JP2001509515A - インテグリン結合ペプチド及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 インテグリンα２Ｉドメインに結合し、Ｉ型及びIV型コラーゲン並びにラミニン−１とのその相互作用の潜在的なインヒビターである３つの共直線アミノ酸：アルギニン−リシン−リシン（ＲＫＫ）を含む環状ペプチドを供する。インテグリン機能をブロックするため及び細胞マイグレーションを阻害するためにこのようなペプチドを用いる方法も供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は、タンパク質治療の分野にある。特に、本発明は、環状ペプチド及び
その使用、特にインテグリンの生物活性をブロックし又は阻害するためのこれら
のペプチドの使用に関する。 発明の背景 インテグリンは、非共有結合したα及びβサブユニットから構成されるヘテロ
ダイマー細胞表面グリコプロテインである、１６のαサブユニット及び８のβサ
ブユニットが同定されている。これらのサブユニットの２０を超える異なる組合
せが見い出されている。

【０００２】 インテグリンは、細胞−マトリックス及び細胞−細胞相互作用を媒介すること
により細胞をそれらの周囲に固定する（報告について、Hemler, M.E. Annu. Rev
. Immunol. 8 : 365〜400 (1990); 及びHynes, R.O. Cell 69 : 11〜25 (1992)
及び本明細書に言及の文献を参照のこと) 。インテグリンによる細胞マトリック
スタンパク質中のアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）の認識は細
胞−マトリックス内の基本的な現象である。フィブロネクチンはＲＧＤ含有タン
パク質の原型である。更に、哺乳動物、トリ、カエル、及び昆虫における多数の
他のマトリックス分子はそれらのＲＧＤ配列を介して細胞付着を媒介する。β１
，β３，β５、又はβ６サブユニットを含むインテグリンヘテロダイマーは、Ｒ
ＧＤ依存性レセプターを形成することができる（Ruoslahti, E., J. Clin. Inve
st. 87 : 1-5 (1991); Busk, Mら、J. Biol. Chem. 267 : 7875-7881 (1992);及
びElices, M.J.ら、J. Cell Biol. 112 : 169-181 (1991)) 。β１サブユニット
において、ＲＧＤ結合部位はその分子のアミノ末端半分に位置するとしており、
αサブユニットがこの相互作用に作用し得る可能性を示唆するいくつかの証拠が
ある（Shih, D.T.ら、J. Cell Biol. 122 : 1361-1371 (1993)) 。まとめると、
１０のインテグリンヘテロダイマーは共通のβ１サブユニットを共有し、それゆ
え、ＲＧＤ結合部位と予想される。しかしながら、β１インテグリンのほとんど
はリガンド結合のための更なるメカニズムを有する。変性したフィブリルコラー
ゲンはα５β１のようなＲＧＤ依存性インテグリンにより認識されるが、ネイテ
ィブコラーゲンはＲＧＤ依存性様式でインテグリンと相互作用する（Gullberg,
D ら、 EMBO J. 11 : 3865〜3873 (1992))。

【０００３】 ２つのインテグリン、α１β１及びα２β１ヘテロダイマーは、ネイティブコ
ラーゲンのための主な細胞レセプターであり、全てのインテグリンと同様、それ
らのリガンドとの相互作用は二価カチオンに依存する（Staatz, W.P.ら、 J. Bi
ol. Chem. 266 : 7363〜7387 (1991))。インテグリンα２β１は、例えば上皮細
胞、血小板、肉芽組織細胞、及び種々の癌細胞上で発現される。α２β１インテ
グリン活性（機能）が本質的である生物現象には、コラーゲン誘導性血小板凝集
、コラーゲン上での細胞マイグレーション、及びコラーゲン繊維の細胞依存性認
識がある。癌生物学において、α２β１インテグリンは侵入性細胞表現型と関連
しており、それは、攻撃性黒色腫のためのマーカーであり得る。他方、乳癌細胞
におけるα２β１インテグリンの過剰発現は正常な表現型を回復させる。他のイ
ンテグリンと同様α２β１は細胞の機能及び遺伝子発現を調節するシグナルも作
り出すことができる。特に、コラゲナーゼ−１のｍＲＮＡレベルはα２β１イン
テグリンにより制御されるようである。

【０００４】 α１及びα２サブユニットは、それらが、例えばフオンウィルブランド因子に
おいて見い出されるＡドメインに似ている特別の“挿入された”ドメイン、Ｉド
メインを含むという意味で、全ての他のβ１会合αサブユニットとそれらの構造
において異なる（Michishita, M.ら、 Cell 72 : 857〜867 (1993)) 。α１Ｉ及
びα２Ｉドメインが対応するインテグリンによるコラーゲンの一次的認識の原因
であることが明らかである（Kamata, T.ら、 J. Biol. Chem. 269 : 9659〜9663
(1994); Kamata, T. ら、J. Biol. Chem. 269 : 26006〜26101 (1994); Kern,
A ら、J. Biol. Chem. 269 : 22811-22816 (1994))。２つの他のα２β１インテ
グリンのためのリガンド、即ちラミニン−１及びエコウィルス−１は、両方とも
更にα２Ｉ−ドメインに結合する。しかしながら、エコウィルス−１はマトリッ
クスタンパク質ではなくα２Ｉドメイン内の異なる部位を認識するようである（
Bergelson, J.M. ら、J. Clin. Invest. 92 : 232-239 (1993)) 。

【０００５】 コラーゲンにおけるα１β１及びα２β１インテグリンの結合部位は分子の三
重ヘリックス領域内に位置している（Eble, J.A.ら、 EMBO J. 12 : 4795〜4802
(1993); Gulberg, D ら、 EMBO J. 11 : 3865〜3873 (1992))。コラーゲンα鎖
由来の１つのペプチド配列は、インテグリン−コラーゲン相互作用をブロックす
ると報告されているが、多くの研究において、それは無効であり、おそらくそれ
はコラーゲン内の実際の結合部位ではない（Cardarelli, P.M.ら、J. Biol. Che
m. 267 : 23159-23164 (1992); Pfaff, M ら、Exp. Cell Res. 206 : 167-176 (
1993);及びTuckwell, D.ら、J. Cell Sci. 108 : 1629-1637 (1995))。より可能
性あるのは、コラーゲン−レセプターインテグリンが１超のコラーゲンα鎖から
のアミノ酸残基を認識することである。IV型コラーゲン−α１β１インテグリン
相互作用において、全てコラーゲンの異なるα鎖からのものである１つのアルギ
ニン及び２つのアスパラギン酸残基の重要性が示されている（Eble, J.A.ら、 E
MBO J. 12 : 4795〜4802 (1993))。

【０００６】 α２β１インテグリンのための周知のマトリックス分子リガンドはＲＫＫ（Ｈ
）配列を含まない。ヒト免疫不全ウィルスＴａｔタンパク質由来のＲＫＫ配列を
含むアルギニンが豊富な直鎖ペプチドはαＶβ５インテグリンと相互作用するこ
とが示されている（Vogel. B.E. ら、J. Cell Biol. 121 : 461-468 (1993)) 。
しかしながら、インテグリン−ペプチド相互作用はＥＤＴＡの存在下で安定であ
ることが見い出されており、このことは、明白な結合メカニズムを示す。以前に
、ＲＫＫ配列モチーフを含むフィブロネクチン内のヘパリンスルフェート結合配
列も開示されたが、それはインテグリンｒα２Ｉドメイン結合に関して非機能的
である（Prake ら、J. Biol. Chem. 268 : 15859-15867 (1993))。

【０００７】 いくつかのヘビ種からの毒は、血小板インテグリン機能をブロックし、その毒
の抗凝固効果の原因であるジスインテグリン様タンパク質を含む。これらのタン
パク質はインテグリン機能の分子メカニズムを理解するのを助け、それらは、新
しい薬剤の開発においても潜在的な価値を有する。ジスインテグリンの多くのＲ
ＧＤ配列を有し、それらは、血小板αIIｂβ３及びαＶβ３インテグリンの機能
を阻害する。ジスインテグリン／メタロプロテイナーゼハブ類ボスロプス・ジャ
ララカ（Bothrops jararaca) からのジスインテグリン／メタロプロテイナーゼ
であるジャララギン（jararhagin) において、配列ＥＣＤはＲＧＤに置きかわる
（Paihe, M.J.Iら、Biol. Chem. 267 : 22869-22876 (1992)) 。ジャララギンは
コラーゲン誘導性血小板凝集の潜在的なインヒビターであり、その効果はα２β
１インテグリン機能の阻害に基づく（De Luca, M. ら、Biochem. Biophys. Res
Commun. 206 : 570-576 (1995)) 。その機能の正確なメカニズムは未知である。
インテグリンα２β１はジャララギンのジスインテグリンドメインを含むヘビ毒
タンパク質であるジャラセチンとも相互作用し得るが、その相互作用はジャララ
ギンより弱いようである（De Luca, Mら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 206
: 570-576 (1995))。 発明の概要 本発明は、ヒトα２Ｉドメイン（ネイティブ及び組換え）に結合する環状ペプ
チドを供する。更に、それらは、コラーゲンＩ及びIV並びにラミニン−１とのヒ
トインテグリン相互作用の潜在的なインヒビターである。

【０００８】 本発明の環状ペプチドは、もとは、ジャララギンのメタロプロテイナーゼドメ
インから得られた。本発明の新規インテグリン結合タンパク質の各々は、３つの
アミノ酸の共直線配列にアルギニン−リシン−リシン（ＲＫＫ）を含む。その環
状形態におけるＲＫＫ配列の存在はインテグリン結合活性を失わせる。 本発明は、ペプチドの配列内にＲＫＫ配列モチーフの１又は複数のコピーを含
む環状ペプチドを更に供する。ここで、このようなコピーは、コラーゲン内のイ
ンテグリンの相互作用を減少させるための能力をペプチドに供するのに十分であ
る。

【０００９】 本発明は、アミノ酸配列：Ｘ₁ ＲＫＫＸ₂ Ｘ₃ Ｘ₄ Ｘ₅ Ｘ₆ （配列番号：１）
（式中、アミノ酸Ｘ₁ −Ｘ₆ はいずれかのアミノ酸であるが、好ましくはＸ₂ は
ヒスチジン（Ｈ）である）を含む環状ペプチドを更に供する。 本発明は、アミノ酸配列：Ｘ₁ ＲＫＫＸ₂ Ｘ₃ Ｘ₄ Ｘ₅ （配列番号：２）（式
中、アミノ酸Ｘ₁ −Ｘ₅ はいずれかのアミノ酸であるが、好ましくはＸ₂ はヒス
チジン（Ｈ）である）を好ましくは含む環状ペプチドを更に供する。

【００１０】 本発明は、アミノ酸配列にＸ₁ ＲＫＫＸ₂ Ｘ₃ Ｘ₄ （配列番号：３）（式中、
アミノ酸Ｘ₁ −Ｘ₄ はいずれかのアミノ酸であるが、好ましくはＸ₂ はヒスチジ
ンである）をより好ましくは含む環状ペプチドを更に供する。 本発明は、ジャララギンのメタロプロテアーゼドメインのアミノ酸２４１−２
４７（ＣＴＲＫＫＨＤ：配列番号：６）及び２４１−２４９（ＣＴＲＫＫＨＤＮ
Ａ；配列番号：７）を各々含む２つの環状ペプチドＣＴＲＫＫＨＤＮＣ（配列番
号：４）及びＣＴＲＫＫＨＤＮＡＱＣ（配列番号：５）、並びに１又は複数のア
ミノ酸、特にＣ，Ｔ，Ｈ，Ｄ，Ｎ，Ａ及び／又はＱからなる群から選択される１
又は複数のアミノ酸を欠如するこれらのペプチドの環状フラグメントを更に供す
る。

【００１１】 本発明は、インテグリン機能をブロックするため、及びこのようなブロッキン
グ活性の必要な生理的状態又は疾患を有する患者を治療するためにこれらのペプ
チドを用いるための方法を更に供する。 本発明による環状インテグリン結合ペプチドは、サンプル混合物からα２含有
インテグリンを単離するためにも役立つ。 好ましい実施形態の詳細な記載 以下の記載において、医学及びタンパク質技術に用いられるいくつかの用語は
広く利用されている。このような用語が供される範囲を含む、明細書及び請求の
範囲の明確かつ一貫した理解を供するために、以下の定義を供する。

【００１２】 “被検体（患者）”とは、獣医学的又は医学的治療の必要な、特に本発明の組
成物での治療が必要な動物又はヒト被検体を意味する。 “治療”又は“処置”とは、本明細書に記載される１又は複数のペプチドを含
む有効量の組成物の、それが必要な被検体への、このような剤に感受性のある異
常又は潜在的な疾患の予防、緩和、防止又は治癒を含み得る目的のための投与を
意味する。

【００１３】 “投与”とは、いずれかの適切な方法による被検体への要求される物質の導入
も意味する。投与の有用な方法には、これらに限らないが、非経口（例えば静脈
内）、筋内、皮下、イオン泳動、経口、直腸、及び経腸がある。 “有効量”とは、定まった要求される終了点に達するのに十分な量を意味する
。本発明のペプチドの有効量は、α２Ｉドメイン含有インテグリン及び本発明の
ペプチドの欠如下でインテグリンと相互作用するであろう１又は複数の標的の機
能的相互作用の程度を減少させ、又はそれを阻害しもしくは防止するのに十分で
ある量である。

【００１４】 “医薬として許容される塩”とは、医薬として許容される酸又は塩基、例えば
これらに限らないが、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸等のような酸、又はアルカリも
しくはアルカリ土類金属水酸化物、水酸化アンモニウム、アルキルアンモニウム
水酸化物等のような塩基から形成された塩を含むことを意図する。 用語“医薬として許容されるビヒクル”とは、化合物の投与のための担体又は
アジュバントを供するように、本発明の調製物への添加物として利用される、溶
媒、担体、希釈剤等を含むことを意図する。

【００１５】 以下の議論及び例示はヒトインテグリンタンパク質を用いてしばしば供される
が、本発明のペプチド及び方法は、ジャララギンが毒の活性成分であるヘビ咬傷
にセンシティブであるいずれの種においても役立つ。このような活性は、このよ
うな種において標的インテグリンに本発明のペプチドが結合する能力の証拠であ
る。それゆえ、以下のヒトでの実施形態を用いる議論及び例示は本発明をこの点
に限定することを意図したものではない。

【００１６】 インテグリンによるコラーゲン認識は、インテグリン−フィブロネクチン結合
に似ている。コラーゲン結合αＩドメイン及びＲＧＤに結合すると予想されるβ
Ｉドメインが構造類似性を有するばかりでなく、環状ＲＧＤペプチドもα２β１
インテグリンに結合することができる。コラーゲンへのインテグリン結合のため
に重要であると考えられる３つのコラーゲンアミノ酸残基は、２つのアスパラギ
ン酸及び１つのアルギニンを含む。

【００１７】 本発明者らは、コラーゲンへのｒα２Ｉドメイン結合をブロックするジャララ
ギンにおけるモチーフがアスパラギン酸又はアルギニン残基のいずれかを含まな
ければならないこと、及びこのような機能のための重大なモチーフがマトリック
ス分子内の周知のインテグリン認識部位として親水性ループ内に、又はヘビ毒ジ
スインテグリン内では親水性ループ内にあるであろうことの仮説を立てた。本発
明者らは、これらの基準を満たすジャララギン構造内の以前には未知の配列につ
いて調査し、インテグリンｒα２ドメインでの固相結合アッセイでテストするた
めに合成ペプチドを調製した。

【００１８】 ジャララギンのメタロプロテイナーゼドメイン内のアミノ酸２４１−２４９を
含むメタロプロテイナーゼ由来のペプチドの１つ：ＣＴＲＫＫＨＤＮＡＱＣ（配
列番号：５）（両端の末端システインをネイティブ配列に加えた）がｒα２Ｉド
メインに強く結合することが見い出された。ユーロピウム標識化ｒα２Ｉ（組換
えα２Ｉ）ドメインをそのペプチドに接着させた時に、１０倍過剰な非標識化ｒ
α２Ｉドメインをそのアッセイに加えた時でさえ、２時間の追跡期間の間、検出
可能な分離がなかったという事実により、高い結合アフィニティーが証明された
。

【００１９】 テストしたペプチドのうち、そのペプチドがＩ型及びIV型コラーゲン並びにラ
ミニン−１へのｒα２Ｉドメイン付着を阻害した唯一のものであった。更に、そ
のペプチドはｒα２Ｉドメイン結合においてＢ．ジャララカ毒液と競合した。こ
れにより、本発明者らは、上述のアミノ酸２４１−２４９に対応するアミノ酸の
存在がジャララギンがα２β１インテグリンと相互作用する理由であると結論づ
けた。

【００２０】 そのペプチド配列の変異分析は新しいインテグリン結合モチーフ、ＲＫＫ又は
ＲＫＫＨ（配列番号：８）を示した。ＲＫＫＨ配列の４番目のアミノ酸であるヒ
スチジンも完全な機能のために重要であり得る。驚くことに、そのペプチド配列
内のアスパラギン酸の変異は効果を有さなかった。α２β１インテグリンのため
の周知のマトリックス分子リガンドはＲＫＫ（Ｈ）配列を含まない。

【００２１】 上述の見い出された新規ｒα２Ｉドメイン結合モチーフ、又はそれを含むペプ
チドは、マトリックスタンパク質認識を防止し得る。この解釈に固執することな
く、この効果は、Ｉドメインリガンド結合部位との直接の相互作用により、又は
Ｉドメインにおいて変化を引きおこし、これによりリガンド認識部位をマスキン
グすることによりおこると考えられる。ｒα２Ｉドメインのコンホメーションの
ペプチド依存性の変化は、コラーゲン結合の防止に伴ってペプチドがｒα２Ｉド
メインのエコウィルス−１への結合を誘導することを示す実験において明らかに
なった。これは、１つのリガンド認識部位の占有が別の部位のアフィニティーを
制御することができることも示す。

【００２２】 従って、本発明の新規インテグリン結合タンパク質の各々は、そのペプチドが
環状形態である場合にそのペプチドに対するインテグリン結合活性を害する３つ
のアミノ酸の共直線配列：アルギニン−リシン−リシン（ＲＫＫ）の共直線配列
を含む。ＲＫＫ配列モチーフの１，２，３又はより多くの複製がそのペプチドの
配列内に存在し得、ここでこのような複製は、インテグリンのコラーゲンとの相
互作用を減少させる能力をペプチドに供するのに十分である。

【００２３】 第１の実施形態において、本発明のペプチドは、アミノ酸配列：Ｘ₁ ＲＫＫＸ ₂ Ｘ₃ Ｘ₄ Ｘ₅ Ｘ₆ （配列番号：１）（式中、各々のＸはアミノ酸であり、アミ
ノ酸Ｘ₁ 〜Ｘ₆ はいずれかのアミノ酸（特にＡ，Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｃ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，
Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ又はＶである）であるが、好まし
くはＸ₂ はヒスチジン（Ｈ）である）を含む環状ペプチドである。

【００２４】 更なる実施形態において、本発明のペプチドは、アミノ酸配列：ＸＲＫＫＸ₂ Ｘ₃ Ｘ₄ Ｘ₅ （配列番号：２）、式中、アミノ酸Ｘ₁ −Ｘ₅ は上述のいずれかの
アミノ酸であるが、好ましくはＸ₂ はヒスチジン（Ｈ）である）を含む環状ペプ
チドである。 更なる実施形態において、本発明のペプチドは、アミノ酸配列Ｘ₁ ＲＫＫＸ₂ Ｘ₃ Ｘ₄ （配列番号：３）（式中、アミノ酸Ｘ₁ −Ｘ₄ は上述のいずれかのアミ
ノ酸であるが、好ましくはＸ₂ はヒスチジンであり、ペプチドは環状構造を有す
る）を含む環状ペプチドである。

【００２５】 極めて好ましい実施形態において、本発明のペプチドはアミノ酸配列ＣＴＲＫ
ＫＨＤＮＣ（配列番号：４）を有する環状ペプチド又はアミノ酸配列ＣＴＲＫＫ
ＨＤＮＡＱＣ（配列番号：５）を有する環状ペプチドであり、好ましくはその２
つの末端のシステイン残基はペプチドを環状構造にするジスルフィド架橋を形成
することに関連する。

【００２６】 本発明の環状ペプチドは、上述の通り１又は複数のアミノ酸Ｘ、特にＣ，Ｔ，
Ｈ，Ｄ，Ｎ，Ａ及び／又はＱのうちの１又は複数を欠如し得る。更に、本発明の
環状ペプチドは、ＲＫＫモチーフが共直線性を保持する限り、上述の配列に挿入
され及び／又は上述の配列に隣接した付加的なアミノ酸を含み得る。但し、この
ようなペプチドはα２−インテグリンに結合する能力を保持する。

【００２７】 末端のシステイン残基は、ペプチドの環化を生ずるであろう様式で位置するこ
とのみを必要とする。好ましくは、システインは、ジスルフィド結合形成がその
ペプチドの環状型に生物活性を与えるように正確な大きさのループを生じるよう
に、ペプチドの両端に位置する。（しかしながら、システイン残基の一方又は両
方は、端よりもむしろペプチドの内部であり得、そのシステインを超えて伸びる
いずれの“尾”もそれが残りのペプチドの環形態の喪失に寄与しない限り、問題
を有する可能性はない。この点に関して、生物活性の保持を許容するようなコン
ホメーションであるように、ペプチドの環形態が妨げられないなら、異なる成分
、例えばアルブミンのようなタンパク質を、リンカー；スペーサーとして用いる
ことができ、又は本発明の環状ペプチドが固体支持体、又は他の要求される成分
、例えば検出可能な標識に結合するように、その環状ペプチドの端に結合させる
ことができよう。

【００２８】 システインがペプチドの末端にある場合、そのペプチドは、好ましくは、シス
テイン間に９つのアミノ酸を含む。８つのアミノ酸は、活性を増強させず、これ
によりこの点でも役立つ。末端のシステイン間に７つのアミノ酸を有する環状ペ
プチドは、７又は８アミノ酸のものより約２０倍有効であり、従って特に好まし
い。一般に、末端のシステイン間に１０又はそれ超のアミノ酸を含むペプチドは
、環状のものよりむしろ（機能的でない）直鎖分子により近い挙動をする危険が
ある。末端システイン間に５又はそれ未満のアミノ酸を含む環状ペプチドは、不
可能ではないが、調製するのが極めて難しい。従って、末端システイン間に７つ
のアミノ酸を含む環状ペプチドが最も好ましい実施形態である。

【００２９】 本発明のペプチドの配列は、上述のペプチドの変異体であって、重大でない差
のアミノ酸置換を有するもの、例えば塩基性アミノ酸の別のものへの置換（ＲＫ
Ｋモチーフを除く）、疎水性残基の他のものへの置換、１つの中性残基の他のも
のへの置換、１つの酸性残基の他のものへの置換、又は１つの芳香族残基の他の
ものへの置換を包含することを意図する。

【００３０】 好ましい実施形態において、そのペプチドの環形態はジスルフィド架橋から生
ずる。しかしながら、ペプチドの環形態を生ずるいずれの共有結合も、その架橋
の機能が単にペプチドを正確なコンホメーションに推進することであるのに役立
つと予想される。 当該技術分野で周知である通り、アミノ酸残基は、適切なアミノ又はカルボキ
シ保護基を用いて、それらの保護化又は非保護化形態であり得る。有用な医薬と
して許容されるカチオンには、アルカリもしくはアルカリ土類金属カチオン（例
えばＮａ，Ｋ，Ｌｉ，１／２Ｃａ，１／２Ｂａ等）又はアミノカチオン（例えば
テトラアルキルアンモニウム、トリアルキルアンモニウム、ここで、各々のアル
キル基はＣ₁ −Ｃ₁₂であり得るが、好ましくはＣ₁ −Ｃ₆ の分枝又は非分枝アル
キル基である）がある。医薬として許容される低級アルキルエステル、医薬とし
て許容されるアミド及び医薬として許容される酸付加塩も調製することができる
。

【００３１】 本発明のペプチドは、例えば引用により本明細書に組み込まれるＵＳ５，６２
７，２６３に記載される通り、当該技術で周知の方法を用いて、合成し、環化す
ることができる。 本発明による環状インテグリン結合ペプチドは、インテグリン機能、特にヒト
インテグリン機能のブロッカー（インヒビター）として役立つ。そのネイティブ
リガンドへのインテグリン結合は、本発明のペプチドの存在下で阻害され又は防
止される。特に環状インテグリン結合ペプチドは、このドメインと相互作用する
高分子、例えばコラーゲン、例えばコラーゲンＩ及びIV、並びに例えばラミニン
−１とのインテグリンα２Ｉドメイン相互作用をブロックするために役立つ。

【００３２】 ヒト組換えα２Ｉドメインの配列は、Takada, Y.及びM.E. Hemler, J. Cell B
iol. 109 : 397-407 (1989) （引用により本明細書に組み込まれる）において供
される。α２Ｉドメインは、一般的な組換え宿主、例えば大腸菌を用いて生産す
ることができる。その特性は、ｒα２Ｉドメインのユーロピウムラベリングに基
づくセンシティブな固相アッセイ及び時間分割蛍光測定を用いてキャラクタライ
ズすることができる。そのアッセイは、酵素又はそれに連結した他の大きな分子
の存在なしにｒα２Ｉドメインの結合を直接、測定することを可能にする。

【００３３】 本発明のペプチドのα２−インテグリン結合能力は、このような結合を検出す
る、特にコラーゲンＩ、コラーゲンIV又はラミニン−１との相互作用をブロック
する結合の能力を検出するアッセイを用いて決定することができる。以下に例示
するように、ユーロピウム標識化組換えα２Ｉドメインを用いる結合アッセイ（
実施例２）、及びα２Ｉドメイン内のウィルス−１認識部位の活性化を検出する
アッセイがこれに役立つ（実施例２）。

【００３４】 本発明のペプチドは、生体内及び試験管内でコラーゲン上での細胞のマイグレ
ーションを阻害し又は防止するために特に役立つ。本発明のペプチドが細胞マイ
グレーションをブロックする能力は、実施例７に供されるような細胞マイグレー
ションアッセイを用いて決定することができる。これにより、本発明は、試験管
内で、又はこのようなマイグレーションがインテグリン依存様式で媒介される場
合に、それを阻害するのが必要な患者において生体内で、コラーゲン上での細胞
マイグレーションを阻害するための方法を供する。これにより、本発明は、細胞
マイグレーションが病理メカニズムの一部である、歯周炎を含む病気を治療する
治療方法を供する。

【００３５】 本発明は、更に、悪性細胞のマイグレーションを阻害するため、及びそれゆえ
、それを特徴とする病気、例えば癌、例えば骨肉腫、及び黒色腫、特にα２β１
インテグリン依存性細胞マイグレーションが悪性メカニズムに寄与し得るものを
治療するための方法を供する。 本発明は、コラーゲンへの血小板の付着及びコラーゲン誘導性血小板凝集を阻
害する方法を更に供する。本発明のペプチドが細胞付着を阻害する能力は、実施
例８に供されるように決定することができる。これにより、本発明は、血小板の
コラーゲンへの付着及びコラーゲン誘導性の血小板凝集を防ぐ必要性を特徴とす
る心臓血管疾患のような状態又は病気のための予防的又は緩和的治療の必要な患
者、例えば発作にあった人又は発作の危険のある患者を治療するための方法を供
する。

【００３６】 本発明のペプチドを含む医薬調製物は、とりわけ、ペプチドの安定化及び有効
な形成のための医薬として許容される担体を含み得る。適切なビヒクル、及びそ
れらの製剤、例えば他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンは、例えば
Remington's Pharmaceutical Sciences (18th edition, A.R. Gennaro, ed., Ma
ck Publishing, Easton, PA 1990) に記載される。有効量の本発明のペプチドを
このような組成物の必要な患者に投与するために適した医薬として許容される組
成物を形成するために、このような組成物は、必要に応じて適切な量の担体ビヒ
クルと一緒に、有効量の１又は複数の本発明のペプチドを含むであろう。

【００３７】 本発明のペプチドは、好ましくは、実質的に汚染物がないように精製される。
細胞内又は試験管内システムのいずれかで、合成した時に関連している不要な材
料から、要求される目的のために役立つのに十分な程度まで、実質的に精製され
ているなら、その材料は“実質的に汚染物を含まない（ない）”と言う。 本発明の方法に役立つ組成物は、１又は複数の本発明のペプチドを含み得る。
一超のペプチドが本組成物中に存在する場合、それは別のペプチドと同じアミノ
酸鎖の一部であっても組成物中の別個のペプチドとして存在してもよい。静脈内
、筋内又は皮下投与のための組成物は、好ましくは約１pg／kg体重〜１mg／kg体
重の範囲で好ましくは投与されるが、それより低い又は高い投与量を投与するこ
ともできる。要求される投与量は、例えば患者の状態の激しさ、並びに患者の体
重、性別、年齢、及び病歴のような基準に依存するであろう。その投与量は、獣
医の設定で動物に又はヒト患者に投与されるか否かにも極めて依存し得る。

【００３８】 非経口的投与の目的のため、本発明のペプチドを含む組成物は、好ましくは蒸
留水に溶かされ、そのpHは好ましくは約６〜８に調節される。そのペプチドが凍
結型で供されるなら、凍結乾燥過程を容易にするために溶液にラクトースを加え
ることができる。このような形態において、次に溶液は滅菌され、容器に導入さ
れ、そして凍結乾燥される。

【００３９】 非経口投与のための本発明の組成物の有用な調製物は、滅菌水性及び非水性溶
媒、懸濁液及びエマルションを含む。有用な非水性溶媒の例にはプロピレングリ
コール、ポリエチレングリコール、植物油、魚油、及び注入用有機エステルがあ
る。水性担体の例には、水、水−アルコール溶液、エマルション又は懸濁液、例
えば塩類溶液及び緩衝医療用非経口ビヒクル、例えば塩化ナトリウム溶液、リン
ガーデキストロース溶液、デキストロース＋塩化ナトリウム溶液、ラクトースを
含むリンガー溶液、又は固定油がある。静脈内ビヒクルの例には、流体及び栄養
補充剤、電解質補充剤、例えばリンガーデキストロース等に基づくものがある。

【００４０】 注入用調製物、例えば油性溶液、懸濁液又はエマルションは、周知の技術に従
って、必要に応じて適切な分散又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて調剤することがで
きる。活性化合物が水溶性形態、例えば水溶性塩の形態である場合、滅菌注入用
調製物は、例えば滅菌非ハイロジェニック水又は１，３−ブタンジオールのよう
な非毒性の非経口性の許容される希釈剤又は溶媒を用いることができる。用いる
ことができる他の許容されるビヒクル及び溶媒には、５％デキストロース注入液
、リンガー注入及び等張塩化ナトリウム注入液（ＵＳＰ／ＮＦに記載）がある。
活性化合物が非水溶性形態である場合、適切な脂溶性溶媒又はビヒクル、例えば
脂肪油、例えばゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル又は
トリグリセリドを含む滅菌した適切な油性懸濁液が用いられる。あるいは、粘度
を増加させる物質、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトー
ル、及び／又はデキストランを含み、任意に安定剤も含む水性注入用懸濁液を用
いることができる。

【００４１】 本発明のペプチドのイオン泳動によるデリバリーのために、ペプチドは、好ま
しくは約４．０もしくはそれ未満のpH又は約７．０もしくはそれ超のpHを有する
。イオン泳動の方法は、例えば、引用により本明細書に組み込まれるＵＳ５，６
３７，０８４及びＵＳ４，９５０，２２９に記載される。 経口（全身性）投与のための医薬調製物は、活性化合物を固体賦形剤と組み合
わせ、任意に生じた混合物を粒状にしてその混合物又は粒子を処理し、要求又は
必要に応じて適切な補助剤を加えた後に糖剤コアの錠剤を供することにより得る
ことができる。歯周炎の治療のための医薬調製物は、口腔内に保持される組成物
において、好ましくは歯周腔内に直接、調製物をおくことにより、最も好ましく
は持続放出性形態において投与することができる。あるいは、本調製物は、本ペ
プチドを要求される部位に局所的に放出するように、歯及び／又は歯肉上に塗る
ことができる。このような技術は、引用により本明細書に組み込まれるＵＳ５，
００２，７６９、ＵＳ５，０２３，０８２、ＵＳ５，１６０，７３７、ＵＳ５，
３３０，７４６、ＵＳ５，４２５，９５３、ＵＳ５，４３８，０７６及びＵＳ５
，６３９，７９５に供される。本調製物は、メンブラン上にも供することができ
る。

【００４２】 適切な賦形剤は、特に充填剤、例えば糖、例えばラクトース又はスクロース、
マンニトール又はソルビトール、セルロース調製物及び／又はリン酸カルシウム
、例えばリン酸三カルシウム又はリン酸水素カルシウム、並びにバインダー、例
えばデンプン、ペースト、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメ
デンプン、又はポテトデンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、
ヒドロキシメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、及び／
又はポリビニルピロリドン、及び／又は必要に応じて分解剤、例えば上述のデン
プン、及びカルボキシメチル−デンプン、架橋化ポリビニルピロリドン、寒天又
はアルギン酸又はその塩、例えばアルギン酸ナトリウムである。補助剤は、とり
わけ、フロー制御剤及び滑剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸又はその塩
、例えばステアリン酸マグネシウム又はステアリン酸カルシウムであり、必要に
応じて胃液耐性である適切なコーティングを有し、これには、この目的のため、
とりわけ、任意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン
グリコール及び／又は二酸化チタンを含む濃縮糖溶液、ラッカー液、及び適切な
有機溶媒又は溶媒混合物がある。胃液耐性のコーティングを作るために、適切な
セルロース調製物、例えばアセチルセルロースフタレート又はヒドロキシプロピ
ルメチルセルロースフタレートが用いられる。染料又は色素を、例えば同定のた
め、又は活性化合物投与量の異なる組合せをキャラクタライズするために添加す
ることができる。

【００４３】 経口投与のための固体投与形態には、カプセル、錠剤、丸薬、トローチ、ロゼ
ンジ、粉末及び粒子がある。このような固体投与形態において、活性化合物は少
くとも１の不活性希釈剤、例えばスクロース、ラクトース又はデンプンと混合す
ることができる。このような投与形態は、通常の実施において、医薬的アジュバ
ント物質、例えばステアレート滑剤も含み得る。固体経口調製物は、腸溶性又は
活性成分の放出を制御する他のコーティングでも調製することができる。

【００４４】 経口投与のための液体投与形態は、水及びアルコールのような当該技術で一般
に用いられる不活性非毒性希釈剤を含む、医薬として許容されるエマルション、
溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルを含む。このような組成物は、アジュバ
ント、例えば湿潤剤、乳化、懸濁、甘味、芳香及び香料剤を含み得る。 本発明の組成物は、ポンプにより又は持続放出性形態で投与することもできる
。本発明の化合物は、適切に挿入されたカテーテルにより、又は特定器官を標的
とするようにデザインされたキメラ分子（又は複合体）の一部のような分子を供
することにより高濃度で特定の器官にデリバリーすることもできる。これに関し
て、上述のペプチドは、より長いペプチドの端に環状の“ループ”を形成するこ
とができ、このようなペプチドは、要求される活性を有する第２のドメインを有
する。このような融合タンパク質は、本発明の環状ペプチドに結合する膜結合イ
ンテグリンを含む細胞を殺す助けとなるドメインを供するようにデザインするこ
とができる。

【００４５】 持続放出性形態での投与は、長期間のくり返しの投与が患者の快適さを最大に
するように行われる場合に、患者のためにより便利である。制御放出性調製物は
、本発明のペプチドと複合化し又はそれに吸着するためのポリマーの使用により
行うことができる。制御されたデリバリーは、適切な高分子（例えばポリエステ
ル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチル
セルロース、カルボキシメチルセルロアーゼプロタミン亜鉛及びプロタミンスル
フェート）を選択すること及び制御放出のための組込み法により行うことができ
る。制御放出調製物による作用の持続時間を制御するための別の可能な方法は、
要求されるペプチドを、ポリマー材料、例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ヒ
ドロゲル、ポリ（乳酸）又はエチレンビニルアセテートコポリマーの粒子に組み
込むことである。あるいは、ペプチドをこれらのポリマー粒子に組み込むかわり
に、ペプチドを、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合化、例えば
ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメ
タクリレート）マイクロカプセル各々により、又はコロイド状ドラッグデリバリ
ーシステム、例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフィアー、マイクロエマ
ルション、ナノパーティクル、及びナノカプセル又はマクロエマルションにおい
て、調製した微小粒子に入れることができる。

【００４６】 本発明のペプチドの生物半減期は、要求される環境における環状形態の保持時
間又は安定性を増加させることにより長くすることができる。特に、環状形態の
安定性を増加させる剤は、ペプチドの生物半減期を増加させると予想することが
できる。これに関して、１又は複数のＤ−アミノ酸（特にその位置で同じＬ−ア
ミノ酸に置換される場合）の使用、又はペプチド構造における１又は複数のアミ
ノ酸アナログ、例えばペンシルアミン（３−メルカプトバリン）の使用は、Ｄ−
アミノ酸又はアミノ酸アナログが組成物を投与する動物又は患者において又は要
求される試験管内組成物において環状構造の代謝による破壊を妨害するように行
われ得る。

【００４７】 本発明のペプチドの、標的へ、特にα２Ｉドメインを含むインテグリンへの結
合を増加させるためのＤ−アミノ酸又はアミノ酸アナログの使用も考慮される。
本発明の組成物及び方法に用いられるペプチドは、その材料の生物活性が消化
過程により破壊されず、かつその化合物の特徴が腸組織を通して吸収されるのを
許容するなら、経口投与のための錠剤、カプセル、粉末塊、又は液体溶液のよう
な投与形態で用いることができる。

【００４８】 本発明の医薬組成物は、それ自体、周知の様式で、例えば慣用的な混合、粒化
、糖剤製造、溶解、凍結乾燥又は同様の方法により製造することができる。 本発明のペプチドは、特に混合物からのα２Ｉ含有インテグリンの抽出のため
に、それらに結合するリガンドの抽出のためのアフィニティー試薬としても用い
ることができる。

【００４９】 本発明はここまでで十分に記述されているが、それは特定の実施例を引用する
ことにより直ちに理解されよう。但しその実施例は詳述目的のために供され、本
発明を限定することを意図したものではない。 実施例 実施例１ ヒト組換えインテグリンα２Ｉドメインの形成 α２ＩドメインをコードするＤＮＡを、テンプレートとしてヒトインテグリン
α２ ｃＤＮＡを用いてＰＣＲにより作り出した（インテグリンα２ｃ ＤＮＡ
はDr. M. Hemler, Dana-Farber, Bostonからいただいた) 。正プライマーは５′
−ＣＡＣＡＧＧＧＡＴＣＣＣＣＴＧＡＴＴＴＴＣＡＧＣＴＣ−３′（配列番号：
９）であり、逆プライマーは、５′−ＧＴＧＧＣＴＧＡＡＴＴＣＡＡＣＡＧＴＡ
ＣＣＴＴＣＡＡＴＧ−３′（配列番号：１０）であった。プライマーを、産物内
に２つの制限部位を導入するようにデザインした：５′端にＢａｍＨＩ部位及び
３′端にＥｃｏＲＩ部位。ＰＣＲ産物及びｐＧＥＸ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、連結し、そして大腸菌ＤＨα５Ｆ′細胞
に形質転換した。次に、α２Ｉドメイン挿入物を有するプラスミド（ｐＪＫα２
Ｉ）を配列決定し、組換えタンパク質ｒα２Ｉの生産のために大腸菌ＢＬ２１に
形質転換した。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−ｒα２Ｉ融合タンパク質
の生産及び精製は次の通り行った典型的には４００mlのＬＢ（カルベニシリン５
０μｇ／ml）にＢＬ２１／ｐＪＫα２Ｉの４０mlの一晩培養物を接種し、その培
養物を３７℃で１時間、培養した。次に、インデューサー、ＩＰＴＧ（最終濃度
０．１mM) を４時間、添加した。

【００５０】 ヒト組換えインテグリンα２Ｉを以下の通り大腸菌から精製した。細胞を遠心
により収集し、ペレットをリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ、pH７．４）に再度懸濁
した。懸濁液を音波処理し、遠心し、上清を保持した。ペレットをＰＢＳに再度
懸濁し、音波処理し、そして更に２回、遠心し、上清をプールした。グルタチオ
ンＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を加え、生じたライ
ゼートを静かに撹拌することにより３０分、室温でインキュベートした。そのラ
イゼートを遠心し、その上清画分を除去し、結合した融合タンパク質を有するグ
ルタチオンＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）を適切なカラムに移した。次にその
カラムを１０容量のＰＢＳ（１４０mM ＮａＣｌ、２．７mM ＫＣｌ、１０mM
Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ 、１．８mM ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、pH７．３）で洗い、その融合タンパ
ク質をグルタチオン溶出緩衝液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、pH８．０中の１０mM還元グルタチオン) で溶出した。その融合タンパク質を
少くとも２時間、室温でトロンビンプロテアーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；１０ユ
ニット）で開裂し、ＰＢＳに対して透析してグルタチオンを除去した。その開裂
混合物を２回目のグルタチオンＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラムを通して
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼを除去した。

【００５１】 ｒα２Ｉを流出物から収集した。正確なホールディングを許容するために５mM
ジチオトレイトール（ＤＴＴ）で組換えタンパク質を処理することが必要であっ
た（ＰＢＳ中５mM ＤＴＴ）。なぜならネイティブＰＡＧＥにより分析する場合
、余分なバンドが処理なしでは見られるからである。その組換えタンパク質はＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により少くとも９０％純度
であり、唯一のバンドがネイティブ−ＰＡＧＥにより観察された。

【００５２】 生産された組換えα２Ｉドメインは、アミノ末端に２つの非インテグリンアミ
ノ酸（ＧＳ）、インテグリン配列１２４〜３３９（ＰＤＦＱ…ＩＥＧＴＶ）（配
列番号：１１及び配列番号：１２）に対応するインテグリンアミノ酸、及びカル
ボキシ末端に６つの非インテグリンアミノ酸（ＥＦＩＶＴＤ；配列番号：１３）
を有する２２３アミノ酸基であった。

【００５３】 実施例２ ユーロピウム標識化ｒα２Ｉのための結合アッセイ ボスロプス・ジャララカ（Bothrops jararaca) ハブ類からの毒液は、Ｉ型コ
ラーゲンへの組換えインテグリンα２Ｉドメインの結合を防止する。 ユーロピウム標識化ｒα２Ｉの使用に基づくセンシティブな固相ｒα２Ｉリガ
ンド結合アッセイを開発した。ｒα２Ｉのユーロピウムでの標識化は次の通り行
った：１／２０容量の１Ｍ ＮａＨＣＯ₃ （pH８．５）をその精製ｒα２Ｉに加
えてイソチオシアネートでの標識化のためにpHを上昇させた。ユーロピウム標識
化試薬（Ｗａｌｌａｃ）を１００倍過剰量で加え、＋４℃で一晩、インキュベー
トした。未結合のラベルをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０／Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６
Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でのゲルろ過により除去してその標識化タンパ
ク質を含む画分をプールした。

【００５４】 ９６ウェルイムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ． Ｎｕｎｃ）を、そのウェル
の表面を、５μｇ／cm² プレート表面のＩ型コラーゲン（ウシ皮膚、Ｃｅｌｌｏ
ｎ）、IV型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ）、ラミニン−１（Engelbreth-Holm-Swarm
マウス腫瘍、Collaborative Researchの基底膜から精製) 、フィブロネクチン（
ヒト血漿フィブロネクチン、Boehringer Mannheim)又は３．３μｇ／mlのエコウ
ィルス−１又はエコウィルス−７を含む０．１mlのＰＢＳに、１２時間、＋４℃
で露出することによりコートした。あるいは、ペプチド及びＢ．ジャララカ毒液
（Ｓｉｇｍａ）を種々の濃度で、製造元の説明に従って、９６−ウェルアミノ結
合プレート（Ｃｏｓｔａｒ）上にコートした。

【００５５】 全てのウェル上の残ったタンパク質吸着部位を、＋３７℃で１時間、ＰＢＳ中
０．１％の熱不活性化ウシ血清アルブミンでブロックした。エコウィルス１（Ｆ
ａｒｏｕｋ株）及び７（Ｗａｌｌａｃｅ）をＡＴＣＣから得た。その精製したウ
ィルスを０．５mM ＭｇＣｌ₂ を含むＰＢＳ中に希釈し、−７０℃で使用するま
で保存した。ユーロピウム標識化ｒα２ＩをＰＢＳ、２mM ＭｇＣｌ₂ 、１mg／
ml ＢＳＡの濃度でそのコートされたウェルに加え、３時間、＋３７℃でインキ
ュベートした。次にウェルをＰＢＳ、２mM ＭｇＣｌ₂ で３回、洗った。０．１
mlのＤｅｌｆｉａ増強溶液（Ｗａｌｌａｃ）を各々のウェルに加え、ユーロピウ
ムシグナルをフルオロメトリー（Model 1232 Delfia, Wallac)で測定した。

【００５６】 ペプチドを内生的に加えた時、その凍結乾燥したペプチドをＰＢＳ、２mM Ｍ
ｇＣｌ₂ 、１mg／ml ＢＳＡ中５００ng／mlのユーロピウム標識化ｒα２Ｉに直
接、溶かし、次にウェルに加えた。ＥＤＴＡをＭｇＣｌ₂ のかわりに用いた場合
、ユーロピウム標識化ｒα２ＩをＰＢＳ、２mM ＥＤＴＡに希釈し、次に、この
緩衝液で洗浄を行った。この結合アッセイは極めてセンシティブであり、本実験
に用いるｒα２Ｉドメインの量を少なくすることが可能であることが見い出され
た。更に、小さい大きさのユーロピウムは、その測定がより大きなマーカー分子
より信頼できる。第３に、ここに記述されるマイクロタイターウェルは、多数の
インテグリンｒα２Ｉドメインブロッキング分子と予想されるもののスクリーニ
ングのために使用できることが見い出された。

【００５７】 ｒα２ＩはＩ型コラーゲン、IV型コラーゲン、及びラミニン−１に結合した。
しかしながら、それはフィブロネクチン又はアルブミン（図１Ａ）に強く結合し
なかった。ｒα２ＩはＭｇ²⁺依存でＩ型コラーゲンに結合し、２mM ＥＤＴＡの
添加は結合を完全に失わせた（図１Ｂ）。これは、二価カチオンの存在下でのみ
α２β１がコラーゲンと相互作用するという事実と一致した。ｒα２Ｉドメイン
のエコウィルス−１への結合は、マトリックス分子への結合よりかなり弱かった
。

【００５８】 先の研究は、Ｂ．ジャララカ毒液が血小板α２β１インテグリンのコラーゲン
との相互作用（DeLuca, M.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 206 : 570〜57
6 (1995)) 。しかしながら、この阻害作用はα２Ｉドメイン機能の防止のためで
あるか否かは不明であった。また、その相互作用に関連するエピトープは不明で
あった。

【００５９】 ｒα２ＩドメインのＩ型コラーゲンへの結合に対するＢ．ジャララカ毒液の効
果を、上述の固相リガンド結合アッセイを用いて研究した。ユーロピウム標識化
ｒα２Ｉドメインは２mM Ｍｇ²⁺の存在下で基層Ｉ型コラーゲンに結合し、次に
結合したｒα２Ｉの量を測定した。その毒液の効果を１μｇ／ml〜１０００μｇ
／mlの範囲の濃度でテストした。毒液はｒα２Ｉドメイン−コラーゲン相互作用
を有効に、濃度に依存して阻害した（図１Ｃ）。見られた阻害がｒα２Ｉのヘビ
毒液との直接の相互作用のためであるか否かを決定するために、マイクロタイタ
ーウェルを毒液タンパク質でコートし、この基層へのｒα２Ｉ結合をテストした
（図１Ｄ）。公開されている文献によれば、ジャララギンはα２β１インテグリ
ンのコラーゲンへの結合を阻害するＢ．ジャララカ毒液内のタンパク質であるこ
とが明らかであり（DeLuca, M ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 206 : 570
-576 (1995))、それゆえｒα２Ｉドメインに結合する最も確からしい毒液成分で
ある。

【００６０】 実施例３ ビオチニル化２２９ｏｘを用いるペプチド及び結合アッセイ 短い環状ジャララギン由来ペプチドは、インテグリンｒα２Ｉドメイン−コラ
ーゲン相互作用へのＢ．ジャララカ毒液の効果に擬態する。 ジャララギン内のα２Ｉドメイン結合部位のキャラクタリゼーションを、その
タンパク質に沿った領域に対応する一連の短い環状ペプチドを用いることにより
続行した。そのテストした領域は、次の事項に基づいて選択した：マトリックス
タンパク質内及びヘビ毒液ジスインテグリン内のインテグリン結合モチーフがル
ープ構造内に見い出されること。ii) 周知のインテグリン結合モチーフがアスパ
ラギン酸残基を含むこと。iii ）インテグリン−コラーゲン相互作用の公開され
たモデルがアスパラギン酸残基に加えてアルギニン残基の役割をきわだたせるこ
と。

【００６１】 ジャララギン由来ペプチドをジャララギンアミノ酸配列の二次構造予測に基づ
いてデザインした。二次構造予測は、Genetics Computer Group (GCG) Software
package (Madison, WI)からのＰｅｐｔｉｄｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅプログラム
(Madison, WI)を用いて行った。Ｅｍｉｎｉ法 (Emini, E.A. ら、J. Virol. 55
: 836〜839 (1985)) に従う表面確率 (Surface probability)及びＫｙｔｅ−Ｄ
ｏｏｌｉｔｔｌｅ (Kyte, J.ら、 J. Mol. biol. 157 : 105〜132 (1982)) 法に
従う親水性を考慮に入れた。

【００６２】 ペプチドを、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学を用いて
、自動ペプチドシンセサイザー（Applied Biosystems 431A)で合成した。アラニ
ン置換のためのペプチドをResearch Genetics (Huntsville, AL)から購入した。
合成した後、ペプチドを酸化してジスルフィド架橋を形成した。そのペプチドを
０．１Ｍ炭酸アンモニウム緩衝液に溶かし、１６〜２４時間、＋４℃でインキュ
ベートした。その酸化は、逆相ＨＰＬＣでチェックし、その酸化ペプチドを凍結
乾燥した。

【００６３】 全てのペプチドをＰＢＳ中に１０mg／mlで完全に溶かした。用いた最も高い濃
度は１mg／mlであったので、不溶性ペプチドによる非特異的効果は避けられた。
種々のペプチドの等電点（ＰＩ）も、Genetics Computer Group (GCG) Software
パッケージ (Madison, WI)からのＩｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃプログラムを用いて一
次配列から決定した。ペプチド２２５ｏｘ（表１）は、２２９ｏｘと同様の等電
点を有することが見い出され（表１）、それゆえ、いくつかの実験において対照
ペプチドとして選択した。

【００６４】 ２２９ｏｘのビオチニル化を次の通り行った：凍結乾燥した２２９ｏｘペプチ
ドをＰＢＳに溶かし、１／５容量の０．１Ｍ ＮａＨＣＯ₃ 、０．５Ｍ ＮａＣ
ｌ（pH８．０）を加えてビオチニル化のためにpHを上昇させた。スルホ−ＮＨＳ
−ビオチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ) を１：２（ｗ／ｗ）２２９ｏｘ：ビオチン
で加え、２時間、ＲＴでインキュベートした。１／１０容量の０．５Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH８．０）をそのビオチニル化反応の最後に加えた。

【００６５】 ビオチニル化２２９ｏｘペプチドを用いる結合アッセイのために、９６ウェル
アミン結合プレート（Ｃｏｓｔａｒ) を、製造元の説明に従って種々の濃度のｒ
α２Ｉドメイン又はｒα２Ｉドメイン由来ペプチドでコートした。全てのウェル
上の残存タンパク質吸着部位をＰＢＳ中０．１％の熱不活性化ウシ血清アルブミ
ンで１時間、＋３７℃でブロックした。ＰＢＳ、２mM ＭｇＣｌ₂ 、１mg／ml
ＢＳＡ中の１００μＭビオチニル化２２９ｏｘをそのコートしたウェルに加え、
＋３７℃で３時間、インキュベートした。次にウェルをＰＢＳ、２mM ＭｇＣｌ ₂ で３回洗い、ユーロピウム標識化ストレプトアビジン（Ｗａｌｌａｃ) をＰＢ
Ｓ、２mM ＭｇＣｌ₂ 、１mg／ml ＢＳＡ中５００μｇ／mlの濃度で室温で３０
分、加えた。ウェルを再び３回、洗った。０．１ml Ｄｅｌｆｉａ増強溶液（Ｗ
ａｌｌａｃ）を各々のウェルに加え、ユーロピウムシグナルをフルオメトリー（
Model 1232 Delfia, Wallac)で測定した。ＥＤＴＡをＭｇＣｌ₂ のかわりに用い
た場合、ユーロピウム標識化ｒα２ＩをＰＢＳ、２mM ＥＤＴＡに希釈し、次に
この緩衝液で洗浄を行った。

【００６６】 その選択された配列に対応するペプチドを合成した。生じたペプチドを表１に
要約する。 これらのペプチドのいずれがα２Ｉドメインと直接、相互作用することができ
るかを研究するため、環状ＲＧＤペプチド、Ｉ型コラーゲン、IV型コラーゲン、
及びフィブロネクチンと一緒にジャララギンをマイクロタイタープレートにコー
トし、ｒα２Ｉ−Ｅｕを加えた。その結果は、２２９ｏｘと呼ぶジャララギンペ
プチドの１つがｒα２Ｉドメインに有効に結合したが、他のテストしたペプチド
は効果を示さなかった（図２Ａ）。

【００６７】 次にそれらペプチドを５００μＭの濃度でＩ型コラーゲンに結合するｒα２Ｉ
に作用する能力についてテストした。再び、２２９ｏｘのペプチドだけが大きな
効果を有し：それはｒα２Ｉドメインとコラーゲンとの間の相互作用を完全に阻
害した（図２Ｂ）。 表１ 本研究に用いた合成ペプチドの配列。ジャララギン（Paine, M.J.Iら、J. Bio
l. Cehm. 267 : 22869-22876 (1992))及びα２Ｉドメイン（Takeda, Y.及びHeml
er, M.E., J. Cell Biol. 109 : 397-407 (1989)) の一次配列に基づいて合成し
たペプチドの名前及び位置を示す。

【００６８】 ジャララギンペプチド アミノ酸配列 残基番号 192ox；配列番号：14 CWSNGDKITC^* 212-219 195ox；配列番号：15 CEQQRYDPYKC ^* 151-159 197ox；配列番号：16 CKLPDSEAHAC ^* 103-111 223ox；配列番号：17 CHYSPDGREIC ^* 46-54 225ox；配列番号：18 CPADVFHKNC^* 441-449 229ox；配列番号：５ CTRKKHDNAQC ^* 241-249 231ox；配列番号：19 CYSNDDEHKGC ^* 537-545 Ｉドメインペプチド アミノ酸配列 残基番号 Ｐ１；配列番号：20 VCDESNSIYC^* 149-157 Ｐ２；配列番号：21 VCDESNSIYPWDAVKNC ^* 149-164 Ｐ３；配列番号：22 IYPWDAVKNFLEKFVQG 155-172 Ｐ４；配列番号：23 AVKNFLEKFVQGLDIG 160-176 Ｐ５；配列番号：24 LDIGPTKTQVGLIQYA 173-188 Ｐ６；配列番号：25 QYANNPRVVFNLNTYKTKEE 186-205 Ｐ７；配列番号：26 LNTYKTKEEMIVAT 197-210 Ｐ８；配列番号：27 ATSQTSQYGGDLTNT 209-223 Ｐ９；配列番号：28 RKYAYSAASGGRRSAT 231-246 Ｐ10；配列番号：29 TDGESHDGSMLKAVIDQ 253-269 Ｐ11；配列番号：30 LDTKNLIKEIKAIASIPTER 291-310 Ｐ12；配列番号：31 SDEAALLEKAGTLGEQ 316-331 他のペプチド アミノ酸配列 引用文献 RGD GACRGDCLGA^* ； Koivunen, E. et al., J
配列番号：32 . Biol. Chem. 268 : 20
205-20210 (1993) RGE GACRGECLGA^* ； Koivunen, E. et al., J
配列番号：33 . Biol. Chem. 268 : 20
205-20210 (1993) ^* 環状ペプチド ２２９ｏｘペプチド及びＢ．ジャララカ毒液の結合特性の間の相関を示すため
、２２９ｏｘペプチドがヘビ毒液中のｒα２Ｉ結合部位と競合する能力をテスト
した。結果は、２２９ｏｘ及びＢ．ジャララカ毒液の両方がｒα２Ｉに結合する
こと、及び２２９ｏｘ−ｒα２Ｉが２２９ｏｘがジャララギンの実際のインテグ
リン結合部位であることを示すことを示した。その阻害は完全ではなかった（約
５０％）ので、なお、Ｂ．ジャララカ毒液はα２Ｉドメインのための別の結合部
位も含むこと可能性がある。

【００６９】 いくつかの出版物において、インテグリン擬態合成ペプチドの環状構造が高ア
フィニティー結合のためにしばしば本質的であることが示されている。これをテ
ストするため、酸化及び直鎖ｐ２９９ペプチドの両方を前掲の固相結合アッセイ
に用いた。環状２２９ｏｘは、Ｉ型コラーゲンへのｒα２Ｉ付着を阻害する能力
を示したが、そのペプチドの直鎖型はほとんど効果を有さなかった（図４Ａ）。
ｒα２Ｉの固相結合２２９ｏｘへの結合は濃度依存性であることが見い出され、
７５μｇ／mlのコーティング濃度で大きな結合が観察された（図４Ｂ）。Ｉ型コ
ラーゲンに加えて、ｒα２ＩドメインはIV型コラーゲン及びラミニン−１にも結
合する。２２９ｏｘペプチドは、ｒα２Ｉのこれらのリガンドへの結合を阻害し
たが、同様のｐＩ値での同じ長さ及びコンホメーションの対照ペプチド２２５ｏ
ｘは効果を有さなかった（図４ｃ）。これは、α２Ｉドメインが同じメカニズム
によりこれらのリガンド全てに結合すること、及び２２９ｏｘがリガンド認識部
位と直接、相互作用することにより、又はＩドメインの３次元構造を不活性なも
のに変化させることにより結合を阻害することを示唆する。

【００７０】 実施例４ ジャララギン由来ペプチドはインテグリンｒα２Ｉドメイン内のエコウィルス
−１認識部位を活性化する。 コラーゲン及びラミニン−１への細胞接着を媒介することに加えて、インテグ
リンα２β１は、ヒト病原体エコウィルス−１による細胞表面付着及び感染を媒
介するウィルスレセプターとしても機能する。マトリックスタンパク質及びエコ
ウィルス−１は異なる様式でインテグリンと相互作用することが見い出されてい
るが、エコウィルス−１のための結合部位はα２サブユニットのＩドメインにも
位置する。上述の通り、ｒα２Ｉドメインは、コートされたエコウィルス−１へ
の弱い結合を示したが、驚くことに、２２９ｏｘペプチドの付加は、対照ペプチ
ド２２５ｏｘが効果を有さなかったのに対して約１０倍、この結合を増加させた
（図５）。この結果は、２２９ｏｘペプチドのα２Ｉドメインへの結合がタンパ
ク質の構造変化を誘導し、ｒα２Ｉのエコウィルス−１への結合アフィニティー
を増加させることを示した。

【００７１】 これは、ＲＫＫの結合がコラーゲンへの結合をアロステリックに阻害し得るＩ
ドメイン上の可能性ある活性調節部位を示唆する。ｒα２Ｉドメインのコンホメ
ーションにおけるＲＫＫ誘導性変化は、ＲＫＫペプチドがコラーゲンへのｒα２
Ｉドメイン付着をブロックするばかりでなくエコウィルス−１へのｒα２Ｉドメ
イン結合も著しく増加させた我々の実験において明白になった。エコウィルス−
１及びコラーゲンがα２Ｉドメインの明確な部位を認識するという上述の示唆を
確認することに加えて、データは、別の結合部位（ＲＫＫ結合部位）の占有によ
る１つのリガンド認識部位（エコウィルス−１結合部位）の重要な制御メカニズ
ムの存在を示す。しかしながら、α２Ｉドメイン構造−機能の関係についての存
在する情報は、ＲＫＫがコラーゲン認識部位に直接、結合するか否か又はそれが
α２Ｉドメイン−コラーゲン相互作用のアロステリックインヒビターであるか否
かを結論づけるために十分ではない。両方の場合、ＲＫＫ含有ペプチドはインテ
グリンＩドメインのリガンド認識機能を示すことを目的とする研究のための極め
て価値あるツールである。

【００７２】 実施例５ ３つのアミノ酸：ＲＫＫの配列はインテグリンｒα２Ｉドメインへの結合のた
めに本質的である。 種々のタンパク質中のインテグリン認識部位についての以前に公開された情報
は、２つのアミノ酸残基、即ちアスパラギン酸及びアルギニンの重要性を強調す
る。２２９ｏｘペプチド内の重要なアミノ酸残基を示すために、一連の新規アミ
ノ酸についてｐ２２９内のアミノ酸をアラニン残基で１つづつ置換するテストを
行った。ペプチドを固相に結合させてそれらがｒα２Ｉに結合する能力について
テストした。興味あることに、３つのアミノ酸アルギニン−リシン−リシン（Ｒ
ＫＫ）が本質的であることが見い出され、隣接したヒスチジンはいくらかの効果
を示した。アスパラギン酸又はアスパラギン残基の置換は効果を有さなかった（
図６Ａ）。これと一致して、Ｉ型コラーゲンへのｒα２Ｉ結合は、ＲＫＫ配列の
アラニン置換を含むペプチドでほとんど阻害されず、アスパラギン酸又はアスパ
ラギン残基の置換はこの機能を損なわせなかった（図６Ｂ）。

【００７３】 ２２９ｏｘペプチドのためのα２Ｉ内の可能性ある結合部位を同定するために
、α２Ｉドメイン中の親水性領域に対応する一連のペプチドを合成し、それらが
ビオチニル化２２９ｏｘに結合する能力についてテストした。α２Ｉドメインペ
プチド及びｒα２Ｉを固相に結合させてビオチニル化２２９ｏｘを加えた。２２
９ｏｘはｒα２Ｉ及びペプチドＰ９に強く結合することが示されたが、反復実験
において、他のペプチドへの結合はなかった（図７Ａ）。ビオチニル化２２９ｏ
ｘと固相に結合したｒα２Ｉとの間の相互作用は、ユーロピウム標識化ｒα２Ｉ
の、固相に結合したＩ型コラーゲン及び２２９ｏｘペプチドへの結合（図７Ｃ）
と同様、二価カチオンに依存した（図７Ｂ）。

【００７４】 実施例６ ＲＫＫ−ペプチドの臨界的長さ ＲＫＫ−ペプチドの臨界的長さを決定するために、ＲＫＫ配列、並びに更なる
次のアミノ酸を含む一セットのペプチドを調製した。ＣＴＲＫＫＨＤＮＡＱＣ（
２２９ｏｘ；配列番号：５）、ＣＴＲＫＫＨＤＮＡＣ（配列番号：３４）及びＣ
ＴＲＫＫＨＤＮＣ（２４８ｏｘ；配列番号：４）をテストした。最も短いペプチ
ドは１０μＭの濃度でコラーゲンへのｒ−α２Ｉドメイン結合の最大阻害を示し
た。これはより長い２２９ｏｘより１０倍有効であった（図８）。

【００７５】 実施例７ 細胞マイグレーションアッセイ マイグレーションアッセイは、コラーゲン様マトリックス内での細胞の動きを
擬態する。この例は、本ペプチドがこのような細胞の動きをブロックし、それゆ
えこのような細胞マイグレーションを特徴とする病気を治療するための治療法に
おいて役立つことを示す。

【００７６】 ２２９ｏｘ／ＲＫＫ−ペプチド及び２２５ｏｘの、細胞−コラーゲン相互作用
への効果を示すために、化学的に形質転換したＨＯＳ−ＭＮＮＧ細胞をＩ型コラ
ーゲンに付着させ、次にそれ上を移動させた。この過程におけるα２β１インテ
グリンの重要性は以前に示されている（Vihinen, Pら、 Cell Growth Diff, 7 :
439〜447 (1996)) 。

【００７７】 細胞マイグレーションアッセイを、上述の通り行った (Vihinen, Pら、 Cell
Growth Diff. 7 : 439〜447 (1996)) 。特に、ヒトＨＯＳ−ＭＮＮＧ骨肉腫細胞
（ＡＴＣＣ）を無血清Ｏｐｔｉｍｅｎ １培地（Life Technologies, Inc) 中に
懸濁し、２０，０００〜３０，０００細胞／ウェルを２．８０mmの直径を有する
金属シリンダー内の２４ウェル細胞培養クラスター（Ｃｏｓｔａｒ）に移した。
その細胞培養ウェルを５μｇ／cm² のＩ型コラーゲンでコートした。その細胞を
＋３７℃で１６時間、コラーゲンに結合させた。そのシリンダーを除去し、非付
着細胞をＯｐｔｉｍｅｎ (Life Technologies, Inc) で洗い落として、その付着
細胞を４日間、ペプチドの存在下でＯｐｔｉｍｅｎ中で移動させた。ペプチドを
含む新しいＯｐｔｉｍｅｎをウェルに毎日、交換した。４日後に、細胞によりカ
バーされた表面領域をMicrocomputer Imaging Deviceversion M4 (Imaging Rese
arch Inc) で測定した。

【００７８】 この実験の結果を図９に示す。２２９ｏｘ又は２２５ｏｘのいずれかのペプチ
ドを５００μＭの濃度で細胞に加え、新しいペプチドを毎日加えた。ＨＯＳ−Ｍ
ＮＮＧ細胞がＩ型コラーゲン上を移動する能力は、２２５ｏｘ対照ペプチドによ
って影響を受けなかったが、２２９ｏｘペプチドはマイグレーションを大きく（
ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定）阻害した（図９）。

【００７９】 コラーゲン上での骨肉腫細胞マイグレーションのこの阻害は、（ｉ）悪性細胞
の動き、及びそれゆえ癌細胞侵入はｐ２２９ｏｘにより防止することができるこ
と、並びに（ii) 少くとも部分的にα２β１インテグリン−コラーゲン相互作用
の結果としてマイグレーションがおこる場合に、いずれの細胞型のマイグレーシ
ョンも阻害することができることを示唆する。

【００８０】 実施例８ ＲＫＫペプチドによる細胞接着の阻害 ヒトケラチノサイトＨａＣａＴ細胞及び細胞系ＵＴ−ＳＣＣ−２の細胞接着を
、ペプチド２２０ｏｘ又はα２インテグリンＧｉ９に対する機能的抗体（Immuno
tech/Coulter, Westrbrook, Maine, USAから市販される抗α２−インテグリン抗
体）の存在下でＩ型コラーゲンに対して口の扁平上皮細胞から確立した。細胞を
１時間、無血清培地中１０μｇ／mlのシクロヘキシイミドで処理した。それを引
き離して、Ｉ型コラーゲンを予めコートしたマイクロタイタープレートに、０．
１％グリシンを含むＤＭＥＭ中に１時間、接着させた。非接着細胞を洗い落とし
、接着細胞をクリスタル・バイオレットで染色して接着細胞の数を、光学吸光度
を測定することにより評価した。

【００８１】 図１０に要約した結果は、本発明によるペプチド、例えばペプチド２２９ｏｘ
（ｐ２２９ｏｘ）が細胞マイグレーションを阻害し、それゆえ上皮細胞マイグレ
ーションに関連する病状、例えば歯周炎の治療又は予防に役立つことを示す。な
ぜなら上皮細胞はα２β１インテグリンに結合して、コラーゲンに沿って移動す
るためにこの結合を用いるからである。

【００８２】 実施例９ 歯周炎及び歯肉炎の治療におけるＲＫＫペプチドの使用 歯周炎は歯を支える結合組織の炎症及び喪失を特徴とする病気である。その病
気は、組織細胞を活性化して、組織成分を分解する加水分解酵素を生産し、放出
させる病原性の経口細菌により開始される。その病気の過程の本質的な特徴は増
殖の増加及び歯肉に結合する上皮細胞の歯の表面（付着上皮／ポケット上皮）へ
のマイグレーションである。

【００８３】 歯周炎及び歯肉炎の慣用的な処理は、機械的にはぎとることにより又は抗生物
質処理による歯周組織からの病原性細菌の除去に集中している。更に、歯周組織
構造の外科的矯正も頻繁に用いられる。 本発明のペプチド、例えばｐ２２９ｏｘにより供される細胞マイグレーション
阻害は、歯周炎及び歯肉炎を含む歯周病を予防又は治療するための他の処理を伴
って、又は単独で用いることができる。特に、ＲＫＫ配列を含む有効量の１又は
複数の本発明の環状ペプチドを含む組成物は、歯周炎及び歯肉炎を含む歯周病の
ための治療の必要な患者に局所的に投与することができる。これに関して役立つ
組成物は、いずれかの慣用的な技術を用いて、局所的な適用のために調剤するこ
とができる。本発明のペプチドは、担体、例えばポリマー担体、例えばエチルセ
ルロース、シリコーンゴム、特に分解性ポリマー及びコポリマー、例えばポリ（
乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸）−ポリ（グリコール酸）コポリマ
ー、ポリアミド及びポリエステル、ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、及びフ
ィブリノーゲンに基づくものに調剤することができ、要求されるＲＫＫ活性又は
放出特性を与えるために架橋が要求される。経口活性のためのこのようなデリバ
リーシステムは、例えば引用により本明細書に組み込まれるＵＳ５，００２，７
６９、ＵＳ５，０２３，０８２、ＵＳ５，１６０，７３７、ＵＳ５，３３０，７
４６、ＵＳ５，４２５，９５３、ＵＳ５，４３８，０７６及びＵＳ５，６３９，
７９５に記載される。そのペプチドは、インプラント形態で口腔内の要求される
部位に、又は口腔内の適所に凝固する液体組成物の一部として、又は要求される
部位に有効レベルのＲＫＫ含有ペプチドを供する磨歯剤もしくはゲルの形態で供
される。本発明のペプチドの量は、口腔の環境及びデリバリーシステムにおいて
要求される阻害効果を供することにおいて有効なレベルを供するように必要に応
じて種々であるが、一般には、処置する状態の激しさに依存して、凝固前の液体
組成物又は固体組成物の約０．００１％〜９５％で存在し得る。

【００８４】 本発明のペプチドを要求される部位に供するための支持体として膜を用いるこ
ともできる。 本発明によるＲＫＫ含有ペプチドは、上皮細胞マイグレーションを特徴とする
病気の治療及び／又は予防のため、特に局所的適用が好ましい医学的状態の治療
のために役立つ。

【００８５】 本発明はここに十分に記述されているが、それは、その内容及び精神に影響を
与えない小さな改変を伴って行うことができることは当業者に明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｆｉｇ１（Ａ−Ｄ）。固相アッセイにおけるユーロピウム標識化ｒα２Ｉの異
なる基質への結合。マイクロタイタープレートウェルをＩ型コラーゲン、IV型コ
ラーゲン、ラミニン−１、及びフィブロネクチンで予めコートした。ｒα２Ｉを
３時間、付着させた（Ａ）。ｒα２ＩをＥＤＴＡ（Ｂ）又はＭｇＣｌ₂ 及び種々
の濃度のボトロプス・ジャララカ（Bothrops jararaca) 毒液（Ｃ）の存在下で
Ｉ型コラーゲンに結合させた。あるいは、ウェルをボトロプス・ジャララカ毒液
で予めコートし、ＭｇＣｌ₂ の存在下で３時間、結合させた（Ｄ）。

【図２】 Ｆｉｇ２（Ａ−Ｂ）。固相アッセイにおける接着タンパク質及びジャララギン
由来ペプチドへのユーロピウム標識化ｒα２Ｉの結合。マイクロタイタープレー
トウェルを種々のペプチド、Ｉ型コラーゲン、IV型コラーゲン及びフィブロネク
チンで予めコートした。データは、異なる基層へのｒα２Ｉ結合を示す３つの平
行実験からの平均を示す（Ａ）。マイクロタイタープレートウェルをＢＳＡ及び
Ｉ型コラーゲンでプレコートし、ｒα２Ｉをペプチドの存在下で３時間、結合さ
せた（Ｂ）。

【図３】 Ｆｉｇ３。２２９ｏｘペプチドの存在下でのペプチド及びボトロプス・ジャラ
ラカ毒液への結合。マイクロタイタープレートウェルをペプチド又はボトロプス
・ジャララカ毒液でプレコートした。ｒα２Ｉドメインを２２９ｏｘペプチドの
存在又は欠如下で結合させた。データは、３つの平行実験からの平均を示す。

【図４】 Ｆｉｇ４（Ａ−Ｃ）。２２９ｏｘペプチドの特性。環状又は直鎖２２９ペプチ
ドの存在下でのＩ型コラーゲンへのｒα２Ｉ結合の阻害についての投与量応答曲
線（Ａ）。あるいは、マイクロタイタープレートウェルを２２９ｏｘペプチドで
プレコートした（Ｂ）。２２９ｏｘペプチドを種々のプレコートした基層上での
ｒα２Ｉ結合アッセイに加えた。

【図５】 Ｆｉｇ５。Ｉ型コラーゲン及びエコウィルス−１へのｒα２Ｉの結合への２２
９ｏｘの効果。マイクロタイタープレートウェルをＩ型コラーゲン及びエコウィ
ルス−１でプレコートし、ｒα２Ｉをペプチドの存在又は欠如下で結合させた。
データは、３つの平行実験からの平均を示す。

【図６】 Ｆｉｇ６（Ａ−Ｂ）。アラニン置換化２２９ｏｘペプチドによるＩ型コラーゲ
ンへのｒα２Ｉの結合の阻害。ペプチドをマイクロタイタープレートウェルにプ
レコートしてｒα２Ｉを結合させた（Ａ）。あるいは、マイクロタイタープレー
トウェルをＩ型コラーゲンでプレコートし、ｒα２Ｉをペプチドの存在下で添加
した（Ｂ）。

【図７】 Ｆｉｇ７（Ａ−Ｃ）。α２Ｉドメインペプチド（Ａ）及びｒα２Ｉ（Ａ，Ｂ）
を固相に結合させてビオチニル化２２９ｏｘを加えた。２２９ｏｘペプチドのα
２Ｉドメイン由来ペプチドへの結合を（Ａ）に示す。固相に結合したｒα２Ｉへ
の２２９ｏｘ結合のためのＭｇ²⁺の重要性を（Ｂ）に示す。固相に結合したＩ型
コラーゲン及び２２９ｏｘペプチドへのｒα２Ｉの結合のためのＭｇ²⁺の重要性
を（Ｃ）に示す。

【図８】 Ｆｉｇ８。コラーゲンへの組換えα２Ｉの結合の阻害。中塗り円は、示される
濃度の２２９ｏｘ（ＣＴＲＫＫＨＤＮＡＱＣ；配列番号：５）の効果を示す。白
ぬき円は、２４８ｏｘ（ＣＴＲＫＫＨＤＮＣ；配列番号：４）の効果を示す。

【図９】 Ｆｉｇ９（Ａ−Ｂ）。Ｉ型コラーゲン上でのＨＯＳ−ＭＮＮＧのマイグレーシ
ョン。細胞を基層に結合させた。４日後に、細胞を染色し、細胞により覆われた
表面領域を、イメージアナライザーにより測定し（Ａ）、ウェルを写真にとった
（Ｂ）。

【図１０】 Ｆｉｇ１０。２２９ｏｘ及びα２インテグリンに対するＧｉ９抗体の存在下で
のＨａＣａＴ及びＵＴ−ＳＣＣ−２細胞の細胞接着。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年１２月２７日（２０００．１２．２７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００８５】 本発明はここに十分に記述されているが、それは、その内容及び精神に影響を
与えない小さな改変を伴って行うことができることは当業者に明らかであろう。

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【訂正理由１】 国際出願日における明細書に添付の配列表についての翻訳文が欠落したので、
これを追加した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 カピラ，ヤルモ フィンランド国，エフイーエン−20540 トゥルク，メンニンカイセンカトゥ 10 デ 25

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アミノ酸配列：ＲＫＫを含む環状インテグリン結合ペプチド
   。
2. 【請求項２】 アミノ酸配列：ＲＫＫＨ（配列番号：８）を含む請求項１に
   記載のペプチド。
3. 【請求項３】 アミノ酸配列：Ｘ₁ ＲＫＫＨＸ₂ Ｘ_n （式中、Ｘはいずれか
   のアミノ酸でありｎは１〜４である）を含む環状ペプチド。
4. 【請求項４】 アミノ酸配列：ＣＴＲＫＫＨＤＮＣ（配列番号：４）を含む
   環状ペプチドインテグリン結合ペプチド。
5. 【請求項５】 アミノ酸配列：ＣＴＲＫＫＨＤＮＡＱＣ（配列番号：５）を
   含む環状ペプチドインテグリン結合ペプチド。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか一に記載のインテグリン結合ペプチ
   ドを含む医薬組成物。
7. 【請求項７】 前記組成物が局所的投与のために適することを特徴とする請
   求項６に記載の医薬組成物。
8. 【請求項８】 α２Ｉドメインを含むインテグリンが該α２Ｉドメインを認
   識する分子に結合するのを阻害するための方法であって、該インテグリンを、請
   求項１〜５のいずれかに記載のインテグリン結合ペプチドに露出することを含む
   方法。
9. 【請求項９】 被検体におけるインテグリン依存性細胞マイグレーションを
   阻害するための方法であって、有効量の請求項１〜５のいずれか一に記載のイン
   テグリン結合ペプチドを前記被検体に供することを含む方法。
10. 【請求項１０】 前記細胞マイグレーションが、被検体における癌、心臓血
    管の疾患又は歯周炎に関連することを特徴とする請求項８に記載の方法。
11. 【請求項１１】 治療の必要な被検体においてコラーゲンでの細胞マイグレ
    ーションを阻害するための方法であって、有効量の請求項１〜５のいずれか一に
    記載のペプチドを前記被検体に投与することを含む方法。
12. 【請求項１２】 被検体において血小板のコラーゲンへの付着又はコラーゲ
    ン誘導性の血小板凝集を阻害するための方法であって、有効量の請求項１〜５の
    いずれか一に記載のインテグリン結合ペプチドを前記被検体に供することを含む
    方法。
13. 【請求項１３】 前記付着又は凝集が被検体における心臓血管の疾患に関連
    することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
14. 【請求項１４】 インテグリン結合剤を同定するための結合アッセイであっ
    て、 ｉ）アッセイすべきインテグリン結合剤をビオチニル化し、 ii）該ビオチン化された剤を、固定化された組換えα２Ｉドメイン又はドメイ
    ン由来ペプチドと、結合のために適した条件下で反応させ、 iii ）該結合した剤を有する固体支持体を洗浄し、 iv）標識化したビオチン結合剤を添加し、そして ｖ）いずれかの結合したインテグリン結合剤を検出する ことを含む方法。
15. 【請求項１５】 インテグリン結合剤を同定するための結合アッセイであっ
    て、 ｉ）α２Ｉドメインをユーロピウムで標識化し、 ii）アッセイすべきインテグリン結合剤を、該ユーロピウム標識化α２Ｉドメ
    インと、結合のために適した条件下で混合し、そして iii ）いずれかの結合したインテグリン結合剤を検出する ことを含む方法。