JP4512370B2

JP4512370B2 - 耐石灰化固定

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Publication number: JP4512370B2
Application number: JP2003564295A
Authority: JP
Inventors: ジラルドットジーン−マリー; ジラルドットマリー−ナディア
Original assignee: バイオメディカルデザインインコーポレイテッド
Priority date: 2002-01-25
Filing date: 2003-01-21
Publication date: 2010-07-28
Anticipated expiration: 2023-01-21
Also published as: EP1476583A4; WO2003064706A1; US20040253291A1; EP1476583B1; JP2005515870A; ES2488766T3; CA2473644A1; AU2003205255B2; US7479164B2; EP1476583A1; CA2473644C

Description

本発明は、移植する前にヒトまたは動物の組織を固定する方法に関し、特に、酵素分解に対してそのような組織を適切に耐性にし、石灰化に耐性を有するように、最小限の収縮で組織を固定する固定方法に関する。

グルタルアルデヒド保存または「固定」された生体プロテーゼ心臓弁の石灰化が頻繁に起こり、これは狭窄および逆流による障害の原因となる。加えて、移植されたデバイスからのグルタルアルデヒドの緩慢な放出は、細胞毒性である。グルタルアルデヒドに依存せずに組織を架橋または固定するいくつかの方法が提供されており、これらには、アシルアジ化物、光酸化、エポキシ、ゲニピン（genipin）およびカルボジイミドが含まれる。後者は、１９９８年３月３１日に発行された特許文献１に記載されている。しかしながら、固定の間に組織収縮が起こり、組織収縮を完全に回避する架橋方法は、未だ完成されていないことが認められている（非特許文献１参照）。このことは、固定の後に調整（tailoring）が行われる特定の心膜または組織に関しては特に重要ではないかもしれないが、正確な相互エンゲージメント、即ち、接合が非常に重要であり、過度の収縮が、弁を機能不全とする可能性のある尖（cusps）の不十分な接合を生じるかもしれないブタ大動脈根小葉に関しては問題である。

米国特許第５７３３３３９号明細書国際公開第９８／３４６５０号パンフレット（１９９８年８月１３日）国際公開第０１／１０２０９号パンフレット（２００１年２月１５日） J. Heart Valve Dis. 2001年; 10(1): 111-124頁 J. Heart Valve Dis. 1996年; 5(5): 518-25頁

したがって、最小限の組織収縮のみを起こす改善された固定技術に対する必要性が未だ存在し、そのような技術の探索が続けられている。

水溶性カルボジイミド処理を基礎とする改善された固定方法が発見され、その方法ではグルタルアルデヒド固定組織と同様に有効に架橋されているが、固定の結果として最小限の収縮のみを示し、哺乳動物に移植した後に、石灰化に対して驚くほど改善された耐性を示す組織を提供する。

さらに特別な態様では、本発明は、生きている哺乳動物への移植に適するように動物組織を固定する方法を提供し、この方法では、カップリングエンハンサーと組み合わされた形の、反応性カルボキシル部分と反応性アミノ部分との間のアミド結合の形成を促進する有効量のカップリング剤、および少なくとも２個の反応性アミン部分を含む架橋剤で、上記動物組織を処理するステップを含み、上記ジアミン架橋剤は少なくとも約８０ミリモルの量で存在し、上記架橋剤と上記動物組織の分子によって担持されている反応性部分との間のアミド化結合の形成をもたらすように上記処理を実施し、それにより固定の間に最小限の表面縮小のみを受けながらも上記組織をプロテアーゼ消化に対して耐性にし、上記固定された組織は石灰化に対して高度に耐性を有する。

他の特別な態様では、本発明は、生きている哺乳動物への移植に適するように新鮮な動物組織を固定する方法を提供し、この方法では、ドナー動物から切除された新鮮な組織を洗浄するがその他の点では変更しないステップと、少なくとも２個の反応性アミン部分を含む有効量の架橋剤、およびカップリングエンハンサーと組み合わされた形の、反応性カルボキシル部分と反応性アミノ部分との間のアミド結合の形成を促進するカップリング剤で、上記洗浄された動物組織を処理するステップとを含み、上記ジアミン架橋剤は少なくとも約８０ミリモルの量で存在し、上記架橋剤と上記動物組織の分子に担持されている反応性部分との間のアミド化結合の形成をもたらすように上記処理を実施し、それにより固定の間に最小限の表面縮小のみを受けながらも上記組織をプロテアーゼ消化に対して耐性にし、固定された組織は石灰化に対して高度に耐性を有する。

さらに特別な態様では、本発明は、動物組織のタンパク質分子間およびタンパク質分子内に架橋を含む動物組織から少なくとも部分的に形成されているプロテーゼを提供し、この架橋は、上記組織上の反応性部分間のアミド結合および上記組織上の反応性部分と少なくとも４個の炭素原子からなる炭素鎖長を有するジアミン架橋剤との間の追加のアミド結合を含み、アミド結合の形成を促進する有効量の水溶性カップリング剤、カップリングエンハンサーおよび約８０から約１３０ミリモルの濃度の上記ジアミン架橋剤を含有する水溶液に、上記組織を曝すことによって上記架橋は達成されている。

本発明が関与する基本的な固定方法は、本願明細書に参照することにより援用される特許文献１に記載されている。意外にも、ジアミン架橋剤の量をかなり増やすことによって、基本のカルボジイミド架橋プロセスを使用して劇的な効果が得られることが判明した。

本願明細書で使用する用語「生体プロテーゼ組織」は、ヒトまたは動物に全面的にまたは一部由来するか、他の生体組織から製造されていて、そのままか、生体プロテーゼの一部としてヒトまたは動物に移植されるべき臓器または組織を含むことを意味している。したがって、この用語には通常、心臓、心臓弁および他の心臓成分、心膜、代用血管、尿路および膀胱部分、腱、腸ならびに通常は皮膚、コラーゲンなどの軟部組織などの生体プロテーゼ組織が含まれる。特に限定されるものではないが、プロテーゼ組織はかなり多くの場合、ウシ、ヒツジ、ブタおよび可能な場合にはヒト組織を含む未加工の（natural）組織からなるものであるが、当業者に良く知られた他の天然材料からなるものを使用することもできる。

本願明細書に記載の１ステップの固定方法は、組織上または組織内に活性部分をほとんど残さないように、組織の反応性カルボキシル部分と、組織上の反応性アミン部分または架橋剤とを結合させることによって、生体プロテーゼ組織を安定化させることからなる。

本願明細書で使用される用語「架橋」とは、（ａ）組織の分子内および分子間に短い共有結合が生じる、組織の２個の反応性部分との間の、または（ｂ）組織上の反応性部分と共有結合架橋剤との間の、アミド結合の形成によって生じる結合など、組織の分子内および分子間における様々な長さの結合の形成によって生じる生体プロテーゼ組織の固定を意味する。

本願明細書で使用される用語「架橋剤」とは、タンパク質動物組織の上のカルボキシル基とアミド結合を形成することが可能な少なくとも２個の遊離した第１級アミン基を好ましくはその各末端部に有するジアミンを記述するものである。これは好ましくは、４から１２個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖化合物であるか、もしくは、おそらく好ましさは劣るが、反応性アミン部分が環の上に適切に位置する２，４，６−トリアミノベンゼンなどの炭素環式化合物を使用することもできる。より好ましくは、たいてい処理される新鮮な組織への適切な浸透を保証するために、約１９０以下、好ましくは１５０以下の分子量を有するジアミノ架橋剤またはトリアミノ架橋剤を選択する。最も好ましくは、各末端に位置する１個の反応性アミンと共に鎖長中に６から８個の炭素原子を有する直鎖である。架橋剤は、その鎖長中に付加的な置換基を有してもよいが、反応性アミンでのみ置換されている炭化水素、例えば、各末端にアミンを有する直鎖アルカンが好ましい。好ましい薬剤は、１，６−ヘキサンジアミンおよび１，７−ヘプタンジアミンである。

本願明細書で使用する用語「カップリング剤」および「カップリングエンハンサー」は、アミド結合の形成をそれぞれ促進および増強する試薬を意味する。それらの結合は、組織上の反応性アミンと反応性カルボキシルとの間に（したがって、かなり近くに位置する２個の反応性基を結合する）、または架橋剤上の反応性アミンと組織上または組織内の反応性カルボキシルとの間に形成される。ペプチド合成および関連分野の専門家は、そのような試薬、例えば、水溶性カルボジイミドおよびスクシンイミドを熟知しているだろう。

好ましい実施形態で使用されるカップリング剤は、塩酸１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）であるが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどの他の適切なカップリング剤を使用することもできる。ＥＤＣがカップリング剤として使用される場合に使用される好ましいカップリングエンハンサーは、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）であるが、ＮＨＳ、ＨＯＢｔおよびＤＭＡＰなどの他の適切なカップリングエンハンサーを代わりに使用することもできる。カップリング剤およびカップリングエンハンサーの濃度は変動させてもよい。しかしながら、当技術分野の専門家であれば、適切な濃度を容易に決定することができる。カップリング剤は、好ましくは約１０ｍＭから５００ｍＭ、より好ましくは約１００ｍＭ以下、最も好ましくは約２０ｍＭおよび５０ｍＭの濃度で使用する。カップリングエンハンサーは、好ましくは０．５ｍＭから約５０ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭ以下で使用する。

架橋剤、カップリング剤およびカップリングエンハンサー、さらにその反応生成物は好ましくは水溶性である。これらは、固定プロセスの間のプロテーゼ組織に対するダメージおよび移植後の毒性、炎症、石灰化などの危険性を最小にしつつ、固定を最大にし、組織の架橋を最適化するように選択すべきである。汚染の危険性を最小にするために、架橋のために使用される溶液の全てを０．４５μｍ以下のフィルターで使用前に濾過することが好ましい。

使用する架橋剤、カップリング剤およびエンハンシング剤に応じて、プロテーゼを架橋するための反応条件は変動させてよい。通常、架橋プロセスは、石灰化の危険性を最小化しつつ、最も効率的な架橋反応をもたらすと当業者によく知られているものから選択される水性緩衝液中で実施する。特に限定されるものではないが、適切な緩衝液の例には、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）および３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）などが含まれる。

この場合にも、使用する架橋剤、カップリング剤およびエンハンシング剤に応じて、緩衝された溶液のｐＨおよび濃度は変動させてもよい。好ましくは、プロテーゼへの害を最小にしつつ、最も効率的な架橋反応が得られるように、緩衝液の濃度およびｐＨを選択する。例えば、カップリング剤としてＥＤＣ、およびカップリングエンハンサーとしてスルホＮＨＳを使用する場合、処理溶液のｐＨを約６．０から約７．４に維持する。反応温度は、約４０℃から０℃であってよく、好ましくは単純に、室温で、例えば約２１から２５℃で反応を実施する。

通常、氷冷した０．８５％の生理食塩水または数種の他の適切な溶液で複数回にわたり濯がれるまで、本発明の１ステップの架橋方法によって固定されるべき新鮮なプロテーゼ組織を氷の上に維持する。このような洗浄または濯ぎを、好ましくはドナー動物から切除された直後に、しかし、いかなる場合においてもその後約７２時間以内に、好ましくは４８時間以内に実施する。さらなる貯蔵時間を必要とする場合には、引き続き、濯いだ組織を好ましくは２４時間以内とし、適切な緩衝液中に、約４℃などの低温で貯蔵する。このような新鮮な組織の特性を変化させるような他の予備処理は必要でないし、望ましくもない。

結果として生じた、固定された生体プロテアーゼデバイス特性の驚くべき改善は、生体プロテーゼ組織を効率的に固定するための必要量を上回る特定のジアミン架橋剤のかなり過剰な使用に起因することが判明した。驚くべきことに、（洗浄を除いて）その他では未処理の新鮮な組織を処理するために、特許文献１に記載されている最高量と比較して、約４から５倍多いジアミン架橋剤を使用すると、生じた製品の他の有利な特性に有害な変化をもたらすことなく、著しい改善が生じることが判明した。特に、後記では表面縮小と称される固定の間に生じる表面積の低下が、５０％を超えて減少し、石灰化に対する製品の耐性が劇的に高まる。熱変性、プロテアーゼ消化に対する耐性またはコラゲナーゼ消化に対する耐性に不利となる変化を伴うことなく、それらの利点が得られる。

ジアミン架橋剤の濃度は、好ましくは約８０から約１３５ミリモル、より好ましくは約９０から１３０ミリモル、さらにより好ましくは約９５から１２５ミリモル、最も好ましくは約１００から１２５ミリモルである。上述のように、好ましいジアミン架橋剤は、１２個以下の炭素原子、例えば４から８個の炭素原子を有する炭素鎖長を有し、さらに好ましくはその各末端にアミン基を有する直鎖アルカン、最も好ましくは１，６−ヘキサンジアミンである。動物組織の処理は、好ましくは、カップリング剤、カップリングエンハンサーおよび架橋ジアミンを含有する水溶液を塗布することによって実施する。水溶性カップリング剤、好ましくはＥＤＣおよびカップリングエンハンサー、好ましくはスルホ−ＮＨＳの濃度は、上述で検討したように、即ち、ＥＤＣが約１０ｍＭから約１００ｍＭおよびスルホ−ＮＨＳが約０．５ｍＭから約１０ｍＭである。

勿論、生体プロテーゼデバイスを哺乳動物、主にヒトに移植可能とする前に滅菌を行う必要があり、このようなことは、通常、包装前の最終ステップとして行われることが良く知られている。したがって、固定の間に最小限の表面縮小のみを有利に受けた組織が、その後の滅菌の間に収縮しないことが往々にして重要である。このことは勿論、（引き続き弁に調整される（tailored）そのままの材料とは逆に）、接合が不利な影響を受けうるかもしれない代替心臓弁などの処置においては特に重要である。生体プロテーゼ材料に向けて特に有効な滅菌プロセスは、特許文献２および特許文献３に記載されている。固定に続き、２５ｍＭのＥＤＣ水溶液中、４０℃で４８時間にわたって滅菌された生体プロテーゼ材料は最小限の表面縮小のみを示し、それは、かかる滅菌を３回繰り返しても維持されることが判明している。滅菌手順の反復を行うことによるそのような試験は、単に念のためであるだけでなく、生体プロテーゼデバイスを滅菌する場合には、どのような理由であっても、バッチと共に含まれるターゲットインジケータが、手順終了時に未だ陽性を示す場合には滅菌手順を繰り返す必要があり、稀な場合にはこれを２回繰り返す。したがって、このような多少極端な条件にかけられた組織に関して表面縮小を測定することが賢明であると考えられた。さらに、２０％のイソプロパノールおよび２５ｍＭのＥＤＣおよび１００ｍＭのエタノールアミン（ブロッカー）である８０％の緩衝水を含有する溶液を用いる処理下で、４０℃で４８時間にわたって滅菌を実施した場合であっても、著しい収縮は生じないことが判明した。

以下の実施例によって、本発明の有効性を示すために実施された実験を記載し、本発明者らが現在認識している最適な方法を記載する。しかしながら、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の境界線は、本願明細書に添付されている請求項に記載されている。

この第１の実験は、架橋の間の表面縮小に対する１，６−ヘキサンジアミン濃度の効果を示すために実施した。

新鮮なブタ大動脈根から８０枚の小葉を切除した。過剰な緩衝液を除去するために、各小葉を吸い取り、流入側を下にして、平らにガラス表面上に置いた。次いで、標線を有する解剖用顕微鏡下に、図１に示されているように放状および円周方向に、尖を、製造者の推奨に従って組織マーキング染料でマーキングした。中央のドットと４個の外側ドットそれぞれとの間の距離は、架橋前は５ｍｍであった。したがって、マーカー間の最大距離は１０ｍｍであった。次いで、小葉をランダムに、それぞれ２０個の尖からなる４つの群に分け、次の条件下でインキュベーションすることによって架橋した。

第１群．２０ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）および１ｍＭのＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を含有する２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５中の１１．２５ｍＭの１，６−へキサンジアミン（ＤＩＡ）の水溶液、室温で９６時間。
第２群．第１群と同じであるが、６２ｍＭのＤＩＡを使用。
第３群．第１群と同じであるが、１１２．５ｍＭのＤＩＡを使用。
第４群．特許文献１に従って、小葉を２ステップの手順でインキュベーションした。第１ステップは第１群と同じく４８時間で、これに２０ｍＭのＥＤＣ／１ｍＭのスルホ−ＮＨＳの存在下で７．５ｍＭのスベリン酸を用いる第２ステップのインキュベーションを続けた。

架橋が完了した後に、標線を有する解剖用顕微鏡を使用して、放射および円周方向に、マーカー間の距離を再び計測して、表面縮小を算出した。それぞれ使用する前に顕微鏡の校正を行った。サイズの縮小を算出し、その結果を表１に示す。

この実験で、２ステップの固定試料、即ち、第４群は、第３群での約３％のみの表面縮小とは対照的に、１２％の表面縮小を示した。比較可能な条件を使用する実験におけるグルタルアルデヒド固定小葉の収縮は、５％以上であることが判明した。小葉収縮の著しい縮小は高いＤＩＡ濃度で得られており、この結果は、少なくとも２０年間に亙って業界基準であったグルタルアルデヒド固定よりも優れていることを証明している。

次の実験は、架橋における１１２．５ｍＭを上回るＤＩＡ濃度の効果を決定するために実施した。

各条件ごとに２１枚の小葉を、新鮮なブタ大動脈根から切除した。各条件で、７個の根およびそのそれぞれ３枚の切除された小葉を、２０ｍＭのＥＤＣおよび１ｍＭのスルホ−ＮＨＳの存在下の２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１１２．５ｍＭまたは１６０ｍＭのＤＩＡの水溶液２５０ｍｌ中で、室温で９６時間にわたってインキュベーションした。インキュベーション後に、試料を滅菌生理食塩水で洗浄し、次いでイソプロピルアルコールの不在下（０％）または５％または２０％の存在下で、２５ｍＭのＥＤＣにおいて４０℃で４８時間にわたり、３回滅菌した。１つの条件では、２０％のイソプロパノールを含有する溶液による滅菌の間に、１００ｍＭのエタノールアミンをブロッカーとして加えた。

結果を表２に示すが、結果は、１１２．５ｍＭのＤＩＡで固定された小葉の３回の連続する滅菌処理は、イソプロピルアルコールの不在下に、１１２．５ｍＭのＤＩＡに関する表１と比較して、著しい組織の収縮は誘発しないことを証明している。５または２０％のアルコールの添加を伴う滅菌は、多少の収縮は誘発したが、滅菌を２０％のイソプロピルアルコールの存在下で行う場合に（さもないと収縮が最大となる）、１００ｍＭのエタノールアミンを加えることによって、繰り返される滅菌によるこのような収縮が著しく阻害される。データは、架橋ステップの間にＤＩＡ濃度を１６０ｍＭまで高めることで、残留する１４％の組織収縮を誘発する（これは、イソプロピルアルコールの不在または存在下での滅菌の間に影響を受けなかった）ことを示す。これは、標準的な固定処理によって生じる収縮よりもかなり大きな収縮量である。

次の実験は、３つの異なる観点から、ブタ大動脈弁の架橋に対するインキュベーション期間の作用を決定するために実施した。

それぞれ４つの弁からなる５つの群を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１１２．５ｍＭのＤＩＡ、ｐＨ６．５、２０ｍＭのＥＤＣおよび１ｍＭのスルホ−ＮＨＳを含有する水溶液中、３、６、２４、４８および９６時間インキュベーションした。次いで弁を、滅菌生理食塩水で洗浄して、反応副産物を除去した。これらを使用するまで、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．８５％の塩化ナトリウム、ｐＨ７．４および２０％のイソプロピルアルコール中で貯蔵した。熱変性試験およびコラゲナーゼおよびプロテアーゼによるタンパク質分解に対する耐性に関する試験を、架橋効力を決定するために行った。これらの試験手順は、非特許文献２に記載されている。新鮮なブタ大動脈根を対照として使用した。

ａ．熱変性
小葉を、大動脈根から切除し、上述の参考文献に記載されている熱安定性試験にかけた（１条件当りｎ＝３）。結果を図２に示すが、結果は、尖組織の架橋は、熱変性に対して最大の安定性を伴って適度に迅速に生じ、それはインキュベーションの約２４時間目に達成され、その後はほとんど変化が生じなかったことを示している。

ｂ．プロテアーゼによる消化に対する耐性
小葉（１条件当り９枚）および大動脈壁のクーポン（１条件当たり１２枚）を、上述の参考文献に記載されている試験に従って５０℃で２４時間にわたってプロテーゼ消化に供した。結果を図３に示すが、これは、心臓弁膜尖および大動脈壁の両方の消化に対する最大耐性が架橋の約２４時間後に生じることを示している。

ｃ．コラゲナーゼによる消化に対する耐性
小葉（１条件当り９枚）および大動脈壁のクーポン（１条件当たり１２枚）を、上述の参考文献に記載されている試験に従って３７℃で７２時間にわたってコラゲナーゼ消化に供した。結果を図４に示すが、これは、最大耐性が、固定のほぼ２４時間後に実質的に得られること、および耐性がさらなる２４時間の処理の結果として最小限しか改善されないことを証明している。

実施例３で得られた良好な結果に従って、ＥＤＣおよび１１２ｍＭのＤＩＡを使用して架橋された組織と、標準的なグルタルアルデヒド固定組織とを比較するために、実施例３と概して同じ試験レジメを使用して実験を実施した。

１１２ｍＭのＤＩＡ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５、２０ｍＭのＥＤＣおよび１ｍＭのスルホ−ＮＨＳを含有する水溶液を使用して、ブタ大動脈根を架橋した。室温で９６時間にわたってインキュベーションした後に、弁を十分に滅菌生理食塩水で洗浄して、未反応の試薬および反応副産物を除去した。弁を、実施例２の滅菌方法に従い、２０％のイソプロパノールを使用して３回滅菌した。標準的なグルタルアルデヒド固定ブタ大動脈根および未固定ブタ大動脈根は、ＭｅｄｔｒｏｎｉｃＨｅａｒｔＶａｌｖｅｓ（ＳａｎｔａＡｎａ，ＣＡ）により提供された。小葉および大動脈壁クーポン（５ｍｍ×５ｍｍ）を切除し、実施例３に一般的に記載されている架橋試験にかけた。加えて、小葉および大動脈壁クーポンを、若いラットに真皮下で８週間移植して、石灰化に対する耐性を評価した。

ａ．熱変性
小葉の熱変性の結果を、表４Ａに表す。新鮮な小葉（即ち、未固定小葉）およびグルタルアルデヒド固定小葉での熱変性温度は、それぞれ６５．５℃および８４．９℃であることが判明し、これは、先行する試験結果と一致する。ＥＤＣ架橋された小葉で決定された熱変性温度は、８０．５℃であり、これは、新鮮な組織を１５℃上回る著しい増加を示している。グルタルアルデヒド固定小葉よりも若干低いが、これは、十分に許容可能であると考えられる。このより低い変性温度は、上述の動的差異と共に、１１２ｍＭのＤＩＡの存在下でのＥＤＣ架橋は、グルタルアルデヒド固定の架橋とは異なる架橋を生じることを示している。

ｂ．プロテアーゼ消化に対する耐性
通常よりも僅かに強い試験用液をこの試験のために使用した。プロナーゼ２４２ｍｇを、１５０ｍｇのみではなく、溶液２５０ｍｌに溶かした。プロテアーゼ消化に対する耐性の結果を、表４Ｂに示す。新鮮な組織は、インキュベーションの２４時間後に完全に消化される。プロテアーゼ消化に対する耐性に関しては、尖および大動脈壁の両方で、この高いジアミン濃度を使用するカルボジイミド固定と標準的なグルタルアルデヒド架橋との間に著しい差異はない。これらの結果は、この架橋方法が、グルタルアルデヒド固定と同様に効果的であることを示唆している。

ｃ．コラゲナーゼ消化に対する耐性
コラゲナーゼ消化に対する耐性の結果を表４Ｃに示す。主にコラーゲンからなる新鮮な小葉は十分に消化される。しかしながら、各大動脈壁の大部分は残る。尖に関しては、ＥＤＣ固定組織とグルタルアルデヒド固定組織との間に著しい差異はない。しかしながら、グルタルアルデヒド固定壁組織は、ＥＤＣ固定組織よりもコラゲナーゼ消化に対してやや耐性が劣るようである。総体的に、ＥＤＣおよび１１２ｍＭのＤＩＡで架橋された組織は、グルタルアルデヒドで架橋された組織と少なくとも同等のコラゲナーゼに対する耐性を有することを、この結果は示している。

ｄ．若いラットへの移植８週間後の石灰化
小葉および壁クーポン（１ｃｍ×１ｃｍ）を、滅菌されたブタ大動脈根から切除した。この試料を、滅菌生理食塩水で２分間にわたって３回洗浄し、次いで、ランダムに若いラットに真皮下で移植した。８週間後に、試料を回収し、洗浄し、上述の参考文献に記載されている定量カルシウム分析にかけた。

表４Ｄに示されている結果は、１１２ｍＭのＤＩＡの存在下にＥＤＣで架橋された組織は、尖であっても大動脈壁であっても、グルタルアルデヒド固定組織よりも、石灰化に対して非常に高い耐性を有することを示している。

さらに、大動脈壁石灰化は、グルタルアルデヒド固定大動脈壁組織における石灰化よりもかなり低いだけではなく、特許文献１に記載されているように固定された比較可能な大動脈壁組織よりも低かった。移植８週間後の壁組織における上記報告のカルシウムレベルは、移植のちょうど４週間後に先に観察されたレベルをやや下回る。移植８週間後以前に、このような大動脈壁中のカルシウムレベルは、試料１ｇ当りＣａ⁺⁺約８０ｍｇであり、これは、本試料で現在判明しているレベルの実質的に２倍であり、臨床的に重要であると考えられる。

上述の実施例で得られた結果は、生体プロテーゼ材料の特性、例えば、その熱変性、プロテアーゼ消化に対する耐性およびコラゲナーゼ消化に対する耐性を改善するために実施された１ステップの固定の結果として生じる表面積の縮小を最小化する際の本発明の有効性を示している。これに関連して、最近数十年間は、グルタルアルデヒド固定が、一般的に認められた標準であり、そのため、同じ組織のグルタルアルデヒド固定との比較を公平に行うことができる。改善された固定プロセスを使用して処理された組織の特性は有利に、グルタルアルデヒドで７日間にわたって処理された同じ組織の特性とこれら３つの態様に関して匹敵することが判明した。さらに実施例３は、このプロセスを使用する固定の効果は、基本的に約２４〜４８時間のインキュベーションの後に最大化すること、およびさらなる処理は、有害ではないが、必要ないようであることを示している。最大の架橋を達成するこの２４時間の期間は、１時間後または２時間後に実質的に完了する他の架橋手順とは対照的であり、このことは、本発明のプロセスが、期間全体で新鮮な組織への十分な浸透に依存しているものとは別の架橋が、まさに生じているようであることを示している。したがって、８時間の処理の後に、特性のかなりの改善が得られるように見えるが、好ましくは、ＥＤＣ−高アミン濃度固定を室温付近で少なくとも２４時間にわたって実施する。おそらく、最も劇的な改善は、耐石灰化性で生じ、これは多くの点で、生体プロテーゼデバイスの最も重要な特性の１つである。それというのも、石灰化は、その作動中に狭窄および逆流を引き起こすプロテーゼ心臓弁での障害の主な原因の１つであることが判明しているためである。特許文献１に記載のプロセスによる固定は以前に、比較可能なグルタルアルデヒド固定生体プロテーゼ組織を上回る耐石灰化性における改善をもたらしたが、表４Ｄは、大動脈壁組織は、グルタルアルデヒド固定組織の耐性のほぼ２倍の石灰化に対する耐性を示すこと、およびこの方法で処理された小葉は、２０倍近く高い耐性を示すことを示している。この意外な耐石灰化性は、本発明により処理された組織を含む生体プロテーゼデバイスに貴重な耐久性を付与すると期待される。

本発明は、本発明者らに現在分かっている本発明を実施するための最も良好な方法を構成する一定の好ましい実施形態に関して記載しているが、本願明細書に添付されている請求項に定義されている本発明の範囲から逸脱することなく、当技術分野の通常の技術を有するものに明らかであるような様々な変化および変更をなすことができることは、理解されるべきである。例えば、処理を好ましくは、水溶液を使用して実施するが、他の生体相容性溶剤または溶剤の組合せを代わりに、当技術分野で通常知られているように使用することができる。

本発明の具体的な特徴は特許請求の範囲において強調される。

固定の間に生じる表面積低下の量を測定するために実施されたマーキングを示すドットが表示されているブタの大動脈弁小葉を示す図である。ブタの小葉の熱変性に対する固定の継続時間の作用を示すグラフである。固定の持続期間に対して、壁組織および小葉のタンパク質分解酵素による消化に対する耐性を示すグラフである。固定の持続期間に対して、壁組織および小葉のコラゲナーゼによる消化に対する耐性を示すグラフである。

Claims

生きている哺乳動物への移植に適するように動物組織を固定する方法において、
Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）からなる群から選択される水溶性カップリングエンハンサーと組み合わされた形の、反応性カルボキシル部分と反応性アミノ部分との間のアミド結合の形成を促進する有効量の水溶性カルボジイミドカップリング剤、および４個から１２個の炭素原子を有する炭素鎖の両端に少なくとも２個の反応性アミン部分を含む架橋剤で、前記動物組織を処理するステップを含み、
前記ジアミン架橋剤が８０ミリモルから１３５ミリモルの量で存在し、前記架橋剤と前記動物組織の分子によって担持されている反応性部分との間のアミド化結合の形成をもたらすように前記処理を実施し、
それにより、固定の間に最小限の表面縮小のみを受けながらも前記組織をプロテアーゼ消化に対して耐性にし、前記固定された組織は石灰化に対して高度に耐性を有することを特徴とする方法。
前記架橋剤は、１，６−ヘキサンジアミンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記ヘキサンジアミンは、１００から１２５ミリモルの濃度で存在することを特徴とする請求項２に記載の方法。
前記カップリング剤は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
前記処理を、室温付近で２４時間にわたって実施することを特徴とする請求項４に記載の方法。
新鮮な組織を組織が切除されてから７２時間以内に処理し、処理の前に、該組織を洗浄するが、その他の点では変更しないことを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の方法。
グルタルアルデヒドで固定された比較可能なプロテーゼよりも高い程度で石灰化に対して耐性を有することを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の方法によって処理されたプロテーゼ。
動物組織のタンパク質分子間およびタンパク質分子内に架橋を含む動物組織から少なくとも部分的に形成されているプロテーゼであって、
架橋が、前記組織上の反応性部分間のアミド結合および前記組織上の反応性部分と４個から１２個の炭素原子からなる炭素鎖長を有するジアミン架橋剤との間の追加のアミド結合を含み、
アミド結合の形成を促進する有効量の水溶性カルボジイミドカップリング剤、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）からなる群から選択される水溶性カップリングエンハンサーおよび８０から１３０ミリモルの濃度の前記ジアミン架橋剤を含有する水溶液に、前記組織を曝すことによって、前記架橋が達成されていることを特徴とするプロテーゼ。