JPH05503097A

JPH05503097A - ４型コラーゲン細胞接着、伸展および運動活性を有するポリペプチド

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Publication number: JPH05503097A
Application number: JP3502713A
Authority: JP
Inventors: シェルバーグ，メアリー　ケー．; ツィリバリー，フォティニ―エフィー　シー．; マッカーシー，ジェイムズ　ビー．
Original assignee: リージェンツオブザユニバーシティオブミネソタ
Priority date: 1989-12-14
Filing date: 1990-12-06
Publication date: 1993-05-27
Anticipated expiration: 2014-03-17
Also published as: JP2872401B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■型コラーゲン細胞接着、伸展および運動活性を有するポリペプチド政府の援助本発明は、Ｕ、Ｓ、インスティテユーツ・オン・ヘルス（Ｕ、Ｓ、　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）により契約番号ＣＡ　４３９２４および３９２１６のもとて政府の援助によって行われた。

発明の背景 ■型コラーゲンは、はとんどもっばら基底膜中に存在する特有の糖タンパク質であり、その構造は血管内皮細胞、上皮細胞等を含む多数の細胞種の基底表面中に見つかる。■型コラーゲンは基底膜の主成分である。それは間質のコラーゲンとは異なる。Ｎｅｗ　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂａｓｅｍｅｎｔ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

Ｋ、　Ｋｕｅｈｎら編、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ、　５７−６７頁（１９８２）を参照のこと。■型コラーゲンは約５００．０００の分子量（ＭＷ）を育し、そして３つのポリペプチド鎖、即ち２本のα１　（ＭＷ　１８５．０００）鎖と１本のα２　（ＭＷ　１７０．０００）鎖から成る。■型コラーゲンは２つの主要タンパク質分解領域、即ち大きい球状の非コラーゲン性ＮＣＩ領域ともう１つの主要三重らせんコラーゲン性領域を有する。後者の領域は、多様な長さの非コラーゲン性配列により中断される。■型コラーゲン分子の概略図を図１に示す。

それは複雑で且つ多領域のタンパク質であり、異なる領域中には異なる生物活性が存する。

■型コラーゲンは基底膜の支持骨格を構成する高分子構造に自己集合する。種々の他の巨大分子成分、例えば、ラミニン、エンタクチン／ニドゲンおよびヘパリン硫酸プロテオグリカンが■型コラーゲンに結合する。■型コラーゲンの追加の機能は細胞結合を媒介することである。様々な細胞種が■型コラーゲン被覆基板上に接着しそして伸展する。Ｊ、　Ｃ。

Ｍｕｒｒａｙら、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、８０．　１９７−２０２　（１９７９）　：Ｍ、　Ａｕｍａｉｌｌｅｙら、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、１０３．　１５６９−１５７６　（１９８６）　：Ｔ、Ｊ、　Ｈｅｒｂｓｔら、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　１０６．１３６５−１３７３　（１９８８）を参照のこと。種々の細胞表面タンパク質、例えば４７ｋＤタンパク質ＣＭ、　Ｋｕｒｋｉｎｅｎ　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５９．５９１５−５９２２（１９８４））　、７０ｋＤタンパク質（Ｓ、Ｐ、　Ｓｕｇｒｕｅ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。

（１９８７））が■型コラーゲンへの細胞結合を媒介することが報告されている。

■型コラーゲンの機能の多様性は、この糖タンパク質か多数の別個で且つ臨床的に関連した過程、例えば傷の治癒における細胞接着および移動、腫瘍細胞の侵入および転移、糖尿病性微小血管障害、高血圧および幾つかの腎臓病、例えば糖尿病性腎障害および多様な病因のネフローゼ症候群による血管の肥大において重要であることを示唆する。例えば、それぞれ肺胞炎および腎炎による喀血および血尿により特徴づけられる病気であるグツドパスチャー症候群では、全てのグツドパスチャー症候群の患者の血清中に■型コラーゲンの主要非コラーゲン性ＮＣＩ領域に対する抗体が見つかる。別の遺伝性腎臓病であるアルポート家族性腎炎は、明らかに■型コラーゲンのＮＣＩ領域の遺伝的欠損によるものである。加えて、真性糖尿病では、完全な■型コラーゲン並びに三重らせん豊富領域が血漿中および基底膜のすぐ近く、即ち細胞外基質中に存在するグルコースの量の増加により化学的に修飾されており、そして機能的に傷つけられている。

分子レベルでのそれらの過程の病態生理学をより詳しく解明するためには、■型コラーゲンの上述の生物学的活性の少なくとも幾つかの原因を■盟コラーゲンの特定のタンパク質分解領域（すなわちＮＣ１，三重らせん豊富領域）またはオリゴペプチドに関係づけることを試みる必要かある。これが達成できれば、重要な医薬組成物用の基剤を提供することができる小さいペプチドを合成することができるであろう。

発明の詳細な説明本発明は、主要三重らせん領域の連続コラーゲン性領域に由来するヒト■型コラーゲンのαｌ鎖の断片を表すポリペプチド（以後“［■−旧”と称する）を提供する。このポリペプチドは通常の固相合成により調製することかできる。該ポリペプチドの式は、ｇ　Ｉ　ｙ−ｖａ　ｌ　ｌｙｓ−ｇ　１ｙ−ａｓ　ｐ−１ｙｓ−ｇ　ｌｙ−ａｓｎ−ｐｒｏ−ｇ　ｌｙ−ｔ　ｒｐ−ｐｒｏ−ｇ　１ｙ−ａｌａ−ｐｒ。

である。ポリペプチドＩＶ−Ｈ１は、正式には■型コラーゲンのαｌ鎖の主要三重らせん領域から単離された■型コラーゲン残基１２６３−１２７７を表す。このポリペプチドについての一文字アミノ酸記号はＧＶＫＧＤＫＧＮＰＧＷＰＧＡＰである。

この合成ポリペプチドを生物学的活性についてアッセイすると、多数の細胞種の接着と伸展を促進することがわかり、黒色腫細胞運動の有力な誘引剤であった。

その上、ペプチドＩＶ−旧はそれの細胞結合特性において高度に特異的である。

例えば、該ペプチドは神経細胞の結合を促進するが、内皮細胞の結合は促進しない。従って、ポリペプチド［Ｖ−旧は（ａｌ培養基板への細胞の接着を促進し、そして（ｂ）腫瘍細胞の転移および侵入を阻害するのに有用であると考えられる。成る細胞種はペプチドＩＶ−Ｈ１に応答する細胞特異的結合性質を有することが証明されているかまたは予想されているので、神経再生および診断用途における援助といったこのペプチドの他の用途が予想される。更に、試験管内または生体内でのペプチドＩＶ−Ｈ１の消化／加水分解が実質的に等価の生物活性を有する幾つかの断片を生成するであろうことも予想される。そのような低分子量ペプチドも本発明の範囲内であると見なされる。

図面の簡単な説明図１は■型コラーゲンの図示であり、各々主要非コラーゲン性ＮＣＩ領域およびｇｌｙ−ｘ−ｙ三重らせんモチーフの中断を含む三重へリックス豊富領域を有するα１（■）およびα２（ＩＶ）鎖の構造を示す。

図２は、ヒトおよびマウスの■型コラーゲンのα１鎖の一次アミノ酸配列の比較を示す。

図３ａは、Ｉｍｍｕｌｏｎ　Ｉウェル上にコーティングされたペプチド［Ｖ−Ｈｌ　（０）並びに対照ペプチド１５（■）、１７（・）および１８　（ロ）の濃度に関する黒色腫細胞接着率を示すグラフである。

図３ｂは、Ｉｍｍｕｌｏｎ　Ｉウェル上にコーティングされたペプチドＩＶ−Ｈ１（○）並びに対照ペプチド１５（■）、１７（・）および１８（ロ）の濃度に関する黒色腫細胞伸展率を示すグラフである。

図４ａは、ポリカーボネートフィルター上にコーティングされたペプチドｒＶ− Ｈ１（○）およびＢＳＡ　（・）に応答した黒色腫細胞の平均細胞運動度を示すグラフである。

図４ｂは、■型コラーゲンが満たされているＢｏｙｄｅｎチャンバーの下側ウェルに応答して前記チャンバー中に取り付けられたポリカーボネートフィルターを横切って移動した黒色腫細胞の数を示すグラフである。

図５ａは、過剰の可溶性ペプチドｔＶ−Ｈ１の濃度ごとのペプチドＩ■−旧　（ ○）、Ｉ型コラーゲン（ロ）および■型コラーゲン（■）がコーティングされたＩｍｍｕｌｏｎ　Ｉウェル、並びに過剰の可溶性ペプチド１７の濃度ごとの■型コラーゲンがコーティングされたＩｍｍｕｌｏｎ　Ｉウェル（・）への黒色腫細胞の接着の相対的阻害を示すグラフである。

図５ｂは、過剰の可溶性ペプチドＩＶ−Ｈ１の濃度ごとのペプチド］Ｖ−旧　（ ○）、Ｉ型コラーゲン（ロ）および■型コラーゲン（■）がコーティングされたＩｍｍｕｌｏｎ　Ｉウェル、並びに過剰の可溶性対照ペプチド１７の濃度ごとの ■型コラーゲンかコーティングされたＩｍｍｕｌｏｎ　Ｉウェル（・）への黒色腫細胞の接着の相対的阻害を示すグラフである。

図５０は、過剰の可溶性ペプチドＩＶ−Ｈ１に応答して■壓（■）および■型（ロ）コラーゲンがコーティングされたポリカーボネートフィルター、並びに過剰の可溶性対照ペプチド１７に応答して■型コラーゲンがコーティングされたフィルター（△）を通過する黒色腫細胞運動の阻害を示すグラフである。

図６ａは、抗−ＩＶ−ＨＩ　ＩｇＧの濃度ごとのペプチドＩＶ−旧（○）、Ｉ型コラーゲン（ロ）または■型コラーゲン（■）がコーティングされたＩｍｍｕｌｏｎ　［ウェル、並びに正常ウサギＩｇＧの濃度ごとの■型コラーゲンがコーティングされたＩｍｍｕｌｏｎ　［ウェル（ム）上への黒色腫細胞の接着の相対的阻害を示すグラフである。

図６ｂは、抗−ＩＶ−ＨＩ　ＩｇＧの濃度ごとのペプチド［Ｖ−Ｈｌ（○）、Ｉ型コラーゲン（ロ）または■型コラーゲン（■）がコーティングされたＩｍｍｕｌｏｎ　Ｉウェル、並びに正常ウサギＩｇＧの濃度に対する■型コラーゲンがコーティングされた［ｍｍｕｌｏｎ　Ｉウェル（ム）上への黒色腫細胞の伸展の相対的阻害を示すグラフである。

図６０は、抗−ＩＶ−旧１ｇＧに応答するＩ型コラーゲン（ロ）および■型コラーゲン（■）がコーティングされたポリカーボネートフィルター、並びに正常ウサギＩｇＧに応答する■型コラーゲンがコーティングされたポリカーボネートフィルター（ム）を通る黒色腫細胞運動の相対的阻害を示すグラフである。

図７は、様々な濃度のペプチドゴＶ−旧がコーティングされたＩｍｍｕｌｏｎ　Ｉウェルへのニワトリニューロンの接着率、およびペプチドＩＶ−Ｈの濃度ごとの延長された神経突起を有する接着ニューロンの比率を示すグラフである。

１４７、　２１７−２２４　（１９８５）　；　Ｔ、　Ｐｉｈｌａｊａｎｉｅｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

２６０、７６８１−７６８７　（１９８５）　；　Ｕ、　Ｓｃｈｗａｒｚ−Ｍａｇｄｏｌｅｎ　ら、Ｆｅｂｓ。

コラーゲン分子あたりのアミノ酸の総数は約４．５５０であり、各生±（ＩＶ）鎖は１．３９０アミノ酸を含む。

米国特許第４．８７６、３３２号は、大動脈内皮細胞および転移性癌細胞を含む多数の細胞種の接着を促進する、■型コラーゲンのａｌ（■）鎖のＮＣＩ領域からの３つのペプチド（“ＴＳ−１゜ＴＳ−２およびＴＳ−３”と称する）を記載している。それらのペプチドのうちの２つ（ＴＳ−２およびＴＳ−３）はヘパリンにも結合する。

本明細書に記載のペプチドＩＶ−Ｈ１は、■型コラーゲンのペプシン生成主要三重らせん断片から誘導される。ペプチドＩＶ−Ｈ１は細胞接着と伸展を促進し、そしてＭ４黒色腫細胞運動の有力な誘引剤である。しかしながら、ペプチドＩＶ −Ｈ１はヘパリンを結合しない。Ｇ、Ｆ、　Ｋｏｌｉａｋｏｓら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。

２６４、２３１３−２３２３　（１９８９）を参照のこと。重要なことには、ペプチドＩＶ−Ｈ１が黒色腫および神経細胞のような成る特定の細胞種のみの接着を促進し、内皮細胞または繊維肉腫細胞の接着を促進しないことが発見された。

ペプチドの合成本発明のポリペプチドはＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相合成法を使って合成した。

これはペプチド合成に最もよく使われる方法であり、Ｊ、Ｍ、　ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ、Ｄ、　Ｙｏｕｎｇにより５ｏｌｉｄ　ＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ出版、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　［Ｌ　（第２版、　１９８４）中に広範に記載されている。

その開示は参考として本明細書中に組み込まれる。

Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄのペプチド合成系はベンジルクロリド基で官能化された１％架橋ポリスチレン樹脂を使用する。保護アミノ酸の塩と反応させると、該ハロゲンはエステルを形成し、保護アミノ酸を樹脂に共有結合させるだろう。アミノ酸の遊離アミノ基を保護するのにベンジルオキシカルボニル（ＢＯＣ）基を使用する。この保護基はジクロロメタン（ＤＣＭ）中の２５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によって除去される。新たに暴露されたアミノ基をＤＣＭ中の１０％トリエチルアミン（ＴＥＡ）により遊離塩基に変換する。次いで、ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を使って、次のＢＯＣ−保護アミノ酸を前のアミノ酸のアミノ基に結合させる。合成中、アミノ酸の側鎖官能基をＴＦＡに安定なベンジル誘導体により保護する。それらの反復反応は全て自動化することができ、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　９９０ペプチド合成装置を使ってミネソタ大学ミクロ化学施設において本発明のペプチドを合成した。

樹脂上での保護ポリペプチドの合成後、ポリペプチド樹脂を無水フッ化水素酸（ＨＦ）で処理し、樹脂とのベンジルエステル結合を開裂せしめ、それによって遊離ポリペプチドを遊離させる。ＨＦ処理によってベンジル誘導化側鎖保護基も除去される。次いで１．０Ｍ酢酸を使ってポリペプチドを樹脂から抽出した後、抽出物を凍結乾燥する。凍結乾燥された粗ポリペプチドをＣ−１８逆相カラム上での分取用高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技術により精製する。本件に使用したような典型的な溶出勾配は、Ｏχ〜６０％アセトニトリル−〇、１％ＴＦＡ／）１．０である。溶出液の吸光度を２２０　ｎｍでモニタリングし、画分を収集し、凍結乾燥する。

精製したポリペプチドの特徴づけはアミノ酸分析によって行う。まず、システィンまたはトリプトファンが存在する時には、ポリペプチドを６Ｍ　ＨＣｌ中で１１０°Ｃで２４時間（一定の煮沸）または４Ｎメタンスルホン酸中で嫌気的に加水分解する。

加水分解されたアミノ酸を、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　６３００アミノ酸分析機器を使って、Ｂｅｃｋｍａｎにより供給されたクエン酸緩衝液を用いて、イオン交換クロマトグラフィーにより分離する。

定量は４４０　ｎｍと５７０　ｎｍにおける吸光度および標準曲線との比較によって行う。配列決定により更にポリペプチドを特徴づけることができる。このアプローチは、アミノ酸組成データが本質的に殆ど有益でない長いポリペプチドに対して特に有用である。配列決定は、Ｒ，Ｍ、　Ｈｅｗｉｃｋら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。

２５６、７９９０　（１９８１）の方法論により、Ｍｏｄｅｌ　４７０Ａ気相シークエネーター（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、）上での自動化されたアミノ末端からの連続エドマン分解によって行う。

ヒト■型コラーゲンの主要三重らせん領域の配列から本発明（７）ヘ−７’チトＩＶ−Ｈｌ　（ＧＶＫＧＤＫＧＮＰＧＷＰＧＡＰ）を合成した。更なる対照として、別の■型コラーゲン由来のペプチドを主要三重らせん領域から合成し、研究した。ペプチドの放射性ヨウ素化を可能にするためにカルボキシ末端にチロシル残基を有する幾つかのそれらのペプチドを合成した。

ペプチド１５　ＧＰＫＧＥＰＧＫＩＶＰＬＰＧ（Ｙ）　６３４−６４７ベプｆ　）”１６　ＧＬＰＧＫＰＧＳＮＤＫＶＤＭＧＳＭＫＧ（Ｙ）　９３０−９４８ペプチド１７　ＧＶＰＧＫＤＧＱＡＧＱＰＧＱＰ（Ｙ）　９７５−９８９ペプチド１８　ＧＥＫＧＤＫＧＬＰＧＬＤ（Ｙ）　１１１５−１１２６高度に転移性のマウス黒色腫細胞に−１７３５−Ｍ４は、当初テキサス州ヒユーストンのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｅｘａｓ　Ｈｅａｌｔｈ　５ｃｉｅｎｃｅｓＣｅｎｔｅｒのＡｎｄｅｒｓｏｎ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌの１．Ｊ、　Ｆｊｄｌｅｒ博士により供給された。該細胞を受け取った時、多数の初期継代細胞を増殖し、そして液体窒素中で凍結させた。腫瘍細胞を通常６週間より短期間試験管内培養し、試験管内継代数を８に制限する。

次いて細胞を捨て、更なる試験管内および生体内実験において使用するため新しい細胞を貯蔵物から取り出す。そのような用心は、連続試験管内継代の結果として起こりつる表現型転換を最小にするために取る。ｌＯ％熱不熱性活性化ウシ胎児血清むダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥ）中で細胞を培養した。５％Ｃ０２を含む湿潤大気中で３７°Ｃの恒温槽中で培養物を増殖させた。ＭｃＣａｒｔｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２７．　１３８０−１３８８（１９８８）により記載されたように０．０５％トリプシンと１　ｍＭＥＤＴＡを使ってフラスコから穏やかに細胞を取り出すことにより、細胞を一週間に２回継代培養した。

ペプチドｌ■−旧を特徴づけるために、該ペプチドと他の細胞系との相互作用を調べた。それらの細胞系としては、ビタミンとｌＯ％ＦＢＳが添加されたＭＥＭ中に維持された高度に転移性のヒト黒色腫細胞系Ａ３７５Ｍ　（これもＦｉｄｌｅｒにより提供）。

および、ｌＯ％ＦＢＳを有するＤＭＥ中に維持された繊維肉腫細胞系ＵＶ２２３７　ＭＭが挙げられる。研究した他の細胞系としては、ＤＭＥ＋１０％Ｃ３中に維持されたＣ６ラツト神経膠腫細胞系（ＡＴＣＣ。

＃ＣＣＬ１０７）　；　１０％ＦＢＳを含むＤＭＥとＨＡＭ　Ｆ１２の１：１溶液中に維持された５ＣＣ９ヒト扁平上皮癌細胞系（ＡＴＣＣ，＃ＣＲＬ１６２９）　；５ａｌｋ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅのＤａｖｉｄ　５ｃｈｕｂｅｒｔから得られ、そして補足物を含むＦ１２Ｈ培地中に維持されたＢ６５およびＢ１０４マウス神経芽より記載されたように単離され維持されたウシ大動脈内皮細胞系か挙げられる。その開示は参考として本明細書に組み込Ｋｌｅｉｎｍａｎら、　１ｏｃｈｅｎ＋１ｓｔｒｙ、　２１．６１８８−６１９３　（１９８２）の方法の変形に従って、ラチリスムマウス中で増殖させたＥｎｇｌｅｂｒｅｔｈＨｏｌｍ　Ｓｗａｒｍ肉腫から■型コラーゲンを抽出した。ＤＥＡＥアニオン交換クロマトグラフィーにより精製した■型コラーゲンを１１０．０００　Ｘｇで９０分間の超遠心にかけ、５０Ｓより大きい透明凝集物を得た。上滑をデカンテーションにより捨て、必要になるまで２ｍＭジチオトレイトールを含む２Ｍグアニジン中で４ ℃にて貯蔵した。Ｗａｄｄｅｌｌ、　Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、、　４８．３１１−３１４　（１９５６）により記載されたようにして■型コラーゲンの濃度を分光光度的に決定した。Ｉ型コラーゲン（ビトロゲン）は、ＣｏｌＣｏ１１ａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡから入手した。

ペプチドのヨウ素化およびＩｍｍｕｌｏｎ　ｌプレート上への結合効率の測定ＮａＩ　２５１でのペプチドの標識はＭｃＣａｎａｈｅｙおよびＤｉｘｏｎ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　７０．２１０−２１３　（１９８０）により記載された通りに行った。簡単に言えば、Ｎａ）ＩＰＯ，緩衝液（ｐＨ７，２）中の０．１■の各ペプチドを０．０５■のクロラミンＴと０．５ｍＣ１のＮａ＋２５１（ＮＥＮ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　ＤｕＰｏｎｔ　Ｃｏ、、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）と共に２分間インキュベートした。０．２■のＮａ２Ｓ２Ｏ５の添加により反応を停止させた。５ｅｐ−Ｐａｋ　Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｌｌｉ−ｐｏｒｅ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）を使った逆相クロマトグラフィーにより遊離のヨウ素を除去し、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル（５０％）を使ってカラムから放射能標識ペプチドを溶出させた。標識ペプチドを凍結乾燥し、使用するまで一８０°Ｃで保存した。Ｖｏｌｌｅｒの炭酸緩衝液で１〜１０μｇ／−の範囲の濃度に希釈されている放射能標識ペプチドの１００μ！アリコートを乾固することにより、９６ウエルのポリスチレン製［ｍｍｕｌｏｎ　１プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ−、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ。

ＶＡ）のウェルに結合するペプチドの効率を測定した。接着および伸展アッセイにおける該ペプチドの結合条件を模擬するために、該ウェルを洗浄し、そしてＶｏｌｌｅｒの炭酸緩衝液中の１０■／ｒｒＬｌのＢＳＡ溶液１５０μｌ／ウェルと共に２時間インキュベートした。次いでウェルを洗浄し、１％ＳＤＳを含む０．５ＮＮａＯＨ１５０μｍ２／ウエルを使ってペプチドを可溶化することにより、表面に結合したペプチドの量を定量した。Ｔｍ　Ａｎａｌｙｔｉｃγカウンター１１９３型中で結合した放射能の量を定量した。

下記の詳細な実施例への参照により本発明を更に記載する。

実施例１ペプチドｆＶ−Ｈ１に関する黒色腫細胞接着および伸展上記のように多数のヒトＩＶＷコラーゲンの主要三重らせん領域由来のペプチドを合成した。ペプチドＩＶ−旧を含むそれらのペプチドを、Ｋ　１７３５　Ｍ４黒色腫細胞の接着および伸展を促進する能力について次のようにスクリーニングした。

Ｍ４黒色腫細胞の半集密的培養物を２μＣ１／ｍｌの３Ｈ−チミジンで一晩放射能標識した。接着アッセイの前に、ハンクス培地中の１０ｍＭ　ＥＤＴＡを使って、あるいは細胞接着かＥＤＴＡ処理後に保持されるであろう内因性細胞表面タンパク質を必要としないことを確証するためにトリプシン溶液（０，０５％トリプシン、　０．０２％ＥＤＴＡ）中で、細胞を培養フラスコから取り出した。次いで黒色腫細胞を洗浄し、２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓとｌｏｍｇ／ｍ１ＢＳＡが補足されたＤＭＥ中に３〜４ＸＩＯ’細胞／ｒｒＬＩの最終濃度になるように細胞を再懸濁した。該細胞は、トリバンブルー色素の排除に基づくと、この操作後も生存力を保持した（〉９５％）。

Ｖｏｌｌｅｒの炭酸緩衝液中に様々な濃度（１〜５００μｇ／ｍｊ）に希釈すれている１００μｌ／ウエルのＩＶ−Ｈｌペプチドを乾固することにより、［ｍｍｕｌｏｎ　１　ミクロタイタープレートを調製した。細胞接着（または伸展）の差が表面への示差的結合によるものてはないことを確証するために放射性ヨウ素化ペプチド（上述）を使って、該プレートに結合するＩＶ−）［１ペ−ブチドの能力を測定した。Ｖｏｌｌｅｒの炭酸緩衝液中の１０■／ｒｒＬｌのＢＳＡ溶液を使って３７°Ｃで１時間、プラスチック上の部位への非特異的細胞接着をブロックした。次いでＶｏｌｌｅｒ／　ＢＳＡ溶液を吸引し、各ウェルに１５０μｌの接着培地（２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓと１０■／７１ＬＩＢＳＡを含むＤＭＥ　）中て５〜６　Ｘ１０３Ｍ４黒色腫細胞を添加した。該細胞を３７°Ｃで３０〜４０分間（または成るアッセイについては９０分間まで）インキュベートし、その時点で細胞を伸展について視覚化するか、または接着を測定するために収得した。洗浄して非接着細胞と弱接着細胞を除去した後、１％ＳＤＳを含む０．５Ｎ　ＮａＯＨ１５０μｌ／ウエルを用いて細胞を可溶化することにより接着を定量した。Ｂｅｃｋｍａｎ　ＬＳ　３８０１液体シンチレーションカウンター中で結合放射能を定量した。伸展測定は、少なくとも１００細胞／ウエルを視覚化しそして伸展細胞の比率を計算することにより、２重盲目試験において２人の別人によって行った。各実験を最低３回繰り返し、与えられた実験内において各実験項目を３通り測定した。

ＩＶ−Ｈｌペプチドは、１〜５００μｇ／−のコーティング範囲内て濃度依存形式において黒色腫細胞接着を促進した（図３ａ）。

１０μｇ／ｒＩＬｌのペプチドＩＶ−Ｈ１のコーティング濃度において有意な細胞接着（投入細胞の３５％）が起こり、そしてペプチドＩＶ−Ｈ１の１００μｇ／ｍｌ溶液がコーティングされたウェルにおいて最大の細胞接着（投入細胞の〉５０％）が観察された。また１、黒色腫細胞伸展はペプチドＩＶ−Ｈ１かコーティングされた表面上で濃度依存形式において起こった。ペプチドＩＶ−Ｈ１の１００μｇ／ｍｌコーティング濃度において４０分以内に最大の伸展（投入細胞の約７０％）が観察された（図３ｂ）。

ペプチドＩＶ−旧媒介細胞接着および伸展かに１７３５　Ｍ４黒色腫細胞に特有でないことを保証するために、他の種々の細胞種を、該ペプチドがコーティングされた表面上での接着および伸展についてスクリーニングした。異なる胎芽性起源の細胞および様々な種からの細胞を、ペプチドＩＶ−Ｈ１がコーティングされた表面上に接着しそして伸展する能力について研究した。細胞種は３つの主なグループから成った（表２を参照のこと）：第一は、マウス高転移性に１７３５　Ｍ４黒色腫に加えて、高度に転移性のヒト黒色腫（Ａ３７５　Ｍ）、ラット神経膠腫（Ｃ６）、およびラット神経芽腫細胞（Ｂ１０４）を包含する、ペプチドｒＶ−Ｈ１と■型コラーゲンの両方の上に接着および伸展した細胞；第二は、ウシ大動脈内皮細胞およびヒト扁平上皮癌細胞系ｃｓｃｃ９）を包含する、■型コラーゲン上では接着および伸展するがペプチドＩＶ−■上では接着および伸展しなかった細胞；そして第三は、マウスＵＶ２２３７　ＭＭ繊維肉腫およびラットＢ６５神経芽腫を包含する、■型コラーゲンまたはペプチドＪＶ−Ｈ２のいずれか一方に接着しなかった細胞。どの場合でも、ＢＳＡまたは対照ペプチドがコーティングされた表面上での細胞接着および伸展はく５％であった。

表２細胞種　起源の種　ペプチド［Ｖ−Ｈｌ”　■型コラーゲン％ＡＤ＠　％ＳＰ　％ＡＤ扁平上皮癌　ヒト　１．９　０　３９．６運動における伸展および細胞接着の改善を考慮して、黒色腫細胞の運動を直接促進する能力についてペプチドＩ■−旧を研究した。Ｈｅｒｂｓｔら、前掲により記載された方法の変形により、８μｍのポアサイズのポリビニルピロリドン不含有ポリカーボネートフィルターを備えた４８ウエルの微小走化性チャンバー（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＤ）中でペプチド媒介Ｍ４黒色腫細胞運動を調べた。簡単に言えば、ペプチドをＶｏｌｌｅｒ炭酸緩衝液中で希釈し、そして３通りにおいて５０μ！アリコートを該チャンバーの下側のウェルに添加した。チャンバーにフィルターを決まった場所に取り付け、そして３７°Ｃにて一晩インキユベートし、該ペプチドをフィルターの下面に吸着せしめた。

次いでフィルターを洗浄し、培地（２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓを含むＤＭＥ。

ｐＨ７，４）のみを含む新鮮なチャンバーに移した。次いて上側のウェルにＤＭＥ／Ｈｅｐｅｓ培地中２０．０００／ウエルにおいて細胞を添加し、湿潤ＣＯ２チャンバー中で３７°Ｃにて６時間インキユベートシた。次いてフィルターを洗浄し、固定し、染色し、フィルターを通って移動した細胞の数を、Ｈｅｒｂｓｔら（前掲）に記載されたＯｐｔｏｍａｘ　Ｉｍａｇｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍを使って定量した。各実験を最低３回繰り返した。その結果は、ペプチド［Ｖ−旧が微小走化性チャンバー中での黒色腫細胞運動の濃度依存性増加を促進したことを示す（図４）。２０μｇ／ｍｌはどの低いコーティングレベルにおいて有意なレベルの運動（ＢＳＡ対照レベルの２倍）が観察され、一方フイルターを１００〜２００μｇ／ｒＩＬｌ溶液のペプチドＩＶ−Ｈ１でコーティングした時に最大の細胞運動（ＢＳＡ対照レベルの５倍）が観察された。これは、完全な■型コラーゲン１０μｇ／ｍｌ溶液に応答する１０倍のバックグラウンドレベルの黒色腫細胞運動に匹敵する（図４ｂ）。

■型コラーゲン媒介Ｍ４黒色腫細胞接着、伸展および移動を阻害する過剰の可溶性ペプチド［■−旧の能力を研究した。阻害研究にＩ型コラーゲンを含めることにより、■型コラーゲン中のペプチドＩＶ−旧配列の特異性を決定づけた。追加の対照として、■型コラーゲン由来のペプチド１７をコラーゲン媒介細胞活性を阻害する能力について研究した。ペプチド１７はペプチド［Ｖ−Ｈｌと同様な長さとアミノ酸組成を有するか、黒色腫細胞の接着または伸展を促進しない。トリパンブルー色素の排除により証明されるように、細胞は調べた全てのペプチド濃度の存在下で生存力を保持した。

それらの実験では、細胞接着アッセイにおいて使用するために、前の用量応答実験において最大Ｍ４黒色腫細胞接着の１７２を与えたペプチドＩＶ−Ｈ１、ＩＶ型コラーゲンまたは■型コラーゲンの濃度（ペプチド５０μｇ／ｍｌおよび完全タンパク質５ｕｇ／ｍｌ）を使って、上記実施例１に記載の通りに［ｍｍｕｌｏｎ　１プレートをコーティングした。それらのペプチドを認識する細胞表面結合タンパク質を占有するために、種々の濃度のペプチドの存在下（または非存在下）で３７°Ｃで２０分間細胞をブレインキュベートした。上記実施例１に記載したように伸展および接着を定量した。

上記実施例３に記載したようにＶｏｌｌｅｒ炭酸緩衝液中の■型コラーゲンまたは■型コラーゲンてフィルターの下側をプレコーティングすることにより、ＩＶｕコラーゲン媒介接触走性運動を阻害するペプチドＩＶ−Ｈ１の能力を測定した。コラーゲンコーティング濃度（５μｇ／ｍｌ）は、細胞運動の最大レベルの１／２を与える濃度に基づいて選択した。細胞表面レセプターへの結合を考慮してアッセイ前に増加する濃度のペプチドと共に細胞を２０分間ブレインキュベートすることにより、細胞運動に対する該ペプチドの阻害効果を測定した。次いてタンパク質がコーティングされたフィルターを有するチャンバーの上側ウェルに、ペプチドの連続存在下で細胞を添加した。

接着アッセイにおいて、外因性可溶性ペプチドＩＶ−Ｈ１は、ＩＶ−旧およびＩＶＷコラーゲン媒介黒色腫細胞接着を強力に阻害した（図５ａ）。ペプチドｒＶ −Ｈ１がコーティングされた表面上への黒色腫細胞接着は、２０μｇ／ｍｌの可溶性ペプチド［■−旧の存在下で４０％近く阻害され、そして試験したペプチドＩＶ−Ｈ１の最高濃度（５００μｇ／Ｔｎｌ）では８０％阻害された（図５ａ）。

同様に、■型コラーゲンかコーティングされた表面上への黒色腫細胞接着は、わずか２０μｇ／ｍ１７の可溶性ペプチドＩＶ−Ｈ１の存在下で２０％阻害され、そして調べたペプチドの最高濃度（５００μｇ／ｍ／）では７０％程大きく阻害された。対比して、１型コラーゲンがコーティングされた表面上への黒色腫細胞接着は、可溶性ペプチドＩＶ−Ｈ１の存在により影響されなかった。

その上、■型コラーゲン媒介黒色腫細胞接着に対する対照ペプチド１７の効果は、試験した最高濃度（５００μｇ／ｒｒＬｌ）においてさえも全く観察されなかった（図３ａ）。

ペプチドＩＶ−Ｈ１がコーティングされた表面上での細胞伸展は、２００μｇ／ｍｌの可溶性ペプチドＩｖ−旧の存在下で７０％まで阻害された（図５ｂ）。同様に、■型コラーゲンがコーティングされた表面上での細胞伸展は、１００μｇ／ｖｔｌのペプチドＩＶ−旧の濃度で２０％阻害され、そして調べた最高濃度（２００μｇ／ｒｒ＃）においては細胞伸展のレベルが５０％減少した。対比して、ペプチドＩＶ−Ｈ１での細胞の前処理は、Ｉ型コラーゲンがコーティングされた表面上での細胞伸展の比率に全く影響を与えなかった。対照実験では、余分なペプチド１７（図５ｂ）は■盟コラーゲンまたはペプチドＩＶ−Ｈ１がコーティングされた表面上での細胞伸展に全く影響を与えなかった。

最後に、■壓コラーゲン媒介細胞運動は、用量依存形式においてペプチドＩＶ− Ｈ１により阻害され、５０μｇ／ｍルベルのペプチドｔＶ−旧において８０％の最大阻害を有した（図５ｃ）。

しかしながら、Ｉ型コラーゲンでプレコーティングしたフィルターを通る黒色腫細胞運動は、ペプチドＩＶ−Ｈ１の存在により阻害されなかった。ペプチド１７は■型コラーゲン媒介細胞運動に対して全く効果がなかった。

実施例５ＢａｕｍｉｎｇｅｒおよびＷｉｌｃｈｅｋ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

Ｈ，Ｖａｎ　ＢｕｎａｋｉｓおよびＪ、Ｊ、　Ｌａｎｇｏｎｅ編、　７０．１５１−１５９　（１９８０）により記載された方法に基づいて、カップリング剤としてカルボジイミドを使ってアオガイヘモシアニン（ＫＬＨ：　ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）と接合されたペプチドＩｖ−旧に対してポリクローナル抗体を惹起せしめた。簡単に言えば、等量（重量で）のペプチドとＫＬＨを水に可溶化し、そして水に溶解された１０倍過剰（重量で）の１−エチル−３−（３ −ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）と混合した。ニューシーラント白ウサギを、完全フロインドアジュバント中のウサギ−匹あたり約２■のペプチド／ＫＬＨ接合体を背中へ複数回皮肉注射することにより免疫処置した。その後、不完全フロインドアジュバント中で隔週のブースター注射を筋肉内に与えた。４回目の免疫処置後１４４回目血清を回収し、未接合のペプチド、起源のタンパク質および種々の他のリガンドに対する反応性についてＲＩＡにより試験した。

５０％硫酸アンモニウムの最終濃度における４°Ｃでの一晩の沈澱により正常ウサギ血清から免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を精製し、プールした。再溶解させた沈澱を０．０３５Ｍ　ＮａＣ１，０，０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，８に対して透析し、以前に記載されたように（Ｓｋｕｂｉｔｚら、　１９８７）　ＤＥＡＥカラムクロマトグラフィーによりＩｇＧを精製した。ＩｇＧの純度を５ＤＳ− ＰＡＧＥにより測定した。精製［ｇＧの免疫反応性の保持をＲＩＡにより確認した。

Ｂ、　ＩＶ−旧抗体特異性についてのアッセイ免疫血清および精製抗ペプチド［ ■−旧ＩｇＧを、５ｋｕｂｉｔｚら。

−貼エエ心±Ｌ上胚＝’　１７３．３４９−３６９　（１９８７）に記載されたようにして、９６ウエルのポリスチレンＩｍｍｕｌｏｎ　１プレート中での間接固相ＲＩＡにより特異性についてスクリーニングした。簡単に言えば、Ｖｏｌｌｅｒの炭酸緩衝液中の種々の濃度のタンパク質またはペプチド５０μｌを各ウェルに加え、２９°Ｃで一晩乾固した。翌日、５％ＢＳＡ　（第Ｖ分画、脂肪酸不含有、Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、　）　、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ −１００および０．０２％ＮａＮ　３を含むＰＢＳ２００μｌを各ウェルに添加した後、３７°Ｃて６０分間インキュベートした。この緩衝液の除去後、５％ＢＳＡおよび０，０２％ＮａＮ、を含むＰＢＳ中の種々の希釈度の精製１ｇＧ　１００μｌを二連りに添加し、ウェルを３７°Ｃで１時間インキュベートした。上記緩衝液での３回の洗浄後、ウサギＩｇＧに対して向けられた約１００．０００　ｃｐｍの１２５　Ｉ標識ロバ［ｇＧ　（比活性５μＣ１／μｇ　：Ａｍｅｒｓｈａｍ、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、　［Ｌ　）を含む５％ＢＳＡ／ＰＢＳ十ＮａＮ、　１００μｌの添加により、結合したｔｇＧを検出した。３７°Ｃての１時間のインキュベーション後、洗浄により未結合の抗体を除去した。６０°Ｃでの１５分間の１００μｌの２Ｍ　ＮａＯＨとのインキュベーション後、可溶化したタンパク質をガラス管に移し、Ｔｍ　Ａｎａｌｙｔｉｃγカウンター１１９３型中で放射能を測定した。

ＫＬＨ接合ペプチド［Ｖ−Ｈｌに対して生じた精製［ｇＧをＲ［Ａにより免疫反応性についてスクリーニングした（表３参照）。

抗ペプチドＩＶ−ＨＩ　ＩｇＧの反応性は■型コラーゲン特異的てあった。というのは、該ＩｇＧは■型コラーゲンおよびペプチド［Ｖ−Ｈｌを認識したが、■ 型コラーゲンを認識しなかったからである。対照の精製正常ウサギＩｇＧは■型コラーゲンとも合成■壓コラーゲン由来ペプチドのいずれとも反応しなかった。

ペプチドＩＶ−Ｈ１に対するポリクローナル抗体を調製し、■型コラーゲン媒介Ｍ４黒色腫細胞接着、伸展および運動を阻害する能力について試験した。それらのアッセイでは、前の用量応答実験において最大Ｍ４黒色腫細胞接着の半分を与える濃度のペプチドｌ■−旧、■型コラーゲンまたはＩ型コラーゲン（ペプチド５０μｇ／ｒｎｌ、完全タンパク質５μｇ／ｍｌ）を使って、細胞接着アッセイに使用するために実施例１に記載のように（ｍｍｕｌｏｎ　１プレートをコーティングした。

表面結合タンパク質中の対応する配列をブロックするために、タンパク質コーティング表面を種々の濃度の精製正常ウサギＩｇＧまたはペプチドＩＶ−Ｈ１に対する精製ＩｇＧと共にインキュベートした。次いでペプチドまたはＩｇＧの連続存在下において細胞をウェルに分配し、３７℃で３０分間インキュベートした。

上述した通りに伸展と接着を定量した。

加えて、下側ウェルでのタンパク質コーティングフィルターを抗体と共に２０〜３０分間インキュベーションして■型コラーゲン分子内のＩＶ−Ｈ１配列を結合させる（即ちブロックする）ことにより、接触走性に対する抗ペプチドＩＶ−ＨＩ　ＩｇＧの阻害効果を測定した。次いで細胞を上側ウェルに添加し、上記実施例４に記載の通りにアッセイを行った。

（リガンド）　ＩｇＧ濃度（μｇ／ｍｌ）タンパク質またはペプチド　０．００１°　０．００４　０．０２　１．０ペプチドＩＶ−Ｈｌ　２９９６＠３１７９　３７０５　３９２７■型コラーゲン　１２７　２９０　７７９　１７４７■型コラーゲン　６９　７１　１１０　１９８フイブロネクチン　８８　７３　８８　２５７ペプチドＩＶ−Ｈｌ　、完全な■盟コラーゲンまたはＩ型コラーゲンがコーティングされた表面上への黒色腫細胞接着を、増加する濃度の抗ペプチドＩＶ−ＨＩ　ＩｇＧの存在下でモニタリングした。５０μｇｏｄのペプチドｔＶ− 旧がコーティングされた表面上の黒色腫細胞接着は、２０μｇ／ｒｌｔｌの抗［Ｖ−Ｈｌ　［ｇＧにより４０％阻害された（図６ａ）。試験した抗体の最高濃度（５００μｇ／ｙｄ’）のところで最大阻害（７０％）が観察された。抗＋Ｖ− ＨＩ　ＩｇＧとのブレインキュベーションにより、■型コラーゲンへの細胞接着も濃度依存形式において減少した。わずか２０μｇｚＷの抗ペプチドＩＶ−ＨＩ　ＩｇＧの存在下て有意な阻害（２０％）が観察され、そして５００μｇ／ｍｌの抗ペプチドＩＶ−旧［ｇＧの存在下では４０％の接着阻害が観察された。対比して、抗ペプチド［Ｖ−ＨＩＩｇＧとのブレインキュベーションは、Ｉ型コラーゲンがコーティングされた表面への黒色腫細胞接着のレベルを減少させなかった。正常ウサギＩｇＧの存在下では、使用した最高濃度（５００μｇ／ｍｊ’）においてさえも、いずれかのコラーゲン性タンパク質がコーティングされた表面への黒色腫細胞接着の阻害は全く観察されなかった。これは、正常ウサギＩｇＧによるペプチドＩＶ−旧への細胞接着の阻害が無いことにより証明される（図６ａ）。

ペプチド［Ｖ−Ｈｌ　、完全な■型コラーゲンまたはＩ型コラーゲンがコーティングされた表面上での黒色腫細胞伸展をモニタリングした。ペプチド［Ｖ−Ｈｌかコーティングされた表面上での細胞伸展は、２０μｇ／ｄはとの低レベルの抗ペプチドＩＶ−ＨＩＩｇＧにより有意に（５０％）減少し、そして５０μｇ／ｍｌにおいて最大阻害（８０％）か観察された（図６ｂ）。同様に、■型コラーゲンがコーティングされた表面上での細胞伸展は、５０μｇ／ｍｌの抗ペプチドＩＶ−ＨＩ　ＩｇＧの存在下で２０％減少し、この［ｇＧが１００μｇ／ｍｌで存在した時は６０％はど大きく減少した。

対比して、Ｉ型コラーゲンかコーティングされた表面上での細胞伸展はこのｒｇＧにより影響を受けなかった（図６ｂ）。

対照の正常ウサギＩｇＧは、ペプチドＩＶ−Ｈ１、ＩＶ型コラーゲンまたは１型コラーゲンがコーティングされた表面上での細胞伸展に影響を与えなかった。

運動アッセイに細胞を添加する前に、コラーゲンがコーティングされたフィルターを抗ペプチドＩＶ−ＨＩ　ＩｇＧと共にインキュベートすることにより、■型コラーゲンにより媒介される黒色腫細胞接触走性に対する抗ペプチドＩＶ−ＨＩ　ＩｇＧの効果をモニタリングした（図６ｃ）。運動は濃度依存形式において減少し、１００μｇ／ｒＩＬｌのＩｇＧて７０％の最大阻害を有した。対比して、Ｉ型コラーゲンがプレコーティングされたフィルターを通過する細胞運動は、該フィルターと抗ペプチドＩＶ−Ｈ１【ｇＧとのブレインキュベーションにより阻害されなかった（図６ｃ）。正常ウサギＩｇＧは■型コラーゲン媒介細胞運動に対して全く効果がなかった。

第９日のニワトリ胚から外科的にを髄神経節を単離した。

この神経組織から外科的および酵素的に結合組織を除去した。

単離した細胞の残部は神経細胞、ダリア細胞および残余の神経芽細胞を含んだ。

次いで細胞を培地１−あたり４０．０００細胞に希釈した。細胞懸濁液０．５１ｎｌを、上記実施例１に示したようにペプチドＩＶ−旧並びに種々の正および負の対照かコーティングされている２４１ｍｍｕｌｏｎ　［プレートのウェルに添加した。

３７°Ｃの湿潤恒温槽中で該プレートを２４時間インキュベートした。次いで培地を除去し、プレートを洗浄して非接着細胞を除去した。１％グルタルアルデヒド溶液を使って接着細胞を固定した。表面に接着した神経細胞の数並びに神経突起を伸長している神経細胞の数の定量を二重盲目条件下で２人によって行った。

その結果は、濃度依存形式において神経細胞接着および神経突起の伸長か促進されたことを示す（図７）。

５μｇ／ｍｊｌ’の濃度のペプチドＥＶ−Ｈ１か最大細胞接着をもたらし、一方５０μｇ／ｍｌの濃度が接着神経細胞からの神経突起の最大伸長を引き起こした。

一緒にしたそれらの結果は、ペプチドＩＶ−Ｈ１が腫瘍細胞接触、伸展および運動の過程における主要な関係物であり、そしてそれが結合するであろう細胞種に関して高度に特異的であることを示す。

本発明のポリペプチドの多数の実際的用途か想像され得る。

そのような用途としては、悪性細胞の転移および侵入を阻害する能力、診断手段としての利用、および神経の再生を促進することが挙げられる。

過去に、選ばれたラミニン領域が侵入性細胞系の転移の可能性を減少させる能力について研究されている（ＭｃＣａｒｔｈＹら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｍｅｔ、　Ｒｅｖ、、　４．１２５−１５２　（１９８５）　）　、この効果は、ラミニンの細胞表面レセプターの飽和、即ち中和、により媒介される。本発明によれば、本明細書に与えられたデータは、■型コラーゲン由来のポリペプチドＩＶ−Ｈ１のレセプターが悪性細胞の細胞表面上に存在することを示唆する。結論として、過剰の可溶性ポリペプチドまたはペプチドＩＶ−旧のポリクローナル［ｇＧ抗体を使って■型コラーゲンレセプターをブロックすることができ、従ってそれらの転移可能性を減少させることができる。加えて、適当な化学療法剤と結合させたペプチドＩＶ−Ｈ１は、悪性細胞増殖を診断および治療するのに用いることができる。

また、本発明のペプチドは、損傷を受けた神経組織の再生を促進するのに有用であるとわかるだろう。特に、ペプチドＩＶ−Ｈ１は神経堤起源の細胞のみの接着を促進するので、神経細胞の過剰増殖を援助する。例えば、神経細胞は接着するが、内皮細胞は接着しない。よって、該ペプチドの結合特異性は内皮細胞が人工的な神経成長を妨害するのを防ぐ。

様々な特定の好ましい態様および技術への参照により本発明を記載してきたが、本発明の精神および範囲内に維持したまま、多数の変更および改良を行い得ることは理解されよう。

井ＦＩＧ、　２ＦＩＧ、２　Ｃ０ＮＴＩＮＵＥＤペプチド濃度　（ｕｑ／ｍ１）ＦＩＧ、　３Ａペプチド濃度　（ｕ＄Ｉ）ＦＩＧ、　３Ｂペプチド濃度　（１，１９７ｍ１）ＦＩＧ、　４Ａ ■型コラーゲン濃度Ｃｕ＆ｍ１）ＦＩＧ、４日０　１００　Ｚｏｏ　３００　４００　５００ペプチド濃度　（ｕｑ／ｍ１）ペプチド濃度　ωｇ／ｍ１）０　１ｏ　２０　３０　４０　５０ペプチド濃度　（ｕｇ／ｍ１）ＩｇＧ濃度　（１，１９７ｍ１）０　５０　１００　１５０　Ｚｏ。

ＩｇＧ濃度（１，１９７ｍ１）００ｌ濃度　（ｕｇ／ｍ１）ペプチド　ＩＶ−８１濃度（μｇ／ウェル）ＦＩＧ、　７要　約　書 ■型コラーゲン細胞接着、伸展および運動活性を有するポリペプチド細胞接着、伸展および運動活性を有する一方、高い細胞特異性を保持している：次式：　ｇｌｙ−ｖａｌ−１ｙｓ−ｇｌｙ−ａｓｐ−１ｙｓ−ｇｌＹ−ａｓｎ− ｐｒｏ−ｇｌｙ−ｔｒｐ−ｐｒｏ−ｇｌｙ−ａｌａ−ｐｒｏを有するポリペプチドが提供される。化学診断および化学療法装置といった医学適用も提供される。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成４年４月９日

Claims

【特許請求の範囲】

１．式：【配列があります】のポリペプチド。
２．適当な生物学的に適合性の剤と結合された、式：【配列があります】のポリペプチドを含んで成る、悪性細胞増殖の検出用の化学診断装置。
３．適当な生物学的に適合性の剤と結合された、式：【配列があります】のポリペプチドを含んで成る、悪性細胞増殖の治療用の化学療法装置。
４．細胞の接着および伸展並びに黒色腫細胞運動を促進する、主要三重らせん領域の連続コラーゲン性領域由来のＩＶ型コラーゲンのα１鎖のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド。
５．前記ポリペプチドが式：【配列があります】を有する、請求項４のポリペプチド。