JP2002508301A

JP2002508301A - タンパク質結合ポリペプチド

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Publication number: JP2002508301A
Application number: JP2000525450A
Authority: JP
Inventors: アオジュラ，ハーメッシュ，シン; クラーク，デービッド，ジョン
Original assignee: アンマットテクノロジーリミテッド
Priority date: 1997-12-19
Filing date: 1998-12-21
Publication date: 2002-03-19
Also published as: WO1999032513A1; AU1771599A; CA2315301A1; GB9726956D0; EP1040122A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、タンパク質結合ポリペプチドであって、タンパク質に結合することが知られている天然のリガンド結合タンパク質から直接は由来しておらず、前記タンパク質結合ポリペプチドが２〜３０個のアミノ酸を含む、タンパク質結合ポリペプチド、およびこのポリペプチドの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、タンパク質結合ポリペプチドおよびこのようなポリペプチドの適用
に関する。

【０００２】（背景）以前は、リガンド結合および受容体タンパク質に結合することが知られている
唯一の低分子は、生物学的起源の天然分子であり、これは、このようなタンパク
質、またはこれらの天然分子の合成類似体の、通常は高度に特異的な機能的部位
に結合することが知られている。これらの低分子の一般的な例は、ハプテン、ポ
リペプチド、並びに抗体および他の免疫グロブリンの可変または相補的決定領域
（ＣＤＲ）に結合するエピトープ、アビジンまたはストレプタビジンに結合する
ビオチン、コンカナバリンＡに結合するグルコース、およびタキキニン受容体に
結合するタキキニンである。他のタンパク質分子が、このようなリガンド結合お
よび受容体タンパク質、例えば免疫グロブリンに結合するプロテインＡまたはＧ
、または多くのタンパク質の表面上のエピトープに結合するものとして挙げられ
る抗体上の他の部位に結合することが知られている一方、これらの結合タンパク
質は、分離、検出および処理におけるこれらの有用性を制限する特に大きなサイ
ズを有する。

【０００３】生命科学における他の主な手段である抗体の使用は、精製手段としてのアフィ
ニティークロマトグラフィーに大いに依存する。特に、固定化されたプロテイン
Ａによる抗体精製は、実験室において、および試験的規模の製造のために、頻繁
に用いられる分離手法である。

【０００４】病原性バクテリアであるスタフィロコッカスオウレウス（Staphylococcus a
ureus）の細胞壁から分離されたプロテインＡおよびβ溶血性ストレプトコッカスジー（Streptococcus G）菌種の細胞壁から分離されたプロテインＧは、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のアフィニティー精製のためのリガ
ンドとして広範囲に用いられる。これらのタンパク質が固定化される多種のアフ
ィニティー支持体が入手できる。プロテインＡおよびプロテインＧは、精製され
る抗体の供給源および亜類型に対する選択性における若干の差異を提供する。タ
ンパク質、例えばプロテインＡおよびプロテインＧのアフィニティークロマトグ
ラフィーにおける使用は、S R Narayaman (Journal of Chromatography 658, 19
94, 第２３７〜２５８頁)による論文中に要約されている。

【０００５】大きいタンパク質、例えばプロテインＡおよびプロテインＧは、壊れやすい分
子であり、これらの生物学的活性は、これらのタンパク質構造において変化する
傾向がある。従って、このようなタンパク質マトリックスの貯蔵および使用は、
熟練した取り扱いおよび注意深い注意を必要とする。各々の精製サイクルの後に
生物学的活性を維持することは、アフィニティークロマトグラフィーカラムの再
使用のために必須である。しかし、各々の精製サイクルは、過酷な条件（例えば
低いｐＨ）を用いることを伴い、これによりタンパク質構造が変性しうる。この
結果、プロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティークロマトグラフ
ィーカラムは、限定された寿命を有し、これは通常の使用において次第に減少し
、不適当な維持または困難な条件においての使用により加速される。

【０００６】市場で入手できるプロテインＡおよび（特に）プロテインＧは、比較的高価で
ある。W R Trumble等(Protein Engineering, 7, No. 5 1994, 第７０５〜７１３
頁)は、アフィニティーカラムにおいて用いられるタンパク質の短縮化によって、使用または貯蔵に際して変化するタンパク質のタンパク質構造の可能性が低下
するか否かを調査し、Ｆｃ結合活性を維持した単一ドメインＩｇＧＦｃ結合タ
ンパク質の最小部分を同定する試行を報告している。この文献には、製造されう
る最小のＦｃ結合タンパク質が、４５〜５５アミノ酸長の程度であることを示し
ている。他の文献は、最近、この配列を３３個の残基に減少している(Proc. Nat
l. Acad. Sci. 1996, 93, 第５６８８〜５６９２頁；Biophysical Journal 1992
, 62, 第８７〜９１頁)。Frick等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 第８
５３２〜８５３６頁)は、プロテインＧからの１１量体ペプチドを誘導し、これがＩｇＧＦｃ部位に特異的に結合することを見出した。

【０００７】他の文献(J. Neuroimmunol. 1993, 48:2, 第１９９〜２０３頁)は、１２〜２８のアミノ酸ドメインを結合し、天然のアミロイドポリペプチドから誘導される
共有膜が、免疫グロブリンＧに、そのヒンジ部において結合することを示した。
しかし、この１７残基ポリペプチドは、変性剤により極めて高いアフィニティー
耐性解離を伴って結合する。ほとんど同一の水治療法プロフィルを有する１７量
体ポリペプチドの類似体はまた、ＩｇＧへの結合を示し、一方混乱させたアミノ
酸配列を有し、従って異なる水治療法プロフィルを有する対照のポリペプチドは
、最小の結合を示す。

【０００８】 G Fassina等(J. Molecular Recognition 1996, 9, 第５６１〜５６９頁)は、プロテインＡを、免疫グロブリンＧのＦｃ部分を認識する能力において模擬する
合成４量体トリペプチドを同定した。

【０００９】しかし、この４量体ポリペプチドは、直鎖状アミノ酸配列ではない。これは、
リシル残基と共に枝分かれする共通のグリシン核上の３量体ペプチド（ＹＴＲ）
の４個のコピーを構成し、さらに後者の４量体ポリペプチドは、ＩｇＧのＦｃ断
片に特異的に結合することが示されている。この状況において、Sloostra等(Mol
ecular Diversity, 1 (1995) 第８７〜９６頁)が、すべての可能なトリマー（８
０００個のペプチド）を作成し、３種の異なる抗体に対してスクリーニングを実
施したことは、注目すべきことである。これらの研究により、この抗体に結合す
る唯一の直鎖状配列のトリマーペプチドが、そのままのエピトープの直鎖状部分
または非直鎖状部分を模擬するのに対応するものであることが、明らかになる。
ＹＴＲ直鎖状ペプチドは、抗体結合配列としては同定されなかった。

【００１０】他の群はパラログを生成し、これは、分子抗体上の抗原への結合部位を模擬す
る短いポリペプチドである。このようなポリペプチドは、抗原に対する高い特異
性を有し、Narayaman（上記）による論文中で検討されたが、抗体アミノ酸配列の知識を必要とし、従って一般的に用いるのには適しない。タンパク質に特異的
に結合するペプチドは、ファージまたは既知の特異性または結合受容体に対して
スクリーニングされた化学的ライブラリーを用いて同定された(Eur. J. Biochem
. 1974, 43, 第７１〜３７５頁、Anal Biochem. 1979, 97, 第３０２〜３０８頁
、Biotech. Bioeng 1995, 47, 第２８８〜２９７頁)。繰り返すが、このようなペプチドは、これらのタンパク質の特異的なリガンドである。

【００１１】本発明者等は、驚くべきことに、抗体およびいくつかの他のタンパク質、代表
的にはリガンド結合および受容体機能を有するものの両方に結合する能力を有す
るが、試験した大部分の酵素には結合しない、短いポリペプチド配列を見出した
。

【００１２】タンパク質結合ポリペプチドは、本発明において、３種の重要で、以前は知ら
れておらず、予測されていない方法により区別することができる：これらの特に
小さいサイズ（２〜５０のアミノ酸、代表的に４〜３０のアミノ酸）；結合した
タンパク質の機能を決定することが知られている部位への異なる部位におけるこ
れらの結合；およびリガンド結合機能を有しうるかまたは有しえない、実質的に
２種または３種以上の無関係なタンパク質へのこれらの結合。このポリペプチド
により結合した代表的なタンパク質は、免疫グロブリン（例えば抗体）および関
連受容体（例えばＢ細胞に対する抗体受容体および細胞免疫系のＴ細胞に対する
Ｔ細胞受容体）；免疫グロブリン結合タンパク質（例えばプロテインＡ、プロテ
インＧ）、レクチン（例えばコンカナバリンＡ）、ビタミン結合タンパク質（例
えばアビジン、ストレプタビジン）である。本発明のポリペプチドは、分離、検
出および処理の分野において、特にタンパク質結合および受容体機能を有するタ
ンパク質へのポリペプチドの結合を伴う用途において、有利である。

【００１３】（発明の開示）本発明の第１の側面は、天然のタンパク質結合タンパク質から直接由来してお
らず、タンパク質結合ポリペプチドが２〜５０個、好ましくは４〜３０個のアミ
ノ酸を含むタンパク質結合ポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、好ま
しくは、１７個より少ないアミノ酸を含む。好ましい実施態様において、ポリペ
プチドは、１３個のアミノ酸を含む。

【００１４】本発明におけるポリペプチドタンパク質相互作用の正確な性質を、詳細な構造
的分析により明らかにすることができる。本発明のポリペプチドを、凝集により
互いに相互作用させるか、または他のタンパク質と相互作用させることができる
。結合および解離は、多くの場合において、しかしすべての場合においてではな
く、凝集現象により支配される。実際に、本発明のポリペプチドは、βアミロイ
ドポリペプチドを含む他のタンパク質の凝集特性に影響しうる。

【００１５】タンパク質結合タンパク質から「直接由来していない」という用語は、ポリペ
プチドと、前述のタンパク質から採取した配列のすべての伸張物、特に伝染性伸
張物（contagious stretch）との間の配列同一性が、９０％未満であることを意
味する。「ポリペプチド」という用語は、本明細書中では、特定の分子が、ペプ
チド結合により一緒に接合された複数のアミノ酸を含むことを示す広い意味で用
いられる。従って、これは、その実質的な範囲を包含し、これは時々文献中でペ
プチド、ポリペプチドまたはタンパク質を意味しうる。

【００１６】ポリペプチドはさらに、１３個より少ないアミノ酸まで短縮することができる
。

【００１７】好ましくは、タンパク質結合ポリペプチドのアミノ酸配列は、ｎ個の極性アミ
ノ酸（ここでｎは０または１である）により隔てられた少なくとも２個の無極性
アミノ酸を含み、前述の配列は、少なくとも２種または３種以上の無関係な他の
タンパク質に結合する能力を有し、ここでこの配列の全長は、前述のタンパク質
中に存在する配列のすべての伸張物と９０％未満の同一性を有する。

【００１８】好ましくは、本発明のタンパク質結合ポリペプチドは、少なくとも１つの無極
性残基に隣接する少なくとも１つのＧｌｎ残基を含む。

【００１９】本発明のタンパク質結合ポリペプチドは、非分枝とすることができ、一層大き
い範囲のポリペプチド、例えばレクチン、ビタミン結合タンパク質および免疫グ
ロブリン結合タンパク質（プロテインＡ自体を含む）と結合することができる。

【００２０】ポリペプチドは、天然のタンパク質活性部位と競合しないタンパク質上の部位
に結合することができる。例えば、ポリペプチドは、好ましくは、抗体の抗原結
合部位と競合しない部位（一つまたは複数）において抗体を結合する。

【００２１】本発明のポリペプチドは、従来技術のタンパク質結合タンパク質分子、例えば
プロテインＡおよびプロテインＧに優るいくつかの利点を有する。

【００２２】本発明のポリペプチドは、上記J. Neuroimmunol (1993) 中に記載されたポリペプチドと区別される。本発明のペプチドとは異なり、これらのペプチドは、ヒ
ンジ領域のみにおいてＩｇＧに特異的に結合する膜結合ポリペプチドであり、Ｆ
ｃまたはＦａｂ断片への結合を示さなかった。アミロイドペプチドが特異的な水
治療法（hydropathic）プロフィルを必要とし、本質的に比較的長く、強力な変性条件の存在における結合の反転に対する抵抗を示すという、さらなる区別があ
る。

【００２３】その小さいサイズのために、本発明のポリペプチドは、従来のタンパク質結合
タンパク質よりも高い能力を有する。即ち、これは、単位重量のポリペプチドあ
たりより多いタンパク質と結合する。本発明のポリペプチドは、酵素で標識した
ウサギおよびヤギＩｇＧ抗体およびある範囲の動物種（ヤギ、ヒト、イヌ、ネコ
、ウマ）からの本来的な抗体に強力に結合するが、このような免疫グロブリン方
法において標識に用いられる一般的な酵素には結合しないことが見出された。

【００２４】固定化されたタンパク質を用いて他のタンパク質をアフィニティークロマトグ
ラフィーにより精製することは、業界において十分知られている。溶液中の分子
が固定化されたリガンドまたは受容体に固体相において特異的に結合する能力に
基づいたアフィニティークロマトグラフィーは、概念的に簡単である。これを、
マトリックスに特異的かつ強力に結合する粗製の調製物から分離されるべきリガ
ンド誘導体化マトリックス、分子を含むカラムにおいて実施し、一方、特異的な
結合部位を有しない不純物のほとんどは、洗浄除去される。次に、特異的に吸収
された分子は、脱着剤により溶出され、回収される。アフィニティークロマトグ
ラフィーは、探査プローブ、診断学的手段および治療剤として用いるための分子
の精製のために重要な方法になった。

【００２５】比較的非特異的なリガンド（例えば染料および他の短いポリペプチド）の場合
において、タンパク質の結合は、典型的にはあまり能率的ではなく、所望のタン
パク質のいくつかを、「バンド」または分離媒体から溶出する分離されたフラク
ションに分割する作用を有するに過ぎない。対照的に、本発明におけるポリペプ
チドリガンドは、典型的に、不純物が洗浄除去され、一方所望のタンパク質が分
離媒体上または分離媒体内に維持されることを可能にする。

【００２６】ポリペプチド配列の短い長さは、ポリペプチドが、アフィニティークロマトグ
ラフィーカラムにおいて用いられる過酷な条件において一層安定であり、また改
良された貯蔵特性を有することを意味する。このような過酷な条件を回避するこ
とができ、これが分離されるタンパク質に対する特別の利点であることは、本発
明の重要な側面である。代表的に結合されるタンパク質を、本発明のポリペプチ
ドから、試薬、例えば希薄酸溶液を用いて、またはポリペプチドを結合するため
に用いられるよりも高いイオン強度を有する緩衝液または電解質を用いることに
より、溶出することができる。１つの例において、本発明に従って弱い緩衝液（
例えば１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７）中で1つのポリペプチドに結合した抗体を、一層強い緩衝液において溶出することができる。当業者には、この種類の
装入および溶出緩衝液を、本発明に従って特定のタンパク質およびポリペプチド
の組み合わせ用に設計することができることは、明らかである。

【００２７】本発明のポリペプチドを、組換えＤＮＡ方法により作成することができる。あ
るいはまた、本発明のポリペプチドを、合成的に作製することができる。これに
より、本発明のポリペプチドをアフィニティーカラムと共に用いる際の、代表的
には特定の生成物を汚染する細菌の細胞エンベロープからの発熱性物質の危険が
低下する。従来のタンパク質結合タンパク質であるプロテインＡおよびプロテイ
ンＧは、病原性バクテリアの細胞エンベロープに由来し、発熱性物質等の不純物
を含みうる。発熱性物質は、動物において熱を生じ、これによりしばしば、従来
のタンパク質調製物が、医学的に用いるのに不適切になり、または注意深く長期
にわたる生産および品質分析手順が必要になる。

【００２８】合成手段による本発明の短いポリペプチドの生産は、これを生産するための費
用が、既知のタンパク質結合ポリペプチドの従来の分離と比較して、顕著に減少
する、という追加の利点を有する。この結果、従来のカラムと比較して、本発明
のポリペプチドを含むアフィニティークロマトグラフィーカラムの費用が顕著に
低下する。

【００２９】本発明のポリペプチドの生産は、総合的に、ポリペプチドの構造を既知の手法
により変化させて、その安定性を改良することができる、というさらなる利点を
有する。例えば、ポリペプチドのいくつかの、またはすべての不安定な結合を、
化学的に改変して、タンパク質分解酵素による攻撃を防止し、これによりポリペ
プチドを非生物分解性にし、微生物学的攻撃に対して耐性にすることができる。
このことは、組換えＤＮＡ手法によっても、そのままのプロテインＡまたはプロ
テインＧを用いて達成することは、極めて困難である。

【００３０】ポリペプチドの構造を改変させて、この結合特性を高めることができる。たと
えば、残基、例えばシステインを、配列中に導入し、この残基によりポリペプチ
ドをアフィニティークロマトグラフィーマトリックスに結合させることができる
。

【００３１】好ましい実施態様において、ポリペプチドは、抗体またはタンパク質酵素接合
体を結合することができる。好ましいタンパク質−酵素接合体には、プロテイン
Ａ−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、コンカナバリンＡ−ＨＲＰ、
およびアビジン−ＨＲＰが含まれる。このような結合体は、イムノアッセイおよ
び関連する免疫学的方法において用途が見出される。

【００３２】本発明の第２の側面は、次のアミノ酸配列: ＴＲＮＧＱＶＬＱＧＡＩＫＧを含むポリペプチドおよびその機能的均等物を提供する。

【００３３】本発明の第３の側面は、次のアミノ酸配列: ＧＱＶＬＱＧＡＩＫＧを含むポリペプチドおよびその機能的均等物を提供する。

【００３４】本発明の第４の側面は、次のアミノ酸配列: ＤＭＨＤＦＦＶＧＬＭを含むポリペプチドおよびその機能的均等物を提供する。

【００３５】本発明の第５の側面は、次のアミノ酸配列: ＡＰＶＧＴＤＫＥＬＳＤＬＬＤＦを含むポリペプチドおよびその機能的均等物を提供する。

【００３６】本発明の第６の側面は、次のアミノ酸配列: ＳＲＡＱＩＬＱＡＡＧを含むポリペプチドおよびその機能的均等物を提供する。

【００３７】本発明の第７の側面は、次のアミノ酸配列: ＫＩＧＱＦＬＩＱＦＡＧＡＦＬＳＩＬＱＧＬＴＬＲＡＡＥＫＱＡＧを含むポリペプチドおよびその機能的均等物を提供する。

【００３８】機能的均等物には、前述のポリペプチドと同一の、またはこれに類似するタン
パク質結合能力を有する前述の配列に対する付加、欠損および／または置換を含
むポリペプチドが含まれる。前述の配列の機能的均等物の決定は、当業者の範囲
内である。例えば、配列ＡＩＫＧを有し、本発明の第２のおよび第３の側面のポ
リペプチドに由来するポリペプチドは、タンパク質に結合する。

【００３９】本発明のポリペプチドの機能的均等物は、改良されたタンパク質結合能力を有
しうる。ポリペプチドの１つまたはそれ以上のアミノ酸を、同様の特性を有する
アミノ酸で置換することができる。

【００４０】同様の特性を有するアミノ酸には、次のものが含まれる。脂肪族側鎖を有するアミノ酸:ｇｌｙ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｐｒｏ脂肪族ヒドロキシルアミノ酸：ｓｅｒ、ｔｈｒ芳香族アミノ酸：ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ塩基性アミノ酸：ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ、ａｓｎ、ｇｌｎ酸性アミノ酸：ａｓｐ、ｇｌｕ硫黄含有アミノ酸：ｃｙｓ、ｍｅｔ

【００４１】無極性アミノ酸は、酸性および塩基性アミノ酸を含まないアミノ酸である。

【００４２】ポリペプチドはまた、合成アミノ酸、例えばアミノアジピン酸、アミノ酪酸、
デスモシン、サルコシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチン、β−ア
ラニン、ホモシステイン、シトルリン、シクロヘキシルアミン、クロロフェニル
アラニン、シスチン、デヒドロプロリン、ホモシトルリン、ホモセリン、ヒドロ
キシプロリン、βヒドロキシバリン、ペニシルアミン、スタチンをも含みうる。

【００４３】好ましくは、ポリペプチドは、天然タンパク質活性部位と競合しないタンパク
質上の部位（一つまたは複数）に結合する。即ち、活性部位の通常の機能は、実
質的に影響されない。タンパク質が抗体である場合には、ポリペプチドは、抗体
の通常の抗原結合部位と競合しない部位（一つまたは複数）において、抗体に結
合しうる。

【００４４】好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドの重合体を製造することが
できる。これらのことは、いくつかのタンパク質結合部位を、同一の分子上に同
時に提供することができる、という利点を有する。重合体は、本発明において、
他の適切なポリペプチドと共に、ポリペプチドの単独重合体または共重合体とす
ることができる。

【００４５】好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドを用いて、他のタンパク質
を、ポリペプチドの配列をタンパク質のアミノ酸配列中に導入することにより改
変させて、タンパク質が他のタンパク質に結合することができるようにする。ア
ミノ酸配列に付加されたか、または置換された本発明のポリペプチドを有しうる
タンパク質には、プロテインＡおよびプロテインＧが含まれる。これにより、タ
ンパク質が抗体および他のタンパク質を結合する能力が改善され、かつ他の分子
に対するこの結合親和性が増大する。あるいはまた、本発明のポリペプチドのポ
リペプチド配列を、他のタンパク質に加えて、新規なタンパク質結合体を製造す
ることを可能にすることができる。

【００４６】本発明のポリペプチドを、アフィニティークロマトグラフィー剤として用いる
ことができる。従って、本発明のポリペプチドを、アフィニティークロマトグラ
フィーにおいて用いるのに適する１種または２種以上の固形物質、例えばアクリ
ル系重合体架橋デキストラン、シリカ、ガラス、アガロース、メタクリルアミド
−メチルビスアクリルアミド、セルロース、ビニル重合体、ポリアクリルアミド
またはこれらの組み合わせと結合させることができる。ポリペプチドは、このよ
うな物質に、業界において知られている任意の手段により共有的にまたは非共有
的に結合することができる。

【００４７】例えば、配列ＧＱＶＬＱＧＡＩＫＧを、各々のアミノ酸の後に試験するための
部分を除去する固体相において組み立てることができる。この例において、Ｌｙ
ｓ残基に、樹脂からのペプチド開裂を伴わずにＤＭＦ中の２０％のピペリジンを
用いて（試験前に）除去することができる一時的な側鎖保護、例えばＦｍｏｃを
導入する。このようにして、本発明者等は、本発明のＧＱＶＬＱＧＡＩＫＧポリ
ペプチドの全体を走査（scan）することができ、対照の実験に対して、短い配列
、例えばＡＬＫＧさえもタンパク質を結合することができることを見出した。

【００４８】好ましくは、本発明のポリペプチドを用いて、抗体、または類似する免疫グロ
ブリン、例えばＴ細胞受容体、レクチン、ストレプタビジン、アビジンまたはこ
れらの断片または誘導体、これらのリガンド、リガンド、基質、抗原または他の
分析物を精製する。

【００４９】抗体結合タンパク質、例えばプロテインＡおよびＧはまた、診断試験またはア
ッセイを実施するにあたり広範囲に用いられ、これには、バイオセンサーデバイ
ス（例えば表面プラズモン共鳴、表面弾性波、または他のこのようなマイクロ電
子工学デバイス、光電子光学デバイス）を用いるこれらのアッセイ、試験および
監視方法が含まれる。当業者には、本発明のポリペプチドを、このようなセンサ
ーデバイスの活性表面に極めて近い広範囲の一般的に用いられている診断学的分
子を結合するこれらの独特の能力が特に有利である場合において、同様に用いる
ことができることは、明らかである。本発明のポリペプチドの小さいサイズによ
り、このようなアッセイ、試験および監視方法、特に反応成分間の距離を短くす
る必要があり、この方法が代表的に近似アッセイと呼ばれるものにおいてさらな
る改善をなすことが可能になる。

【００５０】他の代表例は、蛍光染料（例えばダンシル）をポリペプチドに付着させて、ペ
プチド−染料複合体のタンパク質への結合が測定された蛍光を変化させることで
ある。あるいはまた、タンパク質の天然の（例えばトリプトファン）蛍光を用い
るか、または蛍光をポリペプチド中に導入することができる。両方の場合におい
て、当業者には、ポリペプチドまたはタンパク質の蛍光を、蛍光の性質（その強
度、発光または励起の波長、または蛍光の時間規模または偏光）を変化させるよ
うに組み合わせることは、明らかである。２つまたは３つ以上の分子間の蛍光を
結合させる特定の場合において、特に有利なのは、ポリペプチドが2つの分子間の距離を、プロテインＡまたはＧ等のタンパク質を用いて可能であるよりもはる
かに短くすることができることである。ポリペプチドがタンパク質の官能的部位
に結合しえない一方、そのタンパク質への結合は、蛍光体が、官能的部位におい
て発生する結合プロセスに応答するのに十分官能的部位に近い分子、例えば蛍光
体を提供することができる。例えば、蛍光消失または共鳴エネルギー移動の十分
知られているプロセスを用いることができる。同様に、当業者には、分子または
他の物質を、ポリペプチドに結合させて、タンパク質の機能的部位の通常の作用
を阻害することができることは、明らかである。

【００５１】若干の場合において、ポリペプチドをタンパク質分子上の結合の部位に、業界
において十分に確立されている手順により共有結合させるのが有利であり、これ
は代表的には、ヘテロ二官能化架橋剤を用いることを含み、ポリペプチドをタン
パク質に結合させるこの反応は、光化学方法を含みうる。

【００５２】分離および診断学的試験およびアッセイにおいて用いられる類似する方法を、
微生物学的、動物細胞またはウイルス診断試験、アッセイおよび監視方法の状況
において用いることができる。これらの細胞のいくつかは、本発明のポリペプチ
ドが結合するタンパク質を有しうるか、またはタンパク質を導入して、微生物、
細胞またはウイルスに、この分野の当業者に十分知られている方法により結合さ
せることができる。

【００５３】同様にして、本発明のポリペプチドを用いて、微生物、細胞またはウイルスを
、生物活性薬剤、薬物またはこれらの担体をポリペプチドに十分確立された方法
により結合させることにより、処理することができる。

【００５４】また、本発明のポリペプチドを、比較的大きい薬物分子、例えば一般的に生物
薬剤、細胞、微生物、ウイルス、巨大分子、重合体または他の粒子または物質、
例えば医療用移植片として知られているバイオテクノロジープロセスにより生成
するものの表面上に導入することができ、これを生物学的試料または動物の体中
に導入する。これらの手順における特定の問題は、このようにして導入された分
子、細胞、粒子または物質がしばしば動物体により異物として処理されて、種々
のプロセス（例えば免疫応答）の結果、体中で好ましくない反応が生じることで
ある。これらの好ましくない応答の初期段階の１つは、タンパク質、例えば抗体
が結合して、これが導入された異物を標識するかまたはオプソニン化（opsonize
）し、これが好ましくない応答を引き起こすことである。特にオプソニン化タン
パク質（例えば抗体）の機能的部位を伴わない本発明において記載したプロセス
によりこのような異物に結合した本発明のポリペプチドによる、タンパク質、例
えば免疫グロブリンの結合により、好ましくない生物学的応答を防止するかまた
は最小にすることができる。ポリペプチドを有する異物は、ホストにより異物で
あると認識されないホスト中に存在するタンパク質を結合し、さらに前述のタン
パク質を、これらが該タンパク質の通常の標識またはオプソニン化機能を提供し
ないようにして結合しうる。

【００５５】本発明のポリペプチドは、１度に１つより多いタンパク質に結合することがで
きるため、１つのタンパク質を他のタンパク質に、ポリペプチドとの相互作用に
より標的することができる。同様に、本発明のポリペプチドに結合した抗体を、
ポリペプチドとの相互作用により、特定の部位に標的することができ、他のタン
パク質を次に同一の部位に標的することができ、また逆にもすることができる。

【００５６】ポリペプチドのタンパク質への結合により、これらのタンパク質の特定の機能
的な特性に影響が生じえ、これを利用して、タンパク質の機能を制御することが
できる。１つの実施態様において、アルツハイマーポリペプチドの凝集を、本発
明のポリペプチドに結合させることにより制御して、原線維形成を最小にするこ
とにより治療することができる。

【００５７】幾つかの低合成分子（例えば染料）がタンパク質分子に結合することは、知ら
れている。これらは、本発明のポリペプチドと、はるかに広い、または異なる範
囲のタンパク質（例えば酵素を含む）へのこの結合およびタンパク質上の機能的
部位と他の部位との両方におけるこの結合により、区別される。原則として、短
いポリペプチドはまた、例えばアミノ酸側鎖の塩基性、酸性または疎水性特性を
提供することにより、前述の染料により例示される方法においてタンパク質に結
合するように設計することができ、これにより、多くのタンパク質分子上の多く
のこのような部位への結合が予測される。同様に、ポリペプチドを、タンパク質
上の特定のモチーフに結合するように設計することができる。しかし、当業者に
は、本発明のポリペプチドが、顕著に異なり、かつ予測できない特性を例示する
ことは、明らかである。実際に、本発明のポリペプチドは、以前には未知の一般
的なまたは同様の部位または構造的モチーフのリガンド結合および受容体タンパ
ク質における存在を示し、これは、触媒機能を有するタンパク質である酵素の１
つの他の主要な群を少なくともほとんど有しない。

【００５８】本発明のポリペプチドおよびこの製造を、ここで実施例のみにより、添付した
図面の図１〜１１を参照して記載する。（実施例１）ポリペプチドの製造、精製および特徴づけ溶液相および固体相化学的方法によりポリペプチドを合成する多くの方法が、
知られている。ポリペプチドを、以下のようにして、十分に確立されたプロトコ
ルを用いて、固体相合成により容易に調製することができる。例えば、本発明者
等は、Merrifieldにより開発されたＢｏｃ化学的方法を用いて、配列ＴＲＮＧＱ
ＶＬＱＧＡＩＫＧを有するポリペプチドを合成した。

【００５９】ＭＢＨＡ樹脂（０．５ミリモル）を用いた。Ｌｙｓのための側鎖保護基は、２
−ＣｌＺであった。各々の合成サイクルは、（ｉ）50％のＴＦＡ／ＤＣＭでの２
分および２５分の脱保護、（ｉｉ）５％ＤＩＰＥＡ／ＤＣＭでの中和、および（
ｉｉｉ）ＤＭＦ中の１．５ミリモルのアミノ酸、１．５ミリモルのＢＯＰおよび
４．５ミリモルのＤＩＰＥＡでの４０分間のカップリングから成っていた。所要
に応じて、第２のカップリングを用いて、反応をほぼ完全に行わせた（＞９９．
８％収率）。合成の収量時に、ポリペプチドを、既知の手順により、ＨＦで開裂
させた。代表的に、ポリペプチド樹脂を２０ｍｌのＨＦ、０．５ｇのチオクレゾ
ールおよび０．７５ｇのｐ−クレゾールで処理し、ＨＦを蒸発させた後、５０％
酢酸／水を用いて抽出を実施した。ポリペプチドを、Ｃ−８逆相ヴァイダックセ
ミプレップ（Vydac semi-prep）カラムにおいて、20％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡから８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡへの直線状勾配を用いて、
４５分間にわたり精製した。生成物ピークを凍結乾燥し、ＨＰＬＣにより分析し
た。

【００６０】本発明に係る他の配列を、同様に製造することができる。他の配列において用
いられる側鎖保護アミノ酸は、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｓ
ｐ（ＯｃＨｘ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（
２−ＣＬ−Ｚ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（
ＢｚＬ）−ＯＨおよびＢｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨであった。

【００６１】ビオチンを、ＢＯＰ活性化を用いて、前述のようにして、アミノ酸に同一の方
法によりカップリングすることができる。マルチマーペプチド（multimeric pep
tide）に関して、カップリングさせる第１の残基は、Ｆｍｏｃ―リシン（Ｆｍｏ
ｃ）−ＯＨであった。Ｆｍｏｃ基を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて、除
去した。再びこの手順を繰り返して、４つのペプチド鎖を延長するためのリシン
核を、通常の方法により得た。

【００６２】図１は、精製されたポリペプチド：ＴＲＮＧＱＶＬＱＧＡＩＫＧのＨＰＬＣの
軌跡を示す。２５μｇのこのポリペプチドを、０．１％ＴＦＡから８０％アセト
ニトリル／０．１％ＴＦＡへの連続した勾配を有するＣ−１８ヴァイダックカラ
ムに３０分間適用した。検出波長は、２１８ｎｍであった。

【００６３】異なる配列および類似する特性を有するポリペプチドを合成するための手法は
、十分知られている。例えば、新たな配列を、ポリペプチドライブラリーを構成
する一般的な方法により見出すことができる。同様に、在来の配列を、アミノ酸
または活性のために必要ではない類似体を除去、付加または置き換えまたは置換
することにより、化学的に改変することができる。配列の部分を、異なるポリペ
プチドから組合せて、新たなポリペプチドを作成することができる。この方法の
１つの代表例において、配列ＴＲＮＧＱＶＬＱＧＡＩＫＧを１０個の残基に減少
させて、配列ＧＱＶＬＱＧＡＩＫＧを得、これをさらに、各アミノ酸を一度に置
換することにより改変して、他の残基（Ａｌａ）は、以下のようにいくつかの配
列（「Ａｌａ走査」ポリペプチドと呼ぶ）を生じた：（1）ＡＱＶＬＱＧＡＩＫＧ（2）ＧＡＶＬＱＧＡＩＫＧ（3）ＧＱＡＬＱＧＡＩＫＧ（4）ＧＱＶＡＱＧＡＩＫＧ（5）ＧＱＶＬＡＧＡＩＫＧ（6）ＧＱＶＬＱＡＡＩＫＧ（7）ＧＱＶＬＱＧＡＩＫＧ（8）ＧＱＶＬＱＧＡＡＫＧ（9）ＧＱＶＬＱＧＡＩＡＧ（10）ＧＱＶＬＱＧＡＩＫＡ

【００６４】図２において、Ａｌａ残基を位置１〜１０において有するポリペプチド（１）
〜（１０）を、実施例３に記載するように、これらのＧＡＲＰ（ヤギ抗ウサギペ
ルオキシダーゼ）への結合についてスクリーニングした。吸光度は、各類似体の
結合を反映している。図２のこの置換手法により生じたポリペプチドは、Ａｌａ
走査ポリペプチド配列１〜８が、各々タンパク質を異なるレベルで結合したこと
を示す。

【００６５】Ａｌａ以外のアミノ酸を用いて、数千もの類似体を製造することができる。こ
のようにして、各残基の重要さに関する情報が得られ、これにより新たなポリペ
プチドの発見を導く。

【００６６】（実施例２）ポリペプチドに結合するタンパク質のスクリーニング溶液における、または固体表面に付着することによるポリペプチドを含む分子
へのタンパク質の結合を測定する多くの手法が知られている。本発明者等は、代
表的に、緩衝液、例えば５０ｍＭの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６に溶解した１０
０μｌの２０μｇ／ｍｌのポリペプチドで、８回の反復で、オーバーナイトで被
覆した９６マイクロウェルのＥＬＩＳＡプレートを用いた。次に、被覆したプレ
ートに以下の一連の工程を施した：

【００６７】（１）０．１％のトウィーン（Tween）を含むリン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄する（３回）。（２）１ウェルあたり１００μｌのＰＢＳ−Ｔと共に９０分間インキュベートす
ることにより、プレートをブロックし、これで３回洗浄する。（３）１００μｌの結合タンパク質溶液と共に６０分間インキュベートする。タ
ンパク質は、標識したタンパク質、例えば抗体またはアビジン、またはＨＲＰま
たは他の酵素または報告されているグループで標識した任意の他のものとするこ
とができる。タンパク質溶液の濃度は、標識の量に依存する。（４）ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、付着した標識に依存する手法により応答を監視
する。例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が標識である場合に
は、ウェルを、基質、例えば０．０１％（ＶＶ）の新鮮な過酸化水素を含む５０
ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６に溶解した５−アミノサリチル酸と共に
インキュベートすることができる。次に、短時間インキュベートした（例えば３
０分）後に、読み取り機（reader）、または視覚的に、応答を比色的に測定する
ことができる。図５は、標識として酵素ペルオキシダーゼを用いた場合の、免疫
グロブリンおよび２つの断片の結合を示す。

【００６８】他の様式において、標識を、タンパク質に二次的に付着させるかまたは結合さ
せることができる（前述の工程２）。例えば、ウサギＩｇＧを用いる場合には、
ポリペプチドの被覆を実施する手順は、次の工程を含む：

【００６９】（１）０．１％のトウィーンを含むリン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢ
Ｓ−Ｔ）で洗浄する（３回）。（２）１ウェルあたり１００μｌのＰＢＳ−Ｔと共に９０分間インキュベートす
ることにより、プレートをブロックし、これで３回洗浄する。（３）ＰＢＳ−Ｔ中に調製された結合タンパク質溶液１００μｌと共に６０分間
インキュベートする。（４）ＰＢＳ−トウィーンと共に３回洗浄し、ＧＡＲＰと共にインキュベートす
る。（５）ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、基質、例えば０．０１％（Ｖ／Ｖ）の新鮮な過
酸化水素を含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６に溶解した５−アミ
ノサリチル酸での応答を監視する。

【００７０】固体相アッセイは業界において十分知られており、容易にこれらのプロトコル
にすることができる多種の変法がある。

【００７１】例えば、間接的ペプチド−抗体結合アッセイのために、次の工程を採用した。
プレートを、炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６（１５ｍＭのＮａ₂ＣＯ₃；３５ｍＭのＮ
ａＨＣＯ₃）中で２０μｇ／ｍｌにおいて、１００μｌ／ウェルのＩｇＧ溶液と共に３７度で１時間インキュベートすることにより被覆し；プレートを、０．１
％のトウィーン−２０を含むトリス緩衝化生理食塩水（２５ｍＭ、ｐＨ７．４）
（ＴＢＳ−Ｔ）で３回洗浄し；１００μｌ／ウェルのＴＢＳ−Ｔを用いて、被覆
されていないウェル表面を、３７℃で３時間インキュベートすることによりブロ
ックし；プレートを前述のようにして洗浄し；０．２％のＤＭＳＯを含むＴＢＳ
−Ｔ中で２０μｇ／ｍｌにおいて、１００μｌのビオチニル化ペプチドを、各ウ
ェル中に入れ、続いて３７℃で１時間インキュベートし；過剰であり、かつ未結
合のビオチニル化ペプチドを洗浄し；各ウェル中のＩｇＧ結合ビオチニル化ペプ
チドを、ＴＢＳ−Ｔ中のエクストラビジン（ExtrAvidin）−ペルオキシダーゼ結
合体（製造者により供給され、推薦される１：１０００希釈物）と共にインキュ
ベートすることにより検出し；プレートを、前述のように洗浄して、過剰の、か
つ未結合の結合体を除去し；次に結合した結合体を、５−アミノサルチル酸と共
にインキュベートすることにより検出し、４５０ｎｍにおける光学的読み取り値
を、前述のようにして決定した。

【００７２】ビオチニル化されたＧＱＶＬＱＧＡＩＫＧは、適切な対照と比較して、種々の
供給源およびいくつかのタンパク質からのポリクローナルＩｇＧへの顕著な結合
を示した（表１および２）。このアッセイにおいて、アビジンは、タンパク質に
対するいくらかの非特異的結合を示した。しかし、ペプチド−タンパク質相互作
用からの信号は、明らかであった。

【００７３】従って、ビオチニル化されたＧＱＶＬＱＧＡＩＫＧは、１つより多いタンパク
質に結合する本発明のポリペプチドの一例である。

【００７４】（実施例３）代表的なタンパク質に結合するポリペプチドのスクリーニング本実施例において、ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼを、代表的なタンパク質と
して用いる。

【００７５】種々のポリペプチドを前述のようにしてマイクロウェル中で被覆し、次の工程
を実施した。（１）０．１％のトウィーンを含むリン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢ
Ｓ−Ｔ）で洗浄する（３回）。（２）１ウェルあたり１００μｌのＰＢＳ−Ｔと共に９０分間インキュベートす
ることにより、プレートをブロックし、これで３回洗浄する。（３）１００μｌのＧＡＲＰと共に６０分間インキュベートする。（４）ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、基質、例えば０．０１％（Ｖ／Ｖ）の新鮮な過
酸化水素を含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６に溶解した５−アミ
ノサリチル酸と共にインキュベートすることによる応答を監視する。次に、短時
間インキュベートした（例えば３０分）後に、読み取り機により、または視覚的
に、応答を比色的に測定することができる。

【００７６】１つの代表的な例において、配列ＧＱＶＬＱＧＡＩＫＧを、プロテインＧに由
来する１１量体（１１mer）配列(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 第８５３２〜８５３６頁)と比較した。図６は、天然のタンパク質に由来するペプチドが、本発明者等の配列と同様にはＩｇＧに結合することができないことを示す
。

【００７７】図１０は、ＧＡＲＰの、配列ＫＩＧＱＦＬＩＱＦＡＧＡＦＬＳＩＬＱＧＬＴＬ
ＲＡＡＥＫＱＡＧの３０量体ペプチドへの結合を示す。これらの場合において、
吸着としての比較的短いペプチドよりも長いペプチドにより、改善された応答が
明らかであるか、または結合を改善することができる。実施例９に記載するＢＳ
Ａタンパク質において固定化された配列ＧＱＶＬＱＧＡＩＫＧの１０量体ペプチ
ドもまた、３０量体ペプチドに匹敵する結合を示す（図１０）。

【００７８】同様のスクリーニング方法を用いて、本発明者等は、プレートをフラジェリン
タンパク質（J. Mol.. Biol 1991, 219, 第４７１〜４８０頁に刊行されている配列）で被覆し、これがＧＡＲＰに結合することができないことを見出した。本
発明者等の配列における可能な結合モチーフに基づいて、本発明者等は、ペプチ
ドＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧを合成し、これがＧＡＲＰに結合することを示すことが
できた。このようにして、天然の完全なタンパク質配列への種々の結合特性を示
す、有用なタンパク質結合ポリペプチド配列を誘導することが可能である（図１
１）。

【００７９】（実施例４）直接樹脂上のポリペプチドに結合するタンパク質のスクリーニング短いポリペプチドは、通常マイクロウェルに能率的に吸着しない。このような
ポリペプチドを、この結合能力についてスクリーニングすることができる、いく
つかの方法がある。この方法の１つは、ポリペプチドを、固体表面に共有的に固
定化することである。これに関して、誘導体化された表面を有するＥＬＩＳＡプ
レートは、分子を表面につなぐために市場で入手できる。このような方法は、比
較的短い配列を結合させ、次に前述の通常の方法においてスクリーニングするた
めに、容易に用いることができる。他の方法において、配列を、十分知られてい
る手法により固体相において合成し、樹脂の部分を合成の種々の段階において除
去することができる。次に、樹脂を、マイクロウェルの代わりに、本発明のタン
パク質結合ポリペプチド用の支持体として用いることができる。上記に報告され
たＥＬＩＳＡ方法に類似する洗浄工程を、樹脂を所望の溶液と混合し、分離をベ
ンチトップマイクロ遠心機により実施することにより、実施することができる。
このようにして、本発明者等は、本発明のＴＲＮＧＱＶＬＱＧＡＩＫＧポリペプ
チド全体を走査することができ、短い配列、例えばＡＩＫＧさえも、タンパク質
に結合することができることを見出した。代表例において、ポリペプチド（ＧＱ
ＶＬＱＧＡＩＫＧ）を、実施例１において用いたＢｏｃの代わりにＦｍｏｃアミ
ノ酸を用いたのみで、耐酸樹脂上に組み立てた。少量の樹脂（１０ｍｇ）を、各
アミノ酸の組み立ての後に除去し、９５％ＴＦＡ／５％水混合物で処理して、側
鎖を開裂させた。樹脂をジクロロメタンおよびメタノールで洗浄し、乾燥した。
次に、樹脂を、ＰＢＳ−Ｔの溶液１ｍｌ中でインキュベートして、非特異性部位
をブロックした。実施例２，３および４に記載したＥＬＩＳＡ工程を、１ｍｌの
溶液の容量を用いて樹脂において実施し、続いて遠心分離して各洗浄工程の後に
樹脂を回収することができた。基質を加え、反応を発生させた後の最終段階にお
いて、応答を、上清液の吸光度の読み取り値を記録することにより、測定した。

【００８０】この方法を用いて、樹脂、タンパク質（例えばＧＡＲＰ）に結合した４個の残
基という短い配列、例えばＡＩＫＧの結合を示すことができる。

【００８１】（実施例５）ポリペプチドアフィニティーカラムの調製広範囲のマトリックス（Immobilized affinity ligand techniques (Academic
Press 1992)またはBioaffinity Chromatography (Elsevier Science Publicati
ons 1993)参照）を有するアフィニティーカラムを調製するのに有用ないくつかの方法および化学的方法（chemistries）がある。代表例において、本発明者等は、市場で入手できる予め活性化されたアフィ−プレップ（Affi-prep）カラムを用い、本発明のポリペプチドを高速ステンレススチールカラムにおいて固定化
した。１３量体ポリペプチドを、６個の炭素スペーサー、アミノヘキサン酸を用
いて合成し、希薄緩衝液中でｐＨ７．８において１０ｍｇ／ｍｌのポリペプチド
濃度において固定化した。カラムを通してポリペプチド溶液を再循環させること
により、カップリングを、オーバーナイトで進行させた。次の日に、残留する活
性化された基をすべて、０．１Ｍエタノールアミン溶液で処理した。

【００８２】１つの例において、アフィプレップ−１０固定化ペプチドに結合するタンパク
質−ＨＲＰ結合体を、少量のマトリックス（予めブロックして、非特異的結合を
最小にした）をＰＢＳ−Ｔ緩衝液中でインキュベートし、未結合物質を遠心分離
により洗浄除去することにより、測定した。次に、反応混合物を低速で遠心分離
し、光学密度を記録するために上清液を用いた以外は、実施例２におけるＥＬＩ
ＳＡ測定について記載したようにして、５−アミノサリチル酸と共にインキュベ
ートすることにより、結合した接合体を評価した。エタノールアミンでブロック
したアフィ−プレップ１０マトリックスを、対照マトリックスとして用いた。図
７は、固定化された配列がタンパク質に結合することができることを示す。

【００８３】アミノセファロースマトリックス（ＡＨ−セファロース４Ｂファーマシア）に
おけるマルチマーＧＱＶＬＱＧＡＩＫＧペプチドの固定化を、以下のように実施
した。４ｍｌのＰＢＳ中の１ｇのＡＨ−セファロースを、０．５ｍｌの８％グル
タルアルデヒド溶液で３０分間処理した。焼成した炉上で樹脂を蒸留水で洗浄す
ることにより、過剰の試薬を除去した。１０％ＤＭＳＯを含む５０ｍＭの重炭酸
塩緩衝液、ｐＨ９．６中の２倍モル過剰量のマルチマーペプチドを、この活性化
されたマトリックスに、３時間にわたりカップリングさせた。未結合ペプチドを
、緩衝液、次いで１０％酢酸、次いで水およびエタノールで、濾過により洗浄し
た。マトリックスを、２５ｍｌの緩衝液中に再懸濁させ、数個の結晶のホウ素化
水素ナトリウムを加えた。未結合ペプチドを除去するのに用いた洗浄を、繰り返
した。ニンヒドリン試験を用いて、ペプチドのカップリングを定性的に測定した
。マトリックスを、短いカラム（０．８ｃｍ×１０ｃｍ）中に封入し、結合緩衝
液で平衡にした。

【００８４】（実施例６）ポリペプチドアフィニティーカラムを用いたタンパク質の分離および／または
スクリーニング実施例６において製造したカラムを、ＨＰＬＣシステムに接合させ、タンパク
質を、２８０ｎｍの波長に固定したＵＶ検出器を用いることにより検出した。代
表的に、タンパク質（０．２〜０．５ｍｇ）を、ポリペプチドカラム上に装入し
、適切な緩衝液、例えば１０ｍＭのトリス−ＨＣＬ、ｐＨ８を用いて、０．２ｍ
ｌ／分の流量でレオジン注入器により、平衡にした。流出物を、２８０ｎｍの波
長で連続的に監視し、溶出プロフィルを得た。次に、結合したタンパク質を、溶
出緩衝液、例えば３Ｍのグアニジン塩酸塩または０．１％ＴＦＡを適用すること
により溶出させた。結合および溶出プロフィルは、図３において見られ、これは
、ＨＲＰ酵素（軌跡Ａ）およびヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（軌跡Ｂ）を用いた際の
アフィニティーカラムからの結合および溶出プロフィルを示す。溶出を、０．１
％ＴＦＡ溶液を用いて可能にした一方、結合は、カラムを平衡にするのに用いら
れる１０ｍＭのトリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．４緩衝液中で達成された。この例にお
いて、ＨＲＰは、評価可能には結合せず、従ってほとんど欠如に溶出した。対照
的に、０．１％ＴＦＡを用いた際には、ＩｇＧは結合し、溶出した。

【００８５】実施例５において製造したマルチマーペプチドカラムを、ｐＨ７．４のリン酸
緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）６ｍｌで平衡にした。０．５ｍｌのＰＢＳ中の０．
２ｍｇの量のヤギＩｇＧ(Sigma)を、カラムに、０．４ｍｌ／分の流量で適用した。試料を装入した後、結合緩衝液を適用して、未結合タンパク質を洗浄除去し
、吸光度を２８０ｎｍにおいて連続的に測定した。本発明者等は、次に、３Ｍの
グアニジン塩酸塩の溶液３ｍｌを適用して、結合タンパク質を溶出した。図１２
は、このカラムからの代表的なタンパク質の結合および溶出を示すクロマトグラ
フィープロフィルを示す。

【００８６】（実施例７）ポリペプチドに結合させるための種々の化合物のスクリーニングＥＬＩＳＡおよびアフィニティークロマトグラフィーの方法論を用いて、本発
明者等は、種々の供給源からのいくつかの抗体をスクリーニングし、データを以
下に表にまとめて、代表的なポリペプチド配列への結合を示す。マークしたタン
パク質は、結合を示さなかったか、または有意ではないレベルの結合を示した。

【００８７】

【表１】

【００８８】表１に示された結果は、抗体のほとんどすべての供給源が、結合および溶出を
、種々の程度で示したことを示す。

【００８９】同様に、他の化合物をスクリーニングすることができ、スクリーニングしたも
のの若干を、以下に表にまとめる。

【００９０】

【表２】

【００９１】（実施例８）ＩｇＧにおける結合部位本発明のポリペプチドがタンパク質の通常の結合部位において直接結合しない
ことを例証する実験において、本発明者等は、抗ＦＩＴＣ抗体を用いた。この抗
体は、抗原結合部位において特定の結合によりフルオレセインの＞９５％の蛍光
を消失させることが知られている。この消失アッセイを、３：ｌの１０μｇ／ｍ
ｌのフルオレセイン溶液を含む１０ｍＭのトリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．４緩衝液２
ｍｌ中で、抗体の存在において、および不存在において実施した。図４に示すよ
うに、５：ｌの抗体は、結合によりほとんどの蛍光を消失させることができた。
同一のレベルの結合が、１０：ｇのポリペプチド（ＧＱＶＬＱＧＡＩＫＧ）の存
在において観測された。このデータは、ポリペプチドの結合が、通常のタンパク
質の機能に、評価可能な程度には影響しないことを示す。しかし、本発明のポリ
ペプチドが、機能的部位の近くに結合するか否か、または固定化されていないポ
リペプチドが溶液中では遊離であるものとは異なる挙動を示すか否かは、問題外
とすることはできない。

【００９２】（実施例９）光学的バイオセンサーによる結合の測定ペプチド配列ＧＱＶＬＱＧＡＩＫＧを、以下のようにグルタルアルデヒド方法
を用いて、ＢＳＡ上に固定化した。ウシ血清アルブミン（４ｍｇ）を、０．７５
ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４に溶解した。グルタルアル
デヒド（０．２５ｍｌの８％溶液）を加え、混合物を室温で３０分間かきまぜた
。過剰のグルタルアルデヒドを、ＰＤ−１０カラムにおけるゲル濾過により除去
した。ペプチド（１０ｍｇを最小容積のＤＭＳＯに溶解した）を、活性化された
ＢＳＡに加え、結合を３時間放置して進行させた。未結合ペプチドを、透析、遠
心分離およびさらなるゲル濾過により除去した。

【００９３】この接合体を、ＥＤＣカップリングを用いて、製造者（ＢＩＡcore）の記載に
従って、センサーチップを横断して流すことにより、ＣＭ５チップ上に固定化し
た。ＢＳＡを、対照のフローセルにおいて用いた。ペプチドタンパク質相互作用
は、タンパク質の種々の濃度を用いて、結合定数を測定するための最適な条件を
得る研究である。代表例において、抗体をリン酸緩衝化生理食塩水中で結合させ
、再生を、３Ｍグアニジン塩酸塩溶液を用いて実施した。結合親和性（ｋＤ）を
測定した。図８および９は、会合および解離進行曲線を示す。マルチマーペプチ
ドを、同一の方法で固定化することができ、結合を評価した。得られたｋＤ値は
、マルチマーおよびＢＳＡ結合１０量体ペプチドについて、それぞれ４×１０^-7 Ｍおよび１×１０^-7Ｍであると評価された。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、精製されたペプチドＴＲＮＧＱＶＬＱＧＡＩＫＧのＨＰＬ
Ｃ軌跡である。

【図２】図２は、１０量体ペプチドＧＱＶＬＱＧＡＩＫＧおよびそのＡｌａ
走査誘導体に結合する抗体を示す。

【図３】図３は、ペプチドアフィ−プレップ−１０カラムからの結合および
溶出プロフィルである。

【図４】図４は、１０量体ペプチドの存在および不存在における抗ＦＩＴＣ
によるＦＩＴＣ蛍光の消失を示す、４９０ｎｍにおける励起により記録された蛍
光スペクトルである。

【図５】図５は、１０量体ペプチドＧＱＶＬＱＧＡＩＫＧへのＨＲＰ、ＧＡ
ＲＰ、Ｆｃ断片およびＦａｂ断片の結合を示す。ペプチドが存在しない対照の実
験を、(c)で表示した。

【図６】図６は、ペプチドＧＱＶＬＱＧＡＩＫＧと比較した、ヤギ抗ウサギ
ペルオキシダーゼの、天然の抗体結合タンパク質に由来する１１量体ペプチド（
ＮＤＮＧＶＤＧＥＴＷＹ）(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 第８５３２
〜８５３６頁)への結合を示す。ペプチドが存在しない対照の実験を、(c)で表示
した。

【図７】図７は、ペルオキシダーゼ結合抗体および断片ＦａｂおよびＦｃの
、アフィニティーマトリックスアフィ−プレップ１０上で固定化されたペプチド
ＧＱＶＬＱＧＡＩＫＧへの結合を示す。ペプチドが存在しない対照の実験を、(c
)で表示した。

【図８】図８は、ＣＭ５チップ上で固定化されたＢＳＡ−ペプチド結合体を
有する種々の濃度のヤギＩｇＧの会合および解離を示す。最上部から最下部にか
けての曲線は、それぞれ、１、０．８、０．６、０．４、０．２、０．１、０．
０５および０．０２５μＭのＩｇＧ濃度についてのものである。

【図９】図９は、ＣＭ５チップ上で固定化されたマルチマー１０量体ペプチ
ドを有する種々の濃度のヤギＩｇＧの会合および解離を示す。最上部から最下部
にかけての曲線は、それぞれ、１、０．８、０．６、０．４、０．２、０．１、
０．０５、０．０２５、０．０１２５および０．００６２５μＭのＩｇＧ濃度に
ついてのものである。

【図１０】図１０は、ＥＬＩＳＡにより測定した、３０量体ペプチド（ＫＩ
ＧＱＦＬＩＱＦＡＧＡＦＬＳＩＬＱＧＬＴＬＲＡＡＥＫＱＡＧ）および１０量体
ペプチド（ＧＷＶＬＱＧＡＩＫＧ）とＢＳＡとの結合体への、ヤギ抗ウサギペル
オキシダーゼ（ＧＡＲＰ）の結合を示す。

【図１１】図１１は、鞭毛タンパク質（J. Mol. Biol 1991, 219, 第４７１
〜４８０頁）から採取したペプチド（ＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧ）配列へのＧＡＲＰ
の結合を示し、同一の図面はまた、タンパク質自体が結合しないことを示す。

【図１２】図１２は、マルチマーペプチド（ＧＷＶＬＱＧＡＩＫＧ）カラム
からのヤギＩｇＧの結合および溶出を示すクロマトグラフィープロフィルである
。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｂ０１Ｄ 15/08 Ｃ０７Ｋ 7/06 ４Ｄ０１７Ｃ０７Ｋ 7/06 7/08 ４Ｈ０４５ 7/08 16/06 16/06 17/02 17/02 Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｇ０１Ｎ 33/68 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者クラーク，デービッド，ジョンイギリスチェシャーシーダブリュ11 １ワイビーサンドバックフィールズドライブ６Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA13 BA20 BB22 BB55 BB60 CB01 CB21 CB30 DA12 DA13 DA14 DA36 DA80 FA11 FB01 FB02 FB03 FB06 FB07 FB12 FB15 FB20 GC10 JA20 4B024 AA01 AA11 BA41 BA80 CA04 DA02 DA05 DA11 EA04 GA11 HA01 HA03 4C076 AA19 CC01 EE09 EE26 EE31 EE38 EE41 FF05 FF36 4C084 AA02 BA03 BA14 BA15 BA16 BA17 BA18 BA19 CA59 DC50 NA14 ZA162 ZC192 ZC412 4C085 HH20 JJ05 KA27 KB82 LL13 4D017 AA11 BA07 CA11 DA03 EA05 4H045 AA10 AA11 BA13 BA15 BA16 BA17 BA18 CA42 DA75 EA20 EA50 FA30 FA33 FA72 FA74 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】天然のタンパク質結合タンパク質から直接由来していないタ
ンパク質結合ポリペプチドであって、該タンパク質結合ポリペプチドは２〜５０
個のアミノ酸を含む、タンパク質結合ポリペプチド。
【請求項２】ポリペプチドが、ｎ個の極性アミノ酸（ここでｎは０または
１である）により隔てられた少なくとも２個の無極性アミノ酸を含む、請求項１
記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項３】少なくとも２個またはそれ以上の無関係なタンパク質に結合
することができる、請求項１または２記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項４】少なくとも３個の無関係なタンパク質に結合することができ
る、請求項３記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項５】ポリペプチドが少なくとも４個の無関係なタンパク質に結合
することができる、請求項３または４記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項６】少なくとも５個の無関係なタンパク質に結合することができ
る、請求項３、４または５記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項７】ポリペプチドの全長配列が、タンパク質の任意のアミノ酸配
列と９５％未満の同一性を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパ
ク質結合ポリペプチド。
【請求項８】タンパク質の任意のアミノ酸配列と９０％未満の同一性を有
する、請求項７記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項９】タンパク質の任意のアミノ酸配列と８５％未満の同一性を有
する、請求項７記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項１０】タンパク質の任意のアミノ酸配列と８０％未満の同一性を
有する、請求項７記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項１１】タンパク質の任意のアミノ酸配列と７５％未満の同一性を
有する、請求項７記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項１２】タンパク質の任意のアミノ酸配列と７０％未満の同一性を
有する、請求項７記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項１３】タンパク質の任意のアミノ酸配列と６５％未満の同一性を
有する、請求項７記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項１４】３〜３０個のアミノ酸を含む、請求項１〜１３のいずれか
一項に記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項１５】４〜３０個のアミノ酸を含む、請求項１〜１４のいずれか
一項に記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項１６】ポリペプチドが、３０個未満のアミノ酸を含む、請求項１
〜１５のいずれか一項に記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項１７】ポリペプチドが、１７個未満のアミノ酸を含む、請求項１
６記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項１８】ポリペプチドが、１３個のアミノ酸を含む、請求項１７記
載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項１９】ポリペプチドが、１３個未満のアミノ酸を含む、請求項１
７記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項２０】タンパク質結合ポリペプチドのアミノ酸配列が、互いに隣
接した少なくとも２個の無極性残基を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記
載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項２１】少なくとも１つのグルタミン酸残基を含む、請求項１〜２
０のいずれか一項に記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項２２】ポリペプチドが、１つまたはそれ以上の天然のタンパク質
活性部位と競合しないタンパク質上の、一つまたは複数の部位に結合している、
請求項１〜２１のいずれか一項に記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項２３】ポリペプチドが、一つまたは複数の抗体に、一つまたは複
数の抗体の抗原結合部位と競合しない一つまたは複数の部位において結合してい
る、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項２４】ポリペプチドが、合成的に作製される、請求項１〜２３の
いずれか一項に記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項２５】ポリペプチドが、合成の後に化学的に改変されている、請
求項１〜２４のいずれか一項に記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項２６】ポリペプチドが、ポリペプチド配列中への残基の付加によ
り改変され、これによりポリペプチドをアフィニティークロマトグラフィーマト
リックスに付着させることができる、請求項２５記載のタンパク質結合ポリペプ
チド。
【請求項２７】ポリペプチドは、抗体およびタンパク質−酵素接合体に結
合する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項２８】タンパク質接合体が、プロテインＡ−セイヨウワサビペル
オキシダーゼ（ＨＲＰ）またはコンカナバリンＡ−ＨＲＰまたはアビジン−ＨＲ
Ｐを含む、請求項２７記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項２９】ポリペプチドの１個またはそれ以上のアミノ酸が、置換さ
れる１個または複数のアミノ酸と類似する特性を有するアミノ酸により置換され
ている、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項３０】ポリペプチドが、１個またはそれ以上の合成アミノ酸を含
む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項３１】１個またはそれ以上の合成アミノ酸が、アミノアジピン酸
、アミノ酪酸、デスモシン、サルコシン、ノルバリン、ノルロイシンまたはオル
ニチンを含む、請求項３０記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項３２】ポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィーに用
いるのに適した１種またはそれ以上の固形物質と結合される、請求項１〜３１の
いずれか一項に記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項３３】１種またはそれ以上の固形物質が、アクリル系重合体、架
橋デキストラン、シリカ、ガラス、アガロース、メタクリルアミド−メチルビス
アクリルアミド、セルロース、ビニル重合体およびポリアクリルアミドのいずれ
かを含む、請求項３２記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項３４】ポリペプチドが、１種より多いタンパク質に同時に結合す
ることができる、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のタンパク質結合ポリペ
プチド。
【請求項３５】請求項１〜３４のいずれか一項に記載のタンパク質結合ポ
リペプチドの付加または置換により改変されたアミノ酸配列を有する、ポリペプ
チド。
【請求項３６】ポリペプチドが、プロテインＡまたはプロテインＧを含む
、請求項３５記載のポリペプチド。
【請求項３７】次のアミノ酸配列：ＴＲＮＧＱＶＬＱＧＡＩＫＧを含む、タンパク質結合ポリペプチドおよびその機能的均等物。
【請求項３８】次のアミノ酸配列：ＧＱＶＬＱＧＡＩＫＧを含む、タンパク質結合ポリペプチドおよびその機能的均等物。
【請求項３９】次のアミノ酸配列：ＤＭＨＤＦＦＶＧＬＭを含む、タンパク質結合ポリペプチドおよびその機能的均等物。
【請求項４０】次のアミノ酸配列：ＡＰＶＧＴＤＫＥＬＳＤＬＬＤＦを含む、タンパク質結合ポリペプチドおよびその機能的均等物。
【請求項４１】次のアミノ酸配列：ＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧを含む、タンパク質結合ポリペプチドおよびその機能的均等物。
【請求項４２】次のアミノ酸配列：ＡＩＫＧを含む、タンパク質結合ポリ
ペプチド。
【請求項４３】次のアミノ酸配列：ＫＩＧＱＦＬＩＱＦＡＧＡＦＬＳＩＬＱＧＬＴＬＲＡＡＥＫＱＡＧを含む、タンパク質結合ポリペプチドおよびその機能的均等物。
【請求項４４】機能的均等物が、改変されていないポリペプチドと同一の
、または類似するタンパク質結合能力を有するこれらのアミノ酸配列への付加、
欠損および／または置換を含むポリペプチドを含む、請求項３７〜４３のいずれ
か一項に記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項４５】機能的均等物が、改変されていないポリペプチドと比較し
て改良されたタンパク質結合能力を有するアミノ酸配列への付加、欠損および／
または置換を含むポリペプチドを含む、請求項４４記載のタンパク質結合ポリペ
プチド。
【請求項４６】直鎖状アミノ酸配列を有する、請求項１〜４５のいずれか
一項に記載のタンパク質結合ポリペプチド。
【請求項４７】請求項１〜４６のいずれか一項に記載のタンパク質結合ポ
リペプチドを含む、重合体。
【請求項４８】前記重合体がホモ重合体である、請求項４７記載の重合体
。
【請求項４９】請求項４７または４８記載の重合体および他の適切な重合
体を含む、共重合体。
【請求項５０】前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドの、化学
的または生物学的方法による製造。
【請求項５１】化学的方法が合成の固体相または溶液相方法を含む、請求
項５０記載のポリペプチドの製造。
【請求項５２】生物学的方法が組換えＤＮＡ方法を含む、請求項５０記載
のポリペプチドの製造。
【請求項５３】請求項１〜４６のいずれか一項に記載のポリペプチド、重
合体、共重合体またはタンパク質を、１種またはそれ以上のタンパク質の機能を
決定する１つまたはそれ以上の部位を有する１種またはそれ以上のポリペプチド
またはタンパク質に結合する方法であって、前記結合が、前記１種またはそれ以
上のポリペプチドまたはタンパク質の機能を決定する１つまたはそれ以上の部位
への異なる部位において生じる、方法。
【請求項５４】化学的または生化学的または物理学的または生物学的方法
による、請求項５３記載の結合する方法。
【請求項５５】１種またはそれ以上のポリペプチドまたはタンパク質が、
１種またはそれ以上のエフェクター分子、巨大分子または粒子を含む、請求項５
３または５４記載の結合する方法。
【請求項５６】１種またはそれ以上のエフェクター分子、巨大分子または
粒子が、１種またはそれ以上の生物活性分子または薬物化合物を含む、請求項５
５記載の結合する方法。
【請求項５７】エフェクターが、ポリペプチドおよびエフェクター組立物
を結合する１種またはそれ以上のポリペプチドまたはタンパク質を有する体に対
して作用する、請求項５５または５６記載の結合方法。
【請求項５８】体が、生物学的細胞、微生物、ウイルス、リポソーム、ま
たは粒子、またはこれらの誘導体の含む、請求項５７記載の結合方法。
【請求項５９】請求項１〜４６のいずれか一項に記載のポリペプチド、ま
たは請求項４７または４８記載の重合体、または請求項４９記載の共重合体を含
む、アフィニティークロマトグラフィー薬剤。
【請求項６０】請求項１〜４６のいずれか一項に記載のポリペプチド、ま
たは請求項４７または４８記載の重合体、または請求項４９記載の共重合体を用
いて、抗体または免疫グロブリンを精製する、精製方法。
【請求項６１】免疫グロブリンは、Ｔ細胞受容体、レクチン、ストレプタ
ビジン、アビジン、またはこれらの断片または誘導体、これらのリガンド、リガ
ンド、基質、抗原または他の分析物を含む、請求項６０記載の精製方法。
【請求項６２】請求項１〜４６のいずれか一項に記載のポリペプチド、ま
たは請求項５７または５８記載の重合体、または請求項５９記載の共重合体を用
いる、診断試験、アッセイ、または監視方法。
【請求項６３】試験、アッセイ、または監視方法がバイオセンサーデバイ
スを用いる、請求項６２記載の診断試験、アッセイまたは監視方法。
【請求項６４】バイオセンサーデバイスが、マイクロ電子工学デバイスま
たは光電子工学デバイスを含む、請求項６３記載の診断試験、アッセイまたは監
視方法。
【請求項６５】蛍光染料を、タンパク質結合ポリペプチドに結合させて、
ポリペプチド−染料複合体のタンパク質への結合が測定可能な蛍光を変化させる
、請求項６２〜６４のいずれか一項に記載の診断試験、アッセイまたは監視方法
。
【請求項６６】試験、アッセイまたは監視方法が、微生物学的、動物細胞
またはウイルス診断試験、アッセイまたは監視方法を含む、請求項６２〜６５の
いずれか一項に記載の診断試験、アッセイまたは監視方法。
【請求項６７】生物活性薬剤、薬物または薬物担体がポリペプチドに結合
している、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む配達シス
テム。
【請求項６８】薬物担体がリポソームである、請求項６７記載の配達シス
テム。
【請求項６９】請求項１〜４６のいずれか一項に記載のポリペプチド、ま
たは請求項４７または４８記載の重合体、または請求項４９記載の共重合体が表
面に導入された、薬物分子。
【請求項７０】請求項１〜４６のいずれか一項に記載のポリペプチドの、
アルツハイマー病の治療における使用。
【請求項７１】請求項１〜４６のいずれか一項に記載のタンパク質結合ポ
リペプチドを含む、クロマトグラフィーカラム。
【請求項７２】治療学的薬剤と組合せて用いるための非共有結合ポリペプ
チド−タンパク質接合体において、タンパク質がタンパク質結合標的部分であり
、接合体が標的機能を維持し、ポリペプチドが２〜５０個のアミノ酸を含み、治
療学的薬剤がそこに結合した、非共有結合ポリペプチド−タンパク質接合体。
【請求項７３】治療学的薬剤と組合せて用いるための非共有結合ポリペプ
チド−タンパク質接合体において、タンパク質がタンパク質結合標的部分であり
、接合体が標的機能を維持し、ポリペプチドが２〜５０個のアミノ酸を含み、ポ
リペプチドが、治療学的薬剤を不活性形態から標的部位において放出することが
できる酵素活性を有する、非共有結合ポリペプチド−タンパク質接合体。
【請求項７４】ポリペプチドがリパーゼ活性を有し、治療学的薬剤がリポ
ソーム内に含まれる、請求項７１記載の接合体。
【請求項７５】ポリペプチドが、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載
のアミノ酸配列を含む、請求項７１〜７３のいずれか一項に記載の接合体。