JP2001520539A

JP2001520539A - 架橋された生体組織に活性なようにヘパリンを結合させるための方法

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Publication number: JP2001520539A
Application number: JP54388698A
Authority: JP
Inventors: ティンリー，キャサリン; ヤン，ジュン
Original assignee: バクスターインターナショナルインコーポレイテッド
Priority date: 1997-04-16
Filing date: 1998-03-06
Publication date: 2001-10-30
Also published as: AU734370B2; AU6452398A; CA2286900A1; WO1998046288A1; US5891196A; EP0975378A1; CA2286900C

Abstract

(57)【要約】哺乳動物身体内へ移植されるべき生体または合成材料へヘパリンを結合させるための方法。それ自身上に存在するカルボキシル基を十分に有する結合組織タンパク質または他の化合物の場合、本方法は（a）材料をカルボキシル活性化剤と接触させる工程（b）材料をポリアミン化合物と接触させて、先に活性化されたカルボキシル基の部位で、アミド結合ポリアミン側鎖を形成する工程、および（c）材料を、ヘパリンがポリアミン側鎖のアミノ基と結合するように、ヘパリンと接触させる工程、を含む。材料にカルボキシル基が全くないか、または不足している、結合組織タンパク質または他の分子実在物の場合の別の応用において、本方法は（a）ポリアミン化合物のカルボキシル官能基の少なくともいくつかが活性化され、そしてポリアミン化合物上のアミノ基のいくつかと反応して材料の分子構造内に連結されたポリアミンネットワークを形成するように、材料を、ポリアミン化合物上にカルボキシル官能基を有するポリアミン化合物と組み合わせてカルボキシル活性化剤と接触させる工程、および（b）ヘパリンがポリアミンネットワーク上のアミノ基と結合した状態になるように、材料をヘパリンと接触させる工程、を含む。

Description

【発明の詳細な説明】架橋された生体組織に活性なようにヘパリンを結合させるための方法発明の分野本発明は、概してデバイスを製造するための方法に、およびより詳細には改良された生体適合性を有する、外科的に移植可能なバイオプロテーゼを製造するための方法に関する。発明の背景ｉ．生体組織移植片およびプロテーゼコラーゲン、およびより少ない量のエラスチンは、大抵の生体組織の結合組織骨組を構成する主要な結合組織タンパク質である。各生体組織の相対的柔軟性または剛性は、組織に存在するコラーゲンおよびエラスチンの相対的量により、ならびに／または結合組織タンパク質により形成される物理的配置および配座(例えば、構造格子)により、主に決定される。先行技術は、非常に多くの外科的に移植可能なバイオプロテーゼ用移植片およびプロテーゼ(本明細書中以下「バイオプロテーゼ」としてひとまとめに示す)を包含してきており、これらは完全に、または部分的に、化学的に固定された(すなわち、なめされた)生体組織として形成される。これらの生体組織の化学的固定は、代表的には組織を１種以上の化学物質と接触させることにより達成される。この化学物質は、組織内に存在するコラーゲンおよびエラスチン分子と架橋する。そのようなコラーゲンおよびエラスチンの架橋は、組織が、長い用語「患者の身体への移植または接着」を意味する生体デバイスとして、またはそれに組み込まれて使用され得るように、組織を保存するために役に立つ。これまでバイオプロテーゼとして利用されてきた生体材料の例は、心臓弁、血管、皮膚、硬膜、心膜、靱帯、および腱を含む。これらの解剖学上の構造は、代表的にはコラーゲンおよびエラスチンで形成される結合組織マトリックスを含み、そして各組織の細胞性柔組織はその結合組織マトリックス内に配置され、そして結合組織マトリックスにより支持されている。各コラーゲン分子は、渦巻き状に巻いたらせん構造で織り合わされている３個のポリペプチド鎖から成る。生体組織を保存するために使用される化学的定着剤 (すなわちなめし剤)は、所定のコラーゲン分子内でポリペプチド鎖の官能基間で、または隣接したコラーゲン分子の官能基間で化学的架橋を形成する。化学的架橋が、単一のコラーゲンまたはエラスチン分子内で、ポリペプチド鎖間で形成される場合、そのような架橋は「分子内」と呼ばれ、一方異なるコラーゲンまたはエラスチンのポリペプチド鎖間で形成される架橋は「分子間」と呼ばれる。エラスチン繊維は、デスモシンおよびイソデスモシンを含む剛直な架橋により維持される本質的に繊維質のストランド中の、小分子の繰り返し単位の架橋(天然の連結)により構築される。コラーゲン分子のアミノ基間の架橋を形成するために使用されるこれらの化学的定着剤はまた、エラスチン分子のアミノ基間のそのような架橋を形成する傾向がある。しかしながら、大抵の生体組織に存在するエラスチンの量は、生体組織中に存在するコラーゲンの量よりも実質的に少ない。生体組織においてコラーゲンおよび／またはエラスチンを架橋するために、先に利用されてきた化学的定着剤は、以下を含む：ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ジアルデヒド澱粉、ヘキサメチレンジイソシアネート、および特定のポリエポキシ化合物。グルタルアルデヒドは、バイオプロテーゼとなるべき生体組織を固定するために最も広く使用される薬剤であり、現在以下のような多数の市販のグルタルアルデヒド固定バイオプロテーゼデバイスがある：支持枠またはステントを有するブ er Healthcare Corporation；Edwards CVS Division、Irvine、CA 92714-5686) 、金属枠上に取り付けられたウシ心膜組織で形成されたリーフレット(leaflet) を ericardial Bioprosthesis、Baxter Healthcare Corporation、Edwards CVS Div ision、Irvine、CA 92714-5686)、およびステント無しブタ大動脈プロテーゼs AG、Spierstrasse 5、GH6048、Horn、Switzerland)。ｉｉ．生体組織移植片およびプロテーゼの石灰化バイオプロテーゼ用移植片に伴う１つの問題は、それらが移植に続いてインサイチュで石灰化を受ける傾向があることである。そのような石灰化は、バイオプロテーゼの望ましくない硬直化、退化、および早期失敗(premature failure)をもたらす。内因性および外因性石灰化の両方が、生じることが知られているが、そのような石灰化が生じる正確な機構は不明である。化学的に固定された生体プロテーゼ用移植片が石灰化を受ける速度を決定する因子は、完全には解明されていない。しかしながら、石灰化の速度に影響すると考えられる因子には、以下が挙げられる： a）患者の年齢； b）存在する代謝の異常(すなわち、カルシウム過剰血症、糖尿病など)； c）食事の因子(dietary factors)； d）家系； e）感染； f）非経ロカルシウム投与； g）脱水； h）ゆがみ／機械的因子； i）外科的移植に続く第一期の間の不十分な抗凝固治療；および j）宿主組織応答。グルタルアルデヒド固定バイオプロテーゼ用移植片は、非アルデヒド定着剤により固定された移植片よりも早く石灰化することが観察されている。従って、ポリエポキシ化合物のような、非アルデヒド定着剤は、石灰化について改善された (すなわち減少された)傾向を示すバイオプロテーゼ用移植片材料を製造するのに有用であり得る。結合組織タンパク質を架橋するために使用され得るポリエポキシ化合物の例は、以下を含む：エチレン、ポリエチレングリコール、ジグリシジルエーテル(Denacol EX-810、Nagase Chemical，Co.、Osaka、Japan)、およびグリセロールポリグリシジルエーテル(Denacol EX-313、Nagase Chemical，Co.、 Osaka、Japan)。先行技術はまた、多数の報告および出版物を含み、これらは移植された生体組織のインサイチュ石灰化を緩和する技術またはプロセスを記載する趣旨を有する。これらの出版物は以下を含む：米国特許第4,885,005号（Nashefら）表題「石灰化を抑制するための移植可能な生体組織の表面処理」；米国特許第4,648,881 号（Carpentierら）表題「移植可能な生体組織およびそれらを調製するためのプロセス」；米国特許第4,976,733号（Girardot）表題「プロテーゼ石灰化の予防」米国特許第4,120,649号（Schechter）表題「移植」；米国特許第5,002,256号（Carpentier）表題「生体プロテーゼ移植の石灰化緩和」；欧州特許第103947A2 号（Pollockら）表題「移植中の天然組織のミネラル化を抑制するための方法」、およびW084/01879（Nashefら）表題「石灰化を抑制するための移植可能な生体組織の表面処理」；ならびに、Yi，D.、Liu，W.、Yang，J.、Wang，B.、Dong，G .、およびTan，H.；心臓バイオプロテーゼにおける石灰化の機構および抗石灰化の研究 17〜22頁、Proceedings of Chinese Tissue Valve Conferense．Beijing 、China、1995年６月。ｉｉｉ．組織移植片およびプロテーゼの生体適合性固定された生体組織の全体的な生体適合性(例えば、抗原性、および免疫原性) は、その組織の移植後石灰化の重篤性に明らかに影響を及ぼし得、そしてまた、血小板活性化、血餅形成、局所的炎症、および／または移植片欠損(failure)のような、他の望ましくない移植後合併症または後遺症の発生における因子であり得る。固定された生体組織の生体適合性(例えば、抗原性および／または免疫原性)は、組織の化学的構成(すなわち、表面抗原の存在)、組織の固定に使用された化学的定着剤の型、および固定化の間使用された特定の方法および条件(すなわち、結合組織タンパク質の化学的架橋)に大きく依存する。化学的に固定された生体移植片および／またはプロテーゼの移植に続くことが知られている、生体適合性に関連した問題は、以下を含み得る：局所的組織炎症、血小板凝集、宿主拒絶、および／または移植片もしくはプロテーゼの分解。石灰化のように、生体適合性の欠如もまた、望ましくない移植後合併症または後遺症をもたらし得る。生体移植片またはプロテーゼの非生体適合性による血餅形成に対する可能性を減らすために提唱された方法の１つは、ヘパリンの抗凝固性質が引き続き起こる血餅形成を予防または抑止するように、移植された生体組織のコラーゲンおよび／またはエラスチンにヘパリンを結合させることである。ヘパリンは、L-イズロン酸2-硫酸塩および2-デオキシ-2-スルホアミノグルコース6-硫酸塩の交互に並んだ残基からなる多糖類である。ヘパリンの抗凝固性質は、おそらくはヘパリン分子が血漿中のトロンビンおよび抗トロンビンに、それらの引き続き起こる組合せを促進する様式で、結合することによる。ヘパリンはまた、リポタンパク質リパーゼが細胞表面に結合された状態になることを引き起こすことにより、液体代謝に影響を及ぼし得る。ヘパリンは、共有結合またはイオン結合で、コラーゲンまたはエラスチンに結合し得る。イオン性のアプローチにおいて、ヘパリンは最初にプロタミンにイオン結合してヘパリン-プロタミン複合体を形成する。次いで、ヘパリン-プロタミン複合体がコラーゲンまたはエラスチンマトリックス内へ導入される。結果として、ヘパリンは移植片から血流中へゆっくりと放出される。そのようなヘパリンの管腔移植片(例えば、管状血管移植片)からのゆっくりとした放出は、移植片の管腔の内皮化(endothelialization)を促進し得る。ヘパリンをバイオプロテーゼ材料に結合させるかまたは適用するための方法を記載した特許および特許出願には、以下が挙げられる：米国特許第4,690,973号、医薬的使用のための抗血栓形成性および抗接着材料の生成プロセス(Nobishiki Y.、Kodaira K.、Furuse M.、Miyata T.、Miyamoto T.、およびIto H.)1987年９月１日刊行；米国特許第4,704,131号、医用材料(Noishiki Y.、およびMiyata T.)1987年11月３日刊行；米国特許第4,806,595号、抗血栓形成性医薬材料の調製方法(Noishiki Y.、Kodaira K.、Furuse M.、およびMiyata T.)1989年２月21日刊行。また、以下の出版物もヘパリンをバイオプロテーゼ材料に結合させるかまたは適用するための方法を記載している：Noishiki Y.、Nagaoka S.、Kikuchi T .、およびMori Y.、「ヘパリン化した多孔性ポリマーの血管移植片への応用」Tr ans ASAIO 27:213〜218、1981年；Miyata T.、Noishiki Y.、Matsumae M.、およびYamane Y.、「生体材料に抗血栓形成性を与えるための新方法、および血管移植片へのその成功する応用」Trans ASAIO 29：363〜368、1983年；Noishiki Y .、およびMiyata T.、「ヘパリン徐放性抗接着コラーゲン膜」The 11^th Annual Meeting of the Society for Biomaterials、99頁、San Diego、1985年４月25〜 28日；Noishiki Y.、およびMiyata T.、「小内径のヘパリン-プロタミン-コラーゲン血管移植片の成功した動物研究」Trans ASAIO 31：102〜106、1985年；No． ishiki Y.、およびMiyata T.、「生体材料をヘパリン化する(heparinize)ための簡潔な方法」J Biomed Mater Res．20：337〜346、1986年；Noishiki Y.、およびMiyata T.、「ヘパリン徐放性抗接着コラーゲン膜」、J．Bioactive Biocompa tible Polymers 2:325〜333、1987年；Satoh S.、Niu S.、Shirakata S.、Oka T .、およびNoishiki Y.、「小内径の血管置換物としての自家移植結合組織管の開発」、Trans ASAIO 34：655〜660、1988年；Miyata T.、Furuse M.、およびNois hiki Y.、「ヘパリン徐放性生物分解性抗接着コラーゲン膜」The 3^rd World Bio materials Congress、528頁、４月21〜25日、東京、1988年。ヘパリンを化学的に固定された生体組織に共有結合させようと試みるときに生じ得る問題の１つは、固定化プロセスが結合組織タンパク質分子（例えば、コラーゲンおよびエラスチン）の利用可能なアミノ基(NH₂)の大部分を使い果たし得、そのため引き続きヘパリンと結合するアミノ官能基の数が十分に残らないということである。さらに、結合組織タンパク質に残され得るわずかなアミノ官能基 (NH₂)は、引き続き起こるヘパリン結合に、より適さないように位置するか、または配置し得る。先行技術の上記に説明された欠点の観点から、新規の方法論の開発に対する必要性が残されており、それは、a）結合組織タンパク質のアミノ官能基の数および／または利用可能性を増やし、b）利用可能なアミノ基の位置を、引き続くそれらのヘパリンとの結合を促進するように最適化し、そしてc）移植された移植片のより少ない石灰化および／または向上した生体適合性および／または減少された血栓形成性を生じる様式で、ヘパリンが化学的に固定された結合組織タンパク質に結合された状態になることを引き起こす。米国特許第4,378,224号は、石灰化インヒビターが結合されるプロテーゼデバイスの主要な構造的構成要素の３次元マトリクスの作製により、バイオプロテーゼデバイスの生物物理学的安定性を改善するためのコーティングおよび完全な処理を記載する。米国特許第5,134,192号は、基質（これは、好ましくはポリウレタンまたはポリアミドである）を活性化するためのジカルボキシルハライド（例えば、直鎖アルキルジカルボキシルジハライド）の使用を記載する。発明の要旨本発明は、生体プロテーゼ材料の生体適合性を改善し、そして移植された移植片上または移植片内における、移植後の石灰化、血小板活性化、および血栓形成を最小にするための、バイオプロテーゼ材料を処理する方法を提供する。本発明に従って、結合組織タンパク質(単数または複数)（すなわち、コラーゲンおよび／またはエラスチン）を含む生体材料(例えば、心臓弁、血管、皮膚、硬膜、心膜、靱帯、腱など)を活性なようにヘパリン化するための方法が提供され、この方法は一般に以下の工程を包含する： a）生体材料を化学的架橋剤で処理して、生体材料に存在する結合組織タンパク質分子の間に、および／またはその中に、架橋を形成する工程； b）生体材料を、いくつかのカルボキシル(COOH)官能部分を有するポリアミン化合物(例えば、アミノ酸、ペプチド、またはタンパク質)と接触させる工程； c）生体材料をカルボキシル活性化化合物と接触させて、i)結合組織タンパク質分子、および／またはii)ポリアミン分子(例えば、アミノ酸、ペプチド、またはタンパク質)に存在する遊離のカルボキシル(COOH)基の少なくともいくつかを、アミンと反応する化学的な基に変換する工程(例えば、カルボキシル(COOH)基のO-アシルイソウレア基への変換)；および d）ヘパリンが、結合組織タンパク質と直接結合しているか、または機械的に連結しているポリアミン化合物に存在するアミノ(NH₂)基と結合するように、生体材料をヘパリンと接触させる工程。工程bで加えられるポリアミン化合物は、工程cを開始する前に除去され得るか、または代替的に、工程bで加えられる化合物は、工程cのカルボキシル活性化化合物およびヘパリン化されるべき生体材料とともに同時インキュベートされ得る。遊離のカルボキシル(COOH)基が結合組織タンパク質分子に最初に存在している場合の例において、それらのカルボキシル(COOH)基の活性化は、ポリアミン化合物のアミノ(NH₂)基のいくつかと、結合組織タンパク質分子に形成された活性化カルボキシル(o-アシルイソウレア)基との間のペプチド結合の形成をもたらす。あるいは、結合組織タンパク質分子が遊離のカルボキシル(COOH)基を欠いているか、または不足しているが、しかし工程bにおいて使用されるポリアミン化合物がいくつかのカルボキシル基を含んでいる場合の例において、工程cにおいて加えられるカルボキシル活性化化合物は、ポリアミン化合物(例えば、アミノ酸、ペプチド、タンパク質)に存在するカルボキシル(COOH)基の一部または全部を活性化するように働き、それによりポリアミン化合物のアミノ基をポリアミン化合物の活性化カルボキシル(例えば、o-アシルイソウレア)基と引き続き反応させて、結合組織タンパク質分子のまわりに連結されたポリアミンネットワークを形成し、従ってポリアミン分子の結合組織骨組みへの実質的な結合をもたらす。カルボキシル(COOH)官能基を有するポリアミン化合物の、反応し、そして架橋して延長された分子を形成する能力のために、より多くのアミノ基(NH₂)が、その後のヘパリン結合に利用可能になる；そして工程bおよびcの順序は、いくつかの適用において、交換可能であり得る。また、多くの適用において、工程bおよびcは、材料をカルボキシル活性化剤およびポリアミンの混合物と接触させることにより、同時に実行され得る。工程cで使用されるカルボキシル活性化化合物は、カルボキシル(COOH)基を、アミンと反応し得る活性カルボキシル部分(例えば、o-アシルイソウレア基または活性CO^-部分を有する他の基)または他の化学的基のような、アミン反応性中間体に変換する、任意の化合物であり得る。この目的のために使用し得るカルボキシル活性化化合物の好適なクラスは、カルボジイミド(例えば、1-エチル-3-(3- ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC)；ジヘキシルカルボジイミド(DCC)；1-エチル-3-(4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル)カルボジイミドヨージド(EAC)である。本方法の少なくともいくつかの適用において、1-エチル-3- (3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC)が、現在好適なカルボキシル活性化剤である。この目的のために使用可能であり得るカルボキシル活性化化合物の他の型は、以下を含む：イソキサゾリウム誘導体（例えば、N-エチル -5-フェニルイソキサゾリウム-3'-スルホネート(合成、「ウッドワード試薬K」) ；クロロギ酸エステル(例えば、クロロギ酸エチル、またはクロロギ酸p-ニトロフェニル)；カルボニルジイミダゾール(例えば、1,1'-カルボン-イルジイミダゾール)；n-カルバルコキシジヒドロキノリン(n-carbalkoxydihy-droquinolines)( 例えば、n-(エトキシカルボニル)-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキノリン(EEQD)、およびn-(イソブトキシカルボニル)-2-イソブトキシ-1,2-ジヒドロキノリン(IIDQ) 。工程bで使用されるポリアミンは、アミノ基の全部ではないが一部が本方法の工程cにおいて形成されるアミン反応性中間体と結合し、それにより結合していない官能性アミンを可能にする、十分に高いアミン官能性を有し得る。この様式において、本方法の工程bおよびcにおいて創造されるペプチド結合ポリアミン側鎖および／または機械的に連結したポリアミンネットワークは、結合組織タンパク質分子上に(またはそれと接続して)存在するアミノ官能基の数における増加を提供する。そのようなアミノ官能基(NH₂)の数における増加は、結合組織タンパク質の利用可能なアミノ(NH₂)基と反応してこれを涸渇させる定着剤を、材料の最初の固定化に対して利用されるようにし、次いで本発明の方法は、ヘパリンと結合する前に、結合組織タンパク質上に位置するか、またはそれと接続している利用可能なアミノ(NH₂)基の数を増すために利用され得る。本方法において使用可能なポリアミン化合物の例は、リジン、オルニチンを含む種々のアミノ酸のようなカルボキシル(COOH)およびアミン(NH₂)官能性の両方を有する化合物、複数のカルボキシル(COOH)およびアミノ(NH₂)基を有するオリゴペプチドまたはポリペプチドを含む。本発明の１つの実施態様に従って、上記に記載される方法の工程bおよびcは、先に架橋された(例えば固定された)材料を以下を含む混合物に浸漬させることにより同時に行われ得る；a）カルボキシル活性化化合物(例えば、1-エチル-3-(3- ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC)、およびb）カルボキシル含有ポリアミン化合物(例えば、リジン)。そのような混合物は、４％の1-エチル -3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC)と、４％のリジンとの50％／50％（v／v）混合物を含み得、これは、EDCによるカルボキシル(COOH )基の所望の活性化および引き続き起こるそのような活性化カルボキシル基(例えば、o-アシルイソウレア)のリジンとの反応を促進するのに適しているpHに緩衝化されている。この目的に適切な代表的なpHは、pH=5である。なおさらに本発明に従って、結合組織タンパク質がそれ自身上に存在するカルボキシル(COOH)基を有する場合の適用において、上記に記載される方法の工程b およびcは、同時に、または別々に行われ得る。工程bおよびcが別々に行われる場合、工程bにおいて最初に結合組織タンパク質上のカルボキシル基をカルボキシル活性化化合物にさらすことは、次いで活性化カルボキシル基が工程cにおいて導入されるポリアミン化合物上に存在するアミノ基のいくつかと反応し得るように、それらの内生的カルボキシル基の活性化をもたらす。結合組織タンパク質にどのようなカルボキシル基も全くない、または実質的に全くない場合の他の適用において、工程bおよびcを同時に行うこと、および工程cのポリアミン化合物についてアミン官能基性とともに内生的カルボキシル基を有することが望ましくあり得る。この事について、カルボキシル活性化化合物は、ポリアミン化合物の活性化カルボキシル基がポリアミン化合物のアミノ基のいくつかと反応し、それによりカルボキシルを含まない結合組織タンパク質分子のまわりにポリアミン分子の連結または交差を生じ得るように、ポリアミン化合物上に存在するカルボキシル基を活性化するように働く。従って、たとえ結合組織タンパク質分子にカルボキシル基が全くない、または実質的に全くない場合の適用においても、本発明の方法は、結合組織タンパク質マトリックス内にポリアミン分子の機械的またはステアリン酸(stearic)交差または連結を生じることにより、行われ得る。本発明のさらなる目的および利点が、以下の好適な実施態様の詳細な説明を読み、そして理解することで、当業者に明らかになるだろう。図面の簡単な説明図１は、ヘパリンを先に固定されたバイオプロテーゼ材料に共有結合させるためのプロセスの作業工程図である。図2a〜2cは、以下のように、ヘパリンを固定されたバイオプロテーゼ組織に結合させるための方法の段階的な表示を提供し、ここで遊離のカルボキシル(COOH) 基は結合組織タンパク質分子上に存在する：・図2aは、ポリエポキシ架橋剤により架橋された、そして遊離のカルボキシル側鎖を含むコラーゲン分子の概略図である。・図2bは、本発明に従ったリジンおよびEDCでの処理の後の図2aのコラーゲン分子の概略図である。・図2cは、本発明に従ったヘパリン化の後の図2bのコラーゲン分子の概略図である。図3a〜3cは、以下のように、ヘパリンの固定された生体プロテーゼ組織への機械的な連結を生じさせるための方法の段階的な表示を提供し、結合組織タンパク質分子には遊離のカルボキシル(COOH)基が全くないか、または不足しているが、ポリアミン化合物は遊離のカルボキシル(COOH)基をそれ自身上に有する：・図3aは、ポリエポキシ架橋剤により架橋された、そして遊離のカルボキシル (COOH)側鎖が全くないコラーゲン分子の概略図である。・図3bは、本発明に従ったリジンおよびEDCでの処理の後の図3aのコラーゲン分子の概略図である。・図3cは、本発明に従ったヘパリン化の後の図3bのコラーゲン分子の概略図である。好適な実施態様の説明以下の詳細な説明およびそれが示す実施例は、本発明の特定の実施態様を記載しそして例示する目的のためだけに提供され、そしていかなる方法においても本発明の範囲を制限することを意図しない。ｉ．好適な方法図１は、本発明の方法に従って、ウシ心膜の切片(segment)のような生体組織を処置するための好適な方法の作業工程図を示す。図１に関して、本発明に従う生体組織(例えば、ウシ心膜の切片)を処置するための例示のプロセスは、以下の通りである：工程１：生体組織の収穫および整形ウシ心膜の切片のような適切なコラーゲン性生体組織を、標準的な方法に従って、保乳動物から収穫し、整形し、洗浄し、そして調製する。工程２：架橋この好適な方法において、収穫されて整形された組織の切片は、室温で１週間の間、４％のエチレンジグリシジルエーテル(Denacol EX-810、Nagase Chemical Company、Osaka、Japan)溶液内に浸漬される。このことは、組織内の結合組織タンパク質(例えば、コラーゲンおよびエラスチン分子)上に存在するアミノ(NH₂ )基の架橋をもたらす。このDenacol固定化はまた、結合組織タンパク質分子上に存在するカルボキシル(COOH)基のいくつかと反応し得る。しかしながら、多くの他の定着剤がこの工程において使用され得、組織内のコラーゲンおよび／またはエラスチン分子の所望の架橋を引き起こす任意の化学薬品(例えば、グルタルアルデヒド、ジアルデヒド澱粉など)を含むことが認識されるべきである。使用される定着剤の型、およびさらす時間／条件に依存して、結合組織タンパク質(例えば、コラーゲンおよびエラスチン)分子は、十分な数のそれ自身上に存在する遊離のカルボキシル(COOH)基を有しても有しなくてもよい。本明細書中以下でより詳細に記載されるように、本方法の残りの工程３〜11は、結合組織タンパク質分子が少しでも遊離のカルボキシル(COOH)基を含むかどうかに関わりなく行われ得る。工程３：平衡／中和／生体負荷(bioburden)減少生体組織の所望の架橋が完了した後、組織はGET-S溶液のような中和／平衡／生体負荷減少溶液に浸漬され、GET-S溶液は、グルタルアルデヒド、エタノール、およびTWeen80^TM界面活性剤からなり、リン酸またはHEPES緩衝液のいずれかで中性pHに緩衝化されている。あるいは、ホルムアルデヒド、エタノール、および Tween80^TM界面活性剤からなり、リン酸緩衝液またはHEPES緩衝液のいずれかで中性pHに緩衝化されているFET-S溶液を使用し得る。工程４：リンス中和／平衡／生体負荷減少が完了した後、組織はGET-S溶液から取り出され、そして滅菌脱イオン水の流れで繰り返しリンスされる。たいていの場合において、４回連続した10分のこの型のリンスが、どんな残留定着剤および／または平衡／中和／生体負荷減少溶液でも除去するのに十分である。工程５：リジン溶液への浸漬組織が十分にリンスされた後、組織を、室温で２時間の間、pH５でリジンの４％水性溶液に浸漬する。工程６：カルボキシル活性化化合物の添加組織を４％のリジン溶液に２時間浸漬した後、EDCの４％水性溶液(pH５)を、存在するリジン溶液の体積に対して等体積で加える。このことは、２％のリジンおよび２％のEDCを含む混合物を形成する。その後は、組織を、室温で２時間、このリジン／EDC混合物に浸漬したままにする。工程７：ヘパリン処置組織が上記で記載される２時間の間リジン-EDC混合物中に保持された後、組織をリジン-EDC混合物から取りだし、次いでさらに２時間室温で、ヘパリンの４％水性溶液に浸漬する。このことは、ヘパリンと、本方法の先立つ工程(すなわち、工程５および６)の間に活性化カルボキシル(COOH)基と結合された状態になっている、リジン側鎖上に存在するアミノ(NH₂)基との間の接触をもたらす。工程８：カルボキシル活性化溶液の添加組織を、上記の工程７に従い室温で２時間、４％のヘパリン溶液中に保持した後、EDCの４％水性溶液を、存在する４％のヘパリン溶液の量に対して等体積で加える。このことは実質的に２％のヘパリンおよび２％のEDCを含む混合物を形成する。この得られるヘパリン／EDC混合物のpHを5.0に調整し、そして組織をさらに１〜16時間室温で、そのヘパリン／EDC混合物内に浸漬したままにしておく。このことは、ヘパリンのカルボキシル基(COOH)を活性化させ、そしてそれらの活性化カルボキシル基とリジン側鎖上に存在するアミノ(NH₂)基との間を架橋させる。工程９：リンス次いで、組織を滅菌脱イオン水の流れで繰り返しリンスする。たいていの場合において、それぞれ10分の４回連続したリンスが、どんな残留ヘパリンおよびED Cでも除去するのに十分である。工程１０：滅菌組織が、どんな残留ヘパリンおよび／またはEDC溶液でも除去するのに十分にリンスされた後、組織は、エタノール中１〜10％のホルムアルデヒドおよびTwee n 80界面活性剤の混合物のような、液体滅菌剤混合物に浸漬され得る。組織は、組織を十分に滅菌するために適した時間の間、そのような液体滅菌剤混合物中に保持されたままにされる。エタノール中１〜10％のホルムアルデヒドおよびTwee n 80の混合物が利用される場合において、代表的には、５〜40時間の浸漬時間が所望の滅菌の効果を上げるのに十分である。工程11：保存組織が滅菌された後、組織は、pH7.4に緩衝化された0.625％のグルタルアルデヒド溶液のような適した保存溶液中に置かれ得る。組織は、使用時まで、そのような保存溶液に浸漬されたままである。図2a〜2cおよび3a〜3cは、本発明の好適な方法(例えば、図１の作業工程図で記載される)が、アミノ(NH₂)官能基の結合組織マトリックスへの付加、およびそれに続くヘパリンの結合をもたらす様式を、概略的に示す。詳しくは、図3a〜3cは、結合組織タンパク質分子に利用可能なカルボキシル(C OOH)基が全くないか、または不足している場合の、本方法の適用に関する。一方で、図2a〜2cは、十分な数の利用可能なカルボキシル(COOH)基が架橋された移植片材料の結合組織タンパク質分子上に存在する場合の適用に関する。ｉｉ．十分なカルボキシル(COOH)基が結合組織タンパク質分子上に存在する材料に対する好適な方法の適用特に図1a〜1cに関して、コラーゲン分子上に存在するアミン(NH₂)およびカルボキシル(COOH)側鎖を有するコラーゲン分子10の概略図が提供される。ポリエポキシ定着剤(例えば、Denacol EX313)が、隣接するコラーゲン分子10のアミノ基の間の分子間架橋を形成するために使用され、そのような架橋は文字「D」により表される(図1a)。ポリエポキシ架橋が完了した後、固定された生体材料は、上記で記載される好適な方法の工程５〜６に従って、リジンおよびEDCで処理される。このことは、コラーゲン分子10のカルボキシル(COOH)基のo-アシルイソウレア基への変換をもたらし、これは引き続きリジン分子上の遊離のアミンと反応して、図1bに示されるように、ペプチド結合リジン側鎖12を形成する。これらのペプチド結合リジン側鎖は、その後のヘパリンとの反応に利用可能である多数のアミノ(NH₂)官能基を有する。図1cに示されるように、上記で記載される好適な方法の工程７で提供されるヘパリンはペプチド結合リジン側鎖上のアミノ(NH₂)基と共有結合した状態になり、それにより生体材料のヘパリン化をもたらす。ｉｉｉ．結合組織タンパク質分子にカルボキシル(COOH)官能基が全くないかまたは不足している材料に対する好適な方法の適用特に図3a〜３ｃに示される実施例に関して、本発明の方法はまた、結合組織タンパク質分子に遊離のカルボキシル(COOH)基が全くないか、またはそのようなカルボキシル(COOH)基が不足している(例えば、上記で記載される図2a〜2cの実施例におけるような、リジンの結合組織タンパク質分子とのペプチド結合を提供するのに十分な数のカルボキシル(COOH)官能基を欠いている)生体材料のヘパリン化を促進するために用いられ得る。この事について、図3aは、アミノ(NH₂)側鎖を有するが、しかし任意の遊離のカルボキシル(COOH)基を涸渇させる他の化学的処理のためにそのようなカルボキシル(COOH)側鎖が全くないコラーゲン分子10を示す。分子間架橋が、Denacol Ex 313のようなポリエポキシ定着剤により形成され、そして図3aに「Ｄ」により表示される。図3bに示されるように、引き続いて生体材料をリジンおよびEDCにさらすこと( 上記で記載される好適な方法の工程５および６におけるように)は、リジン分子上に存在するカルボキシル(COOH)基をアミン反応性中間体(例えば、o-アシルイソウレア基)へ変換する。次いで、そのようなアミン反応性中間体はリジン分子上のアミノ基のいくつかと反応してペプチド結合リジンネットワークを形成し、これは材料の架橋されたコラーゲンマトリックス内に機械的に連結されている。その後、生体材料をヘパリンにさらすこと(上記で記載される好適な方法の工程７におけるように)は、機械的に連結されたリジンネットワーク上の残留する遊離のアミノ基(NH₂)へのヘパリンＨの共有結合をもたらし、それによって、生体材料のヘパリン処置を生じる。図2a、2b、2c、3a、3b、および3cの表示が本質的に概略であり、そして本発明の方法の適用から生じる実際の三次元分子構造を描写することを意味しないことが認識されるべきである。例えば、図3bおよび3cに示されるリジン側鎖のいくつかは、実際には、それらのコラーゲン繊維背後への位置取りまたはこれらの図面に示される他の構造のために、視界から部分的に隠されている。ｉｖ．他の生体および非生体材料への本方法の適用本発明の方法は、結合組織タンパク質マトリックスを有するバイオプロテーゼ材料に関してかなりの有用性を有し得るが、これらの方法がまた、他の生体および非生体材料に適用され得ることが理解されるべきである。例えば、架橋した、または架橋可能なポリマー鎖を液体透過性ネットワーク中に有する天然の、または合成のポリマー材料は、本発明の方法によりヘパリン化に供され得る。ポリマー鎖がそれ自身上に存在するカルボキシル(COOH)基を有する場合の例において、本発明の方法は、本明細書中上記の節ｉにおいて記述される詳細な説明に従って、ヘパリンが引き続きイオン結合で結合され得るペプチド結合ポリアミン側鎖を形成するために利用され得る。ポリマー分子にカルボキシル(COOH)基が全くないか、または実質的に全くない場合の他の例において、本発明の方法は、本明細書中上記の節ｉｉにおいて記述される詳細な説明に従って、機械的に連結されたポリアミンネットワークにヘパリンが引き続きイオン結合で結合され得るように、ポリマー分子内に機械的に連結されたポリアミンネットワークを形成するために利用され得る。本発明の方法によりヘパリン化され得る天然の、または合成の液体透過性ポリマー材料の例は、膨張(expanded)ポリテトラフルオロエチレン(PTEE)移植片、ポリエステルのまたは他の編まれたもしくは織られた移植片、およびポリエチレンオキシド(PEO)で作られた生体ゲルマトリックスを含む。本発明は、特定の現在好適な実施態様に関して記載されてきたが、種々の改変または変更が、本発明の意図される精神および範囲から逸脱することなく、上記で記載される実施態様に対してなされ得ることが認識される。例えば、種々の異なる定着剤、カルボキシル活性化化合物、ポリアミン化合物、および他の試薬が、本明細書中上記で記載され、そして図１の作業工程図に示されるものと同じ分子反応および改変を成し遂げるために利用され得る。従って、上記で記載される好適な実施態様に対するそのような理にかなった改変の全てが、以下の請求の範囲内に含まれることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ヤン，ジュンアメリカ合衆国カリフォルニア 92679, ドーブキャニオン，フォックステールレーン 46 【要約の続き】のアミノ基と結合した状態になるように、材料をヘパリンと接触させる工程、を含む。

Claims

【特許請求の範囲】１．結合組織タンパク質分子上に存在するアミノおよびカルボキシル基を有する結合組織タンパク質分子を含む架橋した生体材料に、ヘパリン化するための方法であって、該方法は以下の工程からなる： a）該生体材料を化学的架橋化剤に接触させて、結合組織タンパク質分子の間に架橋を形成する工程； b）該生体材料を、カルボキシル活性化化合物と接触させて、結合組織タンパク質分子上に存在するカルボキシル基を、アミン反応性中間体に変換する工程； c）該生体材料を、ポリアミン化合物上に存在するアミノ基が結合組織タンパク質上に形成された該アミン反応性中間体と反応するように、カルボキシル基（単数または複数）を含むポリアミン化合物と接触させて、それ自身上に共有結合したアミノ官能基を有する共有結合アミン側鎖を形成する工程； d）該生体材料を、ヘパリン上のカルボキシル基が活性化され、次いで共有結合アミン側鎖上に存在するアミノ官能基の少なくともいくつかと共有結合し得るように、ヘパリンと接触させる工程。２．工程aが、前記生体材料を、以下からなる架橋剤の群より選択される架橋剤と接触させる工程を含む、請求項１に記載の方法： a）グルタルアルデヒド； b）ジアルデヒド化合物； c）ポリエポキシ化合物； d）ビスイミドエステル； e）ビス-N-スクシンイミジル；および f）ジイソシアネート。３．工程bが、前記生体材料を、以下からなるカルボキシル活性化化合物の群より選択されるカルボキシル活性化化合物と接触させる工程を含む、請求項１に記載の方法： a)カルボジイミド； b)1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC)； c)ジヘキシルカルボジイミド(DCC)；および d)1-エチル-3-(4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル)カルボジイミドヨージド(E AC)。４．工程aが、前記生体材料を、以下からなる架橋剤の群より選択される架橋剤と接触させる工程を包含する、請求項３に記載の方法： a)グルタルアルデヒド； b)ジアルデヒド化合物； c)ポリエポキシ化合物； d)ビスイミドエステル； e)ビス-N-スクシンイミジル；および、 f)ジイソシアネート。５．前記方法の工程cで利用されるポリアミン化合物が、以下からなるポリアミン化合物の群より選択される、請求項３に記載の方法： a)リジン； b)ヒドロキシリジン； c)オルニチン； d)複数のアミノ基およびカルボキシル基を含むオリゴペプチド；および e)複数のアミノ基およびカルボキシル基を含むポリペプチド。６．工程bおよびcが、前記生体組織を、カルボキシル活性化化合物およびポリアミン化合物を含む混合物と接触させることにより同時に行われて、該組織と該ポリアミン化合物との間で共有結合の形成をもたらす、請求項３に記載の方法。７．前記方法の工程cで利用されるポリアミン化合物が、以下からなるポリアミン化合物の群より選択される、請求項１に記載の方法： a)リジン； b)ヒドロキシリジン； c)オルニチン； d)複数のアミノ基およびカルボキシル基を含むオリゴペプチド；および e)複数のアミノ基およびカルボキシル基を含むポリペプチド。８．工程bおよびcが、前記生体組織を、カルボキシル活性化化合物およびポリアミン化合物を含む混合物と接触させることにより同時に行われて、該組織と該ポリアミン化合物との間で共有結合を形成する、請求項１に記載の方法。９．結合組織タンパク質分子上に存在するアミノおよびカルボキシル基を有する結合組織タンパク質分子を含む架橋した生体材料に、ヘパリン化するための方法であって、該方法は以下の工程からなる： a）該生体材料をエチレンジグリシジルエーテルと接触させて、該結合組織タンパク質のアミノ基の間に架橋を形成する工程； b）該生体材料をリジン溶液と0.5〜20時間接触させる工程； c）工程bの該リジン溶液に、EDC溶液を加えてリジン／EDC混合物を提供し、その後該生体材料を、ほぼ１時間より長く、リジン／EDC混合物と接触した状態に保って、該リジンと該組織との間に共有結合を形成する工程； d）該生体材料をリジン／EDC混合物から取り出す工程； e）該生体材料をヘパリン溶液と0.5〜20時間接触させる工程； f）工程dの該ヘパリン溶液に、EDC溶液を加えてEDC／ヘパリン混合物を提供し、そして該生体材料を、１〜20時間、EDC／ヘパリン混合物と接触した状態に保って、該ヘパリンと該共有結合したリジンとの間に共有結合を形成する工程。１０．前記方法がさらに以下の工程を含む、請求項９に記載の方法： g）前記生体材料を、前記組織の滅菌化を引き起こすのに十分な時間の間、滅菌剤溶液中に置く工程。１１．前記方法がさらに以下の工程を含む、請求項１０に記載の方法： h）前記生体材料を前記滅菌剤溶液から取り出す工程の後、該生体材料をグルタルアルデヒド含有溶液中に保存する工程。１２．工程aおよびbの間に以下のさらなる工程が行われる、請求項９に記載の方法：前記生体組織を、グルタルアルデヒド、エタノール、および界面活性剤を含む生体負荷低減溶液と接触させ、該溶液は6.5〜8.0のpHを有する、工程。１３．前記生体材料が前記生体負荷低減溶液と接触した状態に置かれた後に、しかし工程ｂを始める前に、以下のさらなる工程が行われる、請求項１２に記載の方法：該生体材料を水でリンスする工程。１４．前記生体材料を水でリンスするさらなる工程が以下を含む、請求項１３に記載の方法：該生体材料を脱イオン水で４回リンスする工程であって、各リンスをほぼ10分間継続する、工程。１５．前記工程aで使用されるエチレンジグリシジルエーテル溶液がエチレンジグリシジルエーテルの４％水溶液である、請求項９に記載の方法。１６．前記工程bで使用されるリジン溶液が４％のリジン水溶液である、請求項９に記載の方法。１７．前記４％のリジン水溶液がほぼ5.0のpHを有する、請求項１６に記載の方法。１８．アミノ基をその上に有する結合組織タンパク質分子を含む生体材料をヘパリン化するための方法であって、該方法は以下の工程を包含する： a）該生体材料を架橋剤と接触させて、該結合組織タンパク質分子の間に共有結合架橋を形成する工程； b）該生体材料を、i)カルボキシル基をその上に有するポリアミン化合物、およびii)カルボキシル活性化化合物と接触させて、該ポリアミン分子上に存在するアミノ基の少なくともいくつかが、該ポリアミン分子上に形成されるアミン反応性中間体の少なくともいくつかと共有結合的に（covalently）反応し、それにより該結合組織タンパク質分子と連結した共有結合ポリアミンネットワークを形成するように、該ポリアミン分子上に存在するカルボキシル基の少なくともいくつかをアミン反応性中間体へ変換する工程； c）該生体材料を、ヘパリンが該ポリアミンネットワーク上に存在するアミノ基の少なくともいくつかと共有結合するように、ヘパリンおよびカルボキシル基活性化化合物と接触させる工程。１９．工程aが、前記生体材料を、以下からなる架橋剤の群より選択される架橋剤と接触させる工程を含む、請求項１８に記載の方法： a）グルタルアルデヒド； b）ジアルデヒド化合物； c）ポリエポキシ化合物； d）ビスイミドエステル； e）ビス-N-スクシンイミジル；および f）ジイソシアネート。２０．前記方法の工程bで利用されるポリアミン化合物が、以下からなるポリアミン化合物の群より選択される、請求項１８に記載の方法： a)リジン； b)ヒドロキシリジン； c)オルニチン； d)複数のアミノ基およびカルボキシル基(単数または複数)を含むオリゴペプチド；および e)複数のアミノ基およびカルボキシル基を含むポリペプチド。２１．結合組織タンパク質分子上に存在するアミノ基を有する結合組織タンパク質分子を含む架橋した生体材料をヘパリン化するための方法であって、該方法は以下の工程からなる： a）該生体材料をエチレングリシジルエーテルと接触させて、該結合組織タンパク質のアミノ基の間に共有架橋を形成する工程； b）該生体材料をリジン溶液と0.5〜20時間接触させる工程； c）工程bの該リジン溶液に、EDC溶液を加えてリジン／EDC混合物を提供し、その後該生体材料を、0.5〜20時間、リジン／EDC混合物と接触させて維持し、該リジンと該組織との間に共有結合を形成する工程； d）該生体材料をリジン／EDC混合物から取り出す工程； e）該生体材料をヘパリン溶液と0.5〜20時間接触させる工程； f）工程eの該ヘパリン溶液に、EDC溶液を加えてEDC／ヘパリン混合物を提供し、そして該生体材料を、0.5〜20時間、EDC／ヘパリン混合物と接触させて維持し、該共有結合したリジンと該ヘパリンとの間に共有結合を形成する工程。２２．前記方法がさらに以下の工程を含む、請求項２１に記載の方法： g）前記生体材料を、前記組織の滅菌化を引き起こすのに十分な時間の間、滅菌剤溶液中に置く工程。２３．前記方法がさらに以下の工程を含む、請求項２２に記載の方法： h）前記生体材料を前記滅菌剤溶液から取り出す工程の後、該生体材料をグルタルアルデヒド含有溶液中に保存する工程。２４．工程aおよびbの間に以下のさらなる工程が行われる、請求項２１に記載の方法：前記生体組織を、グルタルアルデヒド、エタノール、および界面活性剤を含む生体負荷低減溶液（bioburden reduction solution）と接触させ、該溶液はpH6.5 〜8.0を有する、工程。２５．前記生体材料が前記生体負荷低減溶液と接触させて置かれた後に、しかし工程ｂを始める前に、以下のさらなる工程が行われる、請求項２４に記載の方法：該生体材料を水でリンスする工程。２６．前記生体材料を水でリンスするさらなる工程が以下を包含する、請求項２５に記載の方法：前記生体材料を脱イオン水で４回リンスする工程であって、各リンスをほぼ10分間継続する、工程。２７．前記工程aで使用されるエチレンジグリシジルエーテル溶液がエチレンジグリシジルエーテルの４％水溶液である、請求項２１に記載の方法。２８．前記工程bで使用されるリジン溶液が４％のリジン水溶液である、請求項２１に記載の方法。２９．前記４％のリジン水溶液がほぼ5.0のpHを有する、請求項２８に記載の方法。３０．ポリマー分子間に形成された分子間架橋を有するポリマー分子を含む透過性ポリマー材料をヘパリン化する方法であって、該方法は以下の工程からなる： a）該材料を、その上に存在するカルボキシル基を有するポリアミン化合物、およびカルボキシル活性化化合物と接触させて、該ポリアミン分子上に存在するアミノ基の少なくともいくつかが、該ポリアミン分子上に形成されるアミン反応性中間体の少なくともいくつかと共有結合的に反応し、それにより該ポリマー分子内に連結された（interlocked）ポリアミンネットワークを形成するように、該ポリアミン分子上に存在するカルボキシル基の少なくともいくつかをアミン反応性中間体へ変換する工程；および、その後 b）該材料を、ヘパリンが該ポリアミンネットワーク上に存在するアミノ基の少なくともいくつかと共有結合するように、ヘパリンおよびカルボキシル活性化化合物と接触させる工程； c）該材料を、該組織の滅菌化を引き起こすのに十分な時間の間、共有結合したヘパリンと共に滅菌剤溶液中に置く工程；および d）該材料を該滅菌剤溶液から取り出す工程の後、該材料をグルタルアルデヒド含有溶液中に保存する工程。３１．以下のさらなる工程を含む、請求項３０に記載の方法：前記材料を、pH6.5〜8.0で、グルタルアルデヒド、エタノール、および界面活性剤を含む生体負荷低減溶液と接触させる工程。