JPS61137825A - コラ−ゲン組織の処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野： 本発明は、コラ−２フ組織をプロテーゼ移植への使用に
適するように処理する方法、及びこのように処理した生
成組＊に関する。さらに詳しくは、本発明はコラーゲン
組織を補って移植に使用し、その上への内皮細胞の増殖
を促進させるためのコラ−ダン組織の処理方法に関する
。

従来技術： と）Ｋ使用するためのプロテーゼ移植組織は以前から公
知であ〕、ヒトを含めた動物から採取した自然組織を用
いることも公知である。自然組織を移植組織に用いる場
合には、移植後の例えば過度の無機質化または石灰化及
び身体免疫系による拒絶のような問題を避けるようにコ
ラーゲン組織を処理することが必要である。自然組織か
ら作られたプロテーゼの安定性を改良するための多くの
処理方法が先行技術で提案されている。

このようは％１９８３年３月２９日ＫＮｉｍｎｉ等に発
行された米国特許第４３７８．２２４号は、動物組織か
ら作られた。異種移植片または同種移植片・移植用のバ
イオプロテーゼの生物物理的安定性を改良する方法であ
って、公知の架橋剤ダルタールアルデヒｒを用いて組織
の蛋白買構造内に架橋を形成し、組織を石灰化抑制剤の
水溶液内に浸せきすることを含む方法を開示している。

Ｎｉｍｎ１等によって挙げられた適当な石灰化抑制剤の
例えばジホスホネート類であシ１代表的なジホスホネー
トとして３−アミノ−１−ヒｒロキシプはパンＬ１−ジ
ホスホネートが挙げられているが、この化合柳の使用を
説明する特定の例はＮｉｍｍ１等によって与えられてい
ない。

さらに、　Ｎｉｍｎ１等はグルタールアルデヒド°処理
の前に組織を採取し洗浄することを述べているが、組織
内に存在する有害な物質を実買的に完全に除去するため
の適当な界面活性剤による前処内くついては示唆してい
ない、従って、　Ｎｉｍｎ１等が提案しているコーチン
グ（２欄、２３行）は本質的には表面現象であ〕、組織
の繊維マトリックス内でのグルタールアルデヒドによる
架橋と石灰化抑制剤による安定化は、　Ｎｉｍｎ１方法
によって達成されず、ｔた達成されることのあシ得ない
亀のである。

Ｄａｒｄｉｋ等に１９７６年１１月２日発行された米国
特許第３９８８，７８２号は、硬化剤としてグルタール
アルデヒｒを用いるへそ帯の動脈及び静脈からの管、パ
ッチ及びみそ形状のプロテーゼの調製を述べている。

ＨａｎＯＯＯｋ等に１９７６年６月２９日に発行された
米国特許第３，９６５４０１号は、組織をなめし剤とし
てのグルタールアルデヒドで処理する、ブタ心膜組織か
らの移植可能な心臓弁の調製を開示している。

インビボにおける大動脈及び腎臓の石灰化に対する種々
なジホスホネートの抑制効果は、Ａｔｈｓｒｏｓａｌｅ
ｒｏｓｉａ　３０巻（１９７８年）３１３−３２０頁の
Ｍ、ＰｏｔｏｋｅｒとＭ　、Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｄｕｎｋ
ｅｒによる文献で考察されている。

８ａｈｅａｈｔｅｒ　Ｋ　１９７８年１０月１７日に発
行された米国特許第４１２Ｑ６４９号は、被移植者Ｋｊ
！−ける保持時間を高めるためのグルタールアルデとド
による移植片の処理を開示している。上述のＮｉｍｎ１
等の場合と同゛様に、この処理は本質的には表面処理で
あシ、付加的な安定化等の処理は開示されていない。

Ｂｒａｕｎ　Ｋ　１９７１年２月２１日に発行された米
国特許第３５６２８２０号は、生物学的組織に基づく管
状、ストリップ状及びシート状のプロテーゼのグルター
ルアルデヒドによる硬化を開示している。

Ｍｉｙａｔａ等に１９７８年７月４日発行された米国特
許第４０９ａ５７１号は、好ましくない物質を消化しコ
ラーゲン質と弾性繊維質の成分を存続させる蛋白溶解酵
素によってブタ血管を処理し、次にこの血管を特に１ホ
ルムアルデヒド９とグルタールアルデヒドの混合物によ
って固定することから成る、異種移植片である代用血管
の製造方法を開示している。

Ｌｅｎｔ！！１等に１９８２年４月６日に発行された米
国特許第４３２３３５８号は、申立てＫよると移植後の
組織の石灰化を阻止するために１例えばドデシル硫散ナ
トリウムのような、硫酸化高級脂肪族アルコールの水溶
性塩の溶液による、グルタールアルデヒド９固定した組
織の処理を開示する。

上述の先行技術の提案の全てが、例えば石灰化を成る程
度抑制し、プロテーゼ移植組織の生物物理学的安定性を
成る程度改良するととくよって、成る程度成功している
が、これらの分野にはまだ問題が残されている。さらに
１前記光行技術の開示のいずれも、プロテーゼ移植組織
の表面での内皮細胞の増殖を促進及び強化することの意
義を認めていない。

内皮は、身体の種々な空隙、特に血管を２イニングする
平たい細胞の層である。内皮細胞による２イニングは平
滑な表面を与えるので、血球と血小板は損傷されること
なく流れることができる。

内皮細胞は種々な作用を有する物質を産生じ分易するこ
とができる、また血液と内皮の界面で生ずる作用は全体
として、有機体に都合の良いように寄与する；例えば、
循環する血球と内皮表面の両方が陰性の電荷を有してい
るため、互いに反撥するので、完全な内皮は非トロンボ
ゲン形成性である。各内皮細胞はその隣接細胞に密接に
結合しておシ、内皮層は血液の液層と細胞層の受動的な
移動を阻止する選択的な浸透膜を形成する。

完全な内皮は血液の漏出を阻止する一次バリヤーとして
作用するが、身体の免疫系に対して、少な玲とも血管の
外側には夾雑物が存在しないという一応の指示をも与え
る。しかし、内皮が損傷、穿刺または破壊されている場
合には、内皮は自動的に、夾雑病原菌を防御する免疫系
による反応を誘発する。自己抗原と異種抗原を一般に区
別し得る免疫系はリンパ球と食細胞の複雑な組合わせを
通して作用し、これらの細胞の活性を利用して、夾雑病
原＠ＶＣ対して同等の保護反応をもたらす。

従って、免疫系に関係する食細胞の中でも、白血球が身
体を微生物から保護するために先ず第一に作用する。他
の重要な食細胞グループは身体中に広範に分布している
大食細胞でちゃ、これは例えば骨髄、肝臓、膵臓及びリ
ンパ結節内で血管のライニングすなわち内皮に関係する
他の食細胞とともに作用する。

免疫系をこれ以上詳細に説明することは本発明を完全に
理解するために必要でないと考えられるが、内皮細胞が
果す役割を開繊することは、本発明が提供する先行技術
を凌駕する改良を理解するために重要である。

本発明の方法を実施することによって、特にこの方法の
本質的な第一段階によるコラーゲン物置から有害物質の
実質的に完全な除去を保証することによって、本発明の
方法によって処理した組織から調製したプロテーゼ移植
片上の内反細胞のインビボ増殖が促進されることが、今
回意外にも発見された。移植時の無機質化または石灰化
の抑制を著しく改良する他に、本発明の方法は先行技術
の方法によって調製した移植片に比べて、身体の免疫系
による拒絶を受けＫくい移植片の形成を可能にする。

問題点を解決するための手段： 本発明によって、コラーゲン組織をプロテーゼ移植への
使用に適合させ、移植後にプロテーゼ移植片上での内皮
細胞の増殖を促進させるようにコラーゲン組織を処理す
る方法であって１次の段階：ｔａ）　　有害物質を実質
的に完全く除去し、コラ−デー組織の繊維構造を露出さ
せるように、前記組織を充分な時間少なくとも１種類の
界面活性剤と接触させる： （ｂｌ　　得られた繊維質マ）ＩＪラックス洗浄して実
質的に全ての界面活性剤を除去する； （ｃ）　　洗浄した組織をグルタールアルデヒド９で固
定する； ［ｄＪ　　グルタールアルデヒビ固定組織を、石灰化抑
制剤、移植組織への食細胞による浸潤及び作用を抑制す
る作用剤及び／または感染を抑制する作用剤で処理する
；及び ｌｅ）　　Ｒ階ｔｃｔのグルタールアルデヒド１と段階
（ｄ）の作用剤の組織への結合を安定化するために、生
成した作用剤、／マド９フ２フ組織を還元剤で処理する から成る方法を提供する。

コラーゲンは、結合組織繊維の主要成分としてを椎動物
に生ずる繊維質蛋白質である。コラーゲンには７種類の
タイプがあシ、一般にタイプＩがが移植片に用いられて
いる。繊維質動物組織は通常コラーゲンを、他の蛋白質
物質、特にエラスチンと共に含んでいる。ここで用いる
かぎり、コラーゲン組織なる用語はコラーゲン自体、特
にタイプＩのコラーゲン、コラーゲンとエラスチ／との
ｄも合物、エラスチンまたは他の蛋白質物質を含むまた
は含まないに拘らず有意な割合でコラーゲンを含むや物
組織を意味するように意図するものである０本発明に用
いるコラーゲン組織の本質的な゛必要条件は、その蛋白
質分子がグルタールアルデヒド°のような固定剤または
なめし剤との反応に適合した遊離アミノ基を含有するこ
とである。

好ましいコラーゲン組織はウシの心腹組織またはブタの
心腹組織である。このような組織はプロテーゼ心臓弁と
しての組織片、特に１９８３年６月２１日に発行された
工ｏｎｅｇｃｕ等の米国特許第４３８ａ７３５号の指示
に従って製造されるような組織片の形成に適している。

本発明の方法によって処理することのできる他の適当な
形態のコラーゲン組織は、硬膜、大腿筋膜、弁組織及び
血管移植片組織である。

コラーゲン組織、例えば心腹組織、を動物から初めて採
取したときには、望ましくない汚染物を除去するために
、洗浄を必要とする５通常、組織を無歯の等張性食塩溶
液で洗浄して、過剰な血液及び血漿蛋白質を除去する。

この従来の前洗浄は。

本発明の方法による本質的な段階すなわち組織を少なく
とも１種類の界面活性剤と充分な時間接触させて有害な
物質を実質的に完全に除去する段階を行う前に１望まし
い一次段階である。

ここで用いるかぎシ、有害物質なる用語はプロテーゼ移
植片として用いるコラーゲンまたはコラーゲン／エラス
チン組織の繊維マトリックスをブロックまたは閉塞させ
るような物質を意味するように意図したものである。こ
のような物質は、除去しない場合には、ホスト有機体く
免疫反応を開始させる部位を与えることにな）、移植片
の拒絶または少なくと、もホスト食細胞による作用が生
ずる。有害物質には、リポ蛋白質とリン脂質を含めた脂
質、赤血球、血漿蛋白質、細胞器官及び死んだ細胞の７
ラグメントならびに遊離脂肪酸、コレステロール、コレ
ステロールエステル及ヒドリグリセリドが含まれる。

本発明の界面活性剤処理段階にぶる有害物質の除去はコ
ラーゲン組織の繊維構造を露出させるので１次の固定段
階で用いるグルタールアルデヒドがコラーゲン組織の繊
維マトリックスに実質的に完全に浸透することが出来る
ため、グルタールアルデヒＦ分子上の反応基がマトリッ
クス内のコラーゲン組織の蛋白質分子上の遊離アミン基
に結合することができる。

従って、本発明の界面活性剤処理は、第一にコラーゲン
組織の繊維マトリックスを表面のみではなくマトリック
ス全体にわたって完全に固定させる。第二には繊維マ）
　ＩＪラックス間隙から有害物質を完全に除去し、有害
物質が次の固定段階で表面下に捕捉されて、移植組織に
対する拒絶またはホスト食細胞による作用の問題の惹起
に利用されることがもはや無いようにするという二重の
目的に役立っている。例えば、上述の米国特許第４３２
ａ３５８号のように、固定段階後の界面活性剤による処
理を支持している先行技術の方法は。

固定剤〈よって組織に固定的に結合した有害物質の除去
に対して実質的に無効である。

本発明による特定順序の段階が移植片の保持の点で先行
技術を凌駕する有意な改良を可能にすることがわかって
いる。

本発明の界面活性剤処理段階に用いる界面活性剤は動物
組織から有害物質を除去するための有効な作用剤である
が、洗浄作用を過剰に行って、強すぎる溶液を用いるこ
とによってベース組織を損傷することがないように注意
しなければならない。

他方では、界面活性剤の濃度と処理時間は有害物質を実
質的に完全に除去するという望ましい結果を得るために
充分でなければならない、この基準の範囲で、界面活性
剤０．５〜６重量％を含有する水溶液として界面活性剤
を用いることが望ましい。

適当な処理時間は２〜６時間、好ましくは約３時間であ
る。

界面活性剤としては陰イオン界面活性剤、非イオン活性
剤、両性界面活性剤またはこれらの混合物が用いられる
。

適当な陰イオン界面活性剤の例は、ドデシル硫酸す）Ｉ
Ｊウム％　ｒデシルスルホ酢酸ナトリウム及びアルカリ
ールポリエーテルスルホン酸ナトリウムである。適当な
非イオン界面活性剤の例は、オクチルフェノキシポリエ
ｒキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、ポリオ
キシエチレン■ソルビタ／モノオレー）　（Ｔｗａｅｎ
　８０　）及びポリオキシエチレン（至）ンルビタンモ
ノステアレート（Ｔｗｃｅｎ　６０　）である、適当な
両性界面活性剤の例は、Ｚｖｒｉｔｔｅｒｇｅｎｔとし
て一般に知られているスルホイタインである。

界面活性剤が陰イオン界面活性剤と非イオン界面活性剤
の混合物である場合には特ＫＷ利な結果が得られること
がわかっておプ、特に好ましい界面活性剤溶液は、陰イ
オン界面活性剤としてｒデシル硫酸ナトリウム１重量−
１非イオン界面活性剤としてオクチルフェノヤシポリエ
トキシエタノール１重量％及び／またはポリオキシエチ
レン（２１ノルビタンモノオレ一ト１重量％を含有する
溶液である。コラーゲン組織を室温において約３時間前
記界面活性剤溶液と接触させるのが好ましい。

界面活性剤は有効な洗浄剤であるばかりでなく、毒素に
もなシ得るものであるので、界面活性剤処理後にコラー
ゲン組織の繊維マトリックスを完全に洗浄して実質的に
全ての界面活性剤を除去することが、本発明の重要な特
徴である。この洗浄段階は１例えば食塩溶液または蒸留
水による。ような、通常の方法で行うことができるが、
界面活性剤の実質的に完全な除去を保証するために、発
泡が停止するまで洗浄を続ける。

上述の界面活性剤による処理及び界面活性剤の痕跡をも
実質的に全て除去するための洗浄段階を行った後に、界
面活性剤処理から得られた組織の繊維マトリックスをグ
ルタールアルデヒド水溶液内に充分な時間浸せきして、
組織の蛋白質分子中に存在する実質的に全ての反応性ア
ミノ基にグルタールアルデヒド０分子を結合させること
によって組織を固定する。固定段階の適当な時間は２〜
１２時間であるが、以下で述べるような浸せき処理をく
シ返すことＫよって実質的に完全な固定を達成させるの
が好ましい。グルタールアルデヒｒの濃度は０．２５〜
１重量−であることが好ましい。

組織の特性を改良し、組織をプロテーゼ移植に適したも
のにするためのグルタールアルデヒド３による動物組織
の固定は、当技術分野で公知であるので、この段階は、
それだけでは本来、発明であるとは主張されていない。

しかし、この段階に関して本発明によって与えられる特
別な寄与は２通シある： 第一には、界面活性剤処理によってコラーゲン組織から
有害物質を実質的に完全に除去した後にのみ、グルター
ルアルデヒドによる浸せきを実施することによって繊維
マトリックスがその表面のみでなく、完全に固定され得
るように繊維マトリックスの適合化を保証する。

第二には、組織をグルタールアルデヒド９中に組織を充
分な時間浸せきして１組織の蛋白質分子中に存在する実
質的に全ての反応性アミノ基にグルタールアルデヒド分
子の反応性基を結合させることくよって、繊維マトリッ
クスを通しての実質的に完全な固定が保証される。

上述の結果は、以下で述べる手段に従って、グルタール
アルデヒド中での浸せきをくシ返して多重の架橋を行う
ことＫよって達成するのが好ましい、グルタールアルデ
ヒド３中に浸せきして多重の架橋を行わせるのみではな
く、以下に述べるように１石灰化抑制剤中及び抗食細胞
剤中にも反復浸せきして本発明によって得られる累積的
な飽和効果を達成することの効果は先行技術によって得
られなかった。ものである。

本発明の好ましい実施態様によると、組織を０．１Ｍ酢
酸塩緩衝液存在下の０．５重量−のグルタールアルデヒ
Ｐ溶液中に約３時間半浸せきする。

次に、過剰なグルタールアルデヒｌ’ｔ−組織から洗浄
する。

本発明の重要な面は、本発明の方法によって処理した組
織から調製したプロテーゼ移植片に対する石灰化の抑制
である。

リン酸イオンの存在が石灰化の発生を増強させる傾向が
あるので、本発明の段階へのリン酸塩緩衝液の使用は、
中間洗浄段階の効果にも拘らず、回避すべきであること
がわかっている。

ｐＨの制御もプロセス中の重要な特徴であるので、この
ような制御を非リン酸塩緩衝液、特に酢酸塩緩衝液によ
って行うのが好ましい。

グルタールアルデヒド固定した組織を本発明に従って、
先ず第一に石灰化抑制剤及び／ｉたは、移植片に対する
食細胞による浸潤及び作用を抑制する作用剤゛によって
さらに処理し、最後に生成した作用剤／マトリックス組
織の分子結合を安定させる還元剤によって処理する。

移植後に移植片の上及び周囲に生ずる無機買化すなわち
詳しくは石灰化は組織の柔軟性を減じ、ホスト身体にお
けるプロテーゼの作用の効率を減する。石灰化を抑制ま
たは減するために、種々な処理方法が先行技術で提供さ
れてお）、これらは成る程度の成功を収めている。特に
、石灰化を抑制するために特定の化合物を使用すること
は、当技術分野で公知である。しかし本発明の方法に従
つて、公知の石灰化抑制剤、特にアミノニＩＪン酸塩を
用いると、先行技術の処理方法を凌駕する実質的な改良
及び先行技術の方法で研究されたことのない分野で意外
な利益がもたらされる。

このように、本発明の方法によって処理したコラーゲ／
組織から製造したプロテーゼ移植片は石灰化のみでなく
、トロンボゲン形成、感染及び分解までも阻止するのに
効果的であることがわかっている。先行技術で達成され
るよシも実質的に大きい、これらの有利な特徴は、移植
片上の内皮細胞被覆が促進され、このような被覆の促進
が移植片を、トロンボゲン形成、石灰化、感染及び変性
を生ずる反応から保護するという事実に帰因できる。

上述の改良は、固定組織をさらに処理するために用いら
れる作用剤、ならびに石灰化抑制剤が食細胞による浸潤
または作用を抑制する作用剤、例えば遊離の反応性アミ
ノ基を有するセファロスポリン誘導体またはメトトレキ
セートあるいは感染を阻止する作用剤、好ましくはセフ
ァロスポリンＣであり得る、上述の段階を特定に組合わ
せるごとくよって達成される。

前記セファロスポリン抗生物質は、分子量１２０２及び
添付図の図７に示した構造式を有する公知の免疫抑制剤
であるシクロスポリンＣから誘導される。

本発明の方法で処理剤として用いる九めに、シクロスポ
リンＡ環は式中の矢印によって示す個所で開裂し、固定
された粗織に付着したグルタールアルデヒド分子上の遊
離な反応性基と反応するように、遊離のアミノ基を生ず
る。

メトトレキセートすな相ちＮ−（４−（（、（４４−ジ
アミノ−６−プテリジニル）メチル〕メチルアミノ〕ベ
ンゾイル）−Ｌ−グルタミン酸は、次の構造式を有する
公知のヨウ酸拮抗物質及び代謝拮抗物質である： ｆｉ３ この薬物はグルタールアルデヒｒ固定組織マトリックス
上の反応性基との反応に利用できる遊離のアミノ基を２
個有している。

セファロスポリンＣは、公知の有効な感染抑制剤である
。

用語法の便宜のために１石灰化抑制剤及び免疫抑制剤／
Ｃらびに本発明の方法の後固定段階で用いる薬物を以下
では、一般名称の「薬物」と呼ぶことＫする、この用語
法では、このプロセスによって生ずる望ましい効果を「
薬物固定」または「免疫抑制」と呼ぶことができる。

本発明の方法による薬物固定によって得られる有利な結
果の１つは、次の要素： （１）　　内皮細胞被覆の強化及び促進：（２）創口治
癒の促進； （３）マクロファージ及び他の食細胞による拒絶と作用
の抑制 の間に効果的なバランスが保たれていることである。

本発明の方法によって薬物固定を受けた組織の好ましい
利用方法は、小葉と縫合環を処理組織から形成するプロ
テーゼ心臓弁の製造でちる。組織の特に好ましい態様は
、薬物がアミノニリン酸カルシウム抑制剤である場合に
製造されるが、この好ましい実施態様から製造したプロ
テーゼ心臓弁は、移植の約２か刃稜のプロテーゼの検査
が、（１）小葉及び縫合環上を実質的に完全に内皮細胞
が被覆し、トロンボゲン形成、石灰化、感染または変性
の徴候がない； （２）マクロ７アージ破片またはマクロファージ因子の
徴候を示さない、実質的に完全な創口治癒が生じた、及
び （３）マクロファージ（単細胞）作用による内皮細胞増
殖の拒絶または抑制の徴候が無いを示した点で、上述の
バランスに一致することがわかっている。

薬物固定方法は、固定し薬物処理し九組織を還元剤で安
定化することによって完成する。理論的には炭素と窒素
との間の二重結合を効果的に還元するような全ての還元
剤を、シアノボロノーイト９ライｒを含めてこの段階に
用いることができるが、有害な残渣から起り得る問題を
避けるために、好ましい還元剤はナトリウムボロハイド
ライド（ＮＩＬＢＨ４）である。

従って、本発明の好ましい実施態様はコラーゲン組織を
プロテーゼ移植での使用に適合するようにまた移植後に
移植片上の内皮細胞の増殖を促進させるように処理する
方法でらって、次の１段階、＝（１１組織を少なくとも
ｌａｉ類の界面活性剤と充分な時間接触させて、有害物
質を実質的に完全に除去し％繊維構造ｔ−赫出し、脂質
、赤血球、血漿蛋白質、細胞器官及び死んだ細胞の７ラ
グメントを全く含まないマトリックスを形成する；（２
）段階（１）から得られた洗浄済み繊維マトリックスを
蒸留水または食塩溶液ですすぎ洗いして実質的に全ての
界面活性剤を除去する；（３）　　前記マトリックスを
グルタールアルデヒド水溶液中に充分な時間浸せきして
、組織の蛋白質分子中に存在する実質的に全ての反応性
アミノ基にグルタールアルデヒＰ分子を結合させる；（
４）グルタールアルデヒＰ固定組織を洗浄して過剰なグ
ルタールアルデヒＰを除去する；（５）固定した組織を
反応性アミノ基含有のアミノニリン酸塩水溶液と充分な
時間処理して、結合したグルタールアルデヒド分子の実
質的に全ての遊離の反応性基をアミノジホスホネートの
反応性アミノ基と結合させる； （６）過剰なアミノジホスホネート’ｌ除去するために
洗浄する；及び （７）ニリン酸結合組織マトリックスをナトリウムボロ
ハイ）４ライｒで処理して、アミノジホスホネートとグ
ルタールアルデヒｒの組織蛋白質との結合を安定化させ
る：及び （８）　　過剰なナトリウムボロハイドライドを除去す
る丸めに洗浄するが、望ましい場合には、得られた処理
済み組織を次の使用までホルムアルデヒｒ水溶液に保存
する から成る方法である。

好ましいコラーゲン組織はウシまたはブタの心腹組織で
ある。この代シに、コラーゲン組織は硬膜、大腿筋膜、
弁組織または血管移植片組織でもあシ得る。

コラーゲン組織を等張性食塩溶液で前洗浄して、段階（
１）の界面活性剤による処理の前に、過剰な血球及び血
漿蛋白質全除去するのが好ましい。

段階（１）は界面活性剤０．５〜６重ｉｔ％含有の水溶
液で行うのが好ましく、また界面活性剤は上記の界面活
性剤リストの中から選択するのが好ましい。

この界面活性剤が陰イオン界面活性剤と非イオン界面活
性剤の混合物である場合に％特に望ましい結果が得られ
る。

特に好ましい界面活性剤溶液は、陰イオン界面活性剤が
１重量％のドデシル硫酸ナトリウムであシ、非イオン界
面活性剤が１重址チオクチルフエノキシポリエトキシエ
タノール及び／または１重量％ポリエチレン■ンルビタ
ンモノオレートであるような溶液である。

段階（１）を実施する場合に、コラーゲン組織を前記界
面活性剤溶液と室温において２〜６時間、特に約３時間
接触させるならば、充分な時間という必要条件が満たさ
れることがわかっている。

段階（３）の固定処理は、０．２５〜１重量−のグルタ
ールアルデヒｒ濃度を百する溶液中で実施するのが好ま
しい。

上述したように、コラーゲン組織、特く心腹組織を固定
溶液で処理する場合には、この段階は０．１Ｍ酢酸塩緩
衝液存在下の０．５重量％グルタールアルデヒｒ溶液中
にコラーゲン組織を約３時間半浸誓きすることによって
実施する。

次にグルタールアルデヒド３固定組織を例えば脱イオン
化または酢酸塩緩衝化水によって、細心に洗浄して、過
剰なグルタールアルデヒ）４全除去し。

次に段階（５）Ｋ従って処理する。

段階（５）に用いるアミノジホスホネートは次式の化合
物から選択する： Ｈ２ 特に好ましいアミノジホスホネートは式（１）の３％式
％ ン酸であプ、このアミノジホスホネーＨ−蒸留水に飽５
１１１サセ九新鮮な溶液（１６１１９／ｄ、　ｐＨ８，
０）に、１日に３時間ずつ３日間にわたって、その都度
新鮮な溶液にして組織を浸せきするのが好ましい、　　
　　　　　　　′　・ 組織をアミノジホスホネート中（各回折たに浸せきする
間隔に一グルタールアルデヒドに浸せきするならば、特
に有利な結果が得られる。これは実際には１段階（３）
、（４）及び（５）をくり返すことを意味する。

この処理後の薬物吸収（すなわちアミノジホスホネート
吸収）に対する多重架橋の累積効果は添付図面の図３で
グラフによって説明する：この効果ならびに薬物吸収に
対する界面活性剤、温度及び固定時間の効果を以下で考
察する。

薬物吸収後の組織処理における次の段階はナトリウムボ
ロハイドライト°による安定化であるが、この段階（力
は５〜１０ｗｗＩ／ｄのナトリウムボロハイトライ）４
＃度ｔ−有する溶液によって行うのが望ましい。

好ましい実施態様の方法を次の反応図式に要約する。こ
の図式では蛋白質−Ｎａ３は１個の遊離アミノ基を有す
る。コラーゲン組織中のコラーゲンまたはエラスチンを
分子を表し、　ＤＰ−Ｎａ２は遊離アミノ基１個ｔ−［
するアミノジホスホネート１分子を表す。

上記の反応図式中で、（３１、（５１及び（７）の数字
は本発明の方法の該当段階と同じであることを示すもの
であり、最後の式は末端ジホスホネート基金含む完全に
飽和し九共役体を説明する。

次の実施例は本発明の好ましい実施態様をさらに詳細に
説明するものでちる。

実施例 子牛の心臓から６膜を採取した。次に心腹組織を０．９
−食塩浴液で洗浄して、過剰な血液及び血漿蛋白質を除
去した。

脂肪組織と厚い付着組織を除去した。洗浄した脂肪金倉
まない心膜組織を次に小片（５〜１０ｃｍ×５〜１０　
ｅｘ　）に切断し、各組織片（以下では簡単に「組織」
と呼ぶ）を次の手段に従って処理した。

組織を、ドデシル硫＃！１重量％及び、商品名「Ｔｒｉ
ｔｏｎ　Ｘ１００Ｊで市販されているオクチルフェノキ
シポリエトキシエタノール１重量％を含有する界面活性
剤溶液中に゛組織金製せきし友。組織を室温（２３〜２
５℃）において３時間浸せきし几。

組織を界面活性剤溶液から取り出し、濾過器内で食塩溶
液によって、組織から生ずる泡が全く見られなくなるま
で完全に洗浄し、吸引と仇浄によって小胞を除去し九、
この洗浄段階の重点は組織から界面活性剤の実質的に完
全な除去を保証することであシ、洗浄溶液の性質はＮ要
ではなく、例えば蒸留水、脱イオン化水またはｐＨ５，
５ｔ−有する０−０５Ｍ酢酸塩緩衝ｉｔ−食塩溶液の代
シに使用可能であることを理解するべきでちる。

前記洗浄段階の後に、組織を０．１Ｍ酢酸塩緩衝液中の
０．５重量％グルタールアルデヒド中に３時間半浸せき
した。

この固定した組織′ｆ、０．０５Ｍ酢酸塩緩衝液（また
は脱イオン化水）中ですすぎ洗いして過剰なグルタール
アルデヒ）＊ヲ除き１次に０．０５Ｍ酢酸塩緩衝液中に
１．６岬／ＷＬｌの３−アミノ−１−ヒドロキシプロパ
ン−Ｌｌ−ジホスホン酸を含Ｗｆる飽和薬物溶液中に組
織を浸せきした。組織盆薬物、溶液中に２〜３時間浸せ
きした。

最初の薬物結合段階後に、組織ｔ’０．０５Ｍ酢酸塩緩
衝液／グルタールアルデヒド溶液中に再び沈め、この中
に１２時間浸せきした。

次に組織を再びすすぎ洗いしてから、薬物溶液中に２〜
３時間浸せきした。

次に固定と薬物結合段階をさらに２回くシ返した。

グルタールアルデヒドとアミノジホスホネート処理ヲ＜
シ返すことの累積効果を添付図面の図３でグラフによっ
て説明する。これらの段階は薬物吸収の萼意な増加があ
るかぎりくシ返すことができる。実際に各段階４回目（
すなわち、各段階を３回反復した後）の性能は、薬物の
実質的Ｋｉｋ大の吸収を達成するのに通常充分であった
。プロセス全体は、組織内のコラーゲンまたはエラスチ
ンのアミノ酸（リシン）へのグルタールアルデヒドを介
した、′アミノジホスホネートのアミノ酸の共役結合に
依存する。

薬物処理を最後にくシ返した後に、ナトリウムボロハイ
ドライト９５岬／ｄを含有する溶液中に組織を２５℃に
おいて３０分間浸せきした。

最後に組織をナトリウムボロハイトライｒ洛液から取シ
出し、すすぎ洗いして過剰なナトリウムボロハイドライ
ドを除去し、使用のために必要となるまで、０．５％ダ
ルタールアルデヒド９またはホルムアルデヒド中に保存
した。

移植する前に、弁をナトリウムボロハイドライト３溶Ｑ
またはグリシン（１０岬／ｒｒｔｌ）ですすぎ洗いして
ホルムアルデヒド３ｔ−除去するように注意することは
重要である。ホルムアルデヒドの除去は組織壊死を減じ
、創口治癒を促進させる。

上述の例で説明した処置に従って処理したｍ織から多く
の組織弁金製造した。

子牛は２か刃稜に殺して、弁ｔ−調べた。石灰化の徴候
μなく、添付図面の図６に示すように−・、内皮細胞被
覆が存在した。これらの結果は本発明の方法によって実
質的な改良が得られることを実証している。

本発明の方法によって改良された効果が得られること金
、図面の図１〜５にグラフによって説明し、図６では写
真によって示した結果が実証している。

図面の図１に関しては％室温（２５℃）において薬物吸
収が約３０分間に着実に増加し、界面活性剤前処理を行
わない場合に約２．９％の最大値に達することが見られ
る。これ以上の浸せき時間及び温度上昇（３７℃まで）
も薬物吸収に殆んど効果ｆ、ＯＷさない。

本発明の方法に従った界面活性剤による組織の処理は１
曲線向が示すように、６０分間まで吸収時間を延ばすの
みでなく、組織によって吸収される薬物量をも増加させ
る。さらに、薬物吸収は温度依存性であシ、３・７℃で
の処理は２５℃での吸収量よりも薬物吸収を２チ高めた
。

図２は薬物吸収に対する固定時間と温度の効果を説明す
る。固定時間の増加が必らずしも薬物吸収を増加させな
いことに注目すべきである。２４時間の固定時間が、２
時間までの薬物処理時間に関して；最大の薬物吸収を得
るのに最適であるように思われる。しかし、２５℃から
３７℃の固定温度の上昇は薬物吸収ｔを有意に増加させ
ている。

図３は、薬物吸収に対する多重架橋すなわち反復固定処
理の効果を説明する。このグラフは、上述の処置に従っ
てグルタールアルデヒｒ中で最初に固定した組織による
０時間から出発して、任意の［ＩＩ’ＬＪ１ａｂ、　ｃ
ｄ及びθｆによって表されるグルタールアルデヒｒ反復
処理Ｇｔ−伴って、各点在した１２０分間の反復薬物処
理りの効果を説明する。

これらの固定時間は、図中に点線で示したように、２ま
たは３時間から１２時間までの範囲であり、これらの固
定時間中は当然薬物吸収がない。しかし、この反復処置
によって効果は累積的になシ、薬物吸収のかなシの増加
が見られる。最初の処理期間の最後の薬物吸収曲線が殆
んど平らになるが、前記反復処置による次の増加が全体
的に意外に大きいことが注目されるであろう。このよう
な増力ａは先行波射で開示された方法では確実に達成さ
れないものであシ、達成不能なものである。

図４は、ナトリウムボロハイド９ライドくよる。還元を
行った、薬物（ＤＰ）結合に対するＰＨの効果を説明す
る。結合がアルカリ性溶液によって増強する傾向がある
ことが認められるであろう。

図５では、心腹組織への薬物の結合の強化に対する一次
界面活性剤処理の効果を説明する。組織に共役結合した
薬物の開会（％）は放射性トレーサーの使用によって決
定し、（１）対照として界面活性剤処理または固定を行
わない新鮮な心腹組織；（２）　　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　
１００　（ＴＸ）による処理後グルタールアルデヒド責
Ｇ、Ａ、）　　によって固定した心腹組織；（３）商品
名Ｔｗｅｅｎ　（Ｔｗ）で市販されているｄ　＋７オキ
シエチレン（イ）ソルビタンモノオレートによる処理後
グルタールアルデヒドで固定した心腹組織：及び（４）
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）での処理後グルター
ルアルデヒドで固定した心腹組織を用いて、薬物吸収量
を比較するためのテストヲ行った。

陰イオン界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウムによ
る前処理に１つて薬物吸収量が有意に増加するのが見ら
れるであろう。この効果は１本発明の望ましい態様によ
る陰イオン界面活性剤と非イオン界面活性剤との混合物
音用いることによって、さらに強化される。

図６は、わずか２か月の移植期間後に組織表面が内皮細
胞によって実質的に完全に被覆されて埴るのを示す。こ
の効果は移植の成功を実証するのに役立つものであシ、
さらにトロンボゲン形成、石灰化、感染または変性が実
質的に存在しないという点で、ここで検討した有利な結
果が先行技術では達成されない程度に達成されたことが
特に実証されている。

【図面の簡単な説明】

図１は、薬物吸収に対する温度と界面活性剤の効果を説
明するグラフであシ； 図２は、薬物吸収に対する固定時間及び温度の効果を説
明するグラフであり； 図３は、薬物吸収に対する多重架橋（固定）の効果を説
明するグラフであシ： 図４は、薬物結合に対するｐＨの効果を説明するグラフ
であ夛： 図５は、界面活性剤による一次処理後に生じた、６膜に
対する薬物結合の強化を説明するグラフであ夛； 図６は１本発明によって処理し九心膜組織から製造した
弁をウシに移植した２か刃径の弁上の内皮細胞被覆を示
す走査電子顕微鏡像（倍率、Ｘ２０００）を示し。 図７はシクロスポリンＡｏＪ：４造式を示す。 図１〜５のグラフにおいて、「薬物」なる用語は３−ア
ミノ−１−ヒドロキシプロパン−１，１−ジホスホン酸
を意味する。本発明によると、他のアミノジホスホネー
トによってもこれに匹敵する結果が得られる。 ｆ’　　−ｉ 代理人弁理士湯　筏　爾　エ　′ （タト賜ジ 及埋瞥ｕ　Ｃ４） Ｆ／θ、ｌ 処可１１％藺關　　Ｆｌθ、２ ｏｐ　５１丸　　　た蒐今Ｒ（叩 Ｆ／θ、４ ＦＩｏ、５ 区内）Ｊ＋’１′（１，・Ｆ（ｉ　’Ｗ　’＋”；　：
こり７、更なし）Ｆ／θ、６ ＦＩｏ、７ 手続補正書（方式） 昭和６０年１２月よ１日 特許庁長官　　宇　賀　道　部　　　殿コラーゲン組織
の処理方法 ６、補正をする者 事件との関係　　　出　願　人 住所 名称　　　マヨ・ファウンディシ冒ン ４、代理人 ５、補正命令の日付　　昭和６０年１１月２６日（発送
日）（１１明細書第４２頁第１５行目「を示し、」とあ
るのを「を示す図、」と訂正する。 （２）法人証明書及訳文を提出します。 （３）　　図面＠６図、第７図を先に提出したものと差
替えます。尚、内容に変更はありません。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）コラーゲン組織をプロテーゼ移植への利用に適す
   るように、また移植後にその上で内皮細胞の増殖を促進
   させるように処理する方法において、次の段階： （ａ）有害物質を実質的に完全に除去し、コラーゲン組
   織の繊維構造を露出させるために充分な時間前記組織を
   少なくとも１種類の界面活性剤と接触させる； （ｂ）得られた繊維マトリックスを洗浄して、実質的に
   全ての界面活性剤を除去する； （ｃ）洗浄した組織をグルタールアルデヒドで固定する
   ； （ｄ）グルタールアルデヒド固定組織を石灰化抑制剤、
   移植片に対する食細胞の浸潤及び作用を抑制する作用剤
   及び／または感染を抑制する作用剤によつて処理する；
   及び （ｅ）得られた作用剤／マトリックス組織を還元剤で処
   理して、組織に対する段階（ｃ）のグルタールアルデヒ
   ド及び段階（ｄ）の作用剤の結合を安定化する から成ることを特徴とする方法。
2. （２）界面活性剤が１重量％ドデシル硫酸ナトリウム及
   び１重量％オクチルフェノキシポリエトキシエタノール
   及び／または１重量％ポリオキシエチレン（２０）ソル
   ビタンモノオレートの混合物であり、コラーゲン組織を
   前記界面活性剤溶液と室温において３時間接触させるこ
   とを特徴とする、特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）コラーゲン組織を食塩溶液で前洗浄して、過剰な
   血液と血漿蛋白質を界面活性剤処理の前に除去すること
   を特徴とする、特許請求の範囲第１項または第２項記載
   の方法。
4. （４）界面活性剤処理から得られた組織の繊維マトリッ
   クスを０．１Ｍ酢酸塩緩衝液存在下の０．５重量％グル
   タールアルデヒド溶液に約３時間半浸せきし、その後過
   剰なグルタールアルデヒドを組織から洗浄することを特
   徴とする、特許請求の範囲第１項から第３項のいずれか
   に記載の方法。
5. （５）グルタールアルデヒド固定組織を石灰化抑制剤で
   充分な時間処理して、前記石灰化抑制剤の反応性アミノ
   基に、結合グルタールアルデヒド分子の実質的に全ての
   遊離反応性基を結合させること及び前記石灰化抑制剤を
   次式の化合物群： （ａ）▲数式、化学式、表等があります▼（ｂ）▲数式
   、化学式、表等があります▼ （ｃ）▲数式、化学式、表等があります▼（ｄ）▲数式
   、化学式、表等があります▼ （ｅ）▲数式、化学式、表等があります▼ から選択されたアミノジホスホネートであることを特徴
   とする特許請求の範囲第４項記載の方法。
6. （６）グルタールアルデヒド固定組織を（ｉ）遊離の反
   応性アミノ基を有するスポリン抗生物質もしくはメトト
   レキセート、または（ｉｉ）セフアロスポリンＣによつ
   て処理することを特徴とする、特許請求の範囲第４項記
   載の方法。
7. （７）組織をさらにナトリウムボロハイドライドによつ
   て処理して処理組織を安定化させることを特徴とする、
   特許請求の範囲第５項または第６項記載の方法。
8. （８）コラーゲン組織をプロテーゼ移植への使用に適す
   るように、また移植後にその上での内皮細胞増殖を促進
   させるように処理する方法において、次の段階： （ａ）有害物質を実質的に完全に除去し、繊維構造を露
   出させて、脂質、赤血球、血漿蛋白質、細胞器官及び死
   んだ細胞のフラグメントを実質的に全く含まないマトリ
   ックスを形成するために充分な時間前記組織を少なくと
   も１種類の界面活性剤と接触させる； （ｂ）段階（ａ）からの洗浄済み繊維マトリックスを蒸
   留水または食塩溶液ですすぎ洗いして、実質的に全ての
   界面活性剤を除去する； （ｃ）グルタールアルデヒド分子を組織の蛋白質分子に
   存在する実質的に全ての反応性アミノ基に結合させるた
   めに充分な時間前記マトリックスをグルタールアルデヒ
   ド水溶液中に浸せきする； （ｄ）グルタールアルデヒド固定組織を洗浄して、過剰
   なグルタールアルデヒドを除去する； （ｅ）結合グルタールアルデヒド分子の実質的に全ての
   遊離の反応性アミノ基をアミノジホスホネートの反応性
   アミノ基に結合させるために充分な時間、固定した組織
   を反応性アミノ基含有のアミノジホスホネートの水溶液
   で処理する； （ｆ）洗浄して過剰なアミノジホスホネートを除去する
   ； （ｇ）ジホスホネート結合組織マトリックスをナトリウ
   ムボロハイドライドによつて処理して、組織の蛋白質分
   子に対するアミノジホスホネート及びグルタールアルデ
   ヒドの結合を安定化させる；及び （ｈ）洗浄して過剰なナトリウムボロハイドライドを除
   去し、望ましい場合には、得られた処理済み組織を次の
   作用に備えてホルムアルデヒド水溶液中に保存する の連続した組合わせから成ることを特徴とする方法。
9. （９）コラーゲン組織がウシまたはブタの心膜組織、硬
   膜、大腿筋膜、弁組織または血管移植片組織であること
   を特徴とする、特許請求の範囲第１項から第８項のいず
   れかに記載の方法。
10. （１０）特許請求の範囲第１項から第９項のいずれかに
    記載の方法によつて製造した、プロテーゼ移植への使用
    に適した、固定し安定化したコラーゲン組織。