JP4990153B2 - ジアルキレントリアミンのアミドおよびペプチド誘導体、ならびにトランスフェクション剤としてのそれらの使用 - Google Patents

ジアルキレントリアミンのアミドおよびペプチド誘導体、ならびにトランスフェクション剤としてのそれらの使用 Download PDF

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Description

本発明は、新しく同定されたスペルミジン系界面活性剤化合物、かかる化合物の使用およびそれらの製造法に関する。本発明はまた、ポリヌクレオチドの細胞への移入を容易にするための、または薬物送達のための治療的に活性な化合物の細胞への移入を容易にするための、該スペルミジン系化合物の使用に関する。本発明の化合物の特性に関連する特性を有する化合物は、しばしば、ジェミニ界面活性剤と称される。
界面活性剤は、低濃度であっても、液体の表面特性に著しい影響を及ぼす物質である。例えば、界面活性剤は、水または水性溶液に溶解した場合には表面張力を有意に減少させるであろうし、２つの液体間、または液体と固体との間の界面張力を減少させるであろう。界面活性剤分子のこの特性は、工業的に、特に、洗剤および石油工業において、幅広く活用されてきた。１９７０年代には、疎水性橋によって結合される極性頭部を有する２本の疎水性鎖を特徴とする新しい種類の界面活性剤分子が報告された（Deinega, Y et al., Kolloidn. Zh. 36, 649, 1974（非特許文献１））。「ジェミニ」と称されているこれらの分子（Menger, FM and Littau, CA, J. Am. Chem. Soc. 113, 1451, 1991（非特許文献２））は、それらの単量体等価物よりも非常に望ましい特性を有する。例えば、それらは、油性液体と水性液体との間の界面張力を低下させるのに非常に効果的であり、非常に低い臨界ミセル濃度を有する（Menger, FM and Keiper, JS, Angewandte. Chem. Int. Ed. Engl., 2000, 39, 1906（非特許文献３））。
カチオン性界面活性剤は、とりわけ、ポリヌクレオチドの培養細胞へのトランスフェクションのために使用されており、遺伝子技術に関与する科学者が商業的に入手可能なこのような作用物質の例がある（例えば、アメリカ合衆国ウィスコンシン州のPromega Corp.から入手可能な真核細胞のトランスフェクションのための試薬ＴｆｘTM−５０）。
遺伝子治療またはアンチセンス治療のいずれかのためのインビボでのＤＮＡの細胞への効果的な送達は、数年間、主要な目標であった。送達ビヒクルとしてのウイルスの使用、例えば、嚢胞性線維症（ＣＦ）の矯正的遺伝子治療を目的とした気道における上皮細胞のためのアデノウイルスの使用に多くの注目が集まった。しかしながら、ＣＦ患者におけるいくつかの成功した遺伝子移入の証拠があるにもかかわらず、アデノウイルス経路は、炎症性副作用および移入された遺伝子の限られた一過性発現のため問題をかかえたままである。カチオン性界面活性剤を使用する研究を含むインビボ遺伝子送達のためのいくつかの代替法が研究された。Gao, X et al. Gene Ther. 2, 710-722,1995（非特許文献４）は、アミン担持カチオン性脂質を用いて、ＣＦマウスの呼吸上皮へのＣＦ膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）の正常なヒト遺伝子を用いるこの方法の実行可能性を立証した。このグループは、引き続いてリポソームＣＦ遺伝子治療試験を行い、一部が成功しただけであったが、ヒトにおけるこの方法の可能性を立証した（Caplen, NJ. et al., Nature Medicine, 1, 39-46, 1995（非特許文献５））。最近では、別のグループが遺伝子送達のための別のカチオン性脂質、例えば、コレステロール誘導体（Oudrhiri, N et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 1651-1656, 1997（非特許文献７））の可能性を研究した（Miller, A, Angew. Int. Ed. Engl., 37, 1768-1785, 1998（非特許文献６））。この限られた研究によって、インビトロおよびインビボの両方で遺伝子の上皮細胞への移入を容易にするこれらコレステロール系化合物の能力が立証され、それにより、この一般的方法の有効性が支持された。
最近、遺伝子トランスフェクションのための非ウイルス（カチオン性脂質）ベクターの使用が論評された。D. Niculescu-Duvaz, J. Heyes and C. J. Springer, Curr. Med. Chem., 2003, 10, 1233（非特許文献８）を参照。
これらの研究および他の研究は、この新しい研究分野において、細胞ベースの実験におけるトランスフェクションのためにインビトロで、および遺伝子治療およびアンチセンス治療のためにインビボで、ポリヌクレオチドの細胞への有効な移入を容易にするための新規低毒性界面活性剤分子の開発が依然として必要とされていることを示している。以前、システイン（ＷＯ ９９／２９７１２（特許文献１））またはスペルミン（ＷＯ ００／７７０３２（特許文献２））またはジアミン（ＷＯ ００／７６９５４（特許文献３））をベースとするジェミニ界面活性剤が調製された。ＷＯ ００／２７７９５（特許文献４）、ＷＯ ０２／３０９５７（特許文献５）、ＷＯ ０２／５０１００（特許文献６）およびＷＯ ０３／８２８０９（特許文献７）には別のジェミニ界面活性剤の例が記載されている。最近、ポリヌクレオチドベクターとしてのジェミニ界面活性剤の使用が論評された（A. J. Kirby, P. Camilleri, J. B. F. N. Engberts, M. C. Feiters, R. J. M. Nolte, O. Soederman, M. Bergsma, P. C. Bell, M. L. Fielden, C. L. Garcia Rodriguez, Philippe Guedat, A. Kremer, C. McGregor, C. Perrin, G. Ronsin and M. C. P. van Eijk, Angew. Chem. Int. Ed., 2003, 42, 1448（非特許文献９）、R. Zana and J. Xia, Gemini Surfactants, Marcel Dekker, NY, 2004（非特許文献１０）もまた参照）。
最近開発された技術は、遺伝子機能を一時的に抑制するための合成低分子干渉（ｓｉ）二本鎖ＲＮＡ分子の使用を含む。もともとC.elegans（A. Fire, Trends Genet., 1999, 15(9), 358（非特許文献１１））の研究からつくられたこのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の技術は、後に開発されて、その用途を哺乳動物細胞に適用することができるようになった（S. M. Elbashir, J. Harborth, W. Lendeckel, A. Yalcin, K. Weber, T. Tuschl, Nature, 2001, 411, 494（非特許文献１２））。これらのｓｉＲＮＡエフェクター分子を細胞集団の大部分の正しい位置に送達する能力がこの技術の有効な利用において重要な工程である。いったん正しく配置されると、ＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖が標的メッセンジャー（ｍ）ＲＮＡ（目的の標的をコードする）の相補的な領域と結合し、ｍＲＮＡの加水分解およびそれに続く分解を引き起こす。このｍＲＮＡの一過性の減少は、標的遺伝子発現の一過性の減少を引き起こす。標的遺伝子発現を、該標的の機能を解明することができるようなレベルに減少させるために、非常に効果的な送達および正しい局在化が必要とされる。
ＷＯ ９９／２９７１２ ＷＯ ００／７７０３２ ＷＯ ００／７６９５４ ＷＯ ００／２７７９５ ＷＯ ０２／３０９５７ ＷＯ ０２／５０１００ ＷＯ ０３／８２８０９ Deinega, Y et al., Kolloidn. Zh. 36, 649, 1974 Menger, FM and Littau, CA, J.Am.Chem.Soc. 113, 1451, 1991 Menger, FM and Keiper, JS, Angewandte. Chem. Int. Ed. Engl., 2000, 39, 1906 Gao, X et al. Gene Ther. 2, 710-722,1995 Caplen, NJ. et al., Nature Medicine, 1, 39-46, 1995 Miller, A, Angew. Int. Ed. Engl., 37, 1768-1785, 1998 Oudrhiri, N et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 1651-1656, 1997 D. Niculescu-Duvaz, J. Heyes and C. J. Springer, Curr. Med. Chem., 2003, 10, 1233 A. J. Kirby, P. Camilleri, J. B. F. N. Engberts, M. C. Feiters, R. J. M. Nolte, O. Soederman, M. Bergsma, P. C. Bell, M. L. Fielden, C. L. Garcia Rodriguez, Philippe Guedat, A. Kremer, C. McGregor, C. Perrin, G. Ronsin and M. C. P. van Eijk, Angew. Chem. Int. Ed., 2003, 42, 1448 R. Zana and J. Xia, Gemini Surfactants, Marcel Dekker, NY, 2004 C.elegans (A. Fire, Trends Genet., 1999, 15(9), 358） S. M. Elbashir, J. Harborth, W. Lendeckel, A. Yalcin, K. Weber, T. Tuschl, Nature, 2001, 411, 494
本発明は、既存の化合物によって示される問題を克服することを目的とするものである。
本発明は、式（Ｉ）：
Figure 0004990153
 ［式中、Ｙは、(Ａａ)xまたは式（ＩＩ）：
Figure 0004990153
 で示される基のいずれかであり；
Ｒ1およびＲ2は、同一であっても異なっていてもよく、炭素原子２４個までの飽和または不飽和の直鎖または分枝状炭化水素鎖であり；
ｍは、１〜１０であり；
ｎは、１〜１０であり；
(Ａａ)xは、各場合において同一であっても異なっていてもよく、直鎖または分枝状に結合したｘ個の天然または非天然アミノ酸であり；
ｘは、各場合において同一であっても異なっていてもよく、１〜６であり；
ｐは、０〜６であり；
ｑは、１〜６であり；
ｒは、１〜６であり；
ｓは、１〜６であり；
ｚは、０または１であり；
Ｘは、Ｎ、ＣＨまたはＣである；ただし、ＸがＮである場合にはｚは０または１であり；ＸがＣＨである場合にはｚは０であり；ＸがＣである場合にはｚは１である］
で示される一般構造を有する化合物、またはその塩（好ましくは、医薬上許容される塩）に関する。
好ましくは、ｍは３〜６であり、最も好ましくは、４である。
好ましくは、ｎは３〜６であり、最も好ましくは、３である。
一の実施態様ａ）では、Ｙは(Ａａ)xである。かかる実施態様では、Ｒ1およびＲ2は、例えば、同一であってよい。(Ａａ)は、好ましくは、塩基性アミノ酸である。塩基性アミノ酸の例としては、[Ｈ2Ｎ(ＣＨ2)3]2Ｎ(ＣＨ2)ＣＯ2Ｈ、(Ｈ2ＮＣＨ2)2ＣＨＣＯ2Ｈ、またはＳｅｒ（セリン）、Ｌｙｓ（リジン）、Ｏｒｎ（オルニチン）、Ｄａｂ（ジアミノ酪酸）またはＤａｐ（ジアミノプロピオン酸）のＬまたはＤエナンチオマーが挙げられる。塩基性アミノ酸の例としては、側鎖に少なくとも１個のＮＨ2基（またはＯＨ基であってもよい）を含んでおり、１〜１２個、例えば、１〜１０個の炭素原子を含んでいるアミノ酸が挙げられる。
好ましくは、ｘは、１〜４であり、より好ましくは１または２であり、最も好ましくは１である。
別の実施態様ｂ）では、Ｙは、式（ＩＩ）：
Figure 0004990153
 ［ここで、
ｘは、各場合において同一であっても異なっていてもよく、１〜６であり；
ｐは、０〜６であり；
ｑは、１〜６であり；
ｒは、１〜６であり；
ｓは、１〜６であり；
ｚは、０または１であり；
Ｘは、Ｎ、ＣＨまたはＣである；ただし、ＸがＮである場合にはｚは０または１であり；ＸがＣＨである場合にはｚは０であり；ＸがＣである場合にはｚは１である］
で示される基である。
実施態様（ｂ）の一例として、Ｘは、例えば、Ｎであってよい。一のかかる実施態様では、ｚは０であり、ｒおよびｓは、例えば、同一であってよく、Ｒ1およびＲ2は、例えば、同一であってよい。
一の実施態様では、Ｘは、ＮまたはＣである。
(Ａａ)は、好ましくは、塩基性アミノ酸である。塩基性アミノ酸の例としては、[Ｈ2Ｎ(ＣＨ2)3]2Ｎ(ＣＨ2)ＣＯ2Ｈ、(Ｈ2ＮＣＨ2)2ＣＨＣＯ2Ｈ、またはＳｅｒ（セリン）、Ｌｙｓ（リジン）、Ｏｒｎ（オルニチン）、Ｄａｂ（ジアミノ酪酸）またはＤａｐ（ジアミノプロピオン酸）のＬまたはＤエナンチオマーが挙げられる。塩基性アミノ酸の例としては、側鎖に少なくとも１個のＮＨ2基（またはＯＨ基であってもよい）を含んでおり、１〜１２個、例えば、１〜１０個の炭素原子を含んでいるアミノ酸が挙げられる。
好ましくは、ｘは、１〜４であり、より好ましくは１または２であり、最も好ましくは１である。（ｂ）の一の実施態様では、ｘは、各場合において同一である。別の実施態様では、ｘは、各場合において異なる。
好ましくは、ｐは１である。
好ましくは、ｑは１または３である。
好ましくは、ｒは１または３である。
好ましくは、ｓは１または３である。
さらに好ましい実施態様では、炭素原子２４個までの飽和または不飽和の直鎖または分枝状炭化水素鎖Ｒ1またはＲ2は、炭素原子１０個またはそれ以上、例えば、炭素原子１２個またはそれ以上、例えば、１４個またはそれ以上、例えば、１６個またはそれ以上を有する。さらに好ましい実施態様では、炭素原子２４個までの飽和または不飽和の直鎖または分枝状炭化水素鎖Ｒ1またはＲ2は
−(ＣＨ2)10ＣＨ3、
−(ＣＨ2)12ＣＨ3、
−(ＣＨ2)14ＣＨ3、
−(ＣＨ2)16ＣＨ3、
−(ＣＨ2)18ＣＨ3、
−(ＣＨ2)20ＣＨ3、
−(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)7ＣＨ3天然混合物、
−(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)5ＣＨ3天然混合物、
−(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)5ＣＨ3シス、
−(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)7ＣＨ3シス、
−(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)5ＣＨ3トランス、
−(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)7ＣＨ3トランス、
−(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)4ＣＨ3、
−(ＣＨ2)7(ＣＨ＝ＣＨＣＨ2)3ＣＨ3、
−(ＣＨ2)3ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ)3(ＣＨ2)4ＣＨ3、
−(ＣＨ2)7ＣＨＣＨ(ＣＨ2)7ＣＨ3、
−ＣＨ2ＣＨ(ＣＨ3)[ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ(ＣＨ3)]3ＣＨ3、または
−(ＣＨ2)22ＣＨ3
から選択される。
最も好ましくは、該炭化水素鎖は、(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)7ＣＨ3天然混合物、(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)7ＣＨ3シスおよび(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)7ＣＨ3トランスから選択される。
一の実施態様では、本発明の化合物は、いわゆる「ジェミニ」界面活性剤化合物である。言い換えると、該化合物は、少なくとも２本の脂肪族鎖について対称的である。
本発明の化合物は、当業者に周知の合成化学を使用して容易に入手可能な出発物質から調製され得る。図１は、本発明の化合物の合成のための中間体６の合成のための一般的なスキームを示す。図２は、本発明の合成のための保護された好ましい(Ａａ)基９の合成のための一般的なスキームを示す。図３は、本発明の化合物の合成のための保護された好ましい(Ａａ)基１４の合成のための一般的なスキームを示す。
図４の一般的なスキームにおいて示されるように、適当な条件下での(Ａａ)x基の付加、次いで、脱保護による中間体６の反応により、本発明の実施態様ａ）による置換パターンを有する分子が生成される。
図５は、本発明の化合物の合成のための中間体６の進んだ中間体１８への変換のための一般的なスキームを示す。図６の一般的なスキームにおいて示されるように、適当な条件下での(Ａａ)x基の付加、次いで、脱保護により、本発明の実施態様ｂ）による置換パターンを有する分子を生成するために中間体１８を使用することができる。
様々な代替ストラテジーが当業者に周知であり、特定の望ましい最終置換パターンのために適当なストラテジーを考えることができる。非対称的な置換パターンについては、生成物または中間体の物理的分離が必要となる場合がある。適当な分離方法、例えば、クロマトグラフィー法が当業者に周知である。
本発明の分子の塩は、例えば図４および６におけるスキームに示されるように、標準的な技術により調製することができる。図４および６において示されるスキームでは、塩形成工程は脱保護工程でもある。
本発明の別の態様は、スペルミジン系界面活性剤化合物を使用するための方法に関する。かかる使用は、全生物におけるアンチセンス、遺伝子治療および遺伝子免疫化（抗体の発生に関する）のためにオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの細胞への移入を容易にすることを含む。他の使用は、例えば特に遺伝子発現研究およびアンチセンス制御実験において、かかる移入が必要とされる場合にポリヌクレオチドの培養細胞へのトランスフェクションを容易にするために本発明の化合物を用いることを含む。かかるポリヌクレオチドおよびアンチセンス分子の調製のためのプロトコールは当該技術分野において周知である（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)、Cohen, JS ed. Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1989)）。ポリヌクレオチドを該化合物と混合し、細胞に加え、インキュベートしてポリヌクレオチド取り込みを可能にすることができる。さらなるインキュベーションの後、トランスフェクトＤＮＡにより与えられる表現型形質について該細胞をアッセイすることができるか、または、ノーザンブロッティングにより、またはＰＣＲに基づく定量化方法（例えば、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）法（アメリカ合衆国コネティカット州のPerkin Elmer））を使用することにより、該ＤＮＡから発現されるｍＲＮＡのレベルを測定することができる。本発明の化合物は、従来技術における化合物と比べて、培養細胞におけるＤＮＡの細胞取り込み効率において有意な（典型的には３〜６倍の）向上をもたらす。トランスフェクションプロトコールでは、該スペルミジン界面活性剤化合物は、トランスフェクションの効率を向上させるために１種類またはそれ以上の補充物と合わせて使用することができる。かかる補充物は、例えば、
（ｉ）中性担体、例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）（Farhood, H., et al (1985) Biochim. Biophys. Acta, 1235-1289）；
（ｉｉ）錯化剤、例えば、商業的に入手可能なＰＬＵＳ剤（アメリカ合衆国メリーランド州のLife Technologies Inc.）、またはポリリジンもしくはポリオルニチンペプチドのようなペプチド、または排他的ではないが主にリジン、オルニチンおよび／またはアルギニンのような塩基性アミノ酸を含むペプチド（例えば、Henner, WD et al (1973) J. Virol. 12(4) pp741-747）
から選択され得る。上記リストは網羅していることを意図するものではなく、トランスフェクションの効率を向上させる他の補充物は本発明の範囲内となる。
さらに別の態様では、本発明は、本発明の化合物を使用する遺伝子治療における遺伝物質の移入に関する。例えば、当業者は、当該技術分野で周知のプロトコールを使用して、本発明のスペルミジン界面活性剤化合物の使用を含む遺伝子治療用の遺伝子送達方法を開発することができる。例えば、遺伝子移入ベクターの肺への送達のための界面活性剤の使用は、Weiss, DJ (2002) Molecular Therapy 6(2) pp148 to 152において論評されている。
本発明のさらに別の態様は、本発明の化合物を使用してインビトロおよびインビボで非ヌクレオチド系薬剤化合物の細胞への送達をもたらす方法に関する。
以下の定義は、本明細書にてしばしば使用される用語の理解を容易にするためのものである。
「アミノ酸」とは、+Ｈ3ＮＣＨ(Ｒ)ＣＯ2 -の形の双極子イオン（双性イオン）をいう。それらは、基Ｒの性質によって区別され、Ｒが水素と違う場合にはＤ系列およびＬ系列を形成する不斉性であり得る。Ｒ基が例えば非極性である場合（例えば、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン）または極性である場合（例えば、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニンおよびリジン）の２０種類の天然アミノ酸がある。非天然アミノ酸の場合、Ｒは、自然界に見られるアミノ酸では見られない他の基であり得る。
「ポリヌクレオチド」とは、一般に、未修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであっても修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよいポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいう。「ポリヌクレオチド」としては、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖であり得るかまたは一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。加えて、「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域をいう。ポリヌクレオチドなる用語としてはまた、１個またはそれ以上の修飾塩基を含有するＤＮＡのものまたはＲＮＡのもの、および安定性のためまたは別の理由のために修飾された骨格をもつＤＮＡのものまたはＲＮＡのものが挙げられる。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化塩基、およびイノシンのような珍しい塩基が挙げられる。ＤＮＡおよびＲＮＡに対して様々な修飾が行われてきた；かくして、「ポリヌクレオチド」は、自然界で典型的に見られるようなポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルスおよび細胞のＤＮＡおよびＲＮＡ特性をもつ化学形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと称される比較的短いポリヌクレオチドを包含する。
「トランスフェクション」とは、化学的手段または物理的手段のいずれかによる細胞膜の修飾を含む方法を使用するポリヌクレオチドの培養細胞への導入をいう。かかる方法は、例えば、Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載されている。該ポリヌクレオチドは、直鎖または環状の一本鎖または二本鎖であってよく、ポリヌクレオチドの複製、またはポリヌクレオチドの一部を含んでいてもよい相同的もしくは非相同的遺伝子の発現を制御するエレメントを含むことができる。
医薬上許容される酸付加塩は、所望により有機溶媒のような適当な溶媒中にて、式（Ｉ）で示される化合物を適当な無機酸または有機酸（例えば、臭化水素酸、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、コハク酸、マレイン酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、安息香酸、サリチル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸（例えば、２−ナフタレンスルホン酸）、またはヘキサン酸）と反応させて、例えば結晶化および濾過により通常単離される塩を得ることにより形成することができる。式（Ｉ）で示される化合物の医薬上許容される酸付加塩は、例えば、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩（例えば、２−ナフタレンスルホン酸塩）またはヘキサン酸塩を含み得るかまたはこの塩である。
本発明は、水和物および溶媒和物を含む式（Ｉ）で示される化合物の塩の可能な全ての化学量論的形態および非化学量論的形態をその範囲内に包含する。
式（Ｉ）で示される化合物には、立体異性体形態で存在することができるものがある。本発明は、これらの化合物の全ての幾何異性体および光学異性体、ならびにラセミ化合物を包含するその混合物を包含することが理解されるであろう。互変異性体もまた本発明の態様をなす。
ここで、以下の実施例によって本発明を説明する。該実施例は、如何なる場合も本発明の範囲を限定しようとするものではない。
記載１： Ｎ1,Ｎ8−ビス(トリフルオロアセチル)−スペルミジン・トリフルオロ酢酸塩（２）
Figure 0004990153
 スペルミジン１（ｍ＝４、ｎ＝３；９.７０ｇ、６６.８ｍｍｏｌ）のＣＨ3ＣＮ（１５０ｍＬ）中溶液にトリフルオロ酢酸エチル（３９.８ｍＬ、３３０ｍｍｏｌ）および水（２.８ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）を添加した。該反応混合物を還流させながら１８時間加熱し、次いで、室温に冷却させ、溶媒を真空蒸発させた。残留固体をＣＨ2Ｃｌ2（２×１５０ｍＬ）と一緒にトリチュレートして、白色固体としてビス(トリフルオロアセトアミド)２を得た（２８.９ｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１.１０分（ｍ／ｚ＝３３８.１ [Ｍ＋Ｈ]+）。
記載２： Ｎ4−(tert−ブトキシカルボニル)−Ｎ1,Ｎ8−ビス(トリフルオロアセチル)−スペルミジン（３）
Figure 0004990153
 窒素雰囲気下にて、Ｎ1,Ｎ8−ビス(トリフルオロアセチル)スペルミジン・トリフルオロ酢酸塩２（２８.８ｇ、６３.８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２８０ｍＬ）中溶液にジイソプロピルエチルアミン（１６.７ｍＬ、９５.７ｍｍｏｌ）およびジ炭酸ジ−tert−ブチル（１４.６３ｇ、６７.０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１００ｍＬ）中溶液を添加した。室温にて１８時間後、溶媒を真空蒸発させ、ＥｔＯＡｃ（７００ｍＬ）を添加した。該溶液を５％ＮａＨＣＯ3（２×１５０ｍＬ）、ブライン（１５０ｍＬ）、５％ＫＨＳＯ4（２×１５０ｍＬ）およびブライン（２×１５０ｍＬ）で連続的に洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、蒸発させて、白色固体としてＢｏｃカルバメート３を得た（２８.０ｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝４.０９分（ｍ／ｚ＝４３８.３ [Ｍ＋Ｈ]+）。
記載３： Ｎ4−(tert−ブトキシカルボニル)−スペルミジン（４）
Figure 0004990153
 １０℃にて、Ｎ4−(tert−ブトキシカルボニル)−Ｎ1,Ｎ8−ビス(トリフルオロアセチル)−スペルミジン（２８.０ｇ、６４.０ｍｍｏｌ）のメタノール（４００ｍＬ）中溶液に水酸化ナトリウム水溶液（２８０ｍＬ×０.５Ｎ）を撹拌しながら添加した。冷却浴を外し、該混合物を１８時間撹拌した後、メタノールを真空蒸発させた。得られた水性懸濁液をＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ［９：１］（５×３００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出物を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、真空蒸発させて、無色の油状物としてアミン４を得た（１５.５ｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝０.５６分（ｍ／ｚ＝２４６.２ [Ｍ＋Ｈ]+）。
記載４： Ｎ1,Ｎ8−ジオレイル−スペルミジン・トリフルオロ酢酸塩（６；Ｒ＝オレイル）
Figure 0004990153
 Ｎ4−(tert−ブチルオキシカルボニル)−スペルミジン４（６３２ｍｇ、２.５８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（９０ｍＬ）中溶液にＴＨＦ（９０ｍＬ）に溶解したオレイン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２.１０ｇ、５.４０ｍｍｏｌ）の溶液および炭酸カリウム（８９０ｍｇ、６.４０ｍｍｏｌ）の水（１４ｍＬ）中溶液を添加した。得られた混合物を室温で１６時間撹拌し、真空濃縮した。残留物をＣＨＣｌ3（３００ｍＬ）に溶解し、５％クエン酸水溶液（５０ｍＬ）およびブライン（２×５０ｍＬ）で洗浄し、次いで、乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、真空濃縮した。得られた油状物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ［７５：２５］、次いで、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ［７５：２５］で溶離するフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、茶色の油状物として中間体Ｂｏｃカルバメート５を得た。該油状物をＣＨ2Ｃｌ2（６.０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却し、トリフルオロ酢酸（６.０ｍＬ）で処理した。得られた混合物を室温にゆっくりと加温し、さらに１.５時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残留物をジエチルエーテルと一緒に共蒸発させて、白色固体としてトリフルオロ酢酸塩６を得た（１.９４ｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１９.０３分（ｍ／ｚ＝６７４.６５６４［Ｍ＋Ｈ]+、１００％)；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ54Ｈ107Ｎ8Ｏ4）６７４.６５６４、測定値６７４.６５６４ [Ｍ＋Ｈ]+）。
記載５： ２,２,２−トリフルオロ−Ｎ−｛３−[３−(２,２,２−トリフルオロアセチルアミノ)−プロピルアミノ]プロピル｝−アセトアミド・トリフルオロ酢酸塩（７）
Figure 0004990153
 Ｎ1−(３−アミノプロピル)プロパン−１,３−ジアミン１（ｍ＝ｎ＝３；５.００ｇ、３８.２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル：水［９９：１］（１５０ｍＬ）中溶液にトリフルオロ酢酸エチル（２７.０ｇ、１９０ｍｍｏｌ）を添加し、該混合物を還流させながら撹拌しながら３時間加熱した。室温に冷却した後、ＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬ）を添加し、得られた沈殿物を回収し、ＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬ）で洗浄して、白色粉末としてトリフルオロ酢酸塩７を得た（１６.６ｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝２.０５分（ｍ／ｚ＝３２３.０ [Ｍ＋Ｈ+]）。
記載６： ｛ビス−[３−(２,２,２−トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]−アミノ｝−酢酸エチルエステル（８）
Figure 0004990153
 ジイソプロピルエチルアミン（１５.０ｇ、８６.３ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸塩８（１５.０ｇ、３４.５ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル（１５０ｍＬ）中溶液にブロモ酢酸エチル（７.３０ｇ、４３.７ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で１８時間撹拌し、次いで、真空濃縮した。得られた残留物を水（１００ｍＬ）で希釈し、ＣＨ2Ｃｌ2（２×６０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、真空蒸発させて、薄黄色の油状物としてエチルエステル８を得た（１４.１ｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝３.０分（ｍ／ｚ＝４１０ [Ｍ＋Ｈ+]）。
記載７： ビス−(３−tert−ブトキシカルボニルアミノ−プロピル)−アミノ]−酢酸（９）
Figure 0004990153
 エチルエステル８（１４.１ｇ、３４.５ｍｍｏｌ）、水酸化ナトリウム（６.０ｇ、４０.０ｍｍｏｌ）、水（３５ｍＬ）およびエタノール（１７５ｍＬ）の混合物を室温で２０時間撹拌した。Ｂｏｃ無水物（１５.１ｇ、６８.８ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌をさらに３時間続けた後、１０％塩酸を添加することにより該混合物を中性ｐＨに調整した。水（１００ｍＬ）を添加し、該溶液をＣＨ2Ｃｌ2（４×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、真空濃縮して、白色粉末としてカルボン酸９を得た（３.５ｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝３.０５分（ｍ／ｚ＝３９０.３ [Ｍ＋Ｈ+]）。
記載８： ジシアノ酢酸メチル・カリウム塩（１１）
Figure 0004990153
 温度を４０℃以下に維持しながら、水酸化カリウム（６.８０ｇ、１２１ｍｍｏｌ）の水（６.０ｍＬ）中撹拌溶液にマロノニトリル（４.００ｇ、６０.６ｍｍｏｌ）およびクロロギ酸メチル（４.９５ｍＬ、６４.２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（９.０ｍＬ）中溶液を０.５時間にわたって添加した。該混合物を室温でさらに２時間撹拌し、得られた沈殿物を濾過により回収し、まず、冷水（１０ｍＬ）で洗浄し、次いで、エタノール（１０ｍＬ）で洗浄して、白色固体としてカリウム塩１１を得た（３.３１ｇ）。
1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）：δH ３.５８（ｓ，３Ｈ）。
記載９： ３−アミノ−２−(アミノメチル)プロピオン酸メチル・二塩酸塩（１２）
Figure 0004990153
 ジシアノ酢酸メチルのナトリウム塩（１.００ｇ、６.２０ｍｍｏｌ）の濃塩酸（３２％、２.０ｍＬ）を含有するメタノール（１００ｍＬ）中溶液中の１０％パラジウム−炭（２.０ｇ）の撹拌懸濁液を５バールおよび室温にて２４時間水素添加した。触媒を濾去し、溶媒を真空蒸発させた。残留物をメタノール（５０ｍＬ）で処理し、沈殿した塩化ナトリウムを濾去した。溶液を低容量に真空濃縮し、次いで、ＥｔＯＡｃを添加して、オフホワイト色の固体として二塩酸塩１２を沈殿させた（１.２０ｇ）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ｄ6 ＤＭＳＯ）：δH ８.４０（ｂｒｓ，６Ｈ）、３.６５（ｓ，３Ｈ）、３.２５（ｍ，１Ｈ）、３.１５（ｍ，４Ｈ）。
記載１０： ３−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)−２−(tert−ブトキシカルボニルアミノ−メチル)プロピオン酸メチルエステル（１３）
Figure 0004990153
 ジイソプロピルエチルアミン（０.９５ｍＬ、５.４０ｍｍｏｌ）および二塩酸塩１２（２５５ｍｇ、１.３５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（８.０ｍＬ）中撹拌溶液にＢｏｃ無水物（０.６２ｇ、２.８３ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１８時間撹拌した後、沈殿した固体を濾去し、濾液を真空蒸発させた。残留油状物をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）に溶解し、次いで、水（２×５ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、真空蒸発させて、粘稠性の無色油状物としてビス−Ｂｏｃカルバメート１３を得た（４３０ｍｇ）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δH ５.２０（ｂｒｓ，２Ｈ）、３.６８（ｓ，３Ｈ）、３.５５（ｍ，２Ｈ）、３.２０（ｍ，２Ｈ）、２.７３（ｍ，１Ｈ）、１.４２（ｓ，１８Ｈ）。
記載１１： ３−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)−２−(tert−ブトキシカルボニルアミノ−メチル)プロピオン酸（１４）
Figure 0004990153
 メチルエステル１３（０.４１ｇ、１.２４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（７.５ｍＬ）中撹拌溶液に２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（２.４８ｍＬ、４.９６ｍｍｏｌ）を添加し、該混合物を室温で２４時間撹拌した。水（１５ｍＬ）を添加し、該溶液を５％クエン酸水溶液で酸性化した。該混合物をＣＨＣｌ3（３×２５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出物をブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、真空蒸発させて、粘稠性の無色油状物として酸１４を得た（２８０ｍｇ）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ｄ6 ＤＭＳＯ）：δH １２.２（ｂｒｓ，１Ｈ）、６.７０（ｂｒｓ，２Ｈ）、３.０５（ｍ，４Ｈ）、２.５０（ｍ，１Ｈ）、１.３５（ｓ，１８Ｈ）。
記載１２： (Ｂｏｃ)2Ｌｙｓ.(tＢｕＯ)ＳｅｒＯＨ
Ｌ−セリンtert−ブチルエーテル（１.０２ｇ、６.３０ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（１.０３ｇ、７.４４ｍｍｏｌ）の水（１２.０ｍＬ）中撹拌混合物にビス−ＢｏｃＬ−リジンＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２,５４ｇ、５.７２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（６０.０ｍＬ）中溶液を添加した。該混合物を室温で１８時間撹拌し、次いで、真空濃縮した。残留物をＣＨＣｌ3（１４０ｍＬ）および水（１４０ｍＬ）で希釈し、１Ｎ塩酸でｐＨ２に調整した。有機層を分取し、水性相をＣＨＣｌ3（２×１４０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、次いで、真空蒸発させて、白色の泡沫体としてジペプチドを得た（２.８４ｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝３.８０分（ｍ／ｚ＝４９０.３ [Ｍ＋Ｈ]+）。
Ｎ1,Ｎ8−ジオレイル−Ｎ4−(Ａａ)−スペルミジン（１６）の一般的な製造方法
Ｎ1,Ｎ8−ジオレイル−スペルミジン・トリフルオロ酢酸塩６のＤＭＦ中溶液（６０ｍＭ）にＮ末端保護アミノ酸（(Ａａ)x−(ＰＧ)y：１.１当量）、ＨＣＴＵ（１.１当量）およびジイソプロピルエチルアミン（３.２当量）を添加した。該混合物をＮ2下にて室温で１８時間撹拌した後、等容量のＥｔＯＡｃを添加した。有機混合物を５％ＫＨＳＯ4水溶液（３×）、５％Ｋ2ＣＯ3水溶液（３×）およびブライン（１×）で連続的に洗浄し、次いで、乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、真空濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＭ）に溶解し、等容量のＥｔＯＡｃ中５.０Ｎ ＨＣｌを添加した。反応物を室温で２時間撹拌し、次いで、真空濃縮し、残留物をジエチルエーテルと一緒にトリチュレートして、非晶質の白色固体を得、これを分取ＭＳ指向型ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ−１８、５μｍ；溶離液Ａ：水＋０.１％ギ酸、溶離液Ｂ：ＭｅＣＮ：水［９５：５］＋０.１％ギ酸；流速：４０ｍＬ／分；検出器（ＥＳＩ−ＭＳ）；方法：１５分間にわたってＡ中５〜３０％Ｂ）により精製した。生成物を含有するフラクションを蒸発させ、残留物をメタノールに溶解し、ジエチルエーテル中２.０Ｎ ＨＣｌで処理した。１０分後、溶媒を真空除去し、残留物を凍結乾燥させて、白色固体として界面活性剤塩酸塩１６を得た。
実施例１： Ａａ＝Ｌ−Ｄａｐ
Figure 0004990153
 ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝７.５０分（ｍ／ｚ＝６７４.６ [Ｍ−Ｄａｐ]+（１００％）、７６０.７ [Ｍ＋Ｈ]+（２０％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ46Ｈ90Ｎ5Ｏ3）７６０.７０４４、測定値７６０.７０２８ [Ｍ＋Ｈ]+。
実施例２： Ａａ＝Ｌ−Ｄａｂ
Figure 0004990153
 ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝６.７０分（ｍ／ｚ＝７７４.７ [Ｍ＋Ｈ]+（５０％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ47Ｈ92Ｎ5Ｏ3）７７４.７２００、測定値７７４.７１９７ [Ｍ＋Ｈ]+。
実施例３： Ａａ＝Ｌ−Ｏｒｎ
Figure 0004990153
 ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝６.６４分（ｍ／ｚ＝７８８.７ [Ｍ＋Ｈ]+（１００％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ48Ｈ94Ｎ5Ｏ3）７８８.７３５７、測定値７８８.７３５０ [Ｍ＋Ｈ]+。
実施例４： Ａａ＝Ｌ−Ｌｙｓ
Figure 0004990153
 ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝６.６８分（ｍ／ｚ＝８０２.８ [Ｍ＋Ｈ]+（１００％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ49Ｈ96Ｎ5Ｏ3）８０２.７５１３、測定値８０２.７５１７ [Ｍ＋Ｈ]+。
実施例５： Ａａ＝Ｄ−Ｌｙｓ
Figure 0004990153
 ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝６.７８分（ｍ／ｚ＝８０２.８ [Ｍ＋Ｈ]+（１００％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ49Ｈ96Ｎ5Ｏ3）８０２.７５１３、測定値８０２.７５２４ [Ｍ＋Ｈ]+。
実施例６： Ａａ＝Ｌ−Ｓｅｒ
Figure 0004990153
 ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１８.４１分（ｍ／ｚ＝７６１.７ [Ｍ＋Ｈ]+（１００％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ46Ｈ89Ｎ4Ｏ4）７６１.６８８４、測定値７６１.６８８８ [Ｍ＋Ｈ]+。
実施例７： Ａａ＝Ｌ−Ｓｅｒ−L−Ｌｙｓ
Figure 0004990153
 ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１４.８９分（ｍ／ｚ＝８８９.８ [Ｍ＋Ｈ]+（１００％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ52Ｈ101Ｎ6Ｏ5）８８９.７８３３、測定値８８９.７８２９ [Ｍ＋Ｈ]+。
実施例８：Ａａ＝Ｌ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ｌｙｓ
Figure 0004990153
 ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１４.９４分（ｍ／ｚ＝８８９.８ [Ｍ＋Ｈ]+（１００％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ52Ｈ101Ｎ6Ｏ5）８８９.７８３３、測定値８８９.７８４２ [Ｍ＋Ｈ]+。
実施例９： Ａａ＝（１４）
Figure 0004990153
 ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝６.３３分（ｍ／ｚ＝７７４.７ [Ｍ＋Ｈ]+（１００％））。
実施例１０： Ａａ＝（９）
Figure 0004990153
 Ｎ1,Ｎ8−ジオレイル−スペルミジン・二(トリフルオロ酢酸塩)６（１.００ｇ、１.４０ｍｍｏｌ）にビス−Ｂｏｃカルボン酸９（６６０ｍｇ、１.６８ｍｍｏｌ）のＴＢＴＵ（５３０ｍｇ、１.６８ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１.５ｍＬ、８.４０ｍｍｏｌ）を含有するＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍＬ）中溶液を添加した。該混合物を室温で１８時間撹拌し、次いで、真空濃縮し、残留物をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）に溶解し、５％ＫＨＳＯ4水溶液（２５ｍＬ）、５％Ｋ2ＣＯ3水溶液（２×２５ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で連続的に洗浄した。有機相を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、真空蒸発させて油状物を得、これをＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ［９０：１０］混合物で溶離するカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）により精製して、無色のガム状物として中間体ビス−Ｂｏｃカルバメートを得た。該ガム状物をＣＨ2Ｃｌ2（２５ｍＬ）に溶解し、ＥｔＯＡｃ中５Ｎ ＨＣｌ（１０ｍＬ）で処理した。得られた混合物を室温で２時間撹拌した後、沈殿した固体を濾過により回収し、無水ジエチルエーテルで洗浄し、真空乾燥させて、白色粉末として実施例１０を得た。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１２.６５分（ｍ／ｚ＝８４５.８ [Ｍ＋Ｈ]+（１００％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ51Ｈ101Ｎ6Ｏ3）８４５.７９３５、測定値８４５.７９３８ [Ｍ＋Ｈ]+。
Ｎ1,Ｎ8−ジオレイル−Ｎ4−[（１４）−Ａａ]−スペルミジン（２０）の一般的な製造方法
実施例９のＤＭＦ中溶液（８０ｍＭ）にＮ末端保護アミノ酸（２.６当量）、ＨＣＴＵ（２.６当量）およびＤＩＥＡ（７.５当量）を添加した。該混合物をＮ2下にて室温で１８時間撹拌し、次いで、等容量のＥｔＯＡｃを添加した。該有機混合物を５％ＫＨＳＯ4水溶液（３×）、５％Ｋ2ＣＯ3水溶液（３×）およびブライン（１×）で連続的に洗浄し、次いで、乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、真空濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＭ）に溶解し、等容量のＥｔＯＡｃ中５.０Ｎ ＨＣｌを添加した。反応物を室温で２時間撹拌し、次いで、真空濃縮し、残留物をジエチルエーテルと一緒にトリチュレートして、非晶質の白色固体を得、これを分取ＭＳ指向型ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ−１８、５μｍ；溶離液Ａ：水＋０.１％ギ酸、溶離液Ｂ：ＭｅＣＮ：水［９５：５］＋０.１％ギ酸；流速：４０ｍＬ／分；検出器（ＥＳＩ−ＭＳ）；方法：１５分間にわたってＡ中３０〜５０％Ｂ）により精製した。生成物を含有するフラクションを蒸発させ、残留物をメタノールに溶解し、ジエチルエーテル中２.０Ｍ ＨＣｌで処理した。１０分後、溶媒を真空除去し、残留物を凍結乾燥させて、白色固体として塩酸塩２０を得た。
実施例１１： Ａａ＝Ｌ−Ｄａｂ
Figure 0004990153
 ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１２.６５分（ｍ／ｚ＝９７４.８ [Ｍ＋Ｈ]+（１００％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ55Ｈ108Ｎ9Ｏ5）９７４.８４７３、測定値９７４.８４７３ [Ｍ＋Ｈ]+。
実施例１２： Ａａ＝Ｌ−Ｌｙｓ
Figure 0004990153
 ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１２.４７分（ｍ／ｚ＝１０３０.９ [Ｍ＋Ｈ]+（１００％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ59Ｈ116Ｎ9Ｏ5）１０３０.９０９９、測定値１０３０.９１０８ [Ｍ＋Ｈ]+。
実施例１３： Ａａ＝Ｌ−Ｓｅｒ−L−Ｌｙｓ
Figure 0004990153
 ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１２.４６分（ｍ／ｚ＝６０３.０［Ｍ＋２Ｈ]2+（１００％）、１２０５.０ [Ｍ＋Ｈ]+（８５％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ65Ｈ126Ｎ11Ｏ9）１２０４.９７４０、測定値１２０４.９７５５ [Ｍ＋Ｈ]+。
Ｎ1,Ｎ8−ジオレイル−Ｎ4−[（９）−Ａａ]−スペルミジン（２０）の一般的な製造方法
室温にて、Ｎ末端保護アミノ酸（(Ａａ)x(ＰＧ)y；２.２当量）、１−(３−ジメチルアミノプロピル)−３−エチルカルボジイミド・塩酸塩（２.２当量）およびジイソプロピルエチルアミン（６.０当量）のＣＨ2Ｃｌ2（約２０ｍＭ）中撹拌溶液に実施例１０のアミン・塩酸塩（Ａａ＝９）（１.０当量）を添加した。１８時間後、反応混合物を真空濃縮し、残留物をＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、水、５％Ｋ2ＣＯ3水溶液およびブラインで連続的に洗浄した。有機相を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、真空濃縮して油状物を得、これを、０.２％トリエチルアミンを含有するＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ3［９７：３］の混合物で溶離するカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）により精製して、無色ガム状物として中間体カルバメート１９を得た。該ガム状物をＥｔＯＡｃ中５Ｎ ＨＣｌ（５ｍＭ）に溶解し、得られた溶液を室温で２時間撹拌した。沈殿した固体を濾過により回収し、無水ジエチルエーテルで洗浄し、真空乾燥させて、白色粉末として塩酸塩２０を得た。
実施例１４： Ａａ＝Ｌ−Ｄａｐ
Figure 0004990153
 ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１２.６５分（ｍ／ｚ＝１０１７.９ [Ｍ＋Ｈ]+（１００％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ57Ｈ113Ｎ10Ｏ5）１０１７.８８９５、測定値１０１７.８９１５ [Ｍ＋Ｈ]+。
実施例１５： Ａａ＝Ｌ−Ｄａｂ
Figure 0004990153
 ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１２.０４分（ｍ／ｚ＝１０４５.９ [Ｍ＋Ｈ]+（１００％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ59Ｈ117Ｎ10Ｏ5）１０４５.９２０８、測定値１０４５.９２２９ [Ｍ＋Ｈ]+。
実施例１６： Ａａ＝Ｌ−Ｌｙｓ
Figure 0004990153
 ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１１.８１分（ｍ／ｚ＝１１０１.９ [Ｍ＋Ｈ]+（８０％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ63Ｈ125Ｎ10Ｏ5）１１０１.９８３４、測定値１１０１.９８１８ [Ｍ＋Ｈ]+。
実施例１７： Ａａ＝Ｄ−Ｌｙｓ
Figure 0004990153
 ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１１.９４分（ｍ／ｚ＝１１０１.９ [Ｍ＋Ｈ]+（８０％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ63Ｈ125Ｎ10Ｏ5）１１０１.９８３４、測定値１１０１.９８３５ [Ｍ＋Ｈ]+。
実施例１８： Ａａ＝Ｌ−Ｓｅｒ
Figure 0004990153
 ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１３.２５分（ｍ／ｚ＝１０１９.８ [Ｍ＋Ｈ]+（１００％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ57Ｈ111Ｎ8Ｏ7）１０１９.８５７６、測定値１０１９.８５６０ [Ｍ＋Ｈ]+。
実施例１９： Ａａ＝Ｌ−Ｓｅｒ−L−Ｌｙｓ
Figure 0004990153
 ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１１.９１分（ｍ／ｚ＝１２７６.０ [Ｍ＋Ｈ]+（１００％）、ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ69Ｈ135Ｎ12Ｏ9）１２７６.０４７５、測定値１２７６.０４４７ [Ｍ＋Ｈ]+。
実施例２０： Ａａ＝（９）
Figure 0004990153
 ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１１.６６分（ｍ／ｚ＝１１８８.０ [Ｍ＋Ｈ]+（１００％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ67Ｈ135Ｎ12Ｏ5）１１８８.０６７８、測定値１１８８.０６８６ [Ｍ＋Ｈ]+。
実施例２１ スペルミジン系界面活性剤化合物を使用する、ＧＦＰを発現する組換えプラスミドの細胞へのトランスフェクション
付着細胞系ＣＨＯ−Ｋ１、Ｃａｃｏ−２細胞、ＨｅｐＧ２細胞およびＩｓｈｉｋａｗａ細胞を使用してトランスフェクション試験を行った。完全培地は、１０％ｖ／ｖのウシ胎仔血清および１×Ｌ−グルタミンを補充した、Ｆ１２（ＣＨＯ−Ｋ１について）、ＥＭＥＭ（Ｃａｃｏ−２について）およびＤＭＥＭ（ＨｅｐＧ２、Ｉｓｈｉｋａｗａについて）からなっていた。全ての培地および補充物は、Life Technologiesから入手した。
インビトロ遺伝子トランスフェクション
トランスフェクションの１６〜１８時間前に細胞を組織培養処理済み９６ウェルプレート（Costar）中に約２×１０4細胞／ウェルの密度で播種した。Ｏｐｔｉｍｅｍ中にて０.０２５μｇ／μｌのプラスミド溶液を調製した。使用したプラスミドは、Clontechから入手したｐＣＭＶ−ｅＧＦＰであった。最終反応混合物中の最終濃度が２０、１０、５および２.５μｇ／ｍｌとなるように該スペルミジン界面活性剤化合物を１０倍濃縮物としてＯｐｔｉｍｅｍに溶解した。ウェルごとにスペルミジン界面活性剤化合物１０μｌをプラスミド１０μｌと混合した。該複合体を室温で１０分間インキュベートした。プレート中の細胞から培地を除去し、それらをＰＢＳ １００μｌで１回洗浄した。該複合体（２０μｌ）を各ウェルに加え、次いで、Ｏｐｔｉｍｅｍ（無血清）または増殖培地（血清）８０μｌを加えて、最終容量を１００μｌにした。無血清プロトコールでは、次に、該プレートを３７℃で６時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、各ウェルに新鮮な完全培地を加え、さらに１８時間インキュベーションを続けた。血清プロトコールでは、該プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。
製造者（Roche Diagnostics）のガイドラインに従ってレポーター遺伝子アッセイを行った。該プレートから培地を除去し、細胞をＰＢＳ １００μｌで１回洗浄した。次いで、各ウェルにレポーター溶解バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.５、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０５％トリトン×１００、２ｍＭ ＤＴＴ）１００μｌを加えた。次いで、該プレートを−８０℃で１５分間放置し、その後、室温で解凍した。次いで、励起波長４８５ｎｍおよび発光波長５２０ｎｍを用いて標準的なプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ、Tecan）を使用して蛍光を測定した。
図７は、実施例５、３、８、７および１０の化合物を用いてトランスフェクトされたＣａｃｏ−２細胞におけるＧＦＰの発現を示す。
図８は、実施例５、３、８、７および１８の化合物を用いてトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞におけるＧＦＰの発現を示す。
図９は、実施例５、３、８、７、１４、１８および１０の化合物を用いてトランスフェクトされたＩｓｈｉｋａｗａ細胞におけるＧＦＰの発現を示す。
図１０は、実施例５、３、７および１８の化合物を用いてトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＧＦＰの発現を示す。
実施例２２ スペルミジン系界面活性剤化合物を使用するｓｉＲＮＡの細胞へのトランスフェクション
付着細胞系ＩｓｈｉｋａｗａおよびＭＣＦ７を使用してノックダウン試験を行った。完全培地は、１０％ｖ／ｖのウシ胎仔血清および１×Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ培地からなっていた。全ての培地および補充物は、Life Technologiesから入手した。
インビトロｓｉＲＮＡトランスフェクション
トランスフェクションの１６〜１８時間前に細胞を組織培養処理済み９６ウェルプレート（Costar）中に約２×１０4細胞／ウェルの密度で播種した。Ｏｐｔｉｍｅｍ中にてDharmaconから購入したｓｉＲＮＡ（ターゲティングＪＮＫ１または非ターゲティング対照）の１μＭ溶液を調製した。最終反応混合物中の最終濃度が５μｇ／ｍｌとなるようにジェミニ脂質を１０倍濃縮物としてＯｐｔｉｍｅｍに溶解した。市販の試薬リポフェクタミン２０００を最終濃度２.５μｇ／ｍｌで使用し、ｓｉＬｅｎｔＦｅｃｔを１μｇ／ｍｌで使用し、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧｅｎｅを０.５μｌ／ウェルで使用した。ウェルごとにジェミニ脂質（市販）の１０μｌ試料をｓｉＲＮＡ １０μｌと混合した。該複合体を室温で１０分間インキュベートした。プレート中の細胞から培地を除去し、それらをＰＢＳ １００μｌで１回洗浄した。該複合体（２０μｌ）を各ウェルに添加し、次いで、増殖培地８０μｌを添加して最終容量を１００μｌにし、該プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。この時点で、ＰＢＳ １００μｌを使用して細胞を１回洗浄し、次いで、ＲＮＡ溶解バッファー（Promega）１００μｌに溶解させた。標準的な定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Taqman）を行って、ＪＮＫ１ ｓｉＲＮＡ標識細胞および非標的細胞の両方においてハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨと比べたＪＮＫ１の相対的な存在量を測定した。ノックダウンの程度は、ＪＮＫ１の処理（ＪＮＫ１）コピー対ＪＮＫ１の対照（非標的）コピーの比率として表した。
図１１は、実施例１０、５および３の化合物を用いてトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞におけるＪＮＫ１のノックダウンを示す。
図１２は、実施例１０、５および３の化合物を用いてトランスフェクトされたＩｓｈｉｋａｗａ細胞におけるＪＮＫ１のノックダウンを示す。
本明細書にて引用した特許および特許出願を包含するがこれらに限定されない全ての刊行物は、個々の刊行物が十分に記載されているのと同様に参照することにより本明細書の一部を構成することを具体的かつ個別に明示されているのと同様に参照することにより本明細書の一部を構成する。
図１は、本発明の分子の合成において有用な保護（Ａａ）基６の合成のための一般的なスキームを示す。 図２は、本発明の分子の合成において有用な保護（Ａａ）基９の合成のための一般的なスキームを示す。 図３は、本発明の分子の合成において有用な進んだ中間体１４の合成のための一般的なスキームを示す。 図４は、本発明の一の一般的な実施態様による分子の合成のための一般的なスキームを示す。 図５は、本発明のさらなる一般的な実施態様による分子の合成のための一般的なスキームを示す。 図６は、本発明のさらなる一般的な実施態様による分子の合成のための一般的なスキームを示す。 図７は、実施例５、３、８、７および１０の化合物を用いてトランスフェクトされたＣａｃｏ−２細胞におけるＧＦＰの発現を示す。実施例の化合物の濃度は、ｕｇ／ｍｌで示される。ＬＰ２Ｋは、リポフェクタミン２０００TMを示す。 図８は、実施例５、３、８、７および１８の化合物を用いてトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞におけるＧＦＰの発現を示す。実施例の化合物の濃度は、ｕｇ／ｍｌで示される。ＬＰ２Ｋは、リポフェクタミン２０００TMを示す。 図９は、実施例５、３、８、７、１４、１８および１０の化合物を用いてトランスフェクトされたＩｓｈｉｋａｗａ細胞におけるＧＦＰの発現を示す。実施例の化合物の濃度は、ｕｇ／ｍｌで示される。ＬＰ２Ｋは、リポフェクタミン２０００TMを示す。 図１０は、実施例５、３、７および１８の化合物を用いてトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＧＦＰの発現を示す。実施例の化合物の濃度は、ｕｇ／ｍｌで示される。ＬＰ２Ｋは、リポフェクタミン２０００TMを示す。 図１１は、実施例１０、５および３の化合物を用いてトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞におけるＪＮＫ１のノックダウンを示す。Ｌ２Ｋは、リポフェクタミン２０００TMを示す。 図１２は、実施例１０、５および３の化合物を用いてトランスフェクトされたＩｓｈｉｋａｗａ細胞におけるＪＮＫ１のノックダウンを示す。Ｌ２Ｋは、リポフェクタミン２０００TMを示す。

Claims (24)

  1. 式（Ｉ）：
    Figure 0004990153
    ［式中、Ｙは、(Ａａ)xまたは式（ＩＩ）：
    Figure 0004990153
    で示される基のいずれかであり；
    Ｒ1およびＲ2は、同一であっても異なっていてもよく、炭素原子２４個までの飽和または不飽和の直鎖または分枝状炭化水素鎖であり；
    ｍは、１〜１０であり；
    ｎは、１〜１０であり；
    (Ａａ)xは、各場合において同一であっても異なっていてもよく、[Ｈ 2 Ｎ(ＣＨ 2 ) 3 ] 2 Ｎ(ＣＨ 2 )ＣＯ 2 Ｈ、(Ｈ 2 ＮＣＨ 2 ) 2 ＣＨＣＯ 2 Ｈ、またはＳｅｒ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＤａｂまたはＤａｐのＬまたはＤエナンチオマーから選択される直鎖または分枝状にアミド結合を形成するように結合したｘ個のアミノ酸であり；
    ｘは、各場合において同一であっても異なっていてもよく、１〜６であり；
    ｐは、０〜６であり；
    ｑは、１〜６であり；
    ｒは、１〜６であり；
    ｓは、１〜６であり；
    ｚは、０または１であり；
    Ｘは、Ｎ、ＣＨまたはＣである；ただし、ＸがＮである場合にはｚは０または１であり；ＸがＣＨである場合にはｚは０であり；ＸがＣである場合にはｚは１である］
    で示される一般構造を有する化合物またはその医薬上許容される塩。
  2. ｍが３〜６である、請求項１記載の化合物またはその医薬上許容される塩。
  3. ｎが３〜６である、請求項１または２記載の化合物またはその医薬上許容される塩。
  4. ｘが１である、請求項１〜３いずれか１項記載の化合物またはその医薬上許容される塩。
  5. Ｙが(Ａａ)xである、請求項１〜４いずれか１項記載の化合物またはその医薬上許容される塩。
  6. Ｙが式（ＩＩ）：
    Figure 0004990153
    ［ここで、
    ｘは、各場合において同一であっても異なっていてもよく、１〜６であり；
    ｐは、０〜６であり；
    ｑは、１〜６であり；
    ｒは、１〜６であり；
    ｓは、１〜６であり；
    ｚは、０または１であり；
    Ｘは、Ｎ、ＣＨまたはＣである；ただし、ＸがＮである場合にはｚは０または１であり；ＸがＣＨである場合にはｚは０であり；ＸがＣである場合にはｚは１である］
    で示される基である、請求項１〜４いずれか１項記載の化合物またはその医薬上許容される塩。
  7. ｐが１である、請求項６記載の化合物またはその医薬上許容される塩。
  8. ｒが１または３である、請求項６または７記載の化合物またはその医薬上許容される塩。
  9. ｓが１または３である、請求項６〜８いずれか１項記載の化合物またはその医薬上許容される塩。
  10. ｑが１または３である、請求項６〜９いずれか１項記載の化合物またはその医薬上許容される塩。
  11. Ｒ 1 またはＲ 2 が炭素原子１２〜２４個の飽和または不飽和の直鎖または分枝状炭化水素鎖である、請求項１〜１０いずれか１項記載の化合物またはその医薬上許容される塩。
  12. Ｒ 1 またはＲ2が
    −(ＣＨ2)10ＣＨ3、
    −(ＣＨ2)12ＣＨ3、
    −(ＣＨ2)14ＣＨ3、
    −(ＣＨ2)16ＣＨ3、
    −(ＣＨ2)18ＣＨ3、
    −(ＣＨ2)20ＣＨ3、
    −(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)5ＣＨ3天然混合物、
    −(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)7ＣＨ3天然混合物、
    −(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)5ＣＨ3シス、
    −(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)7ＣＨ3シス、
    −(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)5ＣＨ3トランス、
    −(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)7ＣＨ3トランス、
    −(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)4ＣＨ3、
    −(ＣＨ2)7(ＣＨ＝ＣＨＣＨ2)3ＣＨ3、
    −(ＣＨ2)3ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ)3(ＣＨ2)4ＣＨ3、
    −(ＣＨ2)7ＣＨＣＨ(ＣＨ2)7ＣＨ3、
    −ＣＨ2ＣＨ(ＣＨ3)[ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ(ＣＨ3)]3ＣＨ3、または
    −(ＣＨ2)22ＣＨ3
    から選択される、請求項１〜１０いずれか１項記載の化合物またはその医薬上許容される塩。
  13. 式：
    Figure 0004990153
    で示される化合物。
  14. 式：
    Figure 0004990153
    で示される化合物。
  15. 式：
    Figure 0004990153
    で示される化合物。
  16. 式：
    Figure 0004990153
    で示される化合物。
  17. インビボまたはインビトロでのＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそのアナログの真核細胞または原核細胞へのトランスフェクションを可能にするための剤であって、請求項１〜１２いずれか１項で定義した化合物もしくはその医薬上許容される塩または請求項１３〜１６いずれか１項で定義した化合物を含む、剤。
  18. 請求項１７記載の剤であって、該化合物が、
    （ｉ）中性担体；または
    （ｉｉ）錯化剤
    からなる群から選択される１つまたはそれ以上の補充物と合わせて用いられる、剤。
  19. 中性担体がジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項１８記載の剤。
  20. 錯化剤が主に塩基性アミノ酸を含むペプチドである、請求項１８または１９記載の剤。
  21. 錯化剤が塩基性アミノ酸からなるペプチドである、請求項１８または１９記載の剤。
  22. 塩基性アミノ酸がリジンおよびアルギニンから選択される、請求項２０または２１記載の剤。
  23. ペプチドがポリリジンまたはポリオルニチンである、請求項２１記載の剤。
  24. 培養細胞のお互いの接着または固体もしくは半固体表面への接着を容易にするための剤であって、請求項１〜１２いずれか１項で定義した化合物もしくはその医薬上許容される塩または請求項１３〜１６いずれか１項で定義した化合物を含む、剤。
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