JP2001516029A

JP2001516029A - 薬物の選択方法

Info

Publication number: JP2001516029A
Application number: JP2000510029A
Authority: JP
Inventors: ヘンリー・アール・ウルフ
Original assignee: ニユコメド・イメージング・アクシエセルカペト
Priority date: 1997-08-20
Filing date: 1998-08-20
Publication date: 2001-09-25
Also published as: GB9717652D0; AU8817398A; NO20000811D0; EP1005655A2; CA2300903A1; WO1999009417A9; WO1999009416A3; WO1999009416A2; WO1999009417A2; AU8816898A; NO20000811L; WO1999009417A3

Abstract

(57)【要約】出発オリゴペプチドから、オリゴペプチドの受容体に対する結合親和性と上記結合の生物学的応答との比に変化を招来する単一部位アミノ酸修飾を有する複数個のオリゴペプチドを作り、二次構造に関与するオリゴペプチドにおける成分の同定および上記成分の非天然アミノ酸による置換、同定された修飾部位に対するアミノ酸セットの使用に基づくコンビナトリアルライブラリーの構築ならびに所望の結合産生を有する第一のライブラリー中に産生されたオリゴペプチドに基づく更なるライブラリーの構築からなる薬物候補化合物の選択方法。候補薬物はライブラリーの同定されたメンバーから選択される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】

本発明は、生物学的受容体に対して親和性を有する薬物候補化合物を選択する
方法に関する。

【０００２】

【背景技術】

細胞表面たとえば赤血球、内皮細胞、腫瘍細胞等の表面は、生物学的リガンド
に対する特徴的な結合部位を有する。このような結合部位はしばしば、二次構造
すなわち細胞表面プロトンのフォールディングコンフォーメーションの結果であ
り、これらへの結合は細胞による応答を誘発する。ひとつの例は、胎盤哺乳類動物の腸管を裏打ちする細胞の、先端刷子縁膜上に
のみ見いだされるＳＴ受容体である。

【０００３】各種の細菌、たとえば、哺乳動物の腸に感染する大腸菌（Eschericia coli）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、シトロバクター・フロインディイ（Citrobact
erfreundii）およびエルシニア・エンテロコリティカ（Yersinia enterocolitic
a）は、ＳＴ受容体に結合し、最終的に、腸管腔内への液体分泌、したがって下痢を招来する生化学的過程のカスケードを誘発する同族のペプチドトキシンを産
生する。これらのＳＴエンテロトキシンは開発途上国における感染性下痢疾患の
主な原因であり、世界中の小児人口の死亡率および罹病率の原因の四位に位置す
る。これらのエンテロトキシンは、通常、１８または１９個のアミノ酸残基を含
有し、プロテアーゼに対して安定で、１００℃において１５分間インキュベート
したのちにもそれらの生物活性を維持する。このような熱安定性ＳＴエンテロト
キシンの例を以下の表１に掲げる。

【０００４】

【表１】

【０００５】天然に存在するＳＴエンテロトキシンはたとえば多数のジスルフィド橋の存在
により比較的複雑な二次構造を有する。すなわち、大腸菌ＳＴａは位置５および
１０、６および１４、ならびに９および１７の間にジスルフィド橋を有する。このような細胞受容体結合オリゴペプチドは、治療的および診断的目的の両者
において興味がもたれる。

【０００６】すなわち、たとえば細胞表面受容体に結合できるオリゴペプチドは、治療的に
または診断的に有効な残基にカップリングさせ、その残基をこのような細胞表面
受容体を有する部位に送達させる生物学的ベクターとして作用させることが可能
である。これはとくに、核画像技術たとえばシンチグラフィー、ＳＰＥＣＴまた
はＰＥＴで検出可能な核ヌクレオチドが生じて、標的受容体を有する生体部位に
蓄積し、したがってこのような部位の検出、所望によりマッピングを可能にする
放射医薬の分野において興味がある。受容体が、望ましくない細胞たとえば腫瘍
細胞にもっぱらまたは優先的に生じる場合、細胞毒性用量の放射線を同様に放射
線照射ベクター結合放射性核種を用いて関連部位に送達することができる。

【０００７】上述の熱安定性ＳＴエンテロトキシンの場合、ＳＴ受容体は天然には腸管腔内
にのみ生じ、結腸癌の転移の結果としてのみ生体内の各所に認められる。放射性
核種標的化ＳＴオリゴペプチドの非経口的投与が、このような転移の検出および
処置に使用できる（US-A-5518888およびWO 95／11694参照）。しかしながら、一般的に、ネイティブなオリゴペプチドの治療的または診断的
残基のためのベクターとしての使用は、たとえばネイティブなオリゴペプチドが
細胞表面受容体における結合時に自然の帰結をもたらすという問題がある。

【０００８】したがって、ネイティブな細胞表面受容体結合ペプチドのペプチド性もしくは
非ペプチド性類縁体、とくにアゴニストよりむしろアンタゴニストである物質、
すなわち受容体に結合しても受容体へのネイティブなリガンドの結合による自然
の帰結を誘発しない物質の開発が探求されていることはよく知られている。ＳＴエンテロトキシンの場合は、下痢を抑制するようにＳＴアンタゴニストを
経口的に投与することができる。ネイティブなリガンドの類縁体についてはまた、標識条件もしくは保存時等に
おけるインビボでのより高い安定性またはインビボにおいてより長い血中プール
保持時間を有する類縁体を探求することができる。

【０００９】候補受容体−アゴニスト（アンタゴニスト）の作り出しは通常、ネイティブな
リガンドの修飾から、ネイティブなリガンドの非ペプチド性類縁体を作ることに
よって、生物学的オリゴマーのランダムライブラリーからの選択によって、また
はこれが明らかにされてきた受容体ポケットに幾何学的および機能的の両者でフ
ィットする化学構造を作ることによって進められる。後者の場合、候補薬剤の開
発には一般にコンピューター補助分子設計（ＣＡＭ−Ｄ）が包含される。

【００１０】これらの技術はすべて重大な欠点を有する。すなわち、候補構造はＣＡＤ−Ｍ
によって同定されるが、同定された至適なリガンド構造が合成困難であったり、
許容できない毒性を示したり、インビボにおける安定性が不十分であったりある
いは選択性が不十分であり、そして、選択過程の精密化に比較的時間を要する。
ランダムに発生されたオリゴペプチド、オリゴヌクレオチドもしくはオリゴ糖の
コンビナトリアルライブラリーの使用は逆重塁（deconvolution）の問題を伴い、広範な実験を行うことなく適当な分布、安定性および選択性を有する物質を同
定する役には立たない。

【００１１】既知のネイティブなリガンドの構造の修飾は、一般的に単一のアミノ酸の変化
たとえば欠失、挿入または交換を介して進められる。大きなオリゴペプチドでは
可能な単一アミノ酸修飾の数は莫大となり、したがってこの方法は著しく時間の
かかるものとなる。

【００１２】既知のネイティブなリガンドの純粋に非ペプチド性構造で機能性の類縁体の作
り出しは、ＣＡＭ−Ｄについて前述したのと同じ問題、すなわち初期の候補物質
以上の精密化に複雑な化学が関与し、また毒性、選択性および安定性には比較的
貧弱な予測性しか期待できない。

【００１３】本発明は合理的およびコンビナトリアルな薬物設計技術の新規な組み合わせを
使用して、受容体結合能力を有する薬剤候補化合物を選択する方法の改良を目的
とするものである。

【００１４】

【発明の開示】

この観点に鑑み、本発明は、薬物候補化合物を選択する方法において、 i）細胞表面または他の受容体部位に結合親和性を有する出発オリゴペプチドを同定し、ii）上記出発オリゴペプチドに関して単一部位のアミノ酸修飾を有す
る複数個の同族のオリゴペプチドを作り、オリゴペプチドおよび上記受容体部位
の間の結合親和性対オリゴペプチドおよび上記受容体部位の間の結合の生物学的
応答の比の増大（または減少）を示すオリゴペプチドを産生する修飾部位を同定
し、iii）上記出発オリゴペプチドのその二次構造に関与する成分を同定し、iv ）工程(ii)において同定される修飾部位に対してアミノ酸のセット、たとえば出
発オリゴペプチドおよび／または上記増大（または減少）を有する同族のオリゴ
ペプチドのその修飾部位におけるアミノ酸と機能的な均等性を有するセットを選
択し、ｖ）工程(iii)において同定される成分に対し、その成分の二次構造を模倣する少なくとも１個の非天然アミノ酸を選択し、vi）上記修飾部位に、上記の
選択されたアミノ酸セットに相当するアミノ酸残基を有し、好ましくは上記の非
天然アミノ酸に相当するアミノ酸残基を上記成分の部位に有するオリゴペプチド
の第一のコンビナトリアルライブラリーを作り、vii）予め決定された最低値より高い結合親和性値を有し、そして所望により結合親和性対生物学的応答の比較
的高い（または低い）比を有する上記第一のライブラリーのメンバーを同定し、
viii）所望により、拡大および／または縮小により、アミノ酸のセットを上記修
飾部位についてまたは非天然アミノ酸を上記成分について変化させて、上記第一
のライブラリーには存在しなかったメンバーを有するオリゴペプチドの更なるコ
ンビナトリアルライブラリーを作り、上記第一のライブラリーを同定されたメン
バーに比較した場合の結合親和性値の改良、および／または結合親和性対生物学
的応答の比の増大（もしくは減少）、および／またはインビボパラメーターたと
えば安定性、毒性、代謝等の改良を有する上記の更なるライブラリーのメンバー
を同定し、所望により工程(viii)を繰り返したのち、上記の第一のおよび更なる
ライブラリーの少なくとも一方が上記非天然アミノ酸または酸の残基を含有する
オリゴペプチドを含むことを条件に、ix）上記の単数または複数のライブラリー
から候補薬物を選択することからなる方法を提供する。

【００１５】コンビナトリアルライブラリーの発生のためのセットのアミノ酸の選択および
実際に修飾の可能な部位の選択には、インビボでの貧弱な安定性または短い血中
プール寿命を生じると考えられるアミノ酸およびオリゴアミノ酸モチーフを同定
し、これらを試験するライブラリーから排除するように試みることが一般に好ま
しい。すなわち、たとえば以下のアミノ酸またはアミノ酸配列は一般に回避され
るか、または置換されるべきアミノ酸またはアミノ酸配列である。Ｔｙｒ-Ｇｌｙ；遊離のα−アミンを有するペプチド；Ｐｒｏ−ｘ（式中、ｘは天然のアミノ酸である）；ｘ−Ｐｈｅ−ｘ；遊離のα−カルボキシルをもつペ
プチド；ｘ−Ｌｙｓ；Ｌｙｓ−Ｌｙｓ；Ｇｌｎ−Ｇｌｎ；ｘ−Ａｒｇ；Ａｒｇ−
Ａｒｇ；Ｇｌｙ−Ｇｌｙ；Ａｌａ−Ａｌａ；およびｘ−Ｔｙｒ。

【００１６】二次構造の非天然アミノ酸模倣体の選択には、多くの可能性が本技術分野にお
いて周知である。すなわち、たとえば以下の置換が行われる。β−ターン模倣体：

【化４】（式中、ＸはＮＨ、

【化５】であり、Ｒは任意の置換基、たとえば任意にヒドロキシル化されたＣ₁〜Ｃ₁₀アルキル、アラールキル、アリールまたはアラルキルである）

【００１７】γ−ターン模倣体：

【化６】

【００１８】β−シート模倣体：

【化７】ジスルフィド橋模倣体：カルボ-スルフィド類縁体

【００１９】すなわち、たとえば大腸菌ＳＴａにおいては、Ｎ−末端Ａｓｎはヘリックス末
端キャップ（近くのアミドカルボニル、この場合はＴｙｒ⁴に水素結合が可能）として同定可能であり、これはヘリックス、この場合は３₁₀ヘリックスを安定化
できる。すなわち、腸毒素産生性を増大させるヘリシティーに好ましい突然変異
であり、ＳＴ受容体アゴニストは、類似の三次元配置を採用するためＮ末端に機
能性基を要求することが期待される。

【００２０】同様に、配列Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＸＸ（式中、ＸＸはＳｅｒ、ＴｈｒまたはＡｌ
ａである）は通常Ｉ型β−ターンを伴う。このような配列は大腸菌ＳＴａの位置
１１〜１３に生じる。ＡｓａまたはＡｌａに対する他の突然変異は一般に他の形
態のβ−ターンまたはγ−ターンを生じる。大腸菌ＳＴａにおけるＩ型βターン
を破壊する突然変異はアゴニスト（たとえば、Ａｌａ１３Ｇｌｙ、Ａｓｎ１１
ＶａｌまたはＡｓｎ１１Ｇｌｙ）またはアンタゴニスト（たとえば、Ｐｒｏ１２Ｇｌｙ）を生じる（ＹＹ−ｎ−ＹＹは、ＸＸⁿがＹＹⁿに変化することを意味する）。

【００２１】大腸菌ＳＴａのＣ−末端はまた、二次構造すなわちII型βターンを伴う。二次構造に関与するアミノ酸の組み合わせは一般的に、既知の構造から予測で
きるかまたはＸ線結晶解析によって決定できる（“Protein folds: a distance-
based approach", Bohr and Brunak編, CRC Press, NY, 1995および “Protein
Folding", Gierasch and King編, AAAS, Washington DC, 1990参照）。

【００２２】工程vi）における第一のライブラリーの作り出しには限定された修飾部位のセ
ットもしくは二次構造成分部位における修飾によって産生される１種または２種
以上の限定されたライブラリーの選択によって、たとえば二次構造成分部位の１
種、２種以上またはすべてが無変化のまま、もしくは修飾部位の最小の見込みの
ある（または実際、最も見込みのある）１種もしくは２種以上が無変化のまま残
された「サブライブラリー」の選択によって、限定されたアミノ酸のセットを用
いることが可能である。

【００２３】任意工程（viii）における更なるライブラリーの作り出しには、修飾／成分部
位のためのアミノ酸のセットは通常、第一のライブラリーで有効であることが見
いだされなかったアミノ酸を回避し、成功したアミノ酸に機能的に類似するアミ
ノ酸、たとえば全体的なライブラリーサイズを抑制するため、またはそれらが購
入するのに比較的高価であるかもしくは組立てるには複雑すぎるので、第一のラ
イブラリーの作り出しに用いるセットから省かれたアミノ酸に置換するように変
化させる。すなわち、たとえば第一のライブラリーには、アミノ酸の相同な群の
単一のメンバーを選択し、たとえばハロゲン化化合物の群の代表としてクロロ化
合物を使用し、これが効果的なアミノ酸であれば、ついで相同な群の他のメンバ
ーを更なるライブラリーの発生のために添加する。

【００２４】修飾部位のアミノ酸セットは天然（Ｌ）アミノ酸および非天然アミノ酸たとえ
ばＤ−酸、α−鎖の長さの同族体、α−鎖置換同族体等を包含することを強調し
なければならない。また第一のライブラリーの作り出しに使用されるアミノ酸セ
ットは出発オリゴペプチドにおける特定の修飾／成分部位に存在するアミノ酸を
一般に包含することになりまた包含してもよいことを強調しなければならない。

【００２５】本発明の方法において用いられる出発オリゴペプチドは、細胞表面または他の
受容体部位に結合親和性を有することが知られ、また特定の生物学的応答を産生
することが知られたネイティブな（すなわち天然に産生される）オリゴペプチド
（たとえば大腸菌ＳＴａ）であることができる。また、それは既知のオリゴペプ
チドのセット（たとえば、上記表１に掲げたＳＴエンテロトキシンのセット）の
成分であってもよく、この場合、工程（ii）における結合親和性および生物学的
応答の基準点はセットの一メンバーについての値、セットのメンバーの平均値、
またはセットのメンバーの特定の成分について測定された値のいずれかである。
しかしさらに、出発オリゴペプチドは、非ネイテフィブなオリゴペプチドたとえ
ば文献から既知のオリゴペプチド、またはライブラリースクリーニング法の使用
により見いだされるオリゴペプチドたとえばファージディスプレーライブラリー
の使用により同定されたオリゴペプチドとすることができる。

【００２６】一般的に、本発明の方法は、受容体アゴニスト候補を同定するために使用され
る。しかしながら、ある環境では、たとえば生物学的応答を誘発する薬剤が望ま
しい場合には、本発明の方法は受容体アゴニストである薬剤候補化合物の同定に
使用されることになる。

【００２７】本発明の方法に使用されるコンビナトリアルライブラリーの発生、選択および
必要に応じて逆重塁は、既知の技術を用いて実施することができる。しかしなが
ら、一般には、オリゴペプチド合成は固相上で行われ、結合親和性は好ましくは
溶液相中において、たとえば固相からライブラリーメンバーを放出させたのちに
アクセスされる。これが行われる場合、固相結合ライブラリーは、ライブラリー
メンバー群を含有する溶液または個々のライブラリーメンバーを含有する溶液の
いずれかを産生するように放出される。後者の場合には逆重塁を必要としないの
に対し、前者ではそれが必要である。

【００２８】逆重塁技術は最近では文献に広範に記載されているが、本発明により逆重塁が
要求される場合は、これは好ましくは、直交走査、すなわち関連オリゴペプチド
構造に戻ってそれらを同定するサブライブラリーの使用を包含する。これに関し
ては、ライブラリーはスプリット−および−ミックス法を用いてポリマービーズ
上に創成することが好ましい。

【００２９】逆重塁の回避が望ましい場合は、ライブラリーは多重ピン法によって発生させ
るか、またはスポット法を使用しもしくはマスクと光脱保護を使用して広範な（
たとえば、シート様の）基体上に発生させることができる。これらの後者の２つ
の方法では、ライブラリーメンバーの同定は基体上におけるその位置により決定
される。混合した溶液相ライブラリーは、すべての基体結合オリゴペプチドの同
時放出によって創成することができる。ほかに個々のライブラリーメンバーを別
個の容器に、たとえば異なるオリゴペプチドについてはオリゴペプチド成長部位
から基体の小片を打ち抜くことによって放出させ、またはチューブのアレイに対
し基板を加圧して異なるオリゴペプチドをそれらの隣接するチューブに放出させ
ることができる。

【００３０】所望により、結合親和性の選択は、生物学的応答を測定する前に、すなわち、
生物学的応答が測定されたために化合物数が減少する前に行われる。これは生物
学的応答の試験に組織サンプルまたは生存動物が要求される場合（結合親和性は
一般に細胞培養液もしくは組織サンプルのみを使用して測定される）とくに好ま
しい。すなわち、工程（ix）の前に、生物学的応答についての選択が工程（vii ）または（viii）でまだ行われていない場合このような選択が一般に行われる。

【００３１】結合親和性のためには、標準的アッセイたとえば濁度法、標識受容体結合物質
に対する競合的結合等が使用できる。生物学的応答のためには、特定の応答、お
よび応答がインビボで試験される場合には、動物モデルに適当なアッセイが用い
られる。このようなアッセイの設計および実施は十分、本技術分野の熟練者の通
常の技術範囲内にある。

【００３２】本発明の方法を用いて候補薬物を同定したのち、候補薬物は上に論じたように
所望により治療的または診断的に有効な残基に接合させ製造することができる。
このような方法、ならびにそれらの生成物、それらを少なくとも１種の医薬的に
許容される担体もしくはレシピエント（たとえば注射用水、生理的食塩水、リン
ゲル溶液、錠剤補助剤、甘味剤、ｐＨ調整剤、粘度調整剤、噴射剤、増量剤等）
とともに含有する医薬組成物、およびそれらを使用する処置または診断方法は、
すべて本発明の更なる態様を形成するものと考えることができる。

【００３３】本発明の方法を用いてオリゴペプチド薬物候補化合物を同定したのち、ペプチ
ド骨格構造を非ペプチド骨格により全体にまたは部分的に置換し、たとえば

【化８】（式中、Ｒ_αnはペプチド側鎖である）の骨格成分を、たとえば、ペプチド結合の一部またはすべてが、たとえば以下のような

【００３４】

【化９】（式中、Ｘは＝Ｎ−Ｎ＝Ｎ−、Ｌ＝Ｎ、ｍは０であるか、またはＸは−Ｓ−ＣＲ _α1 、Ｌは＝Ｎ−Ｃ−、ｍは１である）

【化１０】（たとえば式中、アミドオキソ基は任意にＣＨ₂、ＣＳまたはＣＨＯＨ基により置換され、アミドＮＨ基は任意に −Ｏ−、−Ｓ−、ＣＨ₂またはＣＨＯＨ基によ
って置換され、アミド基は５−もしくは６−員の同素環基もしくは最も好ましく
は環窒素含有ヘテロ環基によって置換されている）骨格構造によって置換された
均等なＲ_αn側鎖置換骨格成分によって置換された類縁体を生成させることが可能であり、またペプチド構造を一部または全体的にペプトイド構造により置換し
、すなわち、

【００３５】

【化１１】にすることが可能である。

【００３６】このような非ペプチド、ペプトイドまたは部分ペプチド類縁体、それらの製造
およびそれらの使用は本発明の更なる態様を形成する。ＳＴ受容体結合物質の同定に限定するものではないが、本発明を以下、例示の
適当な手段としてこのような物質を用いてさらに説明する。

【００３７】ネイティブなＳＴエンテロトキシン構築体は、治療的または診断的残基のため
のベクターとしての使用におけるその魅力を低下させる望ましくない物理化学的
特徴、たとえば多数のジスルフィド、下痢の原因となる活性およびその短い血中
プール保持時間を有する。多かれ少なかれ結合親和性および生物学的応答を維持
する多くの突然変異体が作成された。

【００３８】Ｃｙｓ⁵−Ｃｙｓ¹⁰突然変異体このジスルフィド対は、Ｃｙｓ⁵におけるアミノ機能の喪失に耐えることができるか、またはその立体化学の反転（すなわちＤ−Ｃｙｓ置換）で検出可能な生
物学的応答の喪失を生じない。しかしながら、Ｃｙｓ¹⁰の立体化学は重要であり
、そのＤ−Ｃｙｓによる置換は、大腸菌ＳＴａと比較して５０００分の１への生
物学的応答の喪失を生じる。しかしながら、Ｃｙｓ⁵Ｃｙｓ¹⁰ジスルフィドをカルボ−スルフィド類縁体で置換しても（さらに単純な二環式オリゴペプチドを生
じる）、生物学的応答の１００分の１への喪失しか観察されない。

【００３９】Ｃｙｓ⁶−Ｃｙｓ¹⁴突然変異このジスルフィドはいずれのＣｙｓのＤ−Ｃｙｓによる置換にも耐えることが
できない。生物学的応答は大部分が喪失する（＜７７０分の１以下）。

【００４０】Ｃｙｓ⁹およびＣｙｓ¹⁷突然変異このジスルフィドが医薬有効基の形成に必要かどうかは明らかでない。Ｃｙｓ ¹⁴ のＤ−Ｃｙｓによる置換は生物学的応答の３分の１への喪失（腸毒性産生性の
低下として測定する）を生じるが、Ｃｙｓ⁹のＤ−Ｃｙｓによる置換は２分の１への喪失を生じ、それぞれのアラニンへの同時突然変異の場合にのみ、たとえば
乳児マウスアッセイで測定して２００分の１への活性の喪失を生じる。

【００４１】Ｇｌｕ⁷突然変異水素結合能を変える突然変異（たとえば、ＡｓｐまたはＧｌｎ置換）または位
置７の側鎖の長さは生物学的応答に比較的小さい影響しか与えないように思われ
る。しかしながら、Ｇｌｕ⁷残基の立体化学を変化させる突然変異（たとえば、Ｄ−Ｇｌｕ置換）は生物学的応答に有意な喪失を生じる。Ｇｌｕ⁷をヘリックス破壊Ｐｒｏまたはヘリックス促進Ａｌａにより置換する突然変異により観察され
る差は最小で、ネイティブなＳＴのＸ線構造で観察される３₁₀ヘリックスは要求
される二次構造ではないことを指示している。同様に、Ｇｌｕ⁷はアスパラギン酸の環状同族体、たとえばＰｒｏ（還元ピログルタミン酸）によって置換できる
ように思われる。すなわち、許容できるＧｌｕ⁷置換にはＡｓｐ、Ｇｌｎ、ＡｌａおよびＰｒｏが包含される。

【００４２】Ｌｅｕ⁸突然変異この位置には、Ｖａｌ、ＡｌａおよびＬｙｓのような突然変異は許容され、Ｄ
−Ｌｅｕによる置換は許容されないことから、オリゴペプチド表面の特定の領域
における疎水性相互作用の創成は重要であることが指示される。

【００４３】Ａｓｎ¹¹突然変異この位置では、立体化学または陽電荷のいずれの変化も許容されないように思
われる。しかしながら疎水性、水素結合電位および立体障害の変化は耐えられる
ようである。総体的にこの位置は突然変異にかなり耐えられるようにみえる。す
なわち、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙお
よびＬｅｕによる置換、ならびに好ましさは劣るが、ＡｒｇおよびＬｙｓによる
置換には耐えられる。実際、任意のβ−分岐非塩基性アミノ酸または同族体での
置換には耐えられる。

【００４４】Ｐro¹²突然変異この位置は特定の側鎖の同一性よりもむしろ剛性を要求するように思われる。
すなわち、Ｄ-ＰｒｏおよびＡｌａによる置換は耐えられるが、Ｇｌｙによる置換には耐えられない。

【００４５】Ａｌａ¹³突然変異この位置は、立体化学、水素結合電位、立体障害またはコンフォーメーション
の可撓性の変化に対する耐性は最も低いように思われる。ＳｅｒまたはＧｌｙに
よる置換には耐えられるが、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、ＡｒｇおよびＶalによる
置換には耐えられないように思われる。

【００４６】Ａｌａ¹⁵突然変異この位置は、生物学的応答の有意な変化を生じることなく広範囲の置換、たと
えばＴｈｒまたはＤ-Ａｌａによる置換が可能なように思われる。

【００４７】Ｇｌｙ¹⁶突然変異この位置は、生物学的応答の有意な変化を生じることなく広範囲の置換、たと
えばＡｌａによる置換が可能なように思われる。

【００４８】腸毒性産生性の主要な誘導は、成分Ａｓｎ¹¹−Ｐｒｏ¹²−Ａｌａ¹³のI型β-タ
ーンであるように思われる。ここの突然変異は結合親和性および生物学的応答の
両者を破壊することができる。しかしながら、結合親和性の低下が結合親和性と
生物学的応答の比の増大を生じる突然変異を見いだすことは可能性がある。この
ような突然変異にはたとえばＤ−Ｃｙｓ⁹、Ｇｌｙ¹²およびＤ-Ｃｙｓ¹⁷が包含さ
れる。

【００４９】したがって、エンテロトキシン大腸菌ＳＴａ同族体の直交走査では、第一のラ
イブラリーの構築に以下のセットのアミノ酸／突然変異部位が提案される；位置７、８、９、１１、１２および１３：Ｇ、Ａ、Ｎ、Ｐ、Ｙ、Ｅ、Ｒ、Ｌ、ｄＡ、ｄＮ、ｄＰ、ｄＹ、ｄＥ、ｄＲ、ｄ
Ｌまたは１５すべてのアミノ酸の等しい混合物位置６、1０および１５：Ｃｙｓ位置５：ブロモブチリル酸（bromo butyryl acid）（カルボ−スルフィド５：
１０橋の前駆体）位置１〜４および１５〜１７：省略。

【００５０】余分の修飾、Ａｓｎ¹¹−Ｐｒｏ¹²−Ａｌａ¹³はβ−ターン模倣体

【化１２】によって置換されてもよい。

【００５１】変化できる他の二次構造成分には、β−ターン模倣体、γ−ターン模倣体、β
−シート模倣体、ならびにジスルフィド橋模倣体の表題の下に上掲した構造が包
含される。

【００５２】すなわち、製造できるＳＴ類縁体には、

【化１３】（式中、ｐは１〜４であり、・・・はＣｙｓ：Ｃｙｓジスルフィド橋を表す）、

【００５３】

【化１４】（ＢＴＭはβ−ターン模倣体である）

【００５４】

【化１５】および

【００５５】

【化１６】が包含される。

【００５６】上述のようにコンビナトリアルライブラリーは、固相ペプチド合成を用いて、
たとえば、ポリマーたとえばポリスチレン、ポリスチレン共重合体（たとえば、
ＰＥＧ−ポリスチレンポリマー）、ＰＥＧ、セルロース（たとえば紙、綿等）、
炭水化物（たとえばデキストリン）もしくはポリアクリルアミドのビーズもしく
はシートまたは制御された多孔性ガラス上で合成できる。基体は水性および有機
溶媒中で膨潤する材料、たとえば、ＰＥＧ−ポリスチレン共重合体であることが
有利である。

【００５７】オリゴペプチド生成物は多くのジスルフィド橋を含有することから、アセトア
ミドメチル（Ａｃｍ）で保護された樹脂の使用がとくに望ましい。この使用は新
規であり、本発明の更なる態様を形成する。この観点からみると、本発明は、樹
脂基板上でのオリゴペプチドの固相合成、ついで所望により基体からオリゴペプ
チドを放出させる方法において、上記基体としてアセトアミドメチル保護ポリマ
ーを使用する方法を提供する。

【００５８】オリゴペプチドはたとえばヨウ素のような試薬を用いてこのような樹脂から切
断することができる。この方法でＣ−末端システイン残基を樹脂表面に付着させるのが便利である。すなわち、たとえばＳＴエンテロトキシン同族体は以下のように調製すること
ができる。

【００５９】

【化１７】

【００６０】

【実施例】

次に本発明を以下の非限定的実施例を参照してさらに詳細に説明する。

【００６１】実施例１以下のライブラリーの合成

【化１８】

【００６２】

【化１９】 i）リンカー合成（F. Albericioら、Synthesis、271頁以下、1987参照）

【化２０】（注：ＣＨ₂基はまたＣＲ′Ｘでもよい。ＸはＨまたはＲ′であり、Ｒ′はアルキル、アリール、ヘテロアルキルもしくはヘテロアリール基、またはたとえばア
ミノ酸である）。

【００６３】０.１７モルのスクシンアミド酸（１９.９ｇ）および０.０１８モルのＫＯＨ（１.０ｇ）をホルムアルデヒド：水（７：３ｖ／ｖ１２ml、０.０１２モル）の
溶液に溶解する。混合物を７０℃で５分間撹拌し、ついで一夜室温で撹拌し、６
ＮＨＣｌでｐＨ７.０の酸性にする。溶液を回転蒸発させてシロップとし、酢酸
エチルに再溶解し、ついでＭｇＳＯ₄上で乾燥する。粗生成物はろ過およびろ液の濃縮によって得られる。

【００６４】 ii）システイン−リンカー合成

【化２１】２９モル（４.３２ｇ）のスクシンアミド酸Ｎ−ヒドロキシメチルおよび２４モル（４.１２ｇ）のＬ-システインメチルエステル塩酸塩を５.６mlの水に溶かす。混合物を氷浴中で冷却し、ＴＦＭＳＡ／ＴＦＡ（１：１９混合物３７ml）を
添加する。アルゴン下に９０分撹拌したのち、溶液を回転蒸発させて油状物とし
、ついで再びジエチルエーテル（５×２０ml）を加えると化合物IIが生成する。

【００６５】 iii）ＦＭＯＣ−システイン−リンカー合成

【化２２】工程Ａ（ii）からの化合物IIの油状物を５０mlの１０％Ｎａ₂ＣＯ₃（水性）に
再溶解し、固体のＮａ₂ＣＯ₃でｐＨ1０に調整する。この溶液（氷上で冷却）に、５０mlのジオキサン中２１ミリモルのＦＭＯＣ−ＯＳｕ（７.０８ｇ）を加える。２時間撹拌したのち、生成物を、酸性化（ＨＣｌの添加）および酢酸エチル
への抽出によって精製する。有機層を合わせてＭｇＳＯ₄上で乾燥し、クロロホルム／ヘキサンから再結晶すると化合物IIIが純粋な型で生成する。

【００６６】 iv）ＦＭＯＣ−システイン-(Ｓｕｍ)-樹脂合成

【化２３】総容量５mlのＣＨＣｌ₃中１.０ミリモルのＤＣＣを１.０ミリモルの化合物III
に添加した。１分間撹拌後、このスラリーを１.０ミリモルのアミノメチルＰＥＧ／ポリスチレングラフト共重合体に滴下して加えた。１０分後に、５０mlのＤ
ＭＦ中１ミリモルのヒドロキシベンゾトリアゾールを添加し、スラリーを２時間
撹拌した。さらに５mlのＣＨＣｌ₃中１ミリモルのＤＣＣを添加し、２５℃で一夜振盪して反応させた。

【００６７】１６〜２４時間後、過剰のアミノ基を無水酢酸で遮蔽し、樹脂を完全に洗浄し
、乾燥する。置換レベルを、同じ樹脂のアリコートについて、樹脂の重量に対し
て、切断されたＦＭＯＣ基および定量的ニンヒドリンアッセイに基づいて、比色
的に測定した。

【００６８】Ｂ）ＤおよびＬアミノ酸に基づきＳＴ同族体ライブラリーの合成

【化２４】１５個の反応容器それぞれに（各容器は、ろ過用のシンターフリットおよび栓
を有する）１５０ミリモルのＦＭＯＣ−Ｃｙｓ（Ｓｕｍ）−樹脂（化合物IV）を
添加する。ＦＭＯＣ基を除去し、ついで通常のプロトコール（G. B. Fieldsら、
“Principles and practice of solid phase peptide synthesis" in “Synthet
ic Peptides: auser's guide" W. H. Freeman ＆Co., New York, Gregory A. Gr
ant 編参照）に従い、各反応毎に樹脂を洗浄する。ついで各反応容器を個々に過
剰の１種の代表的保護アミノ酸（Ｇｌｙ、ＤおよびＬ体のＡｌａ、Ａｓｎ、Ｐｒ
ｏ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ）と反応させる。これらの樹脂それぞれの
６分の１をよけて、残りの６分の５（乾燥重量による）を他の樹脂と均一に混合
する。この時点で、添付図面の図１に示すように、１６個の反応容器が樹脂を含
有する。

【００６９】個々の＃１ジペプチド樹脂を１５個の各反応容器に等しく分割し、脱保護し、
代表的なアミノ酸のそれぞれと完全にカップリングさせ、ついで、再び混合する
。このサイクルを、添付図面の図２に示すように、検討すべき各アミノ酸位置に
ついて反復する。これらのペプチドセットそれぞれの生物活性の評価により、最
初に導入されたどのアミノ酸が最も好ましいかを決定することが可能になる。

【００７０】同様に、均一なＸＣ−Ｐ混合物（図１の＃２）を１５個の各反応容器に等しく
分割し、脱保護し、代表的なアミノ酸のそれぞれと完全にカップリングさせ、第
二のコンビナトリアル位置を完全に検討するために、添付図面の図３に示すセッ
トを創成する。戦略は生物活性が最良の配列のクラスを決定するためそのペプチ
ドにより実施する。所望により、至適として同定される側鎖のクラスに基づき同
様にサブライブラリーを作成することができる。たとえば、Ｇｌｙ、Ａｌａおよ
びＡｓｎは極性アミノ酸の代表であり、好ましいアミノ酸としてのそれらの同定
により、そのクラスを完全に検討するためＳｅｒ、ＴｈｒおよびＧｌｎ同族体の
合成が必要になる。クラスの定義およびそれらの代表を以下に掲げる。

【００７１】代表的アミノ酸およびサブセット下線を付したアミノ酸をそれらの各サブセットを代表させるため選択した。極性（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）

【化２５】

【００７２】コンフォーメーショナル（Ｇｌｙ、Ｐｒｏ）

【化２６】

【００７３】芳香族（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）

【化２７】

【００７４】荷電（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）

【化２８】

【００７５】脂肪族（Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ）

【化２９】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法によって１５個の反応容器中に作成されたジペプチドを示す反応
図である。

【図２】本発明の方法によるサイクルを各アミノ酸位置について反復し、これらのペプ
チドのセットの生物活性を評価する実験計画図である。

【図３】本発明の方法によって１５個の反応容器中に作成されたトリペプチドを示す反
応図である。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年２月１８日（２０００．２．１８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【化１】（式中、ＸはＮＨ、

【化２】であり、Ｒは任意の置換基、たとえば任意にヒドロキシル化されたＣ₁〜Ｃ₁₀アルキル、アラールキル、アリールまたはアルクアリールである）から選択される
請求項４記載の方法。

【化３】（式中、Ｒは任意の置換基、たとえば任意にヒドロキシル化されたＣ₁〜Ｃ₁₀アルキル、アラールキル、アリールまたはアルクアリールである）の化合物から選
択される請求項４〜６のいずれかに記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 2G045 AA34 DA36 4C084 AA01 AA02 AA06 AA07 BA17 BA18 CA59 DC50 MA52 MA55 ZA662 ZA732 ZC422 4H045 AA20 BA11 BA15 BA32 BA51 FA33

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 i）細胞表面または他の受容体部位に結合親和性を有する出発オリゴペプチドを同定し、ii）上記出発オリゴペプチドに関して単一部位のア
ミノ酸修飾を有する複数個の同族のオリゴペプチドを作り、オリゴペプチドおよ
び上記受容体部位の間の結合親和性対オリゴペプチドおよび上記受容体部位の間
の結合の生物学的応答の比の増大（または減少）を示すオリゴペプチドを産生す
る修飾部位を同定し、iii）上記出発オリゴペプチドのその二次構造に関与する成分を同定し、iv）工程(ii)において同定される修飾部位に対してアミノ酸のセ
ットを選択し、ｖ）工程(iii)において同定される成分に対し、その成分の二次構造を模倣する少なくとも１個の非天然アミノ酸を選択し、vi）上記の同定され
た修飾部位に、上記の選択されたアミノ酸セットに相当するアミノ酸残基を有す
るオリゴペプチドの第一のコンビナトリアルライブラリーを作り、vii）予め決定された最低値より高い結合親和性値を有し、そして所望により結合親和性対生
物学的応答の比較的高い（または低い）比を有する上記第一のライブラリーのメ
ンバーを同定し、viii）所望により、拡大および／または縮小により、アミノ酸
のセットを上記修飾部位についてまたは非天然アミノ酸を上記成分について変化
させて、上記第一のライブラリーには存在しなかったメンバーを有するオリゴペ
プチドの更なるコンビナトリアルライブラリーを作り、上記第一のライブラリー
の同定されたメンバーに比較して結合親和性値が改良され、および／または結合
親和性対生物学的応答の比が増大（もしくは減少）した上記の更なるライブラリ
ーのメンバーを同定し、所望により工程(viii)を繰り返したのち、上記の第一の
および更なるライブラリーの少なくとも一方が上記非天然アミノ酸または酸の残
基を含有するオリゴペプチドを含むことを条件に、ix）上記の単数または複数の
ライブラリーから候補薬物を選択することからなる薬物候補化合物を選択する方
法。
【請求項２】出発するオリゴペプチドは 19-マーまでである請求項１記載
の方法。
【請求項３】工程(iii)において上述のアミノ酸のセットは、極性、芳香族、荷電、脂肪族、親水性、コンフォーメーション的拘束または親油性の側鎖を
有し、出発オリゴペプチド自体内のまたは同族のオリゴペプチド内の同定された
修飾部位におけるアミノ酸はそれぞれ、極性、芳香族、荷電、脂肪族、親水性、
コンフォーメーション的拘束または親油性の側鎖を有する請求項１または２のい
ずれかに記載の方法。
【請求項４】工程(iv)において上述の少なくとも１種の非天然アミノ酸は
、β−ターン模倣体、γ−ターン模倣体、β−シート模倣体およびジスルヒド橋
模倣体から選択される請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】上記β−ターン模倣体は、【化１】（式中、ＸはＮＨ、【化２】であり、Ｒは任意の置換基、たとえば任意にヒドロキシル化されたＣ₁〜Ｃ₁₀アルキル、アラールキル、アリールまたはアルクアリールである）から選択される
請求項４記載の方法。
【請求項６】上記γ−ターン模倣体は（４−（１−アミノ−アルク−１−
イル）−１,４−ジアザ−５,７−ジオキソ−シクロペンチル）−エタン酸から選
択される請求項４および５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】上記β−シート模倣体は、式【化３】（式中、Ｒは任意の置換基、たとえば任意にヒドロキシル化されたＣ₁〜Ｃ₁₀アルキル、アラールキル、アリールまたはアルクアリールである）の化合物から選
択される請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】上記の第一のコンビナトリアルライブラリーは上記成分の修
飾部位に非天然アミノ酸に相当するアミノ酸残基を有するオリゴペプチドを含有
する請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】薬物化合物の製造方法において、請求項１〜８のいずれかに
記載の方法を実施し、上記薬物化合物として、必要によって治療的または診断的
残基に接合させ、そして必要によってそのペプチド骨格またはその部分を非ペプ
チド骨格で置換して上記候補薬物を製造する方法。
【請求項１０】少なくとも１つのアミドオキソ基はＣＨ₂、ＣＳまたはＣＨＯＨ基によって置換されている請求項９記載の方法。
【請求項１１】少なくとも１つのペプチド骨格アミドＮＨ基は５または６
員のホモまたはヘテロ環状基によって置換されている請求項９および１０のいず
れかに記載の方法。
【請求項１２】少なくとも１つのペプチド骨格アミド基−ＣＯＮＨ−はペ
プトイド骨格アミド基−ＮＨ−ＣＯ−基によって置換されている請求項９〜１１
のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】樹脂基体上オリゴペプチドの固相合成方法であり、必要に
よって続いて基体からオリゴペプチドを放出させる方法において、上記基体とし
てはアセトアミドメチル保護ポリマーを使用することを特徴とする方法。