JP2001509887A - 酸性溶液および陰イオン性界面活性剤中リガンドを固相へ結合させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は抗体または抗原分子の固相への結合方法に関する。抗体または抗原分子と固相とを含むこの反応化合物は、特定の抗体または抗原分子を固相と２段階反応を用いて結合させることにより形成される。この結合は陰イオン性界面活性剤の存在下、ｐＨを塩基性領域まであげるためにアルカリ/溶液を加えた後の、固相の活性基と、抗体、そのフラグメントまたは抗原分子との間の共有結合である。

Description

【発明の詳細な説明】 酸性溶液および陰イオン性界面活性剤中リガンドを固相へ結合させる方法 この発明は、抗体分子または抗原分子の固相との結合方法に関する。抗体また は抗原分子および固相を含むこの反応性化合物は、２段階反応を用いて特定の抗 体または抗原分子を固相に結合させることにより形成される。最終物は、固相に 共有結合し、かつ免疫反応で非常に活性な抗体または抗原分子複合体である。こ の結合した抗体は、モノ−またはポリクローナル抗体であってもよく、さらには 抗体の全体またはその一部であってもよい。本発明の方法は、特異性および感度 の非常に高い免疫アッセイを実施可能にする。この調製手順は、従来開示された 共有結合方法と比べて非常に簡便である。本発明は、抗体類、それらのフラグメ ントまたは抗原類を本発明の方法で付着させた、固相−生体分子コンジュゲート 、すなわち粒子の懸濁液または別の固相を含む試験キットとして産業上利用でき る。本発明の特徴は請求の範囲で定義する。 抗体および抗原分子をラテックス粒子へ吸着的または共有的に付着させる方法 、または抗体分子全体を修飾する方法が知られている。（米国特許第5,095,097 、4,184,849、4,210,723、4,401,765、4,480,042、4,397,960、および4,164,558 号、欧州特許出願0 709 676 A2と同様） 最後に言及した特許出願(EP 0 709 676 A2)では、酸性溶液中でIgG分子全体を 前処置すると分子の３次構造が修飾されるので、中和後に再形成IgG分子全体の 取り付けを行うと、免疫アッセイに関連した不安定要因を低減させることができ る。加えて、該特許出願による方法で、双性イオン性または非イオン性界面活性 剤を使用して酸処置し、さらに中和した抗体のラテックス粒子表面上での共有結 合を増強する。該特許出願には、陰イオンまたは陽イオン性界面活性剤は、ラテ ックス粒子表面上での抗体の共有結合を増強するに効果はないと、特に言及され ている。上記特許出願では、結合の化学は特定のコア−シェル粒子に適用され、 そこで実際の共有結合は、双性イオン性または陰イオン性界面活性剤またはそれ らの混合物の存在下、粒子の最外殻のビニルクロライド、オキシラン、カルボキ シアルデヒド、トシル、メシルまたはn-アクリルオキシスクシンイミド基、また はこれら基の混合物と、抗体分子のアミノ基との間で行われる。しかし、当該方 法は単にIgGクラスの抗体の付着に適しているだけなので、例えば抗原分子の付 着には適さず、本発明の方法とは異なる。 定量および定性免疫アッセイでは、抗体または抗原の量はいずれも、生体液、 分泌液または組織液(血液、血清、血しよう、脳脊髄液、胸膜液、腹水、うみ、 傷分泌液、尿性、痰、かす、咽頭のサンプルなど)から測定される。試験は直接 的、間接的または阻害的であり得る。免疫反応中で、抗体は、この抗体に特異的 な構造の抗原に結合する。抗体または抗原のいずれかを、ある特定のシグナル物 質(ラベル)に結合させ得る。ラベルは、ポリマー粒子(差色したものおよび磁性 のものも)を含む。抗体または抗原分子は、また別の型(例えば、マイクロタイタ ープレートまたは表面上に活性結合グループをもつ試験管またはキュベット)の 固相の表面に付着させることもできる。定量アッセイでは、しばしばサンプルの 光学測定(吸光、消失、比濁、反射率、蛍光、ホスホレセンス)を原理とする分析 装置が使用される。 本発明の方法では、抗体(分子全体またはそのフラグメント)、またはそれに代 えて抗原分子(例えばハプテン、レクチンまたは化合物を含む)を、陰イオン性界 面活性剤の存在下、二段階でコポリマースチレンビニルベンジルクロライド(Ｓ ／ＶＢＣ)粒子の表面に付着させ、そのようにして最終生成物として、共有結合 粒子−抗体コンジュゲート、またはそれに代えて共有結合粒子−抗原コンジュゲ ートとする。ポリマー粒子は、ホモポリマーまたはコポリマーであってもよく、 また、コア−シェル粒子であってもよい。粒子の大きさは通常１０nmから１００ ００nmの範囲にある。Ｓ／ＶＢＣ以外の粒子材料としては、ポリスチレン、ポリ ビニルナフタレン、ポリビニルカルバゾール、ポリビニルトルエン、ポリビニル ブチルスチレン、ポリビニルベンゼン、ポリビニルクロライド、およびそれらの 混合物が考えられる。粒子以外の固相としては、例えばマイクロタイタープレー ト、試験管、アッセイキュベット、免疫クロマトグラフィー物質、フィルター、 試験ストリップまたは金コロイドなども可能である。 本発明の方法では、抗体、そのフラグメント、または抗原を固相に付着させる 場合、それらの構造は、結合の発生期状態(in statu nascendi)および免疫反応 に有利となるように修飾される。その結合は、非イオン性界面活性剤の存在下、 固相の活性基と抗体、そのフラグメントまたは抗原分子との間で起こるとき、共 有結合である。 上述したように、Ｓ/ＶＢＣ以外の粗原料から調製した粒子も考慮される。こ れらの粗原料は、例えば、ポリスチレン、ポリビニルナフタレン、ポリビニルカ ルバゾール、ポリビニルトルエン、ポリビニルブチルスチレン、ポリビニルベン ゼンおよびポリビニルクロライド、およびそれらの混合物、並びに金コロイドか ら選択される。本発明の結合方法は以前に開示されたもの(EP 0 709 676 A2)と は、例えば、結合させる抗体分子が、分子全体でもそのフラグメントでもよく、 また抗原分子でもよい点で異なる。加えてこの方法は、それ自体が、例えば分子 内および分子間架橋(例えばカルボジイミド結合)により結合させる生体分子を、 変性させてしまうことさえある分離工程や結合試薬を必要としないので、非常に 迅速に実施される。本発明の方法は、調製した試薬(すなわち固相−生体分子コ ンジュゲート)を、可溶性および凍結乾燥の両形態で非常に長期間保存すること も可能とする。 結合は、最初の段階では、実質的に疎水性相互作用(水素結合、ワァンデルワ ールス力)を介して極めて迅速に起こり、そして直後に続く第２の段階では共有 的に起こる。このようにしてビニルクロライド基は、抗体分子(分子全体または そのフラグメント)または抗原分子(置換反応)の一級または二級アミノ基と反応 する。ビニルクロライド基は別の基と反応させることもできる。共有結合はかな りゆっくりとした現象であり、その促進には塩基性のｐＨ(８から１１、好まし くはｐＨ９.０)が必要となる。ビニルクロライド基以外の、クロロメチル、エポ キシ、アルデヒド、トシル、メシルまたはn-ヒドロキシスクシンイミド基、また はそれらの混合物も、固相の共有結合基として機能することができ、それゆえ実 際の共有反応段階(段階２)の条件は該反応化学に合わせて最適化される。 結合操作では、Ｓ/ＶＢＣ粒子を、透析によって希酸または緩衝液、好ましく は５ｍＭ ＨＣｌ(ｐＨ２から６、好ましくは２.５)に移行させ、そこへ陰イオン 性界面活性剤、好ましくはポリオキシ-１,２-エタンジイル-α-ノニルフェニル- ｏ-ヒドロオキシ-ホスフェート(Rhodafac-RE610)界面活性剤、を撹拌しながら添 加し、使用した抗体または抗原に応じて最終結合段階で界面活性剤濃度を０.０ １から０.１％、好ましくは０.０２５％にする。抗体または抗原を、好ましくは ０.９％ ＮａＣｌ溶液として、激しく撹拌しながら、５ｍＭ ＨＣｌ中の粒子懸 濁液へ添加し、結合段階で、粒子濃度を約０.５から１０％、好ましくは２％に する。結合段階の抗体または抗原の濃度は、使用した抗原および抗体によって変 わるが、０.０１から１％、好ましくは０.０１から０.２％である。Ｓ/ＶＢＣ粒 子乾燥重量に対する抗体または抗原の比率は０.００１から１.０、最も好ましく は０.１から０.３である。 抗体または抗原とＳ/ＶＢＣ粒子の混合物を、１分から６０分間、好ましくは １０分から２０分間、４℃から５０℃で、好ましくは２０℃でインキュベートす る。インキュベート中陰イオン性界面活性剤の存在下、粒子表面への抗原または 抗体の効率的で本質的に吸着性の付着が起こる(結合反応の第１段階)。次いで塩 基性緩衝液、好ましくは０.１Ｍホウ酸塩緩衝液、ｐＨ９.０を添加して、容量を ２倍にし、粒子濃度を１％にする。この混合物を、１６時間から２４時間、４℃ から５０℃で、最も好ましくは２０℃で、連続的に撹拌しながらインキュベート し、そのようにして本質的に、実際の共有結合を起こさせる(結合反応の第２段 階)。 本発明の結合方法は、先に開示された方法(EP 0 709 676 A2)とは違い、例え ば、結合反応(第１段階)が、酸性ｐＨ中、陰イオン性界面活性剤の存在下(先の 特許出願は陽イオン性界面活性剤の存在下)で起こり、その後結合反応の共有段 階(第２段階)が、塩基性ｐＨ中、別に中和工程を設けずに(先の特許出願では別 途の中和工程がある)行われる点で異なる。 図面の簡単な説明 図１ Ｃ-反応性タンパク質(ＣＲＰ)のアッセイ。本発明により調製し た試薬を使用して得た、典型的な反応曲線。 図２ リウマチの因子のアッセイ。本発明により調製した試薬を使用し て得た、典型的な反応曲線。 図３ ストレプトリシンＯのアッセイ。本発明により調製した試薬を使 用して得た、典型的な反応曲線。 下記でこの発明を、実施例により詳細に例示説明する。実施例は、上記結合反応 の特定の適用について述べており、本発明の限定を意図するものではない。 実施例１ Ｃ-反応性タンパク質(ＣＲＰ)は、炎症性反応の指示薬として一般に認められ ており、患者の全血サンプルまたは血清サンプルから判定することになっている 。ＣＲＰアッセイは、しばしばサンプルの光学測定(吸光、消失、比濁、反射率 、蛍光、ホスホレセンス等)原理による分析装置を使用して実施される。ＣＲＰ 濃度を測定するために、ヒツジ-抗-ヒト-ＣＲＰ抗体(F(ab^,)₂フラグメント)で被 覆したポリマー粒子を調製する。本発明の手順は次の通りである：ＮａＣｌ中０ .９％ Rhodafac-RE610溶液０.３３mlを、Ｓ/ＶＢＣ(５ｍＭ ＨＣｌ中の９％懸濁 液、粒子径９０nm)の粒子懸濁液１mlに加える。混合物を室温で１５分間撹拌す る。粒子乾燥重量１０mgに対して抗-ヒト-ＣＲＰ-F(ab^,)₂抗体１.８２mgを混合 物に加え、０.９％ ＮａＣｌで希釈し、粒子濃度２％の懸濁液を得る。その混合 液を、ｐＨを制御しながら２０℃で１５分間撹拌する。適切なｐＨ範囲は２.５ から３.０である。０.１Ｍホウ酸塩緩衝液(ｐＨ９.０)を混合物に加え、その容 量を２倍にする。ｐＨは９.０であればよい。混合物を２０℃で１８時間撹拌す る。この粒子の表面の非反応活性基を６％ ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)および ０.１％ＮａＮ₃(ｐＨ８.７)を含む３０ｍＭグリシン緩衝液でブロックし、ＢＳ Ａ濃度が０.２％であるようにする。混合物を２０℃で１６時間撹拌する。この 被覆粒子を、洗浄緩衝溶液(３０ｍＭグリシン、０.１％ＢＳＡ、５％ショ糖、０ .１％ＮａＮ₃(ｐＨ８.７))中、遠心分離もしくはダイアフィルトレーションで洗 浄し、その後、貯蔵緩衝溶液(３０ｍＭグリシン、０.１％ ＢＳＡ、５％シヨ糖 、０.１％ＮａＮ₃(ｐＨ８.７))へ移す。この粒子懸濁液に粒子径が１１０nmにな り、懸濁液が単分散形になるまで超音波をかける。最終粒子濃度を、１から４％ とな るよう貯蔵緩衝液の処理によって調節する。こうして得られた試薬を使用して得 られた典型的な反応曲線を図１に示す。 実施例２ リウマチ因子(ＲＦ)の測定は、様々なリウマチ疾病の診断において非常に重要 である。リウマチ因子は、ヒトによって形成されるクラスＭ免疫グロブリンの自 己抗体であり、自身のＩｇＧに対向するものである。ヒトのＲＦとそれ自体の構 造(ＩｇＧ)との間の反応が病気を発症させ、その通常の形態が慢性関節リウマチ である。ＲＦの測定を、前実施例で述べた通り全血サンプルまたは血清から直接 行うことができる。本試験は、特定のラベル粒子をヒト免疫グロブリンＧ分子で 被覆しておく。この実際の結合反応は、結合反応において抗-ヒト-ＣＲＰ抗体(F (ab^,)₂フラグメント)を、ヒトＩｇＧ分子に置き換える以外は前実施例で述べた 通り行う。得られた試薬を使用して得られた典型的な反応曲線を図２に示す。 実施例３ Ａ群連鎖球菌は、その環境に対して、検出可能である様々な化合物を産出する 。これらの細胞外産物の中には有毒なものもある。このような毒素の１つがスト レプトリシンＯである。ヒトはＡ群連鎖球菌に感染すると、抗体を産出する。ほ とんどの場合、Ａ群を検出するために実施される抗体試験は、ＡＳＯ試験(抗-ス トレプトリシンＯ)である。急性Ａ群連鎖球菌咽頭炎に罹病した患者の８０％が ストレプトリシンＯに対する抗体を産出している。加えて、リウマチ熱や糸球体 腎炎の検出にもＡＳＯ測定が推奨されている。本発明の二段階結合方法を使用す ると、ストレプトリシンＯ抗原(ＳＬＯ)はＳ/ＶＢＣ粒子の表面に付着させるこ とができる。そのため患者のサンプルでＳＬＯに対する抗体を測定する(ＡＳＯ 試験)ことができる。この結合は上述のように、抗体またはそのフラグメントに 対して、すなわち２段階で実施される。取得した試薬を使用して得た典型的な反 応曲線を図３に示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ）陰イオン性界面活性剤の存在下、抗体、そのフラグメント、または抗原 を、酸性溶液中に存在する固相と接触させ、該抗体、そのフラグメント、または 該抗原を固相に付着させ、そして ｂ)段階a)で得た、抗体、そのフラグメント、または抗原と、固相との組み合 わせ中に、塩基性溶液を添加してｐＨを塩基性に変え、それらの抗体、フラグメ ントまたは抗原の一級または二級アミノ基と、固相の官能基との間に共有結合を 形成させること、 を含んでなる、抗体分子、そのフラグメント、または抗原分子を固相と共有結合 させる方法。 ２．酸性溶液が、塩酸溶液、好ましくは５ｍＭ ＨＣｌ、ｐＨ２〜４、である、 請求項１に記載の方法。 ３．塩基性溶液が、ホウ酸塩緩衝液、好ましくは０.１Ｍホウ酸塩緩衝液、ｐＨ ９.０、である、請求項１に記載の方法。 ４．陰イオン性界面活性剤が、濃度０.１から０.０１％のポリオキシ-１,２-エ タン-ジイル-α-ノニルフェニル-ｏ-ヒドロキシ-ホスフェート 界面活性剤であ る、請求項１に記載の方法。 ５．固相の共有結合基が、クロロメチル、エポキシ、アルデヒド、トシル、メシ ルおよびn-ヒドロキシスクシンイミド基、およびそれらの基の混合物から選択さ れる、好ましくはクロロメチルである、請求項１に記載の方法。 ６．該方法中の酸性の段階に５から３０分、好ましくは１５分かける、請求項１ に記載の方法。 ７．塩基性段階の結合を酸性段階の直後に開始させ、１から２４時間、好ましく は１８時間かける、請求項１に記載の方法。 ８．固相が、ポリマープラスティック、マイクロタイタープレート、試験管、ア ッセイキュベット、免疫クロマトグラフィー物質、フィルター、試験ストリップ または金コロイド、好ましくはポリマープラスティックである、請求項１に記載 の方法。 ９．ポリマー粒子が、ホモポリマーまたはコポリマーから形成されているか、ま たはコアーシェル粒子である、請求項８に記載の方法。 10．ポリマー粒子の構造成分が、ポリスチレン、ポリビニルナフタレン、ポリビ ニルカルバゾール、ポリビニルトルエン、ポリビニルブチルスチレン、ポリビニ ルベンゼンおよびポリビニルクロライド、およびそれらの混合物から選択される 、請求項９に記載の方法。 11．ポリマー粒子の構造成分が、ポリスチレンおよびポリビニルクロライドの共 重合体である、請求項10に記載の方法。 12．ポリマー粒子のサイズが、１０nmから１００００nm、好ましくは９０nmであ る、請求項10または11に記載の方法。 13．請求項１に記載の方法を使用して、抗体分子、そのフラグメント、または抗 原分子を共有的に付着させた固相を含んでなる、固相-生体分子コンジュゲート 。 14．スチレンビニル-ベンジル-クロライドポリマー粒子と結合した、ヒツジ-抗- ヒト-ＣＲＰ抗体のF(ab^,)₂フラグメントを含んでなる、請求項13に記載の固相- 生体分子コンジュゲート。 15．請求項13または14に記載の固相-生体分子コンジュゲートを含んでなる、診 断用試験キット。