JP2001524535A - 治療剤 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
α−ラクトアルブミンのオリゴマー型（ＭＡＬ）およびＭＡＬに対して感受性の細胞の核質に輸送されるようにＭＡＬと組み合わせられた別の試薬からなる蛋白複合体からなる薬剤。この種の薬剤は別の試薬が治療または標識用の試薬である場合に、特に癌の診断および治療において使用できる。
Description
【０００１】 本発明は癌の治療のような悪性疾患の診断および治療において有用な薬剤、そ
の製造方法、および、それを含有する医薬組成物に関する。 アポトーシス細胞死は細胞質の損失、染色質の辺縁化を伴う核の変化、および
アポトーシス体の形成という特徴を有する（L. M. Schwartz等、Immunol．Today
1993，14：582-590，D．J．McConkey等、Mol．Aspects Med.（1996）17：1-115
， J．F．Kerr等、Cancer (1994）73：2013-26）。細胞の生存性の低下には、初
期には高分子量（ＨＭＷ）のＤＮＡ断片（５０〜３００kbp）が形成され、その 後約２００bpのオリゴマーよりなるオリゴヌクレオソーム長のＤＮＡ断片が生じ
るという段階的に進行するＤＮＡの断片化が伴う。（M．J．Arends等、Am．J．P
athol．(1990）136：593-608，B．Zhivotovosky等、FEBS Lett．(1994）352；15
0-4）。ＤＮＡの断片化に先立って細胞質プロテアーゼおよびＣａ2+−依存性シ グナル化経路が活性化され、これは核の変化の前提条件とみなされている（B．Z
hivotovsky等、Exp．Cell Res．（1995）221：404-412m S. Kumar等、TIBS，(1
995）20：198-202）。Ｆａｓ−リガンドおよびＴＮＦのようなアゴニストはまず
細胞表面の受容体に結合し、その後細胞質と核の変化をもたらす経膜シグナル化
事象を活性化させる（L．G．Zheng等、Nature（1995）377：348-351，W．P．Dec
lercq等、Cytokine（1995，7：701-9．T．S．Griffith，Science，(1995）270：
1189-1192）。エンドヌクレアーゼ活性化およびＤＮＡ断片化には細胞質からの シグナルが核に到達することが必要である。アポトーシス細胞における核取りこ
みおよび核膜を超えるシグナル化の機序は殆ど解明されていない。
の製造方法、および、それを含有する医薬組成物に関する。 アポトーシス細胞死は細胞質の損失、染色質の辺縁化を伴う核の変化、および
アポトーシス体の形成という特徴を有する（L. M. Schwartz等、Immunol．Today
1993，14：582-590，D．J．McConkey等、Mol．Aspects Med.（1996）17：1-115
， J．F．Kerr等、Cancer (1994）73：2013-26）。細胞の生存性の低下には、初
期には高分子量（ＨＭＷ）のＤＮＡ断片（５０〜３００kbp）が形成され、その 後約２００bpのオリゴマーよりなるオリゴヌクレオソーム長のＤＮＡ断片が生じ
るという段階的に進行するＤＮＡの断片化が伴う。（M．J．Arends等、Am．J．P
athol．(1990）136：593-608，B．Zhivotovosky等、FEBS Lett．(1994）352；15
0-4）。ＤＮＡの断片化に先立って細胞質プロテアーゼおよびＣａ2+−依存性シ グナル化経路が活性化され、これは核の変化の前提条件とみなされている（B．Z
hivotovsky等、Exp．Cell Res．（1995）221：404-412m S. Kumar等、TIBS，(1
995）20：198-202）。Ｆａｓ−リガンドおよびＴＮＦのようなアゴニストはまず
細胞表面の受容体に結合し、その後細胞質と核の変化をもたらす経膜シグナル化
事象を活性化させる（L．G．Zheng等、Nature（1995）377：348-351，W．P．Dec
lercq等、Cytokine（1995，7：701-9．T．S．Griffith，Science，(1995）270：
1189-1192）。エンドヌクレアーゼ活性化およびＤＮＡ断片化には細胞質からの シグナルが核に到達することが必要である。アポトーシス細胞における核取りこ
みおよび核膜を超えるシグナル化の機序は殆ど解明されていない。
【０００２】 細胞質から核内への大分子の輸送は高度に調節されている。核孔複合体（Nucl
ear pore complex(ＮＰＣ)）は細胞質と核質との間の大分子の交換の部位である
（D．A．Jans等、Pysiol．Rev（1996）76：651-685，D．Gorlich等、Science（1
996）271：1513-1518およびY．Yoneda，J．Biochem．(1997）121：811-817)。Ｎ
ＰＣは３０kDaより小さい分子の受動的拡散を可能にするが、卵アルブミンのよ うなより大きい蛋白は遅延され、ウシ血清アルブミン（６６kDa）は核質に侵入 しない。核への大型の分子または複合体の侵入には能動輸送が必要であり、一般
的には担体に媒介されている。担体に対する特異性は、核への侵入能力を有する
蛋白の特徴であるいわゆる核標的設定または核局在化配列（ＮＬＳ）により決定
される。例えば、グルココルチコイドをその受容体に結合することによりＨＳＰ
９０が遊離し、これが未使用の受容体に結合し、グルココルチコイド受容体配列
のＮＬＳを露出させ、これによりグルココルチコイドリガンド−受容体複合体が
核に輸送される（J．Yang等、Mol．Cell．Biol．(1994）14：5088-98 issn 0270
-7306）。
ear pore complex(ＮＰＣ)）は細胞質と核質との間の大分子の交換の部位である
（D．A．Jans等、Pysiol．Rev（1996）76：651-685，D．Gorlich等、Science（1
996）271：1513-1518およびY．Yoneda，J．Biochem．(1997）121：811-817)。Ｎ
ＰＣは３０kDaより小さい分子の受動的拡散を可能にするが、卵アルブミンのよ うなより大きい蛋白は遅延され、ウシ血清アルブミン（６６kDa）は核質に侵入 しない。核への大型の分子または複合体の侵入には能動輸送が必要であり、一般
的には担体に媒介されている。担体に対する特異性は、核への侵入能力を有する
蛋白の特徴であるいわゆる核標的設定または核局在化配列（ＮＬＳ）により決定
される。例えば、グルココルチコイドをその受容体に結合することによりＨＳＰ
９０が遊離し、これが未使用の受容体に結合し、グルココルチコイド受容体配列
のＮＬＳを露出させ、これによりグルココルチコイドリガンド−受容体複合体が
核に輸送される（J．Yang等、Mol．Cell．Biol．(1994）14：5088-98 issn 0270
-7306）。
【０００３】 腫瘍細胞および未成熟細胞におけるアポトーシスを誘発するが他の細胞は温存
する乳汁由来の蛋白複合体が報告されている（Proc．Natl．Acad．Sci., USA，9
2，p8064-8068）。活性画分がまずイオン交換クロマトグラフィーによりヒトカ ゼインより単離され、これはＮ末端アミノ酸配列決定と質量スペクトルによりα
−ラクトアルブミンのオリゴマー型（多量体型（multimeric form）即ち「ＭＡ Ｌ」と記載される）を含有することがわかった。単量体のα−ラクトアルブミン
はヒト乳清中の主要蛋白成分であり、約２mg／mlの濃度で存在する（W．E．Hein
e等、J．Nutr．(1991）121：277-83）が、ヒト乳清から単離された単量体のα−
ラクトアルブミンはアポトーシスを誘発していない。別の分析によれば、アポト
ーシス誘発画分は乳清中に存在する単量体α−ラクトアルブミンとは異なる構造
特性を有するα−ラクトアルブミンのオリゴマー型を含有する。アポトーシス誘
発画分を以後ＭＡＬと記載する。オリゴマーがアポトーシスを誘発する機序は、
アポトーシスに細胞外カルシウムが必要であることから、ＭＡＬのＣａ2+結合特
性に関係すると考えられる。 ＭＡＬはウシ、ヒツジまたはヤギの乳汁またはヒト乳清のようなα−ラクトア
ルブミンの他の原料から単離できる。
する乳汁由来の蛋白複合体が報告されている（Proc．Natl．Acad．Sci., USA，9
2，p8064-8068）。活性画分がまずイオン交換クロマトグラフィーによりヒトカ ゼインより単離され、これはＮ末端アミノ酸配列決定と質量スペクトルによりα
−ラクトアルブミンのオリゴマー型（多量体型（multimeric form）即ち「ＭＡ Ｌ」と記載される）を含有することがわかった。単量体のα−ラクトアルブミン
はヒト乳清中の主要蛋白成分であり、約２mg／mlの濃度で存在する（W．E．Hein
e等、J．Nutr．(1991）121：277-83）が、ヒト乳清から単離された単量体のα−
ラクトアルブミンはアポトーシスを誘発していない。別の分析によれば、アポト
ーシス誘発画分は乳清中に存在する単量体α−ラクトアルブミンとは異なる構造
特性を有するα−ラクトアルブミンのオリゴマー型を含有する。アポトーシス誘
発画分を以後ＭＡＬと記載する。オリゴマーがアポトーシスを誘発する機序は、
アポトーシスに細胞外カルシウムが必要であることから、ＭＡＬのＣａ2+結合特
性に関係すると考えられる。 ＭＡＬはウシ、ヒツジまたはヤギの乳汁またはヒト乳清のようなα−ラクトア
ルブミンの他の原料から単離できる。
【０００４】 今般ＭＡＬは感受性細胞（即ち腫瘍細胞）に取りこまれ細胞核内に蓄積するこ
とがわかった。核によるこの高い取りこみとそのオリゴマー蛋白構造との組み合
わせはＭＡＬが他の部分、例えば、細胞毒、または、腫瘍細胞殺傷においてＭＡ
Ｌの作用を補助する作用を有する化学療法剤、または、腫瘍細胞の発見を可能に
する染料または放射標識または他の標識のような診断試薬のための有用な担体を
与えることを意味し、それと同時に、ＭＡＬがこれらの細胞に対して殺傷作用を
発揮することを可能にするのである。
とがわかった。核によるこの高い取りこみとそのオリゴマー蛋白構造との組み合
わせはＭＡＬが他の部分、例えば、細胞毒、または、腫瘍細胞殺傷においてＭＡ
Ｌの作用を補助する作用を有する化学療法剤、または、腫瘍細胞の発見を可能に
する染料または放射標識または他の標識のような診断試薬のための有用な担体を
与えることを意味し、それと同時に、ＭＡＬがこれらの細胞に対して殺傷作用を
発揮することを可能にするのである。
【０００５】 本発明はα−ラクトアルブミンのオリゴマー型（ＭＡＬ）およびＭＡＬに対し
て感受性である細胞の核質に運搬されるようにＭＡＬと組み合わせられた別の試
薬を有する蛋白複合体を含有する薬剤を提供する。
て感受性である細胞の核質に運搬されるようにＭＡＬと組み合わせられた別の試
薬を有する蛋白複合体を含有する薬剤を提供する。
【０００６】 上記別の試薬はコンジュゲート形成により、または、共有結合により、例えば
当該分野で知られるとおり連結やスペーサー基によるなどして結合させてよい。
酵素反応により結合を媒介または促進してよい。 組み換え体形成法によりＭＡＬが上記別の試薬との融合蛋白の形態で生成され
る可能性も有る。
当該分野で知られるとおり連結やスペーサー基によるなどして結合させてよい。
酵素反応により結合を媒介または促進してよい。 組み換え体形成法によりＭＡＬが上記別の試薬との融合蛋白の形態で生成され
る可能性も有る。
【０００７】 上記別の試薬の例には、癌の治療のために用いられる知られた化学療法試薬の
ような細胞毒、ジフテリア毒素のような微生物毒素およびモノクローナル抗体が
包含される。あるいは、上記別の試薬はビオチンまたは125Ｉのような放射標識 のような標識剤を含有する。例えば、標識基を酵素反応により、または、蛋白内
部に標識ビルディングストーン（例えば14Ｃ、35Ｓのような放射性同位体）を有
することにより蛋白内に導入することができる。125Ｉ−標識はラクトペルオキ シダーゼの補助により蛋白に125Ｉを結合させることにより、酵素的に行うこと ができる。蛋白のビオチニル化は蛋白の遊離アミノ基への安定なアミド結合を形
成することにより蛋白にＤ−ビオチニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステルを反応させることにより行う。 蛋白は組み換えにより生成する蛋白の生成中に放射性アミノ酸を添加すること
により標識してもよい。
ような細胞毒、ジフテリア毒素のような微生物毒素およびモノクローナル抗体が
包含される。あるいは、上記別の試薬はビオチンまたは125Ｉのような放射標識 のような標識剤を含有する。例えば、標識基を酵素反応により、または、蛋白内
部に標識ビルディングストーン（例えば14Ｃ、35Ｓのような放射性同位体）を有
することにより蛋白内に導入することができる。125Ｉ−標識はラクトペルオキ シダーゼの補助により蛋白に125Ｉを結合させることにより、酵素的に行うこと ができる。蛋白のビオチニル化は蛋白の遊離アミノ基への安定なアミド結合を形
成することにより蛋白にＤ−ビオチニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステルを反応させることにより行う。 蛋白は組み換えにより生成する蛋白の生成中に放射性アミノ酸を添加すること
により標識してもよい。
【０００８】 上記別の試薬の性質に応じて、本発明の複合体は癌の診断および/または治療 において使用することができる。この目的のためには複合体を医薬組成物として
適宜製剤するが、これらも本発明の別の特徴を構成する。 複合体は経口粘膜投与単位、注射用組成物または局所用組成物の形態で投与す
ることができる。何れの場合においても、蛋白は通常は製薬上許容しうる一般的
に知られた担体、充填剤および／または賦形剤とともに投与する。 蛋白を局所用の溶液またはクリームの形態で投与する場合は、溶液は希釈剤ま
たはクリーム基剤とともに蛋白複合体のための乳化剤を含有する。このような製
剤は直接腫瘍に適用するか、または、ミストの形態で上気道中に吸入することが
できる。
適宜製剤するが、これらも本発明の別の特徴を構成する。 複合体は経口粘膜投与単位、注射用組成物または局所用組成物の形態で投与す
ることができる。何れの場合においても、蛋白は通常は製薬上許容しうる一般的
に知られた担体、充填剤および／または賦形剤とともに投与する。 蛋白を局所用の溶液またはクリームの形態で投与する場合は、溶液は希釈剤ま
たはクリーム基剤とともに蛋白複合体のための乳化剤を含有する。このような製
剤は直接腫瘍に適用するか、または、ミストの形態で上気道中に吸入することが
できる。
【０００９】 経口用には、蛋白は通常は固体、半固体または液体の希釈剤またはカプセルで
あってよい担体と共に投与する。通常は活性化合物の量は製剤の０.１〜９９重 量％、注射用には好ましくは製剤の０.５〜２０重量％、そして、経口投与用の 製剤では２〜５０重量％である。
あってよい担体と共に投与する。通常は活性化合物の量は製剤の０.１〜９９重 量％、注射用には好ましくは製剤の０.５〜２０重量％、そして、経口投与用の 製剤では２〜５０重量％である。
【００１０】 経口投与用の投与単位の形態で複合体を含有する医薬組成物においては、化合
物は固体、粉末化担体、例えば乳糖、サッカロース、ソルビトール、マンニトー
ル、澱粉、例えばバレイショ澱粉、コーンスターチ、アミロペクチン、セルロー
ス誘導体またはゼラチン、並びに抗摩擦剤、例えばステアリン酸マグネシウム、
ステアリン酸カルシウム、ポリエチレングリコールワックス等と混合し、圧縮し
て錠剤とする。多単位用量顆粒も同様に調製できる。上記コアの錠剤および顆粒
を砂糖等の濃厚溶液でコーティングすることができる。コアはまた約５.５より 高いpKaを有するアニオン系重合体のような、胃腸管内における溶解速度を変え る重合体でコーティングすることもできる。このような重合体はヒドロキシプロ
ピルメチルセルロースフタレート、セルロースアセテートフタレート、および、
商標名Eudragit S 100およびL 100で販売されている重合体である。
物は固体、粉末化担体、例えば乳糖、サッカロース、ソルビトール、マンニトー
ル、澱粉、例えばバレイショ澱粉、コーンスターチ、アミロペクチン、セルロー
ス誘導体またはゼラチン、並びに抗摩擦剤、例えばステアリン酸マグネシウム、
ステアリン酸カルシウム、ポリエチレングリコールワックス等と混合し、圧縮し
て錠剤とする。多単位用量顆粒も同様に調製できる。上記コアの錠剤および顆粒
を砂糖等の濃厚溶液でコーティングすることができる。コアはまた約５.５より 高いpKaを有するアニオン系重合体のような、胃腸管内における溶解速度を変え る重合体でコーティングすることもできる。このような重合体はヒドロキシプロ
ピルメチルセルロースフタレート、セルロースアセテートフタレート、および、
商標名Eudragit S 100およびL 100で販売されている重合体である。
【００１１】 ゼラチンカプセルの調製においては、これらはソフトまたはハードであること
ができる。前者の場合は、活性化合物を油分と混合し、後者の場合は多単位用量
顆粒をその中に充填する。 経口投与用の液体製剤はシロップまたは懸濁液、例えば開示した活性化合物約
０.２〜約２０重量％、および、グリセロールおよびプロピレングリコールを含 有する溶液の形態で存在することができる。所望により、このような製剤は着色
剤、着香料、サッカリンおよび粘稠化剤としてのカルボキシメチルセルロースを
含有することができる。
ができる。前者の場合は、活性化合物を油分と混合し、後者の場合は多単位用量
顆粒をその中に充填する。 経口投与用の液体製剤はシロップまたは懸濁液、例えば開示した活性化合物約
０.２〜約２０重量％、および、グリセロールおよびプロピレングリコールを含 有する溶液の形態で存在することができる。所望により、このような製剤は着色
剤、着香料、サッカリンおよび粘稠化剤としてのカルボキシメチルセルロースを
含有することができる。
【００１２】 活性化合物の一日当たり用量は様々であり、投与経路により異なるが、一般的
規則として、個人用には活性化合物１〜１００mg／用量であり、局所用には２〜
２００mg/用量である。２４時間当たりの投与回数は投与経路により異なるが、 例えば鼻への局所適用の場合は、２４時間当たり３〜８回となる等、治療用途に
おいて治療される身体が生成する粘液の流動により異なってよい。
規則として、個人用には活性化合物１〜１００mg／用量であり、局所用には２〜
２００mg/用量である。２４時間当たりの投与回数は投与経路により異なるが、 例えば鼻への局所適用の場合は、２４時間当たり３〜８回となる等、治療用途に
おいて治療される身体が生成する粘液の流動により異なってよい。
【００１３】 本発明は更に上記した複合体または組成物を癌細胞に投与することを包含する
癌の治療方法を提供する。 本発明の複合体の診断への適用はin vitroおよびin vivoで例えば生検試料に 対して行ってよい。この目的のためには、標識を有する複合体は、in vivoで使 用する場合は医薬組成物、または、in vitroで使用する場合は何れかの処方物の
形態で、疑われる腫瘍に適用してよい。次に腫瘍を観察して複合体が核にまで浸
透しているかどうか調べる。核の可視度は複合体が核に吸収されていることを示
すものであり、ＭＡＬ感受性腫瘍とされる。ＭＡＬの取りこみの程度は様々であ
るが、一般的に癌細胞により取りこまれ、従って、特に本発明の複合体において
別の細胞毒と組み合わせた場合に、これらの細胞を殺傷するために使用してよい
。ＭＡＬの取りこみは白血病細胞のようなリンパ腫細胞において特に高い。肺癌
細胞のような癌細胞においても、後に記載する通り、細胞死をもたらすのに十分
な取りこみが有る。本発明の診断方法を用いて得られる情報はその後の治療方法
を決定する際の助けとなる。
癌の治療方法を提供する。 本発明の複合体の診断への適用はin vitroおよびin vivoで例えば生検試料に 対して行ってよい。この目的のためには、標識を有する複合体は、in vivoで使 用する場合は医薬組成物、または、in vitroで使用する場合は何れかの処方物の
形態で、疑われる腫瘍に適用してよい。次に腫瘍を観察して複合体が核にまで浸
透しているかどうか調べる。核の可視度は複合体が核に吸収されていることを示
すものであり、ＭＡＬ感受性腫瘍とされる。ＭＡＬの取りこみの程度は様々であ
るが、一般的に癌細胞により取りこまれ、従って、特に本発明の複合体において
別の細胞毒と組み合わせた場合に、これらの細胞を殺傷するために使用してよい
。ＭＡＬの取りこみは白血病細胞のようなリンパ腫細胞において特に高い。肺癌
細胞のような癌細胞においても、後に記載する通り、細胞死をもたらすのに十分
な取りこみが有る。本発明の診断方法を用いて得られる情報はその後の治療方法
を決定する際の助けとなる。
【００１４】 ＭＡＬと種々の細胞成分との相互作用はビオチニル化ＭＡＬを用いた共焦点顕
微鏡観察により、そして、125Ｉ−標識ＭＡＬを用いた細胞下分画により、検討 されている。単量体α−ラクトアルブミンおよびヒトＩｇＧを対照として使用し
ている。 ＭＡＬはシトソル、小胞画分またはER−Golgi複合体よりもむしろ細胞核に蓄 積することがわかっている。ＭＡＬの核蓄積はそのアポトーシス誘発作用に対し
て感受性の有る細胞では急速に起こるが、耐性細胞では起こっていない。ＷＧＡ
による核取りこみの抑制によりジギトニン透過性付与細胞がアポトーシスを免れ
たことから、核取りこみは核孔複合体を介して行われ、アポトーシスの誘発に必
須であった。Ｃａ2+はＭＡＬ誘発ＤＮＡ断片化に必要であったが、ＭＡＬの核取
りこみはＣａ2+非依存性であった。
微鏡観察により、そして、125Ｉ−標識ＭＡＬを用いた細胞下分画により、検討 されている。単量体α−ラクトアルブミンおよびヒトＩｇＧを対照として使用し
ている。 ＭＡＬはシトソル、小胞画分またはER−Golgi複合体よりもむしろ細胞核に蓄 積することがわかっている。ＭＡＬの核蓄積はそのアポトーシス誘発作用に対し
て感受性の有る細胞では急速に起こるが、耐性細胞では起こっていない。ＷＧＡ
による核取りこみの抑制によりジギトニン透過性付与細胞がアポトーシスを免れ
たことから、核取りこみは核孔複合体を介して行われ、アポトーシスの誘発に必
須であった。Ｃａ2+はＭＡＬ誘発ＤＮＡ断片化に必要であったが、ＭＡＬの核取
りこみはＣａ2+非依存性であった。
【００１５】 結果は、ＭＡＬは細胞核に標的設定することができ、核標的設定の機序はＭＡ
Ｌ誘発アポトーシスに感受性の有る細胞のほうが耐性細胞よりも容易に達成され
ることを示している。アポトーシスの誘発は少なくとも部分的には核のレベルに
おけるＭＡＬの直接の作用を介して起こると考えられる。
Ｌ誘発アポトーシスに感受性の有る細胞のほうが耐性細胞よりも容易に達成され
ることを示している。アポトーシスの誘発は少なくとも部分的には核のレベルに
おけるＭＡＬの直接の作用を介して起こると考えられる。
【００１６】 アポトーシス誘発における決定的工程と考えられるＭＡＬの細胞表面結合が最
初に検討されている。Ｆａｓ−リガンドまたはＴＮＦのような外因性のアポトー
シス誘発分子はそれらの対応する細胞表面受容体に結合し、経膜シグナル化事象
およびアポトーシスに至る細胞内経路をトリガーする。ＭＡＬは細胞表面に急速
に結合し、高いＭＡＬ濃度で飽和し、標識ＭＡＬが未標識ＭＡＬにより競合的に
排除された競合実験により明らかにされるとおり、特異的であった。共焦点顕微
鏡分析によれば、ＭＡＬはパッチ状態で結合することがわかり、このことは、Ｍ
ＡＬが予め形成された凝集塊として結合したか、または、結合したＭＡＬがキャ
ッピングまたは他の受容体分布に影響する機序を介して膜の特定の領域に蓄積し
たことを示唆している。蛋白の単量体で不活性でオリゴマーの活性型の細胞表面
結合には定量的な差は殆ど無かった。更にまた、感受性細胞および耐性細胞への
細胞表面結合には差は無かった。結果によれば、ＭＡＬは、細胞表面結合それ自
体がアポトーシスをトリガーするものではないという点で、ＴＮＦおよびＦａｓ
−リガンドのようなアゴニストとは異なっている。最近、Sheridan等（Science,
（1997）277：818-821およびPan等（Science（19970277：815-818）は健常細胞 の膜における天然受容体のシグナル化ドメインを欠失した偽受容体を報告してい
る［Pan，1997 ＃640,；Sheridan，1997 ＃639］。TRAIL蛋白は同様の親和性で 細胞表面受容体に結合するが、健常細胞においてアポトーシスシグナルを誘発す
ることはできない。
初に検討されている。Ｆａｓ−リガンドまたはＴＮＦのような外因性のアポトー
シス誘発分子はそれらの対応する細胞表面受容体に結合し、経膜シグナル化事象
およびアポトーシスに至る細胞内経路をトリガーする。ＭＡＬは細胞表面に急速
に結合し、高いＭＡＬ濃度で飽和し、標識ＭＡＬが未標識ＭＡＬにより競合的に
排除された競合実験により明らかにされるとおり、特異的であった。共焦点顕微
鏡分析によれば、ＭＡＬはパッチ状態で結合することがわかり、このことは、Ｍ
ＡＬが予め形成された凝集塊として結合したか、または、結合したＭＡＬがキャ
ッピングまたは他の受容体分布に影響する機序を介して膜の特定の領域に蓄積し
たことを示唆している。蛋白の単量体で不活性でオリゴマーの活性型の細胞表面
結合には定量的な差は殆ど無かった。更にまた、感受性細胞および耐性細胞への
細胞表面結合には差は無かった。結果によれば、ＭＡＬは、細胞表面結合それ自
体がアポトーシスをトリガーするものではないという点で、ＴＮＦおよびＦａｓ
−リガンドのようなアゴニストとは異なっている。最近、Sheridan等（Science,
（1997）277：818-821およびPan等（Science（19970277：815-818）は健常細胞 の膜における天然受容体のシグナル化ドメインを欠失した偽受容体を報告してい
る［Pan，1997 ＃640,；Sheridan，1997 ＃639］。TRAIL蛋白は同様の親和性で 細胞表面受容体に結合するが、健常細胞においてアポトーシスシグナルを誘発す
ることはできない。
【００１７】 ＭＡＬはそのアポトーシス誘発作用に対して感受性のある細胞の核に急速に取
りこまれたことから、これは核標的設定が可能であることが示唆された。この用
語は本明細書では、核コンパートメントへの特定の分子の優先的局在化を記載す
るために用いる。原料、構造および機能において多様な分子が細胞核に到達する
能力を共有しており、細胞質コンパートメントではなくここでその主要な機能を
発揮している。核へのＭＡＬの取りこみはＷＧＡ、即ち、ヌクレオポリンのグリ
コシル化領域に結合し、核孔を通るインポルチン−蛋白複合体の輸送を立体的に
妨害するレクチンを用いた抑制試験で明らかにされたとおり、核孔複合体を介し
て行われた（S．A．Adam等、(1990）J．Cell．Biol．111：807-816）。ＷＧＡ処
理によりジギトニン処理細胞の核へのＭＡＬ取りこみがブロックされ、ＭＡＬ−
誘発ＤＮＡ断片化が抑制された。ＭＡＬの核取りこみの構造的根拠およびその機
序を明らかにする必要がある。従来の核標的設定配列は配列の相同性が僅かであ
るか殆ど無い塩基性アミノ酸のクラスターを含んでいる場合が多い（Jans等、（
1996）前出、J．Garcia-Bustos等、Biochim Biophys．Acta．(1991）1071：83-1
01）。α−ラクトアルブミンの単量体型の配列分析では既知の核標的モチーフの
存在は示されず、単量体は細胞核を標的設定しなかった。従って、恐らくは、Ｍ
ＡＬは核コンパートメント、核膜および／または核孔への親和性を与える構造的
修飾を有していたと考えられる。
りこまれたことから、これは核標的設定が可能であることが示唆された。この用
語は本明細書では、核コンパートメントへの特定の分子の優先的局在化を記載す
るために用いる。原料、構造および機能において多様な分子が細胞核に到達する
能力を共有しており、細胞質コンパートメントではなくここでその主要な機能を
発揮している。核へのＭＡＬの取りこみはＷＧＡ、即ち、ヌクレオポリンのグリ
コシル化領域に結合し、核孔を通るインポルチン−蛋白複合体の輸送を立体的に
妨害するレクチンを用いた抑制試験で明らかにされたとおり、核孔複合体を介し
て行われた（S．A．Adam等、(1990）J．Cell．Biol．111：807-816）。ＷＧＡ処
理によりジギトニン処理細胞の核へのＭＡＬ取りこみがブロックされ、ＭＡＬ−
誘発ＤＮＡ断片化が抑制された。ＭＡＬの核取りこみの構造的根拠およびその機
序を明らかにする必要がある。従来の核標的設定配列は配列の相同性が僅かであ
るか殆ど無い塩基性アミノ酸のクラスターを含んでいる場合が多い（Jans等、（
1996）前出、J．Garcia-Bustos等、Biochim Biophys．Acta．(1991）1071：83-1
01）。α−ラクトアルブミンの単量体型の配列分析では既知の核標的モチーフの
存在は示されず、単量体は細胞核を標的設定しなかった。従って、恐らくは、Ｍ
ＡＬは核コンパートメント、核膜および／または核孔への親和性を与える構造的
修飾を有していたと考えられる。
【００１８】 種々の細胞におけるＭＡＬ−誘発アポトーシスへの感受性はＭＡＬの核蓄積と
比例していた。ＭＡＬは急速に感受性細胞株Ｌ１２１０の核に侵入した。０.３m
g／mlの濃度で、細胞の１０％で１時間後に核の染色が認められ、これは６時間 後には７５％に増加した。ＤＮＡ断片化は６時間のインキュベーション後に初め
て観察された。核取りこみは、中程度の感受性を有するＡ５４９細胞系統ではよ
りゆっくり起こり、ヒト腎細胞では低いか、または起こらなかった。
比例していた。ＭＡＬは急速に感受性細胞株Ｌ１２１０の核に侵入した。０.３m
g／mlの濃度で、細胞の１０％で１時間後に核の染色が認められ、これは６時間 後には７５％に増加した。ＤＮＡ断片化は６時間のインキュベーション後に初め
て観察された。核取りこみは、中程度の感受性を有するＡ５４９細胞系統ではよ
りゆっくり起こり、ヒト腎細胞では低いか、または起こらなかった。
【００１９】 総細胞結合ＭＡＬまたはＭＡＬ細胞質取りこみを細胞間で比較した場合には差
は見とめられなかった。細胞質への取りこみはＬ１２１０、Ａ５４９およびＨＲ
ＴＥＣ細胞で同様の速度過程で起こった。細胞内ＭＡＬの総量はＬ１２１０細胞
で最も高かったが、その殆どは核に存在し、細胞質には存在しなかった。このこ
とは核取りこみが決定的工程であることを示唆している。核レベルでのＭＡＬの
直接作用の別の証拠は単離された核を用いて観察されている。ＭＡＬは全細胞で
必要とされた濃度より低濃度で単離核内でＤＮＡ断片化を誘発した。３種類の細
胞から単離された核は全てＭＡＬの作用に対して感受性を示し、ＤＮＡ断片化の
速度過程は同様であった。（ＨＭＷ−オリゴヌクレオソーム長断片。未損傷の核
と単離核との間の差）。これらの結果は感受性細胞と耐性細胞を分離する決定的
事象は核コンパートメント内に入った後のＭＡＬの作用よりはむしろ細胞質から
核内へのＭＡＬの実際の輸送であることを示唆している。
は見とめられなかった。細胞質への取りこみはＬ１２１０、Ａ５４９およびＨＲ
ＴＥＣ細胞で同様の速度過程で起こった。細胞内ＭＡＬの総量はＬ１２１０細胞
で最も高かったが、その殆どは核に存在し、細胞質には存在しなかった。このこ
とは核取りこみが決定的工程であることを示唆している。核レベルでのＭＡＬの
直接作用の別の証拠は単離された核を用いて観察されている。ＭＡＬは全細胞で
必要とされた濃度より低濃度で単離核内でＤＮＡ断片化を誘発した。３種類の細
胞から単離された核は全てＭＡＬの作用に対して感受性を示し、ＤＮＡ断片化の
速度過程は同様であった。（ＨＭＷ−オリゴヌクレオソーム長断片。未損傷の核
と単離核との間の差）。これらの結果は感受性細胞と耐性細胞を分離する決定的
事象は核コンパートメント内に入った後のＭＡＬの作用よりはむしろ細胞質から
核内へのＭＡＬの実際の輸送であることを示唆している。
【００２０】 ラクトアルブミンは１つの高親和性および１つの低親和性のＣａ2+結合部位を
有するＣａ2+結合蛋白である（J．Ren等、J．Biol．Chem．(1992）268：19292-8
）。ＭＡＬ誘発アポトーシスは細胞外Ｃａ2+を必要とすることが報告されている
（A，Hakansson等、(1995）前出）。本研究において、出願人は細胞外または細 胞内のＣａ2+濃度を変化させる種々の薬剤の核標的設定またはＤＮＡ断片化に対
する作用を検討した。Ｃａ2+−キレート剤で感受性細胞を前処理すると単離核に
おけるＭＡＬ−誘発ＤＮＡ断片化が抑制されることがわかった。しかしながら、
核標的設定の過程には影響が無かった。これらの観察結果は、アポトーシスは２
つの収束的機序、即ち核へのＭＡＬの輸送、および、使用可能なＣａ2+濃度の変
化の結果として起こることを示唆している。 従って、本発明の治療を例えば医薬組成物の使用により適用する場合は細胞を
確実に殺傷できるのに十分なカルシウム濃度となるように留意することが必要で
ある。しかしながら、より高いカルシウム濃度はＭＡＬを不活性化させる場合が
ある。従って、処方物中のカルシウム剤の含有は回避しなければならない。
有するＣａ2+結合蛋白である（J．Ren等、J．Biol．Chem．(1992）268：19292-8
）。ＭＡＬ誘発アポトーシスは細胞外Ｃａ2+を必要とすることが報告されている
（A，Hakansson等、(1995）前出）。本研究において、出願人は細胞外または細 胞内のＣａ2+濃度を変化させる種々の薬剤の核標的設定またはＤＮＡ断片化に対
する作用を検討した。Ｃａ2+−キレート剤で感受性細胞を前処理すると単離核に
おけるＭＡＬ−誘発ＤＮＡ断片化が抑制されることがわかった。しかしながら、
核標的設定の過程には影響が無かった。これらの観察結果は、アポトーシスは２
つの収束的機序、即ち核へのＭＡＬの輸送、および、使用可能なＣａ2+濃度の変
化の結果として起こることを示唆している。 従って、本発明の治療を例えば医薬組成物の使用により適用する場合は細胞を
確実に殺傷できるのに十分なカルシウム濃度となるように留意することが必要で
ある。しかしながら、より高いカルシウム濃度はＭＡＬを不活性化させる場合が
ある。従って、処方物中のカルシウム剤の含有は回避しなければならない。
【００２１】 ＭＡＬはその主要な成分としてα−ラクトアルブミンオリゴマーを含有する。
α−ラクトアルブミン蛋白ファミリーは広範に研究されており分子レベルで特性
化されている。種々の生物種に由来するラクトアルブミンは構造的にはほとんど
差異が無いが、量は例えばウシ乳汁と比較してヒトの場合が多い。α−ラクトア
ルブミンのモノマー型は１４kDaの分子量を有し、ヒト乳汁中で量的に優勢な乳 清蛋白である（W．E．Heine等、(1991）前出）。一方ＭＡＬは乳清からは得られ
ないが、低ｐＨで沈殿させた後のヒト乳汁のカゼイン画分から得られる。活性画
分は高い親和性でイオン交換マトリックスに結合し、高塩度で溶離し、α−ラク
トアルブミンの数種類のオリゴマー型を含有することがわかっている。低いｐＨ
および可変のアニオン条件が単量体のα−ラクトアルブミンの分子構造をいわゆ
る溶融球状に変化させることが報告されており、溶融球体はα−ラクトアルブミ
ンの天然型と完全変性型との間の部分的に開かれた（unfolded）中間体である（
K．Kuwajima., Faseb J.（1996）10：102-109，A．Alexandrescu等、Biochemist
ry（1993）32：1707-1718）。構造研究による予備的結果によれば、ＭＡＬはヒ ト乳清中に存在する状態の単量体α−ラクトアルブミンとは異なる構造的特徴を
有する部分的に再度折り曲げられたオリゴマーを含有することが示唆されている
。
α−ラクトアルブミン蛋白ファミリーは広範に研究されており分子レベルで特性
化されている。種々の生物種に由来するラクトアルブミンは構造的にはほとんど
差異が無いが、量は例えばウシ乳汁と比較してヒトの場合が多い。α−ラクトア
ルブミンのモノマー型は１４kDaの分子量を有し、ヒト乳汁中で量的に優勢な乳 清蛋白である（W．E．Heine等、(1991）前出）。一方ＭＡＬは乳清からは得られ
ないが、低ｐＨで沈殿させた後のヒト乳汁のカゼイン画分から得られる。活性画
分は高い親和性でイオン交換マトリックスに結合し、高塩度で溶離し、α−ラク
トアルブミンの数種類のオリゴマー型を含有することがわかっている。低いｐＨ
および可変のアニオン条件が単量体のα−ラクトアルブミンの分子構造をいわゆ
る溶融球状に変化させることが報告されており、溶融球体はα−ラクトアルブミ
ンの天然型と完全変性型との間の部分的に開かれた（unfolded）中間体である（
K．Kuwajima., Faseb J.（1996）10：102-109，A．Alexandrescu等、Biochemist
ry（1993）32：1707-1718）。構造研究による予備的結果によれば、ＭＡＬはヒ ト乳清中に存在する状態の単量体α−ラクトアルブミンとは異なる構造的特徴を
有する部分的に再度折り曲げられたオリゴマーを含有することが示唆されている
。
【００２２】 さらにまた、ＭＡＬは脂質を含有する場合が多く、特にヒト乳汁由来のＭＡＬ
はリン脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、コレステロール、トリグリセリド
および遊離の脂肪酸を含有する。特にＭＡＬの遊離脂肪酸含有量は生乳中に存在
するよりも高値であると考えられる。アポトーシスにおける、あるいはＭＡＬ構
造の安定化におけるこれらの脂質の役割は十分解明されていない。しかしながら
、ＭＡＬ中にこれらの成分が存在することはその治療作用にとって好ましい。
はリン脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、コレステロール、トリグリセリド
および遊離の脂肪酸を含有する。特にＭＡＬの遊離脂肪酸含有量は生乳中に存在
するよりも高値であると考えられる。アポトーシスにおける、あるいはＭＡＬ構
造の安定化におけるこれらの脂質の役割は十分解明されていない。しかしながら
、ＭＡＬ中にこれらの成分が存在することはその治療作用にとって好ましい。
【００２３】 本研究はＭＡＬと単量体α−ラクトアルブミンとの間のアポトーシス誘発活性
の差を確認しており、その細胞内相互作用の明らかな差を示している。単量体α
−ラクトアルブミンは細胞表面に結合し、細胞質に侵入したが、細胞核内には蓄
積しなかった。蛋白を核内に自由拡散させた場合、ジギトニン透過性付与細胞に
おいても、核レベルではα−ラクトアルブミンの作用は認められなかった。さら
にまた、アポトーシス感受性と耐性の細胞との間には単量体の細胞下分布には差
が無かった。結果によれば、構造的修飾またはＭＡＬ中に存在する別の乳成分が
核標的設定およびアポトーシス誘発に必要であることを示している。
の差を確認しており、その細胞内相互作用の明らかな差を示している。単量体α
−ラクトアルブミンは細胞表面に結合し、細胞質に侵入したが、細胞核内には蓄
積しなかった。蛋白を核内に自由拡散させた場合、ジギトニン透過性付与細胞に
おいても、核レベルではα−ラクトアルブミンの作用は認められなかった。さら
にまた、アポトーシス感受性と耐性の細胞との間には単量体の細胞下分布には差
が無かった。結果によれば、構造的修飾またはＭＡＬ中に存在する別の乳成分が
核標的設定およびアポトーシス誘発に必要であることを示している。
【００２４】 ヒト乳汁は母乳保育乳児に対し粘膜免疫系を与える。乳汁中の分子は粘膜組織
への微生物の結合を防止し、ウイルス粒子を溶解し、細菌の細胞壁を破壊し、そ
して、微生物の生育を防止する（H．McKenzie等、Adv. Protein Chem., (1994）
44：173-313，J．J Kabara等、Antimicrob. Agents Chemother (1972）2：23-28
，F．D．Gillin等、Science (1983）221：1290-1292）。疫学的試験によれば、 一貫して母乳保育乳児においてウイルス性および細菌性の感染症の頻度が低値と
なっている。疫学的試験ではまた、母乳保育が癌からの保護をもたらすという説
得力のある証拠が得られている。母乳保育個体のリンパ腫および他の悪性疾患の
発生率は低値であり、頻度は母乳保育期間の長さに従って低下している（M．K.
Davis等、Lancet（1988）ii：365-368）。乳癌の発生率は、出生児に母乳保育を
行った女性において低下することを示唆する別の報告が有る（V．Siskind等、Am
．J．Epidemiol.（1989）130：229-236，P．A．Newcomb等、N．Engl．J．Med．(
1994）330：81-87）。本発明者等の研究によれば、疾患頻度の低下の潜在的機序
が明らかになった。ＭＡＬは母乳保育されている乳児の腸内で急速に増殖する細
胞に到達し、発達を通じて、そして、新生物を回避するような選択を促すか、ま
たは粘膜関連リンパ様組織に到達して局所リンパ球集団の機能に影響すると考え
られる。
への微生物の結合を防止し、ウイルス粒子を溶解し、細菌の細胞壁を破壊し、そ
して、微生物の生育を防止する（H．McKenzie等、Adv. Protein Chem., (1994）
44：173-313，J．J Kabara等、Antimicrob. Agents Chemother (1972）2：23-28
，F．D．Gillin等、Science (1983）221：1290-1292）。疫学的試験によれば、 一貫して母乳保育乳児においてウイルス性および細菌性の感染症の頻度が低値と
なっている。疫学的試験ではまた、母乳保育が癌からの保護をもたらすという説
得力のある証拠が得られている。母乳保育個体のリンパ腫および他の悪性疾患の
発生率は低値であり、頻度は母乳保育期間の長さに従って低下している（M．K.
Davis等、Lancet（1988）ii：365-368）。乳癌の発生率は、出生児に母乳保育を
行った女性において低下することを示唆する別の報告が有る（V．Siskind等、Am
．J．Epidemiol.（1989）130：229-236，P．A．Newcomb等、N．Engl．J．Med．(
1994）330：81-87）。本発明者等の研究によれば、疾患頻度の低下の潜在的機序
が明らかになった。ＭＡＬは母乳保育されている乳児の腸内で急速に増殖する細
胞に到達し、発達を通じて、そして、新生物を回避するような選択を促すか、ま
たは粘膜関連リンパ様組織に到達して局所リンパ球集団の機能に影響すると考え
られる。
【００２５】 以下、本発明を、添付のダイアグラム図を参照しながら実施例により特に記載
する。 添付図面において、図１Ａは、種々の時間に渡りインキュベートされたＭＡＬ
の種々の濃度による３種の細胞のインキュベーションに関する生存性試験の結果
を示す。生存性は培地のみに曝露された細胞の％として、トリパンブルー排除に
基づいて測定した。
する。 添付図面において、図１Ａは、種々の時間に渡りインキュベートされたＭＡＬ
の種々の濃度による３種の細胞のインキュベーションに関する生存性試験の結果
を示す。生存性は培地のみに曝露された細胞の％として、トリパンブルー排除に
基づいて測定した。
【００２６】 図１Ｂは電場反転ゲル電気泳動により測定した種々の時点におけるこれらの細
胞におけるＭＡＬにより誘発された染色質の開裂（パネルＩ）および従来のゲル
電気泳動で分析したオリゴヌクレオソーム長ＤＮＡ断片化（パネルII）を示す。 ６時間（Ｌ１２１０）または２４時間（Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細胞）後に
細胞の５０％を殺傷するＭＡＬの濃度（ＬＤ50濃度）で細胞をインキュベートし
た。種々の細胞に対するＬＤ50濃度は、Ｌ１２１０細胞が０.５mg／ml、Ａ５４ ９細胞が１.２５mg／mlそしてＨＲＴＥＣ細胞が４.５mg／mlであった。
胞におけるＭＡＬにより誘発された染色質の開裂（パネルＩ）および従来のゲル
電気泳動で分析したオリゴヌクレオソーム長ＤＮＡ断片化（パネルII）を示す。 ６時間（Ｌ１２１０）または２４時間（Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細胞）後に
細胞の５０％を殺傷するＭＡＬの濃度（ＬＤ50濃度）で細胞をインキュベートし
た。種々の細胞に対するＬＤ50濃度は、Ｌ１２１０細胞が０.５mg／ml、Ａ５４ ９細胞が１.２５mg／mlそしてＨＲＴＥＣ細胞が４.５mg／mlであった。
【００２７】 図２Ａは、共焦点顕微鏡観察により可視化したビオチニル化ＭＡＬ（ｄ）およ
びα−ラクトアルブミン（ｃ）と対照のストレプトアビジン（ａ）およびＩｇＧ
（ｂ）の細胞表面結合を示すものである。 図２Ｂは、漸増濃度の放射標識ＭＡＬ（−◇−）、ＡＬＡ（−□−）またはＩ
ｇＧ（−○−）に３０分曝露した後のＬ１２１０、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細
胞における細胞結合放射能を示すものである。
びα−ラクトアルブミン（ｃ）と対照のストレプトアビジン（ａ）およびＩｇＧ
（ｂ）の細胞表面結合を示すものである。 図２Ｂは、漸増濃度の放射標識ＭＡＬ（−◇−）、ＡＬＡ（−□−）またはＩ
ｇＧ（−○−）に３０分曝露した後のＬ１２１０、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細
胞における細胞結合放射能を示すものである。
【００２８】 図３は、Ａ５４９細胞の種々の細胞コンパートメントとのＭＡＬの相互作用を
示すものである。（ａ）ストレプトアビジン対照。（ｂ）３０分のインキュベー
ションの後に検出された細胞表面結合。ＭＡＬの細胞表面結合の形態および強度
は３種類の細胞について、そして、ＡＬＡについても同様であった。（ｃ）ＭＡ
Ｌと共に３時間インキュベートした後に細胞質の顆粒蛍光が検出された。（ｄ）
核の蓄積は２４時間のインキュベートの後に最高値となった。核の蓄積はＬ１２
１０細胞でより急速であった。ＭＡＬの核蓄積はＨＲＴＥＣ細胞では観察されな
かった。尺度となる棒の単位はμmである。
示すものである。（ａ）ストレプトアビジン対照。（ｂ）３０分のインキュベー
ションの後に検出された細胞表面結合。ＭＡＬの細胞表面結合の形態および強度
は３種類の細胞について、そして、ＡＬＡについても同様であった。（ｃ）ＭＡ
Ｌと共に３時間インキュベートした後に細胞質の顆粒蛍光が検出された。（ｄ）
核の蓄積は２４時間のインキュベートの後に最高値となった。核の蓄積はＬ１２
１０細胞でより急速であった。ＭＡＬの核蓄積はＨＲＴＥＣ細胞では観察されな
かった。尺度となる棒の単位はμmである。
【００２９】 図４は、Ｌ１２１０、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細胞における種々の細胞下コ
ンパートメントへの125Ｉ−標識ＭＡＬの局在化を示すものである。細胞を放射 標識ＭＡＬ １０6cpmに曝露し、ホモジナイズし、各細胞下画分に結合している 放射能をγカウンターで定量した。核画分は大部分が核を含有し、ペレット２は
原形質膜、ゴルジ膜、ＥＲ膜およびミトコンドリアを含有し、ペレット３は小胞
体を含有し、そして、上澄みはシトソルを含有していた。
ンパートメントへの125Ｉ−標識ＭＡＬの局在化を示すものである。細胞を放射 標識ＭＡＬ １０6cpmに曝露し、ホモジナイズし、各細胞下画分に結合している 放射能をγカウンターで定量した。核画分は大部分が核を含有し、ペレット２は
原形質膜、ゴルジ膜、ＥＲ膜およびミトコンドリアを含有し、ペレット３は小胞
体を含有し、そして、上澄みはシトソルを含有していた。
【００３０】 図５は、ＭＡＬとＡＬＡとの間の細胞下分布における差を示すものである。Ｌ
１２１０、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細胞をそれぞれ６時間、２４時間および２
４時間、放射標識蛋白１０6cpmに曝露した。細胞をホモジナイズし、示差遠心分
離に付し、各細胞下画分の放射能を測定した。
１２１０、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細胞をそれぞれ６時間、２４時間および２
４時間、放射標識蛋白１０6cpmに曝露した。細胞をホモジナイズし、示差遠心分
離に付し、各細胞下画分の放射能を測定した。
【００３１】 図６は、ＭＡＬ ０.４mg／mlと共に２時間インキュベートした後のＬ１２１０
、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣの核におけるＭＡＬ誘発染色質開裂を示すものであ
る。抑制実験では単離した核をＷＧＡ ５０μg／mlと共に予備インキュベートし
た後に蛋白を添加した。染色質の開裂は電場反転ゲル電気泳動（上）で分析し、
オリゴヌクレオソーム断片化は従来のゲル電気泳動（下）で検出した。
、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣの核におけるＭＡＬ誘発染色質開裂を示すものであ
る。抑制実験では単離した核をＷＧＡ ５０μg／mlと共に予備インキュベートし
た後に蛋白を添加した。染色質の開裂は電場反転ゲル電気泳動（上）で分析し、
オリゴヌクレオソーム断片化は従来のゲル電気泳動（下）で検出した。
【００３２】 図７は、ジギトニン予備処理Ａ５４９細胞の核へのＭＡＬ、ＡＬＡおよびＩｇ
Ｇの核取り込みを示すものである。ジギトニン透過性付与細胞を２０分間ビオチ
ニル化蛋白と共にインキュベートし、洗浄し、ＦＩＴＣ−コンジュゲートストレ
プトアビジン（緑色）で逆染色し、共焦点顕微鏡により可視化した。核ＤＮＡは
ヨウ化プロピジウム（赤色）２５μg／mlで逆染色した。核の染色はストレプト アビジンのみ（ａ）ＩｇＧ（ｂ）ＡＬＡ（ｃおよびｄ）およびＭＡＬ（ｅおよび
ｆ）に曝露した細胞について示す。抑制試験では、ジギトニン透過性付与細胞を
ＷＧＡ ５０μg／mlと共に予備インキュベートした後にビオチニル化蛋白を添加
した。ＭＡＬの核取りこみはＷＧＡにより抑制されたが（ｆ）、ＡＬＡもなお取
りこまれた（ｄ）。
Ｇの核取り込みを示すものである。ジギトニン透過性付与細胞を２０分間ビオチ
ニル化蛋白と共にインキュベートし、洗浄し、ＦＩＴＣ−コンジュゲートストレ
プトアビジン（緑色）で逆染色し、共焦点顕微鏡により可視化した。核ＤＮＡは
ヨウ化プロピジウム（赤色）２５μg／mlで逆染色した。核の染色はストレプト アビジンのみ（ａ）ＩｇＧ（ｂ）ＡＬＡ（ｃおよびｄ）およびＭＡＬ（ｅおよび
ｆ）に曝露した細胞について示す。抑制試験では、ジギトニン透過性付与細胞を
ＷＧＡ ５０μg／mlと共に予備インキュベートした後にビオチニル化蛋白を添加
した。ＭＡＬの核取りこみはＷＧＡにより抑制されたが（ｆ）、ＡＬＡもなお取
りこまれた（ｄ）。
【００３３】 図８は、Ｃａ2+抑制剤で処理した後のＭＡＬの細胞下分布の作用を示す。Ｌ１
２１０およびＡ５４９細胞に０.５mM ＢＡＰＴＡ／ＡＭ、１０μMベラピミルま たは５μMニフィジピンで予備処理し、その後、放射標識蛋白１０6cpmにそれぞ れ６時間および２４時間暴露した。細胞をホモジナイズし、示差遠心分離に付し
、そして、各細胞下画分の放射能を測定した。
２１０およびＡ５４９細胞に０.５mM ＢＡＰＴＡ／ＡＭ、１０μMベラピミルま たは５μMニフィジピンで予備処理し、その後、放射標識蛋白１０6cpmにそれぞ れ６時間および２４時間暴露した。細胞をホモジナイズし、示差遠心分離に付し
、そして、各細胞下画分の放射能を測定した。
【００３４】 実施例においては、以下の試薬を使用した。 ＦＩＴＣコンジュゲートブタ抗ウサギ抗体およびＦＩＴＣコンジュゲートスト
レプトアビジンはDakopatts a／s（Glostrup，Denmark）から入手した。ＤＥＡ Ｅ−トリスアクリルＭはBioSepra（Villeneuve la，Garenne，France）から入手
した。ビオチン標識キットはBoeringer Manheimer GmbH（Germany）から、125Ｉ
はAmersham（ＵＫ）から入手した。FlowcheckTMおよびFlowserTM蛍光球体はCoul
ter Inc．(Hialeah，FL，USA）より入手した。Seaplaque GTG低融点アガロース ゲルおよびSeaKem GTGアガロースはSeaKem，FMK Bioproducts (Rockdale，USA）
から入手した。Dulbeccoの変性Eagle培地、Hank均衡化塩溶液（ＨＢＳＳ）、Ｒ ＰＭＩ １６４０、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、Ｌ−グルタミン、２−メルカプト エタノール、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンおよび１kD Ｄ ＮＡラダーはGibco／BRL、Life Technology Ltd（Paisley Scotland，UK）から 入手した。ホウ酸、ジメチルスルホキシド、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＮａＣｌ、ＫＨ2Ｐ Ｏ4、ＭｇＣｌ2、ＮａＡｚｉｄ、Tween-20およびトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタンはKebo Lab（Stockholm, Sweden）から入手した。ＰＤ−１０カラム 、ヘパリンおよびパーコール（percoll）溶液はPharmacia Biotech（Stockholm,
Sweden）から、α−ラクトアルブミン、ロイペプチン、アンチパイン、ＰＭＳ Ｆ、Triton X-100、ＮＰ−４０、ＣＨＡＰＳ、トリプシン、ブチレート、Ｎ−ラ
ウロイルサルコシン、過ヨウ素酸ナトリウム、プロテイナーゼＫ、ツニカマイシ
ン、ラクトパーオキシダーゼ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、コラゲナーゼＩ型、ＤＮＡ
ｓｅ IV型および２セットのパルスマーカー：Saccharomyces cerevisiae由来染 色体（２２５−２２００kbp）およびλＤＮＡ Hind III断片、λＤＮＡおよびλ
ＤＮＡ連鎖体（concatemer）（０.１−２００kbp）の混合物はSigma Chemicals
Inc（St Louis，USA）から入手した。
レプトアビジンはDakopatts a／s（Glostrup，Denmark）から入手した。ＤＥＡ Ｅ−トリスアクリルＭはBioSepra（Villeneuve la，Garenne，France）から入手
した。ビオチン標識キットはBoeringer Manheimer GmbH（Germany）から、125Ｉ
はAmersham（ＵＫ）から入手した。FlowcheckTMおよびFlowserTM蛍光球体はCoul
ter Inc．(Hialeah，FL，USA）より入手した。Seaplaque GTG低融点アガロース ゲルおよびSeaKem GTGアガロースはSeaKem，FMK Bioproducts (Rockdale，USA）
から入手した。Dulbeccoの変性Eagle培地、Hank均衡化塩溶液（ＨＢＳＳ）、Ｒ ＰＭＩ １６４０、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、Ｌ−グルタミン、２−メルカプト エタノール、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンおよび１kD Ｄ ＮＡラダーはGibco／BRL、Life Technology Ltd（Paisley Scotland，UK）から 入手した。ホウ酸、ジメチルスルホキシド、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＮａＣｌ、ＫＨ2Ｐ Ｏ4、ＭｇＣｌ2、ＮａＡｚｉｄ、Tween-20およびトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタンはKebo Lab（Stockholm, Sweden）から入手した。ＰＤ−１０カラム 、ヘパリンおよびパーコール（percoll）溶液はPharmacia Biotech（Stockholm,
Sweden）から、α−ラクトアルブミン、ロイペプチン、アンチパイン、ＰＭＳ Ｆ、Triton X-100、ＮＰ−４０、ＣＨＡＰＳ、トリプシン、ブチレート、Ｎ−ラ
ウロイルサルコシン、過ヨウ素酸ナトリウム、プロテイナーゼＫ、ツニカマイシ
ン、ラクトパーオキシダーゼ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、コラゲナーゼＩ型、ＤＮＡ
ｓｅ IV型および２セットのパルスマーカー：Saccharomyces cerevisiae由来染 色体（２２５−２２００kbp）およびλＤＮＡ Hind III断片、λＤＮＡおよびλ
ＤＮＡ連鎖体（concatemer）（０.１−２００kbp）の混合物はSigma Chemicals
Inc（St Louis，USA）から入手した。
【００３５】 ネズミリンパ芽様白血病細胞系統Ｌ１２１０（ATCC CLL 219）を１０％ＦＣＳ
、２mMグルタミンおよびml当たり５０μgゲンタマイシンを含有し、更に５０μ
Ｍ２−メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ １６４０培地内で培養した。 細胞をフラスコから吸引し、遠心分離して回収し、洗浄し、ＲＰＭＩ中に再懸濁
した。
、２mMグルタミンおよびml当たり５０μgゲンタマイシンを含有し、更に５０μ
Ｍ２−メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ １６４０培地内で培養した。 細胞をフラスコから吸引し、遠心分離して回収し、洗浄し、ＲＰＭＩ中に再懸濁
した。
【００３６】 ヒト肺癌細胞系Ａ５４９（ATCC CLL 185）を２−メルカプトエタノールを添加
しない以外は上記と同様の培地中で培養した。細胞を３７℃で約１０分間versen
e（ＰＢＳ １Ｌ当たり０.２ｇナトリウムＥＤＴＡ）で脱着させた。脱着した細 胞を１０分間３２０×ｇで遠心分離することにより回収し、ＲＰＭＩ中に再懸濁
した。
しない以外は上記と同様の培地中で培養した。細胞を３７℃で約１０分間versen
e（ＰＢＳ １Ｌ当たり０.２ｇナトリウムＥＤＴＡ）で脱着させた。脱着した細 胞を１０分間３２０×ｇで遠心分離することにより回収し、ＲＰＭＩ中に再懸濁
した。
【００３７】 ヒト腎尿細管上皮細胞（ＨＲＴＥＣ）は水腎症と機能低下のために摘出した３
歳男児の腎臓より単離した。腎皮質を腎髄質から切除し、粉砕し、１０分間２５
０×ｇで遠心分離することにより採取した。皮質断片を０.１％コラゲナーゼＩ 型（Sigma）および０.０４％ＤＮＡｓｅ IV型（Sigma）を含有する０.１５Ｍ ｐ
Ｈ７.２のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中、回転プラットホーム上、４℃で一夜 インキュベートした。組織を遠心分離（２５０×ｇ、１０分間）して採取し、１
５％ウシ胎児血清を添加した等量のＨＢＳＳで希釈した。組織を８倍容量の１５
％ＦＣＳ添加ＨＢＳＳに再懸濁し、２段階Percoll勾配、即ちＨＢＳＳ中３０お よび５０％希釈、の最上部に適用し、４℃で２０分間１５００×ｇで遠心分離し
、界面を採取した。この界面を４倍容量の１５％ＦＣＳ添加ＨＢＳＳで希釈し、
１０分間２５０×ｇで遠心分離し、１５％ＦＣＳ、２mM Ｌ−グルタミン、２０ 単位／mlヘパリン、１００Ｕ／mlペニシリンおよび１００μg／mlストレプトマ イシン添加Dulbecco変性Eagle培地中、Primariaフラスコ中に再懸濁した。細胞 を９５％および空気５％ＣＯ2雰囲気下に３７℃でインキュベートし、全面培養 まで生育させた。トリプシン処理後、細胞懸濁液を３５μｍナイロンメッシュで
ろ化し、Primariaフラスコに再プレート化し、全面培養まで生育させた。細胞単
離物をトリプシン処理し、５％ＤＭＳＯ含有ＦＣＳ中濃縮し、次に使用するまで
液体窒素中に保存した。実験で使用した細胞は３〜４回継代培養し、Ａ５４９細
胞について上記した通り培養した。
歳男児の腎臓より単離した。腎皮質を腎髄質から切除し、粉砕し、１０分間２５
０×ｇで遠心分離することにより採取した。皮質断片を０.１％コラゲナーゼＩ 型（Sigma）および０.０４％ＤＮＡｓｅ IV型（Sigma）を含有する０.１５Ｍ ｐ
Ｈ７.２のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中、回転プラットホーム上、４℃で一夜 インキュベートした。組織を遠心分離（２５０×ｇ、１０分間）して採取し、１
５％ウシ胎児血清を添加した等量のＨＢＳＳで希釈した。組織を８倍容量の１５
％ＦＣＳ添加ＨＢＳＳに再懸濁し、２段階Percoll勾配、即ちＨＢＳＳ中３０お よび５０％希釈、の最上部に適用し、４℃で２０分間１５００×ｇで遠心分離し
、界面を採取した。この界面を４倍容量の１５％ＦＣＳ添加ＨＢＳＳで希釈し、
１０分間２５０×ｇで遠心分離し、１５％ＦＣＳ、２mM Ｌ−グルタミン、２０ 単位／mlヘパリン、１００Ｕ／mlペニシリンおよび１００μg／mlストレプトマ イシン添加Dulbecco変性Eagle培地中、Primariaフラスコ中に再懸濁した。細胞 を９５％および空気５％ＣＯ2雰囲気下に３７℃でインキュベートし、全面培養 まで生育させた。トリプシン処理後、細胞懸濁液を３５μｍナイロンメッシュで
ろ化し、Primariaフラスコに再プレート化し、全面培養まで生育させた。細胞単
離物をトリプシン処理し、５％ＤＭＳＯ含有ＦＣＳ中濃縮し、次に使用するまで
液体窒素中に保存した。実験で使用した細胞は３〜４回継代培養し、Ａ５４９細
胞について上記した通り培養した。
【００３８】 ＭＡＬを例えば、WO 96／04929に記載の通り凍結乳汁から精製した。即ち、ヒ
ト乳汁を解凍し、遠心分離して脂肪分を除去した。脱脂乳を酸沈殿によりカゼイ
ンと乳清とに分離した（O．Melander，1947，Uppsala Lakarforen，Forhandl．3
-4：107-198）。カゼイン沈殿を遠心分離により回収し、蒸留水中の再懸濁３〜 ５サイクルにより洗浄し、凍結乾燥した。カゼインを、ＦＰＬＣ機材（Pharmaci
a-LKB, Uppsala，Sweden）に連結したＤＥＡＥ−トリスアクリルＭを充填したイ
オン交換カラムを用いてＮａＣｌ勾配により分画した。ＭＡＬ複合体を１Ｍ Ｎ ａＣｌで溶離させた。溶出液を少なくとも４８時間蒸留水に対して透析（膜カッ
トオフ３.５kD）することにより脱塩し、凍結乾燥し、適切な濃度に再懸濁した 。
ト乳汁を解凍し、遠心分離して脂肪分を除去した。脱脂乳を酸沈殿によりカゼイ
ンと乳清とに分離した（O．Melander，1947，Uppsala Lakarforen，Forhandl．3
-4：107-198）。カゼイン沈殿を遠心分離により回収し、蒸留水中の再懸濁３〜 ５サイクルにより洗浄し、凍結乾燥した。カゼインを、ＦＰＬＣ機材（Pharmaci
a-LKB, Uppsala，Sweden）に連結したＤＥＡＥ−トリスアクリルＭを充填したイ
オン交換カラムを用いてＮａＣｌ勾配により分画した。ＭＡＬ複合体を１Ｍ Ｎ ａＣｌで溶離させた。溶出液を少なくとも４８時間蒸留水に対して透析（膜カッ
トオフ３.５kD）することにより脱塩し、凍結乾燥し、適切な濃度に再懸濁した 。
【００３９】 実施例１ ＭＡＬ−誘発アポトーシスへの細胞の感受性 Ｌ１２１０、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細胞をＲＰＭＩに懸濁した（２×１０ 6 細胞／ml）。細胞懸濁液（９００μl）を２４穴プレート中ＭＡＬ（１００μl ）と混合し、それぞれ６時間または２４時間３７℃でインキュベートし、吸引に
より回収した。細胞の一部を用いてトリパンブルー排除により生存性を調べた。
残りの細胞をＤＮＡ断片化に関して分析した。 ＤＮＡ断片化はアガロースゲル電気泳動により検出した（Hakansson等、（199
5）前出）。即ち、細胞（２×１０6）をＴＥ−緩衝液（１０mMトリス、１mM Ｅ ＤＴＡ、ｐＨ８.０）２５０μlおよび氷冷細胞融解緩衝液（０.５％Triton X-10
0、５mMトリス、２０mM ＥＤＴＡ、ｐＨ８.０）２５０μ中に懸濁し、回転混合 し、１時間氷上で細胞溶解させた。１５分間１３,０００×ｇで遠心分離するこ とにより、ＤＮＡ断片を未損傷の染色質から分離した。上澄みを新しい管に移し
、冷無水エタノール１mlおよび５Ｍ ＮａＣｌ ２５μlを添加した後、ＤＮＡを −２０℃で沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１３,０００×ｇで１５分間遠心分離 することによりペレット化し、エタノールが蒸発するまでSpeed-Vac Concentrat
or (Savant Instruments Inc., Farmingdale, NY, USA）中で乾燥させた。ペレ ットを３０μlのＴＥ−緩衝液中に再懸濁し、１mg／mlのＲＮＡｓｅＡと共に３ ７℃で１時間、次いで５００μg／mlのプロテイナーゼＫと共に１時間インキュ ベートした。試料を１.８％アガロースゲルに添加し、４０Ｖの定電圧で一夜泳 動した。臭化エチジウム（６μg／ml）で染色後ＵＶ光（３０５nm）下にＤＮＡ を可視化し、Polaroid 55 ポジ−ネガフィルムを用いて写真撮影した。ＤＮＡの
大きさは１０１８bpのｄｓＤＮＡ断片反復物および７５〜１６３６bpの範囲のベ
クターＤＮＡよりなる１kDのＤＮＡラダー（Gibco BRL，Life Technologies LTD
., Paisley, UK）を用いてカリブレーションした。
より回収した。細胞の一部を用いてトリパンブルー排除により生存性を調べた。
残りの細胞をＤＮＡ断片化に関して分析した。 ＤＮＡ断片化はアガロースゲル電気泳動により検出した（Hakansson等、（199
5）前出）。即ち、細胞（２×１０6）をＴＥ−緩衝液（１０mMトリス、１mM Ｅ ＤＴＡ、ｐＨ８.０）２５０μlおよび氷冷細胞融解緩衝液（０.５％Triton X-10
0、５mMトリス、２０mM ＥＤＴＡ、ｐＨ８.０）２５０μ中に懸濁し、回転混合 し、１時間氷上で細胞溶解させた。１５分間１３,０００×ｇで遠心分離するこ とにより、ＤＮＡ断片を未損傷の染色質から分離した。上澄みを新しい管に移し
、冷無水エタノール１mlおよび５Ｍ ＮａＣｌ ２５μlを添加した後、ＤＮＡを −２０℃で沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１３,０００×ｇで１５分間遠心分離 することによりペレット化し、エタノールが蒸発するまでSpeed-Vac Concentrat
or (Savant Instruments Inc., Farmingdale, NY, USA）中で乾燥させた。ペレ ットを３０μlのＴＥ−緩衝液中に再懸濁し、１mg／mlのＲＮＡｓｅＡと共に３ ７℃で１時間、次いで５００μg／mlのプロテイナーゼＫと共に１時間インキュ ベートした。試料を１.８％アガロースゲルに添加し、４０Ｖの定電圧で一夜泳 動した。臭化エチジウム（６μg／ml）で染色後ＵＶ光（３０５nm）下にＤＮＡ を可視化し、Polaroid 55 ポジ−ネガフィルムを用いて写真撮影した。ＤＮＡの
大きさは１０１８bpのｄｓＤＮＡ断片反復物および７５〜１６３６bpの範囲のベ
クターＤＮＡよりなる１kDのＤＮＡラダー（Gibco BRL，Life Technologies LTD
., Paisley, UK）を用いてカリブレーションした。
【００４０】 高分子量ＤＮＡ断片は電場反転ゲル電気泳動（ＦＩＧＥ）により検出した。即
ち、細胞（２×１０6）を緩衝液（０.１５Ｍ NaClaniacal, ２mM ＫＨ2ＰＯ4／
ＫＯＨ, ｐＨ６.８，１mM ＥＧＴＡ，５mM ＭｇＣｌ2）１８０μLおよび３７℃ の溶融１％低融点アガロースゲル（SeaKem，FMK Bioproducts, Rockdale, USA）
１８０μL中に懸濁し、予備冷却したプレートの充填物にピペットで添加し、４ ℃で１０分間放置した。充填物を２４時間５０℃で、１mg／充填物のインキュベ
ーション緩衝液（１０mM ＮａＣｌ、１０mM トリス、ｐＨ９.５、２５mM ＥＤＴ
Ａ、 １％Ｎ−ラウロイルサルコシン、最終濃度０.２mg／mlとなるようにプロテ
イナーゼＫを添加）中でインキュベートした。インキュベーションの後、２時間
４℃でＴＥ−緩衝液を３回変えてすすいだ。充填物は電気泳動まで５０mM ＥＤ ＴＡ中に保存した。電気泳動は１２℃で０.５×ＴＢＥ（４５mM トリス、１.２ ５mM ＥＤＴＡ、４５mM ホウ酸、ｐＨ８.０）中１％アガロースゲル中１８０Ｖ で行い、その際、３：１の前進ｖｓ逆行比を用いて２４時間、０.８ｓ〜３０ｓ にランピング（ramping）率を変化させた。ＤＮＡの大きさのカリブレーション はSigmaより購入した２セットのパルスマーカー：Saccharomyces cerevisiae由 来染色体（２２５−２２００kbp）およびλＤＮＡおよびλＤＮＡ連鎖体（conca
temer）（０.１−２００kbp）の混合物を用いて行った。ゲルの染色および写真 撮影は上述の通り実施した。
ち、細胞（２×１０6）を緩衝液（０.１５Ｍ NaClaniacal, ２mM ＫＨ2ＰＯ4／
ＫＯＨ, ｐＨ６.８，１mM ＥＧＴＡ，５mM ＭｇＣｌ2）１８０μLおよび３７℃ の溶融１％低融点アガロースゲル（SeaKem，FMK Bioproducts, Rockdale, USA）
１８０μL中に懸濁し、予備冷却したプレートの充填物にピペットで添加し、４ ℃で１０分間放置した。充填物を２４時間５０℃で、１mg／充填物のインキュベ
ーション緩衝液（１０mM ＮａＣｌ、１０mM トリス、ｐＨ９.５、２５mM ＥＤＴ
Ａ、 １％Ｎ−ラウロイルサルコシン、最終濃度０.２mg／mlとなるようにプロテ
イナーゼＫを添加）中でインキュベートした。インキュベーションの後、２時間
４℃でＴＥ−緩衝液を３回変えてすすいだ。充填物は電気泳動まで５０mM ＥＤ ＴＡ中に保存した。電気泳動は１２℃で０.５×ＴＢＥ（４５mM トリス、１.２ ５mM ＥＤＴＡ、４５mM ホウ酸、ｐＨ８.０）中１％アガロースゲル中１８０Ｖ で行い、その際、３：１の前進ｖｓ逆行比を用いて２４時間、０.８ｓ〜３０ｓ にランピング（ramping）率を変化させた。ＤＮＡの大きさのカリブレーション はSigmaより購入した２セットのパルスマーカー：Saccharomyces cerevisiae由 来染色体（２２５−２２００kbp）およびλＤＮＡおよびλＤＮＡ連鎖体（conca
temer）（０.１−２００kbp）の混合物を用いて行った。ゲルの染色および写真 撮影は上述の通り実施した。
【００４１】 Ｌ１２１０細胞は０.５mg／mlのＭＡＬへの曝露で死滅し、細胞の５０％は６ 時間後も生存していた（図１Ａ）。Ａ５４９細胞は、細胞の５０％がその生存性
を失うためにはより高い濃度（１.２５mg／mlのＭＡＬ）およびより長いインキ ュベーション時間（２４時間）を要した（図１Ａ）。ＨＲＴＥＣ細胞はＭＡＬ濃
度４mg／mlまで、２４時間インキュベーション後も完全に生存性を保っていた。
単量体のα−ラクトアルブミンは１０mg／mlでも細胞の生存性に対する作用を示
さなかった。
を失うためにはより高い濃度（１.２５mg／mlのＭＡＬ）およびより長いインキ ュベーション時間（２４時間）を要した（図１Ａ）。ＨＲＴＥＣ細胞はＭＡＬ濃
度４mg／mlまで、２４時間インキュベーション後も完全に生存性を保っていた。
単量体のα−ラクトアルブミンは１０mg／mlでも細胞の生存性に対する作用を示
さなかった。
【００４２】 ＤＮＡ断片化の速度過程を図１Ｂに示す。ＤＮＡ断片化は高度な時間および濃
度依存性を示した。ＨＭＷ ＤＮＡ断片化はＭＡＬ（０.５mg／ml）と共に３０分
間インキュベートした後にＬ１２１０細胞で観察され、オリゴヌクレオソーム長
ＤＮＡ断片は３時間後に検出された。より低いＭＡＬ濃度（０.３mg／ml）では ＤＮＡの断片化は６時間後に最初に観察され、より高いＭＡＬ濃度（０.７５mg ／ml）では断片化は２時間で既にみとめられた。それ以降の時間には、細胞の二
次的溶解のため断片化は観察されなかった。
度依存性を示した。ＨＭＷ ＤＮＡ断片化はＭＡＬ（０.５mg／ml）と共に３０分
間インキュベートした後にＬ１２１０細胞で観察され、オリゴヌクレオソーム長
ＤＮＡ断片は３時間後に検出された。より低いＭＡＬ濃度（０.３mg／ml）では ＤＮＡの断片化は６時間後に最初に観察され、より高いＭＡＬ濃度（０.７５mg ／ml）では断片化は２時間で既にみとめられた。それ以降の時間には、細胞の二
次的溶解のため断片化は観察されなかった。
【００４３】 Ａ５４９細胞ではＨＭＷの断片化は１.０mg／mlで６時間インキュベートした 後に最初に観察され、１.５mg／mlで最大値を示した（図１Ｂ、パネルＩ）。そ れ以上のＤＮＡ分解は、より高濃度のＭＡＬで、最終的に全く染色体ＤＮＡが観
察されなくなるまで認められた（２.５mg／ml）。オリゴヌクレオソーム断片化 は検出されなかった（図１Ｂ、パネルII）。 ＨＲＴＥＣ細胞は２４時間ＭＡＬ４mg／mlに曝露した後にもＨＭＷ ＤＮＡ断 片化は起こさなかった（図１Ｂ）。
察されなくなるまで認められた（２.５mg／ml）。オリゴヌクレオソーム断片化 は検出されなかった（図１Ｂ、パネルII）。 ＨＲＴＥＣ細胞は２４時間ＭＡＬ４mg／mlに曝露した後にもＨＭＷ ＤＮＡ断 片化は起こさなかった（図１Ｂ）。
【００４４】 これらの結果によれば、試験した細胞種の間で、ＭＡＬ−誘発アポトーシスへ
感受性が異なっていたことが解かった。Ｌ１２１０細胞系は高度な感受性を有し
、Ａ５４９細胞は中程度の感受性を有し、そして、非転移培養物は試験濃度範囲
内では蛋白複合体の作用に対して耐性を示した。蛋白の単量体は不活性であった
。
感受性が異なっていたことが解かった。Ｌ１２１０細胞系は高度な感受性を有し
、Ａ５４９細胞は中程度の感受性を有し、そして、非転移培養物は試験濃度範囲
内では蛋白複合体の作用に対して耐性を示した。蛋白の単量体は不活性であった
。
【００４５】 実施例２ ＭＡＬ複合体の細胞表面結合 ＭＡＬ、ヒトα−ラクトアルブミン（ＨＬＡ）および免疫グロブリンＧを製造
元の指示書に従ってビオチニル化するか、または、ラクトペルオキシダーゼ法を
用いて125Ｉで標識した。蛋白をＰＢＳＡ−Ｔ緩衝液（３０mM Ｎａ2ＨＰＯ4、１
２０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７.４、０.１％ＮａＡｚｉｄ、０.０５％ Tween-20添加 ）に溶解し、蛋白２５μl（２５μg）を125Ｉ（０.２Ci）２μl、ラクトペルオ キシダーゼ（２.５mg／ml）２μlおよびＨ2Ｏ2（ＰＢＳ中１：２０００希釈）と
共に、２分間室温でインキュベートした。ＰＢＳＡ−Ｔを５００μl添加するこ とにより反応を停止した。標識された蛋白をＰＤ−１０カラム上で精製した。Ｐ
ＢＳＡ−Ｔ中の画分５００μlを溶出させ、放射能を含有する画分を−２０℃で 保存した。標識された蛋白を緩衝液１mlで溶離し、これは約２×１０8cpmの放射
能を有していた。
元の指示書に従ってビオチニル化するか、または、ラクトペルオキシダーゼ法を
用いて125Ｉで標識した。蛋白をＰＢＳＡ−Ｔ緩衝液（３０mM Ｎａ2ＨＰＯ4、１
２０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７.４、０.１％ＮａＡｚｉｄ、０.０５％ Tween-20添加 ）に溶解し、蛋白２５μl（２５μg）を125Ｉ（０.２Ci）２μl、ラクトペルオ キシダーゼ（２.５mg／ml）２μlおよびＨ2Ｏ2（ＰＢＳ中１：２０００希釈）と
共に、２分間室温でインキュベートした。ＰＢＳＡ−Ｔを５００μl添加するこ とにより反応を停止した。標識された蛋白をＰＤ−１０カラム上で精製した。Ｐ
ＢＳＡ−Ｔ中の画分５００μlを溶出させ、放射能を含有する画分を−２０℃で 保存した。標識された蛋白を緩衝液１mlで溶離し、これは約２×１０8cpmの放射
能を有していた。
【００４６】 Ｌ１２１０、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細胞（３×１０6細胞／ml、５０μl）
を３７℃で種々の時間、ビオチニル化ＭＡＬ、ＡＬＡまたはＢＳＡ ５０μlとと
もに懸濁液中でインキュベートした。細胞を１０分間３２０×ｇで遠心分離する
ことによりＰＢＳで洗浄し、上澄みを傾瀉した。ＦＩＴＣ−コンジュゲートスト
レプトアビジン（ＰＢＳ中１：５０希釈）を添加し、細胞を室温で３０分間イン
キュベートした。細胞を上記の通り遠心分離により洗浄し、３００μl ＰＢＳに
懸濁し、表面の蛍光を４８８nmアルゴンレーザーを装着したCoulter Epics Prof
ile IIフローサイトメーター（Coulter Inc.）を用いたフローサイトメトリーに
より分析した。５２５nmバンドパスフィルターで緑色蛍光を検出した。ＰＭＴ電
圧は初期は１２５０Ｖにセットし、Immunobeads（Coulter）を用いたカリブレー
ションにより日毎に調節した。
を３７℃で種々の時間、ビオチニル化ＭＡＬ、ＡＬＡまたはＢＳＡ ５０μlとと
もに懸濁液中でインキュベートした。細胞を１０分間３２０×ｇで遠心分離する
ことによりＰＢＳで洗浄し、上澄みを傾瀉した。ＦＩＴＣ−コンジュゲートスト
レプトアビジン（ＰＢＳ中１：５０希釈）を添加し、細胞を室温で３０分間イン
キュベートした。細胞を上記の通り遠心分離により洗浄し、３００μl ＰＢＳに
懸濁し、表面の蛍光を４８８nmアルゴンレーザーを装着したCoulter Epics Prof
ile IIフローサイトメーター（Coulter Inc.）を用いたフローサイトメトリーに
より分析した。５２５nmバンドパスフィルターで緑色蛍光を検出した。ＰＭＴ電
圧は初期は１２５０Ｖにセットし、Immunobeads（Coulter）を用いたカリブレー
ションにより日毎に調節した。
【００４７】 細胞表面結合物質は共焦点顕微鏡観察により調べ、フローサイトメトリーで定
量した。３種類の細胞への結合は１０分後に検出され、３０分のインキュベーシ
ョン後に最高値となり、フローサイトメトリーにより測定された蛍光強度はスト
レプトアビジン対照の１２.１、１３.４およ８.５倍であった。ＭＡＬは共焦点 顕微鏡観察で認められた未染色領域（図２Ａ）により隔たれたパッチに分布して
いた。
量した。３種類の細胞への結合は１０分後に検出され、３０分のインキュベーシ
ョン後に最高値となり、フローサイトメトリーにより測定された蛍光強度はスト
レプトアビジン対照の１２.１、１３.４およ８.５倍であった。ＭＡＬは共焦点 顕微鏡観察で認められた未染色領域（図２Ａ）により隔たれたパッチに分布して
いた。
【００４８】 ＭＡＬの細胞表面結合はまた細胞への125Ｉ−標識ＭＡＬの添加後の最初の３ ０分の間、細胞結合放射能として定量された（図２Ｂ）。懸濁液（３×１０6細 胞／ml、１００μl）中のＬ１２１０、Ａ５４９またはＨＲＴＥＣへの放射標識 蛋白の表面結合は３７℃で３０分間125Ｉ−標識ＭＡＬ、ＡＬＡまたはＩｇＧ１ ×１０6cpmと共にインキュベートした後に、Epicsのγカウンター（Coulter Inc
.）を用いて定量し、細胞をＰＢＳで１０分間３２０×ｇで遠心分離することに より３回洗浄した。
.）を用いて定量し、細胞をＰＢＳで１０分間３２０×ｇで遠心分離することに より３回洗浄した。
【００４９】 結合はＭＡＬの濃度に従って増大し、２×１０6cpmへの曝露３０分の後にＬ１
２１０、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細胞でそれぞれ２３,０００、２００００お よび１８０００cpmで飽和したのに対し、ＩｇＧのＬ１２１０およびＡ５４９細 胞では１５００および１３００cpmであった。３種類の細胞の間にはＭＡＬの細 胞表面結合に差は無かった（図２Ｂ）。この方法を用いた場合には125Ｉ−標識 ＡＬＡの結合はＭＡＬの場合より低値であった。２×１０6cpmのＡＬＡに３０分
間曝露した後、結合はＬ１２１０、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細胞でそれぞれ５
０００、７０００および７５００cpmであった。
２１０、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細胞でそれぞれ２３,０００、２００００お よび１８０００cpmで飽和したのに対し、ＩｇＧのＬ１２１０およびＡ５４９細 胞では１５００および１３００cpmであった。３種類の細胞の間にはＭＡＬの細 胞表面結合に差は無かった（図２Ｂ）。この方法を用いた場合には125Ｉ−標識 ＡＬＡの結合はＭＡＬの場合より低値であった。２×１０6cpmのＡＬＡに３０分
間曝露した後、結合はＬ１２１０、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細胞でそれぞれ５
０００、７０００および７５００cpmであった。
【００５０】 実施例３ ＭＡＬの核取りこみ 細胞内蛋白を検出するために、細胞を室温でリン酸緩衝パラホルムアルデヒド
（４％）（B. Sander等、Immunol．Rev．(1991）119：65-92）中５分間、ビオチ
ニル化ＭＡＬ０.３mg／ml添加後種々の時点で固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ 中０.１％サポニンを用いて透過性付与した。ＦＩＴＣコンジュゲートストレプ トアビジン（０.１％サポニン中１：１００希釈）を添加し、細胞を室温で３０ 分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ−サポニンで２回、ＰＢＳで１回洗浄し
、スライドガラス上に搭載し、Nikon Diaphot反転顕微鏡に連結したＢｉｏ−Ｒ ａｄ １０２４レーザー走査共焦点装置（Bio Rad Laboratories, Hemel-Hempste
ad, UK）中で分析した。
（４％）（B. Sander等、Immunol．Rev．(1991）119：65-92）中５分間、ビオチ
ニル化ＭＡＬ０.３mg／ml添加後種々の時点で固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ 中０.１％サポニンを用いて透過性付与した。ＦＩＴＣコンジュゲートストレプ トアビジン（０.１％サポニン中１：１００希釈）を添加し、細胞を室温で３０ 分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ−サポニンで２回、ＰＢＳで１回洗浄し
、スライドガラス上に搭載し、Nikon Diaphot反転顕微鏡に連結したＢｉｏ−Ｒ ａｄ １０２４レーザー走査共焦点装置（Bio Rad Laboratories, Hemel-Hempste
ad, UK）中で分析した。
【００５１】 サポニンによる透過性付与によりストレプトアビジンの侵入が可能となった。
培地、ビオチニル化ＢＳＡまたはα−ラクトアルブミンで処理した細胞を対照群
として用いた（図３）。ＭＡＬの核取りこみはそのアポトーシス誘発作用に対し
て感受性の細胞では急速に起こったことが解かった。Ｌ１２１０細胞の核染色は
細胞の約１０％では約２時間後に最初に検出され、６時間後には７０％を超える
Ｌ１２１０細胞の核が明確に染色された。細胞質の染色は上記細胞で観察されな
かった。Ａ５４９細胞におけるＭＡＬの核局在化はより長いインキュベーション
時間を要した（図３）。約１５％のＡ５４９細胞の核が明確に染色された。同時
に、ＭＡＬは細胞全体を通じて均一に分布した顆粒状の蛍光としてＡ５４９細胞
の細胞質内で観察された。核取りこみはビオチニル化ＭＡＬ（１mg／ml）に曝露
したＨＲＴＥＣ細胞では観察されなかった。ＭＡＬと比較してＡＬＡの核取り込
みには顕著な相違が認められた。ＡＬＡの核染色は６時間後には約３０％のＬ１
２１０細胞で、そして、２４時間後には約１５％のＡ５４９細胞で検出されたの
みであった。ＨＲＴＥＣ細胞ではＡＬＡの染色は検出されなかった。
培地、ビオチニル化ＢＳＡまたはα−ラクトアルブミンで処理した細胞を対照群
として用いた（図３）。ＭＡＬの核取りこみはそのアポトーシス誘発作用に対し
て感受性の細胞では急速に起こったことが解かった。Ｌ１２１０細胞の核染色は
細胞の約１０％では約２時間後に最初に検出され、６時間後には７０％を超える
Ｌ１２１０細胞の核が明確に染色された。細胞質の染色は上記細胞で観察されな
かった。Ａ５４９細胞におけるＭＡＬの核局在化はより長いインキュベーション
時間を要した（図３）。約１５％のＡ５４９細胞の核が明確に染色された。同時
に、ＭＡＬは細胞全体を通じて均一に分布した顆粒状の蛍光としてＡ５４９細胞
の細胞質内で観察された。核取りこみはビオチニル化ＭＡＬ（１mg／ml）に曝露
したＨＲＴＥＣ細胞では観察されなかった。ＭＡＬと比較してＡＬＡの核取り込
みには顕著な相違が認められた。ＡＬＡの核染色は６時間後には約３０％のＬ１
２１０細胞で、そして、２４時間後には約１５％のＡ５４９細胞で検出されたの
みであった。ＨＲＴＥＣ細胞ではＡＬＡの染色は検出されなかった。
【００５２】 実施例４ 細胞内分布の放射標識試験 125Ｉ−標識α−ラクトアルブミンおよびＩｇＧを対照として125Ｉ−標識ＭＡ
Ｌに曝露した細胞においてＭＡＬの細胞内分布を更に分析した（図４）。細胞を
機械的に破壊した後に細胞下画分を調製し、各画分中の放射標識ＭＡＬの量を細
胞破壊前に測定した総細胞結合放射能との比較において測定した。画分Ｐ１は大
部分は細胞核を含有し、Ｐ２は原形質膜、ゴルジ膜、ＥＲ膜およびミトコンドリ
アを含有し、Ｐ３は小胞体および上澄みを含有し、そして、画分Ｓはシトソル蛋
白を含有していた。画分の純度は特定のマーカー（ＤＮＡ、アルカリホスファタ
ーゼ、ＲＮＡおよびカタラーゼ）の定量により測定した。
Ｌに曝露した細胞においてＭＡＬの細胞内分布を更に分析した（図４）。細胞を
機械的に破壊した後に細胞下画分を調製し、各画分中の放射標識ＭＡＬの量を細
胞破壊前に測定した総細胞結合放射能との比較において測定した。画分Ｐ１は大
部分は細胞核を含有し、Ｐ２は原形質膜、ゴルジ膜、ＥＲ膜およびミトコンドリ
アを含有し、Ｐ３は小胞体および上澄みを含有し、そして、画分Ｓはシトソル蛋
白を含有していた。画分の純度は特定のマーカー（ＤＮＡ、アルカリホスファタ
ーゼ、ＲＮＡおよびカタラーゼ）の定量により測定した。
【００５３】 詳細には、細胞下画分化を文献に従って行った（J．Graham., Isolation of s
ubcellular organelles and membranes., p161-1019，D. Rickwood編、Centrifu
gation，a practical approach；第２版、IRL Press，Washington DC）。懸濁液
中のＬ１２１０、Ａ５４９またはＨＲＴＥＣ細胞（３×１０6細胞／ml、１００ μl）を３７℃で種々の時間に渡り、125Ｉ−標識ＭＡＬ、ＡＬＡまたはＩｇＧ１
×１０6cpmとともにインキュベートした。細胞を３回氷冷ＰＢＳで洗浄し、上澄
みを傾瀉した。細胞をホモジナイズ用緩衝液（１０mM トリス塩酸、ｐＨ７.８、
５mM ＭｇＣｌ2および２mM ＣａＣｌ2をＬ１２１０用、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、２
mM ＥＤＴＡ、ｐＨ７.５をＡ５４９細胞用とした）５００μl中に懸濁し、ペス トルサイズ４１５のDounceホモジナイザー（Thomas，Philadelphia，USA）中５ ０ストロークでホモジナイズした。スクロースを終濃度２５０mmで添加し、ホモ
ジネートを室温で２５分間１００×ｇで遠心分離した。最初のペレットには核、
大型ミトコンドリアおよび原形質膜の大型のシート状物が含有されていた。残り
の上澄みを更に４℃で３０分間１２０００×ｇで遠心分離して得られた第２のペ
レットはミトコンドリア原形質内網状組織、原形質膜および細胞小器官を含有し
ていた。上澄みを最終的に４℃で２時間１５００００×ｇで遠心分離することに
より、小胞体、原形質内網状組織を含有するペレットおよびシトゾル蛋白を含有
する上澄みが得られた。 特定の細胞コンパートメントを文献記載の酵素的または化学的アッセイを用い
て検出した（Graham前出、p309-333）。
ubcellular organelles and membranes., p161-1019，D. Rickwood編、Centrifu
gation，a practical approach；第２版、IRL Press，Washington DC）。懸濁液
中のＬ１２１０、Ａ５４９またはＨＲＴＥＣ細胞（３×１０6細胞／ml、１００ μl）を３７℃で種々の時間に渡り、125Ｉ−標識ＭＡＬ、ＡＬＡまたはＩｇＧ１
×１０6cpmとともにインキュベートした。細胞を３回氷冷ＰＢＳで洗浄し、上澄
みを傾瀉した。細胞をホモジナイズ用緩衝液（１０mM トリス塩酸、ｐＨ７.８、
５mM ＭｇＣｌ2および２mM ＣａＣｌ2をＬ１２１０用、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、２
mM ＥＤＴＡ、ｐＨ７.５をＡ５４９細胞用とした）５００μl中に懸濁し、ペス トルサイズ４１５のDounceホモジナイザー（Thomas，Philadelphia，USA）中５ ０ストロークでホモジナイズした。スクロースを終濃度２５０mmで添加し、ホモ
ジネートを室温で２５分間１００×ｇで遠心分離した。最初のペレットには核、
大型ミトコンドリアおよび原形質膜の大型のシート状物が含有されていた。残り
の上澄みを更に４℃で３０分間１２０００×ｇで遠心分離して得られた第２のペ
レットはミトコンドリア原形質内網状組織、原形質膜および細胞小器官を含有し
ていた。上澄みを最終的に４℃で２時間１５００００×ｇで遠心分離することに
より、小胞体、原形質内網状組織を含有するペレットおよびシトゾル蛋白を含有
する上澄みが得られた。 特定の細胞コンパートメントを文献記載の酵素的または化学的アッセイを用い
て検出した（Graham前出、p309-333）。
【００５４】 ＤＮＡおよびＲＮＡは臭化エチジウムの結合により画分内で検出した。試料（
１容）をヘパリン溶液（２５μg／ml）１容およびＰＢＳ１mlと、または、ヘパ リン１容、ＲＮＡｓｅＡ（５０μg／ml）１容およびＰＢＳ１容と混合した。試 料を２０分間３７℃でインキュベートし、臭化エチジウム１容を添加した（２５
μg／ml）。６０秒間インキュベートした後に３６０nmの励起波長および５８０n
mの発光波長を用いて蛍光を測定した。ＰＢＳをブランクとし、ＰＢＳ４容中の ホモジネート１容をバックグラウンド補正ファクターとし、蛍光をＤＮＡ標準物
質（λＤＮＡ２５μg／nl）と比較した。
１容）をヘパリン溶液（２５μg／ml）１容およびＰＢＳ１mlと、または、ヘパ リン１容、ＲＮＡｓｅＡ（５０μg／ml）１容およびＰＢＳ１容と混合した。試 料を２０分間３７℃でインキュベートし、臭化エチジウム１容を添加した（２５
μg／ml）。６０秒間インキュベートした後に３６０nmの励起波長および５８０n
mの発光波長を用いて蛍光を測定した。ＰＢＳをブランクとし、ＰＢＳ４容中の ホモジネート１容をバックグラウンド補正ファクターとし、蛍光をＤＮＡ標準物
質（λＤＮＡ２５μg／nl）と比較した。
【００５５】 ４℃で３分間、試料（０.５ml）をＨ2Ｏ2（０.５ml）と混合することによりカ
タラーゼ活性を測定した。Ｈ2ＳＯ4（０.１ml）を添加して反応を停止し、ＫＭ ｎＯ4（０.７ml）を添加して試料の光学密度を１分間以内に４８０nmで測定した
。 アルカリホスファターゼ活性は試料５０μlをアッセイ混合物（１６mM ｐ−ニ
トロフェニルホスフェート溶液５ml、５０mMホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９. ５）５mlおよび１Ｍ ＭｇＣｌ2 ２０μl）２００μlと混合し、６０分間３７℃ でインキュベートすることにより検出した。吸光度を４１０nmで測定した。
タラーゼ活性を測定した。Ｈ2ＳＯ4（０.１ml）を添加して反応を停止し、ＫＭ ｎＯ4（０.７ml）を添加して試料の光学密度を１分間以内に４８０nmで測定した
。 アルカリホスファターゼ活性は試料５０μlをアッセイ混合物（１６mM ｐ−ニ
トロフェニルホスフェート溶液５ml、５０mMホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９. ５）５mlおよび１Ｍ ＭｇＣｌ2 ２０μl）２００μlと混合し、６０分間３７℃ でインキュベートすることにより検出した。吸光度を４１０nmで測定した。
【００５６】 125Ｉ−標識ＭＡＬの分布および種々の細胞コンパートメント内の取りこみの 速度過程を図４に示す。ビオチニル化ＭＡＬを用いた場合と同様、細胞の種類の
間で125Ｉ−標識ＭＡＬの核局在化には相違が認められた。ＭＡＬはＬ１２１０ 細胞の核内に蓄積し、総放射能の約７８％（３４２００／４４０００）が６時間
後に核画分（Ｐ１）から回収された。ＨＲＴＥＣ細胞核へのＭＡＬの取りこみは
緩やかであり、インキュベーション２４時間後に核画分中には総細胞結合放射能
の僅か１６％（２２００／１４０００）のみ認められた。Ａ５４９細胞は中間の
結果を示し、２４時間後には核画分中約５２％の125Ｉ−標識ＭＡＬが認められ た（１３７００／２７０００）。同程度の相違は、他の細胞下画分中の細胞結合
ＭＡＬの総量については、細胞の種類の間で認められなかった。最終測定時にお
いて、Ｌ１２１０、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細胞のペレット２中にはそれぞれ
４５００cpm（１０％）、５１００cpm（１９５）および２１００cpm（１５％） が検出され、そして、ペレット３中には８００cpm（２％）、１４００cpm（５％
）および１１００cpm（８％）が検出され、そして、シトソル画分中には４５０ ０cpm（１０％）、６８００cpm（２５％）および８６００cpm（６１％）が検出 された。
間で125Ｉ−標識ＭＡＬの核局在化には相違が認められた。ＭＡＬはＬ１２１０ 細胞の核内に蓄積し、総放射能の約７８％（３４２００／４４０００）が６時間
後に核画分（Ｐ１）から回収された。ＨＲＴＥＣ細胞核へのＭＡＬの取りこみは
緩やかであり、インキュベーション２４時間後に核画分中には総細胞結合放射能
の僅か１６％（２２００／１４０００）のみ認められた。Ａ５４９細胞は中間の
結果を示し、２４時間後には核画分中約５２％の125Ｉ−標識ＭＡＬが認められ た（１３７００／２７０００）。同程度の相違は、他の細胞下画分中の細胞結合
ＭＡＬの総量については、細胞の種類の間で認められなかった。最終測定時にお
いて、Ｌ１２１０、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細胞のペレット２中にはそれぞれ
４５００cpm（１０％）、５１００cpm（１９５）および２１００cpm（１５％） が検出され、そして、ペレット３中には８００cpm（２％）、１４００cpm（５％
）および１１００cpm（８％）が検出され、そして、シトソル画分中には４５０ ０cpm（１０％）、６８００cpm（２５％）および８６００cpm（６１％）が検出 された。
【００５７】 ビオチニル化ＡＬＡを用いたこれらの結果を125Ｉ−標識ＡＬＡを用いて確認 した。単量体蛋白はＭＡＬよりも低い効率で細胞に侵入し、主にシトソルから回
収され、核からは回収されなかった（図５）。Ｌ１２１０、Ａ５４９およびＨＲ
ＴＥＣ細胞における125Ｉ−標識ＡＬＡの核取りこみは、対応する細胞種の125Ｉ
−標識ＭＡＬで観察された値の２３％、２７％および３７％であった。放射標識
ＡＬＡの細胞質の局在化は放射標識ＭＡＬで測定された量の８０％、７５％およ
び６０％であった。 ビオチニル化および125Ｉ−標識ＭＡＬを用いて行った細胞局在化試験によれ ば、ＭＡＬは核内に輸送され、ＭＡＬの種々の細胞への核取りこみはＭＡＬ−誘
発アポトーシスへのそれらの感受性に比例していることが示唆された。
収され、核からは回収されなかった（図５）。Ｌ１２１０、Ａ５４９およびＨＲ
ＴＥＣ細胞における125Ｉ−標識ＡＬＡの核取りこみは、対応する細胞種の125Ｉ
−標識ＭＡＬで観察された値の２３％、２７％および３７％であった。放射標識
ＡＬＡの細胞質の局在化は放射標識ＭＡＬで測定された量の８０％、７５％およ
び６０％であった。 ビオチニル化および125Ｉ−標識ＭＡＬを用いて行った細胞局在化試験によれ ば、ＭＡＬは核内に輸送され、ＭＡＬの種々の細胞への核取りこみはＭＡＬ−誘
発アポトーシスへのそれらの感受性に比例していることが示唆された。
【００５８】 実施例５ 単離した核に対するＭＡＬ複合体の作用 核をＬ１２１０、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細胞から精製し、低濃度のＭＡＬ
（０.２および０.４mg／ml）とともにインキュベートした。ＨＭＷおよびオリゴ
ヌクレオソーム長ＤＮＡ断片の形成を検討した。 Ａ５４９、Ｌ１２１０およびＨＲＴＥＣの核をホモジナイズした細胞から単離
した。ホモジナイズにより得られたペレット１を１００×ｇで２０分間核緩衝液
中で２回洗浄し、核緩衝液に懸濁して実験に供した。ラット肝核を単離した。
（０.２および０.４mg／ml）とともにインキュベートした。ＨＭＷおよびオリゴ
ヌクレオソーム長ＤＮＡ断片の形成を検討した。 Ａ５４９、Ｌ１２１０およびＨＲＴＥＣの核をホモジナイズした細胞から単離
した。ホモジナイズにより得られたペレット１を１００×ｇで２０分間核緩衝液
中で２回洗浄し、核緩衝液に懸濁して実験に供した。ラット肝核を単離した。
【００５９】 懸濁液中のＡ５４９、Ｌ１２１０およびＨＲＴＥＣの核を２４穴プレートの個
々のウエルに入れ（９００μl）、ＭＡＬ、α−ラクトアルブミン、ラクトフェ リンまたはＢＳＡ（核緩衝液中１００μl）と混合し、３７℃で１時間（Ｌ１２ １０）または２時間（Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ）インキュベートし、吸引して
回収し、上記した通りＤＮＡの断片化について分析した。ＤＮＡ断片化の抑制は
、核を１０分間室温で、０.５mM ＥＤＴＡ、１０μM ＢＡＰＴＡ／ＡＭ、１０μ
M ベラパミル、１μM ＶＡＤ、０.２５μM ＢＯＣ、０.５μg／mlカルペプチン 、０.５μM ＤＣＩと共に予備インキュベートすることにより調べた。
々のウエルに入れ（９００μl）、ＭＡＬ、α−ラクトアルブミン、ラクトフェ リンまたはＢＳＡ（核緩衝液中１００μl）と混合し、３７℃で１時間（Ｌ１２ １０）または２時間（Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ）インキュベートし、吸引して
回収し、上記した通りＤＮＡの断片化について分析した。ＤＮＡ断片化の抑制は
、核を１０分間室温で、０.５mM ＥＤＴＡ、１０μM ＢＡＰＴＡ／ＡＭ、１０μ
M ベラパミル、１μM ＶＡＤ、０.２５μM ＢＯＣ、０.５μg／mlカルペプチン 、０.５μM ＤＣＩと共に予備インキュベートすることにより調べた。
【００６０】 能動核取りこみをAdams等の方法（（1990）前出）に多少の修正を加えて実施 した。 即ち、１×１０6細胞を、室温で５分間、ロイペプチン、アプロチニン、アン チパインの各々１μg／mlおよびジギトニン４０μg／mlを添加した核輸送緩衝液
（ＮＴＢ）１００μl中でインキュベートし、ＮＴＢ中１０分間３２０×ｇで遠 心分離することにより洗浄した。ビオチニル化蛋白（５μl、５mg／ml）を、ホ スホクレアチンクレアチン、ホスホキナーゼおよびＡＴＰを添加した総量１００
μlのＮＴＢ中の細胞に添加し、室温で種々の時間インキュベートし、１０分間 ３２０×ｇで遠心分離することによりＮＴＢ中２回洗浄した。細胞を６分間ＮＴ
Ｂ中０.２％Triton-X100で処理し、洗浄し、最後に、１：１００希釈フルオレセ
インコンジュゲートストレプトアビジンを室温で３０分間添加し、洗浄した。次
に細胞をNikon Microphot（Japan）顕微鏡による蛍光顕微鏡観察により、または
、BioRad MRC-1024機器においてレーザー走査共焦点顕微鏡観察により検査した 。 低い程度の自発的ＤＮＡ断片化が３種類の細胞に由来する未刺激の核で観察さ
れたが、ＭＡＬは１時間後にはＨＭＷ ＤＮＡ断片の、そして、２時間後にはオ リゴヌクレオソーム長断片の形成を増強していた（図６）。
（ＮＴＢ）１００μl中でインキュベートし、ＮＴＢ中１０分間３２０×ｇで遠 心分離することにより洗浄した。ビオチニル化蛋白（５μl、５mg／ml）を、ホ スホクレアチンクレアチン、ホスホキナーゼおよびＡＴＰを添加した総量１００
μlのＮＴＢ中の細胞に添加し、室温で種々の時間インキュベートし、１０分間 ３２０×ｇで遠心分離することによりＮＴＢ中２回洗浄した。細胞を６分間ＮＴ
Ｂ中０.２％Triton-X100で処理し、洗浄し、最後に、１：１００希釈フルオレセ
インコンジュゲートストレプトアビジンを室温で３０分間添加し、洗浄した。次
に細胞をNikon Microphot（Japan）顕微鏡による蛍光顕微鏡観察により、または
、BioRad MRC-1024機器においてレーザー走査共焦点顕微鏡観察により検査した 。 低い程度の自発的ＤＮＡ断片化が３種類の細胞に由来する未刺激の核で観察さ
れたが、ＭＡＬは１時間後にはＨＭＷ ＤＮＡ断片の、そして、２時間後にはオ リゴヌクレオソーム長断片の形成を増強していた（図６）。
【００６１】 ジギトニンは原形質膜に透過性を付与するが、核膜は未損傷のままとする。Ｌ
１２１０、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細胞を核輸送緩衝液中のジギトニンで透過
性付与し、洗浄し、ホスホクレアチン、クレアチンホスホキナーゼおよびＡＴＰ
を添加した緩衝液中のビオチニル化ＭＡＬに曝露した。ヒトＩｇＧおよび単量体
α−ラクトアルブミンを対照群として用いた。ＭＡＬはジギトニン処理細胞の核
に直接取りこまれ、最大濃度は２０分後に観察された（図７ｅ）。
１２１０、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細胞を核輸送緩衝液中のジギトニンで透過
性付与し、洗浄し、ホスホクレアチン、クレアチンホスホキナーゼおよびＡＴＰ
を添加した緩衝液中のビオチニル化ＭＡＬに曝露した。ヒトＩｇＧおよび単量体
α−ラクトアルブミンを対照群として用いた。ＭＡＬはジギトニン処理細胞の核
に直接取りこまれ、最大濃度は２０分後に観察された（図７ｅ）。
【００６２】 ジギトニン透過性付与細胞にＭＡＬ０.４mg／mlを添加したところ、ＨＭＷ ＤＮＡ断片が１時間後、オリゴヌクレオソーム断片が２時間後に形成した。ＡＬ
Ａはその分子量（１４kDa）から推定された通りジギトニン透過性付与細胞の核 に侵入し、核を明確に染色した（図７ｃ）。ＩｇＧは単離された核中やジギトニ
ン透過性付与細胞の核中には検出されなかった（図７ａ）。
Ａはその分子量（１４kDa）から推定された通りジギトニン透過性付与細胞の核 に侵入し、核を明確に染色した（図７ｃ）。ＩｇＧは単離された核中やジギトニ
ン透過性付与細胞の核中には検出されなかった（図７ａ）。
【００６３】 これらの実験によれば、ＡＬＡとＭＡＬは共に核に輸送されるが、ＭＡＬのみ
が単離された核でのＤＮＡ断片化を、明らかに活性化細胞質の非存在下に、誘発
することができることが示された。しかしながら、３種類の細胞の核の間にはＭ
ＡＬ-誘発ＤＮＡ断片化への感受性には差は無かった。このことは、ＭＡＬへの 異なる感受性は、核そのものへの作用よりはむしろ核標的設定過程により決定さ
れることを示唆している。
が単離された核でのＤＮＡ断片化を、明らかに活性化細胞質の非存在下に、誘発
することができることが示された。しかしながら、３種類の細胞の核の間にはＭ
ＡＬ-誘発ＤＮＡ断片化への感受性には差は無かった。このことは、ＭＡＬへの 異なる感受性は、核そのものへの作用よりはむしろ核標的設定過程により決定さ
れることを示唆している。
【００６４】 実施例６ ＭＡＬの核取りこみのための核孔複合体の役割 ヌクレオポリンに結合し、核孔を通るインポルチン−蛋白複合体の輸送を抑制
する小麦胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）を用いて、ジギトニン処理細胞において核
孔を超える能動輸送の役割を調べた。ジギトニン透過性付与Ｌ１２１０細胞を２
０分間ＷＧＡ ５０μg／mlとともに予備インキュベートし、洗浄し、ビオチニル
化ＭＡＬに曝露した。ＩｇＧおよびα−ラクトアルブミンを対照として用いた（
図７）。
する小麦胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）を用いて、ジギトニン処理細胞において核
孔を超える能動輸送の役割を調べた。ジギトニン透過性付与Ｌ１２１０細胞を２
０分間ＷＧＡ ５０μg／mlとともに予備インキュベートし、洗浄し、ビオチニル
化ＭＡＬに曝露した。ＩｇＧおよびα−ラクトアルブミンを対照として用いた（
図７）。
【００６５】 詳細には、ビオチニル化蛋白を添加する前に、細胞を小麦胚芽アグルチニン（
ＷＧＡ）５０μg／ml、０.５mM ＥＤＴＡ、０.５mM ＢＡＰＴＡ／ＡＭまたは１ ０μMベラパミルと共に２０分間室温で予備インキュベートした。細胞をＷＧＡ で予備処理し、次に１０分間３２０×ｇでＮＴＢ中遠心分離することにより洗浄
し、その後、蛋白を添加した。
ＷＧＡ）５０μg／ml、０.５mM ＥＤＴＡ、０.５mM ＢＡＰＴＡ／ＡＭまたは１ ０μMベラパミルと共に２０分間室温で予備インキュベートした。細胞をＷＧＡ で予備処理し、次に１０分間３２０×ｇでＮＴＢ中遠心分離することにより洗浄
し、その後、蛋白を添加した。
【００６６】 抗核抗体を含有する血清をジギトニンおよびＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で透過性
付与した細胞に添加し、その後、室温で３０分間抗ヒトＩｇＧ抗体（１：１００
）とともにインキュベートし、１０分間３２０×ｇで遠心分離することにより洗
浄し、そして上記した通り可視化することにより核膜の一体性を調べた。Triton
-X100による透過性付与では明らかな核の染色が認められたのに対し、ジギトニ ン４０μg／mlの濃度でジギトニン透過性付与した細胞では検知可能な染色は観 察されなかった。（抗体はClinical Immunology Laboratory，Lundにより提供さ
れた。）
付与した細胞に添加し、その後、室温で３０分間抗ヒトＩｇＧ抗体（１：１００
）とともにインキュベートし、１０分間３２０×ｇで遠心分離することにより洗
浄し、そして上記した通り可視化することにより核膜の一体性を調べた。Triton
-X100による透過性付与では明らかな核の染色が認められたのに対し、ジギトニ ン４０μg／mlの濃度でジギトニン透過性付与した細胞では検知可能な染色は観 察されなかった。（抗体はClinical Immunology Laboratory，Lundにより提供さ
れた。）
【００６７】 ＷＧＡはＭＡＬの核取り込みを完全にブロックし、輸送が核孔複合体を介した
ものであることが示唆された（図７ｆ）。ヒトＩｇＧはＷＧＡの存在下および不
存在下において取りこまれなかった（図７ａおよび７ｂ）。単量体のα−ラクト
アルブミンは核膜を超えて自由拡散する１４kDaの蛋白である。ＷＧＡはジギト ニン処理細胞の核へのα−ラクトアルブミンの取りこみに対して作用を有さなか
った（図７ｄ）。小麦胚芽アグルチニンを用いて更に、単離核およびジギトニン
透過性付与細胞におけるＤＮＡ断片化を抑制した。ＷＧＡ ５０μg／mlと共に予
備インキュベートすることにより、ＭＡＬ ０.４mg／mlへの曝露によりＤＮＡの
断片化が部分的にブロックされた（図６）。
ものであることが示唆された（図７ｆ）。ヒトＩｇＧはＷＧＡの存在下および不
存在下において取りこまれなかった（図７ａおよび７ｂ）。単量体のα−ラクト
アルブミンは核膜を超えて自由拡散する１４kDaの蛋白である。ＷＧＡはジギト ニン処理細胞の核へのα−ラクトアルブミンの取りこみに対して作用を有さなか
った（図７ｄ）。小麦胚芽アグルチニンを用いて更に、単離核およびジギトニン
透過性付与細胞におけるＤＮＡ断片化を抑制した。ＷＧＡ ５０μg／mlと共に予
備インキュベートすることにより、ＭＡＬ ０.４mg／mlへの曝露によりＤＮＡの
断片化が部分的にブロックされた（図６）。
【００６８】 実施例７ ＭＡＬの核取りこみのための、そして、ＤＮＡ断片化の誘発のための、Ｃａ2+の
役割 ＭＡＬ誘発アポトーシスは細胞外Ｃａ2+を必要とすることが以前明らかにされ
た。このことは、ＭＡＬが細胞核に到達した後に、Ｃａ2+が核取りこみまたはＤ
ＮＡ断片化誘発の機序に影響する可能性があることを示唆している。Ｌ１２１０
、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細胞を、Ｃａ2+取りこみ抑制剤（ベラパミルおよび
ニフィジピン）と共に、細胞外Ｃａ2+−キレート形成剤（ＥＤＴＡおよびＥＧＴ
Ａ）と共に、そして、細胞内Ｃａ2+−キレート形成剤（ＢＡＰＴＡ／ＡＭ）と共
に予備インキュベートした。125Ｉ−標識ＭＡＬを細胞に添加し、Ｌ１２１０細 胞では６時間後、そして、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細胞では２４時間後に核取
りこみを調べた。Ｃａ2+取りこみ抑制剤およびキレート形成剤はＭＡＬの核取り
こみに対する作用を有さなかった（図８）。その後、対照群核およびＣａ2+抑制
剤と共にインキュベートした核において、ＭＡＬ誘発ＤＮＡ断片化を調べた。ベ
ラパミル、ＥＤＴＡおよびＢＡＰＴＡ／ＡＭはＬ１２１０およびＡ５４９の核に
おいてＤＮＡ断片化を完全にブロックした。これらの結果は、ＭＡＬによるＤＮ
Ａ断片化はＣａ2+を必要とするが、ＭＡＬの核取りこみはＣａ2+非依存性であっ
たことを示している。
役割 ＭＡＬ誘発アポトーシスは細胞外Ｃａ2+を必要とすることが以前明らかにされ
た。このことは、ＭＡＬが細胞核に到達した後に、Ｃａ2+が核取りこみまたはＤ
ＮＡ断片化誘発の機序に影響する可能性があることを示唆している。Ｌ１２１０
、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細胞を、Ｃａ2+取りこみ抑制剤（ベラパミルおよび
ニフィジピン）と共に、細胞外Ｃａ2+−キレート形成剤（ＥＤＴＡおよびＥＧＴ
Ａ）と共に、そして、細胞内Ｃａ2+−キレート形成剤（ＢＡＰＴＡ／ＡＭ）と共
に予備インキュベートした。125Ｉ−標識ＭＡＬを細胞に添加し、Ｌ１２１０細 胞では６時間後、そして、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細胞では２４時間後に核取
りこみを調べた。Ｃａ2+取りこみ抑制剤およびキレート形成剤はＭＡＬの核取り
こみに対する作用を有さなかった（図８）。その後、対照群核およびＣａ2+抑制
剤と共にインキュベートした核において、ＭＡＬ誘発ＤＮＡ断片化を調べた。ベ
ラパミル、ＥＤＴＡおよびＢＡＰＴＡ／ＡＭはＬ１２１０およびＡ５４９の核に
おいてＤＮＡ断片化を完全にブロックした。これらの結果は、ＭＡＬによるＤＮ
Ａ断片化はＣａ2+を必要とするが、ＭＡＬの核取りこみはＣａ2+非依存性であっ
たことを示している。
【図１Ａ】 種々の時間に渡りインキュベートされたＭＡＬの種々の濃度による３種の細胞
のインキュベーションに関する生存性試験の結果を示す。
のインキュベーションに関する生存性試験の結果を示す。
【図１Ｂ−Ｉ】 電場反転ゲル電気泳動により測定した種々の時点におけるこれらの細胞におけ
るＭＡＬにより誘発された染色質の開裂を示す。
るＭＡＬにより誘発された染色質の開裂を示す。
【図１Ｂ−II】 従来のゲル電気泳動で分析したオリゴヌクレオソーム長ＤＮＡ断片化を示す。
【図２Ａ】 共焦点顕微鏡観察により可視化したビオチニル化ＭＡＬ（ｄ）およびα−ラク
トアルブミン（ｃ）と対照のストレプトアビジン（ａ）およびＩｇＧ（ｂ）の細
胞表面結合を示す。
トアルブミン（ｃ）と対照のストレプトアビジン（ａ）およびＩｇＧ（ｂ）の細
胞表面結合を示す。
【図２Ｂ】 漸増濃度の放射標識ＭＡＬ（−◇−）、ＡＬＡ（−□−）またはＩｇＧ（−○
−）に３０分曝露した後のＬ１２１０、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細胞における
細胞結合放射能を示す。
−）に３０分曝露した後のＬ１２１０、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細胞における
細胞結合放射能を示す。
【図３】 Ａ５４９細胞の種々の細胞コンパートメントとのＭＡＬの相互作用を示すもの
である。
である。
【図４】 Ｌ１２１０、Ａ５４９およびＨＲＴＥＣ細胞における種々の細胞下コンパート
メントへの125Ｉ−標識ＭＡＬの局在化を示す。
メントへの125Ｉ−標識ＭＡＬの局在化を示す。
【図５】 ＭＡＬとＡＬＡとの間の細胞下分布における差を示す。
【図６】 ＭＡＬ ０.４mg／mlと共に２時間インキュベートした後のＬ１２１０、Ａ５４
９およびＨＲＴＥＣの核におけるＭＡＬ誘発染色質開裂を示す。
９およびＨＲＴＥＣの核におけるＭＡＬ誘発染色質開裂を示す。
【図７】 ジギトニン予備処理Ａ５４９細胞の核へのＭＡＬ、ＡＬＡおよびＩｇＧの核取
り込みを示す。
り込みを示す。
【図８】 Ｃａ2+抑制剤で処理した後のＭＡＬの細胞下分布の作用を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 51/00 Ａ６１Ｐ 35/00 47/42 Ａ６１Ｋ 37/02 Ａ６１Ｐ 35/00 43/00 49/02 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 カタリーナ・スヴァンボルイ スウェーデン国エス−223 62ルンド．セ ールヴェガータン23．ユニヴァーシティ・ オブ・ルンド．デパートメント・オブ・ラ ボラトリー・メディスン．ディヴィジョ ン・オブ・クリニカル・イミュノロジー (72)発明者 ペル・アンダーシュ・ホーカンソン スウェーデン国エス−223 54ルンド．フ ロールマンスガータン２アー Ｆターム(参考） 4C076 AA06 AA11 AA17 AA95 BB01 CC26 CC27 EE41 EE59 FF04 FF11 FF16 FF68 4C084 AA02 AA03 AA12 BA44 CA38 DA27 MA02 MA52 NA05 NA13 ZB211 ZB261 4C085 AA11 AA14 AA21 HH03 JJ02 KA29 KB18 KB57 LL18
Claims (19)
- 【請求項１】 α−ラクトアルブミンのオリゴマー型（ＭＡＬ）およびＭＡ
Ｌに対して感受性である細胞の核質に運搬されるようにＭＡＬと組み合わせられ
た別の試薬からなる蛋白複合体からなる薬剤。 - 【請求項２】 別の試薬がコンジュゲート形成によりＭＡＬに結合した請求
項１記載の薬剤。 - 【請求項３】 別の試薬が共有結合によりＭＡＬに結合した請求項１記載の
薬剤。 - 【請求項４】 別の試薬が連結またはスペーサー基によりＭＡＬに共有結合
した請求項３記載の薬剤。 - 【請求項５】 別の試薬がＭＡＬに融合したポリペプチドまたは蛋白からな
る請求項１記載の薬剤。 - 【請求項６】 別の試薬が細胞毒、微生物毒または抗体である請求項１〜５
の何れか一項に記載の薬剤。 - 【請求項７】 別の試薬がモノクローナル抗体からなる請求項６記載の薬剤
。 - 【請求項８】 別の試薬が標識剤からなる請求項１〜５の何れか一項に記載
の薬剤。 - 【請求項９】 標識剤がビオチンまたは放射性標識である請求項８記載の薬
剤。 - 【請求項１０】 125Ｉ、14Ｃまたは35Ｓからなる放射性標識を有する請求 項９記載の薬剤。
- 【請求項１１】 製薬上許容しうる担体または賦形剤と共に請求項１〜１０
の何れか一項に記載の薬剤を含有する医薬組成物。 - 【請求項１２】 局所使用のための溶液またはクリームの形態である請求項
１１記載の組成物。 - 【請求項１３】 経口投与に適合した請求項１３記載の組成物。
- 【請求項１４】 癌の治療における請求項１〜７の何れか一項に記載の薬剤
の使用。 - 【請求項１５】 癌の診断における請求項８〜１０の何れか一項に記載の薬
剤の使用。 - 【請求項１６】 癌の診断または治療のための医薬の調製のための請求項１
〜１０の何れか一項に記載の薬剤の使用。 - 【請求項１７】 請求項１〜１０の何れか一項に記載の薬剤または請求項１
１〜１３の何れか一項に記載の組成物を癌細胞に投与することからなる癌の治療
方法。 - 【請求項１８】 請求項１〜１０の何れか一項に記載の薬剤を癌の疑いのあ
る細胞に適用すること、および、細胞の核内への薬剤の浸透を観察することから
なる癌の診断方法。 - 【請求項１９】 患者より単離した試料に対し、in vitroで実施する請求項
１８記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9725126.8A GB9725126D0 (en) | 1997-11-27 | 1997-11-27 | Therapeutic agents |
| GB9725126.8 | 1997-11-27 | ||
| PCT/IB1998/001920 WO1999027967A1 (en) | 1997-11-27 | 1998-11-23 | Therapeutic agents |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001524535A true JP2001524535A (ja) | 2001-12-04 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000522952A Abandoned JP2001524535A (ja) | 1997-11-27 | 1998-11-23 | 治療剤 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1032426A1 (ja) |
| JP (1) | JP2001524535A (ja) |
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| GB (1) | GB9725126D0 (ja) |
| WO (1) | WO1999027967A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007524708A (ja) * | 2004-02-26 | 2007-08-30 | ハムレット・ファルマ・アーベー | 血管新生を阻害するラクトアルブミン |
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|---|---|---|---|---|
| US20030077255A1 (en) * | 2001-04-16 | 2003-04-24 | Sabharwal Hemant K. | Compositions of bacteria and alpha-lactalbumin and uses thereof |
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| DK2385954T3 (da) | 2009-01-09 | 2013-06-17 | Hamlet Pharma Ab | Kompleks og fremstillingsproces |
| EP2643010B1 (en) | 2010-11-24 | 2016-11-16 | HAMLET Pharma AB | Biologically active complex and its preparation |
| WO2014008465A2 (en) | 2012-07-05 | 2014-01-09 | The Research Foundation For The State University Of New York | Potentiation of antibiotic treatment with a protein-lipid complex |
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|---|---|---|---|---|
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| US6455673B1 (en) * | 1994-06-08 | 2002-09-24 | President And Fellows Of Harvard College | Multi-mutant diphtheria toxin vaccines |
| ES2136206T3 (es) * | 1994-08-16 | 1999-11-16 | Hemant Sabharwal | Composicion antibacteriana que contiene alfalactalbumina multimerica. |
| US5614191A (en) * | 1995-03-15 | 1997-03-25 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | IL-13 receptor specific chimeric proteins and uses thereof |
-
1997
- 1997-11-27 GB GBGB9725126.8A patent/GB9725126D0/en not_active Ceased
-
1998
- 1998-11-23 JP JP2000522952A patent/JP2001524535A/ja not_active Abandoned
- 1998-11-23 WO PCT/IB1998/001920 patent/WO1999027967A1/en active Application Filing
- 1998-11-23 EP EP98954689A patent/EP1032426A1/en not_active Withdrawn
- 1998-11-23 US US09/555,270 patent/US6808930B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-23 AU AU11710/99A patent/AU1171099A/en not_active Abandoned
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007524708A (ja) * | 2004-02-26 | 2007-08-30 | ハムレット・ファルマ・アーベー | 血管新生を阻害するラクトアルブミン |
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