JP2002145798A - 虚血関連ニューロン損傷を処置するための組成物 - Google Patents
虚血関連ニューロン損傷を処置するための組成物Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 脳内の虚血損傷に関連したニューロン損傷を
処置するために有効な組成物、および、このようなニュ
ーロン損傷を処置するための新規ペプチドを提供するこ
と。 【解決手段】 哺乳動物中枢神経系ニューロン細胞にお
けるノルエピネフリン放出を遮断する活性、および、ニ
ューロン膜ω−コノトキシンＭＶＩＩＡ結合部位に結合
する活性を有するニューロンカルシウムチャンネルアン
タゴニストωコノトキシンペプチドであって、該遮断活
性および該結合活性が、ω−コノトキシンＭＶＩＩＡ、
ＧＶＩＡ、またはＴＶＩＡの遮断活性および結合活性の
範囲内にあるペプチドを含む、哺乳動物種における虚血
状態に関連するニューロン損傷を減ずるための薬学的組
成物。
処置するために有効な組成物、および、このようなニュ
ーロン損傷を処置するための新規ペプチドを提供するこ
と。 【解決手段】 哺乳動物中枢神経系ニューロン細胞にお
けるノルエピネフリン放出を遮断する活性、および、ニ
ューロン膜ω−コノトキシンＭＶＩＩＡ結合部位に結合
する活性を有するニューロンカルシウムチャンネルアン
タゴニストωコノトキシンペプチドであって、該遮断活
性および該結合活性が、ω−コノトキシンＭＶＩＩＡ、
ＧＶＩＡ、またはＴＶＩＡの遮断活性および結合活性の
範囲内にあるペプチドを含む、哺乳動物種における虚血
状態に関連するニューロン損傷を減ずるための薬学的組
成物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、虚血状態、例え
ば、発作（ｓｔｒｏｋｅ）に関連したニューロン損傷を
減ずる際に使用するための組成物に、および、当該組成
物に含まれている新規ペプチドに関する。
ば、発作（ｓｔｒｏｋｅ）に関連したニューロン損傷を
減ずる際に使用するための組成物に、および、当該組成
物に含まれている新規ペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】中枢神経系（ＣＮＳ）に対する虚血損傷
は、全体的なまたは局部的な虚血状態から生じ得る。全
体的な虚血は、脳全体への血流がある時間止まる状態下
に起こり、例えば、心拍停止から生じ得る。局部的な虚
血は、脳の一部に、その通常の血液供給がない状態下に
起こり、例えば、大脳血管の血栓塞栓症による閉塞（ｏ
ｃｃｌｕｓｉｏｎ）、外傷性頭部損傷、水腫、および脳
腫瘍から生じ得る。
は、全体的なまたは局部的な虚血状態から生じ得る。全
体的な虚血は、脳全体への血流がある時間止まる状態下
に起こり、例えば、心拍停止から生じ得る。局部的な虚
血は、脳の一部に、その通常の血液供給がない状態下に
起こり、例えば、大脳血管の血栓塞栓症による閉塞（ｏ
ｃｃｌｕｓｉｏｎ）、外傷性頭部損傷、水腫、および脳
腫瘍から生じ得る。
【０００３】全体的および局部的な虚血状態は共に、た
とえ虚血状態が一時的であっても、広範囲にわたるニュ
ーロン損傷を引き起こす可能性を有する。永久的なニュ
ーロン損傷は、脳への血流の停止に続く最初の１分間に
生じ得、全体的および局部的な虚血における損傷の大部
分は、虚血の発症に続く数時間あるいは数日すらにわた
って起こる。このニューロン損傷の多くは、組織の再灌
流の二次的な結果、例えば、損傷した内皮による血管に
作用する生成物の放出および損傷した組織による細胞に
有毒な生成物（フリーラジカル、ロイコトリエンなど）
の放出に帰せられる。
とえ虚血状態が一時的であっても、広範囲にわたるニュ
ーロン損傷を引き起こす可能性を有する。永久的なニュ
ーロン損傷は、脳への血流の停止に続く最初の１分間に
生じ得、全体的および局部的な虚血における損傷の大部
分は、虚血の発症に続く数時間あるいは数日すらにわた
って起こる。このニューロン損傷の多くは、組織の再灌
流の二次的な結果、例えば、損傷した内皮による血管に
作用する生成物の放出および損傷した組織による細胞に
有毒な生成物（フリーラジカル、ロイコトリエンなど）
の放出に帰せられる。
【０００４】いくつかの薬物方法が、虚血に関連した発
作および別のニューロン状態の処置のために提案され、
そしてこれらは最近の論説（例えば、Ｗａｕｑｕｉｅ
ｒ）中で精査されている。抗凝血剤、例えば、ヘパリン
が検討されているが、雑多な結果である。
作および別のニューロン状態の処置のために提案され、
そしてこれらは最近の論説（例えば、Ｗａｕｑｕｉｅ
ｒ）中で精査されている。抗凝血剤、例えば、ヘパリン
が検討されているが、雑多な結果である。
【０００５】同様に、抗血管収縮剤、例えば、フルナラ
ジン（ｆｌｕｎａｒａｚｉｎｅ）、興奮性神経伝達物質
アンタゴニスト、例えば、ＭＫ−８０１およびＡＰ７、
ならびに抗水腫化合物は、神経毒神経病または感染に対
する高められた感受性を含む種々の副作用よりまさる明
らかな利点なしで、雑多な結果を示す。
ジン（ｆｌｕｎａｒａｚｉｎｅ）、興奮性神経伝達物質
アンタゴニスト、例えば、ＭＫ−８０１およびＡＰ７、
ならびに抗水腫化合物は、神経毒神経病または感染に対
する高められた感受性を含む種々の副作用よりまさる明
らかな利点なしで、雑多な結果を示す。
【０００６】血管拡張剤の２つの一般的な類が、ニュー
ロン虚血損傷の可能な処置のために研究されている。パ
パべリン、プロスタサイクリン、ペントキシフィリン
（ｐｅｎｔｏｘｉｆｙｌｌｉｎｅ）、およびニトロプル
シド（ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ）を含む非特異的な
血管拡張剤は、虚血損傷を減ずる際にいかなる明らかな
利点をも証明することはできなかった。血管拡張剤の第
二の一般的な類は、種々のカルシウム−アンタゴニスト
血管拡張薬物を含む。ベラパミルならびに、平滑筋およ
び横紋筋へのカルシウムの流入を妨げる関連化合物は、
重大な心臓毒性が続き得る高い薬物濃度でのみ有効であ
ると思われる。ジヒドロピリジン、例えば、ニモジピン
は、雑多な結果を生じる−−いくつかの神経学的改善が
見られ得るが、増加した大脳水腫も観察されている。ジ
ルチアゼムによって例示されるような、ベンゾチアゼピ
ンは、適度な保護作用を示すが、これらの薬物も、処置
に不利であり得る低血圧のような望ましくない副作用を
引き起こすと思われる。
ロン虚血損傷の可能な処置のために研究されている。パ
パべリン、プロスタサイクリン、ペントキシフィリン
（ｐｅｎｔｏｘｉｆｙｌｌｉｎｅ）、およびニトロプル
シド（ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ）を含む非特異的な
血管拡張剤は、虚血損傷を減ずる際にいかなる明らかな
利点をも証明することはできなかった。血管拡張剤の第
二の一般的な類は、種々のカルシウム−アンタゴニスト
血管拡張薬物を含む。ベラパミルならびに、平滑筋およ
び横紋筋へのカルシウムの流入を妨げる関連化合物は、
重大な心臓毒性が続き得る高い薬物濃度でのみ有効であ
ると思われる。ジヒドロピリジン、例えば、ニモジピン
は、雑多な結果を生じる−−いくつかの神経学的改善が
見られ得るが、増加した大脳水腫も観察されている。ジ
ルチアゼムによって例示されるような、ベンゾチアゼピ
ンは、適度な保護作用を示すが、これらの薬物も、処置
に不利であり得る低血圧のような望ましくない副作用を
引き起こすと思われる。
【０００７】要約すると、今日までのところ発作および
脳の別の虚血関連状態の処置のために提案されている薬
物は、（ｉ）比較的有効でない、（ｉｉ）望ましくない
副作用が観察される用量レベルでのみ有効である、およ
び／または（ｉｉｉ）薬物の潜在的有効性を傷つける、
全身性の作用、例えば、低血圧を生じる。
脳の別の虚血関連状態の処置のために提案されている薬
物は、（ｉ）比較的有効でない、（ｉｉ）望ましくない
副作用が観察される用量レベルでのみ有効である、およ
び／または（ｉｉｉ）薬物の潜在的有効性を傷つける、
全身性の作用、例えば、低血圧を生じる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】それ故、本発明の一般
的目的は、脳内の虚血損傷に関連したニューロン損傷を
処置するために有効な組成物を提供することである。
的目的は、脳内の虚血損傷に関連したニューロン損傷を
処置するために有効な組成物を提供することである。
【０００９】本発明の別の目的は、このようなニューロ
ン損傷を処置するための新規ペプチドを提供することで
ある。
ン損傷を処置するための新規ペプチドを提供することで
ある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明の薬学的組成物
は、哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロン細胞中
のノルエピネフリン放出を遮断する、およびニューロン
膜ω−コノトキシン（ＯＣＴ）ＭＶＩＩＡ結合部位に結
合する活性−それらは、ＯＣＴのＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡ
およびＴＶＩＡに関するこのような活性の範囲内にある
−を有するニューロン細胞カルシウムチャンネルアンタ
ゴニズトω−コノトキシンペプチドを包含する。当該ペ
プチドは、注射に適当なビヒクル中に保持される。
は、哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロン細胞中
のノルエピネフリン放出を遮断する、およびニューロン
膜ω−コノトキシン（ＯＣＴ）ＭＶＩＩＡ結合部位に結
合する活性−それらは、ＯＣＴのＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡ
およびＴＶＩＡに関するこのような活性の範囲内にある
−を有するニューロン細胞カルシウムチャンネルアンタ
ゴニズトω−コノトキシンペプチドを包含する。当該ペ
プチドは、注射に適当なビヒクル中に保持される。
【００１１】１つの好ましいＯＣＴペプチドは、形：Ｃ
ＫＧＫＧＡＸ1ＣＸ2ＲＸ3Ｘ4ＹＤＣＣＴＧＳＣＸ5ＲＸ6
ＧＫＣ−ｔ〔但し、Ｘ1＝ＫまたはＳ；Ｘ2＝Ｓまたは
Ｈ；Ｘ3＝ＬまたはＴ；Ｘ4＝ＭまたはＳ；Ｘ5＝Ｎまた
は欠落；Ｘ6＝Ｓまたは欠落；そしてｔはカルボキシま
たはアミド化カルボキシ末端基である。〕を有してい
る。
ＫＧＫＧＡＸ1ＣＸ2ＲＸ3Ｘ4ＹＤＣＣＴＧＳＣＸ5ＲＸ6
ＧＫＣ−ｔ〔但し、Ｘ1＝ＫまたはＳ；Ｘ2＝Ｓまたは
Ｈ；Ｘ3＝ＬまたはＴ；Ｘ4＝ＭまたはＳ；Ｘ5＝Ｎまた
は欠落；Ｘ6＝Ｓまたは欠落；そしてｔはカルボキシま
たはアミド化カルボキシ末端基である。〕を有してい
る。
【００１２】もう１つの好ましいＯＣＴペプチドは、
形：ＣＸ1ＳＸＧＳＳＣＳＸＴＳＹＮＣＣＲＳＣＮＸＹ
Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＣＸ5−ｔ〔但し、Ｘ1＝ＫまたはＬ；Ｘ2＝Ｔ
またはＳ；Ｘ3＝ＫまたはＲ；Ｘ4＝ＲまたはＫ；Ｘ5＝
ＹまたはＲ；そしてｔ＝カルボキシまたはアミド化カル
ボキシ末端基である。〕を有している。
形：ＣＸ1ＳＸＧＳＳＣＳＸＴＳＹＮＣＣＲＳＣＮＸＹ
Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＣＸ5−ｔ〔但し、Ｘ1＝ＫまたはＬ；Ｘ2＝Ｔ
またはＳ；Ｘ3＝ＫまたはＲ；Ｘ4＝ＲまたはＫ；Ｘ5＝
ＹまたはＲ；そしてｔ＝カルボキシまたはアミド化カル
ボキシ末端基である。〕を有している。
【００１３】より一般的に、当該組成物は、哺乳動物の
ＣＮＳニューロン細胞からのノルエプネフリンの放出を
阻害する、およびニューロン膜ω−コノトキシンＭＶＩ
ＩＡ結合部位に結合する活性を、ＯＣＴのＭＶＩＩＡ，
ＧＶＩＡおよびＴＶＩＡに関するこのような活性の範囲
内にある活性で、有するニューロン細胞カルシウムチャ
ンネルアンタゴニスト化合物を含む。当該化合物は、適
当な薬学的ビヒクル中に保持される。
ＣＮＳニューロン細胞からのノルエプネフリンの放出を
阻害する、およびニューロン膜ω−コノトキシンＭＶＩ
ＩＡ結合部位に結合する活性を、ＯＣＴのＭＶＩＩＡ，
ＧＶＩＡおよびＴＶＩＡに関するこのような活性の範囲
内にある活性で、有するニューロン細胞カルシウムチャ
ンネルアンタゴニスト化合物を含む。当該化合物は、適
当な薬学的ビヒクル中に保持される。
【００１４】１つの実施態様において、ＭＶＩＩＡ部位
に対する当該化合物の結合活性は、当該化合物によるニ
ューロン膜からのＯＣＴ ＭＶＩＩＡの競合的置換によ
って求められる結合定数によって特徴づけられる。
に対する当該化合物の結合活性は、当該化合物によるニ
ューロン膜からのＯＣＴ ＭＶＩＩＡの競合的置換によ
って求められる結合定数によって特徴づけられる。
【００１５】第二の実施態様において、結合活性は、ニ
ューロン細胞ＯＣＴ ＳＶＩＢ部位およびニューロン細
胞ＯＣＴ ＭＶＩＩＡ部位に結合する化合物に関する結
合定数の比によって特徴づけられる。
ューロン細胞ＯＣＴ ＳＶＩＢ部位およびニューロン細
胞ＯＣＴ ＭＶＩＩＡ部位に結合する化合物に関する結
合定数の比によって特徴づけられる。
【００１６】本発明はさらに、Ｘ1＝Ｋ，Ｘ2＝Ｓ，Ｘ3
＝Ｌ，Ｘ4＝Ｍ，Ｘ5＝欠落、そしてＸ6＝Ｓ、およびＸ1
＝Ｓ，Ｘ2＝Ｈ，Ｘ3＝Ｔ，Ｘ4＝Ｓ，Ｘ5＝Ｎ、そしてＸ
6＝欠落のペプチドを除く、形：ＣＫＧＫＧＡＸ1ＣＸ2
ＲＸ3Ｘ4ＹＤＣＣＴＧＳＣＸ5ＲＸ6ＧＫＣ−ｔ〔但し、
Ｘ1＝ＫまたはＳ；Ｘ2＝ＳまたはＨ；Ｘ3＝Ｌまたは
Ｔ；Ｘ4＝ＭまたはＳ；Ｘ5＝Ｎまたは欠落；Ｘ6＝Ｓま
たは欠落；そしてｔ＝カルボキシまたはアミド化カルボ
キシ末端基〕、または、Ｘ1＝Ｋ，Ｘ2＝Ｔ，Ｘ3 ＝Ｋ，
Ｘ4＝Ｒ、そしてＸ5＝Ｙ；およびＸ1＝Ｌ，Ｘ2＝Ｓ，Ｘ
3＝Ｒ，Ｘ4＝Ｋ、そしてＸ5＝Ｒのペプチドを除く、
形：ＣＸ1ＳＸＧＳＳＣＳＸＴＳＹＮＣＣＲＳＣＮＸＹ
Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＣＸ5−ｔ〔但し、Ｘ1＝ＫまたはＬ；Ｘ2＝Ｔ
またはＳ；Ｘ3 ＝ＫまたはＲ；Ｘ4＝ＲまたはＫ；Ｘ5＝
ＹまたはＲ；そしてｔ＝カルボキシまたはアミド化カル
ボキシ末端基〕を有するＯＣＴペプチドを含む。
＝Ｌ，Ｘ4＝Ｍ，Ｘ5＝欠落、そしてＸ6＝Ｓ、およびＸ1
＝Ｓ，Ｘ2＝Ｈ，Ｘ3＝Ｔ，Ｘ4＝Ｓ，Ｘ5＝Ｎ、そしてＸ
6＝欠落のペプチドを除く、形：ＣＫＧＫＧＡＸ1ＣＸ2
ＲＸ3Ｘ4ＹＤＣＣＴＧＳＣＸ5ＲＸ6ＧＫＣ−ｔ〔但し、
Ｘ1＝ＫまたはＳ；Ｘ2＝ＳまたはＨ；Ｘ3＝Ｌまたは
Ｔ；Ｘ4＝ＭまたはＳ；Ｘ5＝Ｎまたは欠落；Ｘ6＝Ｓま
たは欠落；そしてｔ＝カルボキシまたはアミド化カルボ
キシ末端基〕、または、Ｘ1＝Ｋ，Ｘ2＝Ｔ，Ｘ3 ＝Ｋ，
Ｘ4＝Ｒ、そしてＸ5＝Ｙ；およびＸ1＝Ｌ，Ｘ2＝Ｓ，Ｘ
3＝Ｒ，Ｘ4＝Ｋ、そしてＸ5＝Ｒのペプチドを除く、
形：ＣＸ1ＳＸＧＳＳＣＳＸＴＳＹＮＣＣＲＳＣＮＸＹ
Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＣＸ5−ｔ〔但し、Ｘ1＝ＫまたはＬ；Ｘ2＝Ｔ
またはＳ；Ｘ3 ＝ＫまたはＲ；Ｘ4＝ＲまたはＫ；Ｘ5＝
ＹまたはＲ；そしてｔ＝カルボキシまたはアミド化カル
ボキシ末端基〕を有するＯＣＴペプチドを含む。
【００１７】未だ別の面で、本発明は、哺乳動物種にお
ける、例えば、発作により生ずるような、虚血関連ニュ
ーロン損傷を減ずるのに有効なカルシウムチャンネルア
ンタゴニスト化合物を選択する方法を含む。当該化合物
は、ニューロン細胞ＯＣＴＭＶＩＩＡ結合部位に対する
その親和性について、および、哺乳動物のＣＮＳニュー
ロン細胞中のノルエピネフリン放出を阻害するその能力
についてアッセイされる。アッセイした化合物は、も
し、ＣＮＳニューロン細胞からのノルエピネフリン放出
に関する、およびニューロン膜ω−コノトキシンＭＶＩ
ＩＡ結合部位への結合に関するその活性が、ＯＣＴのＭ
ＶＩＩＡ，ＧＶＩＡ，およびＴＶＩＡに関するこのよう
な活性の範囲内にあるならば、このような処置において
使用するために選択される。
ける、例えば、発作により生ずるような、虚血関連ニュ
ーロン損傷を減ずるのに有効なカルシウムチャンネルア
ンタゴニスト化合物を選択する方法を含む。当該化合物
は、ニューロン細胞ＯＣＴＭＶＩＩＡ結合部位に対する
その親和性について、および、哺乳動物のＣＮＳニュー
ロン細胞中のノルエピネフリン放出を阻害するその能力
についてアッセイされる。アッセイした化合物は、も
し、ＣＮＳニューロン細胞からのノルエピネフリン放出
に関する、およびニューロン膜ω−コノトキシンＭＶＩ
ＩＡ結合部位への結合に関するその活性が、ＯＣＴのＭ
ＶＩＩＡ，ＧＶＩＡ，およびＴＶＩＡに関するこのよう
な活性の範囲内にあるならば、このような処置において
使用するために選択される。
【００１８】本発明のこれらのおよび別の目的および特
徴は、本発明の以下の詳細な説明が、添付した図面と関
連して読まれるとき、より完全に明らかになるであろ
う。
徴は、本発明の以下の詳細な説明が、添付した図面と関
連して読まれるとき、より完全に明らかになるであろ
う。
【００１９】
【発明の実施の形態】１．ＯＣＴペプチド ω−コノトキシン（ＯＣＴ）ペプチドは、イモガイ（Ｃ
ｏｎｕｓ）属の海生巻貝により生産されるペプチド毒素
であり、そしてそれは、カルシウムチャンネル遮断薬と
して作用する。イモガイ属中の、約５００種の円錐状の
巻貝は確認されており、そして、これらの種のいくつか
から種々のＯＣＴペプチドが単離されている。いくつか
の天然のＯＣＴペプチドの一次配列が、図１に示されて
いる。慣用の文字イニシアルが、アミノ酸残基について
使用され、そしてＸは、４−ヒドロキシプロリンを表
し、４Ｈｙｐとも略書される。図中に示されている全て
のペプチドは、それらのＣ末端でアミド化されている。
ｏｎｕｓ）属の海生巻貝により生産されるペプチド毒素
であり、そしてそれは、カルシウムチャンネル遮断薬と
して作用する。イモガイ属中の、約５００種の円錐状の
巻貝は確認されており、そして、これらの種のいくつか
から種々のＯＣＴペプチドが単離されている。いくつか
の天然のＯＣＴペプチドの一次配列が、図１に示されて
いる。慣用の文字イニシアルが、アミノ酸残基について
使用され、そしてＸは、４−ヒドロキシプロリンを表
し、４Ｈｙｐとも略書される。図中に示されている全て
のペプチドは、それらのＣ末端でアミド化されている。
【００２０】ペプチドの同定する名称は、図中に同様に
示されており、そしてこれらの名称は本明細書において
特定のＯＣＴペプチドに関連して使用されるであろう。
例えば、配列がＭＶＩＩＡと称されるペプチドは、本明
細書においてＯＣＴ ＭＶＩＩＡと呼ばれる。ＯＣＴ
ＭＶＩＩＡおよびＯＣＴ ＧＶＩＡペプチドは、それぞ
れ、一般の名称ＣｍＴｘおよびＣｇＴｘをも有する。Ｏ
ＣＴペプチドの全ては、ＭＶＩＩＡペプチドについて示
されているように、システイン残基１および４、２およ
び５、そして３および６をつなぐ３つのジスルフィド結
合を有する。
示されており、そしてこれらの名称は本明細書において
特定のＯＣＴペプチドに関連して使用されるであろう。
例えば、配列がＭＶＩＩＡと称されるペプチドは、本明
細書においてＯＣＴ ＭＶＩＩＡと呼ばれる。ＯＣＴ
ＭＶＩＩＡおよびＯＣＴ ＧＶＩＡペプチドは、それぞ
れ、一般の名称ＣｍＴｘおよびＣｇＴｘをも有する。Ｏ
ＣＴペプチドの全ては、ＭＶＩＩＡペプチドについて示
されているように、システイン残基１および４、２およ
び５、そして３および６をつなぐ３つのジスルフィド結
合を有する。
【００２１】図２は、本発明により合成されそして試験
された、天然のＯＣＴ ＭＶＩＩＡ、ＯＣＴ ＧＶＩ
Ａ、およびＳＶＩＢペプチドの類似体を示している。標
準の単一アミノ酸コード文字が図中で使用されている；
Ｘ＝ヒドロキシプロリン；Ｎｌｅ＝ノルロイシン；Ｃ末
端のＮＨ2基は、ペプチドが、Ｃ末端アミノ化されてい
ることを示している；Ｇ−ＯＨは、未変性グリシン残基
中の末端を示している。
された、天然のＯＣＴ ＭＶＩＩＡ、ＯＣＴ ＧＶＩ
Ａ、およびＳＶＩＢペプチドの類似体を示している。標
準の単一アミノ酸コード文字が図中で使用されている；
Ｘ＝ヒドロキシプロリン；Ｎｌｅ＝ノルロイシン；Ｃ末
端のＮＨ2基は、ペプチドが、Ｃ末端アミノ化されてい
ることを示している；Ｇ−ＯＨは、未変性グリシン残基
中の末端を示している。
【００２２】ＯＣＴペプチド、例えば、図１および２に
示されているようなものは、開示されているような（Ｒ
ｉｖｉｅｒ）慣用の固体相方法によって合成され得る。
手短に言えば、Ｎ−α−保護アミノ酸無水物を、結晶形
で調製しそしてＮ末端への連続するアミノ酸付加に使用
する。各残基の付加で、成長するペプチド（固体保持体
上）を酸処理してＮ−α−保護基を除去し、数回洗浄し
て残った酸を除去する、そして反応媒体へのペプチド末
端の接近性を増進する。次いで当該ペプチドを、活性化
したＮ−保護アミノ酸対称無水物と反応させ、そして固
体保持体を洗浄する。各残基付加工程で、アミノ酸付加
反応は、２または３の個々の付加反応の全てについて繰
り返され得、反応される、成長するペプチド分子の割合
を高める。一般に、１〜２の反応サイクルが、第一の１
２の残基付加に、そして２〜３の反応サイクルが、残り
の残基のために使用される。
示されているようなものは、開示されているような（Ｒ
ｉｖｉｅｒ）慣用の固体相方法によって合成され得る。
手短に言えば、Ｎ−α−保護アミノ酸無水物を、結晶形
で調製しそしてＮ末端への連続するアミノ酸付加に使用
する。各残基の付加で、成長するペプチド（固体保持体
上）を酸処理してＮ−α−保護基を除去し、数回洗浄し
て残った酸を除去する、そして反応媒体へのペプチド末
端の接近性を増進する。次いで当該ペプチドを、活性化
したＮ−保護アミノ酸対称無水物と反応させ、そして固
体保持体を洗浄する。各残基付加工程で、アミノ酸付加
反応は、２または３の個々の付加反応の全てについて繰
り返され得、反応される、成長するペプチド分子の割合
を高める。一般に、１〜２の反応サイクルが、第一の１
２の残基付加に、そして２〜３の反応サイクルが、残り
の残基のために使用される。
【００２３】成長するペプチド鎖を完全なものにした
後、保護したペプチド樹脂を液体フッ化水素酸で処理し
て保持体からペプチドを脱ブロック化し（ｄｅｂｌｏｃ
ｋ）そして遊離する。アミド化ペプチドの調製のため
に、環からのペプチド開裂後、合成の際に使用される樹
脂保持体を選択してＣ末端アミンを供給する。
後、保護したペプチド樹脂を液体フッ化水素酸で処理し
て保持体からペプチドを脱ブロック化し（ｄｅｂｌｏｃ
ｋ）そして遊離する。アミド化ペプチドの調製のため
に、環からのペプチド開裂後、合成の際に使用される樹
脂保持体を選択してＣ末端アミンを供給する。
【００２４】ペプチド中の３つのジスルフィド結合は、
ジチオトレイトール（ＤＴＴ）存在下に室温でまたは４
℃で延長された反応期間にわたって空気酸化により形成
され得る。代わりに、正しいまたは所望の架橋がランダ
ム酸化によって達成され得ない場合、ブリッジが連続的
に、１度に１つのブリッジが形成される化学的直接方法
が使用され得る。以下の側鎖保護基が、システイン残基
の各対のために使用され得る：４−メチルベンジル、エ
チルカルバモイル、およびアセトアミドメチル。これら
の保護基は、保護基のどの１つの種類もが他の２つに影
響を与えない条件下で除去され得る、直交するセットを
構成する。方法は、ここでは、保護基の１つの種類をシ
ステイン残基の対から除去し、次いで酸化して第一のジ
スルフィドブリッジを形成することを包含している。保
護基の第二の種類を次いで除去し、再度酸化して第二の
ブリッジを形成する。第三ブリッジは同様の方法で形成
される。
ジチオトレイトール（ＤＴＴ）存在下に室温でまたは４
℃で延長された反応期間にわたって空気酸化により形成
され得る。代わりに、正しいまたは所望の架橋がランダ
ム酸化によって達成され得ない場合、ブリッジが連続的
に、１度に１つのブリッジが形成される化学的直接方法
が使用され得る。以下の側鎖保護基が、システイン残基
の各対のために使用され得る：４−メチルベンジル、エ
チルカルバモイル、およびアセトアミドメチル。これら
の保護基は、保護基のどの１つの種類もが他の２つに影
響を与えない条件下で除去され得る、直交するセットを
構成する。方法は、ここでは、保護基の１つの種類をシ
ステイン残基の対から除去し、次いで酸化して第一のジ
スルフィドブリッジを形成することを包含している。保
護基の第二の種類を次いで除去し、再度酸化して第二の
ブリッジを形成する。第三ブリッジは同様の方法で形成
される。
【００２５】当該ペプチドは、ゲル濾過による最初の分
離により単離され得、ペプチド二量体およびより高度な
ポリマーを除去し、そして同様に、酸化反応において使
用される、望ましくない塩、例えば、グアニジン塩酸塩
を除去する。
離により単離され得、ペプチド二量体およびより高度な
ポリマーを除去し、そして同様に、酸化反応において使
用される、望ましくない塩、例えば、グアニジン塩酸塩
を除去する。
【００２６】不十分に精製したペプチドをさらに、分取
ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより精製し、そして当該
ペプチドの純度をアミノ酸組成物分析により確認する。
ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより精製し、そして当該
ペプチドの純度をアミノ酸組成物分析により確認する。
【００２７】ＩＩ．神経保護化合物 このセクションは、本発明による、ＯＣＴペプチドによ
って例示されるような、虚血関連ニューロン損傷を減ず
るのに有効である化合物の試験管内阻害および結合特性
を記載している。以下のセクションＶに記載されている
ように、試験管内阻害および結合特性は、神経保護化合
物の選択の際に使用できる。
って例示されるような、虚血関連ニューロン損傷を減ず
るのに有効である化合物の試験管内阻害および結合特性
を記載している。以下のセクションＶに記載されている
ように、試験管内阻害および結合特性は、神経保護化合
物の選択の際に使用できる。
【００２８】Ａ．カルシウムチャンネルアンタゴニスト
活性 本発明の神経保護化合物は、ニューロン細胞中の電圧ゲ
ートイオン電流を阻害するそれらの活性によって定義さ
れるような、ニューロン細胞カルシウムチャンネルアン
タゴニストである。
活性 本発明の神経保護化合物は、ニューロン細胞中の電圧ゲ
ートイオン電流を阻害するそれらの活性によって定義さ
れるような、ニューロン細胞カルシウムチャンネルアン
タゴニストである。
【００２９】電圧ゲートカルシウムチャンネルは、ニュ
ーロン中、そして、心筋、平滑筋、および骨格筋ならび
に別の興奮性細胞中に存在し、そして膜興奮、筋収縮、
および細胞分泌中、例えば、シナプス伝達中で種々の役
割を果たすことが知られている（ＭｃＣｌｅｓｋｅ
ｙ）。ニューロン細胞中で、電圧ゲートカルシウムチャ
ンネルは、それぞれ、神経化学により、特徴的なゲート
電圧（ｇａｔｉｎｇｖｏｌｔａｇｅ）、不活性化速度、
および選択的変調を有するＬ、Ｔ、およびＮチャンネル
に分類されている（Ｎｏｗｖｃｋｙ）。
ーロン中、そして、心筋、平滑筋、および骨格筋ならび
に別の興奮性細胞中に存在し、そして膜興奮、筋収縮、
および細胞分泌中、例えば、シナプス伝達中で種々の役
割を果たすことが知られている（ＭｃＣｌｅｓｋｅ
ｙ）。ニューロン細胞中で、電圧ゲートカルシウムチャ
ンネルは、それぞれ、神経化学により、特徴的なゲート
電圧（ｇａｔｉｎｇｖｏｌｔａｇｅ）、不活性化速度、
および選択的変調を有するＬ、Ｔ、およびＮチャンネル
に分類されている（Ｎｏｗｖｃｋｙ）。
【００３０】電圧ゲートニューロンカルシウムチャンネ
ルの阻害（遮断）を試験する１つの適当なシステムは、
マウス神経芽細胞腫細胞系，Ｎ１Ｅ１１５系である。膜
電流は、通常、実施例１に詳述されている方法に従っ
て、パッチクランプ法の全細胞形状（ｃｏｎｆｉｇｕｒ
ａｔｉｏｎ）を用いて測定される。
ルの阻害（遮断）を試験する１つの適当なシステムは、
マウス神経芽細胞腫細胞系，Ｎ１Ｅ１１５系である。膜
電流は、通常、実施例１に詳述されている方法に従っ
て、パッチクランプ法の全細胞形状（ｃｏｎｆｉｇｕｒ
ａｔｉｏｎ）を用いて測定される。
【００３１】手短に言えば、細胞電位が約−１００ｍＶ
の保持電圧から−６０ｍＶ〜＋２０ｍＶの範囲にある試
験電位まで進められる電圧クランププロトコールが行わ
れ、そして細胞は、当該保持電位でパルスの間５秒間保
持された。
の保持電圧から−６０ｍＶ〜＋２０ｍＶの範囲にある試
験電位まで進められる電圧クランププロトコールが行わ
れ、そして細胞は、当該保持電位でパルスの間５秒間保
持された。
【００３２】図３は、−８０ｍＶ〜−２０ｍＶの電位段
階によって引き出される典型的な内向きのカルシウム電
流を示している。これ、および記録の大部分において、
シグナルを増加するために、Ｃａに代わってＢａが、カ
ルシウムチャンネルを通じて、電荷キャリヤーとなった
（ＭｃＣｌｅｓｋｅｙ）。実施例１に記載した手順によ
れば、Ｎ１Ｅ１１５神経芽細胞腫細胞は、ナトリウムに
代えてＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＮＭＤＧ）、およ
び２ｍＭ Ｃａの代わりに１０ｍＭ Ｂａを有する塩類
溶液中に浸された。これらの置換は、どちらかといえば
カルシウム電流記録を汚染するであろうナトリウム電流
を減じ、そして浴中２ｍＭ Ｃａのみの場合より高くカ
ルシウム電流を高めた。カリウム電流は、浴中のＴＥＡ
およびピペット溶液中のＣｓによって遮断された。
階によって引き出される典型的な内向きのカルシウム電
流を示している。これ、および記録の大部分において、
シグナルを増加するために、Ｃａに代わってＢａが、カ
ルシウムチャンネルを通じて、電荷キャリヤーとなった
（ＭｃＣｌｅｓｋｅｙ）。実施例１に記載した手順によ
れば、Ｎ１Ｅ１１５神経芽細胞腫細胞は、ナトリウムに
代えてＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＮＭＤＧ）、およ
び２ｍＭ Ｃａの代わりに１０ｍＭ Ｂａを有する塩類
溶液中に浸された。これらの置換は、どちらかといえば
カルシウム電流記録を汚染するであろうナトリウム電流
を減じ、そして浴中２ｍＭ Ｃａのみの場合より高くカ
ルシウム電流を高めた。カリウム電流は、浴中のＴＥＡ
およびピペット溶液中のＣｓによって遮断された。
【００３３】図３，曲線Ａから明らかなように、カルシ
ウム電流は素早く（約２０ｍｓ内に）活性化しそして３
０〜４０ｍｓの時間定数で不活性化する。カルシウム電
流は、脱分極ピークによって引き出されたピークの内向
きの電流の振幅によって測定され、そして約−１２００
ｐＡの測定値を有する。図３（曲線Ａ）中の細胞は、神
経芽細胞腫細胞中のＬ型カルシウムチャンネルを有効に
遮断することを予期される１μＭニフェジピン，ジヒド
ロピリジンにもさらされ、そして測定されたカルシウム
電流に対する影響は全く観察されなかった。観察された
カルシウム電流は従って主としてＮ型カルシウムチャン
ネル電流であることが予期される。
ウム電流は素早く（約２０ｍｓ内に）活性化しそして３
０〜４０ｍｓの時間定数で不活性化する。カルシウム電
流は、脱分極ピークによって引き出されたピークの内向
きの電流の振幅によって測定され、そして約−１２００
ｐＡの測定値を有する。図３（曲線Ａ）中の細胞は、神
経芽細胞腫細胞中のＬ型カルシウムチャンネルを有効に
遮断することを予期される１μＭニフェジピン，ジヒド
ロピリジンにもさらされ、そして測定されたカルシウム
電流に対する影響は全く観察されなかった。観察された
カルシウム電流は従って主としてＮ型カルシウムチャン
ネル電流であることが予期される。
【００３４】ＯＣＴのＭＶＩＩＡおよびＧＶＩＡの増加
する用量に対する、電圧ゲートカルシウム電流の応答が
図４に示されている。カルシウム電流の５０％阻害が引
き起こされるＥＤ50濃度は、電圧ゲート電流振幅から決
定され、ＯＣＴペプチド濃度の関数としてプロットされ
る。計算されたＥＤ50は、高い阻害ペプチド活性を示
し、ＧＶＩＡについて１２ｎＭそしてＭＶＩＩＡについ
て１１６ｎＭである。これらならびにＯＣＴペプチドＳ
ＶＩＡおよびＳＶＩＢに関するＥＤ50濃度は以下の表１
に示されている。以下のセクションＩＩＩにおいて理解
されるであろうように、比較的低いＩＣ50値（１μＭ以
下）を有する２つの化合物は、両方とも、神経保護剤と
して活性であり、他方、この閾値より高いＩＣ50を有す
るＯＣＴＳＶＩＡおよびＳＶＩＢはない。より一般的に
は、本発明の化合物は例１に詳述されたアッセイ中約１
μＭより低いＥＤ50値で電圧ゲートカルシウムチャンネ
ル電流を阻害するそれらの能力により、電圧ゲートカル
シウムチャンネルのアンタゴニストとして分類される。
する用量に対する、電圧ゲートカルシウム電流の応答が
図４に示されている。カルシウム電流の５０％阻害が引
き起こされるＥＤ50濃度は、電圧ゲート電流振幅から決
定され、ＯＣＴペプチド濃度の関数としてプロットされ
る。計算されたＥＤ50は、高い阻害ペプチド活性を示
し、ＧＶＩＡについて１２ｎＭそしてＭＶＩＩＡについ
て１１６ｎＭである。これらならびにＯＣＴペプチドＳ
ＶＩＡおよびＳＶＩＢに関するＥＤ50濃度は以下の表１
に示されている。以下のセクションＩＩＩにおいて理解
されるであろうように、比較的低いＩＣ50値（１μＭ以
下）を有する２つの化合物は、両方とも、神経保護剤と
して活性であり、他方、この閾値より高いＩＣ50を有す
るＯＣＴＳＶＩＡおよびＳＶＩＢはない。より一般的に
は、本発明の化合物は例１に詳述されたアッセイ中約１
μＭより低いＥＤ50値で電圧ゲートカルシウムチャンネ
ル電流を阻害するそれらの能力により、電圧ゲートカル
シウムチャンネルのアンタゴニストとして分類される。
【００３５】
【表１】 神経細胞カルシウム電流について抑制する試験ペプエチ
ドはさらにカルシウム電流を遮断する際のペプチド活性
がニューロン細胞に特異的であることを確認するため
に、非ニューロン細胞中で試験され得る。ＯＣＴによる
カルシウム電流阻害に無反応性である種々の筋細胞、例
えば、脊椎動物胎児心筋および骨格筋細胞が適してい
る。細胞電流測定は、実質的に、上に概説されそして実
施例１に詳述されているようになされる。例えば、ＯＣ
Ｔ ＭＶＩＩＡは、後根ガングリオン（ｄｏｒｓａｌ
ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉｏｎ）（ＤＲＧ）ニューロンを
含む、種々のニューロン細胞中の電圧ゲートカルシウム
チャンネルを遮断することが報告されている（ＭｃＣｌ
ｅｓｋｅｙ）。カルシウムチャンネル電流のこの遮断ま
たは阻害は、ペプチドによるカルシウム電流阻害は、心
筋、平滑筋、および骨格筋において観察されなかったの
で、ニューロン特異的であることが報告されている。
ドはさらにカルシウム電流を遮断する際のペプチド活性
がニューロン細胞に特異的であることを確認するため
に、非ニューロン細胞中で試験され得る。ＯＣＴによる
カルシウム電流阻害に無反応性である種々の筋細胞、例
えば、脊椎動物胎児心筋および骨格筋細胞が適してい
る。細胞電流測定は、実質的に、上に概説されそして実
施例１に詳述されているようになされる。例えば、ＯＣ
Ｔ ＭＶＩＩＡは、後根ガングリオン（ｄｏｒｓａｌ
ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉｏｎ）（ＤＲＧ）ニューロンを
含む、種々のニューロン細胞中の電圧ゲートカルシウム
チャンネルを遮断することが報告されている（ＭｃＣｌ
ｅｓｋｅｙ）。カルシウムチャンネル電流のこの遮断ま
たは阻害は、ペプチドによるカルシウム電流阻害は、心
筋、平滑筋、および骨格筋において観察されなかったの
で、ニューロン特異的であることが報告されている。
【００３６】Ｂ．ノルエピネフリン放出の選択的阻害 本発明による、神経保護化合物の第二の必要な特性な、
脳（ＣＮＳ）ニューロン細胞中の脱分極誘発およびカル
シウム依存ノルエピネフリン放出を特異的に阻害する
が、しかし骨格筋の哺乳動物神経筋接合部での神経伝達
物質放出を阻害しない能力である。ニューロン細胞中の
ノルエピネフリン放出の阻害は、実施例２に詳述されて
いるように、標準方法により哺乳動物脳海馬スライスに
おいてアッセイされ得る。手短に言えば、海馬スライス
をミクロ力価プレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ ｐｌａ
ｔｅ）の個々のウエルに分布しそして細胞接種に好都合
である条件下に放射能標識化ノルエピネフリンと共にイ
ンキュベーションする。細胞を低カリウム媒体で洗浄
し、次いで、１５分間刺激媒体中に、試験化合物の選択
された濃度の存在下に浸す。興奮緩衝液の除去後、各ス
ライス中に残っている放射能を測定する。
脳（ＣＮＳ）ニューロン細胞中の脱分極誘発およびカル
シウム依存ノルエピネフリン放出を特異的に阻害する
が、しかし骨格筋の哺乳動物神経筋接合部での神経伝達
物質放出を阻害しない能力である。ニューロン細胞中の
ノルエピネフリン放出の阻害は、実施例２に詳述されて
いるように、標準方法により哺乳動物脳海馬スライスに
おいてアッセイされ得る。手短に言えば、海馬スライス
をミクロ力価プレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ ｐｌａ
ｔｅ）の個々のウエルに分布しそして細胞接種に好都合
である条件下に放射能標識化ノルエピネフリンと共にイ
ンキュベーションする。細胞を低カリウム媒体で洗浄
し、次いで、１５分間刺激媒体中に、試験化合物の選択
された濃度の存在下に浸す。興奮緩衝液の除去後、各ス
ライス中に残っている放射能を測定する。
【００３７】図５は、先ず、通常の洗浄溶液（白地
棒）、次いで、興奮媒体（黒地棒）に浸したラット脳海
馬スライスからのノルエピネフリン放出に関する、ＯＣ
Ｔ ＭＶＩＩＡペプチドの増加する濃度の効果を示して
いる。理解されるように、当該化合物は、興奮媒体の存
在下にノルエピネフリン放出の強い用量依存阻害を引き
起こすが、興奮媒体の不存在下には引き起こさない。用
量依存阻害データから、エピネフリン放出の５０％阻害
を引き起こすのに有効な化合物濃度が計算される。
棒）、次いで、興奮媒体（黒地棒）に浸したラット脳海
馬スライスからのノルエピネフリン放出に関する、ＯＣ
Ｔ ＭＶＩＩＡペプチドの増加する濃度の効果を示して
いる。理解されるように、当該化合物は、興奮媒体の存
在下にノルエピネフリン放出の強い用量依存阻害を引き
起こすが、興奮媒体の不存在下には引き起こさない。用
量依存阻害データから、エピネフリン放出の５０％阻害
を引き起こすのに有効な化合物濃度が計算される。
【００３８】この方法により試験された種々のＯＣＴペ
プチドに関する表２中に示されたＩＣ50値は、薄い（２
００μ）および厚い（４００μ）海馬スライスから計算
された平均ＩＣ50値を表している。０.８〜２.４ｎＭの
間の、３つの最も低いＩＣ50 値は、著しい神経保護活性
を示すＯＣＴペプチドに対応している（以下のセクショ
ンＩＩＩ）。ＯＣＴペプチドＭＶＩＩＡ（１９５）およ
びＭＶＩＩＡ（２０１）は、以下のセクションＩＶにお
いて検討されているように、キー残基部位（図２）にア
ミノ酸置換または変性を有するＭＶＩＩＡである。この
変性ペプチドについて測定された、より高いＩＣ50値
は、神経保護活性の実質的減少または損失に反映され
る。ＳＶＩＡおよびＳＶＩＢ ＯＣＴペプチドは、神経
保護活性を示さないＯＣＴ化合物を代表しており、そし
てこれは、ノルエピネフリン放出に関する高いＩＣ50値
によって反映されている。ＳＶＩＢ（２０２）ペプチド
は、ＭＶＩＩＡ ＯＣＴ中位置９〜１２のＳｅｒ−Ａｒ
ｇ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ残基をＳＶＩＢ ＯＣＴ中の同一位
置のＡｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ残基の代わりに用
いる、ＳＶＩＢペプチドの変性である。この変性は、ノ
ルエピネフリン放出の阻害に関するＩＣ50値を著しく減
じ、そして弱い神経保護活性しか観察されなかった。
プチドに関する表２中に示されたＩＣ50値は、薄い（２
００μ）および厚い（４００μ）海馬スライスから計算
された平均ＩＣ50値を表している。０.８〜２.４ｎＭの
間の、３つの最も低いＩＣ50 値は、著しい神経保護活性
を示すＯＣＴペプチドに対応している（以下のセクショ
ンＩＩＩ）。ＯＣＴペプチドＭＶＩＩＡ（１９５）およ
びＭＶＩＩＡ（２０１）は、以下のセクションＩＶにお
いて検討されているように、キー残基部位（図２）にア
ミノ酸置換または変性を有するＭＶＩＩＡである。この
変性ペプチドについて測定された、より高いＩＣ50値
は、神経保護活性の実質的減少または損失に反映され
る。ＳＶＩＡおよびＳＶＩＢ ＯＣＴペプチドは、神経
保護活性を示さないＯＣＴ化合物を代表しており、そし
てこれは、ノルエピネフリン放出に関する高いＩＣ50値
によって反映されている。ＳＶＩＢ（２０２）ペプチド
は、ＭＶＩＩＡ ＯＣＴ中位置９〜１２のＳｅｒ−Ａｒ
ｇ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ残基をＳＶＩＢ ＯＣＴ中の同一位
置のＡｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ残基の代わりに用
いる、ＳＶＩＢペプチドの変性である。この変性は、ノ
ルエピネフリン放出の阻害に関するＩＣ50値を著しく減
じ、そして弱い神経保護活性しか観察されなかった。
【００３９】
【表２】 要約すると、著しい神経保護活性は、０.８〜２.４ｎＭ
範囲中のＩＣ50で、そしてより一般的には、活性なＯＣ
ＴのＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡ，およびＴＶＩＡについて測
定されたＩＣ50値の範囲内にあるＩＣ50値；即ち、これ
らの活性なＯＣＴペプチドについて測定された最も大き
いＩＣ50値未満で、ノルエピネフリン放出を阻害する能
力に関連している。この範囲のわずかに外側のＩＣ50値
を持つ化合物は、中位〜低い神経保護活性を有し得、そ
して、高いＩＣ50値を持つ化合物は神経保護しない。
範囲中のＩＣ50で、そしてより一般的には、活性なＯＣ
ＴのＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡ，およびＴＶＩＡについて測
定されたＩＣ50値の範囲内にあるＩＣ50値；即ち、これ
らの活性なＯＣＴペプチドについて測定された最も大き
いＩＣ50値未満で、ノルエピネフリン放出を阻害する能
力に関連している。この範囲のわずかに外側のＩＣ50値
を持つ化合物は、中位〜低い神経保護活性を有し得、そ
して、高いＩＣ50値を持つ化合物は神経保護しない。
【００４０】Ｃ．ＯＣＴ受容体への、特異的な、高い親
和性結合 本発明による、神経保護化合物の別の特性は、ニューロ
ン細胞中のＯＣＴ ＭＶＩＩＡ結合部位に関する高い親
和性結合である。以下で理解されるであろうように、結
合親和性は、ＭＶＩＩＡ結合部位に関する化合物の結合
定数により、または、ニューロン細胞ＭＶＩＩＡ結合部
位およびＳＶＩＢ結合部位への結合について測定された
結合定数の比により、特徴づけられ得る。
和性結合 本発明による、神経保護化合物の別の特性は、ニューロ
ン細胞中のＯＣＴ ＭＶＩＩＡ結合部位に関する高い親
和性結合である。以下で理解されるであろうように、結
合親和性は、ＭＶＩＩＡ結合部位に関する化合物の結合
定数により、または、ニューロン細胞ＭＶＩＩＡ結合部
位およびＳＶＩＢ結合部位への結合について測定された
結合定数の比により、特徴づけられ得る。
【００４１】ニューロン組織中のＯＣＴ ＭＶＩＩＡ結
合部位への結合は、種々の細胞型およびシナプトソーム
細胞フラクションで論証され得る。１つの好ましいニュ
ーロン膜は、哺乳動物脳シナプトソーム調製物、例え
ば、実施例３に記載されたラット脳シナプトソーム調製
物である。ＭＶＩＩＡ結合部位に関する化合物の結合定
数は一般に、次のように、シナプトソーム調製物から放
射能標識化ＯＣＴ ＭＶＩＩＡの競合的置換によって決
定される。
合部位への結合は、種々の細胞型およびシナプトソーム
細胞フラクションで論証され得る。１つの好ましいニュ
ーロン膜は、哺乳動物脳シナプトソーム調製物、例え
ば、実施例３に記載されたラット脳シナプトソーム調製
物である。ＭＶＩＩＡ結合部位に関する化合物の結合定
数は一般に、次のように、シナプトソーム調製物から放
射能標識化ＯＣＴ ＭＶＩＩＡの競合的置換によって決
定される。
【００４２】シナプトソーム膜に関するＭＶＩＩＡペプ
チドの結合定数Ｋdは、放射能標識化ペプチドの増加す
る量をシナプトソーム膜に添加する飽和結合方法によっ
て決定され、そして各濃度で結合された標識化材料の量
を求める。次に、濃度の関数としての結合したペプチド
のプロットを使用して、Ｂmax,シナプトソーム上の結合
部位の濃度、およびＫdを、標準方法に従って計算す
る。特に、Ｋd値は、シナプトソーム特異的結合部位を
半分飽和するのに必要とされるペプチドの計算された濃
度である。図６Ａは、ラット脳シナプトソームヘのＯＣ
Ｔ ＭＶＩＩＡの特異的結合を示し、ＯＣＴペプチド濃
度の関数としてプロットされ、そして図６Ｂは、Ｓｃａ
ｔｃｈａｒｄプロット形にある同一データを示してい
る。Ｓｃａｔｃｈａｒｄプロット線の傾斜から、８.８
ｐＭのＫd結合値が得られる。
チドの結合定数Ｋdは、放射能標識化ペプチドの増加す
る量をシナプトソーム膜に添加する飽和結合方法によっ
て決定され、そして各濃度で結合された標識化材料の量
を求める。次に、濃度の関数としての結合したペプチド
のプロットを使用して、Ｂmax,シナプトソーム上の結合
部位の濃度、およびＫdを、標準方法に従って計算す
る。特に、Ｋd値は、シナプトソーム特異的結合部位を
半分飽和するのに必要とされるペプチドの計算された濃
度である。図６Ａは、ラット脳シナプトソームヘのＯＣ
Ｔ ＭＶＩＩＡの特異的結合を示し、ＯＣＴペプチド濃
度の関数としてプロットされ、そして図６Ｂは、Ｓｃａ
ｔｃｈａｒｄプロット形にある同一データを示してい
る。Ｓｃａｔｃｈａｒｄプロット線の傾斜から、８.８
ｐＭのＫd結合値が得られる。
【００４３】ＭＶＩＩＡ結合部位に関する試験化合物の
結合定数を決定するために、試験化合物を、ｎＭ範囲中
の増加する濃度で、結合した、放射能標識化ＯＣＴ Ｍ
ＶＩＩＡを有するシナプトソーム調製物に添加する。次
いで、シナプトソーム材料を素早く濾過し、洗浄しそし
て結合した放射能標識についてアッセイする。試験化合
物の結合定数（Ｋi）は、ＧＶＩＡペプチドについて図
７に示されているように、コンピューター適合競合的結
合曲線を用いて求め、先ず、化合物のＩＣ50値、即ち、
標識化ＭＶＩＩＡペプチドの５０％置換を与える濃度を
求め、次に、例３に詳述されているように、ＯＣＴ Ｍ
ＶＩＩＡのＫd値および当該化合物のＩＣ50値からＫiを
計算する。試験した多数のＯＣＴペプチドに関する、計
算されたＩＣ50およびＫi値を表３に示す。当該化合物
は、増加するＩＣ50およびＫi値の順序で配列されてい
る。
結合定数を決定するために、試験化合物を、ｎＭ範囲中
の増加する濃度で、結合した、放射能標識化ＯＣＴ Ｍ
ＶＩＩＡを有するシナプトソーム調製物に添加する。次
いで、シナプトソーム材料を素早く濾過し、洗浄しそし
て結合した放射能標識についてアッセイする。試験化合
物の結合定数（Ｋi）は、ＧＶＩＡペプチドについて図
７に示されているように、コンピューター適合競合的結
合曲線を用いて求め、先ず、化合物のＩＣ50値、即ち、
標識化ＭＶＩＩＡペプチドの５０％置換を与える濃度を
求め、次に、例３に詳述されているように、ＯＣＴ Ｍ
ＶＩＩＡのＫd値および当該化合物のＩＣ50値からＫiを
計算する。試験した多数のＯＣＴペプチドに関する、計
算されたＩＣ50およびＫi値を表３に示す。当該化合物
は、増加するＩＣ50およびＫi値の順序で配列されてい
る。
【００４４】
【表３】 ＭＶＩＩＡ（１９８）化合物は、ＯＣＴ ＭＶＩＩＡ中
の位置２にＡｌａ置換を含み、そして、ＯＣＴ ＭＶＩ
ＩＡ（２００）はＯＣＴ ＭＶＩＩＡの７位にＡｌａ置
換を含む。他の化合物は図２中に同定されている。
の位置２にＡｌａ置換を含み、そして、ＯＣＴ ＭＶＩ
ＩＡ（２００）はＯＣＴ ＭＶＩＩＡの７位にＡｌａ置
換を含む。他の化合物は図２中に同定されている。
【００４５】既知の神経保護活性を有する化合物、ＯＣ
Ｔ ＭＶＩＩＡ、ＧＶＩＡ、およびＴＶＩＡは、約１５
〜３００ｐＭの間のＩＣ50値ならびに約１および１００
ｐＭの間のＫ1値を有している。逆に、神経保護でない
ＯＣＴペプチド、例えば、ＯＣＴ ＳＶＩＡおよびＳＶ
ＩＢは十分により大きいＩＣ50およびＫi値を有してい
る。
Ｔ ＭＶＩＩＡ、ＧＶＩＡ、およびＴＶＩＡは、約１５
〜３００ｐＭの間のＩＣ50値ならびに約１および１００
ｐＭの間のＫ1値を有している。逆に、神経保護でない
ＯＣＴペプチド、例えば、ＯＣＴ ＳＶＩＡおよびＳＶ
ＩＢは十分により大きいＩＣ50およびＫi値を有してい
る。
【００４６】試験された多数のＯＣＴペプチド化合物
は、ＯＣＴペプチドＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡ，および／ま
たはＴＶＩＡのそれらの範囲内のＩＣ50およびＫi値を
示し、従ってこれらの化合物は神経保護化合物として重
きをなす候補者であるべきである。しかしながら、これ
らの化合物のいくつか、例えば、ＭＶＩＩＡ（２０
１）、ＭＶＩＩＡ（１９５）、およびＳＶＩＢ（２０
２）は、神経保護化合物の範囲外にあるノルエピネフリ
ン放出の阻害に関するＩＣ50値を有しており（表２）、
従って、これらの化合物は、神経保護化合物についての
全ての基準を満たすわけではない。
は、ＯＣＴペプチドＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡ，および／ま
たはＴＶＩＡのそれらの範囲内のＩＣ50およびＫi値を
示し、従ってこれらの化合物は神経保護化合物として重
きをなす候補者であるべきである。しかしながら、これ
らの化合物のいくつか、例えば、ＭＶＩＩＡ（２０
１）、ＭＶＩＩＡ（１９５）、およびＳＶＩＢ（２０
２）は、神経保護化合物の範囲外にあるノルエピネフリ
ン放出の阻害に関するＩＣ50値を有しており（表２）、
従って、これらの化合物は、神経保護化合物についての
全ての基準を満たすわけではない。
【００４７】ニューロン細胞膜細胞中のＭＶＩＩＡ結合
タンパク質の同定は、実施例５に詳述されているよう
に、放射能標識化ＯＣＴ ＭＶＩＩＡをシナプトソーム
に結合し、そしてペプチドを標識化するニューロン膜に
架橋することによって、試験された。標識化した膜を、
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で可溶化し、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分別
し、そして標識化バンドについてオートラジオグラフィ
ーによって試験した。１つの場合において、当該膜を、
過剰の未標識化ＯＣＴ ＭＶＩＩＡの存在下に標識化ペ
プチドと共にインキュベーションした。同様の結合研究
が、標識化ＯＣＴ ＧＶＩＡで行われた。
タンパク質の同定は、実施例５に詳述されているよう
に、放射能標識化ＯＣＴ ＭＶＩＩＡをシナプトソーム
に結合し、そしてペプチドを標識化するニューロン膜に
架橋することによって、試験された。標識化した膜を、
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で可溶化し、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分別
し、そして標識化バンドについてオートラジオグラフィ
ーによって試験した。１つの場合において、当該膜を、
過剰の未標識化ＯＣＴ ＭＶＩＩＡの存在下に標識化ペ
プチドと共にインキュベーションした。同様の結合研究
が、標識化ＯＣＴ ＧＶＩＡで行われた。
【００４８】ゲルのオートラジオグラフィーは、図８に
示され、そこでは、レーンａおよびｂは、未標識化ＯＣ
Ｔ ＭＶＩＩＡの不存在（レーンａ）および存在（レー
ンｂ）下でのシナプトソーム膜へのＭＶＩＩＡ結合パタ
ーンを示しており、そして、レーンｃおよびｄは、未標
識化ＯＣＴ ＧＶＩＡの不存在（レーンｃ）および存在
（レーンｄ）の存在下でのシナプトソーム膜へのＧＶＩ
Ａ結合パターンを示している。ゲルパターンは、標識化
ＭＶＩＩＡペプチドの大部分が２００〜２１０キロダル
トンのタンパク質バンドに結合すること、および、当該
結合は、未標識化ＯＣＴ ＭＶＩＩＡでの置換による証
拠として、特異的であることを示している（レーン
ｂ）。この結合は、レーンｃおよびｄにおける放射能標
識化パターンから判断されるように、ＯＣＴ ＧＶＩＡ
の主要な特異的結合部位であると同様に思われる。
示され、そこでは、レーンａおよびｂは、未標識化ＯＣ
Ｔ ＭＶＩＩＡの不存在（レーンａ）および存在（レー
ンｂ）下でのシナプトソーム膜へのＭＶＩＩＡ結合パタ
ーンを示しており、そして、レーンｃおよびｄは、未標
識化ＯＣＴ ＧＶＩＡの不存在（レーンｃ）および存在
（レーンｄ）の存在下でのシナプトソーム膜へのＧＶＩ
Ａ結合パターンを示している。ゲルパターンは、標識化
ＭＶＩＩＡペプチドの大部分が２００〜２１０キロダル
トンのタンパク質バンドに結合すること、および、当該
結合は、未標識化ＯＣＴ ＭＶＩＩＡでの置換による証
拠として、特異的であることを示している（レーン
ｂ）。この結合は、レーンｃおよびｄにおける放射能標
識化パターンから判断されるように、ＯＣＴ ＧＶＩＡ
の主要な特異的結合部位であると同様に思われる。
【００４９】本発明によれば、最も高い神経保護活性を
有する化合物が、ニューロン膜上のＳＶＩＢ結合部位に
関する比較的低い結合親和性を示し、他方、この部位に
関する高い結合親和性は、不活性化合物で観察されるこ
とが、同様に発見された。ニューロン細胞ＳＶＩＡ結合
部位に結合する化合物に関するＩＣ50およびＫi値は、
上述したように、シナプトソーム調製物に結合するＯＣ
Ｔ ＳＶＩＢのＫdを決定し、次いで、試験化合物によ
る標識化ＯＣＴ ＳＶＩＢの競合的置換を用いて試験化
合物のＩＣ50およびＫi値を求めることによって計算さ
れ得る。図９は、ＳＶＩＢ結合部位への結合が試験され
たいくつかのＯＣＴペプチドに関するコンピューター適
合競合的結合曲線を示している。これらの曲線から、上
述したように、ＩＣ50およびＫi値が決定された。
有する化合物が、ニューロン膜上のＳＶＩＢ結合部位に
関する比較的低い結合親和性を示し、他方、この部位に
関する高い結合親和性は、不活性化合物で観察されるこ
とが、同様に発見された。ニューロン細胞ＳＶＩＡ結合
部位に結合する化合物に関するＩＣ50およびＫi値は、
上述したように、シナプトソーム調製物に結合するＯＣ
Ｔ ＳＶＩＢのＫdを決定し、次いで、試験化合物によ
る標識化ＯＣＴ ＳＶＩＢの競合的置換を用いて試験化
合物のＩＣ50およびＫi値を求めることによって計算さ
れ得る。図９は、ＳＶＩＢ結合部位への結合が試験され
たいくつかのＯＣＴペプチドに関するコンピューター適
合競合的結合曲線を示している。これらの曲線から、上
述したように、ＩＣ50およびＫi値が決定された。
【００５０】表４は、試験した化合物に関するＫi値を
示している。理解されるように、最も低い親和性結合
（最も高い結合定数値）が、神経保護化合物（ＯＣＴ
ＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡおよびＴＶＩＡ）について観察さ
れ、そして最も高い親和性が、非保護性化合物、例え
ば、ＳＶＩＡおよびＳＶＩＢについて観察された。神経
保護活性およびＳＶＩＢ結合の間の一般的逆相関が、い
くつかの変性化合物、例えば、ＭＶＩＩＡ（２０１）で
観察されるが、別のもの、例えば、ＭＶＩＩＡ（１９
５）では見られない。表４は同様に、表３からの、ＭＶ
ＩＩＡ結合部位に関するＯＣＴ化合物のＫi、そして対
応するＫi比すなわちＫi（ＳＶＩＢ）／Ｋi（ＭＶＩＩ
Ａ）を列挙している。これらの比は、神経保護化合物お
よび神経保護活性を示さないものの間の結合特性の相違
を強調する。
示している。理解されるように、最も低い親和性結合
（最も高い結合定数値）が、神経保護化合物（ＯＣＴ
ＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡおよびＴＶＩＡ）について観察さ
れ、そして最も高い親和性が、非保護性化合物、例え
ば、ＳＶＩＡおよびＳＶＩＢについて観察された。神経
保護活性およびＳＶＩＢ結合の間の一般的逆相関が、い
くつかの変性化合物、例えば、ＭＶＩＩＡ（２０１）で
観察されるが、別のもの、例えば、ＭＶＩＩＡ（１９
５）では見られない。表４は同様に、表３からの、ＭＶ
ＩＩＡ結合部位に関するＯＣＴ化合物のＫi、そして対
応するＫi比すなわちＫi（ＳＶＩＢ）／Ｋi（ＭＶＩＩ
Ａ）を列挙している。これらの比は、神経保護化合物お
よび神経保護活性を示さないものの間の結合特性の相違
を強調する。
【００５１】
【表４】 前述から、本発明による神経保護化合物は、ニューロン
膜上のＭＶＩＩＡ結合部位に関する高い結合親和性によ
って特徴づけられることが理解される。この部位に関す
る結合親和性は、２つの方法うちの１っによって特徴づ
けられ得る。第一のアプローチにおいて、ＭＶＩＩＡ部
位に関する当該化合物の結合親和性は、ＯＣＴ ＭＶＩ
ＩＡ，ＧＶＩＡ，またはＴＶＩＡのものと直接比較され
る。神経保護化合物は、結合親和性がＯＣＴのＭＶＩＩ
Ａ，ＧＶＩＡ，およびＴＶＩＡについて測定された結合
親和性の範囲内にあるものである、すなわち、結合定数
がこれら３つのＯＣＴペプチドの中で最も高い結合定数
より大きくない。
膜上のＭＶＩＩＡ結合部位に関する高い結合親和性によ
って特徴づけられることが理解される。この部位に関す
る結合親和性は、２つの方法うちの１っによって特徴づ
けられ得る。第一のアプローチにおいて、ＭＶＩＩＡ部
位に関する当該化合物の結合親和性は、ＯＣＴ ＭＶＩ
ＩＡ，ＧＶＩＡ，またはＴＶＩＡのものと直接比較され
る。神経保護化合物は、結合親和性がＯＣＴのＭＶＩＩ
Ａ，ＧＶＩＡ，およびＴＶＩＡについて測定された結合
親和性の範囲内にあるものである、すなわち、結合定数
がこれら３つのＯＣＴペプチドの中で最も高い結合定数
より大きくない。
【００５２】代わりに、ＭＶＩＩＡ部位に関する結合親
和性は、ちょうど今記載したように、ＭＶＩＩＡおよび
ＳＶＩＢ部位に関する結合定数の比によって特徴づけら
れ得る。ここで、神経保護化合物は、結合比が、ＯＣＴ
のＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡ，およびＴＶＩＡについて測定
されたこのような結合比の範囲内にあるものである、す
なわち、結合比はこれら３つのＯＣＴペプチドの中で最
も大きい比よりも大きくない。
和性は、ちょうど今記載したように、ＭＶＩＩＡおよび
ＳＶＩＢ部位に関する結合定数の比によって特徴づけら
れ得る。ここで、神経保護化合物は、結合比が、ＯＣＴ
のＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡ，およびＴＶＩＡについて測定
されたこのような結合比の範囲内にあるものである、す
なわち、結合比はこれら３つのＯＣＴペプチドの中で最
も大きい比よりも大きくない。
【００５３】ＩＩＩ．神経保護組成物 本発明は、ヒト患者の虚血状態に関連したニューロン損
傷を減ずるのに有効な組成物を提供する。虚血状態は、
例えば、心不全によって引き起こされるような、大脳循
環における中断、または、脳への血液供給の全体的損失
に導かれる別の状態に、あるいは血流における局部的中
断による、例えば、大脳出血、あるいは局部的血栓また
は塞栓事象、あるいは頭部外傷により得る。
傷を減ずるのに有効な組成物を提供する。虚血状態は、
例えば、心不全によって引き起こされるような、大脳循
環における中断、または、脳への血液供給の全体的損失
に導かれる別の状態に、あるいは血流における局部的中
断による、例えば、大脳出血、あるいは局部的血栓また
は塞栓事象、あるいは頭部外傷により得る。
【００５４】当該組成物で処置され得る虚血状態は、一
般に、脳内の血管の閉塞（ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）ま
たは破壊により引き起こされる神経学的機能の突然の減
少または損失として定義されるような、発作に関連して
いる。発作および別のタイプの大脳虚血状態において、
ペプチド処置は、最初の虚血事象から生じる二次的な脳
損傷を妨げるかまたは減ずることを目指している。二次
的な損傷は、一般に、病巣の虚血の場合、虚血損傷を取
り囲む領域中の、そして同様に、全体的虚血の場合、海
馬または基底核のような、病変における選択的な傷をう
けやすい領域中の、大脳細胞破壊、または、病変を包含
する。二次的な損傷は、しばしば、機能性障害、例え
ば、短期または長期の記憶の損失により明らかにされ得
る。以下に見られるように、本発明の処置方法は、虚血
に関連した解剖学上のおよび機能性の二次的損傷を減ず
るかまたは妨げるのに有効である。
般に、脳内の血管の閉塞（ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）ま
たは破壊により引き起こされる神経学的機能の突然の減
少または損失として定義されるような、発作に関連して
いる。発作および別のタイプの大脳虚血状態において、
ペプチド処置は、最初の虚血事象から生じる二次的な脳
損傷を妨げるかまたは減ずることを目指している。二次
的な損傷は、一般に、病巣の虚血の場合、虚血損傷を取
り囲む領域中の、そして同様に、全体的虚血の場合、海
馬または基底核のような、病変における選択的な傷をう
けやすい領域中の、大脳細胞破壊、または、病変を包含
する。二次的な損傷は、しばしば、機能性障害、例え
ば、短期または長期の記憶の損失により明らかにされ得
る。以下に見られるように、本発明の処置方法は、虚血
に関連した解剖学上のおよび機能性の二次的損傷を減ず
るかまたは妨げるのに有効である。
【００５５】本発明の組成物は、哺乳動物ニューロン細
胞中のノルエピネフリン放出を選択的に遮断する、およ
びニューロン膜ω−コノトキシンＭＶＩＩＡ結合部位に
結合する活性−それらは、ＯＣＴペプチドＭＶＩＩＡ，
ＧＶＩＡ，またはＴＶＩＡに関するこのような活性の範
囲内にある−を有しているニューロン細胞カルシウムチ
ャンネルアンタゴニスト化合物を包含している。結合活
性は、上記セクションＩＩに検討されているように、ニ
ューロン膜上のＭＶＩＩＡ部位に関する結合定数とし
て、または、ＭＶＩＩＡおよびＳＶＩＢ結合部位に関す
る結合定数の比として表され得る。当該化合物は、適当
な薬学的キャリヤー、例えば、無菌注射溶液中に保持さ
れる。
胞中のノルエピネフリン放出を選択的に遮断する、およ
びニューロン膜ω−コノトキシンＭＶＩＩＡ結合部位に
結合する活性−それらは、ＯＣＴペプチドＭＶＩＩＡ，
ＧＶＩＡ，またはＴＶＩＡに関するこのような活性の範
囲内にある−を有しているニューロン細胞カルシウムチ
ャンネルアンタゴニスト化合物を包含している。結合活
性は、上記セクションＩＩに検討されているように、ニ
ューロン膜上のＭＶＩＩＡ部位に関する結合定数とし
て、または、ＭＶＩＩＡおよびＳＶＩＢ結合部位に関す
る結合定数の比として表され得る。当該化合物は、適当
な薬学的キャリヤー、例えば、無菌注射溶液中に保持さ
れる。
【００５６】ニューロン細胞カルシウムチャンネルアン
タゴニストの１つの典型的な類は、必要な阻害および結
合活性を有するＯＣＴペプチドである。当該ペプチド
は、非経口的投与のために適当な不活性キャリヤー、例
えば、無菌生理学的食塩溶液中に配合される。キャリヤ
ー溶液中のペプチドの濃度は、一般に、約０.１〜１０
ｍｇ／ｍｌの間にある。投与される用量は、投与経路に
よって決められるであろう。１つの適当な経路は、ペプ
チドの結合および阻害値により、約０.１〜５０μｇペ
プチド／ｋｇ体重の用量レベルで、大脳室内（ｉｎｔｒ
ａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）（ＩＣＶ）
である。当該ペプチド化合物は、以下に論証されている
ように、代わりに、静脈内（ＩＶ）に投与され得る。被
検者をＨ１およびＨ２ヒスタミン受容体に特異的な抗ヒ
スタミンで前もって処置してペプチド投与後に起こり得
る血圧の低下を減ずることが、ＩＶ投与に所望され得
る。
タゴニストの１つの典型的な類は、必要な阻害および結
合活性を有するＯＣＴペプチドである。当該ペプチド
は、非経口的投与のために適当な不活性キャリヤー、例
えば、無菌生理学的食塩溶液中に配合される。キャリヤ
ー溶液中のペプチドの濃度は、一般に、約０.１〜１０
ｍｇ／ｍｌの間にある。投与される用量は、投与経路に
よって決められるであろう。１つの適当な経路は、ペプ
チドの結合および阻害値により、約０.１〜５０μｇペ
プチド／ｋｇ体重の用量レベルで、大脳室内（ｉｎｔｒ
ａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）（ＩＣＶ）
である。当該ペプチド化合物は、以下に論証されている
ように、代わりに、静脈内（ＩＶ）に投与され得る。被
検者をＨ１およびＨ２ヒスタミン受容体に特異的な抗ヒ
スタミンで前もって処置してペプチド投与後に起こり得
る血圧の低下を減ずることが、ＩＶ投与に所望され得
る。
【００５７】以下に報告されているように、そして本発
明の重要な特徴によれば、虚血事象後に十分、例えば、
一時的閉塞期間に続いて１時間、投与されると、神経保
護化合物の保護効果の損失はほとんどまたは全ぐないと
いうことが見出された。遅延した投与保護事象は、ペプ
チドが、虚血損傷から二次的な大脳損傷に導く事象を遮
断するのに有効であることを示唆する、なぜならば、こ
れらの事象は損傷後かなりの時間にわたって、または数
日間にわたってすら生じ得るからである。従って、遅延
した投与は、虚血の発病に続いて、数時間にわたって、
または１日またはそれ以上にわたってすら、二次的な大
脳損傷を減ずるのに有効であり得る。
明の重要な特徴によれば、虚血事象後に十分、例えば、
一時的閉塞期間に続いて１時間、投与されると、神経保
護化合物の保護効果の損失はほとんどまたは全ぐないと
いうことが見出された。遅延した投与保護事象は、ペプ
チドが、虚血損傷から二次的な大脳損傷に導く事象を遮
断するのに有効であることを示唆する、なぜならば、こ
れらの事象は損傷後かなりの時間にわたって、または数
日間にわたってすら生じ得るからである。従って、遅延
した投与は、虚血の発病に続いて、数時間にわたって、
または１日またはそれ以上にわたってすら、二次的な大
脳損傷を減ずるのに有効であり得る。
【００５８】虚血損傷に関連した神経損傷を減ずる際の
当該組成物の有効性は、全体的虚血および二次的発作損
傷のためのモデルシステムとして広範に使用される、３
種の動物系において試験された。第一の系は、首の頸動
脈の一時的閉塞によって引き起こされる全体的虚血のア
レチネズミの２血管閉塞モデルである。臨床的比較のた
めに、このモデルにおいて生じる虚血は、心停止によっ
て引き起こされる虚血に連結している、なぜならば、脳
への全ての血流が、決まった期間、一般には５〜１０分
間止められるからである。
当該組成物の有効性は、全体的虚血および二次的発作損
傷のためのモデルシステムとして広範に使用される、３
種の動物系において試験された。第一の系は、首の頸動
脈の一時的閉塞によって引き起こされる全体的虚血のア
レチネズミの２血管閉塞モデルである。臨床的比較のた
めに、このモデルにおいて生じる虚血は、心停止によっ
て引き起こされる虚血に連結している、なぜならば、脳
への全ての血流が、決まった期間、一般には５〜１０分
間止められるからである。
【００５９】個々な後遺症におけるいくつかの相違が、
種の間で認められるが、アレチネズミは、人を含む別の
哺乳動物において見出されるのと同一種類の、虚血に対
する選択的局部的損傷を示す。特に、海馬ＣＡ１領域に
おいて観察される特徴的な二次的損傷は、人を含む別の
哺乳動物において見られるものに類似している（Ｋｉｒ
ｉｎｏ；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ）。この領域のニューロ
ン、そして特に錐体ニューロンは、虚血損傷の４日後ま
での期間にわたって、遅延したニューロン死を示す。
種の間で認められるが、アレチネズミは、人を含む別の
哺乳動物において見出されるのと同一種類の、虚血に対
する選択的局部的損傷を示す。特に、海馬ＣＡ１領域に
おいて観察される特徴的な二次的損傷は、人を含む別の
哺乳動物において見られるものに類似している（Ｋｉｒ
ｉｎｏ；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ）。この領域のニューロ
ン、そして特に錐体ニューロンは、虚血損傷の４日後ま
での期間にわたって、遅延したニューロン死を示す。
【００６０】第二のモデルは、ラットの４血管閉塞モデ
ルである。一次的閉塞を引き起こすための実験手順は、
次の類似点を含む心停止に続くヒト脳中の状態によく似
た虚血を引き起こす：虚血事象は、一時的、一般に５〜
３０分である；それは麻酔していない状態で生じる；た
いていのラットにおいて、虚血事象は、全身性発作（ｓ
ｅｉｚｕｒｅ）を伴わず、そして発作を有する動物は研
究から除外され得る。さらに、当該閉塞手順は、当該動
物を容易に監視し、維持しそして分析することを可能に
する（Ｐｕｌｓｉｎｅｌｌｉ）。
ルである。一次的閉塞を引き起こすための実験手順は、
次の類似点を含む心停止に続くヒト脳中の状態によく似
た虚血を引き起こす：虚血事象は、一時的、一般に５〜
３０分である；それは麻酔していない状態で生じる；た
いていのラットにおいて、虚血事象は、全身性発作（ｓ
ｅｉｚｕｒｅ）を伴わず、そして発作を有する動物は研
究から除外され得る。さらに、当該閉塞手順は、当該動
物を容易に監視し、維持しそして分析することを可能に
する（Ｐｕｌｓｉｎｅｌｌｉ）。
【００６１】第三モデルは、局部的虚血のラット大脳動
脈閉塞モデルである。このモデルにおいて、左大脳動脈
は、電気凝固により永久的に閉塞される。閉塞の２４時
間後、当該動物を麻酔にかけ、そした、損傷領域を磁気
共鳴画像によって調べる。
脈閉塞モデルである。このモデルにおいて、左大脳動脈
は、電気凝固により永久的に閉塞される。閉塞の２４時
間後、当該動物を麻酔にかけ、そした、損傷領域を磁気
共鳴画像によって調べる。
【００６２】Ａ．解剖学的損傷の減少 アレチネズミモデルシステム中の虚血を、実施例７に詳
述されているように、８分間、２つの頸動脈を閉塞する
ことによって、麻酔をかけた動物中に引き起こした。Ｏ
ＣＴペプチドを閉塞期間の間、あるいは閉塞に続いて１
時間ＩＣＶ投与した。閉塞およびペプチド処置の４日
後、当該動物を、例７に詳述されているように、海馬Ｃ
Ａ１領域中の解剖学的損傷について組織学的に調べた。
述されているように、８分間、２つの頸動脈を閉塞する
ことによって、麻酔をかけた動物中に引き起こした。Ｏ
ＣＴペプチドを閉塞期間の間、あるいは閉塞に続いて１
時間ＩＣＶ投与した。閉塞およびペプチド処置の４日
後、当該動物を、例７に詳述されているように、海馬Ｃ
Ａ１領域中の解剖学的損傷について組織学的に調べた。
【００６３】図１０Ａおよび１０Ｂは、虚血、およびＭ
ＶＩＩＡ ＯＣＴ（１０Ａ）または薬物ビヒクル（１０
Ｂ）の注入後の動物中のアレチネズミ海馬ＣＡ１領域の
低倍率顕微鏡写真である。図中の矢印は、ＣＡ１領域の
おおよその境界を示している。より高い倍率で、薬物処
置した虚血動物中の細胞は正常であるように見え（図１
１Ａ）、他方、損傷は、ビヒクルのみを受け取った虚血
動物中で明白である。完全な薬物保護のもう１つの例
は、図１１Ｃ中に見られ、そして、部分的保護の例は、
図１１Ｄ中に見られ、そこには、少数の損傷細胞があ
る。
ＶＩＩＡ ＯＣＴ（１０Ａ）または薬物ビヒクル（１０
Ｂ）の注入後の動物中のアレチネズミ海馬ＣＡ１領域の
低倍率顕微鏡写真である。図中の矢印は、ＣＡ１領域の
おおよその境界を示している。より高い倍率で、薬物処
置した虚血動物中の細胞は正常であるように見え（図１
１Ａ）、他方、損傷は、ビヒクルのみを受け取った虚血
動物中で明白である。完全な薬物保護のもう１つの例
は、図１１Ｃ中に見られ、そして、部分的保護の例は、
図１１Ｄ中に見られ、そこには、少数の損傷細胞があ
る。
【００６４】解剖学的切片、例えば、図１０および１１
において見られるものは、実施例７に述べれている基準
に従って採点された。上記採点システムを基準とした、
ＯＣＴ ＭＶＩＩＡまたはＯＣＴ ＧＶＩＡで処置し
た、あるいは、ビヒクルのみを受け取った虚血動物中の
解剖学的損傷の程度を、以下の表５に示す。当該ペプチ
ドは、以下の表中に示されてた全用量で、虚血の８分間
にＩＣＶ注入によって投与された。理解されるように、
より高い用量のＯＣＴ ＭＶＩＩＡで処置した動物中の
損傷の程度は、未処理動物中のそれの２５％しかなかっ
た。ＧＶＩＡペプチドは、損傷に関して５０％より多い
減少をも引き起こしそしてより低い用量は、ほぼ最高の
有効性であった。
において見られるものは、実施例７に述べれている基準
に従って採点された。上記採点システムを基準とした、
ＯＣＴ ＭＶＩＩＡまたはＯＣＴ ＧＶＩＡで処置し
た、あるいは、ビヒクルのみを受け取った虚血動物中の
解剖学的損傷の程度を、以下の表５に示す。当該ペプチ
ドは、以下の表中に示されてた全用量で、虚血の８分間
にＩＣＶ注入によって投与された。理解されるように、
より高い用量のＯＣＴ ＭＶＩＩＡで処置した動物中の
損傷の程度は、未処理動物中のそれの２５％しかなかっ
た。ＧＶＩＡペプチドは、損傷に関して５０％より多い
減少をも引き起こしそしてより低い用量は、ほぼ最高の
有効性であった。
【００６５】
【表５】 同様の処置方法が、アレチネズミ全体的虚血モデルにお
いて適用されたが、そこでは、神経保護剤が、虚血の１
時間後に投与された。解剖学的損傷において観察された
減少は、以下の表６に要約されている。表５中のデータ
の比較は、当該薬物が虚血事象（８分の閉塞）の１時間
後に投与された時に、比較できる用量（０.１μｇ）で
保護効果のほとんどの損失を示す。
いて適用されたが、そこでは、神経保護剤が、虚血の１
時間後に投与された。解剖学的損傷において観察された
減少は、以下の表６に要約されている。表５中のデータ
の比較は、当該薬物が虚血事象（８分の閉塞）の１時間
後に投与された時に、比較できる用量（０.１μｇ）で
保護効果のほとんどの損失を示す。
【００６６】
【表６】 ラットモデルシステム中の虚血は、脊椎動脈をまず外科
的に遮断し、外科的回復後、１５分間頸動脈を一時的に
遮断する（従って、脳への血流を完全に遮断する）こと
によって引き起こされた。閉塞の間、動物に、０.３μ
ｇＯＣＴ ＭＶＩＩＡペプチドをＩＣＶで与えた。閉塞
の４日後、上述したように、当該動物を組織学的に調べ
て、一海馬ＣＡ１領域中の損傷の程度を求めた。平均ス
コアを、塩類溶液およびＭＶＩＡ ＯＣＴ処置の比較の
ために、表７に示す。理解されるように、処置した動物
中の損傷の程度は、未処置動物のそれの約１／３に過ぎ
なかった。
的に遮断し、外科的回復後、１５分間頸動脈を一時的に
遮断する（従って、脳への血流を完全に遮断する）こと
によって引き起こされた。閉塞の間、動物に、０.３μ
ｇＯＣＴ ＭＶＩＩＡペプチドをＩＣＶで与えた。閉塞
の４日後、上述したように、当該動物を組織学的に調べ
て、一海馬ＣＡ１領域中の損傷の程度を求めた。平均ス
コアを、塩類溶液およびＭＶＩＡ ＯＣＴ処置の比較の
ために、表７に示す。理解されるように、処置した動物
中の損傷の程度は、未処置動物のそれの約１／３に過ぎ
なかった。
【００６７】
【表７】 個々の研究において、一連の付加的なＯＣＴペプチド
は、同一動物系において試験された。これらの研究の結
果を図１２に要約する。データは、この比較のためにい
くつかの実験から持ち寄った。データを、Ｚ−スコア変
換して種々の平均対照（塩類溶液処置）損傷値を有する
試料間の比較を促進した。この分析において、対照群の
平均はゼロの値を仮定し、そして対照からの偏差を正
（対照と比較して損傷の増加を示す）および負（対照と
比較して損傷の減少を示す）の値として示す。ＯＣＴ
ＭＶＩＩＡおよびＯＣＴ ＴＶＩＡは各々、それらの負
のＺ−スコアから示されるように、研究において著しい
神経保護を示した。ＭＶＩＩＡ（１９５）は、対照とは
あまり異ならないが、両方の用量でその負のＺ−スコア
によって示されるように、試験された２つの用量で神経
保護に対する傾向を示した。対照的に、ＯＣＴ ＳＶＩ
Ｂ、ＯＴＣ ＳＶＩＢ（２０２）、ＯＣＴ ＭＶＩＩＡ
（２０１）、およびＯＣＴ ＳＶＩＡは全て、それらの
正のＺ−スコアによって示されるように、神経保護活性
を示さなかった。
は、同一動物系において試験された。これらの研究の結
果を図１２に要約する。データは、この比較のためにい
くつかの実験から持ち寄った。データを、Ｚ−スコア変
換して種々の平均対照（塩類溶液処置）損傷値を有する
試料間の比較を促進した。この分析において、対照群の
平均はゼロの値を仮定し、そして対照からの偏差を正
（対照と比較して損傷の増加を示す）および負（対照と
比較して損傷の減少を示す）の値として示す。ＯＣＴ
ＭＶＩＩＡおよびＯＣＴ ＴＶＩＡは各々、それらの負
のＺ−スコアから示されるように、研究において著しい
神経保護を示した。ＭＶＩＩＡ（１９５）は、対照とは
あまり異ならないが、両方の用量でその負のＺ−スコア
によって示されるように、試験された２つの用量で神経
保護に対する傾向を示した。対照的に、ＯＣＴ ＳＶＩ
Ｂ、ＯＴＣ ＳＶＩＢ（２０２）、ＯＣＴ ＭＶＩＩＡ
（２０１）、およびＯＣＴ ＳＶＩＡは全て、それらの
正のＺ−スコアによって示されるように、神経保護活性
を示さなかった。
【００６８】第二の処置方法で、ＯＣＴペプチドを、実
施例８Ｂに詳述したように、静脈内投与した。ＯＣＴ
ＭＶＩＩＡによって引き起こされた全体的虚血における
神経保護の程度が表８に示されている。表中の「ＮＳ
Ｄ」は、「統計学的に異ならない」ことを示している。
施例８Ｂに詳述したように、静脈内投与した。ＯＣＴ
ＭＶＩＩＡによって引き起こされた全体的虚血における
神経保護の程度が表８に示されている。表中の「ＮＳ
Ｄ」は、「統計学的に異ならない」ことを示している。
【００６９】
【表８】 第三の虚血モデルシステムにおいて、実施例９に詳述さ
れているように、ＯＣＴペプチドが、左中央の大脳動脈
の閉塞の１０分前にＩＣＶ注入により投与された。２４
時間後、対照および処置動物中の解剖学的損傷の程度
を、磁気共鳴画像によって調べた。８つの対照画像を記
録し、そして、各画像中の梗塞領域が、絵素を数えるこ
とによって決定された。表９中に示されているのが、ラ
ットごとの８つの冠状切片からの絵素の平均総数であ
る。１.７μｇのＯＣＴ ＭＶＩＩＡ（ＩＣＶ）を用い
た処置により、中央大脳動脈閉塞によって引き起こされ
た平均梗塞サイズの面積が２４％減少した。この減少
は、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙＵ試験により評価される
ように、統計学的に重要であった。
れているように、ＯＣＴペプチドが、左中央の大脳動脈
の閉塞の１０分前にＩＣＶ注入により投与された。２４
時間後、対照および処置動物中の解剖学的損傷の程度
を、磁気共鳴画像によって調べた。８つの対照画像を記
録し、そして、各画像中の梗塞領域が、絵素を数えるこ
とによって決定された。表９中に示されているのが、ラ
ットごとの８つの冠状切片からの絵素の平均総数であ
る。１.７μｇのＯＣＴ ＭＶＩＩＡ（ＩＣＶ）を用い
た処置により、中央大脳動脈閉塞によって引き起こされ
た平均梗塞サイズの面積が２４％減少した。この減少
は、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙＵ試験により評価される
ように、統計学的に重要であった。
【００７０】
【表９】 Ｂ．機能的活性保護：機能冗進 動物中の大脳虚血の１つの共通する結果は、機能亢進で
あり、それは、数時間の閉塞の間の歩く（探索）行動と
して見られ得、そして、数日後まで観察され得る。虚血
アレチネズミにおける機能亢進は、例１０に記載された
ように監視された。手短に言えば、アレチネズミを、個
々に、６０分間、統計学的分析のために１５分ごとに記
録した累積活性カウントを用いて試験した。ベースライ
ン活性は、この測定に関する種々の処置群の比較可能性
を確実にするために、外科的処置の前に測定し、そして
活性測定は、閉塞の１日および３日後になされた。
あり、それは、数時間の閉塞の間の歩く（探索）行動と
して見られ得、そして、数日後まで観察され得る。虚血
アレチネズミにおける機能亢進は、例１０に記載された
ように監視された。手短に言えば、アレチネズミを、個
々に、６０分間、統計学的分析のために１５分ごとに記
録した累積活性カウントを用いて試験した。ベースライ
ン活性は、この測定に関する種々の処置群の比較可能性
を確実にするために、外科的処置の前に測定し、そして
活性測定は、閉塞の１日および３日後になされた。
【００７１】試験の結果を図１３にプロットする。各試
験曲線中の下向きの傾斜は、当該動物が試験環境に、よ
り馴れるにつれて、試験の、４回の１５分間隔（１〜４
はベースラインについて、５〜８は１日目について、そ
して９〜１２は３日目について）にわたり活動が減少す
るためである。閉塞のみ（△）は、閉塞の１日後、ベー
スラインレベルを越えて活性レベルに著しい上昇を生
じ、そして、高められた活性レベルが、３日間にわたっ
て観察され、永久的な行動損傷を示す。ビヒクルのＩＣ
Ｔ投与を受け取った非閉塞対照動物（○）は、試験期間
を通じてベースライン活性レベルを維持した。虚血不存
在下のＯＣＴペプチド自体（▲）は活動を減じた、そし
て、この効果は３日目ですらわずかに持続する。ＯＣＴ
ＭＶＩＩＡで処置した閉塞動物（▲）は、１日目でベ
ースラインより低い値を示し、明らかに、ペプチドだけ
により生ずる減ぜられた活性を反映している。３日目
で、処置動物は、活性のほぼ正常なレベルを示し、ＯＣ
Ｔペプチド処置が虚血誘発機能亢進に対して保護を与え
ることを示している。
験曲線中の下向きの傾斜は、当該動物が試験環境に、よ
り馴れるにつれて、試験の、４回の１５分間隔（１〜４
はベースラインについて、５〜８は１日目について、そ
して９〜１２は３日目について）にわたり活動が減少す
るためである。閉塞のみ（△）は、閉塞の１日後、ベー
スラインレベルを越えて活性レベルに著しい上昇を生
じ、そして、高められた活性レベルが、３日間にわたっ
て観察され、永久的な行動損傷を示す。ビヒクルのＩＣ
Ｔ投与を受け取った非閉塞対照動物（○）は、試験期間
を通じてベースライン活性レベルを維持した。虚血不存
在下のＯＣＴペプチド自体（▲）は活動を減じた、そし
て、この効果は３日目ですらわずかに持続する。ＯＣＴ
ＭＶＩＩＡで処置した閉塞動物（▲）は、１日目でベ
ースラインより低い値を示し、明らかに、ペプチドだけ
により生ずる減ぜられた活性を反映している。３日目
で、処置動物は、活性のほぼ正常なレベルを示し、ＯＣ
Ｔペプチド処置が虚血誘発機能亢進に対して保護を与え
ることを示している。
【００７２】Ｂ．機能活性保護：自発的交互（Ｓｐｏｎ
ｔａｎｅｏｕｓ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ） 脳の海馬領域に対する損傷は、場所的学習および記憶に
おける欠損を生ずることが知られており、それ故、海馬
細胞に対する虚血損傷は、上に文献で証明されているよ
うに、短期記憶に関連する機能活性の損失をも伴い得る
ことが予期され得る。
ｔａｎｅｏｕｓ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ） 脳の海馬領域に対する損傷は、場所的学習および記憶に
おける欠損を生ずることが知られており、それ故、海馬
細胞に対する虚血損傷は、上に文献で証明されているよ
うに、短期記憶に関連する機能活性の損失をも伴い得る
ことが予期され得る。
【００７３】実験動物中の短期記憶の測定として広く適
用されている１つの試験は、Ｙ迷路であり、そこでは、
動物は、Ｙ「迷路」のステムの出発点に置かれそして２
つのＹアームのいずれかに入るのを許される。当該動物
が１つのアームに入ると、ドアはその背後で閉じられ
る。５秒後、当該動物を２〜１２分の試験間間隔（ｉｎ
ｔｅｒｔｒｉａｌ ｉｎｔｅｒｖａｌ）（ＩＴＩ）でそ
のホームケージに戻す。その間隔の終わりに、当該動物
を同一方法で再度迷路中で走らせる。たいていの正常な
動物は交互になるであろう、すなわち、最初の試験で入
らなかったアームに入るであろう。試験は、交互につい
て「Ｙ」および同一Ｙアームの反復選択について「Ｎ」
により採点される。
用されている１つの試験は、Ｙ迷路であり、そこでは、
動物は、Ｙ「迷路」のステムの出発点に置かれそして２
つのＹアームのいずれかに入るのを許される。当該動物
が１つのアームに入ると、ドアはその背後で閉じられ
る。５秒後、当該動物を２〜１２分の試験間間隔（ｉｎ
ｔｅｒｔｒｉａｌ ｉｎｔｅｒｖａｌ）（ＩＴＩ）でそ
のホームケージに戻す。その間隔の終わりに、当該動物
を同一方法で再度迷路中で走らせる。たいていの正常な
動物は交互になるであろう、すなわち、最初の試験で入
らなかったアームに入るであろう。試験は、交互につい
て「Ｙ」および同一Ｙアームの反復選択について「Ｎ」
により採点される。
【００７４】試験手順において、アナネズミ中の虚血
は、ビヒクル（対照）あるいは、０.１または０.３μｇ
のＯＣＴ ＭＶＩＩＡまたはＧＶＩＡペプチド（全ての
薬物処置からの結果は、実施例１０に記載されたように
合わされた）の同時のＩＣＴ投与と共に、上述したよう
に誘発された。閉塞の３日後、当該動物をＹ迷路中で試
験した。自発的な交互試験の結果は、少なくとも０.１
μｇのいずれか一方の化合物の用量からの解剖学的保護
が存在する動物について表１０に要約されている。
は、ビヒクル（対照）あるいは、０.１または０.３μｇ
のＯＣＴ ＭＶＩＩＡまたはＧＶＩＡペプチド（全ての
薬物処置からの結果は、実施例１０に記載されたように
合わされた）の同時のＩＣＴ投与と共に、上述したよう
に誘発された。閉塞の３日後、当該動物をＹ迷路中で試
験した。自発的な交互試験の結果は、少なくとも０.１
μｇのいずれか一方の化合物の用量からの解剖学的保護
が存在する動物について表１０に要約されている。
【００７５】
【表１０】 表中のデータから理解されるように、対照動物（閉塞な
し、ビヒクルのＩＣＶ投与）に関する正常なＹ／Ｎ比は
約２：１であった。虚血損傷は、この比を、Ｙ試験にお
いて実質的にランダム行動を示す、１未満までの低下を
引き起こした。虚血動物において見られる短期記憶の損
失は、ペプチド処置により完全に妨げられ、約２：１の
Ｙ／Ｎ比が得られた、虚血損傷の不存在下でのペプチド
のみは、Ｙ／Ｎ比を高めるように見えた、そしてこの増
強は処置された、虚血動物の改善された行動に寄与し得
る。
し、ビヒクルのＩＣＶ投与）に関する正常なＹ／Ｎ比は
約２：１であった。虚血損傷は、この比を、Ｙ試験にお
いて実質的にランダム行動を示す、１未満までの低下を
引き起こした。虚血動物において見られる短期記憶の損
失は、ペプチド処置により完全に妨げられ、約２：１の
Ｙ／Ｎ比が得られた、虚血損傷の不存在下でのペプチド
のみは、Ｙ／Ｎ比を高めるように見えた、そしてこの増
強は処置された、虚血動物の改善された行動に寄与し得
る。
【００７６】要約すると、ＯＣＴペプチド処置が解剖学
的損傷を著しく減ずることを示した虚血動物は、虚血誘
発機能亢進および短期記憶の損失に対するペプチド保護
によって立証されるように、統計学的に改善された機能
活性をも示した。
的損傷を著しく減ずることを示した虚血動物は、虚血誘
発機能亢進および短期記憶の損失に対するペプチド保護
によって立証されるように、統計学的に改善された機能
活性をも示した。
【００７７】ＩＶ．神経保護ＯＣＴペプチド化合物 Ａ．ＯＣＴペプチドの選択 完全な配列が知られているペプチド（図１）の配列相同
性分析に基づいて、天然に生じる神経保護ＯＣＴペプチ
ドを、図１４から認識され得るように、別個のグループ
ＩおよびＩＩに、それぞれ、そのグループに対する異な
る内部相同性を用いて、分類された。グループＩは、神
経保護活性を有する化合物の範囲内のＭＶＩＩＡ部位に
対する結合定数を有する活性ＯＣＴペプチドＭＶＩＩＡ
およびＭＶＩＩＢを含んでいる。グループＩＩは、神経
保護ペプチドＧＶＩＡおよびＴＶＩＡを含んでいる。第
三のグループは、不活性ペプチドＳＶＩＡおよびＳＶＩ
Ｂならびに、ニューロン膜上のＭＶＩＩＡ部位に関する
結合活性および／またはノルエピネフリン阻害における
活性が活性化合物の範囲外にあるＯＣＴペプチドを含ん
でいる。
性分析に基づいて、天然に生じる神経保護ＯＣＴペプチ
ドを、図１４から認識され得るように、別個のグループ
ＩおよびＩＩに、それぞれ、そのグループに対する異な
る内部相同性を用いて、分類された。グループＩは、神
経保護活性を有する化合物の範囲内のＭＶＩＩＡ部位に
対する結合定数を有する活性ＯＣＴペプチドＭＶＩＩＡ
およびＭＶＩＩＢを含んでいる。グループＩＩは、神経
保護ペプチドＧＶＩＡおよびＴＶＩＡを含んでいる。第
三のグループは、不活性ペプチドＳＶＩＡおよびＳＶＩ
Ｂならびに、ニューロン膜上のＭＶＩＩＡ部位に関する
結合活性および／またはノルエピネフリン阻害における
活性が活性化合物の範囲外にあるＯＣＴペプチドを含ん
でいる。
【００７８】ＯＣＴペプチドの３つのグループは、一直
線にされたそれらの６つのＣｙｓ残基と共に、図１４中
に配列され、それは、位置１，８，１５，１６，２０お
よび２８にこれらの残基を置いている。この直線を作る
ために、ギャップが、３つのグループの中に示された位
置に導入された。以下の分析において、これらのギャッ
プは、たとえ、それらが、活性ＯＣＴペプチドのそれぞ
れのグループ中のアミノ酸の欠落を表していても、図１
４中に示された割り当てられた数を保持する。
線にされたそれらの６つのＣｙｓ残基と共に、図１４中
に配列され、それは、位置１，８，１５，１６，２０お
よび２８にこれらの残基を置いている。この直線を作る
ために、ギャップが、３つのグループの中に示された位
置に導入された。以下の分析において、これらのギャッ
プは、たとえ、それらが、活性ＯＣＴペプチドのそれぞ
れのグループ中のアミノ酸の欠落を表していても、図１
４中に示された割り当てられた数を保持する。
【００７９】ペプチド中の配列変化は、一次構造のみに
基づいて、次の制約を採用することによって分析され
た： １．両方のグループ中のペプチドは、位置１，８，１
５，１６，２０，および２８にＣｙｓ残基を含んでい
る。他のＣｙｓ残基は、それらがペプチドの酸化の際に
選択的に保護されて３つのジスルフィド結合を形成する
場合にのみ、以下に示す位置で置換され得た。
基づいて、次の制約を採用することによって分析され
た： １．両方のグループ中のペプチドは、位置１，８，１
５，１６，２０，および２８にＣｙｓ残基を含んでい
る。他のＣｙｓ残基は、それらがペプチドの酸化の際に
選択的に保護されて３つのジスルフィド結合を形成する
場合にのみ、以下に示す位置で置換され得た。
【００８０】２．両方のグループ中のペプチドは、位置
１および１６、８および２０、そして１５および３０で
Ｃｙｓ残基に連結している３つのジスルフィド結合を含
んでいる。上述したように、ジスルフィドブリッヂは、
ＤＴＴの存在下に完全配列ペプチドの空気酸化により形
成される。ペプチドが３つの所望のジスルフィド結合を
形成できることは、それ故、ペプチドが、ジスルフィド
架橋の前に、３つの選択された結合を許す構造を、上で
検討されたＣｙｓ保護基方法を用いてまたは用いずに、
取り入れることができることを必要とするであろう。こ
の制約は、従って、３つの選択したブリッジの形成を妨
げるかまたは別の方法でじゃまするアミノ酸変化を除外
するであろう。
１および１６、８および２０、そして１５および３０で
Ｃｙｓ残基に連結している３つのジスルフィド結合を含
んでいる。上述したように、ジスルフィドブリッヂは、
ＤＴＴの存在下に完全配列ペプチドの空気酸化により形
成される。ペプチドが３つの所望のジスルフィド結合を
形成できることは、それ故、ペプチドが、ジスルフィド
架橋の前に、３つの選択された結合を許す構造を、上で
検討されたＣｙｓ保護基方法を用いてまたは用いずに、
取り入れることができることを必要とするであろう。こ
の制約は、従って、３つの選択したブリッジの形成を妨
げるかまたは別の方法でじゃまするアミノ酸変化を除外
するであろう。
【００８１】制約１および２は、３つのジスルフィドブ
リッジにより課されたＯＣＴペプチドの基本的構造を保
つ。
リッジにより課されたＯＣＴペプチドの基本的構造を保
つ。
【００８２】３．第一グループ内で、６つの非保存残基
で生じるアミノ酸変化が許され、カルボキシ末端がアミ
ド化されるかまたは遊離酸の形を有するペプチドを含
む。すなわち、第一グループの化合物は、形： ＣＫＧＫＧＡＸ1ＣＸ2ＲＸ3Ｘ4ＹＤＣＣＴＧＳＣＸ5Ｒ
Ｘ6ＧＫＣ−ｔ 〔但し、Ｘ1＝ＫまたはＳ；Ｘ2＝ＳまたはＨ；Ｘ3＝Ｌ
またはＴ；Ｘ4＝ＭまたはＳ；Ｘ5＝Ｎまたは欠落；Ｘ6
＝Ｓまたは欠落；そしてｔはカルボキシまたはアミド化
カルボキシ末端基である。〕を有するペプチド構造を含
んでいる。
で生じるアミノ酸変化が許され、カルボキシ末端がアミ
ド化されるかまたは遊離酸の形を有するペプチドを含
む。すなわち、第一グループの化合物は、形： ＣＫＧＫＧＡＸ1ＣＸ2ＲＸ3Ｘ4ＹＤＣＣＴＧＳＣＸ5Ｒ
Ｘ6ＧＫＣ−ｔ 〔但し、Ｘ1＝ＫまたはＳ；Ｘ2＝ＳまたはＨ；Ｘ3＝Ｌ
またはＴ；Ｘ4＝ＭまたはＳ；Ｘ5＝Ｎまたは欠落；Ｘ6
＝Ｓまたは欠落；そしてｔはカルボキシまたはアミド化
カルボキシ末端基である。〕を有するペプチド構造を含
んでいる。
【００８３】４．第二グループ内で、５つの非保存残基
で生じるアミノ酸変化が許され、カルボキシ末端がアミ
ド化されるかまたは遊離酸の形を有するペプチドを含
む。従って、第二グループの化合物は、形： ＣＸ1ＳＸＧＳＳＣＳＸＴＳＹＮＣＣＲＳＣＮＸＹＸ2Ｘ
3Ｘ4ＣＸ5−ｔ 〔但し、Ｘ1＝ＫまたはＬ；Ｘ2＝ＴまたはＳ；Ｘ3＝Ｋ
またはＲ；Ｘ4＝ＲまたはＫ；Ｘ5＝ＹまたはＲ；そして
ｔ＝カルボキシまたはアミド化カルボキシ末端基〕を有
するペプチド構造を含んでいる。
で生じるアミノ酸変化が許され、カルボキシ末端がアミ
ド化されるかまたは遊離酸の形を有するペプチドを含
む。従って、第二グループの化合物は、形： ＣＸ1ＳＸＧＳＳＣＳＸＴＳＹＮＣＣＲＳＣＮＸＹＸ2Ｘ
3Ｘ4ＣＸ5−ｔ 〔但し、Ｘ1＝ＫまたはＬ；Ｘ2＝ＴまたはＳ；Ｘ3＝Ｋ
またはＲ；Ｘ4＝ＲまたはＫ；Ｘ5＝ＹまたはＲ；そして
ｔ＝カルボキシまたはアミド化カルボキシ末端基〕を有
するペプチド構造を含んでいる。
【００８４】５．両方の活性グループを共に考慮する
と、全ての活性種中で保存されているアミノ酸位置が維
持される。従って、例えば、Ｃｙｓ残基、５位グリシ
ン、１３位チロシン、１９位セリン、そして２６位リシ
ンは全て維持される。
と、全ての活性種中で保存されているアミノ酸位置が維
持される。従って、例えば、Ｃｙｓ残基、５位グリシ
ン、１３位チロシン、１９位セリン、そして２６位リシ
ンは全て維持される。
【００８５】６．両方の活性グループを共に考慮する
と、活性種の範囲内で変わりそうなアミノ酸位置があ
る。例えば、位置２のアミノ酸は、リシンまたはロイシ
ンであり得、そして位置３のアミノ酸はグリシンまたは
セリンであり得る。さらに、もし異なる位置の２つまた
はそれ以上のアミノ酸が共通の置換クラス中にあるなら
ば、そのクラス中の置換が好都合であり得る。標準的置
換クラスは、例えば、標準Ｄａｙｈｏｆｆ頻度交換マト
リックス（Ｄａｙｈｏｆｆ）により決定されるように、
実際に、相同タンパク質中の共通の側鎖特性および最も
高い置換頻度に基づいて６つのクラスがある。これらの
クラスは、クラスＩ：Ｃｙｓ；クラスＩＩ：Ｓｅｒ，Ｔ
ｈｒ，Ｐｒｏ，４Ｈｙｐ，Ａｌａ，およびＧｌｙ，小さ
い脂肪族側鎖およびＯＨ基側鎖を表している；クラスＩ
ＩＩ：Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，およびＧｌｎ，水素結
合を形成できる、中性および負電荷側鎖を表している；
クラスＩＶ：Ｈｉｓ，Ａｒｇ，およびＬｙｓ，塩基性極
性側鎖を表している；クラスＶ：Ｉｌｅ，Ｖａｌ，およ
びＬｅｕ，分枝脂肪族側鎖を表している、ならびにＭｅ
ｔ；ならびにクラスＶＩ：Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，およびＴｒ
ｐ，芳香族側鎖を表している、である。さらに、各グル
ープは、関連したアミノ酸類似体、例えば、クラスＩＶ
中に、オルニチン、ホモアルギニン、Ｎ‐メチルリシ
ン、ジメチルリシン、またはトリメチルリシン、およ
び、クラスＶＩ中にシクロヘキシルアラニンまたはハロ
ゲン化チロシンを含み得る。さらに、当該クラスは、Ｌ
‐アミノ酸が置換に好ましいにもかかわらず、Ｌおよび
Ｄ立体異性体を含み得る。
と、活性種の範囲内で変わりそうなアミノ酸位置があ
る。例えば、位置２のアミノ酸は、リシンまたはロイシ
ンであり得、そして位置３のアミノ酸はグリシンまたは
セリンであり得る。さらに、もし異なる位置の２つまた
はそれ以上のアミノ酸が共通の置換クラス中にあるなら
ば、そのクラス中の置換が好都合であり得る。標準的置
換クラスは、例えば、標準Ｄａｙｈｏｆｆ頻度交換マト
リックス（Ｄａｙｈｏｆｆ）により決定されるように、
実際に、相同タンパク質中の共通の側鎖特性および最も
高い置換頻度に基づいて６つのクラスがある。これらの
クラスは、クラスＩ：Ｃｙｓ；クラスＩＩ：Ｓｅｒ，Ｔ
ｈｒ，Ｐｒｏ，４Ｈｙｐ，Ａｌａ，およびＧｌｙ，小さ
い脂肪族側鎖およびＯＨ基側鎖を表している；クラスＩ
ＩＩ：Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，およびＧｌｎ，水素結
合を形成できる、中性および負電荷側鎖を表している；
クラスＩＶ：Ｈｉｓ，Ａｒｇ，およびＬｙｓ，塩基性極
性側鎖を表している；クラスＶ：Ｉｌｅ，Ｖａｌ，およ
びＬｅｕ，分枝脂肪族側鎖を表している、ならびにＭｅ
ｔ；ならびにクラスＶＩ：Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，およびＴｒ
ｐ，芳香族側鎖を表している、である。さらに、各グル
ープは、関連したアミノ酸類似体、例えば、クラスＩＶ
中に、オルニチン、ホモアルギニン、Ｎ‐メチルリシ
ン、ジメチルリシン、またはトリメチルリシン、およ
び、クラスＶＩ中にシクロヘキシルアラニンまたはハロ
ゲン化チロシンを含み得る。さらに、当該クラスは、Ｌ
‐アミノ酸が置換に好ましいにもかかわらず、Ｌおよび
Ｄ立体異性体を含み得る。
【００８６】７．既知の不活性種を考慮すると、不活性
種中に存在するが活性種に存在しないアミノ酸に、任意
の選択された残基位置で置換することは、活性化合物中
の活性を維持するのに好ましくない。従って、例えば、
３位のセリンは、活性および不活性化合物の両方の中に
存在するが、４位のセリンは不活性種のみの中に存在
し、従って好ましくない。
種中に存在するが活性種に存在しないアミノ酸に、任意
の選択された残基位置で置換することは、活性化合物中
の活性を維持するのに好ましくない。従って、例えば、
３位のセリンは、活性および不活性化合物の両方の中に
存在するが、４位のセリンは不活性種のみの中に存在
し、従って好ましくない。
【００８７】上記アミノ酸選択ルール６〜７は、神経保
護ＯＣＴペプチド中の許されたアミノ酸置換のための基
準として意図される。いったんアミノ酸置換または変性
がなされると、上述したように、ペプチドはさらに必要
なカルシウムチャンネルアンタゴニスト活性、および、
ノルエピネフリン放出の阻害およびニューロン膜のＭＶ
ＩＩＡ結合部位への結合に関する、必要な活性について
スクリーニングされる。
護ＯＣＴペプチド中の許されたアミノ酸置換のための基
準として意図される。いったんアミノ酸置換または変性
がなされると、上述したように、ペプチドはさらに必要
なカルシウムチャンネルアンタゴニスト活性、および、
ノルエピネフリン放出の阻害およびニューロン膜のＭＶ
ＩＩＡ結合部位への結合に関する、必要な活性について
スクリーニングされる。
【００８８】ＯＣＴペプチドヘのアミノ酸置換または変
性のいくつかは、上で概説された原理を説明している。
例えば、図２と関連して、ＭＶＩＩＡ（１９５）化合物
は、図１４中に示されたＭＶＩＩＡ構造中の位置２６に
対応する位置にＬｙｓ〜Ａｌａ置換を含む。この置換
は、保存した配列位置にあるので、神経保護活性が失わ
れるか減ぜられるであろうことが予測される。上に見ら
れるように（図１２）、ＭＶＩＩＡ（１９５）ペプチド
は、ＭＶＩＩＡ結合活性の保持を示すが、置換されてい
ないＭＶＩＩＡ ＯＣＴと比べて、減ぜられたノルエピ
ネフリン活性、および、弱い神経保護活性を示す。
性のいくつかは、上で概説された原理を説明している。
例えば、図２と関連して、ＭＶＩＩＡ（１９５）化合物
は、図１４中に示されたＭＶＩＩＡ構造中の位置２６に
対応する位置にＬｙｓ〜Ａｌａ置換を含む。この置換
は、保存した配列位置にあるので、神経保護活性が失わ
れるか減ぜられるであろうことが予測される。上に見ら
れるように（図１２）、ＭＶＩＩＡ（１９５）ペプチド
は、ＭＶＩＩＡ結合活性の保持を示すが、置換されてい
ないＭＶＩＩＡ ＯＣＴと比べて、減ぜられたノルエピ
ネフリン活性、および、弱い神経保護活性を示す。
【００８９】別の例として、ＭＶＩＩＡ（２０１）化合
物は、位置９〜１２に、Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｍｅ
ｔからＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ，不活性ＳＶＩ
ＢＯＣＴペプチド中の位置９〜１２の配列への置換を含
む。位置９の置換は、Ａｒｇが、非神経保護化合物中の
この位置に存在しているが、神経保護ＯＣＴペプチドの
１つの中に存在していないので、好ましくない。位置１
０の置換は、同じ理由で好ましくない。しかしながら、
ＬｅｕからＴｈｒへの置換は神経保護ペプチド内で起こ
るので、位置１１の置換は好ましい。位置１２でのＭｅ
ｔからＳｅｒへの置換は同一の理由で好ましい。ペプチ
ド変性は２つの好ましくない置換を含むので、神経保護
活性が失われるか減ぜられるであろうことが予期され
る。上に見られるように、ＭＶＩＩＡ（２０１）ペプチ
ドは、ＭＶＩＩＡ結合活性の保持を示す（表３）が、置
換されていないＭＶＩＩＡ ＯＣＴと比較して、減ぜら
れたノルエピネフリン阻害活性（表２）および弱い神経
保護活性を示す（図１２）。
物は、位置９〜１２に、Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｍｅ
ｔからＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ，不活性ＳＶＩ
ＢＯＣＴペプチド中の位置９〜１２の配列への置換を含
む。位置９の置換は、Ａｒｇが、非神経保護化合物中の
この位置に存在しているが、神経保護ＯＣＴペプチドの
１つの中に存在していないので、好ましくない。位置１
０の置換は、同じ理由で好ましくない。しかしながら、
ＬｅｕからＴｈｒへの置換は神経保護ペプチド内で起こ
るので、位置１１の置換は好ましい。位置１２でのＭｅ
ｔからＳｅｒへの置換は同一の理由で好ましい。ペプチ
ド変性は２つの好ましくない置換を含むので、神経保護
活性が失われるか減ぜられるであろうことが予期され
る。上に見られるように、ＭＶＩＩＡ（２０１）ペプチ
ドは、ＭＶＩＩＡ結合活性の保持を示す（表３）が、置
換されていないＭＶＩＩＡ ＯＣＴと比較して、減ぜら
れたノルエピネフリン阻害活性（表２）および弱い神経
保護活性を示す（図１２）。
【００９０】Ｂ．ＣＯＴペプチド 本発明はさらに、天然のＣ末端アミド化ＯＣＴペプチド
ＭＶＩＩＡ，ＭＶＩＩＢ，ＧＶＩＡ，およびＴＶＩＡを
除いて、上記アミノ酸選択規則３および４に従って形成
された活性ＯＣＴペプチドを含む。
ＭＶＩＩＡ，ＭＶＩＩＢ，ＧＶＩＡ，およびＴＶＩＡを
除いて、上記アミノ酸選択規則３および４に従って形成
された活性ＯＣＴペプチドを含む。
【００９１】さらに特に、本発明のペプチド化合物は、
Ｘ1＝Ｋ、Ｘ2＝Ｓ、Ｘ3＝Ｌ、Ｘ4＝Ｍ、Ｘ5＝欠落、そ
してＸ6＝ＳおよびＸ1＝Ｓ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝
Ｓ、Ｘ5＝欠落、そしてＸ6＝欠落のペプチドを除く、
形： ＣＫＧＫＧＡＸ1ＣＸ2ＲＸ3Ｘ4ＹＤＣＣＴＧＳＣＸ5Ｒ
Ｘ6ＧＫＣ−ｔ（グループ１） 〔但し、Ｘ1＝ＫまたはＳ；Ｘ2＝ＳまたはＨ；Ｘ3＝Ｌ
またはＴ；Ｘ4＝ＭまたはＳ；Ｘ5＝Ｎまたは欠落；Ｘ6
＝Ｓまたは欠落、そしてｔ＝カルボキシまたはアミド化
カルボキシ末端基〕；および、Ｘ1＝Ｋ、Ｘ2＝Ｔ、Ｘ3
＝Ｋ、Ｘ4＝Ｒ、そしてＸ5＝Ｙ；およびＸ1＝Ｌ、Ｘ2＝
Ｓ、Ｘ3＝Ｒ、Ｘ4＝Ｋ、そしてＸ5＝Ｒのペプチドを除
く： ＣＸ1ＳＸＧＳＳＣＳＸＴＳＹＮＣＣＲＳＣＮＸＹＸ2Ｘ
3Ｘ4ＣＸ5−ｔ（グループ２） 〔但し、Ｘ1＝ＫまたはＬ；Ｘ2＝ＴまたはＳ；Ｘ3＝Ｋ
またはＲ；Ｘ4＝ＲまたはＫ；そしてＸ5＝ＹまたはＲ〕
を有する。
Ｘ1＝Ｋ、Ｘ2＝Ｓ、Ｘ3＝Ｌ、Ｘ4＝Ｍ、Ｘ5＝欠落、そ
してＸ6＝ＳおよびＸ1＝Ｓ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝
Ｓ、Ｘ5＝欠落、そしてＸ6＝欠落のペプチドを除く、
形： ＣＫＧＫＧＡＸ1ＣＸ2ＲＸ3Ｘ4ＹＤＣＣＴＧＳＣＸ5Ｒ
Ｘ6ＧＫＣ−ｔ（グループ１） 〔但し、Ｘ1＝ＫまたはＳ；Ｘ2＝ＳまたはＨ；Ｘ3＝Ｌ
またはＴ；Ｘ4＝ＭまたはＳ；Ｘ5＝Ｎまたは欠落；Ｘ6
＝Ｓまたは欠落、そしてｔ＝カルボキシまたはアミド化
カルボキシ末端基〕；および、Ｘ1＝Ｋ、Ｘ2＝Ｔ、Ｘ3
＝Ｋ、Ｘ4＝Ｒ、そしてＸ5＝Ｙ；およびＸ1＝Ｌ、Ｘ2＝
Ｓ、Ｘ3＝Ｒ、Ｘ4＝Ｋ、そしてＸ5＝Ｒのペプチドを除
く： ＣＸ1ＳＸＧＳＳＣＳＸＴＳＹＮＣＣＲＳＣＮＸＹＸ2Ｘ
3Ｘ4ＣＸ5−ｔ（グループ２） 〔但し、Ｘ1＝ＫまたはＬ；Ｘ2＝ＴまたはＳ；Ｘ3＝Ｋ
またはＲ；Ｘ4＝ＲまたはＫ；そしてＸ5＝ＹまたはＲ〕
を有する。
【００９２】これらのペプチドは、本発明の組成物中
に、適当な薬学的キャリヤーと共に配合のために意図さ
れる。
に、適当な薬学的キャリヤーと共に配合のために意図さ
れる。
【００９３】Ｖ．神経保護化合物を選択する セクションＩＩ中で検討された化合物試験方法が、本発
明に従って同様に使用されて、神経保護活性を有するカ
ルシウムチャンネルアンタゴニスト化合物を同定するこ
とができる。スクリーニング方法において、カルシウム
チャンネルアンタゴニスト化合物が、哺乳動物ＣＮＳニ
ューロン細胞中のノルエピネフリン放出を阻害するその
能力について、および、神経細胞ω−コノトキシンＭＶ
ＩＩＡ結合部位へのその親和性について、スクリーニン
グされる。試験化合物のカルシウムチャンネルアンタゴ
ニスト活性は既知であり得、または、実施例１に記載さ
れているように、ニューロン細胞中の脱分極誘発カルシ
ウムチャンネル電流を阻害するその能力により、示され
得る。
明に従って同様に使用されて、神経保護活性を有するカ
ルシウムチャンネルアンタゴニスト化合物を同定するこ
とができる。スクリーニング方法において、カルシウム
チャンネルアンタゴニスト化合物が、哺乳動物ＣＮＳニ
ューロン細胞中のノルエピネフリン放出を阻害するその
能力について、および、神経細胞ω−コノトキシンＭＶ
ＩＩＡ結合部位へのその親和性について、スクリーニン
グされる。試験化合物のカルシウムチャンネルアンタゴ
ニスト活性は既知であり得、または、実施例１に記載さ
れているように、ニューロン細胞中の脱分極誘発カルシ
ウムチャンネル電流を阻害するその能力により、示され
得る。
【００９４】試験化合物は、当該化合物が： （ｉ）ＯＣＴペプチドＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡ，およびＴ
ＶＩＡがこのようなノルエピネフリン放出を有効に阻害
する、濃度範囲中で、哺乳動物ＣＮＳ神経細胞中のノル
エピネフリン放出を阻害するのに有効であり、そして （ｉｉ）ＯＣＴペプチドＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡ，および
ＴＶＩＡの結合部位に関する結合親和性の範囲内にある
ＯＣＴ ＭＶＩＩＡ結合部位に関する結合親和性を有す
るならばこのような神経損傷を処置する際に使用するた
めに選択される。
ＶＩＡがこのようなノルエピネフリン放出を有効に阻害
する、濃度範囲中で、哺乳動物ＣＮＳ神経細胞中のノル
エピネフリン放出を阻害するのに有効であり、そして （ｉｉ）ＯＣＴペプチドＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡ，および
ＴＶＩＡの結合部位に関する結合親和性の範囲内にある
ＯＣＴ ＭＶＩＩＡ結合部位に関する結合親和性を有す
るならばこのような神経損傷を処置する際に使用するた
めに選択される。
【００９５】スクリーニングされ得る化合物は、ＯＣＴ
ペプチド、ならびにその類似体およびフラグメントに加
えて、別のペプチドおよびペプチドフラグメントならび
に有機分子を含む。好ましいスクリーニング方法は上に
記載され、そして実施例２、４、および５に詳述されて
いる。
ペプチド、ならびにその類似体およびフラグメントに加
えて、別のペプチドおよびペプチドフラグメントならび
に有機分子を含む。好ましいスクリーニング方法は上に
記載され、そして実施例２、４、および５に詳述されて
いる。
【００９６】次の実施例で、本発明の組成物の種々の特
徴、および虚血関連損傷（ｉｎｊｕｒｙ）中のニューロ
ン損傷（ｄａｍａｇｅ）を減ずる際のそれらの使用を説
明するつもりであるが、本発明の範囲を限定することは
決して意図されていない。
徴、および虚血関連損傷（ｉｎｊｕｒｙ）中のニューロ
ン損傷（ｄａｍａｇｅ）を減ずる際のそれらの使用を説
明するつもりであるが、本発明の範囲を限定することは
決して意図されていない。
【００９７】
【実施例】（実施例１） カルシウム−チャンネルアンタゴニスト活性：イオン電
流の阻害 カルシウムチャンネルを通るイオン電流を、単一のパッ
チ−クランプ電極により電圧固定された細胞中で調べ
た。これらの完全な細胞のパッチ−クランプ研究は、種
々の細胞型が調べられているが、主としてＮ１Ｅ１１５
マウス神経芽細胞腫細胞に関してなされた。
流の阻害 カルシウムチャンネルを通るイオン電流を、単一のパッ
チ−クランプ電極により電圧固定された細胞中で調べ
た。これらの完全な細胞のパッチ−クランプ研究は、種
々の細胞型が調べられているが、主としてＮ１Ｅ１１５
マウス神経芽細胞腫細胞に関してなされた。
【００９８】Ａ．電流測定方法 たいていの測定値は、カルシウム電流の調査を他のイオ
ン電流の不存在下に可能にする浴塩類溶液を用いて得ら
れた。これらの溶液は、８０ｍＭ ＮＭＤＧ（ナトリウ
ム置換として）、３０ｍＭ ＴＥＡＣｌ（カリウム電流
を遮断する）、１０ｍＭ ＢａＣｌ2（カルシウムチャ
ンネルを通る電荷キャリヤーとして）、および１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳを、ｐＨ７.３で含んでいた。いくつかの
溶液は、２ｍＭキニジン（カリウム電流を遮断する）お
よび３μＭテトロドトキシン（ナトリウム電流を遮断す
る）をも含む。通常の浴塩類溶液は（ｍＭ）：１４０
ＮａＣｌ、１０ ブドウ糖、３ ＫＣｌ、２ ＣａＣｌ
2、１ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.３
であった。細胞間溶液は、１５０ｍＭ ＣｓＣｌ、０.
５ｍＭ ＣａＣｌ2、５ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2、２ｍＭ Ｋ2ＡＴＰをｐＨ７.３〜７.４で含んで
いた。浴塩類溶液および全ての内部溶液は、使用する前
に濾過された。
ン電流の不存在下に可能にする浴塩類溶液を用いて得ら
れた。これらの溶液は、８０ｍＭ ＮＭＤＧ（ナトリウ
ム置換として）、３０ｍＭ ＴＥＡＣｌ（カリウム電流
を遮断する）、１０ｍＭ ＢａＣｌ2（カルシウムチャ
ンネルを通る電荷キャリヤーとして）、および１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳを、ｐＨ７.３で含んでいた。いくつかの
溶液は、２ｍＭキニジン（カリウム電流を遮断する）お
よび３μＭテトロドトキシン（ナトリウム電流を遮断す
る）をも含む。通常の浴塩類溶液は（ｍＭ）：１４０
ＮａＣｌ、１０ ブドウ糖、３ ＫＣｌ、２ ＣａＣｌ
2、１ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.３
であった。細胞間溶液は、１５０ｍＭ ＣｓＣｌ、０.
５ｍＭ ＣａＣｌ2、５ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2、２ｍＭ Ｋ2ＡＴＰをｐＨ７.３〜７.４で含んで
いた。浴塩類溶液および全ての内部溶液は、使用する前
に濾過された。
【００９９】ピペットは、Ｃｏｒｎｉｎｇ ７０５２ガ
ラス（Ｇａｒｎｅｒ ＧｌａｓｓＣｏｍｐａｎｙ，Ｃｌ
ａｒｅｍｏｎｔ，カリフォルニア州 ９１７１１）から
作られ、Ｓｙｌｇａｒｄ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍ
ｉｄｌａｎｄ，ミシガン州４８６４０）で被覆されそし
て使用前に火仕上げされた。泡数は、ピペット抵抗一般
に２〜５ＭＯｈｍで、一般に５〜６であった。Ｃｏｒｎ
ｉｎｇ ８１６１、Ｋｉｍｂｌｅ、および別のガラス
も、観察されたカルシウム電流に関する顕著な影響なし
に使用された。
ラス（Ｇａｒｎｅｒ ＧｌａｓｓＣｏｍｐａｎｙ，Ｃｌ
ａｒｅｍｏｎｔ，カリフォルニア州 ９１７１１）から
作られ、Ｓｙｌｇａｒｄ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍ
ｉｄｌａｎｄ，ミシガン州４８６４０）で被覆されそし
て使用前に火仕上げされた。泡数は、ピペット抵抗一般
に２〜５ＭＯｈｍで、一般に５〜６であった。Ｃｏｒｎ
ｉｎｇ ８１６１、Ｋｉｍｂｌｅ、および別のガラス
も、観察されたカルシウム電流に関する顕著な影響なし
に使用された。
【０１００】記録は、室温で、Ａｘｏｐａｔｃｈ １−
Ｃ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｏｓ
ｔｅｒ Ｃｉｔｙ，カリフォルニア州 ９４４０４）を
用いて行われそして、ｐＣＬＡＭＰソフトウェア（Ａｘ
ｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて分析された。
データは、１ｋＨｚの典型的なサンプリング率として１
０００Ｈｚでフィルターにかけた；全ての場合におい
て、データは、ほとんどサンプリング率の１／５の振動
数でフィルターにかけた。データは、当該ソフトウェア
によりオンラインで集められた。分析は、Ｈｅｗｌｅｔ
ｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ＬａｓｅｒＪｅｔ Ｐｒｉｎｔｅ
ｒ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｐａｌｏ Ａｌ
ｔｏ，カリフォルニア州 ９４３０６）を介してプリン
トアウトしてスクリーン上で行われた。
Ｃ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｏｓ
ｔｅｒ Ｃｉｔｙ，カリフォルニア州 ９４４０４）を
用いて行われそして、ｐＣＬＡＭＰソフトウェア（Ａｘ
ｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて分析された。
データは、１ｋＨｚの典型的なサンプリング率として１
０００Ｈｚでフィルターにかけた；全ての場合におい
て、データは、ほとんどサンプリング率の１／５の振動
数でフィルターにかけた。データは、当該ソフトウェア
によりオンラインで集められた。分析は、Ｈｅｗｌｅｔ
ｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ＬａｓｅｒＪｅｔ Ｐｒｉｎｔｅ
ｒ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｐａｌｏ Ａｌ
ｔｏ，カリフォルニア州 ９４３０６）を介してプリン
トアウトしてスクリーン上で行われた。
【０１０１】典型的な実験は次のようにして行われた：
シール形成に続いて直列抵抗補正および容量性一時的相
殺の後、１０ｍＶずつの増加で、細胞電位を、保持電位
（一般に−１００ｍＶ）から、−６０ｍＶから＋２０ｍ
Ｖに変動する試験電位まで上げる電圧クランププロトコ
ールを行った。細胞を、パルスの間５秒間保持電位で保
持した。別の保持電位から出発するプロトコールは通
常、試験電位の同一範囲をカバーした。
シール形成に続いて直列抵抗補正および容量性一時的相
殺の後、１０ｍＶずつの増加で、細胞電位を、保持電位
（一般に−１００ｍＶ）から、−６０ｍＶから＋２０ｍ
Ｖに変動する試験電位まで上げる電圧クランププロトコ
ールを行った。細胞を、パルスの間５秒間保持電位で保
持した。別の保持電位から出発するプロトコールは通
常、試験電位の同一範囲をカバーした。
【０１０２】Ｂ．電流阻害測定 図３は、Ｎ１Ｅ−１１５マウス神経芽細胞腫細胞からの
カルシウム電流トレースを示す。この図は、時間に関し
て、左から右へ読み、トレースの下向きの振れば、細胞
中への正の電流を示している。電流は、１００ｍＶから
−１０ｍＶへの電圧段階によって引き出された。細胞
は、ナトリウムをＮＭＤＧによって置き換えそして２ｍ
Ｍ Ｃａの代わりに１０ｍＭ Ｂａを含む塩類溶液中に
浸した。カリウム電流は、浴中のＴＥＡおよびピペット
溶液中のＣｓによって遮断された。
カルシウム電流トレースを示す。この図は、時間に関し
て、左から右へ読み、トレースの下向きの振れば、細胞
中への正の電流を示している。電流は、１００ｍＶから
−１０ｍＶへの電圧段階によって引き出された。細胞
は、ナトリウムをＮＭＤＧによって置き換えそして２ｍ
Ｍ Ｃａの代わりに１０ｍＭ Ｂａを含む塩類溶液中に
浸した。カリウム電流は、浴中のＴＥＡおよびピペット
溶液中のＣｓによって遮断された。
【０１０３】図３中，Ｂ〜Ｄを付けた３つのトレース
は、１０ｎＭ（３Ｂ），５０ｎＭ（３Ｃ）、そして２０
０ｎＭ（３Ｄ）の増加するＭＶＩＩＡ ＯＣＴペプチド
濃度で、減少するカルシウム電流を示している。
は、１０ｎＭ（３Ｂ），５０ｎＭ（３Ｃ）、そして２０
０ｎＭ（３Ｄ）の増加するＭＶＩＩＡ ＯＣＴペプチド
濃度で、減少するカルシウム電流を示している。
【０１０４】電圧ゲートカルシウム電流の、ＯＣＴｓ
ＭＶＩＩＡおよびＧＶＩＡの増加する用量に対する応答
が図４中に示されている。計算したＩＣ50は、ＧＶＩＡ
について１２ｎＭそしてＭＶＩＩＡについて１１６ｎＭ
である。これらの値は、それらの作用部位に関する当該
ペプチドの極めて高い特異性を示している。
ＭＶＩＩＡおよびＧＶＩＡの増加する用量に対する応答
が図４中に示されている。計算したＩＣ50は、ＧＶＩＡ
について１２ｎＭそしてＭＶＩＩＡについて１１６ｎＭ
である。これらの値は、それらの作用部位に関する当該
ペプチドの極めて高い特異性を示している。
【０１０５】表１は、ＧＶＩＡ，ＭＶＩＩＡ，ＳＶＩＢ
およびＳＶＩＡ ＯＣＴに関するＩＣ50値を比較してい
る。ＯＣＴ ＧＶＩＡおよびＯＣＴ ＭＶＩＩＡはナノ
モル濃度範囲で、測定されたカルシウム電流の５０％阻
害を示すのに、ＯＣＴ ＳＶＩＢおよびＯＣＴ ＳＶＩ
Ａに関するＩＣ50値は、試験した濃度範囲内で測定でき
なかった、それ故、示されたマイクロモル濃度より上の
ＩＣ50値を有するように列挙されている。ＯＣＴ ＳＶ
ＩＢおよびＯＣＴ ＳＶＩＡは、このアッセイ中で不活
性であると考察される。
およびＳＶＩＡ ＯＣＴに関するＩＣ50値を比較してい
る。ＯＣＴ ＧＶＩＡおよびＯＣＴ ＭＶＩＩＡはナノ
モル濃度範囲で、測定されたカルシウム電流の５０％阻
害を示すのに、ＯＣＴ ＳＶＩＢおよびＯＣＴ ＳＶＩ
Ａに関するＩＣ50値は、試験した濃度範囲内で測定でき
なかった、それ故、示されたマイクロモル濃度より上の
ＩＣ50値を有するように列挙されている。ＯＣＴ ＳＶ
ＩＢおよびＯＣＴ ＳＶＩＡは、このアッセイ中で不活
性であると考察される。
【０１０６】（実施例２） 神経伝達物質放出の阻害 Ａ．ラット海馬スライスからの［3Ｈ］ノルエピネフリ
ン放出 雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、エーテル
で軽く麻酔をかけ、首を切り、そして脳を取り除いた。
次いで海馬を解剖して大脳皮質を取り除きそして室温の
酸素化した捕集緩衝液（０.１％子ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）およびｍＭにおいて：ＮａＣｌ，１２３、Ｋ
Ｃｌ，４.８；ＣａＣｌ2，１.２；ＭｇＳＯ4，１.２；
ＫＨ2ＰＯ4，１.２；ブドウ糖，１１；ＮａＨＣＯ3，２
５）ですすいだ。スライス（厚さ２００または４００μ
Ｍ）を、ＴｃＩｌｗａｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｈｏｐｐ
ｅｒを用いて作りそして直ちに室温の捕集緩衝液に移し
た。次いで、スライスを、ウエルごとに、０.１ｍｌ捕
集緩衝液を含む９６−ウエルプレート（Ｄｙｎａｔｅｃ
ｈ）のそれぞれのウエルに分配した。次いで、１ｍＭア
スコルビン酸塩（ａｓｃｏｒｂａｔｅ）および試験化合
物を含む捕集緩衝液中に稀釈された［3Ｈ］ノルエピネ
フリン（３μＣｉ／ｍｌ）を各ウエルに添加した。イン
キュベーションは３７度で３０分間、加湿した、５％Ｃ
Ｏ2インキュベーター中であった。次いで、浸している
緩衝液を取り除きそしてスライスを２回それぞれ１１分
間、適当な試験化合物を含む基本緩衝液（基本緩衝液：
０.１％ＢＳＡおよびｍＭにおいて：ＮａＣｌ，１２
３、ＫＣｌ，５.０；ＣａＣｌ2，０.４；ＭｇＳＯ4，
１.２；ＫＨ2ＰＯ4，１.２；ブドウ糖，１１；ＮａＨＯ
3，２５）で洗浄した。次いで各スライスを１５分間基
本緩衝液０.１ｍｌ中でインキュベーションした。次い
でこの緩衝液を測定のために取り除きそして１５分間
０.１ｍｌ興奮緩衝液（０.１％ＢＳＡ ｍＭにおいて：
ＮａＣｌ，９７、ＫＣｌ，３０；ＣａＣｌ2，０.４；Ｍ
ｇＳＯ4，１.２；ＫＨ2ＰＯ4，１.２；ブドウ糖，１
１、ＮａＨＣＯ3，２５）によって置き換えた。次い
で、興奮緩衝液を、放射能測定のために取り除いた。各
スライス中に残っている放射能を測定した。データを、
スライスごとの放射能の総ｃｐｍに正規化した：総放射
能＝Ｓ＋Ｂ＋スライス〔但し、Ｓは興奮緩衝液中に存在
する放射能の量であり、そしてＢは、基本緩衝液中に存
在する放射能の量である。〕。総放射能の割合としての
興奮された放出＝１００（Ｓ／（Ｓ＋Ｂ＋スライ
ス））、および総放射能の割合としての基本放出＝１０
０（Ｂ／（Ｓ＋Ｂ＋スライス））。濃度効果グラフは、
図５中のようにプロットされた。コンピューターを用い
た曲線適合を用いて、このようなデータからＩＣ50値を
決定した。これらの値を図２に示す。
ン放出 雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、エーテル
で軽く麻酔をかけ、首を切り、そして脳を取り除いた。
次いで海馬を解剖して大脳皮質を取り除きそして室温の
酸素化した捕集緩衝液（０.１％子ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）およびｍＭにおいて：ＮａＣｌ，１２３、Ｋ
Ｃｌ，４.８；ＣａＣｌ2，１.２；ＭｇＳＯ4，１.２；
ＫＨ2ＰＯ4，１.２；ブドウ糖，１１；ＮａＨＣＯ3，２
５）ですすいだ。スライス（厚さ２００または４００μ
Ｍ）を、ＴｃＩｌｗａｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｈｏｐｐ
ｅｒを用いて作りそして直ちに室温の捕集緩衝液に移し
た。次いで、スライスを、ウエルごとに、０.１ｍｌ捕
集緩衝液を含む９６−ウエルプレート（Ｄｙｎａｔｅｃ
ｈ）のそれぞれのウエルに分配した。次いで、１ｍＭア
スコルビン酸塩（ａｓｃｏｒｂａｔｅ）および試験化合
物を含む捕集緩衝液中に稀釈された［3Ｈ］ノルエピネ
フリン（３μＣｉ／ｍｌ）を各ウエルに添加した。イン
キュベーションは３７度で３０分間、加湿した、５％Ｃ
Ｏ2インキュベーター中であった。次いで、浸している
緩衝液を取り除きそしてスライスを２回それぞれ１１分
間、適当な試験化合物を含む基本緩衝液（基本緩衝液：
０.１％ＢＳＡおよびｍＭにおいて：ＮａＣｌ，１２
３、ＫＣｌ，５.０；ＣａＣｌ2，０.４；ＭｇＳＯ4，
１.２；ＫＨ2ＰＯ4，１.２；ブドウ糖，１１；ＮａＨＯ
3，２５）で洗浄した。次いで各スライスを１５分間基
本緩衝液０.１ｍｌ中でインキュベーションした。次い
でこの緩衝液を測定のために取り除きそして１５分間
０.１ｍｌ興奮緩衝液（０.１％ＢＳＡ ｍＭにおいて：
ＮａＣｌ，９７、ＫＣｌ，３０；ＣａＣｌ2，０.４；Ｍ
ｇＳＯ4，１.２；ＫＨ2ＰＯ4，１.２；ブドウ糖，１
１、ＮａＨＣＯ3，２５）によって置き換えた。次い
で、興奮緩衝液を、放射能測定のために取り除いた。各
スライス中に残っている放射能を測定した。データを、
スライスごとの放射能の総ｃｐｍに正規化した：総放射
能＝Ｓ＋Ｂ＋スライス〔但し、Ｓは興奮緩衝液中に存在
する放射能の量であり、そしてＢは、基本緩衝液中に存
在する放射能の量である。〕。総放射能の割合としての
興奮された放出＝１００（Ｓ／（Ｓ＋Ｂ＋スライ
ス））、および総放射能の割合としての基本放出＝１０
０（Ｂ／（Ｓ＋Ｂ＋スライス））。濃度効果グラフは、
図５中のようにプロットされた。コンピューターを用い
た曲線適合を用いて、このようなデータからＩＣ50値を
決定した。これらの値を図２に示す。
【０１０７】（実施例３） シナプトソーム膜調製物 Ａ．哺乳動物−脳シナプトソームおよびシナプトソーム
膜 シナプトソームを、ラット全脳または脳の海馬領域から
調製した。ラットを犠牲にし、そして前脳を取り除き、
次のプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）を含む１０ｍｌの氷冷
した０.３２Ｍ蔗糖に移した：１ｍＭ ＥＧＴＡ；１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ；１μＭ ペプスタチン；２μＭロイペプ
チン。脳を、モーターで動かされるＴｅｆｌｏｎ−ガラ
スホモジナイザーを用いて均一化した（４００ｒｐｍで
約８パス）。４個の脳からのホモジネートをプールしそ
して９００×ｇで１０分間４度で遠心分離した。上清を
次いで８，５００×ｇで１５分間遠心分離した。結果と
して得られるペレットをそれぞれ１０ｍｌの氷冷した
０.３２Ｍ蔗糖＋ＰＩ中で渦状混合で再懸濁した。サス
ペンションを、次いで、８,５００×ｇで１５分間遠心
分離した。ペレットを２０ｍｌの氷冷した０.３２Ｍ蔗
糖＋ＰＩ中に再懸濁した。サスペンション（５ｍｌ／
管）を四段階蔗糖密度勾配で層にした（それぞれ７ｍ
ｌ：１.２Ｍ蔗糖，１.０Ｍ蔗糖，０.８Ｍ蔗糖，０.６Ｍ
蔗糖；全ての蔗糖溶液はＰＩを含んでいる）。勾配管
を、振動バケットローター中で１６０,０００×ｇで６
０分間４度で遠心分離した。１.０Ｍ蔗糖層＋１.０およ
び１.２Ｍ蔗糖層の間の境界面を集めそして氷冷した脱
イオン水＋ＰＩで稀釈して０.３２Ｍの最終蔗糖濃度に
した。結果として得られるサスペンションを、２０,０
００×ｇで１５分間遠心分離した。ペレットを次いで５
ｍｌ氷冷リン酸緩衝塩類溶液＋ＰＩ中に再懸濁した。結
果として生じるラット脳シナプトソームを次いで分割し
（ａｌｉｑｕｏｔｅ）そして液体窒素封入システム中に
貯蔵した。
膜 シナプトソームを、ラット全脳または脳の海馬領域から
調製した。ラットを犠牲にし、そして前脳を取り除き、
次のプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）を含む１０ｍｌの氷冷
した０.３２Ｍ蔗糖に移した：１ｍＭ ＥＧＴＡ；１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ；１μＭ ペプスタチン；２μＭロイペプ
チン。脳を、モーターで動かされるＴｅｆｌｏｎ−ガラ
スホモジナイザーを用いて均一化した（４００ｒｐｍで
約８パス）。４個の脳からのホモジネートをプールしそ
して９００×ｇで１０分間４度で遠心分離した。上清を
次いで８，５００×ｇで１５分間遠心分離した。結果と
して得られるペレットをそれぞれ１０ｍｌの氷冷した
０.３２Ｍ蔗糖＋ＰＩ中で渦状混合で再懸濁した。サス
ペンションを、次いで、８,５００×ｇで１５分間遠心
分離した。ペレットを２０ｍｌの氷冷した０.３２Ｍ蔗
糖＋ＰＩ中に再懸濁した。サスペンション（５ｍｌ／
管）を四段階蔗糖密度勾配で層にした（それぞれ７ｍ
ｌ：１.２Ｍ蔗糖，１.０Ｍ蔗糖，０.８Ｍ蔗糖，０.６Ｍ
蔗糖；全ての蔗糖溶液はＰＩを含んでいる）。勾配管
を、振動バケットローター中で１６０,０００×ｇで６
０分間４度で遠心分離した。１.０Ｍ蔗糖層＋１.０およ
び１.２Ｍ蔗糖層の間の境界面を集めそして氷冷した脱
イオン水＋ＰＩで稀釈して０.３２Ｍの最終蔗糖濃度に
した。結果として得られるサスペンションを、２０,０
００×ｇで１５分間遠心分離した。ペレットを次いで５
ｍｌ氷冷リン酸緩衝塩類溶液＋ＰＩ中に再懸濁した。結
果として生じるラット脳シナプトソームを次いで分割し
（ａｌｉｑｕｏｔｅ）そして液体窒素封入システム中に
貯蔵した。
【０１０８】結合アッセイで使用する前に、シナプトソ
ームを解かしそして３容積の氷冷した脱イオン水＋ＰＩ
で稀釈した。このサスペンションをＰＴ１０−３５Ｐｏ
ｌｙｔｒｏｎ（６に合わせる）を用いて２回の１０秒バ
ーストで均一化した。ホモジネートを、４０,０００×
ｇで２０分間４度で遠心分離した。結果として得られる
ペレットを約５ｍｌの氷冷したリン酸緩衝塩類溶液＋Ｐ
Ｉ中に再懸濁した。結果として得られる脳シナプトソー
ム膜調製物を分割しそして使用するまで−８０℃で貯蔵
した。膜調製物のタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ
試薬（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、標準として子ウシ血清
アルブミンを用いて求めた。
ームを解かしそして３容積の氷冷した脱イオン水＋ＰＩ
で稀釈した。このサスペンションをＰＴ１０−３５Ｐｏ
ｌｙｔｒｏｎ（６に合わせる）を用いて２回の１０秒バ
ーストで均一化した。ホモジネートを、４０,０００×
ｇで２０分間４度で遠心分離した。結果として得られる
ペレットを約５ｍｌの氷冷したリン酸緩衝塩類溶液＋Ｐ
Ｉ中に再懸濁した。結果として得られる脳シナプトソー
ム膜調製物を分割しそして使用するまで−８０℃で貯蔵
した。膜調製物のタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ
試薬（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、標準として子ウシ血清
アルブミンを用いて求めた。
【０１０９】（実施例４） シナプトソーム膜中のＭＶＩＩＡ結合部位へのＯＣＴペ
プチド結合 Ａ．飽和結合アッセイ ＭＶＩＩＡ ＯＣＴを、本質的にＡｈｍａｄらの方法に
従って、125Ｉ−ヨウ素を用いて、ＩｏｄｏｇｅｎTMと
の反応により放射能標識化した。Ｉｏｄｏｇｅｎ反応に
続いて、ペプチド溶液を、ＨＰＬＣによってＣ−８逆相
カラムを介してクロマトグラフィーで分離しそして０.
１％トリフルオロ酢酸から０.１％トリフルオロ酢酸中
６０％アセトニトリルまでの勾配で溶出した。誘導され
てないＭＶＩＩＡ ＯＣＴに続く放射活性のきわだった
ピークを集めた。
プチド結合 Ａ．飽和結合アッセイ ＭＶＩＩＡ ＯＣＴを、本質的にＡｈｍａｄらの方法に
従って、125Ｉ−ヨウ素を用いて、ＩｏｄｏｇｅｎTMと
の反応により放射能標識化した。Ｉｏｄｏｇｅｎ反応に
続いて、ペプチド溶液を、ＨＰＬＣによってＣ−８逆相
カラムを介してクロマトグラフィーで分離しそして０.
１％トリフルオロ酢酸から０.１％トリフルオロ酢酸中
６０％アセトニトリルまでの勾配で溶出した。誘導され
てないＭＶＩＩＡ ＯＣＴに続く放射活性のきわだった
ピークを集めた。
【０１１０】ラット脳シナプトソーム膜への［125Ｉ］
−ＭＶＩＩＡ ＯＣＴに関する結合 定数（Ｋd）を、［125Ｉ］ＭＶＩＩＡ ＯＣＴの増加す
る量をシナプトソーム膜調製物（１０μｇ膜タンパク
質，全容積０.５ｍｌ中、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ
７.０、７５ｍＭ ＮａＣｌ、０.１ｍＭ ＥＧＴＡ、
０.１ｍＭ ＥＤＴＡ、２μＭロイペプチン，０.０３５
μｇ／ｍｌアプロチニン、および０.１％子ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）からなる結合緩衝液中に懸濁され
た）のアリコートに添加する飽和結合法によって決定さ
れた。標識化化合物の各濃度での結合を、１ｎＭの標識
化していないＭＶＩＩＡ ＯＣＴの不存在または存在下
に決定して特異的結合を求めた。各濃度で特異的に結合
した標識化ペプチドの量を用いてＢmax、シナプトソー
ム上の特異的結合部位の濃度、および標準結合分析方法
（Ｂｅｎｎｅｔｔ）の後で、Ｋdを求めた。図６Ａは、
ラットシナプトソーム膜への［125Ｉ］ＭＶＩＩＡの飽
和結合曲線を示している。図６Ｂは、データのＳｃａｔ
ｃｈａｒｄ変換を示し、そこから、約１０ｐＭの計算さ
れたＫｄが求められる。
−ＭＶＩＩＡ ＯＣＴに関する結合 定数（Ｋd）を、［125Ｉ］ＭＶＩＩＡ ＯＣＴの増加す
る量をシナプトソーム膜調製物（１０μｇ膜タンパク
質，全容積０.５ｍｌ中、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ
７.０、７５ｍＭ ＮａＣｌ、０.１ｍＭ ＥＧＴＡ、
０.１ｍＭ ＥＤＴＡ、２μＭロイペプチン，０.０３５
μｇ／ｍｌアプロチニン、および０.１％子ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）からなる結合緩衝液中に懸濁され
た）のアリコートに添加する飽和結合法によって決定さ
れた。標識化化合物の各濃度での結合を、１ｎＭの標識
化していないＭＶＩＩＡ ＯＣＴの不存在または存在下
に決定して特異的結合を求めた。各濃度で特異的に結合
した標識化ペプチドの量を用いてＢmax、シナプトソー
ム上の特異的結合部位の濃度、および標準結合分析方法
（Ｂｅｎｎｅｔｔ）の後で、Ｋdを求めた。図６Ａは、
ラットシナプトソーム膜への［125Ｉ］ＭＶＩＩＡの飽
和結合曲線を示している。図６Ｂは、データのＳｃａｔ
ｃｈａｒｄ変換を示し、そこから、約１０ｐＭの計算さ
れたＫｄが求められる。
【０１１１】Ｂ．競合的置換結合アッセイ 実施例３に記載されたように調製したラット脳シナプト
ソーム膜を、２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７.０、７５ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、０.１ｍＭ ＥＧＴＡ、０.１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、２μＭロイペプチン、０.０３５μｇ／ｍｌアプ
ロチニン、および０.１％子ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）からなる結合緩衝液中に懸濁した。［125Ｉ］−Ｍ
ＶＩＩＡ ＯＣＴ（２５−３０,０００ｃｐｍ，約１５
００〜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および試験化合物をポ
リプロピレン管に１ｎＭ ＭＶＩＩＡ ＯＣＴの不存在
下または存在下に分割して非特異的結合を求めた。膜サ
スペンションを稀釈しそして、各アッセイ管が１０μｇ
の膜タンパク質を含みそして全容積が０.５ｍｌになる
ように、最後に試験管に分割した。１時間室温でインキ
ュベーションした後、管を氷浴中に置き、次いで、ＧＦ
／Ｃフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）を通して濾過し、そ
れを０.６％ポリエチレンイミン中で前もって浸しそし
て洗浄緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７.０、１
２５ｍＭ ＮａＣｌ、０.１％ＢＳＡ）で、Ｍｉｌｌｉ
ｐｏｒｅ濾過システムを用いて予備洗浄した。濾過のほ
んの前に、各アッセイ管は３ｍｌの氷冷した洗浄緩衝液
を受け取った。濾過した膜を２回３ｍｌ容積の氷冷した
洗浄緩衝液で洗浄し、乾燥し、そして、フィルターに結
合した放射能を、Ｂｅｃｋｍａｎ γ計数管中で測定し
た（７５％計数効率）。
ソーム膜を、２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７.０、７５ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、０.１ｍＭ ＥＧＴＡ、０.１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、２μＭロイペプチン、０.０３５μｇ／ｍｌアプ
ロチニン、および０.１％子ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）からなる結合緩衝液中に懸濁した。［125Ｉ］−Ｍ
ＶＩＩＡ ＯＣＴ（２５−３０,０００ｃｐｍ，約１５
００〜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および試験化合物をポ
リプロピレン管に１ｎＭ ＭＶＩＩＡ ＯＣＴの不存在
下または存在下に分割して非特異的結合を求めた。膜サ
スペンションを稀釈しそして、各アッセイ管が１０μｇ
の膜タンパク質を含みそして全容積が０.５ｍｌになる
ように、最後に試験管に分割した。１時間室温でインキ
ュベーションした後、管を氷浴中に置き、次いで、ＧＦ
／Ｃフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）を通して濾過し、そ
れを０.６％ポリエチレンイミン中で前もって浸しそし
て洗浄緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７.０、１
２５ｍＭ ＮａＣｌ、０.１％ＢＳＡ）で、Ｍｉｌｌｉ
ｐｏｒｅ濾過システムを用いて予備洗浄した。濾過のほ
んの前に、各アッセイ管は３ｍｌの氷冷した洗浄緩衝液
を受け取った。濾過した膜を２回３ｍｌ容積の氷冷した
洗浄緩衝液で洗浄し、乾燥し、そして、フィルターに結
合した放射能を、Ｂｅｃｋｍａｎ γ計数管中で測定し
た（７５％計数効率）。
【０１１２】ラット脳シナプトソーム膜に関する代表的
置換結合曲線を図７に示した。ＩＣ50値は、４−パラメ
ーターロジスティファンクションによって作成されたラ
イン適合曲線から算定された。これらの値は、ラット脳
シナプトソーム膜への、［12 5Ｉ］ＭＶＩＩＡ ＯＣＴ
の全特異的結合を５０まで阻害するのに必要な試験化合
物の濃度を表しており、そこでは、特異的結合は、過剰
の（１ｎＭ）未標識化［125Ｉ］ＭＶＩＩＡ ＯＣＴの
不存在および存在下での［125Ｉ］ＭＶＩＩＡＯＣＴの
結合の間の相違として定義される。このような値は、特
異的結合部位に関する一連の化合物の相対的親和性の近
似値として役に立つ。
置換結合曲線を図７に示した。ＩＣ50値は、４−パラメ
ーターロジスティファンクションによって作成されたラ
イン適合曲線から算定された。これらの値は、ラット脳
シナプトソーム膜への、［12 5Ｉ］ＭＶＩＩＡ ＯＣＴ
の全特異的結合を５０まで阻害するのに必要な試験化合
物の濃度を表しており、そこでは、特異的結合は、過剰
の（１ｎＭ）未標識化［125Ｉ］ＭＶＩＩＡ ＯＣＴの
不存在および存在下での［125Ｉ］ＭＶＩＩＡＯＣＴの
結合の間の相違として定義される。このような値は、特
異的結合部位に関する一連の化合物の相対的親和性の近
似値として役に立つ。
【０１１３】各試験物質に関する結合定数（Ｋi）は、
別々の機会に二重に行われた２つのアッセイからの競合
的結合データの、非線形の、最小自乗法の回帰分析を用
いて計算された。ＫiおよびＩＣ50（標識化化合物の５
０％が試験化合物によって置換される濃度）の間の関係
は、Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ方程式： Ｋi＝ＩＣ50／（１十［Ｌ］／Ｋd） 〔但し、ＩＣ50は、標識化リガンドの特異的結合を５０
％まで減ずるのに必要な試験物質の濃度である；［Ｌ］
は、実験に使用した［125Ｉ］−ＭＶＩＩＡ ＯＣＴの
濃度である；そしてＫdは、飽和結合実験のラット脳シ
ナプトソーム膜への［125Ｉ］−ＭＶＩＩ ＯＣＴの結
合について求められた結合定数である。〕によって表さ
れる。表３は、ラット脳シナプトソームのＭＶＩＩＡ結
合部位に関する種々のＯＣＴペプチドについての、算定
されたＩＣ50およびＫi値をまとめている。
別々の機会に二重に行われた２つのアッセイからの競合
的結合データの、非線形の、最小自乗法の回帰分析を用
いて計算された。ＫiおよびＩＣ50（標識化化合物の５
０％が試験化合物によって置換される濃度）の間の関係
は、Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ方程式： Ｋi＝ＩＣ50／（１十［Ｌ］／Ｋd） 〔但し、ＩＣ50は、標識化リガンドの特異的結合を５０
％まで減ずるのに必要な試験物質の濃度である；［Ｌ］
は、実験に使用した［125Ｉ］−ＭＶＩＩＡ ＯＣＴの
濃度である；そしてＫdは、飽和結合実験のラット脳シ
ナプトソーム膜への［125Ｉ］−ＭＶＩＩ ＯＣＴの結
合について求められた結合定数である。〕によって表さ
れる。表３は、ラット脳シナプトソームのＭＶＩＩＡ結
合部位に関する種々のＯＣＴペプチドについての、算定
されたＩＣ50およびＫi値をまとめている。
【０１１４】（実施例５） ＯＣＴＭＶＩＩＡ結合タンパク質の同定 ラット脳海馬領域（ＲＨＭ）からのシナプトソーム膜
は、実施例３に記載されたように調製された。４０μｇ
タンパク質を含むシナプトソーム調製物のアリコート
を、架橋結合緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７.
１、７５ｍＭ ＮａＣｌ、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１
ｍＭ ＥＧＴＡ、０.００２ｍＭロイペプチン、０.５Ｔ
ＩＵ／ｍｌアプロチニン）中で稀釈した。このサスペン
ションを次いでペレット化した（１３,０００×ｇ、１
５分）。ペレットを次いで架橋結合緩衝液中に再懸濁
し、再度ペレット化しくそして結果として得られるペレ
ットを、架橋結合緩衝液中に懸濁して約１ｍｇ／ｍｌの
最終的タンパク質濃度を有する洗浄されたシナプトソー
ム調製物を得た。
は、実施例３に記載されたように調製された。４０μｇ
タンパク質を含むシナプトソーム調製物のアリコート
を、架橋結合緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７.
１、７５ｍＭ ＮａＣｌ、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１
ｍＭ ＥＧＴＡ、０.００２ｍＭロイペプチン、０.５Ｔ
ＩＵ／ｍｌアプロチニン）中で稀釈した。このサスペン
ションを次いでペレット化した（１３,０００×ｇ、１
５分）。ペレットを次いで架橋結合緩衝液中に再懸濁
し、再度ペレット化しくそして結果として得られるペレ
ットを、架橋結合緩衝液中に懸濁して約１ｍｇ／ｍｌの
最終的タンパク質濃度を有する洗浄されたシナプトソー
ム調製物を得た。
【０１１５】結合は、０.４ｍｌの適当な架橋結合緩衝
液、０.０５ｍｌの洗浄したシナプトソーム調製物（結
合部位の濃度：（最終濃度：０.０５μＭ）、０.０５ｍ
ｌの［125Ｉ］−ＭＶＩＩ ＯＣＴ（最終濃度：０.１ｎ
Ｍ）を含む、全容積０.５ｍｌの中で行われた。分けた
アリコートにおいて、０.００５ｍｌの未標識化ＭＶＩ
ＩＡ ＯＣＴを添加して、非特異的結合を評価した（最
終濃度：０.０５μＭ）。インキュベーションは、試料
をくるくると回転して、２０〜２４°で２５分間であっ
た。
液、０.０５ｍｌの洗浄したシナプトソーム調製物（結
合部位の濃度：（最終濃度：０.０５μＭ）、０.０５ｍ
ｌの［125Ｉ］−ＭＶＩＩ ＯＣＴ（最終濃度：０.１ｎ
Ｍ）を含む、全容積０.５ｍｌの中で行われた。分けた
アリコートにおいて、０.００５ｍｌの未標識化ＭＶＩ
ＩＡ ＯＣＴを添加して、非特異的結合を評価した（最
終濃度：０.０５μＭ）。インキュベーションは、試料
をくるくると回転して、２０〜２４°で２５分間であっ
た。
【０１１６】インキュベーション期間の終わりで、その
受容体に対する、結合した［125Ｉ］−ＭＶＩＩＡ Ｏ
ＣＴの架橋は、０.０１ｍｌの２５ｍＭ １−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＨ
ＣＬ（ＥＤＣ）をサスペンション（使用の直前に、２５
ｍＭ ＰＩＰＥＳ，ｐＨ６．１に溶解されたＥＤＣ）に
添加することによって行われた。この混合物を１０分間
氷温度で、断続的に混合しながら、インキュベーション
した。反応を、２０ｍＭ酢酸アンモニウムの添加によっ
て抑えた。この混合物を次いで１３,０００×ｇで１５
分間遠心分離することによってペレット化し、続いて１
〜２回、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７.５中で再
懸濁しそしてペレット化することによって洗浄した。最
終的なぺレットを、２０μｌの新しい試料緩衝液（２０
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭジチオトレイトー
ル、４Ｍ尿素、８％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０.
１％ブロモフェノールブルー）中に溶解し、次いで、試
料の前加熱なしに、ＳＤＳＰＡＧＥ（４〜１５％アクリ
ルアミド勾配ゲル）にかけた。類似の実験を、
［125Ｉ］ＧＶＩＡ ＯＣＴを架橋リガンドとして用い
て行った。
受容体に対する、結合した［125Ｉ］−ＭＶＩＩＡ Ｏ
ＣＴの架橋は、０.０１ｍｌの２５ｍＭ １−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＨ
ＣＬ（ＥＤＣ）をサスペンション（使用の直前に、２５
ｍＭ ＰＩＰＥＳ，ｐＨ６．１に溶解されたＥＤＣ）に
添加することによって行われた。この混合物を１０分間
氷温度で、断続的に混合しながら、インキュベーション
した。反応を、２０ｍＭ酢酸アンモニウムの添加によっ
て抑えた。この混合物を次いで１３,０００×ｇで１５
分間遠心分離することによってペレット化し、続いて１
〜２回、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７.５中で再
懸濁しそしてペレット化することによって洗浄した。最
終的なぺレットを、２０μｌの新しい試料緩衝液（２０
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭジチオトレイトー
ル、４Ｍ尿素、８％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０.
１％ブロモフェノールブルー）中に溶解し、次いで、試
料の前加熱なしに、ＳＤＳＰＡＧＥ（４〜１５％アクリ
ルアミド勾配ゲル）にかけた。類似の実験を、
［125Ｉ］ＧＶＩＡ ＯＣＴを架橋リガンドとして用い
て行った。
【０１１７】図８は、ラット脳シナプトソーム膜調製物
への［125Ｉ］ＭＶＩＩＡ ＯＣＴおよび［125Ｉ］ＭＶ
ＩＩＢ ＯＣＴの架橋結合を証明するオートラジオグラ
フを示す。多数のタンパク質バンドが、当該手順によっ
て標識化されるが、２００〜２３０キロダルトンタンパ
ク質として移動するタンパク質バンドでの結合は、上述
したような過剰の未標識化リガンドの含有物によって特
に置換された。
への［125Ｉ］ＭＶＩＩＡ ＯＣＴおよび［125Ｉ］ＭＶ
ＩＩＢ ＯＣＴの架橋結合を証明するオートラジオグラ
フを示す。多数のタンパク質バンドが、当該手順によっ
て標識化されるが、２００〜２３０キロダルトンタンパ
ク質として移動するタンパク質バンドでの結合は、上述
したような過剰の未標識化リガンドの含有物によって特
に置換された。
【０１１８】これらの結果は、ラットシナプトソーム膜
への高い親和性特異的結合が少なくとも部分的には、ゲ
ル上の２００〜２３０Ｋｄ領域中で移動するタンパク質
バンドでの結合に帰することを示唆している。他のバン
ドの標識化は、より低い親和性または非特異的結合のい
ずれかのためであり得る、なぜならば、これらのバンド
ヘの標識化は、未標識化リガンドによって置き換えられ
なかったからである。
への高い親和性特異的結合が少なくとも部分的には、ゲ
ル上の２００〜２３０Ｋｄ領域中で移動するタンパク質
バンドでの結合に帰することを示唆している。他のバン
ドの標識化は、より低い親和性または非特異的結合のい
ずれかのためであり得る、なぜならば、これらのバンド
ヘの標識化は、未標識化リガンドによって置き換えられ
なかったからである。
【０１１９】（実施例６） シナプトソーム膜中のＳＶＩＢ結合部位へのＯＣＴペプ
チド結合 ラット脳シナプトソーム膜を、実施例３に記載したよう
に調製した。ＯＣＴＳＶＩＢを、実施例４に記載した、
Ｉｏｄｏｇｅｎ反応により125Ｉ−ヨウ素でヨウ素化す
ることにより放射能標識化した。ラット脳シナプトソー
ム膜上の放射能標識化ＳＶＩＢの置換結合は、実施例４
Ｂと同様に行った。アッセイした、いくつかのＯＣＴペ
プチドに関するＳＶＩＢ置換曲線を図９に示す。ＩＣ50
値およびＫi値は、実施例４に記載したように計算し
た。表４は、試験したＯＣＴペプチドに関する計算した
Ｋi値、および、ＯＣＴ ＭＶＩＩＡ部位へのＫi結合定
数とＳＶＩＢ結合部位へのＫi結合定数との比を示して
いる。
チド結合 ラット脳シナプトソーム膜を、実施例３に記載したよう
に調製した。ＯＣＴＳＶＩＢを、実施例４に記載した、
Ｉｏｄｏｇｅｎ反応により125Ｉ−ヨウ素でヨウ素化す
ることにより放射能標識化した。ラット脳シナプトソー
ム膜上の放射能標識化ＳＶＩＢの置換結合は、実施例４
Ｂと同様に行った。アッセイした、いくつかのＯＣＴペ
プチドに関するＳＶＩＢ置換曲線を図９に示す。ＩＣ50
値およびＫi値は、実施例４に記載したように計算し
た。表４は、試験したＯＣＴペプチドに関する計算した
Ｋi値、および、ＯＣＴ ＭＶＩＩＡ部位へのＫi結合定
数とＳＶＩＢ結合部位へのＫi結合定数との比を示して
いる。
【０１２０】（実施例７） 解剖学的損傷の減少：全体的虚血モデル１ 全体的虚血損傷を、標準手順（Ｋｉｒｉｎｏ）に従っ
て、アレチネズミモデルにおいて調べた。体重５０〜８
０ｇの雄のモンゴリアンアレチネズミ（Ｍｅｒｉｏｎｅ
ｓ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ，Ｔｕｍｂｌｅｂｒｏｏ
ｋ Ｆａｒｍ，Ｗｅｓｔ Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ，マサ
チューセッツ州）を、７０％亜酸化窒素（０.４４Ｌ／
分）および３０％酸素（０.１９Ｌ／分）によって保持
される４％ハロセンで、小室中で麻酔した。それらを次
いで、２％ハロセンを用いた外科的処置の間ずっと、そ
れらの鼻を、ガス発射管上のゴム製のダム中の穴を通し
て置くことによって保った。無菌技術を用いて、両方の
共通の頸動脈を露出し、解剖して取り囲んでいる領域を
除き、そして、鎖骨の約３〜４ｍｍ上で微小血管クラン
プを用いて閉塞した。両方の動脈を閉塞する間、時間を
計って閉塞を８分間継続した。一般に、２つの動脈の各
々を締める間は、約１分間であり、そして、それらを締
めていない間は、約４秒であった。クランプを除いた
後、皮膚を縫合して閉じそして麻酔を中止した。
て、アレチネズミモデルにおいて調べた。体重５０〜８
０ｇの雄のモンゴリアンアレチネズミ（Ｍｅｒｉｏｎｅ
ｓ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ，Ｔｕｍｂｌｅｂｒｏｏ
ｋ Ｆａｒｍ，Ｗｅｓｔ Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ，マサ
チューセッツ州）を、７０％亜酸化窒素（０.４４Ｌ／
分）および３０％酸素（０.１９Ｌ／分）によって保持
される４％ハロセンで、小室中で麻酔した。それらを次
いで、２％ハロセンを用いた外科的処置の間ずっと、そ
れらの鼻を、ガス発射管上のゴム製のダム中の穴を通し
て置くことによって保った。無菌技術を用いて、両方の
共通の頸動脈を露出し、解剖して取り囲んでいる領域を
除き、そして、鎖骨の約３〜４ｍｍ上で微小血管クラン
プを用いて閉塞した。両方の動脈を閉塞する間、時間を
計って閉塞を８分間継続した。一般に、２つの動脈の各
々を締める間は、約１分間であり、そして、それらを締
めていない間は、約４秒であった。クランプを除いた
後、皮膚を縫合して閉じそして麻酔を中止した。
【０１２１】閉塞の間または後、側脳室をねらった大脳
室内（ＩＣＶ）注射を行った。これをなし遂げるため
に、２７ゲージ針を伴う１０マイクロリットル Ｈａｍ
ｉｌｔｏｎ注射器を、この系内の空気の不存在を保証す
るためにバック充填により注射液（ｉｎｊｅｃｔａｔｅ
ｅ）で満たした。堅いプラスチックスリーブを、針の
３.５ｍｍがスリーブ通って突き出すように、針にはめ
た。ブレブマの周囲の頭蓋を露出し、真ん中の１.１ｍ
ｍ左の距離をコンパスで測定し、そしてブレグマの０.
４ｍｍ後ろの距離を目によって見積もった。針の先端を
頭蓋に垂直に保持しそしてそれを通して回転させながら
一般的圧力を適用することによってその点に挿入した。
それは、スリーブが頭蓋に接するまで進められ、そして
５マイクロリットルの注射液を約３秒間にわたって注入
した。次いで皮膚を縫合して閉じた。閉塞した動物は、
薬物またはそのビヒクルのいずれかを受け取った。注射
した、閉塞されていない対照は麻酔され、そしてＩＣＴ
注射のみを受け取った。
室内（ＩＣＶ）注射を行った。これをなし遂げるため
に、２７ゲージ針を伴う１０マイクロリットル Ｈａｍ
ｉｌｔｏｎ注射器を、この系内の空気の不存在を保証す
るためにバック充填により注射液（ｉｎｊｅｃｔａｔｅ
ｅ）で満たした。堅いプラスチックスリーブを、針の
３.５ｍｍがスリーブ通って突き出すように、針にはめ
た。ブレブマの周囲の頭蓋を露出し、真ん中の１.１ｍ
ｍ左の距離をコンパスで測定し、そしてブレグマの０.
４ｍｍ後ろの距離を目によって見積もった。針の先端を
頭蓋に垂直に保持しそしてそれを通して回転させながら
一般的圧力を適用することによってその点に挿入した。
それは、スリーブが頭蓋に接するまで進められ、そして
５マイクロリットルの注射液を約３秒間にわたって注入
した。次いで皮膚を縫合して閉じた。閉塞した動物は、
薬物またはそのビヒクルのいずれかを受け取った。注射
した、閉塞されていない対照は麻酔され、そしてＩＣＴ
注射のみを受け取った。
【０１２２】動物をＣＯ2で麻酔した。胸腔を開きそし
て頭蓋動物を心臓を通して、ヘパリン（１０単位／ｍ
ｌ）を含む約３ミリリットルのリン酸緩衝塩類溶液（Ｐ
ＢＳ；０.１０Ｍリン酸ナトリウム；０.１５Ｍ塩化ナト
リウム）、その後約１０ｍｌのＺａｍｂｏｎｉ’ｓ ｆ
ｉｘ（０.１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７.４または１０％リン
酸緩衝ホルマリン中１５％（容積／容積）ピクリン酸４
％（重量／容積）パラホルムアルデヒド）で灌流した。
脳を取り除きそして同一の固定液に数時間浸しておい
た。
て頭蓋動物を心臓を通して、ヘパリン（１０単位／ｍ
ｌ）を含む約３ミリリットルのリン酸緩衝塩類溶液（Ｐ
ＢＳ；０.１０Ｍリン酸ナトリウム；０.１５Ｍ塩化ナト
リウム）、その後約１０ｍｌのＺａｍｂｏｎｉ’ｓ ｆ
ｉｘ（０.１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７.４または１０％リン
酸緩衝ホルマリン中１５％（容積／容積）ピクリン酸４
％（重量／容積）パラホルムアルデヒド）で灌流した。
脳を取り除きそして同一の固定液に数時間浸しておい
た。
【０１２３】脳を視交叉のすぐ後でおよび乳頭体の後ろ
でブロックにした。次いでそれらを１０％（重量／容
積）蔗糖中にＰＢＳ中で一晩４度で置いた。海馬を含む
ブロックを液体フレオン中でクリオスタットチャック上
に凍結組織検体のためのＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商
標）Ｏ．Ｃ．Ｔ．包埋媒体（Ｍｉｌｅｓ Ｉｎｃ．，Ｅ
ｌｋｈａｒｔ，アイオワ州）を用いて液体フレオンで凍
結した。厚さ１０ミクロンの切片を切った。海馬の適切
な部分が得られるまで（脳ごとに４０〜５０切片）、約
１００ミクロン離れた各シリーズに関して５切片のシリ
ーズを集めた。脳ごとに少なくとも８切片を、実質的
に、報告された手順により、ヘマトキシリンおよびエオ
シンで染色した。
でブロックにした。次いでそれらを１０％（重量／容
積）蔗糖中にＰＢＳ中で一晩４度で置いた。海馬を含む
ブロックを液体フレオン中でクリオスタットチャック上
に凍結組織検体のためのＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商
標）Ｏ．Ｃ．Ｔ．包埋媒体（Ｍｉｌｅｓ Ｉｎｃ．，Ｅ
ｌｋｈａｒｔ，アイオワ州）を用いて液体フレオンで凍
結した。厚さ１０ミクロンの切片を切った。海馬の適切
な部分が得られるまで（脳ごとに４０〜５０切片）、約
１００ミクロン離れた各シリーズに関して５切片のシリ
ーズを集めた。脳ごとに少なくとも８切片を、実質的
に、報告された手順により、ヘマトキシリンおよびエオ
シンで染色した。
【０１２４】次いでカバーガラスを、接着剤としてＰｅ
ｒｍｏｕｎｔTMを用いて、切片上に置いた。図１０Ａお
よび１０Ｂは、虚血後くＭＶＩＩＡ ＯＣＴ（１０Ａ）
の注入後または薬物ビヒクル後（１０Ｂ）の動物中のア
ナネズミ海馬（ＣＡ１領域）の低倍率顕微鏡写真であ
る。図中の矢印は、海馬のＣＡ１領域のおおよその境界
を示している。より高い倍率で、薬物処置虚血動物中の
細胞は、正常であると思われ（図１１Ａ）、他方、損傷
は、ビヒクルのみを受け取うた虚血動物中ではっきりし
ている（図１１Ｂ）。完全な薬物保護の別の例は、図１
１Ｃに見られ、そして、部分的保護の例は、図１１Ｄに
見られ、そこには、少数の損傷細胞が存在している。
ｒｍｏｕｎｔTMを用いて、切片上に置いた。図１０Ａお
よび１０Ｂは、虚血後くＭＶＩＩＡ ＯＣＴ（１０Ａ）
の注入後または薬物ビヒクル後（１０Ｂ）の動物中のア
ナネズミ海馬（ＣＡ１領域）の低倍率顕微鏡写真であ
る。図中の矢印は、海馬のＣＡ１領域のおおよその境界
を示している。より高い倍率で、薬物処置虚血動物中の
細胞は、正常であると思われ（図１１Ａ）、他方、損傷
は、ビヒクルのみを受け取うた虚血動物中ではっきりし
ている（図１１Ｂ）。完全な薬物保護の別の例は、図１
１Ｃに見られ、そして、部分的保護の例は、図１１Ｄに
見られ、そこには、少数の損傷細胞が存在している。
【０１２５】切片、例えば、図１０および１１に見られ
るようなものは、個々の試料の処置を知らない調査者に
よって検査されそして採点された。虚血損傷は、海馬の
ＣＡ１領域中で採点された。損傷は一般にピンク色（エ
オシン好性）細胞質および収縮した、暗青色の核として
見られた。採点は以下に記載されたようなものであっ
た。
るようなものは、個々の試料の処置を知らない調査者に
よって検査されそして採点された。虚血損傷は、海馬の
ＣＡ１領域中で採点された。損傷は一般にピンク色（エ
オシン好性）細胞質および収縮した、暗青色の核として
見られた。採点は以下に記載されたようなものであっ
た。
【０１２６】
【表１１】 上記採点システムに基づいた、ＭＶＩＩＡまたはＧＶＩ
Ａ ＯＣＴで処置した、あるいは、ビヒクルのみを受け
取った（対照）虚血動物中の解剖学的損傷の程度は、表
５中に示されている。８分間の閉塞の間、表５に示した
全用量で、当該ペプチドをＩＣＶ注入により投与した。
理解されるように、より高い用量のＭＶＩＩＡ ＯＣＴ
で処置した動物中の損傷の程度は、未処置動物中のそれ
の２５％に過ぎなかった。ＧＶＩＡペプチドは同様に、
５０％より高い、損傷の減少を引起し、そしてより低い
用量は、ほぼ最高の有効性であった。
Ａ ＯＣＴで処置した、あるいは、ビヒクルのみを受け
取った（対照）虚血動物中の解剖学的損傷の程度は、表
５中に示されている。８分間の閉塞の間、表５に示した
全用量で、当該ペプチドをＩＣＶ注入により投与した。
理解されるように、より高い用量のＭＶＩＩＡ ＯＣＴ
で処置した動物中の損傷の程度は、未処置動物中のそれ
の２５％に過ぎなかった。ＧＶＩＡペプチドは同様に、
５０％より高い、損傷の減少を引起し、そしてより低い
用量は、ほぼ最高の有効性であった。
【０１２７】第二の処置方法において、ＯＣＴペプチド
を、上記と同一の薬物用量レベルで、８分の閉塞後１時
間、ＩＣＶ注入によって投与した。薬物の存在および不
存在下での解剖学的損傷は、表６に示されている。
を、上記と同一の薬物用量レベルで、８分の閉塞後１時
間、ＩＣＶ注入によって投与した。薬物の存在および不
存在下での解剖学的損傷は、表６に示されている。
【０１２８】（実施例８） 解剖学的損傷の減少：アナネズミ虚血モデル２ 全体的虚血損傷を、ラット中の一時的全体的虚血を誘導
するためのＰｕｌｓｉｎｅｌｌｉおよびＢｒｉｅｒｌｙ
（Ｐｕｌｓｉｎｅｌｌｉ）の４容器閉塞方法を用いて、
ラット脳モデル中で調べた。２つの頸動脈は全脳に血液
を供給するが、それらの閉塞のみでは、前脳血流に対す
る中位の効果を有するに過ぎない、なぜならば、後部の
連絡動脈が、２つの脊椎動脈によって供給される脳幹血
液供給から血液の短絡を作ることを可能にするからであ
る。それ故、苛酷な前脳虚血を行うために、４つ全ての
血管を閉塞しなければならない。使用される手順は、虚
血を、外科的に移植されたクランプを閉じることによっ
て、意識のある動物中に引き起こし、それ故薬物処理と
の起こりうる相互作用を避けることを可能にする。手順
は、意識のある動物中の皮膚の傷を再び開く必要なしに
頸動脈閉塞を可能にするように修正された。
するためのＰｕｌｓｉｎｅｌｌｉおよびＢｒｉｅｒｌｙ
（Ｐｕｌｓｉｎｅｌｌｉ）の４容器閉塞方法を用いて、
ラット脳モデル中で調べた。２つの頸動脈は全脳に血液
を供給するが、それらの閉塞のみでは、前脳血流に対す
る中位の効果を有するに過ぎない、なぜならば、後部の
連絡動脈が、２つの脊椎動脈によって供給される脳幹血
液供給から血液の短絡を作ることを可能にするからであ
る。それ故、苛酷な前脳虚血を行うために、４つ全ての
血管を閉塞しなければならない。使用される手順は、虚
血を、外科的に移植されたクランプを閉じることによっ
て、意識のある動物中に引き起こし、それ故薬物処理と
の起こりうる相互作用を避けることを可能にする。手順
は、意識のある動物中の皮膚の傷を再び開く必要なしに
頸動脈閉塞を可能にするように修正された。
【０１２９】外科的処置は、両方の脊椎動脈を永久的に
閉塞するそして動脈クラスプを移植してより遅い時間で
の頸動脈の一時的閉塞を可能にするように行った。ベン
トバルビタールナトリウム麻酔（６０ｍｇ／ｋｇ）の
下、雄のＦｉｓｈｅｒ３４４ラットを、定位的容器中に
置きそして第一頸部脊椎を解剖用顕微鏡を用いて露出し
た。脊椎動脈を、翼状の孔を通じて焼灼装置を用いて閉
塞しそして皮膚を傷クリップで閉じた。当該動物を、あ
お向けに置きそして頸動脈を注意深く解剖して取り囲む
神経および管を顕微鏡下に取り除いた。クラスプのＳｉ
ｌａｓｔｉｃループのくくりつけていない端を、動脈の
後ろに通しそしてクラスプのじゃまもののない側を経て
置きそして他方の末端について固定した。次いでこのこ
とを別の頸動脈について繰り返した。ループの末端を外
に向けさせるように皮膚を閉じる時、クラスプを、皮膚
に３−０縫合線で結紮した。
閉塞するそして動脈クラスプを移植してより遅い時間で
の頸動脈の一時的閉塞を可能にするように行った。ベン
トバルビタールナトリウム麻酔（６０ｍｇ／ｋｇ）の
下、雄のＦｉｓｈｅｒ３４４ラットを、定位的容器中に
置きそして第一頸部脊椎を解剖用顕微鏡を用いて露出し
た。脊椎動脈を、翼状の孔を通じて焼灼装置を用いて閉
塞しそして皮膚を傷クリップで閉じた。当該動物を、あ
お向けに置きそして頸動脈を注意深く解剖して取り囲む
神経および管を顕微鏡下に取り除いた。クラスプのＳｉ
ｌａｓｔｉｃループのくくりつけていない端を、動脈の
後ろに通しそしてクラスプのじゃまもののない側を経て
置きそして他方の末端について固定した。次いでこのこ
とを別の頸動脈について繰り返した。ループの末端を外
に向けさせるように皮膚を閉じる時、クラスプを、皮膚
に３−０縫合線で結紮した。
【０１３０】虚血を、手術の２日後に引き起こした。頸
動脈を閉塞するために、当該動物を、皮膚を、首の後ろ
で軽くつまむことによって保持しそして各ループの末端
を引出しそして、強力なクランプで固定した。１５分閉
塞の終わりに、クランプを取り除いて再灌流した。有効
な閉塞は、当該動物に、閉塞の約１分内に、その直立応
答（ｒｉｇｈｔｉｎｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を失わせ
る。当該動物が、閉塞の間に直立応答を失わないか、ま
たは、それを回復する時、ループをよりしっかり引いて
完全な頸動脈閉塞を確実にした。それらの直立応答を失
わない動物は、研究から除いた、なぜならば、これは、
未だかなりの大脳血流が存在することを示唆していたか
らである。
動脈を閉塞するために、当該動物を、皮膚を、首の後ろ
で軽くつまむことによって保持しそして各ループの末端
を引出しそして、強力なクランプで固定した。１５分閉
塞の終わりに、クランプを取り除いて再灌流した。有効
な閉塞は、当該動物に、閉塞の約１分内に、その直立応
答（ｒｉｇｈｔｉｎｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を失わせ
る。当該動物が、閉塞の間に直立応答を失わないか、ま
たは、それを回復する時、ループをよりしっかり引いて
完全な頸動脈閉塞を確実にした。それらの直立応答を失
わない動物は、研究から除いた、なぜならば、これは、
未だかなりの大脳血流が存在することを示唆していたか
らである。
【０１３１】このような動物の神経病理学的分析（以下
参照）が、この観察を確かにしている、なぜならば、当
該損傷は、それらの直立応答を失う動物中よりも少ない
ことが発見されているからである。いくつかの動物は閉
塞の間に１回または２回自ら直立したが、直ちに直立応
答を再度失い、そして研究から除かれなかった。自ら直
立しそしてそのままの動物は除外された。
参照）が、この観察を確かにしている、なぜならば、当
該損傷は、それらの直立応答を失う動物中よりも少ない
ことが発見されているからである。いくつかの動物は閉
塞の間に１回または２回自ら直立したが、直ちに直立応
答を再度失い、そして研究から除かれなかった。自ら直
立しそしてそのままの動物は除外された。
【０１３２】Ａ．ＯＣＴペプチドの大脳室内投与 大脳室内（ＩＣＶ）化合物を受け取ったラットを、ハロ
タンを用いて麻酔し、直ぐ後に再灌流し、そして５μＬ
塩類溶液中に含まれた化合物または塩類溶液のみを、ア
レチネズミについて側脳室に注射した。注射の座標は、
真ん中の１.２ｍｍ左そしてブレグマの後ろ０.５ｍｍ
で、深さ３〜４ｍｍであった。直腸温度を、閉塞のちょ
うど前から、そして閉塞後４〜６時間監視した。ラット
は、閉塞に続く４〜６時間平常体温で維持された（直腸
温度約３７度で）。神経保護の程度は表７に示されてい
る。
タンを用いて麻酔し、直ぐ後に再灌流し、そして５μＬ
塩類溶液中に含まれた化合物または塩類溶液のみを、ア
レチネズミについて側脳室に注射した。注射の座標は、
真ん中の１.２ｍｍ左そしてブレグマの後ろ０.５ｍｍ
で、深さ３〜４ｍｍであった。直腸温度を、閉塞のちょ
うど前から、そして閉塞後４〜６時間監視した。ラット
は、閉塞に続く４〜６時間平常体温で維持された（直腸
温度約３７度で）。神経保護の程度は表７に示されてい
る。
【０１３３】Ｂ．ＯＣＴペプチドの静脈内投与 大脳虚血のラット４−ＶＯモデルに関する化合物の静脈
内（ＩＶ）投与について、ラットを上述したように手術
し次いで閉塞した。閉塞クランプを取り除いた後、ラッ
トを、Ｒｏｄｅｎｔ Ｒｅｓｔｒａｉｎｔ Ｃｏｎｅｓ
（Ｈａｒｖａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中に置い
た。可逆止血帯を尾静脈に適用し、そしてＯＣＴ ＭＶ
ＩＩＡを全容積０.２５ｍｌで、表８に示した用量で注
入した。ＩＣＶ投与について、加熱装置を用いた閉塞の
後、ラットは４〜６時間平常温度で維持された（直腸温
度約３７度で）。神経保護の程度は表８に示されてい
る。
内（ＩＶ）投与について、ラットを上述したように手術
し次いで閉塞した。閉塞クランプを取り除いた後、ラッ
トを、Ｒｏｄｅｎｔ Ｒｅｓｔｒａｉｎｔ Ｃｏｎｅｓ
（Ｈａｒｖａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中に置い
た。可逆止血帯を尾静脈に適用し、そしてＯＣＴ ＭＶ
ＩＩＡを全容積０.２５ｍｌで、表８に示した用量で注
入した。ＩＣＶ投与について、加熱装置を用いた閉塞の
後、ラットは４〜６時間平常温度で維持された（直腸温
度約３７度で）。神経保護の程度は表８に示されてい
る。
【０１３４】（実施例９） 解剖学的損傷の減少：局部的虚血モデル 大脳虚血のラットの中央大脳動脈閉塞モデルを、ＳＨＲ
系ラットで行った。ラットを、Ｅｖｉｐａｎ（１５０ｍ
ｇ／ｋｇ腹腔内）を用いて麻酔した。ＯＣＴＭＶＩＩＡ
を、例８に記載したように、５μｌの容積で大脳室内に
左の側脳室へ注射した。１０分以内に、左中央の大脳動
脈は、電気凝固によって永久的に閉塞された。閉塞が行
われた２４時間後、ラットを再度Ｅｖｉｐａｎで磁気共
鳴画像のために麻酔した。８つの冠状像が記録された。
各像中の梗塞像は、絵素を数えることによって決定され
た。表９には、ラットごとの、８つの冠状切片からの絵
素の平均総数が示されている。１．７μｇのＭＶＩＩＡ
ＯＣＴでの処置（ｉ．ｖ．ｃ．）は、中央大脳動脈閉
塞により引き起こされる平均梗塞サイズ面積を２４％減
少する。この減少は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ試
験によってアッセイされるように、統計学的に重要であ
る。
系ラットで行った。ラットを、Ｅｖｉｐａｎ（１５０ｍ
ｇ／ｋｇ腹腔内）を用いて麻酔した。ＯＣＴＭＶＩＩＡ
を、例８に記載したように、５μｌの容積で大脳室内に
左の側脳室へ注射した。１０分以内に、左中央の大脳動
脈は、電気凝固によって永久的に閉塞された。閉塞が行
われた２４時間後、ラットを再度Ｅｖｉｐａｎで磁気共
鳴画像のために麻酔した。８つの冠状像が記録された。
各像中の梗塞像は、絵素を数えることによって決定され
た。表９には、ラットごとの、８つの冠状切片からの絵
素の平均総数が示されている。１．７μｇのＭＶＩＩＡ
ＯＣＴでの処置（ｉ．ｖ．ｃ．）は、中央大脳動脈閉
塞により引き起こされる平均梗塞サイズ面積を２４％減
少する。この減少は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ試
験によってアッセイされるように、統計学的に重要であ
る。
【０１３５】（実施例１０） 機能活性の損失に対する保護 Ａ．機能亢進 大脳虚血の１つの共通する後遺症は、機能亢進であり、
それは、閉塞の数時間内の歩き回る行動として見られ
得、そして、その後数時間まで測定され得る。機能冗進
は、Ａｕｔｏｍｅｘ活性モニター（Ｃｏｌｕｍｂｉａ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，オハイオ
州）で量的に表され、それは、ラジオ周波数電界の摂動
を記録する。アレチネズミをそれぞれ１７×２７ｃｍの
プラスチック製かご中で６０分間、統計学的分析のため
に１５分間ごとに記録した累積活性計数を用いて、試験
した。ベースライン活性を手術前に測定してこの測定に
関する異なる処置群の比較可能性を確実にした。
それは、閉塞の数時間内の歩き回る行動として見られ
得、そして、その後数時間まで測定され得る。機能冗進
は、Ａｕｔｏｍｅｘ活性モニター（Ｃｏｌｕｍｂｉａ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，オハイオ
州）で量的に表され、それは、ラジオ周波数電界の摂動
を記録する。アレチネズミをそれぞれ１７×２７ｃｍの
プラスチック製かご中で６０分間、統計学的分析のため
に１５分間ごとに記録した累積活性計数を用いて、試験
した。ベースライン活性を手術前に測定してこの測定に
関する異なる処置群の比較可能性を確実にした。
【０１３６】試験の結果は図１３にプロットされてい
る。各試験曲線の下向きの傾斜は、当該動物は、試験環
境に、より馴れるにつれて、試験の、４つの１５分間隔
（１〜４はベースラインについて、５〜８は１日目につ
いて、そして９〜１２は３日目について）にわたり活性
が減少するためである。閉塞のみ（△）は、閉塞の１日
後にベースラインレベルを越えた活性レベルの著しい上
昇を引き起こし、そして、高められた活性レベルが３日
間にわたって、永久的な行動損傷を示して、観察され
た。ビヒクルのＩＣＴ投与を受け取った、非閉塞対照動
物（○）は、試験期間を通じてベースライン活性レベル
のままであった。ＯＣＴペプチドそれ自体（９）は、虚
血の不存在下に、活性を下げ、そしてこの効果は３日目
ですらわずかに持続した。ＯＣＴ ＭＶＩＩＡで処置し
た閉塞動物（▲）は、ペプチドのみによって引き起こさ
れる減ぜられた活性を明らかに反映して、１日目にベー
スラインより低い値を示した。３日目で、処置動物は、
ほぼ正常レベルの活性を示し、ＯＣＴペプチド処置が、
虚血誘発機能元進に対して保護を与えることを示した。
る。各試験曲線の下向きの傾斜は、当該動物は、試験環
境に、より馴れるにつれて、試験の、４つの１５分間隔
（１〜４はベースラインについて、５〜８は１日目につ
いて、そして９〜１２は３日目について）にわたり活性
が減少するためである。閉塞のみ（△）は、閉塞の１日
後にベースラインレベルを越えた活性レベルの著しい上
昇を引き起こし、そして、高められた活性レベルが３日
間にわたって、永久的な行動損傷を示して、観察され
た。ビヒクルのＩＣＴ投与を受け取った、非閉塞対照動
物（○）は、試験期間を通じてベースライン活性レベル
のままであった。ＯＣＴペプチドそれ自体（９）は、虚
血の不存在下に、活性を下げ、そしてこの効果は３日目
ですらわずかに持続した。ＯＣＴ ＭＶＩＩＡで処置し
た閉塞動物（▲）は、ペプチドのみによって引き起こさ
れる減ぜられた活性を明らかに反映して、１日目にベー
スラインより低い値を示した。３日目で、処置動物は、
ほぼ正常レベルの活性を示し、ＯＣＴペプチド処置が、
虚血誘発機能元進に対して保護を与えることを示した。
【０１３７】Ｂ．自発的交互 ここで使用されたタイプの虚血の、卓越した神経病理学
的結果が、場所的学習および記憶の欠落を引き起こすこ
とが知られている海馬損傷であるので、迷路行動におけ
る新しい（作動）記憶の試験を用いた。この試験はＹ迷
路を使用する。
的結果が、場所的学習および記憶の欠落を引き起こすこ
とが知られている海馬損傷であるので、迷路行動におけ
る新しい（作動）記憶の試験を用いた。この試験はＹ迷
路を使用する。
【０１３８】アレチネズミを、Ｙ迷路中で試験した、そ
こでは、当該動物は、迷路のステムの出発点に置かれ、
そして当該動物がアームに入った時に、ドアがその後ろ
で閉じられる。５秒後に、アレチネズミを、２〜１２分
の試験間間隔（ＩＴＩ）でそのホームケージに戻す。そ
の間隔の終わりに、アレチネズミを再度同一の方法で迷
路中で走らせる。たいていの正常のネズミは交互である
であろう、即ち、最初の試験で入ったアームに入るであ
ろう。場合により、動物は約１分以内にアームに入らな
かった、なぜならば、それは発作（ｓｅｉｚｕｒｅ）を
有しており、それ故この試験から除外された。
こでは、当該動物は、迷路のステムの出発点に置かれ、
そして当該動物がアームに入った時に、ドアがその後ろ
で閉じられる。５秒後に、アレチネズミを、２〜１２分
の試験間間隔（ＩＴＩ）でそのホームケージに戻す。そ
の間隔の終わりに、アレチネズミを再度同一の方法で迷
路中で走らせる。たいていの正常のネズミは交互である
であろう、即ち、最初の試験で入ったアームに入るであ
ろう。場合により、動物は約１分以内にアームに入らな
かった、なぜならば、それは発作（ｓｅｉｚｕｒｅ）を
有しており、それ故この試験から除外された。
【０１３９】個々の実験は、データの有意味な統計学的
評価を可能するには、グループごとに少なすぎる動物を
含んでいたので、結果を、海馬損傷に対する薬物処置に
よる保護の良好な証拠が存在する全ての実験について合
わせた（実施例７）。正の結果を有する実験のみが合わ
され、解剖学的保護が行動保護と関連しているかを決定
した。
評価を可能するには、グループごとに少なすぎる動物を
含んでいたので、結果を、海馬損傷に対する薬物処置に
よる保護の良好な証拠が存在する全ての実験について合
わせた（実施例７）。正の結果を有する実験のみが合わ
され、解剖学的保護が行動保護と関連しているかを決定
した。
【０１４０】自発的交互試験の結果を、少なくとも０.
１μｇの用量の各化合物からの解剖学的保護が存在する
実験について表１０に要約した。合わせたデータに関す
るカイ二乗検定法は、ｐ＜０.０１で重要であった。各
ファクターを別々に調べるために合わせた処置群（例え
ば、閉塞された全て対未閉塞の全て、薬物処置にかかわ
らず）は、そぞれ、カイ二乗検定法によりｐ＜０.０５
で重要であることを示した；すなわち、（ａ）虚血は、
一層悪い行動を引き起こした、そして（ｂ）行動のレベ
ルは、処置動物中で大部分再度蓄積された。
１μｇの用量の各化合物からの解剖学的保護が存在する
実験について表１０に要約した。合わせたデータに関す
るカイ二乗検定法は、ｐ＜０.０１で重要であった。各
ファクターを別々に調べるために合わせた処置群（例え
ば、閉塞された全て対未閉塞の全て、薬物処置にかかわ
らず）は、そぞれ、カイ二乗検定法によりｐ＜０.０５
で重要であることを示した；すなわち、（ａ）虚血は、
一層悪い行動を引き起こした、そして（ｂ）行動のレベ
ルは、処置動物中で大部分再度蓄積された。
【０１４１】本発明が特別な実施態様に関して記載され
ているにもかかわず、当業者にとって、種々の変化およ
び修正は、本発明から離れることなくなし得ることは明
らかである。
ているにもかかわず、当業者にとって、種々の変化およ
び修正は、本発明から離れることなくなし得ることは明
らかである。
【０１４２】参考文献 Ａｈｍａｄ，Ｓ．ら，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，
４５３：２４７−２５６（１９８８） Ａｉｔｋｅｎｈｅａｄ，Ａ．（１９８６），Ｂｒｉｔｉ
ｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ，：２９０−２９６ ＢａｅｔｈｍａｎｎおよびＪａｎｓｅｎ （１９８
６），ＥｕｒｏｐｅａｎＮｅｕｒｏｌｏｇｙ，２５，Ｓ
ｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １：１０２−１１４ Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｐ．ら，Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍ
ｉｔｔｅｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ，ｐ
ｐ．６１−８９，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨー
ク（１９８３） Ｂｅｒｇｅｒ，Ｌ．およびＨａｋｉｍ，Ａ．（１９８
８）Ｓｔｒｏｋｅ，１９：１２５７−１２６１ Ｂｒａｎｄｔ，Ｌ．，Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎｍ Ｂ．，Ｓ
ａｖｅｌａｎｄ，Ｈ，，およびＨｙｍａｎ，Ｔ．（１９
８８），Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒｕｒｇｉｃａ，
Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４５：１１−２０ Ｂｒｉｎｔ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｂｌｏｏ
ｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．８：４７４−４８５（１９
８８） Ｇｅｌｍｅｒｓ，Ｈ．，Ｇｏｒｔｅｒ，Ｋ．，Ｗｅｅｒ
ｄｔ，Ｃ．，Ｗｅｉｚｅｒ，Ｈ．（１９８８），Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃ
ｉｎｅ ３１８：２０３−２０７ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｗｅｉｓｓ，Ｊ．，Ｐｈａ
ｍ，Ｐ．およびＣｈｏｉ，Ｄ．（１９８７），Ｔｈｅ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａ
ｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ
ｉｃｓ ２４３：７８４−７９１ Ｇｒａｙ，Ｗ．，Ｏｌｉｖｅｒａ，Ｂ．およびＣｒｕ
ｚ，Ｌ，（１９８８）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏ
ｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５７：６６５−７００ Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｄ．およびＣｈｏｉ，Ｄ．（１９８
９）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌｏｇｙ ａｎｄ ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＴｈｅｒ
ａｐｅｕｔｉｃｓ ２５０：７５２−７５８ Ｋｉｒｉｎｏ，Ｔ．（１９８２）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ，２３９：５７−６９ Ｌａｎｇｌｅｙ，Ｍ．およびＳｏｒｋｉｎ，Ｅ．（１９
８９），Ｄｒｕｇｓ３７：６６９−６９９ ＭｃＣｌｅｓｋｅｙ，Ｅ．Ｗ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４３２７−３１
（１９８７） Ｎｅｗｂｅｒｇ，Ｌ．，Ｓｔｅｅｎ，Ｐ．，Ｍｉｌｄ
ｅ，Ｊ．およびＭｉｃｈｅｎｆｅｌｄｅｒ，Ｊ．（１９
８４）Ｓｔｒｏｋｅ １５：６６６およびその次の頁 Ｎｏｗｙｃｋｙ，Ｍ．Ｃ．，Ｆｏｘ，Ａ．Ｐ．およびＴ
ｓｉｅｎ，Ｒ，Ｗ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），
３１６：４４０−４４３（１９８５） Ｐｕｌｓｉｎｅｌｌｉ，Ｗ．Ａ．ら，（１９７９）Ｓｔ
ｒｏｋｅ，１０：２６７−２７２ Ｏｌｉｖｅｒａ，Ｂ．，Ｍｃｉｎｔｏｓｈ，Ｊ．，Ｃｒ
ｕｚ，Ｌ．，Ｌｕｑｕｅ，Ｆ．およびＧｒａｙ，Ｗ．
（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３：５０８
７−５０９０ Ｏｌｎｅｙ，Ｊ．，Ｌａｂｒｕｙｅｒｅ，Ｊ．およびＰ
ｒｉｃｅ，Ｍ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１
３６０−１３６２ Ｒｉｖｉｅｒ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
２：１１９４−１１９８ Ｒｏｔｈｍａｎ，Ｓ．（１９８４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ７：１８８４−１８９
１ Ｓａｎｏ，Ｋ．ら（１９８７）Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌ，１４１：２３５−２４１ Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．，Ｚｗａｎ，Ｊ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ
ｓ，Ｔ．，Ｍｅｌｄｒｕｍ，Ｂ．（１９８４）Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２２６：８５０−８５２ Ｔａｔｅｉｓｈｉ，Ａ．，Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．，
Ｄｒｕｍｏｎｄ，Ｊ．，Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，Ｍ．，Ｚｏ
ｒｎｏｗ，Ｍ．，Ｇｒａｆｅ，Ｍ．およびＳｃｈａｐｉ
ｒｏ，Ｈ．，（１９８９）Ｓｔｒｏｋｅ ２０：１０４
４−１０５０ Ｖａｎ Ｒｅｅｍｐｔｓ，Ｊ．およびＢｏｒｇｅｒｓ，
Ｍ．（１９８４）Ａｃａｄ．Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｏｌ
ｉｃａ Ｂｅｌｇｅ ３５，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，２
０９−２１８ Ｖａｎ Ｒｅｅｍｐｔｓ，Ｊ．およびＢｏｒｇｅｒｓ，
Ｍ．（１９８５）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｅｍｅｒｇｅｎ
ｃｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １４：８およびその次の頁 Ｖｉｂｕｌｓｒｅｔｈ，Ｓ．，Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，
Ｗ．，Ｂｕｓｔｒｏ，Ｒ．，およびＧｉｎｓｂｅｒｇ，
Ｍ．（１９８７）Ｓｔｒｏｋｅ １８：２１０−２１６ Ｗａｕｑｕｉｅｒ，Ａ．，Ｅｄｍｏｎｄｓ，Ｈ．，Ｃｌ
ｉｎｃｋｅ，Ｇ．（１９８７）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃ
ｅ ａｎｄ Ｂｉｏｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｒｅｖｉｅ
ｗｓ １１：２８７−３０６
４５３：２４７−２５６（１９８８） Ａｉｔｋｅｎｈｅａｄ，Ａ．（１９８６），Ｂｒｉｔｉ
ｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ，：２９０−２９６ ＢａｅｔｈｍａｎｎおよびＪａｎｓｅｎ （１９８
６），ＥｕｒｏｐｅａｎＮｅｕｒｏｌｏｇｙ，２５，Ｓ
ｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １：１０２−１１４ Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｐ．ら，Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍ
ｉｔｔｅｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ，ｐ
ｐ．６１−８９，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨー
ク（１９８３） Ｂｅｒｇｅｒ，Ｌ．およびＨａｋｉｍ，Ａ．（１９８
８）Ｓｔｒｏｋｅ，１９：１２５７−１２６１ Ｂｒａｎｄｔ，Ｌ．，Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎｍ Ｂ．，Ｓ
ａｖｅｌａｎｄ，Ｈ，，およびＨｙｍａｎ，Ｔ．（１９
８８），Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒｕｒｇｉｃａ，
Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４５：１１−２０ Ｂｒｉｎｔ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｂｌｏｏ
ｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．８：４７４−４８５（１９
８８） Ｇｅｌｍｅｒｓ，Ｈ．，Ｇｏｒｔｅｒ，Ｋ．，Ｗｅｅｒ
ｄｔ，Ｃ．，Ｗｅｉｚｅｒ，Ｈ．（１９８８），Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃ
ｉｎｅ ３１８：２０３−２０７ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｗｅｉｓｓ，Ｊ．，Ｐｈａ
ｍ，Ｐ．およびＣｈｏｉ，Ｄ．（１９８７），Ｔｈｅ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａ
ｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ
ｉｃｓ ２４３：７８４−７９１ Ｇｒａｙ，Ｗ．，Ｏｌｉｖｅｒａ，Ｂ．およびＣｒｕ
ｚ，Ｌ，（１９８８）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏ
ｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５７：６６５−７００ Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｄ．およびＣｈｏｉ，Ｄ．（１９８
９）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌｏｇｙ ａｎｄ ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＴｈｅｒ
ａｐｅｕｔｉｃｓ ２５０：７５２−７５８ Ｋｉｒｉｎｏ，Ｔ．（１９８２）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ，２３９：５７−６９ Ｌａｎｇｌｅｙ，Ｍ．およびＳｏｒｋｉｎ，Ｅ．（１９
８９），Ｄｒｕｇｓ３７：６６９−６９９ ＭｃＣｌｅｓｋｅｙ，Ｅ．Ｗ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４３２７−３１
（１９８７） Ｎｅｗｂｅｒｇ，Ｌ．，Ｓｔｅｅｎ，Ｐ．，Ｍｉｌｄ
ｅ，Ｊ．およびＭｉｃｈｅｎｆｅｌｄｅｒ，Ｊ．（１９
８４）Ｓｔｒｏｋｅ １５：６６６およびその次の頁 Ｎｏｗｙｃｋｙ，Ｍ．Ｃ．，Ｆｏｘ，Ａ．Ｐ．およびＴ
ｓｉｅｎ，Ｒ，Ｗ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），
３１６：４４０−４４３（１９８５） Ｐｕｌｓｉｎｅｌｌｉ，Ｗ．Ａ．ら，（１９７９）Ｓｔ
ｒｏｋｅ，１０：２６７−２７２ Ｏｌｉｖｅｒａ，Ｂ．，Ｍｃｉｎｔｏｓｈ，Ｊ．，Ｃｒ
ｕｚ，Ｌ．，Ｌｕｑｕｅ，Ｆ．およびＧｒａｙ，Ｗ．
（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３：５０８
７−５０９０ Ｏｌｎｅｙ，Ｊ．，Ｌａｂｒｕｙｅｒｅ，Ｊ．およびＰ
ｒｉｃｅ，Ｍ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１
３６０−１３６２ Ｒｉｖｉｅｒ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
２：１１９４−１１９８ Ｒｏｔｈｍａｎ，Ｓ．（１９８４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ７：１８８４−１８９
１ Ｓａｎｏ，Ｋ．ら（１９８７）Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌ，１４１：２３５−２４１ Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．，Ｚｗａｎ，Ｊ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ
ｓ，Ｔ．，Ｍｅｌｄｒｕｍ，Ｂ．（１９８４）Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２２６：８５０−８５２ Ｔａｔｅｉｓｈｉ，Ａ．，Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．，
Ｄｒｕｍｏｎｄ，Ｊ．，Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，Ｍ．，Ｚｏ
ｒｎｏｗ，Ｍ．，Ｇｒａｆｅ，Ｍ．およびＳｃｈａｐｉ
ｒｏ，Ｈ．，（１９８９）Ｓｔｒｏｋｅ ２０：１０４
４−１０５０ Ｖａｎ Ｒｅｅｍｐｔｓ，Ｊ．およびＢｏｒｇｅｒｓ，
Ｍ．（１９８４）Ａｃａｄ．Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｏｌ
ｉｃａ Ｂｅｌｇｅ ３５，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，２
０９−２１８ Ｖａｎ Ｒｅｅｍｐｔｓ，Ｊ．およびＢｏｒｇｅｒｓ，
Ｍ．（１９８５）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｅｍｅｒｇｅｎ
ｃｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １４：８およびその次の頁 Ｖｉｂｕｌｓｒｅｔｈ，Ｓ．，Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，
Ｗ．，Ｂｕｓｔｒｏ，Ｒ．，およびＧｉｎｓｂｅｒｇ，
Ｍ．（１９８７）Ｓｔｒｏｋｅ １８：２１０−２１６ Ｗａｕｑｕｉｅｒ，Ａ．，Ｅｄｍｏｎｄｓ，Ｈ．，Ｃｌ
ｉｎｃｋｅ，Ｇ．（１９８７）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃ
ｅ ａｎｄ Ｂｉｏｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｒｅｖｉｅ
ｗｓ １１：２８７−３０６
【図１】図１は、いくつかの天然に生じるＯＣＴペプチ
ドの一次配列を示す。
ドの一次配列を示す。
【図２】図２は、類似のＯＣＴペプチドを示す。
【図３】図３は、未処置の神経芽細胞腫の細胞（３Ａ）
中およびＯＣＴ ＭＶＩＩＡの、増加する濃度にさらさ
れた神経芽細胞腫の細胞（３Ｂ−３Ｄ）中の−１００ま
たは−８０ｍＶ〜−２０ｍＶの電圧ステップによって引
き起こされる電圧ゲートカルシウム電流（ｖｏｌｔａｇ
ｅ−ｇａｔｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｕｒｒｅｎｔ）ト
レースを示す。
中およびＯＣＴ ＭＶＩＩＡの、増加する濃度にさらさ
れた神経芽細胞腫の細胞（３Ｂ−３Ｄ）中の−１００ま
たは−８０ｍＶ〜−２０ｍＶの電圧ステップによって引
き起こされる電圧ゲートカルシウム電流（ｖｏｌｔａｇ
ｅ−ｇａｔｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｕｒｒｅｎｔ）ト
レースを示す。
【図４】図４は、ＯＣＴ ＭＶＩＩＡ（●）およびＯＣ
ＴＧＶＩＡ（▲）の関数として神経芽細胞腫細胞中の最
高の内向きのカルシウム電流の阻害パーセントをプロッ
トしている。
ＴＧＶＩＡ（▲）の関数として神経芽細胞腫細胞中の最
高の内向きのカルシウム電流の阻害パーセントをプロッ
トしている。
【図５】図５は、ＯＣＴ ＭＶＩＩＡ活性の関数とし
て、カリウム興奮（黒地棒）によるまたは基本の状態
（白地棒）におけるニューロン細胞からのノルエピネフ
リン放出の阻害を示す。
て、カリウム興奮（黒地棒）によるまたは基本の状態
（白地棒）におけるニューロン細胞からのノルエピネフ
リン放出の阻害を示す。
【図６】図６（ＡおよびＢ）は、ＯＣＴ ＭＶＩＩＡ濃
度の関数として、ラットシナプトソーム膜に結合したＯ
ＣＴ ＭＶＩＩＡの量（６Ａ）、および、Ｓｃａｔｃｈ
ａｒｄ プロットとしてプロットされた同一のデータ
（６Ｂ）を示す結合曲線である。
度の関数として、ラットシナプトソーム膜に結合したＯ
ＣＴ ＭＶＩＩＡの量（６Ａ）、および、Ｓｃａｔｃｈ
ａｒｄ プロットとしてプロットされた同一のデータ
（６Ｂ）を示す結合曲線である。
【図７】図７は、ラット脳シナプトソーム中のＯＣＴ
ＭＶＩＩＡ結合部位に結合するＯＣＴペプチドに関す
る、コンピューター適合競合的結合曲線を示す（ゼロの
非放射能標識リガンドで結合した［125Ｉ］の割合とし
ての、結合［125Ｉ］ＭＶＩＩＡが示されている）。
ＭＶＩＩＡ結合部位に結合するＯＣＴペプチドに関す
る、コンピューター適合競合的結合曲線を示す（ゼロの
非放射能標識リガンドで結合した［125Ｉ］の割合とし
ての、結合［125Ｉ］ＭＶＩＩＡが示されている）。
【図８】図８は、非放射能標識化ＯＣＴの存在（レーン
ｂおよびｄ）または不存在（レーンａおよびｃ）下で膜
に添加した共有結合した放射能標識化ＯＣＴ ＭＶＩＩ
Ａ（レーンａおよびｂ）または共有結合したＯＣＴ Ｇ
ＶＩＡ（レーンｃおよびｄ）を有するラットシナプトソ
ーム膜の★のＳＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラムを示
す。
ｂおよびｄ）または不存在（レーンａおよびｃ）下で膜
に添加した共有結合した放射能標識化ＯＣＴ ＭＶＩＩ
Ａ（レーンａおよびｂ）または共有結合したＯＣＴ Ｇ
ＶＩＡ（レーンｃおよびｄ）を有するラットシナプトソ
ーム膜の★のＳＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラムを示
す。
【図９】図９は、ラット脳シナプトソーム中のＯＣＴ
ＳＶＩＢ結合部位に結合するＯＣＴに関するコンピュー
ター適合競合的結合曲線を示す。
ＳＶＩＢ結合部位に結合するＯＣＴに関するコンピュー
ター適合競合的結合曲線を示す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは、虚血後の動物中のアレ
チネズミ海馬ＣＡ１領域の低倍率顕微鏡写真である。
チネズミ海馬ＣＡ１領域の低倍率顕微鏡写真である。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｄは、薬物で処置した虚血動
物（１１Ａ，１１Ｃ，１１Ｄ）中、ビヒクルのみを受け
取った動物（１１Ｂ）中、虚血細胞損傷に対するＯＣＴ
による完全な保護を示す動物（１１Ｃ）中；および虚血
細胞損傷に対するＯＣＴによる部分的保護を示す動物
（１１Ｄ）中の細胞のより高い倍率の顕微鏡写真であ
る。
物（１１Ａ，１１Ｃ，１１Ｄ）中、ビヒクルのみを受け
取った動物（１１Ｂ）中、虚血細胞損傷に対するＯＣＴ
による完全な保護を示す動物（１１Ｃ）中；および虚血
細胞損傷に対するＯＣＴによる部分的保護を示す動物
（１１Ｄ）中の細胞のより高い倍率の顕微鏡写真であ
る。
【図１２】図１２は、神経保護の全体的虚血モデル中の
種々のＯＣＴペプチドで観察される海馬ＣＡ１細胞中の
神経保護の程度を示す。
種々のＯＣＴペプチドで観察される海馬ＣＡ１細胞中の
神経保護の程度を示す。
【図１３】図１３は、（ａ）未閉塞および未処置の
（○）、（ｂ）未閉塞およびＭＶＩＩＡペプチドで処置
した（●）、（ｃ）閉塞したが未処置の（△）および閉
塞しかつＭＶＩＩＡペプチドで処置した（▲）動物中の
自発運動活性における変化をプロットしている。
（○）、（ｂ）未閉塞およびＭＶＩＩＡペプチドで処置
した（●）、（ｃ）閉塞したが未処置の（△）および閉
塞しかつＭＶＩＩＡペプチドで処置した（▲）動物中の
自発運動活性における変化をプロットしている。
【図１４】図１４は、ＯＣＴペプチドの神経保護および
不活性群のアミノ酸配列を示す。
不活性群のアミノ酸配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ビットナー・ロバート・エス アメリカ合衆国、インディアナ州、47906 ウエスト・ラファィエット、サミット・ ドライヴ、1520 (72)発明者 バワーサックス・スティーブン・エス アメリカ合衆国、カリフォルニア州、 94025 メンロー・パーク、ダンスムイア ー・ウエィ、148 (72)発明者 フォックス・ジェィムス・エィ アメリカ合衆国、カリフォルニア州、 94306 パロ・アルト、カールソン・サー クル、3708 (72)発明者 ヴァレンチノ・カレン・エル アメリカ合衆国、カリフォルニア州、 94070 サン・カルロス、トゥ・エルム・ ストリート、ナンバー202 (72)発明者 ヤマシロ・ドナルド・エィチ アメリカ合衆国、オハイオ州、44118 ク リーブランド・ハイツ・セブレンス・サー クル、30 アパートメント 407 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 BA01 BA08 BA19 BA23 CA47 DA35 NA14 ZA011 ZA012 ZA021 ZA022 ZA361 ZA362 ZC022 4H045 AA10 AA30 BA18 CA50 DA83 EA23
Claims (1)
- 【請求項１】 哺乳動物中枢神経系ニューロン細胞にお
けるノルエピネフリン放出を遮断する活性、および、ニ
ューロン膜ω−コノトキシンＭＶＩＩＡ結合部位に結合
する活性を有するニューロンカルシウムチャンネルアン
タゴニストωコノトキシンペプチドであって、該遮断活
性および該結合活性が、ω−コノトキシンＭＶＩＩＡ、
ＧＶＩＡ、またはＴＶＩＡの遮断活性および結合活性の
範囲内にあるペプチドを含む、哺乳動物種における虚血
状態に関連するニューロン損傷を減ずるための薬学的組
成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US44004989A | 1989-11-22 | 1989-11-22 | |
| US440,049 | 1989-11-22 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50152291A Division JP3809184B2 (ja) | 1989-11-22 | 1990-11-21 | 虚血関連ニューロン損傷を処置するための組成物 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004028643A Division JP2004196814A (ja) | 1989-11-22 | 2004-02-04 | 虚血関連ニューロン損傷を処置するための組成物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002145798A true JP2002145798A (ja) | 2002-05-22 |
Family
ID=23747212
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001269591A Withdrawn JP2002145798A (ja) | 1989-11-22 | 2001-09-05 | 虚血関連ニューロン損傷を処置するための組成物 |
| JP2004028643A Withdrawn JP2004196814A (ja) | 1989-11-22 | 2004-02-04 | 虚血関連ニューロン損傷を処置するための組成物 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004028643A Withdrawn JP2004196814A (ja) | 1989-11-22 | 2004-02-04 | 虚血関連ニューロン損傷を処置するための組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JP2002145798A (ja) |
-
2001
- 2001-09-05 JP JP2001269591A patent/JP2002145798A/ja not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-02-04 JP JP2004028643A patent/JP2004196814A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2004196814A (ja) | 2004-07-15 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20031002 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20041129 |