）を添加した。Ｈ2雰囲気下（５ｂａｒ
）で混合物を４８時間撹拌した。混合物を１ｃｍのセライトで濾過し、フィルタ
ーを１０ｍｌのＨＯＡｃですすぎ、濾液を蒸発させた。これにより１００ｍｇの
粗４５を緑色油状物質として得た。
【００５１】 実施例７ 化合物４６ １００ｍｇの粗４５（最大０．０５ｍｍｏｌｅ）を１０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶
解し、１０ｍｌのＥｔＯＡｃを添加した。ＨＣｌ気体を１時間吹き込み、混合物
を室温で１８時間撹拌した。大部分のＣＨ2Ｃｌ2を蒸発させることにより除去し
、３０ｍｌのエーテルを添加し、混合物を０℃で１時間撹拌した。結晶性物質が
得られなかったので、混合物を蒸発させて７５ｍｇの粗４６を黄色油状物質とし
て得た。
【００５２】 実施例８ 化合物４９ ８５０ｍｇ（１．０ｍｍｏｌｅ）の３９を２０ｍｌのＨ2Ｏに溶解し、８８ｍ ｇ（２．２ｍｍｏｌｅ）のＮａＯＨを添加後、懸濁液を得た。透明溶液が得られ
るまでＴＨＦを添加し（３０ｍｌ）、９７４ｍｇ（２．２ｍｍｏｌｅ）のＢＯＣ 2 ＬｙｓＯＳｕｃ（化合物４８）を添加した。室温で２０時間撹拌後、大部分の ＴＨＦを蒸発させることにより除去し、さらに２０ｍｌのＨ2Ｏを添加し、混合 物を２時間撹拌した。固体を集め、Ｈ2Ｏですすぎ、乾燥させ、１．３５ｇ（９ ０％）の４９を白色固体として得た。
【００５３】 実施例９ 化合物５０ ５００ｍｇの４９を２５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、２５ｍｌのＥｔＯＡｃを
添加後、ＨＣｌ気体を１時間吹き込み、混合物を０℃で１．５時間撹拌した。固
体を集めることができなかったので、４０ｍｌのエーテルを添加し、１８時間撹
拌を継続した。固体を集め、エーテルですすぎ、乾燥させ、２９０ｍｇの５０を
白色固体として得た。
【００５４】 実施例１０ 化合物５１ ４２５ｍｇ（０．４３ｍｍｏｌｅ）の４１を２０ｍｌのＨ2Ｏに溶解し、４４ ｍｇ（１．１ｍｍｏｌｅ）のＮａＯＨを添加した。懸濁液が得られ、透明溶液が
得られるまでＴＨＦを添加した（２５ｍｌ）。４８７ｍｇ（１．１ｍｍｏｌｅ）
の４８を添加後、混合物を室温で２０時間撹拌した。大部分のＴＨＦを蒸発させ
、さらに２０ｍｌのＨ2Ｏを添加し、１．５時間撹拌、固体を集め、Ｈ2Ｏですす
ぎ、乾燥させた。これにより７５０ｍｇの５１を白色固体として得た。
【００５５】 実施例１１ 化合物５２ ２５０ｍｇの５１を３０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、３０ｍｌのＥｔＯＡｃを
添加後、ＨＣｌ気体を１時間吹き込み、混合物を０℃で１．５時間撹拌した。固
体を集め、エーテルですすぎ、乾燥させ、１２０ｍｇの５２を白色塩として得た
。
【００５６】 実施例１２ 化合物５７（ＳｕｃＯｓｅｒＬｙｓＢＯＣ2） ４．４３ｇ（１０ｍｍｏｌｅ）のＢＯＣ2ＬｙｓＯＳｕｃ（４８）を５０ｍｌ のＴＨＦに溶解し、５０ｍｌのＨ２Ｏ中の１．１６ｇ（１１ｍｍｏｌｅ）のＬ−
セリンおよび１．５２ｇ（１１ｍｍｏｌｅ）のＫ2ＣＯ3の溶液を即座に添加した
。混合物を室温で７２時間撹拌た。大部分のＴＨＦを蒸発させることにより除去
し、１Ｍ ＨＣｌを添加することにより残存スラリーを酸性にし、ｐＨ２として 、ＣＨ2Ｃｌ2（２ｘ７５ｍｌ）で抽出した。一緒にした有機層を乾燥（Ｎａ2Ｓ Ｏ4）させ、蒸発させ、５７を白色固体として得て、これをそのまま実施例４３ に使用した。
【００５７】 実施例１３ 化合物５４ ８５０ｍｇ（１．０ｍｍｏｌｅ）の３９を３０ｍｌのＨ2Ｏに溶解し、８８ｍ ｇ（２．２ｍｏｌｅ）のＮａＯＨを添加し、ついで、３０ｍｌのＴＨＦを添加し
て透明溶液を得た。３０ｍｌのＴＨＦ中の１．５ｇ（最大２．３ｍｍｏｌｅ）の ５７ の溶液を即座に添加し、溶液を室温で４８時間撹拌した。大部分のＴＨＦを
蒸発させることにより除去し、さらに３０ｍｌのＨ2Ｏを添加し、撹拌を１時間 継続した。固体が得られなかっので、混合物を７５ｍｌのＥｔＯＡｃ／エーテル
（２：１）で抽出した。一緒にした有機層を乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）させ、蒸発させ
て、ＢＯＣ−保護中間体を固体泡状物質として得た。 この泡状物質を２５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、５０ｍｌのＥｔＯＡｃを添加
した。透明溶液にＨＣｌ気体を１時間吹き込み、０℃でさらに１時間撹拌を継続
した。塩を集め、エーテルですすぎ、減圧乾燥し、１．１５ｇ（８５％）の５４ をわずかに褐色の固体として得た。
【００５８】 実施例１４ 化合物５５ １．１８ｇ（１．０ｍｍｏｌｅ）の５０を２５ｍｌのＨ2Ｏに溶解し、１７６ ｍｇ（４．４ｍｍｏｌｅ）のＮａＯＨを添加し、ついで、３０ｍｌのＴＨＦを添
加して透明溶液を得た。９７４ｍｇ（２．２ｍｍｏｌｅ）の４８を添加し、混合
物を室温で４８時間撹拌した。大部分のＴＨＦを蒸発させることにより除去し、
さらに５０ｍｌのＨ2Ｏを添加し、混合物を２時間撹拌した。固体が得られなか ったので、混合物をエーテル（２ｘ１００ｍｌ）で抽出し、一緒にした有機層を
乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、蒸発させ、２ｇのＢＯＣ−保護中間体を固体泡状物質
として得た。泡状物質を５０ｍｌのＥｔＯＡｃに溶解し、溶液にＨＣｌ気体を１
時間吹き込み、撹拌を０℃でさらに１時間継続した。塩を集め、エーテルですす
ぎ、減圧乾燥し、１．１５ｇ（７６％）の５５をほとんど白色の固体として得た
。
【化１３】
【００５９】 実施例１５ 化合物５６ １．９５ｇ（４．４ｍｍｏｌｅ）の４８を使用する以外は化合物５５の合成と
同様にして化合物５６を合成した。これにより１．１ｇ（６０％）の５６をわず
かに灰色がかった白色の固体として得た。
【化１４】
【００６０】 実施例１６ 化合物５７、５８および５９ 上記化合物の合成と同様にして化合物５７、５８および５９を合成した。当業
者に良く知られた合成ペプチド化学を用いて、化合物３９または異なった飽和も
しくは不飽和炭化水素鎖を有する化合物３９と等価な中間体を、オルニチン化合
物と結合させる。
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【００６１】 上記実施例に示した化学式において、簡単のために、適宜、水素原子がＮ、Ｃ
およびＯ原子から省略されていることを、当業者は理解するであろう。
【００６２】 実施例１７ ペプチドをベースにしたジェミニ化合物を用いる、ルシフェラーゼ
を発現する組み換えプラスミドのＨＥＫ２９ ３細胞中へのトランスフェクショ
ン すべての組織培養用試薬はLife Technologies Incから得た。トランスフェク ション２４時間前に、ＨＥＫ２９３細胞をNunc６ウェル培養プレートに、ウェル
１個あたり２〜３ｘ１０5個として撒いた。１０％ ｖ／ｖウシ胎児血清を補足し
たEagle塩含有Dulbecco改変Eagle培地（＝完全培地）２ｍｌ中に細胞を撒いた。
加湿雰囲気下、５％ ＣＯ2中、３７℃で細胞を増殖させた。６μｇのＤＮＡ（Pr
omegaから得た「ルシフェラーゼ対照プラスミド」）を１００μｌの無血清培地 （OPTI-MEMR）中に溶解させた。ペプチドをベースにしたジェミニ化合物を、組 織培養グレードの水中、１ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ついで、OPTI-MEMRで 希釈して最終体積１００μｌ中の適当濃度とした。ＤＮＡおよびジェミニ溶液を
混合し（全体積２００μｌ；最終濃度５、２５、５０、１００、１５０、２００
、２５０および３００μｇ／ｍｌ）、室温で１５分放置した。ＤＮＡ／ジェミニ
混合物を各ウェル中の細胞に添加し、１８〜２０時間接触させた。ついで、細胞
をリン酸塩緩衝化セイラインで２回洗浄し、ついで、１ｍｌの新鮮完全培地を添
加した。細胞をさらに２４時間インキュベーションし、ついで、溶解させ、ルシ
フェラーゼ活性をアッセイした。 各ウェル中の細胞を１ｍｌの溶解バッファーに懸濁し、そのうち１００μｌを
１００μｌのルシフェラーゼ基質と混合すること以外は製造者の説明書に従って
、Canberra Packard (Berkshire, UK) Luclite kitを用いてすべてのルシフェラ
ーゼ活性のアッセイを行った。１５分の適応時間中、反応混合物を放置し、つい
で、Top Countシンチレーションカウンター中で５分間カウントした。シンチレ ーションカウンターからの１秒間あたりのカウント数としてルシフェラーゼ活性
を測定した。１個のウェルにつき４系の別個のカウントを行った。 ＤＮＡを含まない対照トランスフェクション、ならびにＣａＰＯ4、アニオン 性ジェミニ化合物（１）および製造者推奨濃度の市販リポフェクション試薬Lipo
fectAmineTMおよびLipotaxiTM（それぞれ、１０、２５、５０、７５、１２５μ ｇ／ｍｌおよび１７５、２５０、３２５、４００、５００μｇ／ｍｌ）を含む対
照トランスフェクションをセットアップした。 結果（図１）は、カチオン性のペプチドをベースにしたジェミニ化合物（５４
）、（５５）および（５６）は、約１５０μｇ／ｍｌの濃度において、ＨＥＫ２
９３細胞中へのルシフェラーゼプラスミドのトランスフェクションを容易ならし
める非常に効果的な薬剤であることを明確に示す。詳細には、化合物（５４）は
２５０μｌ／ｍｌでピークとなり、平均カウント（４つの別個の系の）は７００
００ｃｐｓを超える。化合物（５５）は３００μｇ／ｍｌで最も効果的であり、
平均カウントは約４５０００ｃｐｓである。化合物（５６）は２００μｇ／ｍｌ
で最も効果的であり、平均カウントは約５００００である。対照的に、「ＤＮＡ
なし」陰性対照は、アニオン性ジェミニ化合物（１）およびカチオン性ジェミニ
化合物（５０および５２）と同じバックグラウンドであった。ＣａＰＯ4トラン スフェクションは非常に低いカウントであり、約２０００ｃｐｓである。比較の
ため、Lipofectamineでのトランスフェクションの結果を図２に示し、そのピー クはわずか１２５００ｃｐｓ（１２５μｇ／ｍｌ）であり、Lipotaxiでのトラン
スフェクションにおいては２５００ｃｐｓであった（１７５μｇ／ｍｌおよび３
２５μｇ／ｍｌにおいて）。
【００６３】 実施例１８ ペプチドをベースにしたジェミニ化合物を用いる、ルシフェラーゼ
を発現する組み換えプラスミドのＣＨＯ−Ｋ１細胞中へのトランスフェクション
トランスフェクション２４時間前にＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−９
６１８）を、Ｔ25−培養フラスコ（Corning-Coaster Buckinghamshire, UK）に 、フラスコ１個あたり７ｘ１０5個として撒いた。ヌクレオシドおよびデオキシ ヌクレオシドを含み、１ｘＬ−グルタミンおよび１０％ ｖ／ｖウシ胎児血清を 補足した５ｍｌのＭＥＭα培地（完全培地）に、培養ＣＨＯ−Ｋ１細胞を撒いた
。湿潤雰囲気下、５％ ＣＯ2中３７℃で細胞を増殖させた。 トランスフェクションを行うために、５μｇのＤＮＡ（ルシフェラーゼ対照プ
ラスミド）を、水中（最終体積４００μｌ）でジェミニ化合物とともにインキュ
ベーションした。ペプチドをベースにしたジェミニ化合物を組織培養グレードの
水中１ｍｇ／ｍｌとし、ついで、適当濃度に希釈し、最終体積２００μｌとした
。室温に３０分置いた後、２．６ｍｌのOPTI-MEMR培地を添加し、溶液を細胞に 添加した。３７℃で一晩インキュベーション後、トランスフェクション溶液を完
全培地に置き換えて、細胞を３７℃でインキュベーションした。トランスフェク
ションから２４時間後、フラスコから細胞を剥がし、９６ウェルのプレートに、
ウェル１個あたり０．５ｘ１０5個の密度で撒き、３７℃でさらに２４時間イン キュベーションした。トランスフェクションから約４８時間後に、製造者（Roch
e Diagnostics, Mannheim, Germany）の説明書に従ってルシフェラーゼリポータ
ー遺伝子アッセイを行った。１５分の適応時間中プレートを放置し、ついで、To
pCount NXTカウンター（Canberra Packard）で６０秒間カウントした。１のトラ
ンスフェクションにつき８個のウェルの平均をカウントした。 ＤＮＡを含まない対照トランスフェクション、ならびにアニオン性ジェミニ化
合物および市販試薬LipofectAmine PLUSTMを含む対照トランスフェクションをセ
ットアップした。 図３に示す結果は、カチオン性ペプチドをベースにした化合物５４、５５およ
び５６は、ルシフェラーゼプラスミドをＣＨＯ−Ｋ１細胞中にトランスフェクシ
ョンすることを容易ならしめるための非常に有効な試薬であることを示す。上記
条件を用いた場合、化合物５４は３０ｍＭで平均カウントをピークに達せしめ、
１秒あたり１．４ｘ１０5カウント（ｃｐｓ）を超える。化合物５５は３０ｍＭ において最も有効で、平均カウントは約２．４ｘ１０5ｃｐｓである。化合物５ ６は４０ｍＭで最も有効で、平均カウントは約１．９ｘ１０5ｃｐｓである。対 照的に、陰性対照は無視できるカウントとなった。
【００６４】 実施例１９ ペプチドをベースとしたジェミニ化合物を種々の添加物質とともに
使用する、ルシフェラーゼを発現する組み換えプラスミドのＣＨＯ−Ｋ１細胞中
へのトランスフェクション 中性担体、例えばジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）（
Farhood, H., et al (1985)）または複合体形成試薬、例えばＰＬＵＳ化合物（L
ife Technologies Inc.）を添加することにより、ジェミニ化合物のトランスフ ェクション能をさらに増大させることができた。 図４は、例えば、化合物５５とＤＯＰＥを２：１の割合とした場合にルシフェ
ラーゼ活性が９倍上昇することを示す。２：１の割合の化合物５５とＤＯＰＥ、
ならびに１１．６μｌのＰＬＵＳ化合物の添加により媒介されるトランスフェク
ションは平均カウント６．５ｘ１０5ｃｐｓとなり、化合物５５単独の場合と比 較してルシフェラーゼ活性は１２倍上昇する。ＰＬＵＳ化合物をＤＮＡとともに
インキュベーションした場合、化合物５５単独の場合と比較してルシフェラーゼ
活性は４倍上昇する。
【００６５】 実施例２０ 培養フラスコへの培養細胞の付着を容易ならしめるための、ペプチ
ドをベースにしたジェミニ化合物の使用 通常の増殖培地および培養条件を用いて（ＲＰＭＩに１０％ウシ胎児血清を添
加；３７℃、５％ ＣＯ2）、しかしながらウェル１個あたり５０〜６０μｇのペ
プチドをベースにしたジェミニ化合物を添加した場合、懸濁細胞系Jurkatはプラ
スチック製培養容器の底面に付着することができた。ジェミニ化合物の不存在下
では、Jurkat細胞は懸濁した状態で増殖した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ジェミニ化合物（１）、（５０）、（５２）、（５４）、（５５
）、（５６）を用いるＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションを示す。棒は、
２系の同じウェルから取った４つの試料の平均ｃｐｓを示す。
【図２】 製造者推奨濃度のLipofectAmineTMおよびLipotaxiTMを用いるＨ ＥＫ２９３細胞のトランスフェクションを示す。棒は、２系の同じウェルから取
った４つの試料の平均ｃｐｓを示す。
【図３】 ジェミニ化合物（５４）、（５５）および（５６）を用いるＣＨ
Ｏ−Ｋ１細胞のトランスフェクションを示す。棒は、８個のウェルの平均値±平
均値の標準偏差を示す。
【図４】 ＤＯＰＥのみ添加および／またはＰＬＵＳ添加の場合の、ジェミ
ニ化合物５５を用いるＣＨＯ−Ｋ１細胞のトランスフェクションを示す。棒は、
８個のウェルの平均値±平均値の標準偏差を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 パトリック・カミレーリ イギリス、シーエム19・５エイダブリュ ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ エンス・パーク・サウス、スミスクライ ン・ビーチャム・ファーマシューティカル ズ (72)発明者 アンドレアス・クレマー イギリス、シーエム19・５エイダブリュ ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ エンス・パーク・サウス、スミスクライ ン・ビーチャム・ファーマシューティカル ズ (72)発明者 サイモン・ケンティン・ジョン・ライス イギリス、シーエム19・５エイダブリュ ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ エンス・パーク・サウス、スミスクライ ン・ビーチャム・ファーマシューティカル ズ Ｆターム(参考） 4C084 AA13 NA14 ZB312 4H045 AA10 AA30 BA11 BA12 EA20 EA35 FA50

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ２本の結合した鎖を含むペプチドをベースにしたジェミニ化
    合物： 【化１】 ［式中、各鎖は、 （１）１個またはそれ以上のアミノ酸および／またはアミンから形成される、正
    に帯電した親水性頭部Ｑ1またはＱ2； （２）ポリペプチド骨格を有する中央部Ｐ1またはＰ2； （３）疎水性尾部Ｒ1またはＲ2 を有し、各鎖の中央部はブリッジＹによりＰ1およびＰ2を介して結合している ］。
  2. 【請求項２】 式（Ｉ）： 【化２】 ［式中、Ａ1およびＡ5は同じであっても異なっていてもよく、直鎖状または分枝
    状に結合された１個またはそれ以上のアミノ酸またはアミンから構成される正に
    帯電した基であり； Ａ2／Ａ6ＣＨ（ＮＨ）ＣＯは同じであっても異なっていてもよく； ｐおよびｑは同じであっても異なっていてもよく、０または１であり； Ｘ1／Ｘ2ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ）ＣＯは同じであっても異なっていてもよく、シス テインから誘導されるか（Ｘ1／Ｘ2＝Ｓ）、あるいはセリンまたはメチオニンか
    ら誘導され（Ｘ1／Ｘ2＝Ｏ）； Ａ4／Ａ8ＣＨ（ＮＨ）ＣＯは同じであっても異なっていてもよく、セリンまた
    はスレオニンから誘導され； Ｙはリンカー基であるか、あるいはＸ1およびＸ2がそれぞれＳである場合には
    Ｙはジスルフィド結合であり； Ｒ1およびＲ2はＣ(10-20)飽和または不飽和アルキル基であり； ＷおよびＺはＮＨ、Ｏ、ＣＨ2またはＳである］で示されるペプチドをベース にしたジェミニ化合物またはその塩。
  3. 【請求項３】 Ａ1およびＡ5基がアミド（ＣＯＮＨ）結合により結合してい
    る、請求項２記載のペプチドをベースにしたジェミニ化合物。
  4. 【請求項４】 Ａ1／Ａ5がアルギニン、リジン、オルニチンおよびヒスチジ
    ンから選択されるＤ−またはＬ−アミノ酸である、請求項２または３に記載の化
    合物。
  5. 【請求項５】 Ａ1／Ａ5が直鎖状または分枝鎖状に連結された７個までのア
    ミノ酸を有するものである、請求項２ないし４に記載の化合物。
  6. 【請求項６】 Ａ1／Ａ5が２個または３個のリジンまたはオルニチンまたは
    リジン、オルニチン、アルギニンもしくはヒスチジンからなる組み合わせを有す
    るものである、請求項５記載の化合物。
  7. 【請求項７】 Ａ2／Ａ6ＣＨ（ＮＨ）ＣＯが誘導されるアミノ酸がセリンで
    ある、請求項２ないし６のいずれか１項に記載の化合物。
  8. 【請求項８】 Ｙが（ＣＨ2）mであり、ｍが１ないし６の整数である、請求
    項２ないし７のいずれか１項に記載の化合物。
  9. 【請求項９】 Ｘ1およびＸ2がそれぞれＳである場合にＹがジスルフィド結
    合である、請求項２ないし７のいずれか１項に記載の化合物。
  10. 【請求項１０】 ｍが２である請求項８または９に記載の化合物。
  11. 【請求項１１】 ＲがＣ12アルキルである請求項２ないし１０のいずれか１
    項に記載の化合物。
  12. 【請求項１２】 ＷおよびＺがＮＨである請求項２ないし１１のいずれか１
    項に記載の化合物。
  13. 【請求項１３】 塩が医薬上許容される塩である請求項２ないし１２のいず
    れか１項に記載の化合物。
  14. 【請求項１４】 対称形、すなわち、Ａ1およびＡ5が同じであり、Ａ2およ びＡ6が同じであり、Ａ4およびＡ8が同じであり、Ｒ1およびＲ2が同じであり、 ＷおよびＺが同じである請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の化合物。
  15. 【請求項１５】 化合物３９：２−アミノ−３−｛２−［２−アミノ−２−
    （１−ドデシルカルバモイル−２−ヒドロキシ−エチルカルバモイル）−エチル
    スルファニル］−エチルスルホニル｝−Ｎ−（１−ドデシルカルバモイル−２−
    ヒドロキシ−エチル）−プロピオンアミド 【化３】 またはその誘導体である化合物４０ないし５８。
  16. 【請求項１６】 化合物： 【化４】
  17. 【請求項１７】 化合物： 【化５】
  18. 【請求項１８】 化合物 【化６】
  19. 【請求項１９】 化合物 【化７】
  20. 【請求項２０】 化合物 【化８】
  21. 【請求項２１】 インビボまたはインビボにおける真核細胞中へのＤＮＡま
    たはＲＮＡのトランスフェクションを可能ならしめることにおける、請求項１な
    いし２０のいずれか１項に記載のペプチドをベースにしたジェミニ化合物の使用
    。
  22. 【請求項２２】 （ｉ）中性担体；または （ｉｉ）複合体形成化合物 からなる群より選択される１種またはそれ以上の添加物質と組み合わせて使用さ
    れるものである、請求項２１記載のペプチドをベースにしたジェミニ化合物の使
    用。
  23. 【請求項２３】 中性担体がジオレイルホスファチジルエタノールアミン（
    ＤＯＰＥ）である請求項２２記載の使用。
  24. 【請求項２４】 複合体形成試薬がＰＬＵＳ試薬である請求項２２記載の使
    用。
  25. 【請求項２５】 複合体形成試薬が主として塩基性アミノ酸を含むペプチド
    である請求項２２記載の使用。
  26. 【請求項２６】 ペプチドが塩基性アミノ酸からなるものである請求項２５
    記載の使用。
  27. 【請求項２７】 塩基性アミノ酸がリジンおよびセリンから選択されるもの
    である請求項２５または２６に記載の使用。
  28. 【請求項２８】 ペプチドがポリリジンまたはポリオルニチンである請求項
    ２６記載の使用。
  29. 【請求項２９】 遺伝子治療のためにインビボにおいて細胞中にポリヌクレ
    オチドをトランスフェクションする方法であって、請求項１ないし２０のいずれ
    か１項に記載のペプチドをベースにしたジェミニ化合物を、遺伝子治療ベクター
    とともに、あるいは遺伝子治療ベクターとは別々に投与することを含む方法。
  30. 【請求項３０】 抗感染治療に使用するためのポリヌクレオチドまたは抗感
    染化合物を原核細胞または真核細胞中に導入することを容易ならしめるための、
    請求項１ないし２０のいずれか１項に記載のペプチドをベースにしたジェミニ化
    合物の使用。
  31. 【請求項３１】 培養細胞を互いに付着させること、あるいは培養細胞を固
    体もしくは半固体表面に付着させることを容易ならしめるための、請求項１ない
    し２０のいずれか１項に記載のペプチドをベースにしたジェミニ化合物の使用。
  32. 【請求項３２】 アミノ酸またはペプチドを２−アミノ−３−｛２−［２−
    アミノ−２−（１−ドデシルアルバモイル−２−ヒドロキシ−エチルカルバモイ
    ル）−エチルスルファニル］−エチルスルホニル｝−Ｎ−（１−ドデシルカルバ
    モイル−２−ヒドロキシ−エチル）−プロピオンアミドに添加することを含む、
    請求項１または２のペプチドをベースにしたジェミニ化合物の製造方法。
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