JP2001500372A - 独特の髄膜炎菌性bエピトープを規定するモノクローナル抗体およびワクチン組成物の調製におけるそれらの使用 - Google Patents

独特の髄膜炎菌性bエピトープを規定するモノクローナル抗体およびワクチン組成物の調製におけるそれらの使用

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Abstract

(57)【要約】 Neisseria meningitidis血清型B(「MenB」)に対する新規の殺菌性抗体が開示される。この抗体は、宿主組織のポリシアル酸と交差反応しないか、または最小限に交差反応するかのいずれかであり、従って、自己免疫活性の最小の危険を提示する。この抗体は、MenBまたはE.coli K1上で見出される独特のエピトープの分子模倣物を同定するために使用される。このようなペプチド模倣物の例が記載される。これらは、MenBまたはE.coli K1疾患を、自己抗体を誘発する危険を伴わずに予防するために使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】 独特の髄膜炎菌性Bエピトープを規定するモノクローナル抗体 およびワクチン組成物の調製におけるそれらの使用技術分野 本発明は、一般に、細菌病原体に関する。特に、本発明は、Neisseria mening itidis血清型Bに対する機能活性を誘発し、また自己免疫活性を欠失する抗体、 これを得る方法および使用する方法、ならびにこの抗体を使用して同定される分 子模倣物に関する。発明の背景 Neisseria meningitidisは、細菌性髄膜炎および敗血症の原因物質である。髄 膜炎菌は、莢膜および細胞壁の抗原の免疫学的特徴に基づいて血清学的群に分け られる。現在認識されている血清型には、A、B、C、D、W-135、X、Y、Z 、および29Eが含まれる。血清型特異性を担うポリサッカライドは、いくつかの これらの群(A、B、C、D、W-135、およびYを含む)から精製されている。 N.meningitidis血清型B(「MenB」)は、合衆国およびヨーロッパに居住す る幼児および小児における細菌性髄膜炎の約50パーセントを占める。この生物は また、若年成人に致死的な敗血症を引き起こす。青年において、外膜タンパク質 (OMP)粒子からなる実験的MenBワクチンが、約50%防御的であることが見出さ れている。しかし、防御は、ワクチン接種された幼児および小児(疾患の最も大 きな危険にある年齢群)において観察されていない。さらに、OMPワクチンは、 血清型特異的かつサブタイプ特異的であり、そして優勢なMenB株は、地理的およ び時間的変化の両方に供され、このようなワクチンの有用性を制限する。 莢膜ポリサッカライドに基づく有効なワクチンは、血清型A、C、Y、および W135によって引き起こされる髄膜炎菌性疾患に対して開発されている。しかし、 MenBポリサッカライドワクチンを開発する類似の試みは、莢膜MenBポリサッカラ イド(本明細書中で、「MenB PS」と呼ばれる)の乏しい免疫原性に起因して失 敗している。MenB PSは、(N-アセチル(α2→8)ノイラミン酸のホモポリマーで ある。EscherichiacoliK1は、同一の莢膜ポリサッカライドを有する。MenB PSに よって惹起される抗体は、宿主のポリシアル酸(PSA)と交差反応する。PSAは、 胎児および新生児組織において豊富に、特に脳組織中に見出される神経細胞接着 分子(「NCAM」)上で発現される。PSAはまた、腎臓、心臓、および臭神経を含 む成人組織においてより低い程度にまで見出される。従って、ほとんどの抗MenB PS抗体もまた、自己抗体である。それゆえ、このような抗体は、胎児発達に有 害に影響を与えるか、または自己免疫疾患を導く能力を有する。 MenB PS誘導体は、MenB PSの不良な免疫原性を回避するための試みにおいて調 製されている。例えば、C3〜C8N-アシル置換MenB PS誘導体が記載されている。J enningsらに対するEP公開第504,202Bを参照のこと。同様に、Jenningsらに対す る米国特許第4,727,136号は、N-プロピオニル化MenB PS分子(本明細書中で「NP r-MenB PS」と呼ばれる)を記載する。NPr-MenB PS複合糖質で免疫したマウスは 、IgG抗体の高力価を誘発すると報告された。Jenningsら(1986)J.Immunol.13 7:1708。ウサギにおいて、抗体の2つの異なる集団(2つの異なるエピトープに 結合し、1つは天然のMenB PSにより共有されていて、1つは共有されていない と報告されている)が、誘導体を用いて産生された。殺菌活性が、MenB PSと交 差反応しなかった抗体集団において見出された。Jenningsら(1987)J.Exp.Med. 165:1207。この結合体によって惹起された防御的抗体と反応する細菌表面のエピ トープの同一性は、未知のままである。 ペプチドは、ポリサッカライド特異的抗体、および他のポリサッカライド結合 タンパク質に結合することによってポリサッカライドの模倣物として作用し得る 。例えば、コンカナバリンA(ConA)(これは、末端α連結マンノースまたはグ ルコース残基を有するオリゴサッカライドに結合する)は、pIIIコートタンパク 質のアミノ末端に短いペプチド配列を有する細菌性ファージのランダムライブラ リー由来のペプチド模倣物を選択するために使用されている。Oldenbergら(199 2)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5393;Scottら(1992)Proc.Natl.Acad.Sc i.USA 89:5398。同様に、モノクローナル抗体は、ファージライブラリー由来の 腺ガン細胞の表面上に存在する炭水化物のペプチド模倣物を同定した。Hoess ら(1993)Gene 128:43。 ペプチドは、ポリサッカライド特異的抗体もまた惹起し得る。例えば、Wester inkら(1988)Infect.Immun.56:1120は、N.meningitidis血清型C(「MenC」) 莢膜ポリサッカライドに対するモノクローナル抗体を、抗イディオタイプ抗体を 惹起するために使用した。抗イディオタイプ抗体で免疫したマウスは、致死的用 量のMenC細菌での感染から防御された。これらの実験者らは、引き続き、MenC抗 イディオタイプ抗体のペプチドフラグメントが血清抗MenC抗体を誘発し、そして 動物をMenC細菌での致死的抗原投与後の菌血症および死から防御することを示し た。Westerinkら(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4021。 しかし、現在までに、このようなアプローチはMenBワクチンの開発に関して採 用されていない。MenBに対する安全でかつ効果的なワクチンの産生が特に望まし いことは、容易に明らかである。発明の要旨 本発明は、MenB PS誘導体に対する機能的に活性な抗体の発見に基づいている 。ここで、この抗体は、本明細書中で記載されるアッセイを使用して決定した場 合、宿主組織と交差反応しないか、または最小限に交差反応する。それゆえ、こ れらの抗体は、自己免疫疾患を誘発する最小の危険を提示し、そして本明細書中 で「非自己反応性」と呼ばれる。本明細書中で自己反応性を決定するために使用 されるアッセイには、細胞表面上に長鎖ポリシアル酸残基を発現する神経芽細胞 腫細胞株に対する結合アッセイが含まれる。詳細には、これらのアッセイにおい てネガティブな抗体は、自己反応性を欠失すると考えられる。非自己反応性抗体 は、ワクチン組成物中で使用され得る独特のMenB PSエピトープの分子模倣物を 同定するために特に有用である。さらに、抗体、抗体のヒト化バージョン、それ らのフラグメントおよび機能的等価体もまた、MenBおよびE.coli K1疾患に対す る、および/またはそのための治療に対する補助物として、受動免疫において使 用される。このような分子は、本明細書中に記載される自己反応性アッセイで決 定した場合、宿主組織中のポリシアル酸に結合しないので、MenBおよびE.coli K1疾患の処置および/または予防のための安全なそして効率的な方法を提供する 。 従って、1つの実施態様において、本発明は、MenB PS誘導体に対する抗体に 関する。ここで、この抗体は、宿主組織と自己反応性ではない。このような抗体 は、MenB細菌に対する機能活性を誘発し得るとしてさらに特徴づけられる。この ような抗体の1つの特定の群はまた、ELISAにおいてNeisseria meningitidis血 清型B莢膜ポリサッカライド(NAc-MenB PS)と非交差反応性であるとして特徴 づけられる。しかし、これらの抗体は、それらがB群莢膜細菌の細胞表面に結合 し得るが、莢膜欠損変異体には結合し得ない点で抗莢膜性である。 本発明の別の実施態様は、MenB PS誘導体に対するモノクローナル抗体、およ びこれらのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。 本発明の他の実施態様は、本発明の抗体分子によって結合され得る独特のNeis seria meningitidis血清型Bエピトープに関する。 本発明のなおさらなる実施態様は、MenB PSの独特のエピトープの分子模倣物 を単離するための方法、およびこの方法を使用して同定される分子模倣物に関す る。この方法は、以下を包含する: (a)MenB PSの独特のエピトープの推定分子模倣物を含む分子の集団を提供す る工程; (b)上記分子模倣物が存在する場合には、上記抗体と上記分子模倣物との間 の免疫学的結合を可能にする条件下で、上記分子の集団をその抗体と接触させて 複合体を提供する工程;そして (c)非結合分子から上記複合体を分離する工程。 別の実施態様において、本発明は、MenBの独特のエピトープを、薬学的に受容 可能な賦形剤と組み合わせて含むワクチン組成物に関する。 なお別の実施態様において、本発明は、MenBの独特のエピトープの分子模倣物 を、薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて含むワクチン組成物に関する。 なおさらなる実施態様において、本発明は、MenBの独特のエピトープの抗イデ ィオタイプ抗体分子模倣物を、薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて含むワ クチン組成物に関する。 なおさらなる実施態様において、本発明は、上記の抗体を含む薬学的組成物に 関する。 別の実施態様において、本発明は、上記の薬学的組成物の有効量を被験体に投 与する工程を包含する、哺乳動物被験体においてMenBおよび/またはE.coli.K1 疾患を処置または予防するための方法に関する。 本発明のこれらおよび他の実施態様は、本明細書中の開示を考慮することによ り、当業者に容易に想到される。図面の簡単な説明 図1A〜1Dは、ELISAによって決定した、3つの代表的な抗NPr-MenB PSモノクロ ーナル抗体(それぞれ、SEAM-3、SEAM-5、SEAM-16、およびSEAM-18)の固相NPr- MenB PSへの用量応答結合活性を示す。示すデータは、緩衝液で希釈した抗体( ●)、または25μg/mlの可溶性NPr-MenB PSを含む緩衝液で希釈した抗体(○) についてである。データにおけるX軸について異なる範囲を使用する。ここでモ ノクローナル抗体SEAM-3、SEAM-16、およびSEAM-18を0.0001μg/ml〜1μg/ml で示し、そしてモノクローナル抗体SEAM-5を0.1μg/ml〜100μg/mlで示す。 図2は、ELISAによって決定した、可溶性高分子量(HMW)NPr-MenB PSインヒ ビターの25μg/ml(■)または3.8モノマーの平均重合度を有する低分子量(LM W)NPr-MenBオリゴサッカライドインヒビター(□)の25μg/mlのいずれかによ って4つの代表的な抗NPr-MenB PSモノクローナル抗体(SEAM-2、SEAM-3、SEAM- 16、およびSEAM-18)の固相NPr-MenB PSへの結合の阻害を示す。 図3は、ELISAによって決定した、5つの代表的な抗NPr-MenB PSモノクローナ ル抗体(SEAM-12、SEAM-16、SEAM-18、SEAM-2、およびSEAM-3)の固相NAc-MenB PSへの結合を示す。0.5μg/mlおよび/5μg/mlの抗体で試験した場合、3つの 抗体(SEAM-12、SEAM-16、およびSEAM-18)は有意な結合を示した。2つの他の 抗体(SEAM-2およびSEAM-3)は、5倍高い濃度(25μg/mlの抗体)で試験した 場合、ネガティブであった。 図4A〜4Gは、間接的な蛍光フローサイトメトリーによって決定した、コントロ ール抗体ならびに代表的な抗NPr-MenB PSモノクローナル抗体(SEAM-3、SEAM-18 、SEAM-9、SEAM-10、およびSEAM-7)の莢膜化全MenB細菌および非莢膜化全MenB 細菌との交差反応性を示す。莢膜はNAc-MenBPSを含む。 図5A〜図5Dは、MenB試験株8047に対して試験した場合、4つの代表的な抗NPr- MenB PSモノクローナル抗体(それぞれ、SEAM-3、SEAM-5、SEAM-12、およびSEAM -18)の補体媒介性殺菌活性を示す。3つの異なる補体供給源(乳仔ウサギの補 体I(▲);乳仔ウサギ補体II(●);およびヒト補体(○))を用いる実験か らの結果を示す。 図6A〜6Iは、間接的な蛍光フローサイトメトリーによって決定した、ヒト神経 芽細胞腫株CHP−134の表面上に示されるポリシアル酸抗原との3つのコントロー ル抗体および4つの代表的な抗NPr-MenB PSモノクローナル抗体(SEAM-5、SEAM- 35、SEAM-12、およびSEAM-7)の交差反応性を示す。 図7は、ファージディスプレイペプチドライブラリーからSEAMモノクローナル 抗体によって選択した67個の独特のペプチド模倣配列(配列番号1〜67)のアミ ノ酸配列を示す。 図8Aおよび図8Bは、SEAMモノクローナル抗体によって選択したペプチド模倣配 列を含む2つのペプチドへの7つの代表的なSEAMモノクローナル抗体(SEAM-2、 SEAM-3、SEAM-5、SEAM-7、SEAM-12、SEAM-16、およびSEAM-18)のELISA結合活性 を示す。(図8Aにおいて、「Pep4」は、ラウリル−GLY-GLY-[配列番号4]-アミ ドであり、そして図8Bにおいて、「Pep8」は、ラウリル−GLY-GLY-[配列番号8] -アミドである)。各ペプチドは、ペプチドのマイクロタイタープレートへの結 合を促進するためにカルボキシル末端アミド、およびアミノ末端にラウリル−GL Y-GLYを含む。 図9は、固相抗原ペプチドとしてPep8を用いるELISAによって測定した、CD1 マウス由来のプールした(1つのプール当たり4匹のマウス)免疫血清および非 免疫(CTL)血清の抗体結合活性を示す。免疫血清は、莢膜欠損Neisseria menin gitidisM7株外膜タンパク質粒子と複合体化した模倣ペプチドの5μgまたは50 μgで免疫化したマウス由来である。ペプチドは、Pep5(ラウリル−GLY-GLY-[ 配列番号5]-アミド)、Pep8(ラウリル−GLY-GLY-[配列番号8]-アミド)、ま たはPep1〜Pep9の9つのペプチド(Pep1、ラウリル−GLY-GLY-[配列番号1]-ア ミド;Pep2、ラウリル−GLY-GLY-[配列番号2]-アミド;Pep3、ラウリル−GLY-G LY-[配列番号3]-アミド;Pep4、ラウリル−GLY-GLY-[配列番号4]-アミド;Pep 5、 ラウリル−GLY-GLY-[配列番号5]-アミド;Pep6、ラウリル−GLY-GLY-[配列番号 6]-アミド;Pep7、ラウリル−GLY-GLY-[配列番号7]-アミド;Pep8、ラウリル −GLY-GLY-[配列番号8]-アミド;およびPep9、ラウリル−GLY-GLY-[配列番号9 ]-アミド)の混合物を含んだ。緩衝液で希釈した血清(□)、可溶性Pep8(アセ チル-[配列番号8]-アミド)を含む緩衝液(■)、または可溶性の非関連ペプチ ドR1(アセチル-GLN-TRP-GLU-ARG-THR-TYR-アミド(配列番号68)を含む緩衝液 (網かけバー)との間の結合を比較する。 図10は、固相抗原としてNPr-MenB PSを用いたELISAによって測定した、CD1マ ウス由来のプールした(1つのプール当たり4匹のマウス)免疫血清および非免 疫コントロール血清の抗体結合活性を示す。マウスを、上記の図9のようなペプ チド免疫原で免疫した。 図11は、固相抗原としてNAc-MenB PSを用いたELISAによって測定した、CD1マ ウス由来のプールした(1つのプール当たり4匹のマウス)免疫血清および非免 疫コントロール血清の抗体結合活性を示す。マウスを、上記の図9のようなペプ チド免疫原で免疫した。公知の自己抗体活性を有するSEAM-30抗体はポジティブ コントロールとして役立つ。 図12A〜12Bは、種々の希釈の試験血清およびヒト補体とインキュベートした細 菌のパーセント生存率を示す。示すデータは、莢膜欠損Neisseria meningitidis M7株外膜タンパク質粒子と複合体化した模倣ペプチドPep8(ラウリル−GLY-GLY -[配列番号8]-アミド)の5μg(図11A)または50μg(図11B)で免疫化した CD1マウス由来の試験プール血清(1つのプール当たり4匹のマウス)由来であ る。血清は、緩衝液またはPep8インヒビター(100μg/ml)を含む緩衝液で希釈 した。補体の供給源はヒト無ガンマグロブリン血症であり、そして細菌試験株は 8047である。発明の詳細な説明 本発明の実施は、他に示さなければ、当該分野の技術内の免疫学、微生物学、 分子生物学、および組換えDNA技術の従来の方法を用いる。このような技術は、 文献において十分に説明される。例えば、SambrookらMolecular Cloning:AL aboratory Manual(第2版、1989);DNA Cloning:A Practical Approach第I巻 &第II巻(D.Glover編);Oligonucleotide Synthesis(N.Gait編、1984);N ucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins編、1985);Transcription a nd Translation(B.Hames & S.Higgins編、1984);Animal Cell Culture(R .Freshney編、1986);Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning(19 84);およびHandbook of Experimental Immunology、I〜IV巻(D.M.Weirおよ びC.C.Blackwell編、1986、Blackwell Scientific Publication)を参照のこと 。 本明細書および添付の請求の範囲で使用される場合、単数形態「a」、「an」 、および「the」は、他に内容が明確に指示しなければ、複数の参照を含む。 I.定義 本発明を記載するにおいて、以下の用語が用いられ、そして以下に示すように 定義されることが意図される。 本明細書中で使用される場合「MenB PS誘導体」は、MenBの天然の莢膜ポリサ ッカライドの化学的改変によって得られた分子をいう。このようなMenB PS誘導 体は、適切なアシル基(例えば、C3〜C8およびより高級なアシル基(ここで用語 「アシル基」は任意のアシル化された直鎖状分子、分枝状分子、脂肪族分子、ま たは芳香族分子を含む))との、天然の分子のシアル酸残基N-アセチル基の置換 によって改変されているMenB PS分子を含むが、これらに限定されない。本明細 書中での使用に対して特に好ましいMenB PS誘導体は、天然のMenB PSのN-アセチ ル基についてのN-プロピオニル基での置換を含む(本明細書中で「NPr-MenB PS」 と呼称)。N-アシル置換MenB PS誘導体(NPr-MenB PSを含む)を合成するための 方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、Jenningsらへの米国特許第4,72 7,136号およびさらにJenningsらへのEP公開番号第504,202B号に記載される。 MenB PSまたはMenB PS誘導体の「分子模倣物」は、MenB細菌上に発現される少 なくとも1つの「独特の」エピトープを機能的に模倣する分子である。「独特の エピトープ」は、宿主組織のポリシアル酸と交差反応しない(それゆえ自己免疫 活性を欠く)か、または最少に交差反応するかのいずれかである機能的に活性な (例えば、オプソニ媒介性殺菌および/または補体媒介性殺菌)抗MenB抗体の形 成を惹起し得るエピトープである。このような分子模倣物は、ワクチン組成物に おいて有用であり、そして以下でさらに記載される診断的な適用または治療的適 用のための抗体の惹起において有用である。分子模倣物には、小有機化合物;核 酸および核酸誘導体;サッカライドまたはオリゴサッカライド;ペプチド、タン パク質、およびそれらの誘導体(例えば、非ペプチド有機部分、アミノ酸および /またはペプチド結合を含んでもよいし、含まなくてもよいが、ペプチドリガン ドの構造的特徴および機能的特徴を保持する合成ペプチド、ならびにN-置換グリ シンを含む分子であるペプトイドおよびオリゴペプトイド(例えば、Simonら(1 992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:9367に記載されるペプトイドおよびオリ ゴペプトイド))を含むペプチド模倣物;ならびに抗体(これは、抗イディオタ イプ抗体を含む)が挙げられるが、これらに限定されない。分子模倣物の同定お よび生成のための方法は、以下により十分に記載される。 用語「抗体」は、ポリクローナル抗体調製物およびモノクローナル抗体調製物 ならびにハイブリッド抗体、変化された抗体、F(ab')2フラグメント、F(ab)分子 、Fvフラグメント、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、およびもとの抗体分子の免 疫学的結合特性を示すそれらの機能的なフラグメントを含む調製物を含む。 本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」は、同質な抗体集団を有 する抗体組成物をいう。この用語は、それが作製される様式によって限定されな い。この用語は、全免疫グロブリン分子ならびにFab分子、F(ab')2フラグメント 、Fvフラグメント、およびもとのモノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を 示す他の分子を含む。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する 方法は当該分野で公知であり、そして以下でより十分に記載される。 「抗原」は抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質を含むように本 明細書中で定義される。「免疫原」は、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活 性化を開始し得る抗原である。 「エピトープ」によって、特異的B細胞およびT細胞が応答する抗原上の部位 が意味される。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換 可能に使用される。ペプチドエピトープは、エピトープに独特な空間的コンフォ メーション中に3つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なく とも5つのこのようなアミノ酸からなり、より通常には少なくとも8〜10のこの ようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法 は当該分野で公知であり、そして例えば、X線結晶学、および2次元核磁気共鳴 分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるエピトープの同定は、当該分 野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、Geysenら(1984)Proc. Natl.Acad.Sci.USA 81:3998(所定の抗原における免疫原性エピトープの位置 を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法);米国特許第4,708, 871号(抗原のエピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順);お よびGeysenら(1986)Molecular Immunology 23:709(所定の抗体に対して高い 親和性を有するペプチドを同定するための技術)を参照のこと。同じエピトープ を認識する抗体が、単純な免疫アッセイにおいて同定され得る。これは標的抗原 に対する別の抗体の結合をブロックする一方の抗体の能力を示す 「独特のMenBエピトープ」は、MenB細菌上に存在するエピトープとして本明細 書中で定義される。ここで、エピトープを指向する抗体はMenBに特異的に結合し 得、そして宿主組織の表面上に存在するシアル酸残基と交差反応しないか、また は最少に交差反応する。従って、1つ以上の「独特のMenBエピトープ」を含むか 、または模倣する免疫原は、MenB疾患の予防のためのワクチンにおいて有用であ り、そして自己免疫応答を惹起しないか、または自己免疫応答を惹起する最少の 危険与える。 本明細書中に記載されるアッセイを使用して決定される、MenBに対する補体媒 介性殺菌活性および/またはオプソニン活性を抗体分子が示す場合、抗体はMenB 生物に対する「機能的な活性」を示す。 本明細書中に記載される結合アッセイを使用して決定される、宿主組織中のポ リシアル酸との交差反応性免疫学的結合特性を本抗体が示さない場合、「独特の 」MenBエピトープに対して特異的な抗体は、「自己免疫活性を欠く」、および/ または「自己反応性ではない」。 本明細書中で記載される結合アッセイにおいてポジティブであるとみなされる 公知の交差反応性自己抗体と比較して、宿主組織のポリシアル酸への結合を示す のに約10倍高い抗体濃度を本抗体が必要とする場合、「独特の」MenBエピトープ に対して特異的な抗体は、「自己反応性ではない」。(例えば、図6におけるSE AM-12の結合をSEAm-35の結合と比較のこと)。従って、この用語は、本明細書中 で記載される結合アッセイにおいて自己反応性でないか、または最少に自己反応 性であるそれらの抗体を含む。 本明細書中で使用される用語「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」は 、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンが特異的である抗原との間に生じる非共 有結合的な相互作用の型をいう。 用語「精製された」および「単離された」により、ポリペプチド、抗体、およ び核酸配列を言及する場合、示された分子が、実質的に他の同型の生物学的巨大 分子の非存在下で存在することを意味する。本明細書中で使用される用語「精製 された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも75重量%、より好まし くは少なくとも85重量%、よりさらに好ましくは少なくとも95重量%、そして最 も好ましくは少なくとも98重量%の、同型の生物学的巨大分子が存在することを 意味する。同様に、「単離された」抗体は、抗体の混合集団から分離された抗体 (例えば、目的の分子に対して惹起された抗血清)である。 「相同性」とは、2つのポリヌクレオチド部分またはポリペプチド部分間の同 一性の割合をいう。2つ以上の配列間の対応は当該分野で公知の技術により決定 され得る。例えば、相同性は、2つのポリペプチド分子間の配列情報の直接比較 により決定され得る。2つのペプチド配列は、少なくとも約60%(好ましくは少 なくとも約80%、そして最も好ましくは少なくとも約90%)のアミノ酸が一致す る場合に、「実質的に相同」である。 II.発明を実施する態様 本発明は、MenBに対する新規の機能性抗体の発見に基づく。抗体は、本明細書 中に記載されるアッセイを用いて決定される場合、宿主中のポリシアル酸と交差 反応しないか、または最小限に交差反応性であり、それゆえ、この抗体は、宿主 組織と高度に交差反応性である抗体よりも自己免疫活性を惹起する危険性が低い 。この抗体を使用して、MenBの表面に見い出される独特なエピトープの分子模倣 物 を同定し得る。抗体および/または模倣物を、MenBおよびE.coli K1疾患を処置 および/または予防するためにワクチン組成物において、ならびにMenBおよびE. coli K1細菌の同定のための診断組成物において使用し得る。 上記で説明されるように、MenBの天然の莢膜ポリサッカライド(本明細書中で 「MenB PS」という)は、ヒトおよび他の哺乳動物被験体において不充分に免疫 原性である。さらに、天然のMenB PSは、自己抗体の産生を惹起し、それゆえ、 ワクチン組成物における使用には不適切であり得る。従って、本発明は、MenB P S誘導体に対して調製される抗体を使用する。これらの抗体は、MenB細菌に対す る機能活性(ここで、この機能活性はMenB疾患に対する防御を付与することにお いて重要である)を示すそれらの能力に基づいて選択される。抗体はまた、最小 限または検出不可能な自己免疫活性を示すことを基礎に選択される。 より詳細には、MenB PS誘導体は、本発明の抗体分子を得る際の使用のために 調製された。誘導体は、一般に、天然の分子のシアル酸残基N−アセチル基のC3 〜C8アシル置換基を含む。特に好ましいMenB PS誘導体は、天然MenB PSのN−ア セチル基についてのN−プロピオニル基の置換を含み、これは、本明細書中で「 NPr-MenB PS」という。同一物を合成するためのこのような誘導体および方法は 、例えば、米国特許第4,727,136号およびEP公報第504,202 B号(両者ともJennei ngsら)に記載される。 C3〜C8アシル誘導体は、まず天然のMenB(例えば、N.meningintidis培養物か ら得られる)を強塩基の存在下で処置して定量的にN−アセチル基を除去し、そ して分子のシアル酸残基部分内の反応性アミン基を提供することにより作製され 得る。次いで、脱アシル化MenB PSフラグメントはN−アセチル化される。例え ば、NPr-MenB PSの場合、脱アシル化分子は、米国特許第4,727,136号(Jennings ら)に記載されるように、無水プロピオン酸または塩化プロピオニルのようなプ ロピオニル基の供給源を用いてN−プロピオニル化される。N−アセチル化の程 度は、例えば、NMR分光学を用いて決定され得る。一般に、反応条件は、N−ア セチル化の程度が少なくとも80%であるように、選択される。 MenB PS誘導体の免疫原性を増大させるために、誘導体を適切なキャリア分子 に結合させて複合糖質を提供し得る。詳細には、十分に定義されそして制御され る構造の立体配置を有するN−アセチル化MenB PS複合糖質調製物は、以下に記 載のように、中間サイズのN−アセチル化MenBオリゴサッカライドから形成され 得る。 従って、N−アセチル化MenB PS複合糖質の一群(その一例は、本明細書中で 「CONJ-2」といわれる)は、以下のように調製され得る。例えば、NMR分析によ り決定される場合、実質的に100%のN−アセチル化シアル酸残基を有するN− アセチル化MenB PS調製物は、緩和な酸性条件下で断片化され、種々の大きさの オリゴサッカライド分子の集団を提供し得る。断片化産物は、例えば、標準的な イオン交換クロマトグラフィー技術を、例えば段階的塩濃度勾配と組合せて使用 してサイズ分画され、同質のサイズのN−アセチル化MenB分子の画分を提供する 。中間サイズのオリゴサッカライドを含む画分(例えば、約5〜約22、好ましく は10〜約20、そしてより好ましくは約12〜約18の平均Dpを有する)は、非還元末 端において化学的に末端活性化され、そして還元的アミノ化技術によりタンパク 質キャリアに結合され、CONJ-2複合糖質を提供する。首尾良い複合体化は、例え ば、ゲル濾過により決定され得、そして最終のサッカライドのタンパク質に対す る比率(w/w)は、呈色アッセイにより評価され得る。 次いで、MenB PS誘導体(例えば、CONJ-2)から形成される複合糖質を、本明 細書中で使用して免疫化宿主における抗サッカライド抗体の形成を惹起する。こ のような抗体のサブセットは、本明細書中に記載される結合アッセイを用いて決 定される場合、MenB細菌に結合しないはずであるか、宿主組織シアル酸残基と交 差反応しないはずであるか、または最小限に交差反応性であるはずである。抗体 は、アイソタイプ、精緻な抗原特異性、機能活性、および宿主組織との交差反応 性に関して十分に特徴づけられ得る。 例えば、哺乳動物被験体(簡便には、齧歯類およびウサギのような標準的な実 験動物)は、複合糖質を含む組成物を、適切なアジュバントと共に免疫してポリ クローナル血清の産生を惹起し得る。動物の群は、一般に、免疫化され、そして 組成物で何回か追加免疫される。免疫化された動物由来の抗血清が得られ得、そ して宿主組織と交差反応しないポリクローナル血清はインサイチュ吸収または従 来のアフィニティークロマトグラフィー技術を用いて得られ得る。首尾良い複合 糖質抗原は、T細胞依存性抗原の特徴である、実質的にIgG抗MenB PS誘導体−抗 体応答を惹起するそれらの能力により同定され得る。高度に免疫原性であり、そ して主にIgG抗体を産生することが見い出されている複合体は、本発明の方法に おける使用について特に好ましい。 細菌性抗血清の形成を惹起し得るMenB PS誘導体は、モノクローナル抗体の産 生における使用に適している。より詳細には、種々のMenB PS誘導体結合体を提 供するために使用されるプロセスは、MenB生物の表面に見い出されるエピトープ を模倣し、そして宿主において最小限に発現される独特のサッカライド関連エピ トープを提示する優れた免疫原を産生するために設計される。従って、本明細書 中に記載されるMenB PS誘導体は、防御的または治療的薬学的調製物において直 接使用され得る、好ましくは、抗MenBワクチンについての独特のエピトープを提 供するMenBポリサッカライド抗原の模倣物について検索するのに使用され得るMe nB特異的な抗体の産生を惹起し得る。 従って、本発明の1つの実施態様において、選択されたMenB誘導体を使用して 、モノクローナル抗体およびその機能的等価物を提供する。本明細書中において 使用される、特定のモノクローナル抗体に関する用語「機能的等価物」は、以下 である分子を意味する:(a)例示的なモノクローナル抗体を架橋ブロックする ;(b)問題のMenB PS誘導体または複合糖質に選択的に結合する;(c)本明細 書中に記載される結合アッセイを用いて決定される場合、宿主PSA(および、必 要に応じて、以下に記載される標準的なアッセイにより決定される場合、MenB細 菌性細胞に対する活性(例えば、補体媒介性殺菌活性および/またはオプソニン 活性))とは交差反応しないか、または最小限に交差反応する。さらに、本発明 のハイブリドーマを産生する特定のモノクローナル抗体に関して本明細書中にお いて使用されるように、用語「子孫」は、世代または核型に係わらず、親により 産生されるモノクローナル抗体を産生する、親のハイブリドーマのすべての誘導 体、子孫(issue)、子孫(offspring)を含むことが意図される。 モノクローナル抗体は、当該分野で周知の標準的な技術(例えば、Kohlerおよ びMilstein,Nature(1975)256:495)またはその改変(例えば、Buckら(1982)I n Vitro 18:377により記載される))を使用して調製される。代表的には、マウ スまたはラットを、タンパク質キャリアに結合しているMenB PS誘導体で免疫化 し、追加免疫し、そして脾臓(および必要に応じていくつかの大きなリンパ節) を取り出し、そして単一細胞を解離する。所望であれば、脾臓細胞は、細胞懸濁 液を抗原でコートされたプレートまたはウェルに適用することにより、スクリー ニングされ得る(非特異的接着細胞の除去後)。抗原に特異的な膜結合型イムノ グロブリンを発現するB細胞がプレートに結合し、そして懸濁液の残渣でもリン ス除去されない。次いで、得られたB細胞、すなわちすべての剥離した脾臓細胞 を、ハイブリドーマを形成するために誘導させてミエローマ細胞と融合させる。 ハイブリドーマ形成(hybridization)における使用のための代表的なマウスミ エローマ株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)から入手可能 なミエローマ株を含む。 より詳細には、体細胞ハイブリッドは、Buckら(前出)の方法により、アザグ アニン耐性非分泌マウスミエローマ細胞株P3X63-Ag8.653(ATCCから入手可能) を用いて調製され得る。ハイブリドーマ細胞株は、一般に限界希釈法によりクロ ーン化され、そして免疫化免疫原に特異的に結合し、そして無関連の抗原に結合 しない抗体の産生についてアッセイされる。次いで、選択されたモノクローナル 抗体分泌ハイブリドーマは、インビトロ(例えば、組織培養瓶または中空繊維反 応器)、またはインビボ(例えば、マウスの腹水)のいずれでも培養される。 ハイブリドーマ上清は、例えば、免疫化MenB PS誘導体または天然のMenB PS( NAc-MenB PS)を用いる固体相ELISAまたは間接免疫蛍光アッセイのいずれかを用 いて、抗MenB PS誘導体反応性抗体についてアッセイされ得る。ハイブリドーマ により分泌されるモノクローナル抗体の選択性は、競合的特異的結合アッセイ( 例えば、阻害ELISAなど)を用いて評価され得る。例えば、緩衝液か、または可 溶性MenB PS誘導体もしくはNAc-MenB PSを含む緩衝液中に希釈されている抗体分 子は、結合したMenB PS誘導体の存在下ELISA容器中で反応される。洗浄後、結合 抗体は、二次抗体としての標識抗Ig(抗IgM、IgGおよびIgA)により検出される 。可溶性MenB PS誘導体により阻害される抗体は、特異的であると考慮され、従 ってさらなる研究(アイソタイプ決定および交差反応性、機能活性および自己反 応性についてのさらなるスクリーニングを含む)のために選択される。 特に、部分精製したモノクローナル抗体分子は、それらの細胞表面上にポリシ アル酸残基を発現する宿主細胞に結合するその能力について個々に評価され得る 。このような細胞は、自己免疫活性を示す抗体の検出についての代理標的を代表 する。1つの標的は、ヒト神経芽腫細胞株CHP-134(これは、Livingstonら(198 8)J.Biol.Chem.263:9443に記載されるように、長鎖α2−8ポリシアル酸(NCA M)をその細胞表面上に発現する。)を含む。他の適切な細胞は、以下を含むが それらに限定されない:新生児脳細胞、例えば腎臓、心臓および嗅覚神経由来の 組織、培養伏在静脈内皮細胞、細胞傷害性Tリンパ球およびナチュラルキラー細 胞(NK)細胞。例えば、Brandonら(1993)、Intl.J.Immunopathology and Phar macology 6:77を参照のこと。ハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体 分子は、培養物中の適切な試験細胞集団に添加され得、そしてモノクローナルの 細胞標的に対する潜在的結合が、標識モノクローナルを用いて直接、または各々 のモノクローナル抗体と特異的に反応する適切な標識二次試薬(例えば、Staphy lococcusプロテインAおよびGならびに抗マウス抗体分子)を用いて間接的に、 検出および定量され得る。試験宿主組織PSAと交差反応しないか、または最小限 の反応性を示す抗体は、本発明の目的のための自己反応性とは考慮されない。従 って、これらの抗体は、さらなる使用に適切である。さらに、試験組織との結合 (この結合は試験細胞のノイラミニダーゼでの前処理によっては影響されない) を示すいくつかの抗体もまた、さらなる使用に適切であり得る。このような抗体 の自己反応性は、本明細書中で「不定な」と呼ぶ。 機能活性は、補体媒介性殺菌活性および/またはオプソニン活性を評価するこ とにより測定され得る。詳細には、抗体の補体媒介性殺菌活性は、Goldら(1970 )Infect.Immun.1:479、Westerinkら(1988)Infect.Immun.56:1120、Mandre llら(1995)J.Infect.Dis.172:1279、およびGranoffら(1995)Clin.Diagn.Lab oratory lmmunol.2:574により記載されるような標準的なアッセイを使用して評 価され得る。これらのアッセイにおいて、N.meningitidisを、補体供給源ととも に、および試験される抗体とともに反応させる。細菌計数を、種々の試料採取時 間で行う。補体媒介性殺菌活性を実証するこれらの抗体は、0時間でのコロニー 数と比較した場合、抗体および補体との60分間のインキュベーションの後に測定 される生存細菌細胞数において最小50%の減少により実証されるように、本発明 の目的上、細菌活性を示すことが考えられ、そしてさらなる使用に適切である。 補体媒介性溶菌は、浸潤性の髄膜炎菌性疾患に対する宿主保護を担う主要な機 構であると考えられる。しかし、証拠は、オプソニン作用の重要な保護役割もま た支持する(例えば、Bjerknesら(1995)Infect.Immun.63:160を参照のこと) 。従って、本明細書中で産生される抗体のオプソニン活性は、機能活性を評価す るための第二の手段として、または別の手段として、評価され得る。オプソニン アッセイからの結果は、殺菌性データを補充するために、および保護を与え得る 抗体の選択を助けるために、使用され得る。オプソニン活性の評価はまた、本明 細書中で、IgG1イソタイプを有する本発明のマウスモノクローナル抗体の評価の ために特に有用である。マウスIgG1は(ヒトIgG1と比較して)、補体の活性化に 効果がない。従って、マウスIgG1抗体は、上記のアッセイにおいて、MenBの補体 媒介性溶菌を活性化しない。しかし、IgG1抗NPr-MenB PSモノクローナル抗体の 機能活性は、補体の非存在下でのオプソニン作用により評価され得る。 種々のオプソニンアッセイ方法が、当該分野で公知であり、そして本発明のモ ノクローナル抗体の機能活性を評価するために使用され得る。このような標準的 なアッセイには、Sjursenら(1987)Acta Path.Microbiol.Immunol.Scand., C節 95:283、Halstensenら(1989)Scand.J.Infect.Dis.21:267、Lehmann ら(1991)APMIS 99:769、Halstensenら(1991)NIPH Annals 14:157、Fredlund ら(1992)APMIS 100:449、Guttormsenら(1992)Infect.Immun.60.2777、Gut tormsenら(1993)J.Infec.Dis.167:1314、Bjerknesら(1995)Infect.Immu n.63:160、Hayrinenら(1995)J.Infect.Dis.171:148、de Velascoら(1995 )J.Infect.Dis.172:262、およびVerheul,A.F.M.(1991)「Meningococcal LPS Derived Okigosaccharide-Protein Conjugate Vaccines,Immunochemical a nd Immunological Aspects」,Thesis,Utrecht University,The Netherlands,11 2-135頁、によって記載されるものが含まれる。 目的の選択されたモノクローナル抗体は、日常的な組織培養方法を用いてイン ビトロで、または哺乳動物被験体を用いてインビボで拡大され得る。例えば、プ リスタン初回刺激マウスは、対数期ハイブリドーマ細胞をPBS中で、腹水生成の ために播種され得る。腹水液は、さらなる精製の前に、-70℃で貯蔵され得る。 特に、抗体が予防的または治療的な薬学的調製物(例えば、MenBに対する受動 的保護を提供するための)において、ならびにMenB診断的調製物において使用さ れる場合、キメラ抗体を提供することが所望であり得る。ヒトおよび非ヒトアミ ノ酸配列から構成されるキメラ抗体は、ヒトにおいてそれらの免疫原性を減少す るようにマウスモノクローナル抗体分子から形成され得る(Winterら(1991)Na ture 349:293;Lobuglioら(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86:4220;Shaw ら(1987)J.Immunol.138:4534;およびBrownら(1987)Cancer Res.47:3577 ;Riechmannら(1988)Nature 332:323;Verhoeyenら(1988)Science 239:1534 ;およびJonesら(1986)Nature 321:522;欧州公開第519,596号、1992年12月23 日公開;および英国特許公開第GB2,276,169号、1994年9月21日公開)。 親のモノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示し得る抗体分子フラグメ ント(例えば、F(ab')2、Fv、およびsFv分子)は、公知の技術を使用して生成さ れ得る。Inbarら(1972)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 69:2659;Hochmanら(1976 )Biochem 15:2706;Ehrlichら(1980)Bioche・19:4091;Hustonら(1988)Pro c.Nat.Acad.Sci.USA 85(16):5879;ならびにHustonら、米国特許第5,091,51 3号および第5,132,405号;ならびにLadnerら、第4,946,778号。 あるいは、インビトロでモノクローナル抗体分子集団を拡大するために、ファ ージ表示系が使用され得る。Saikiら(1986)Nature 324:163;Scharfら(1986 )Science 233:1076;米国特許第4,683,195号および第4,683,202号;Yangら(19 95)J Mol Biol 254:392;Barbas,IIIら(1995)Methods:Comp.Meth Enzymol8: 94;Barbas,IIIら(1991)Proc Natl Acad Sci USA 88:7978。 一旦生成すると、ファージ表示ライブラリーは、公知の技術を使用して、Fab 分子の免疫学的結合親和性を改良するために使用され得る。例えば、Figiniら( 1994)J.Mol.Biol.239:68を参照のこと。 ファージ表示ライブラリーから選択されたFab分子の重鎖および軽鎖部分のコ ード配列は、単離または合成され得、そして発現のために任意の適切なベクター またはレプリコンにクローン化され得る。例えば、細菌、酵母、昆虫、両生類、 および哺乳動物系を含む任意の適切な発現系が使用され得る。細菌における発現 系は、Changら(1978)Nature 275:615、Goeddelら(1979)Nature 281:544、Go eddelら(1980)Nucleic Acids Res.8:4057、欧州出願第EP 36,776号、米国特 許第4,551,433号、deBoerら(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25、お よびSiebenlistら(1980)Cell 20:269に記載されるものを含む。 酵母における発現系は、以下に記載されるものを含む: 昆虫における異種遺伝子の発現は、以下に記載されるように達成され得る: 多数のバキュロウイルス株および変異体、ならびに宿主からの対応する許容昆虫 宿主細胞は、以下に記載される: 哺乳動物発現は、以下に記載されるように達成され得る:哺乳動物発現の他の機能は、以下に記載されるように容易に行われ得る: 任意の上記の抗体分子は、抗MenBの治療的または予防的な薬剤を提供するため に、本明細書中で使用され得る。さらに、本発明のマウスモノクローナル抗体由 来の抗原結合部位を含む「ヒト化」抗体分子は、上記の技術を使用して生成され 得る。 上記の本発明の抗MenB抗体は、MenBからの独特のエピトープの分子模倣物を同 定するために、多様な分子ライブラリーをスクリーニングするためのレセプター として簡便に使用される。分子ライブラリーの模倣物を同定するための方法には 、一般に1つ以上の以下の手順の使用が含まれる:(1)固定化標的レセプター でのアフィニティー精製;(2)可溶性レセプターの繋留リガンドへの結合;お よび(3)溶解性化合物を、抗原競合アッセイにおいて直接的に試験する工程、 ま たは生物学的活性について試験する工程。分子模倣物についてスクリーニングさ れた分子には、小さな有機化合物、有機化合物の組合せライブラリー、核酸、核 酸誘導体、糖類またはオリゴ糖、ペプチド、溶解性ペプチド、固相上に繋留され たペプチド、細菌性ファージ表面タンパク質上に提示されるペプチド、細菌性表 面タンパク質または抗体、および/または非ペプチド有機部分を含むペプチドが 含まれるが、これらの限定されない。 例えば、多様な分子種のライブラリーは、組合せ有機合成を用いて作製され得 る。例えば、Gordonら(1994)J.Med.Chem.37:1335を参照のこと。例えば、 オリゴカルバメート(Choら(1993)Science 261:1303);N-置換グリシンポリ マーのようなペプトイド(Simonら(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:936 7);およびビニログのポリペプチド(Hagiharaら(1992)J.Am.Chem.Soc.1 14:6568)が含まれるが、これらに限定されない。 当該分野で公知の種々のアプローチが、合成の間にビルディングブロックが加 えられる際に、ビルディングブロックを探知するために使用され得、その結果個 々のライブラリーメンバーの動作記録が測定され得る。これらのアプローチには 、写真平板チップ上の所在確認可能な部位(オリゴカルバメート)、逆重畳積分 ストラテジー(ここで、「ヒット」は、部分的な合成ライブラリー(ペプトイド 、ペプチド)へのモノマーの再帰性付加を介して同定される)、およびヌクレオ チド(Nielsenら(1993)J.Am.Chem.Soc.115:9812)または他の有機部分( 「タグ」)(Ohlmeyerら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10922)の別 々の合成によりコードされた組合せライブラリーが含まれる。次いで、各ライブ ラリーメンバーと結合したコード化タグは、模倣物が選択された後に解読され得 る。例えば、核酸タグは、DNA配列決定により解読され得る。 ペプトイド組合せライブラリーは、独特なMenBエピトープの分子模倣物を同定 するために特に有用である。ペプトイドは、N-置換グリシンのオリゴマーであ り(Simonら(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:9367)、そして新規の分 子の化学的に多様なライブラリーを作製するために使用され得る。モノマーは、 t-ブチル-ベース側鎖および9-フルオレニルメトキシ-カルボニルα-アミン保 護を組み込み得る。ペプトイドオリゴマーへのモノマーの集合は、例えば、Zuck er mannら(1991)J.Am.Chem.Soc.114:10646の「サブモノマー法」を用いて、 固相上で行われ得る。この方法において、合成は、Rinkアミドポリスチレン樹脂 を用いて行われる(Rinkら(1987)Tetrahedron Lett.28:3787)。樹脂結合ア ミンは、ジイソプロピルカルボジイミドでのブロモ酢酸のインサイチュ活性化に よってブロモアセチル化される。続いて、樹脂結合ブロモアセトアミドはアミン の付加により置換される。アミンは、さらなる反応基のt-ブチルベース保護を 組み込み得る。この2工程サイクルは、所望の数のモノマーが付加されるまで、 繰り返される。次いで、オリゴペプチドは、95%トリフルオロ酢酸/5%水での 処理により樹脂から遊離される。好ましくは、合成は、ロボットの合成機を用い て行われる。例えば、Zuckermannら(1992)Pept.Protein Res.40:498を参照 のこと。代替において、ペプトイドモノマーのオリゴマー化は、ベンゾトリアゾ ール-1-イルオキシトリス(ピロリジノ)ホスホニウムヘキサフルオルホスフェ ートまたはブロモトリス(ピロリジノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェー トのいずれかにより、インサイチュ活性化によって行われ得る。この代替方法に おいて、他の工程は、α-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)アミノ酸を用 いる従来のペプチド合成と同一である(例えば、Simonら(1992)前出、を参照 のこと)。 一旦ペプトイドライブラリーが作製されると、それらは、例えば、本発明のモ ノクローナル抗体を、組み合わせペプトイドの種々のプールとともに、MenB PS 誘導体またはMenB細菌(単独または複合糖質としてのいずれか)でコートしたマ イクロタイタープレートのウェルに添加することによってスクリーニングされ得 る。インキュベーション期間および非結合抗体を除去するための洗浄の後に、結 合抗体の存在は、標準的なELISAアッセイによって決定される。例えば、Harlow およびLane,Antibodies:A Laboratory Manual(1988),Cold Spring Harbor La boratory Cold Spring Harbor,NY,553を参照のこと。結合抗体を含まないウェ ルは、抗体に結合するペプトイド模倣物の存在を示す。プール中のペプトイド模 倣物の特定の詳細な正体は、モノマーユニットを部分的に合成されたライブラリ ーのメンバーに再帰的に添加することによって決定される。Zuckermannら、(19 94)J.Med.Chem.37:2678。 ペプチドライブラリーはまた、本発明の抗MenB抗体を用いて、MenBの独特のエ ピトープの分子模倣物についてスクリーニングするために使用され得る。このよ うなライブラリーは、可溶性である合成ペプチド(Houghten(1985)Proc.Natl .Acad.Sci.USA 82:5131)または固相支持体に結合された合成ペプチド(Geyse nら、(1987)Immunol.Methods 102:259;米国特許第4,708,871号)および融合タ ンパク質として生物学的に発現されるペプチド(scottら、(1990)Science 249 :386)のようなペプチドに基づくが、これらに限定されない。ペプチド組み合わ せライブラリーの総説については、例えば、Gallopら、(1994)J.Med.Chem.37 :1233を参照のこと。 例えば、既知の配列を有するランダム可溶性ペプチドは、個々に標識されたポ リプロピレンバッグ中での反復性のカップリング/脱保護サイクルの間に、固相 支持体および互いに分離されたライブラリーのメンバー上で合成され得る(Houg hten(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5131)。合成の後、ペプチドは、固 相支持体から切断され、そしてポリプロピレンバッグ上の標識によって同定され る。この方法を用いて産生された合成ペプチドライブラリーは、マイクロタイタ ープレートウェルに個々のペプチドを吸着させ、そして標準的なELISAアッセイ を用いて抗体結合を決定することによって、所望の特性を有する抗体への結合に ついてスクリーニングされ得る。 潜在的なペプチド模倣物の大きなライブラリーはまた、Geysenの米国特許第4, 708,871号に記載されるようなオーバーラッピングペプチドの同時合成によって 構築され得る。合成ペプチドは、合成のために使用された支持体に付着している 間にELISAによって抗体との相互作用について試験され得る。固相支持体は、一 般に、キャリア上に重合体鎖を産生するための少なくとも1つの官能基を含有す るビニルモノマーを接ぎ木重合されるポリエチレンまたはポリプロピレンのロッ ドである。この官能基は、反応して一級または二級アミン基を提供する。これは 、次いで固相ペプチド化学の従来法を使用して、適切な順番で連続してアミノ酸 残基と反応して所望の合成ペプチドを構築する。例えば、ペプチド配列は、Geys enら、(1987)J.Immunol.Methods 102:259に記載されるような、マイクロタイ タープレート中で配列されたポリアクリル酸-接ぎ木ポリエチレンのピンにおけ るパ ラレル合成によって作製され得る。このようなライブラリーは、例えば、ペプチ ド-ピンを含むウェルに抗体を添加することによってスクリーニングされ得る。 ウェルからの非結合抗体の洗浄の後、結合抗体の存在は、ELISAアッセイを用い て検出され得る。 本発明の抗体と相互作用するペプチド模倣物はまた、生物学的発現系を用いて 同定され得る。例えば、Christianら、(1992)J.Mol.Biol.227:711;Devlinら 、(1990)Science 249:404;Cwirlaら、(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87: 6378;Gallopら、(1994)J.Med.Chem.37:1233を参照のこと。このような系を 用いて、ランダムペプチド配列の大きなライブラリーは、本発明の抗体に結合す る分子についてスクリーニングされ得る。このアプローチはまた、同定された模 倣物の単純な分子特徴付けを可能にする。なぜなら、このペプチドをコードする DNAが容易に配列決定され得るからである。さらに、希な模倣物は、選択/増幅の いくつかのラウンドによって増幅され得る。 例えば、ファージディスプレイライブラリーは、ランダムペプチド配列をコー ドする合成DNAピースを、糸状バクテリアファージm13、fd、またはf1のpIIIまた はpVIIIタンパク質をコードする遺伝子の5'末端付近に挿入することによって産 生され得る(Parmleyら、(1988)Gene 73:305;Smithら、(1993)Meth.Enzymo l.217:228)。次いで、この遺伝子および無作為化した伸長を含むファージ、フ ァージミド、またはプラスミドDNAは、E.coliまたはヘルパーファージとともに 同時感染したE.coliのような適切な宿主を形質転換するために使用される。この 培養物から単離されたファージは、アミノ末端から伸長する無作為化ペプチド配 列を有するpIII(1〜5コピー)またはpVIII(約4000コピー)表面タンパク質を 保有する。ファージは、例えば、本発明のレセプター抗体をビオチン標識するこ と、ファージをビオチン標識レセプターとともにインキュベートすること、およ びストレプトアビジンコートプレート上でファージを反応させることによるアフ ィニティー精製によって精製され得る。結合ファージは、溶出され、アガー培地 上の適切な宿主を感染させることによって増幅され、そしてアフィニティー精製 のさらなる回に曝される。アフィニティー精製のより後の回からのファージは、 クローン化され、そして増殖され、それらのDNAが配列決定されて発現されるペ プチ ドのアミノ酸配列が決定され、そしてMenB抗体へのそれらの結合が、ELISAまた は当該分野で周知の種々の他のスクリーニング手順によって評価され得る。 ヒトFab抗体の組み合わせライブラリーはまた、ファージ表面タンパク質上に ディスプレイされて、本明細書中での使用に有用な分子模倣物が選択され得る。 このようなライブラリーの調製は本明細書の上記に記載されている。このような 技術の総説については、例えば、Burtonら、(1994)Adv.Immunol.57:191を参 照のこと。 MenBユニークエピトープの分子模倣物はまた、Cullら、(1992)Proc.Natl.Ac ad.Sci.USA 89:1865に記載される方法において本発明の抗MenB抗体を用いて同定 され得る。Cullの技術は、DNA結合タンパク質、LacIを利用して、ペプチドとそ のコードDNA配列との間に連結を形成する。この方法において、無作為化ペプチ ドをコードするDNAは、プラスミド上に存在するLacI遺伝子の3'末端に付加され る。このプラスミドはまた、LacI、lacOのDNA結合部位を含む。LacIは、適切な 宿主(例えば、E.coli)中のプラスミドから発現される場合、lacOに密接に結合 する。従って、細胞が溶解される場合、そのカルボキシル末端で無作為化ペプチ ドをディスプレイするLacIの各々のコピーは、それをコードするDNAと会合する 。これらの「プラスミド上のペプチド」ライブラリーをスクリーニング、増幅、 および配列決定する方法は、上記のようなファージディスプレイに使用される方 法と同じである。 分子模倣物は、抗MenB抗体を用いて、インビトロ細胞非含有系(例えば、Matt heakisら、(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9022に記載される系)において 同定され得る。このアプローチにおいて、新生ペプチドはポリソーム複合体にお いてディスプレイされ、そしてライブラリーの構築、ペプチドの発現、およびス クリーニングは、細胞非含有系で行われる。ポリソーム上にディスプレイされた ペプチドは、例えば、アフィニティー精製/増幅スクリーニング手順を用いてス クリーニングされ得る。ここで、MenB特異的抗体/レセプターは、例えば、プラ スチックプレート上に固定化される。 上記のライブラリーに使用される分子は、より安定なコンフォメーションを形 成し、従って有用な分子模倣物の同定を増強するために操作され得る。例えば、 システイン残基は、無作為化配列中に取り込まれて、ジスルフィドループを形成 し得(O'Nealら、(1992)Proteins 14:509)、そしてタンパク質足場は、内部 ループセグメント中の無作為化ペプチドをディスプレイするために使用され得る (Freimuthら、(1990)J.Biol.Chem.265:896;Sollazzoら、(1990)Prot.Engi n.4:215)。 抗イディオタイプ抗体はまた、MenBの独特のエピトープの分子模倣物としての 使用のために本発明の抗MenB抗体を用いて産生され得る。抗イディオタイプ抗体 の総説については、例えば、Kieber-Emmonsら、(1986)Int.Rev.Immunol.1:1 を参照のこと。この点に関して、抗体の重鎖および軽鎖によって形成されるポケ ットまたは割れ目は、しばしば抗原結合に親密に関与する。この領域は、パラト ープと呼ばれ、抗体によって結合される抗原表面の「内部イメージ」である。パ ラトープに指向する抗体は、いくつかの潜在的な抗イディオタイプ抗体の1つで あり、抗原の模倣物であり得る。重鎖および軽鎖の無作為化ペプチドループは、 抗体多様性の発生の一部として天然に生じる。 本発明の抗MenBモノクローナル抗体は、例えば、Westerinkら、(1988)Infec t.Immun.56:1120に記載される技術を使用して、抗イディオタイプ抗体産生を誘 発するために、そして抗原の「イメージ」保有抗イディオタイプを選択するため に使用され得る。 1つの実施態様において、上記のようなファージディスプレイ抗体の組み合わ せライブラリーは、模倣物抗体(すなわち、ファージディスプレイFab抗イディ オタイプ抗体)を同定するために本発明の抗MenBモノクローナル抗体を使用して スクリーニングされる。 産生される抗イディオタイプ抗体は、標準的な実験室動物モデルにおいて抗Me nB抗体産生を誘発する能力について容易に試験され得る。抗イディオタイプ抗体 の可変性遺伝子は、ペプチドワクチン候補物を同定するために配列決定され得る 。 さらに、オリゴヌクレオチド(DNA、RNA、および修飾ヌクレオチド)の組み合 わせライブラリーは、本発明の非自己反応性、抗MenB抗体に結合する分子模倣物 を探索するためにスクリーニングされ得る。このようなライブラリーの産生およ び使用のための技術は、例えば、Goldら、(1995)Annu.Rev.Biochem.64:763に 総説される。SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrich ment)として知られるシステムが、抗MenB抗体に向かう所望の結合親和性および 特異性を有する特異的配列の非常に大きな数のオリゴヌクレオチドを迅速にスク リーニングするために使用され得る。(Tuerkら、(1990)Science 249:505)。 例えば、固定化された非自己反応性MenBモノクローナル抗体は、組み合わせライ ブラリーから特異的な結合オリゴヌクレオチドをアフィニティー精製するために 使用され得る。結合オリゴヌクレオチドは、競合リガンドを添加することまたは pHを低下することによって固定化抗体から放出される。放出されたオリゴヌクレ オチドは、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて直接増幅されるか、または逆転写酵素 を用いて二本鎖DNAに変換される(Tuerkら、1990、前出)。続いて、所望の模倣 物が得られるまで選択および増幅のさらなる回が行われる。オリゴヌクレオチド 模倣物の配列は、DNA配列決定によって決定される。 一旦、推定分子模倣物が同定されると、それらは、上記のように、自己反応性 を欠失しているか、または最小の自己反応性しか有さない機能的に活性(例えば 、殺菌および/またはオプソニン)な抗体を誘発する能力について試験される。 これらの特性を有する分子模倣物は、さらなる使用(例えば、ワクチン組成物) のために適切である。 抗MenBモノクローナル抗体はまた、異なる特異性の抗体の殺菌および/または オプソニン機能を調査するために、ならびに宿主PSAと交差反応しないMen細菌表 面上の独特のエピトープの分子特性を同定するために使用され得る。さらに、抗 MenB抗体は、MenB細菌またはMenBPS誘導体のフラクションを単離するために使用 され得る。一旦単離されると、抗MenB抗体と反応性である重要なエピトープは、 特徴付けられ、そしてオリゴサッカライドタンパク質結合ワクチンに直接使用さ れるか、またはワクチンにおける使用のためのモデル合成サッカライドもしくは 模倣物に使用され得る。 本発明の機能的に活性な抗MenB抗体を用いて同定された分子模倣物は、診断ア ッセイにおける使用のための抗体試薬を産生するために使用され得る。例えば、 分子模倣物と反応性である抗体は、免疫診断技術(例えば、競合、直接反応、ま たはサンドイッチタイプのアッセイ)を用いて、生物学的サンプル中の細菌抗原 を検出するために使用され得る。このようなアッセイとしては、ウエスタンブロ ット;凝集試験;酵素標識および媒介イムノアッセイ(例えば、ELISA);ビオ チン/アビジンタイプアッセイ;ラジオイムノアッセイ;イムノ電気泳動;免疫 沈降などが挙げられる。 さらに、分子模倣物および抗idモノクローナル抗体を用いて同定された分子模 倣物、ユニーク(例えば、非自己反応性)MenBエピトープは、ワクチン接種した 被験体におけるMenB疾患の防止のためのワクチン組成物において本明細書中で使 用され得る。 ワクチン組成物は、MenBの抗idモノクローナル抗体、分子模倣物、または非自 己免疫エピトープの1つ以上を含み得る。ワクチンはまた、他の抗原および免疫 調節剤(例えば、免疫グロブリン、サイトカイン、リンホカイン、およびケモカ イン:これらは、IL-2、改変IL-2(cys125→ser125)、GM-CSF、IL-12、γ-イン ターフェロン、IP-10、MIPIβ、およびRANTESを含むがこれらに限定されない) と共に投与され得る。 ワクチンは、一般に、1つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル 」(例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなど)を含む。さらに 、補助物質(例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質など)がこのようなビヒ クル中に存在し得る。 アジュバントもまた、ワクチンの有効性を増強するために用いられ得る。アジ ュバントは、ワクチン組成物に直接添加され得るか、または別に(ワクチン投与 と同時または直後のいずれかで)投与され得る。このようなアジュバントとして は、以下が挙げられるが、これらに限定されない:(1)アルミニウム塩(ミョ ウバン)(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウ ムなど);(2)水中油型エマルジョン処方物(他の特定の免疫刺激剤(例えば 、ムラミルペプチド(下述)または細菌細胞壁成分)を有するまたは有さない) :例えば、(a)MF59(国際公開第WO 90/14837号):5%スクワレン、0.5%Tw een 80、および0.5%Span 85を含む(必要に応じて、種々の量のMTP-PE(下述) を含むが、必要とされるわけではない)、微小流動機(microfluidizer)(例えば 、Model 100Y microfluidizer(Microfluidics、Newton、MA)を用いてサブミク ロ ン粒子に処方された、(b)SAF:10%スクワレン、0.4%Tween 80、0.5%プル ロニックブロックポリマーL121、およびthr-MDP(下述)を含む、サブミクロン 粒子に微小流動されるか、またはより大きな粒子サイズエマルジョンを生成する ようにボルテックスされるかのいずれかである、(c)RibiTMアジュバントシス テム(RAS)(Ribi Immunochem、Hamilton、MT):2%スクワレン、0.2%Tween 80、および1つ以上の細菌細胞壁成分(モノホスホリルリピドA(MPL)、トレハ ロースジミコレート(TDM)、および細胞壁骨格(CWS)からなる群より、好まし くは、MPL+CWS(DetoxTM))を含む;(3)サポニンアジュバント(例えば、st imulonTM(Cambridge Bioscience、Worcester、MA)が用いられ得るか、または それから生成された粒子であり得る(例えば、ISCOM(免疫刺激複合体));( 4)フロイント完全アジュバント(FCA)およびフロイント不完全アジュバント (FICA);(5)サイトカイン(例えば、インターロイキン(IL-1、IL-2など) 、マクロフアージコロニー刺激因子(M-CSF)、腫瘍壊死因子(TNF)など;なら びに(6)免疫刺激剤として作用して組成物の有効性を増強し得る他の物質。 ムラミルペプチドとしては、N-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソグル タミン(thr-MDP)、N-アセチル-ノルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン( nor-MDP)、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2 −(1'-2'-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチル アミン(MTP-PE)などが挙げられるが、これらに限定されない。 分子模倣物から形成されたワクチン組成物の有効性を増強するために、模倣物 をキャリア分子に結合体化させることが必要であり得る。このようなキャリア分 子は、それ自身、有害な抗体の産生を誘導しない。適切なキャリアは、代表的に は、大きい、ゆっくりと代謝される巨大分子(例えば、タンパク質、ポリサッカ ライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマ ー、脂質集合体(例えば、油滴またはリポソーム)、不活性ウイルス粒子、CRM1 97 (無毒変異ジフテリア毒素)など)である。このようなキャリアは、当業者に 周知である。模倣物結合体は、MenB細菌細胞の表面に見られるものに密接に類似 するエピトープを発現するそれらの能力について選択される。従って、適切な結 合体は、細菌に対して機能活性を有する抗体の形成を惹起し、かつ本明細書中 に記載の結合アッセイを用いて決定されるように宿主組織においてポリシアル酸 と交差反応しないか、または最小限で交差反応性である。 代表的には、ワクチン組成物は、注射用(液体溶液または懸濁液のいずれか) として調製される;注射前に液体ビヒクルに入れて溶液または懸濁液とするのに 適切な固体形態もまた、調製され得る。調製物はまた、上述のように、アジュバ ント効果の増強のために、リポソーム中に乳化またはカプセル化され得るか、あ るいは粒子に吸着され得る。 ワクチンは、抗idモノクローナル抗体;タンパク質の分子模倣物、ペプチド分 子模倣物、もしくは複合体;またはそれらをコードするヌクレオチド配列を有効 量で、および必要に応じて他の上述の成分を含む。「有効量」とは、投与される 個体において免疫応答を誘導し、かつ個体において自己免疫応答を刺激する危険 性を最小限にとどめる分子の量を意味する。一般に、このような応答は、被験体 において、ワクチンに対して分泌性、細胞性、および/または抗体媒介性免疫応 答の発達を生じる。通常、このような応答は、以下の効果の1つ以上を含むがこ れらに限定されない:免疫クラス(例えば、免疫グロブリンA、D、E、Gまた はM)のいずれかからの抗体の産生;Bリンパ球およびTリンパ球の増殖;免疫 細胞への活性化、成長、および分化シグナルの供給;ヘルパーT細胞、サプレッ サーT細胞、ならびに/または細胞傷害性T細胞および/もしくはγδT細胞集 団の拡大。 一旦処方されると、ワクチンは、非経口(例えば、注射により、皮下、または 筋内のいずれか)に従来通りに投与される。他の投与様式に適切なさらなる処方 物としては、経口処方物および肺処方物、坐剤、および経皮適用剤が挙げられる 。投与処置は、単回用量スケジュールまたは多回用量スケジュールであり得る。 MenB PSのDNAまたはRNA模倣物をコードするポリヌクレオチドもまた、核酸免 疫化のためのワクチンにおいて用いられ得る。代替的に、ペプチド模倣物をコー ドするポリヌクレオチドは、核酸免疫化において用いられ得る。一般に、このよ うな方法は、核酸分子またはタンパク質のインビボ発現のために、1つ以上の所 望の分子をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞への導入を含む。ポリヌクレ オチドは、レシピエント被験体に直接導入され得る(例えば、注射、吸入など) か、または宿主から取り出された細胞にエキソビボで導入され得る。後者の場合 、形質転換細胞は、ポリヌクレオチドによりコードされた分子に対して免疫応答 が高められ得る被験体に再導入される。核酸免疫化の方法は当該分野で公知であ り、例えば、国際公開第WO 93/14778号(1993年8月5日公開);国際公開第WO 90/11092号(1990年10月4日公開);Wangら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(19 93)90:4156;Tangら、Nature(1992)356:152;およびUlmerら、Science(1993 )259:1745に開示されている。一般に、ポリヌクレオチドは、リポソーム中にカ プセル化されたベクターとして投与され、そして上述のようなワクチン組成物に 処方される。 本発明の抗MenBモノクローナル抗体、およびそれらの機能的等価物は、哺乳動 物においてMenBおよびE.coli K1疾患を処置および/または予防するために薬学 的組成物中で用いられ得る。このような疾患としては、幼児、小児、および成人 における細菌性髄膜炎および敗血症が挙げられる。この点について、非常に活性 な抗MenBモノクローナル抗体調製物を、感染の危険性のある被験体または最近因 子に曝露された個体に投与することにより、個体に即時的な受動免疫が提供され る。このような受動免疫化は、正常被験体および免疫無防備状態被験体の両方に おいて好結果であると期待される。さらに、このようなモノクローナル抗体組成 物の投与は、単独または既知の抗MenB治療薬と組み合わせて、哺乳動物被験体に おいてMenBに対する抗体価を提供するために用いられ得る。 一般に、本発明の薬学的組成物は、上記の抗MenBモノクローナル抗体(Fab分 子、Fvフラグメント、sFv分子、およびそれらの組み合わせを含む)の1つ以上 の混合物を含む。組成物は、MenB疾患を予防するか、またはMenB感染後の個体を 処置するために用いられ得る。 薬学的組成物の治療用途は、感染個体からのMenB感染因子の減少および/また は除去、ならびに循環MenB因子および疾患の蔓延可能性の減少および/または除 去を包含する。 本発明のワクチン組成物に関して上述したように、薬学的組成物は、補助的な 免疫調節剤(例えば、IL-2、改変IL-2(cys125→ser125)、GM-CSF、IL-12、γ- インターフェロン、IP−10、MIP1β、およびRANTES)と共に投与され得る。 1つ以上の抗体、抗体フラグメント、sFv分子またはそれらの組み合わせを活 性成分として含む薬学的組成物の調製は、一般に当業者に公知である。一旦処方 されると、組成物は、非経口(例えば、注射により、皮下、静脈内、または筋内 のいずれか)に従来通りに投与される。他の投与様式に適切なさらなる処方物と しては、経口処方物および肺処方物、坐剤、および経皮適用剤が挙げられる。 薬学的組成物は、投与処方と適合するように、かつ予防的および/または治療 的に有効である量で、処置されるべき被験体に投与される。送達される組成物の 量は、一般に、一投与当たり約50〜約10,000μgの活性剤の範囲内にあり、処置 されるべき被験体、それ自身の免疫応答を高める被験体の免疫系の能力、および 所望される保護の程度に依存する。必要な正確な量は、とりわけ処置されるべき 個体の年齢および一般状態、処置される状態の重度、ならびに投与様式に依存し て変動する。適当な有効量は、当業者により容易に決定され得る。従って、薬学 的組成物の「有効量」は、MenB疾患症状の処置または予防をもたらすのに充分で あり、そして日常的な試行により決定され得る比較的広範な範囲にある。 さらに、薬学的組成物は、単回用量スケジュールで投与され得るか、あるいは 好ましくは多回用量スケジュールで投与され得る。多回用量スケジュールは、主 要な投与経過が1〜10の個別用量、続いて、組成物の作用を維持または強化する のに必要とされる続く時間間隔で与える他の用量を伴うものである。従って、投 与レジメはまた、少なくとも部分的には、処置される被験体の特定の必要性に基 づいて決定され、当業者の判断に依存する。 III .実験 以下に、本発明を実施するための特定の実施態様の例を挙げる。本実施例は、 例示の目的にのみ提供され、本発明の範囲をいかなるようにも限定することを意 図しない。 用いた数字(例えば、量、温度など)に関して正確に記載するよう試みたが、 幾分かの実験誤差および偏差はもちろん許容されるべきである。 実施例1 「サイズ化」複合糖質の調製 例示のNPr-MenBオリゴサッカライド破傷風トキソイド複合ワクチン(本明細書 中、以後CONJ-2と称する)を以下のように調製した。MenBBポリサッカライドの N-アセチル基を、ポリサッカライドをNaBH4の存在下で2M NaOH中で6時間、11 0℃に加熱することにより除去した。脱アセチル化ポリサッカライドを飽和炭酸 水素ナトリウム緩衝液中で十分に透析し、次いで過剰のプロピオン酸無水物と共 に、室温で12時間、撹拌した。溶液を水中で十分に透析し、N-プロピオニル化髄 膜炎菌B(NPr-MenB PS)ポリサッカライドを凍結乾燥により回収した。 複合ワクチンの調製のために、NPr-MenBポリサッカライドを、10mM酢酸ナトリ ウム中でpH5.5で50℃で2時間、部分的に加水分解した。得られたオリゴサッカ ライド混合物をQ-セファロース上で分画した。2〜6の平均重合度(Dp)を有す るオリゴサッカライドを100mM NaClを用いてまず溶出し、廃棄した。中間サイズ のオリゴサッカライドを500mM NaClを用いて溶出した。続いて、Mono Qカラムを 用いる分析イオン交換クロマトグラフィーにより、中間サイズのオリゴサッカラ イドがDp 13〜20の大きさの範囲であることを決定した(平均=Dp 13)。 末端アルデヒド基を、暗所において室温で15〜30分間、これらを100mM過ヨウ 素酸ナトリウムと反応させることにより、中間サイズのオリゴサッカライドの非 還元末端で生成した。過剰のエチレングリコールを用いて酸化反応を停止させ、 そして生成物をSephadex G-25カラム上で脱塩した。オリゴサッカライド−タン パク質結合体を、40mg/mlのシアノホウ素化水素ナトリウムを有する0.75Mリン 酸カリウム緩衝液(pH9.0)中で末端アルデヒド含有NPr-MenBオリゴサッカライ ドの破傷風トキソイドとの混合物(それぞれモル比200:1)を、40℃で1日およ び室温で2日撹拌することにより調製した。得られたNPr-MenBオリゴサッカライ ド−破傷風トキソイド結合体(CONJ-2)を、溶出緩衝液として50mMリン酸ナトリ ウム(pH7.0)、150mM塩化ナトリウムを用いてSephadex G-100におけるゲル濾過 クロマトグラフィーにより最終的に精製した。複合ワクチンのシアル酸組成およ びタンパク質組成をそれぞれ、Svennerholmレゾルシノール反応(Svennerholm, L.(1957)Biochim.Biophys.Acta.24:604)およびLowryアッセイにより測定 した。重量基準で、CONJ-2結合体の最終的な糖対タンパク質比は、0.10 〜0.25の範囲であった。 実施例2 複合糖質の特徴付け CONJ-2複合糖質を以下のように特徴付けた。共有原子価(例えば、NPr-MenB O Sとタンパク質キャリアとの間の共有結合を確立する)を示すために、以下を含 む多くの物理化学的技術を使用し得る:SDS-PAGE;ウェスタンブロット;Sephad ex G-100ゲル濾過;など。本研究の目的のために、SDS-PAGEを使用して、キャ リアタンパク質バンド自体と比較した場合、複合体バンドについてより高い分子 量へのシフトを示すことによって、NPR-MenB OS/TT CONJ-2複合糖質の共有結合 を確立した。CONJ-2複合糖質のウェスタンブロット分析は、TTおよびNPr-MenB P Sについてのポジティブ免疫反応性シグナルの、特異的な抗TTおよび抗NPr-MenB PS抗血清との一致によって共有原子価を示した。 立体因子に基づいて、CONJ-2複合糖質の調製における大きな分子量のポリサッ カライドの代わりのオリゴサッカライドの使用は、タンパク質キャリア分子上ヘ のサッカライド抗原のより高いカップリング効率を可能にする。これらのNPr-Me nBオリゴサッカライドに基づく複合体の最終的なサッカライド対タンパク質比は 、タンパク質キャリア当たり共有結合する約3〜5のNPr-MenBオリゴサッカライ ド鎖に対応する約0.10〜0.25に及ぶ。毎重量に基づいて、CONJ-2複合糖質は、以 前に報告されたNPr-MenBポリサッカライドに基づく複合体(米国特許第4,727,13 6号)(ここで、CONJ-2は平均して約7.5〜18.8倍多いサッカライドを含む)より 高いサッカライドローディングを有するようである(NPr-MenB PSの分子量とし て10,000ダルトンを用いる)。 さらに、十分に規定された中間体の鎖長(例えば、平均10〜20 Dp)の実質的 に均一なサイズのサッカライド部分を有するCONJ-2複合糖質を構築することは、 より一貫した免疫学的挙動を呈する複合糖質を生じることが予期される。さらに 、Q-Sepharoseクロマトグラフィー精製NPr-MenBオリゴサッカライドの選択的末 端活性化(例えば、非還元性末端でのアルデヒド基の選択的導入)は、両方の末 端で誘導される「活性な」アルデヒド基を有するNPr-MenB PS分子の使用から生 じ 得る架橋不均一構造の可能性を回避する。この点において、両末端活性化PS(両 方の末端にアルデヒド基を有する)を、N-脱アセチル化手順の間に、予めNaBH4 に曝露されたN-アセチル化MenB PSの過ヨウ素酸酸化から誘導し得る。 実施例3 モノクローナル抗体の調製 4〜6週齢の雌CDIマウスを、NPr-MenB OS/TT(CONJ-2)複合糖質抗原および( 最後の追加免疫注射を除いて)FCAを含む組成物を用いて、腹腔内注射によって ワクチン接種した。ワクチン接種を、1ヶ月間隔で総量2または3投薬量で投与 した(追加免疫を含む)。融合の3日前、初回刺激した動物を、アジュバントの 非存在下でNPr-MenB OS/TT(CONJ-2)複合糖質抗原で追加免疫した。各用量の最終 容量は0.1mlであり、これは2.5μgのシアル酸を含んだ。追加免疫注射後、動物 を脾臓摘出し、そして脾臓細胞をミエローマ細胞との融合用に調製した。 融合の約1週間前、非分泌マウスP3X63-Ag8.653ミエローマ細胞(ATCC受託番 号第ATCC-1580-CRL号から入手可能)を、25mMのHEPES緩衝液およびL-グルタミン を有する完全なRPMI-1640培地(GIBCO BRL 041-02400)で拡大した。細胞培養物 を、細胞増殖、細胞数をモニターするため、およびコンタミネーションをスクリ ーニングするために定期的に評価した。 融合の1日目、脾臓細胞、およびパートナーのP3X63-Ag8.653ミエローマ細胞 (Ag8細胞)を洗浄し、収集し、そして5:1(脾臓細胞:ミエローマ細胞)の 比で混合した。細胞融合を、50%ポリエチレングリコール(PEG)の存在下で37℃ にて実施した。生じた細胞ペレットを収集し、そして96ウェル平底細胞培養プレ ート(COSTAR 3596)中に置き、そして適切な条件下で(例えば、5%CO2中37℃に て)インキュベートした。インキュベーションの1日後、ヒポキサンチン、アミ ノプテリン、およびチミジン(HAT)を含む選択培地を、各ウェルに添加した。 増殖している細胞を含み、そして約10〜25%のコンフルエンスを示すウェルか らのハイブリドーマを、HAT選択培地中でのインキュベーションの約2週間後に スクリーニングのために選択した。選択したハイブリドーマ上清を、固相アビジ ン-ビオチン化NPr-MenB PSに基づくELISAアッセイを用いてスクリーニングした 。 上清における抗体結合の特異性を、インヒビターとして可溶性NPr-MenB PSを用 いて決定した。ネガティブコントロールは、RPMI培地、Ag8ミエローマ上清、お よび非関連モノクローナル抗体調製物を含んだ。NPr-MenB OS/TT(CONJ-2)複合糖 質で免疫したマウス由来のプールしたポリクローナル血清を、ポジティブコント ロールとして使用した。上清との一晩のインキュベーション後、反応ウェルを洗 浄し、そして結合した免疫グロブリンを、アルカリホスファターゼ標識多価抗マ ウス免疫グロブリン(IgG、IgA、IgM)を用いて検出した。 候補ハイブリドーマを、上記のELISAアッセイにおけるNPr-MenB PSについての それらの示された結合親和性に基づいて同定した。高度に反応性の抗体分子を分 泌するハイブリドーマを、限定濾過によってクローニングした。詳細には、候補 ハイブリドーマ細胞株を、20μlのクローニング/拡大培地(IL6を有するComple te RPMI-1640)中に、Terasakiプレート(NUNC)中0.3、1.0、および3.0細胞/ウェ ルでプレートした。2週間後、培養物を増殖について視覚的に検査した。頻度分 析を、Lefkovitsら(1984)Immun.Today 5(9):265によって記載される最小二 乗法を用いて実施した。マスターウェル中の反応性上清を同定するために使用さ れるELISAアッセイを繰り返し、7および14日目の抗体活性を評価した。次いで 、選択したクローンを、組織培養および腹水生成におけるその後の使用のために 拡大および凍結した。このようにして、39のハイブリドーマのパネルを生成し、 そしてそれから得た分泌したモノクローナル抗体分子(「SEAMモノクローナル抗 体」、詳細にはモノクローナル抗体SEAM-1〜SEAM-24、SEAM-26、SEAM-28〜SEAM- 31、SEAM-33〜SEAM-36、SEAM-38〜SEAM-42、およびSEAM-48と命名した)を、さ らなる評価のために調製した。 より詳細には、選択したモノクローナル抗体を、組織培養においてか、または 腹水液においてのいずれかで、Pristaneで初回刺激した7〜8週齢の雄Balb/cマ ウスを用いて生成した。各動物被験体を、ハイブリドーマ細胞での接種の1週間 前に、0.5mlのPristaneでの腹腔内注射によって初回刺激した。接種前、ハイブ リドーマ細胞濃度を、滅菌したPBSを用いて、2.5×106〜3×106細胞/mlに調整 した。初回刺激した動物を、1mlのハイブリドーマ細胞で腹腔内に注射した。こ こで、各クローン細胞株を3匹の異なるマウス中に接種した。接種の1〜2週間 後、腹水液の回収を開始し、約1週間継続した。回収した液体を、2700rpm(1500 ×g)にて室温で10分間遠心分離した。上清を収集し、そしてペレットを廃棄した 。単離した腹水液を、回収の過程にわたって4℃にて貯蔵し、そして異なる日に 回収した液体をプールし、一定分量に分け、そして-70℃にて凍結した。 実施例4 モノクローナル抗体の特徴付け 未精製のモノクローナル抗体の濃度を、ELISA捕捉アッセイおよび放射状免疫 拡散アッセイを用いて決定した。詳細には、捕捉ELISA手順を用いて、各抗NPr-M enB PSモノクローナル抗体の濃度を決定した。10mM PBS(pH7.4)において1μg/ mlに希釈した100μL/ウェルのアフィニティー精製ウサギ抗マウスIgG、IgM、お よびIgA(HおよびL、Zymed)を含むマイクロタイタープレート(Immulon 2、Dyn atech Laboratories,Inc.から入手可能)を、4℃で一晩インキュベートした。 ウェルを、PBSで3回洗浄後、250μLのブロッキング緩衝液(1%ウシ血清アル ブミン(BSA)および0.1%アジ化ナトリウムを含むPBS、pH7.4)で満たし、そして 室温にて30〜60分間インキュベートし、非特異的結合部位をブロックした。プレ ートを、洗浄緩衝液(0.1% Tween 20および0.1%アジ化ナトリウムを含むPBS、p H7.4)で3回洗浄した。試験するべき抗体を、希釈緩衝液(1% BSA、0.1% Twee n 20、および0.1%アジ化ナトリウムを含むPBS、pH7.4)に希釈し、次いで各ウェ ル当たり100μlで添加した。プレートを覆い、そして4℃で一晩インキュベー トした。マウスIgG1、IgG2b、IgG3、およびIgM免疫グロブリン標準(Southern B iotechnology Associatesから入手可能)を、500ng/ml〜4ng/mlに及ぶ濃度で使 用し、抗体濃度を定量するための標準曲線を構築した。 一晩のインキュベーション後、ウェルを冷洗浄緩衝液で5回洗浄し、そして希 釈緩衝液において1:2000希釈した100μl/ウェルのアルカリホスファターゼ結 合抗マウスIgG、IgM、およびIgAポリクローナル抗体(HおよびL、Zymed)ととも に、4℃で3時間インキュベートした。次いで、プレートを冷洗浄緩衝液で洗浄 し、そして基質緩衝液(1.0Mジエタノールアミン、0.5mM MgCl2、pH9.8)で1mg/m lに希釈した100μlの新しく調製した基質(p-ニトロフェニルリン酸、Sigm a)を各ウェルに添加した。約30分後に405nmでの吸光度値を測定した。モノクロ ーナル抗体調製物の免疫グロブリン濃度を、標準曲線から算出した。 放射状免疫拡散アッセイを以下のように実施した。放射状免疫拡散プレートお よび試薬を、The Binding Site Limited(Birmingham,England)から入手した。 次いで、アッセイプロトコルは、RIDキットとともに供給された製造業者の明確 な説明書に基づいた。簡単には、キットに供給されたキャリブレーター抗体を、 適切な量の蒸留水を用いて再構成した。1:2および1:10希釈のキャリブレー ター抗体を調製した。必要ならば、試験サンプルを1% BSAに希釈し得る。キャ リブレーター抗体(適切な、1:2および1:10希釈)について10μlのアリコ ート(IgAおよびIgG2aサブクラス抗体について20μl)および試験サンプルを、 プレート上の分離したウェルに適用し、そして室温にて120時間インキュベート した。抗体の濃度を、沈殿物の環の直径を測定し、そしてこれらの値をRIDキッ トに含まれる参考の表と比較することによって決定した。 次いで、組織培養物または腹水液由来のモノクローナル抗体を、以下のように 部分的に精製した。モノクローナルを含む組織培養上清または腹水(200mlまた は指示された容量)を、溶液を穏やかに撹拌しながら、等量の冷100%飽和硫酸 アンモニウム(SIGMA,Saint Louls,MO)にゆっくりと添加した。モノクローナル 抗体および硫酸アンモニウム混合物を、4℃で一晩インキュベートした。翌朝に 、混合物を、均質化のために穏やかに撹拌し、そしてSorvall SS34ローターにお いて5000rpmで、4℃にて30分間遠心分離した。上清をデカントした後、等容量 の50%硫酸アンモニウム溶液(すなわち、100%飽和硫酸アンモニウムと同じ容 量)を使用して、ペレットを洗浄し、そして再懸濁した。得られた混合物を、So rvall SS34ローターにおいて5000rpmで、4℃にて30分間遠心分離した。次いで 、上清をデカントし、そして排出した。 腹水について、ペレットをPBS緩衝液(50mMのリン酸ナトリウム、150mMの塩化 ナトリウム、pH7.4)において、0.3〜0.5容量の開始容量に再構成した。組織培養 上清について、ペレットを、PBS緩衝液の0.1容量の開始容量に再構成した。再構 成したモノクローナル抗体および硫酸アンモニウム混合物を透析チューブ(分子 量カットオフ10,000〜12,000)に入れ、そして4LのPBS中で一晩透析させ た。PBS溶液を、後の2日間にわたって3〜4回交換した。透析チューブからの モノクローナル抗体分子をシリンジ中に移し、そして0.2μmメンブレンフィル ターを通して濾過滅菌し、次いで-20℃にて貯蔵した。 次いで、部分精製したモノクローナル抗体調製物を(a)免疫グロブリンアイソ タイプ、(b)NPr-MenB PSへの濃度依存性結合、(c)種々のNPr-MenBオリゴマーの 、NPr-MenB PSへの結合を阻害する能力、(d)天然のMenB PSとの交差反応性、(e) MenBの病原性株との交差反応性、(f)補体媒介性殺菌活性、(g)オプソニン活性、 および(h)細胞表面にて長鎖α2-8連結ポリシアル酸を発現する神経芽細胞腫細胞 株への結合によって示されるような自己反応性について特徴付けした。これらの 実験において、モノクローナル抗体の濃度を、捕捉ELISAおよび上記のRIDアッセ イによって測定した。 (a) 抗体のアイソタイプ分類: モノクローナル抗体(重鎖および軽鎖)のアイソタイプを、二次アルカリホス ファターゼ結合抗体がIgGサブクラス、IgM、IgA、ならびにκ軽鎖およびλ軽鎖 に特異的であるという唯一の差異を有する、上記の抗NPr-MenB PS ELISAについ てのプロトコルを用いて、ELISAによって決定した。また、キットを使用して、 抗体分子をアイソタイプ分類した。キットは、異なる型の免疫グロブリンペプチ ド鎖について特異的なヤギ抗体でコートした分類固着基質からなった。キットは 、基質に対するヤギ抗体に結合するマウスモノクローナル抗体を検出するための 、抗マウス免疫グロブリンに特異的なペルオキシダーゼ標識種を提供する。 以下で表1に記載するように、39のモノクローナル抗体中のアイソタイプの分 布が、1つのIgM、および38のIgG(8つのIgG1、5つのIgG2a、16のIgG2b、およ び9つのIgG3)からなることを見出した。さらに、すべての抗体分子は、κ軽鎖 を有した。 (b)NPr-MenB PS への濃度依存的結合: 固相ELISA手順を用いて、緩衝液のみまたは25μg/mlの可溶性NPr-MenB PSイ ンヒビターの存在下での抗体分子のNPr-MenB PSへの濃度依存的結合を評価した 。ビオチン化NPr-MenB PS-ADHを、Suttonら(1985)J.Immunol.Methods 82:215の 方法を用いて調製した。10mM PBS(pH7.4)中の100μl/ウェルのアビジン(4μg/ mlExtr Avidin,Sigma)を含むマイクロタイタープレート(Immulon 2,Dynatech Laboratorles,Inc.より入手可能)を、4℃で一晩インキュベートした。PBSでの 3回の洗浄後、PBS中の100μlのビオチン化NPr-MenB PSを各ウェルに添加し、 そして37℃で2時間インキュベートした。プレートをPBSで3回洗浄し、そして ウェルを250μlのブロッキング緩衝液で満たし、そして室温で30〜60分間イン キュベートして非特異的結合部位をブロックした。 ブロッキング後、プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。モノクローナルの種 々の希釈の50μlアリコートを、50μlの希釈緩衝液、または1mlあたり50μg の可溶性NPr-MenB PSを含む(25μg/mlの最終インヒビター濃度として)50μl の希釈緩衝液のいずれかで含む複製プレートのウェルヘ添加した。次いで、プレ ートを覆い、そして4℃で一晩インキュベートした。翌日、ウェルを冷洗浄緩衝 液で5回洗浄し、次いで希釈緩衝液において1:2000に希釈された100μl/ウェル のアルカリホスファターゼ結合抗マウスIgG、IgM、およびIgAポリクローナル抗 体(Zymed)を用いて4℃で3時間インキュベートした。次いで、プレートを冷洗 浄緩衝液で洗浄し、そして基質緩衝液において1mg/mlに希釈された100μlの新 しく調製した基質(p-ニトロフェニルリン酸,Sigma)を各ウェルヘ添加した。405 nmでの吸光値を約30分後に測定した。 図1A〜1Dは、ELISAによって決定された固相NPr-MenB PSに対する4つの代表的 抗NPr-MenB PSモノクローナル抗体(それぞれ、SEAM-3、SEAM-5、SEAM−16、お よびSEAM-18)の用量反応結合活性を示す。データは緩衝液において(●)、また は25μg/mlの可溶性NPr-MenB PSを含む緩衝液において(○)希釈された抗体につ いて示す。データ中でX軸に対する異なる範囲を使用する(ここで、モノクロー ナル抗体SEAM-3、SEAM−16、およびSEAM−18は、0.0001〜1μg/mlで示し、およ びモノクローナル抗体SEAM-5は0.1〜100μg/mlで示す)。基質とのインキュベ ーション 後に0.5のODをもたらすに十分な抗体の濃度は、(SEAM-5の結合をSEAM−18の結 合と比較して)かなり変化した。 表1は、39のSEAMモノクローナル抗体の各々に対してELISAにおいて0.5のODを もたらすに必要な抗体のそれぞれの濃度範囲を要約する。示される値における大 きな不均一性に対する最も可能性の高い説明は、NPr-MenB PSへの抗体の結合活 性の相違である。 (c) オリゴマーによるNPr-MenB PSへの抗体結合の阻害: 競合固相ELISA手順を用いて、固相NPr-MenB PSに対するモノクローナル抗体分 子の結合を阻害するためのNPr-MenBオリゴマーインヒビターの能力を評価した。 アッセイを、モノクローナル抗体を、0.5〜1のODをもたらす濃度まで予め希釈し たことを除いては、抗NPr-MenB PS ELISAについて上記のように実施した。モノ クローナル抗体を、複製プレートのウェル(各々は、25μg/mlの最終インヒビ ター濃度をもたらす以下の可溶性インヒビターの1つを含む:高分子量(HMW)NP r-MenB PS;または低分子量(LMW)NPr-MenB OS(3.8の平均Dpを有する))へ添加 した。 プレートを覆い、そして4℃で一晩インキュベートした。翌日、ウェルを冷洗 浄緩衝液で5回洗浄し、次いで希釈緩衝液において1:2000に希釈された100μl/ ウェルのアルカリホスファターゼ結合抗マウスIgG、IgM、およびIgAポリクロー ナル抗体(Zymed)を用いて4℃で3時間インキュベートした。次いで、プレート を冷洗浄緩衝液で洗浄し、そして基質緩衝液において1mg/mlに希釈された100μ lの新しく調製した基質(p-ニトロフェニルリン酸,Sigma)を各ウェルヘ添加し た。405nmでの吸光値を約30分後に測定した。阻害パーセントを、インヒビター の非存在下での結合と比較して計算した。 図2は、4つの代表的な抗NPr-MenB PSモノクローナル抗体(SEAM-2、SEAM-3、 SEAM-16、およびSEAM-18)の、25μg/mlの可溶性高分子量(HMW)NPr-MenB PSイン ヒビター(■)、または25μg/mlの低分子量(LMW)NPr-MenBオリゴサッカライド (3.8の平均Dp)インヒビター(□)のいずれかによる固相NPr-MenB PSへの結合の 阻害を示す。 HMW NPr-MenB PSインヒビターは、試験された全てのモノクローナル抗体にお いて、約75%〜95%の阻害を与えた。モノクローナル抗体における詳細な抗原特 異性の差異は、試験されたLMWインヒビターとのそれぞれの阻害パターンの差異 から明白である。例えば、NPr-MenB PSへのSEAM-3およびSEAM-8の結合は、NPr-M enB PSの可溶性LMWインヒビターによって完全に阻害される。対照的に、SEAM-2 およびSEAM-16は、オリゴマーによって顕著に阻害されない(20%未満)。全て のモノクローナル抗体についてのLMW NPr-MenB OS阻害の結果を表1に示す。さ らに、以下に記載のように、モノクローナルの詳細な抗原特異性における他の差 異は、ELISAにおけるNAc-MenB PSへの交差反応性において観察された差異、およ び宿主のポリシアル酸への結合における差異によって明白である。 (d)NAc-MenB PS との交差反応性: モノクローナル抗体を、固相ELISA形式において、NAc-MenB PSの直接的結合に よって示されたように、NAc-MenBポリサッカライドへとの交差反応するそれらの 能力について評価した。使用された方法は、固相抗原としてビオチン化NPr-MenB PSの代わりに、NAc-MenB PS-ADHを使用したこと以外は、NPr-MenB PS ELISAに ついての上記の方法と類似した。 モノクローナルの種々の希釈の50μlアリコートを、50μlの希釈緩衝液、ま たは1mlあたり50μgの可溶性NAc-MenB PSを含む(25μg/mlの最終インヒビタ ー濃度として)50μlの希釈緩衝液のいずれかを含む複製プレートのウェルヘ添 加した。次いで、プレートを覆い、そして4℃で一晩インキュベートした。翌日 、ウェルを冷洗浄緩衝液で5回洗浄し、次いで希釈緩衝液において1:2000に希釈 された100μl/ウェルのアルカリホスファターゼ結合抗マウスIgG、IgM、および IgAポリクローナル抗体(Zymed)を用いて、4℃で3時間インキュベートした。次 いで、プレートを冷洗浄緩衝液で洗浄し、そして基質緩衝液において1mg/mlに希 釈された100μlの新しく調製した基質(p-ニトロフェニルリン酸,Sigma)を、各 ウェルヘ添加した。405nmでの吸光値を、約30分後に測定した。 図3は、5つの代表的な抗NPr-MenB PSモノクローナル抗体(SEAM-12、SEAM-1 6、SEAM-18、SEAM-2、およびSEAM-3)の、固相NAc-MenB PSへの結合を示す。見 られ得るように、3つの抗体(SEAM-12、SEAM-16、およびSEAM-18)は、0.5μg /mlおよび/または5μg/mlの抗体で試験された場合、顕著な結合を示した。以 前にスクリーニングアッセイにおいてネガティブであることが示された2つの他 の抗体(SEAM-2およびSEAM-3)は、5倍高い濃度(25μg/mlの抗体)で試験され た場合、ネガティブであることが確認された。39のモノクローナル抗体のそれぞ れのNAc-MenB PSとの交差反応性を、高い交差反応性(+++)から交差反応性でない (0)範囲にわたって得点づけした。結果を表1に示す。見られ得るように、16の モノクローナル抗体が、NAc-MenB PSと交差反応し、そして4つが最小で交差反 応した(±)(図1)。これらの20のポジティブまたは弱いポジティブなモノクロ ーナル調製物の交差反応性の特異性を、可溶性NAc-MenB PSを用いた結合の阻害 によって確認した。26の非交差反応性モノクローナル抗体は、25μg/mlまでの 抗体濃度で試験した場合、固相NAc-MenB PSへの顕著な結合は示さなかった。 (e) 細菌結合アッセイ 抗N-Pr髄膜炎菌Bポリサッカライド抗体の、病原性細胞株N.meningitidis族B の表面上へ結合する能力を、間接的免疫蛍光アッセイのフローサイトメトリー検 出を用いて決定した。2つの完全に莢膜化された髄膜炎菌B試験生物(8047株( 殺菌活性の測定のために使用した株)およびNmB株)を使用した。NmBのトランス ポゾン含有変異体である第3の非莢膜化株、M7(Stephensら(1991)Infect.& Immu n.59:4097-4102)を、莢膜ポリサッカライドへの抗体結合の特異性についてのネ ガティブコントロールとして使用した。Mueller-Hinton培地および0.25%グルコ ース中において対数増殖中期へ増殖された細菌細胞を回収し、そして1mlあたり 約108細胞の密度でブロッキング緩衝液において再懸濁した。次いで、モノクロ ーナル抗体(10または100μg/mlの濃度)を添加し、そして氷上で2時間細胞へ 結合させた。ブロッキング緩衝液での2回の洗浄後、細胞を、FITC結合F(ab')2 フラグメントヤギ抗マウスIgG(H+L)(Jackson Immune Research,West Grove,PA) とインキュベートし、PBS緩衝液中の0.25%ホルムアルデヒドで固定し、そして フローサイトメトリーによって分析した。 ポジティブコントロール抗体は、髄膜炎菌特異的血清型決定およびサブタイプ 決定モノクローナル抗体(MN2C3B、MNl6Cl3F4、RIVM、Bllthoven、the Netherlan ds)を含んだ。ネガティブコントロールは、関連しない特異性を有するマウスIgG モノクローナル抗体からなった。 図4A〜4Gは、代表的な実験からの結果を示す。モノクローナル抗体SEAM-3およ びSEAM-18は、この間接的蛍光フローサイトメトリーアッセイにおいて、莢膜化 された両方の試験株に対する強い莢膜特異的結合を示す(それぞれ、図4Cおよび 4D)。対照的に、モノクローナル抗体SEAM-9およびSEAM-10は、このアッセイに おいてネガティブであった(図4Eおよび4F)。表1に要約されるように、24の抗 N-Pr髄膜炎菌Bポリサッカライド抗体は、100μg/mlで試験した場合、細菌結合 の証拠を示した。2つのさらなる抗体は、莢膜化株および非莢膜化変異株の両方 に最小の結合の証拠を示した。これらの抗体の細菌結合を、不定(i)として得点 づけした。例えば、図4Gに示されるSEAM-7の結合を参照のこと。 (f)補体媒介性殺菌活性: 殺菌アッセイを、Mandrellら(1995)J.Infec.Dis.172:1279に記載される 方法を使用して、以下の改変を用いて行った:生物を0.25%グルコース;および バルビトール緩衝液の代わりにGey緩衝液からなる血清希釈緩衝液を含有するMue ller-Hinton培地で増殖させた。いくつかの実験では、補体の異なる供給源を使 用した:これらは2つの異なるウサギの乳仔の血清プール(Rab C IおよびRab C IIと呼ばれる)ならびにヒト無ガンマグロブリン血症血清(Hu Cと呼ばれる) を含んだ。 異なる濃度の抗体および20%の補体と共にインキュベートした場合のN.menin giditis 8047株のパーセント生存率を、4つの代表的なモノクローナル抗体に ついて示す(図5A〜5D)。示した各抗体を、以下の3つの異なる補体供給源を用 いて試験した:ウサギの乳仔の血清プールI(▲)、ウサギの乳仔の血清プール II(●)、およびヒト無ガンマグロブリン血症(○)。SEAM-5およびSEAM-12に ついて、各抗体に対する類似の用量応答が、3つの補体供給源のそれぞれについ て観察された。対照的に、SEAM-18は、ウサギの補体のいずれの供給源で必要と されるよりも、ヒト補体の存在下で細菌の死滅を誘発するためにより高い抗体濃 度 を必要とした。SEAM-3は、2つのウサギ補体供給源を用いて試験した場合、効率 的な死滅を示し、そしてヒト補体供給源を用いて試験した場合、活性を示さなか った。補体媒介性細菌溶解を活性化する各モノクローナル抗体の能力を、表1に 報告する。ELISAによるNAc-MenB PSと交差反応性である殺菌性抗体の例(例えば 、SEAM-18、SEAM-30、およびSEAM-35)が挙げられる。NAc-MenB PSとの交差反応 性を示さない殺菌性抗体の例(例えば、SEAM-2、SEAM-5、SEAM-7、およびSEAM-8 )もまた挙げられる。 (g)オプソニン活性 モノクローナル抗体のオプソニン活性を、種々の確立された方法によって測定 し得る。Sjursenら(1987)Acta Path.Microbiol.Immunol.Scand.,Sec.C 9 5 :283,Halstensenら(1989)Scand.J.Infect.Dis.21:267,Lehmannら(199 1)APMIS 99:769,Halstensenら(1991)NIPH Annals 14:157,Fredlundら(199 2)APMIS 100:449,Guttormsenら(1992)Infect.Imnlun.60:2777、Guttormse nら(1993)J.Infec.Dis.167:1314、Bjerknesら(1995)Infect.Immun.63: 160、およびHayrlnenら(1995)J.Infect.Dis.171:1481。 1つのオプソニン作用のアッセイにおいて、GN寒天プレート(Greiner Labort echniek,Greiner BV,Alphen a/d Rijn,Netherlands)上で37℃で新たに増殖 させたN.menigitidisを使用して、0.1の初期ODを得るように8mlのMueller Hin ton培地(Difco,Detroit,MI)に接種した。細菌を、激しく振盪しながら対数 期(0.75〜0.85の660nmでの吸光度)まで増殖させた。細胞を、蓋付きの滅菌の プラスチックチューブに移し、そして10分間3500rpmで遠心分離した。 細胞を、4mlの70%エタノールを添加し、そして4℃で少なくとも1時間イン キュベートすることによって固定した。固定した細胞を、3500rpmで10分間の遠 心分離によって再度ペレット化し、そして滅菌のリン酸緩衝化生理食塩水(PBS )中に1.0のODになるように再懸濁した。細胞懸濁物(1.35ml)をエッペンドル フチューブに添加し、そして5分間10,000rpmで遠心分離した。上清を廃棄し、 そして別の1.35mlを同じチューブに添加し、続いて遠心分離して1チューブあた り1×109細胞を得た。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)を含有するPB S(Sigma,St.Louis,MO)の1.0mg/mlの溶液を調製し、そして5分間超音波処 理し、次いで5分間10,000rpmで遠心分離した。FITC-PBS溶液(50μl)を各チ ューブの細菌に添加し、次いで軽度に攪拌しながら37℃にて1時間インキュベー トした。PBS(950μl)を各チューブに添加し、そして2分間10,000rpmで遠心 分離した。ペレットを1mlのPBSで1回、そして1mlのBSA-Hanks平衡化塩溶液( BSA-HBBS)で1回洗浄した。FITC標識した髄膜炎菌を1%のBSA-HBBS中で再構成 し、そして100μlのアリコートに分けた。これを、アッセイでの使用まで-20℃ で保存した。 ヒト多型性核細胞(PMN)をヘパリン含有チューブ中の健常な成体の末梢血か ら単離した(Becton Dickinson,Mountain View,CA)。10mlの容量の血液を、 等量のリン酸緩衝化生理食塩水(PBS;pH7.4)で希釈し、そして12mlのhistopaq ue(密度1.119、Sigma Diagnostics,St.Louis,MO)の上部の10mlのFicoll Pa queTM(Pharmacia,Uppsaila,Sweden)からなるFicoll histopaque勾配に載せ た。室温で400×gで20分間の遠心分離後、PMNをhistopaqueの上部から回収し、 そして1%のゼラチンを含有する氷冷RPMI培地(Roswell Park Memorial Instit ute,NY)を添加した。細胞を250×gで遠心分離し、そして残りの赤血球を9ml の氷冷した滅菌水中に細胞を再懸濁することによって溶解させた。1分後、濃縮 したPBSおよびRPMI-ゼラチンを添加して細胞懸濁物を等張化した。PMNを遠心分 離し、そしてRPMI培地に1×107/mlの密度に再懸濁した。PMNの純度および生存性 は95%以上であった。 マイクロタイタープレートに、試験されるべきモノクローナル抗体の適切な希 釈物(BSA-HBBS中で希釈した)、5μlの10%ヒト補体(BSA-HBBS中)、および 25μlのFITC標識した細菌懸濁物を添加して、50μlの全容量にした。選択した 抗体を、補体を含まずに、そして3つまでの異なる補体供給源:正常なプールし たヒト血清;無ガンマグロブリン血症血清;およびウサギ胎児血清を用いて、1 〜10%までで補体濃度を変化させて試験した。各アッセイはポジティブおよびネ ガティブ抗体コントロール、ならびに補体、非オプソニン作用、および細胞のみ のコントロールを含んだ。オプソニン作用反応を、30分間37℃にて振盪機上で反 応させ、その後、氷上にマイクロタイタープレートに置くことによって反応を停 止 した。 食細胞懸濁物(50μl)を5×106細胞/mlの最終濃度で添加した。これによっ て10:1の細菌:食細胞の比が得られる。食細胞活動を、振盪機上で37℃で30分 間反応させ、その後、それを氷上に置いた。冷BSA-HBBS(100μl)を各ウェル に添加した。プレートを10分間1100rpmで遠心分離した。上清をウェルから吸引 し、そして細胞を2回以上150μlの冷BSA-HBBSで洗浄した。次いで、冷BSA-HBB S(150μl)を添加し、そして得られた細胞懸濁物を滅菌チューブに移した。2 %のパラホルムアルデヒドを含有するPBSの溶液(Polysciences,Inc.,Warring ton,PA)を添加して細胞を固定した。次いでサンプルを、間接的な蛍光フロー サイトメトリーによって分析した。 16の代表的なSEAMモノクローナル抗体についてのオプソニン作用実験の結果を 、表1に報告する。オプソニンであることが見出されている全ての抗体は、少な くとも1つの補体供給源を使用する上記のアッセイにおいてもまた殺菌性であっ た。しかし、表1に見られ得るように、殺菌性であるがオプソニン性ではない抗 体の例(例えば、SEAM-2、SEAM-5、SEAM-7、SEAM-16、およびSEAM-41を参照のこ と)が挙げられる。 (h)自己反応性の評価: 39 SEAMモノクローナル抗体を含有する部分精製された組織培養上清を、宿主 のポリシアル酸に対する自己反応性について評価した。1つのアッセイにおいて 、モノクローナル抗体を、ヒト神経芽細胞腫細胞株CHP-134(Livingstonら、(1 988)J.Biol.Chem.263:9443)と交差反応するその能力について、間接的免疫 蛍光のフローサイトメトリー検出を用いて評価した。このアッセイにおいて、そ の表面の神経細胞接着分子(NCAM)に結合した長鎖ポリシアル酸(PSA)を発現 するCHP-134細胞は、ヒトPSA抗原についての細胞性マーカーとして作用する。コ ントロール実験において、ほぼコンフルエントな細胞培養物を50mlの遠心管に回 収し、そして1000×gで遠心分離した。上清をデカントした後、5mlのブロッキ ング緩衝液を、再懸濁した細胞に添加した。次いで、細胞を血球計で計数し、そ して2つの等しいアリコートに分けた。1方のアリコートを、エキソノイラミニ ダ ーゼ(10ユニット/108細胞、SIGMA Chemical Co.,Saint Louls,MO)とともに 室温で2時間インキュベートした;他方のアリコートを、同様に、しかし酵素な しで処理した。インキュベーションの後、各アリコートからの細胞を、個々の反 応管に、各管が106個の細胞を含むよう分配した。細胞を洗浄するために、2ml のブロッキング緩衝液を各反応管に添加し、その管をSorvall RT-600B中で、20 ℃、1000rpmで、6分間遠心分離し、そして上清を吸引除去した。洗浄した細胞 を、総容量200μlで、抗体を含まずに、または示された濃度(通常10または100 μg/ml)の試験抗体(すなわち、SEAM MAb)とともにのいずれかで、氷上で2 時間インキュベートした。 アッセイにおけるコントロール抗体は、以下を含んでいた:(1)関連しない 特異性のIgGモノクローナル抗体(ネガティブコントロールとしての、VIIGI0) ;(2)IgM抗ポリシアル酸モノクローナル抗体(ポジティブコントロールとし ての、2-1B);および(3)NCAMのタンパク質骨格に特異的な抗CD56モノクロー ナル抗体(Immunotech,Marseille,France)。ブロッキング緩衝液(2ml)を 、各反応管に添加し、そして管をSorvall RT-600B中で、20℃、1000rpmで、6分 間遠心分離した。遠心分離の後に、上清を吸引除去し、そして細胞を室温で1時 間、150μlのフルオレセインイソチオシアネート(FITC)-結合体化F(ab')2フラ グメントヤギ抗マウスIgG(H+L)(4μg/mlに希釈)(Jackson Immune Research,We st Grove,PA)とともにインキュベートした。ブロッキング緩衝液で洗浄した後 、PBS緩衝液(50mMリン酸ナトリウム、pH7.0、150mM塩化ナトリウム)中の400μ lの0.25%ホルムアミドを細胞に添加し、そして細胞をFACSCANTM細胞ソーター (Becton-Dickinson,Mountain View,CA)を使用して、フローサイトメトリー によって分析した。 全ての抗体を、二連の最終濃度10および100μg/mlの抗体で、未処理細胞、お よびノイラミニダーゼで前処理した細胞を使用して試験した。この処理によって 表面ポリシアル酸が切断され、そしてポリシアル酸への抗体結合の特異性につい てのアッセイにおけるコントロールを提供する。代表的な実験において(図6A〜 61)、一次抗体なしで、または関連しない抗原特異性を有するコントロールモ ノクローナル抗体とともにインキュベートした細胞は、非常に小さい蛍光を示す (約98%の細胞が<10ユニットの蛍光を有する、図6A)。対照的に、抗NAc MenB PSモノクローナル抗体である2-1Bで処理された実質的に全ての細胞が、強く蛍 光を発する(図6B、左)。この蛍光は、抗体がノイラミニダーゼで前処理された 細胞とともにインキュベートされる場合、コントロールレベルまで減少する(図 6B、右)。同様に、抗CD56で処理した細胞は、強く蛍光を発する(図6C)。この 抗体を用いて、蛍光は、細胞をノイラミニダーゼで前処理することによって影響 を受けない。なぜなら、CD56決定基は、NCAMのタンパク質骨格に位置し、そして ノイラミニダーゼによるポリシアル酸の除去によって影響を受けないからである 。 SEAM-5抗体は、100μg/mlで試験される場合(図6D)、検出可能な結合を与えず 、このアッセイではネガティブであると考えられる。SEAM-35抗体は、10または1 00μg/mlで試験した場合(図6Eおよび6F)、強力なポリシアル酸特異的結合を示 し、ポジティブであると考えられる。少数個の抗NPr MenB PSモノクローナル抗 体が、100μg/mlで試験された場合、結合を示すが、10μg/mlで試験された場 合、ネガティブであるようである(例えば、図6Gおよび6HのSEAM-12を参照のこ と)。このような抗体は、本出願の目的については、最小限に自己反応性である と考えられる。細胞のノイラミニダーゼによる前処理によって影響を受けなかっ た神経芽細胞株との弱い反応性を有する抗体は、希少のようである(SEAM-7、図 6Iを参照のこと)。このような抗体のポリシアル酸との自己反応性は、アッセイ において中程度として得点され、そしてこれらの抗体はまた、本出願の目的につ いて、宿主PSAに対して最小の自己反応性を有すると考えられる。 表1は、この間接的蛍光フローサイトメトリーアッセイにおいて決定した場合 の、各抗体の自己抗体活性を要約する。CHP-134細胞において発現したポリシア ル酸抗原との交差反応性は、ELISAアッセイにおいて抗体のNAc-MenB PSとの交差 反応性と密接に相関した。表1に示すように、ELISAにおいてNAc-MenB PSと交差 反応しなかったモノクローナル抗体は、CHP-134細胞にも結合しなかったが、ELI SAにおいてNAc-MenB PSと交差反応した抗体の全てが、PSAともまた交差反応した 。2つのアッセイ間のこの相関は、予想されなかった。なぜなら、NAc-MenB PS および宿主PSAのポリサッカライド共有結合構造は、同一であると報告されてい るからである。実施例5 SEAM モノクローナル抗体組成物を用いた受動免疫 上記で特徴づけられたSEAMモノクローナル抗体の能力を評価して、細菌性抗原 投与に対する受動防御を提供するために、以下の免疫化研究を行った。 動物:非近交系の乳仔SPF(特異的病原体を含まない)白色種wistarラットを 、ヘルシンキ大学動物センター(Helsinki,Finland)から入手した。 細菌株:MenB:15:p1.7、16表現型を有するヒト患者単離株であるNeisseria me ringitidiSB群の株IH 5341、および1〜2のさらなる他のB群細菌株(例えば 、M355;B:15:P1.15)を用いた。全ての細菌株を、ラットで5回継代し、そし てスキムミルク中で−70℃にて保存した。各実験について、新鮮な接種物をスト ックから採取し、そしてIsoVitalex、L-トリプトファン、およびヘモグロビン を補充した淋菌(GC)培地塩基(GC寒天II Base,Becton Dickinson,Mountain View,CA)上で培養した。5% CO2中で37℃で一晩のインキュベーション後、い くつかのコロニーを、20mlの脳−心臓注入ブロスを含有する培養フラスコ中に接 種し、そして回転シェーカー中で150rpmで37℃にて、光学密度(Klett 90)が108 cfu/mlに対応するまでインキュベートした。次いで、培養物を、使用のために1 06cfu/mlに対応するリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中に希釈した。抗原投与用 量中の生存細菌の実際数を、PBS中への懸濁物の系列希釈の後にcfuを計数し、そ してプロテオースペプトン寒天上にプレートすることにより決定した。 免疫:各実験では、4〜6日齢の乳仔ラットの3〜4匹の同腹子をランダムに 選択し、そして各6匹の動物の実験群に分け、そしてSEAMモノクローナル抗体組 成物(0.9%生理食塩水中)、生理食塩水溶液(0.9%)、またはコントロール抗 体のいずれかを腹腔内注射した。各群で3匹の動物に、SEAM抗体(それぞれ、0. 4μg、2μg、および10μgの用量)を接種し、2匹の動物をネガティブコン トロール(一方は生理食塩水単独の注射を受け、そして他方は関連しない特異性 のモノクローナル抗体の注射を受けた)として用い、そしてポジティブな動物は 、抗Men Bポリサッカライド抗体の注射を受けた。 細菌抗原投与:最初の注射の1〜2時間後、乳仔ラットは、最終容量100μl 中 の105個のNeisseria meningitidis B群細菌の株IH 534(ラットで5回継代した )の細菌抗原投与の腹腔内注射を受けた。細菌接種の6時間後、菌血症および髄 膜炎の発達を、乳仔ラットから採取した血液および脳脊髄サンプルを培養するこ とにより評価した。 6回の代表的なSEAMモノクローナル抗体(SEAM-5、SEAM-7、SEAM-8、SEAM-10 、SEAM-12、およびSEAM-18)についての研究(N.meningitidis菌血症からの防 御)の結果を、以下の表4に示す。見られ得るように、SEAM-12抗体およびSEAM- 18抗体は強力に防御性であり、SEAM-7抗体およびSEAM-8抗体は部分的に防御性で あり、SEAM-5抗体およびSEAM-10抗体は10μg/pupの用量まで防御を全く提供し ない。 実施例6 SEAM モノクローナル抗体を用いるMenB抗原のペプチド模倣物の同定 以下の手順を、本発明のSEAMモノクローナル抗体と相互作用するペプチド模倣 物を同定するために実施した。ファージディスプレイペプチドライブラリーを、 M13ベクター中に、当業者に公知の技術を用いて構築した。Adeyら(1996)「Con struction of Random Peptide Libraries in Bacteriophage M13」,Phage Disp lay of Peptides and Proteins,Kayら編,Academic Press,San Diego,CA。特 に、直鎖状8マー(L8)、環状6マー(C6)、および単一C(C1)ペプチドを、 pIIIバクテリオファージタンパク質のN末端伸長物として提示した。ライブラリ ーの特徴を、以下の表3に示す。 aペプチドは、M13ファージタンパク質pIIIとの融合物として提示される。b Xは、ランダムなアミノ酸を示し、他の全ては標準的な一文字コードである。c (P)4または(P)6は、それぞれ、4または6個のプロリン残基のいずれかをい う。 ライブラリーのパニングを、抗体がマイクロタイタープレートに直接吸収され たこと以外は、Smithら(1993)Methods in Enzymology 217.:228に記載される 技術を用いて実施した。代表的なモノクローナル抗体(1μg/mlのSEAM-2、SEA M-3、SEAM-5、SEAM-7、SEAM-12、SEAM-16、SEAM-18、およびSEAM-28)、または 対応する濃度のコントロール抗体(マウス抗MenB PS特異的モノクローナル(2-1 B)、ヒト抗Hib PSモノクローナル(ED8)、および関連しない特異性のマウスモ ノク ローナル(Laz2)))を含有する100μl溶液を、マイクロタイタープレート(I mmunolon II)中で4℃にて一晩インキュベートした。ウェルをPBSで洗浄した後 、ブロッキング溶液(PBS中の5%(w/v)脱脂粉乳、0.2%(w/v)Tween-20、0. 02%(w/v)アジ化ナトリウム)を、ウェルを完全に満たすように添加し、次い でプレートを室温にて3時間インキュベートした。ブロックしたプレートを、PB Sで6回洗浄した。 約1010pfuのファージを、1ウェルあたり100μlの総容量で三連のウェルに添 加した。プレートを、ファージとともに40℃にて一晩インキュベートした。次い で、各ウェルを、PBSで9回洗浄し、そして各ウェルに100μlの0.2Mグリシン、 HCl(pH2.2)緩衝液を添加し、そして室温にて1時間インキュベートすることに より結合したファージを放出させた。それぞれの三連ウェルからの緩衝溶液を合 わせ、そして溶液100μlあたり20μl 1.5M Tris(pH8.8)緩衝液の添加によりpH を8に調整した。0.2%(w/v)マルトースおよび12μg/mlテトラサイクリンを 含有するLB培地(LB-mal,tet培地)中でOD550nm=0.4〜0.6の密度のE.coli(XLl -Blue)の新鮮に増殖させた培養物(2ml)を、放出されたファージの合わせた 溶液に添加した。細胞およびファージを、37℃にて20分間インキュベートし、そ の後20mlの培地を添加した。細胞を37℃にて一晩増殖させ、次いで遠心分離(50 00×gにて10分間)によりペレット化した。上清を0.2μmメンブレンを通して 濾過し、そして0.15容量の20%(w/v)ポリエチレングリコール8000、4M NaClを 添加し、そして混合物を4℃にて一晩静置することによりファージを沈澱させた 。沈澱したファージを、遠心分離(10,000×gにて10分間)により回収し、次い で20ml PBS中に再懸濁した(約1012pfu/ml)。 各パニングを、各スクリーニングについて3または4回繰り返した。最後に、 最後のパニングから放出されたファージを用いてXLl-Blue細胞を感染させ、そし ていくつかの系列希釈物をLB寒天プレート上に直接プレートした。個々のプラー クを選択し、そしてXLl-Blueの5ml培養物(LB-mal,tet培地)中で増幅させた。 ファージからのDNAを、QIA8-PrepTMカラム(Quiagen)を用いて調製し、そしてS equenaseTMキット(Amersham)を製造者の指示に従って用いて配列決定した。 計67個の独特のペプチド配列(ペプチドPep 1〜Pep67)を、SEAMモノクローナ ル抗体により選択した。これらのペプチド配列を、図7において配列番号1〜67 として示す。これらの配列のうち、13個は、偶然を越えて同定された(表4)。 1つの例外はあるが、コントロール抗体により選択された配列(2−1B,ED8、よ びLaz2)はいずれも、SEAMモノクローナル抗体により選択された配列に対して同 一でも有意に相同でもなかった。1つの例外(配列番号9)は、SEAM-3およびLa z2コントロール抗体の両方により選択された。しかし、この結果は、おそらく、 試薬間の相互コンタミネーションに起因する。なぜなら、両方の実験を同時に行 なったからである。 実施例7 ペプチド模倣物の特徴付け 合成ペプチドへの抗体結合の特徴付けのために、部分的に精製されたモノクロ プロテインGカラム(4.6mm×100mm)を用いて1.7ml(PerSeptive Biosystems, Framingham,MA)のカラム容量でさらに精製した。プロテインGカラムを、10カ ラム容量のPBS緩衝液で平衡化した。腹水またはPBS中に再懸濁した組織培養物の いずれかからのモノクローナル抗体調製物(2ml)を、プロテインGカラムに注 射した。5カラム容量のPBS緩衝液で洗浄した後、モノクローナル抗体を、0.2M グリシン-HCl、150mM塩化ナトリウム(pH2.5)緩衝液を用いてプロテインGカラ ムから溶出した。溶出した抗体を、内部に備えられた分光光度学的検出器で220n mおよび280nmの両方でモニタリングし、そして溶出ピークを収集し、そして4℃ にて保存した。収集してすぐに100μlの1.5M Tris(pH8.8)を添加することに より、各1ml画分のpHを8.0に上昇させた。精製したモノクローナル抗体の濃度 を、分光光度計で、280nmの吸光度で、0.71mg-1ml cm-1の吸光係数を用いて決定 した。 ELISAを用いて、抗NPr-MenB PS抗体が、表4に同定した選択されたペプチド模 倣配列に対応する合成ペプチドを認識する能力を決定した。合成ペプチドを、Bi osynthesis(Lewisville,TX)から購入した。ELISAプレートへの吸収を促進す るために、疎水性テイルのアミノ末端(ラウリル-GLY-GLY)での付加によりペプ チドを改変した。さらに、ペプチドは、カルボキシル末端アミドであった。合成 ペプチド(1mg)を、100μlのジメチルスルホキシド(Sigma,St.Louis,MO )中に再懸濁し、次いでアリコートを、50mM Hepes(Fisher Scientific,Pitts burgh,PA)pH8.0、150mM NaCl(Sigma,St.Louis,MO)、および0.02%アジ化 ナトリウム(Sigma,St.Louis,MO)中で10μg/mlのペプチド濃度までさらに 希釈した。50mM Hepes緩衝液中に100μl/ウェルの10μg/mlペプチド溶液を含 有すtilly,Va.)を、4℃にて一晩インキュベートした。プレートをリン酸緩衝化生 理食塩水(PBS,pH7.4)で3回洗浄した後、ウェルを、200μlのブロッキング 緩衝液で満たし、そして1〜2時間室温でインキュベートして非特異的結合部位 をブロックした。次いで、プレートを、洗浄緩衝液で5回洗浄した。 ペプチド結合について試験されるべきSEAMモノクローナル抗体の種々の希釈物 (50μl)を、50μlの希釈緩衝液、または1mlあたり50μgの可溶性NPr-MenB PS(25μg/mlの最終インヒビター濃度)を含有する50μlの希釈緩衝液のいず れか を含む二連のプレートに添加した。次いでプレートを覆い、そして4℃にて一晩 インキュベートした。翌日、プレートを、洗浄緩衝液で5回洗浄し、次いで希釈 緩衝液中に1:2000に希釈したアルカリホスファターゼ結合抗マウスポリクローナ ル抗体、IgA+IgG+IgM(Zymed,South San Francisco,CA)100μl/ウェルとと もに、4℃にて3時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝液で5 回洗浄し、そして基質緩衝液中に1mg/mlまで希釈した新鮮に調製した基質(p- ニトロフェニルリン酸,Sigma,St.Louis,MO)100μlを各ウェルに添加した 。吸光度の値を、30分後に405nmで測定した。 繋留されたPep 4およびPep 8に対する代表的な結合データを、それぞれ図8-A および図8-Bに示す。いくつかのSEAM抗NPr-MenB PSモノクローナル抗体は、これ らの2つのペプチドを認識する。対照的に、同じアイソタイプの関連しないマウ スモノクローナル抗体は、このアッセイにおいて結合を示さない(データは示さ ず)。いくつかのSEAM抗NPr-MenB PSモノクローナル抗体については、25μg/ml でのNPr-MenB PSの添加は、ペプチド(例えば、SEAM-3)に対する抗体の結合を 完全に阻害した。他の抗体については、結合の部分的な阻害が存在する(例えば 、SEAM-16およびSEW-18)かまたは阻害が存在しない(SEAM-5)かのいずれかで ある。表5にまとめるように、NPr-MenB PSに対するSEAM抗NPr-MenB PSモノクロ ーナル抗体の濃度依存性結合と、特定の合成ペプチドへのそれぞれの結合との間 に密接な対応が存在する。例えば、NPr-MenB PSおよびPep 8に対する抗体SEAM-3 、SEAM-5、SEAM-7、SEAM-16、およびSEAM-18の相対結合を参照のこと。 実施例8 ペプチド模倣ワクチン組成物の調製 上記のペプチド模倣配列に相当する合成ペプチドを含むワクチン組成物を以下 のように調製した。 OMP 粒子の調製。 OMP粒子を、Lowellら(1988)J.Expt.Med.167:658- 663、およびZollingerら(1979)J.Clin.Invest.63:836-848により記載された 技術の組合せを用いて、B群のNeisseria meningitidisの莢膜欠損変異体株(M7 株)から調製した。簡単に述べれば、37℃でインキュベートされたチョコレート 寒天平板上の一晩培養からの、Neisseria meningitidis M7株(NmB由来の非莢膜 変異体)を、殺菌Frantz培地(1Lの水中に、10.3gのNa2HPO4、10gのカザミノ酸( Difco、Detroit、MI)、0.36gのKCl、0.012gのシステイン-HCl(Sigma、St.Louis 、MO)、および25mlの40%グルコース-40mM MgSO4(Sigma、St.Louis、MO)、pH7. 4)を含む2つの500mlフラスコに接種するために用いた。細菌を、初期の0.1〜0. 2のODから対数期まで(0.75〜0.85のOD)、シェーカー180rpmで6〜8時間増殖さ せた。この細菌を、0.5%フェノール溶液を用いて室温で1時間不活性化した。 細胞を、3000×gで30分間の遠心分離により回収した。デカンテーションにより 上清液を流し出し、そして細胞をPBSで2回洗浄した。得られたペレットを-20℃ で貯蔵した。 次いで、細菌を、0.05MのTris-HCl、0.15MのNaClおよび0.01MのEDTA(pH7.4)を 含む15mlの緩衝液中に再懸濁し、それから30分間56℃まで暖めた。室温まで冷却 した後、この懸濁液を、Polytron(Kinematica GmbH.,Luzern,Switzerland)中 で、3分間フルスピードでせん断し、それからl6000×gで15分間遠心分離した。 得られたペレットを、10mlの緩衝液(500mM塩化ナトリウム、50mMリン酸ナトリウ ム)を用いて再懸濁し、そして5mlのデタージェント溶液(10%デオキシコール酸 ナトリウム(DOC)(Calbiochem、La Jolla、CA)、0.15Mグリシン(Biorad、Hercule s、CA)、および30mMエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)(SIGMA、Saint Louis、M O))で処理した。懸濁液を16,000×gで15分間遠心分離した。次いで上清液を集め 、そして100,000×gで2時間遠心分離した。外膜タンパク質調製物を含むペレッ ト を、10mlの水に再懸濁し、そして4℃で貯蔵した。 外膜タンパク質の10mlの懸濁液を、5mlのデタージェント溶液で再処理し、つ しで30分間56℃まで暖めた。冷却後、リポポリサッカライド(LPS)を、外膜タン パク質から、第2のデタージェント溶液(1%DOC、0.05Mグリシン、および0.005 M EDTA、pH 8.8)中の2cm×20cmのSephadex G-100カラム(Pharmacia Fine Chemi cals、Piscataway、N.J.)を用いて、1度に2mlのクロマトグラフィーにより取 り出した。ピークのフラクションを集めて30℃まで暖め、そして0.2μmのメン ブレンフィルターを通じて、4容量の冷フィルター滅菌濾過したエタノール中に 直接滅菌濾過した。この混合液を4℃で一晩インキュベートした。得られた沈殿 物を、16,000×gで10分間の遠心分離により集め、そして1mlの滅菌蒸留水中に 再懸濁した。得られるOMP調製物は可溶性であったが、わずかに乳白色であり、 そして-60℃で貯蔵した。 ペプチド/OMP粒子の調製 ワクチンを、ペプチドPep5およびPep8から、またはペプチドPep1〜Pep9の混合 物から調製した。ペプチドのOMP粒子への疎水的複合体化を容易にするために、 各ペプチドを、ELISAについて上記したように、アミノ末端における疎水性テイ ル(ラウリル-GLY-GLY)、およびカルボキシルアミドの付加により改変した。各ワ クチンのために、5mgのペプチドを、100μlのジメチルスルホキシド(DMSO)(SI GMA、Saint Louis、MO)中に溶解した。得られる溶液を、50mMの4-(-2-ヒドロキ シエチル)-1−ピペラジンエタンスルホン酸(Hepes)、pH8.0、およびIMのフェリ シアン化カリウム(SIGMA、Saint Louis、MO)を含む緩衝液で750μlまで希釈し た。次いで、7.5μgの両性イオン性デタージェント(Empigen、Calblochem、La Jolla、CA)を、上記のペプチド溶液に添加した。室温で1時間インキュベーショ ンした後、ペプチド溶液の各々を、1mlの総容量について、250μlの外膜タン パク質(OMP)粒子(20mg/ml)と合わせた。この溶液を75℃まで20分間加熱した。室 温まで冷却した後、このOMP/ペプチド混合物を、分子量10,000カットオフのSlid e-A-Lyzer(Pierce、Rockford、IL)に添加し、そして1L PBS中で一晩透析した 。PBS溶液(1L)は8時間にわたって2回交換した。実施例9 OMP- ペプチド模倣ワクチン組成物を用いた免疫 上記の実施例8で調製されたOMP-ペプチドワクチン組成物を評価するために、 以下の研究を実施した。 動物:Balb/cおよびCD1マウス(Jackson Laboratory、Bar Harbor、ME) を免疫原性研究のために使用した。マウスは2週間の間隔離して維持した。 ワクチン調製物:最初の注射には、ワクチン溶液(2mg/ml PBS中の総ペ プチド/タンパク質)を、同容量の完全フロイントアジュバント(Sigma、St.Loui s、MO)と合わせ、1mg/mlのペプチド/タンパク質最終濃度を調製した。次の注射 には、不完全フロイントアジュバントを用いて類似のワクチン組成物を調製した 。各組成物を、均一なエマルジョンを得るために、2つのシリンジを通して押し 込みそして押し返した。このエマルジョンを次いで免疫に用いた。 免疫:各処置群は、4匹のBalb/cマウスおよび4匹のCD1マウスを含ん でいた。免疫化しなかった4匹のBalb/cマウスおよび4匹のCD1マウスの対照群 もまた存在した。個々の処置群は、5μgまたは50μgのペプチドの用量、およ び5μgまたは50μgのOMP粒子をそれぞれ受けた。このワクチン組成物は、5 または50μlの総容量で腹腔内(IP)にそれぞれ投与された。免疫は、合計3回の 免疫について3週間間隔で繰り返した。動物を、第3回目の免疫から1および4 週間後に、尾静脈から放血させた。 OMP粒子と複合体化したペプチドPep8で免疫したCD1およびBalb/cマウスは、第 3回目の免疫後4週間で得られた血清中に、ELISAにより測定したとき、高い抗P ep8抗体応答を示す。CD1マウスの応答に対する代表的なデータを図9に示す。つ なぎ止められたPep8に対する抗体結合は、可溶性Pep8(アセチル-[Pep8]-アミド) により阻害されるが、可溶性の非関連ペプチド「R1」(アセチル-GLN-TRP-GLU-AR G-THR-TYR-アミド)(配列番号68)により阻害されない。抗-Pep8抗体はまた、9つ のペプチドの組合せ(ペプチドPep1Pep9/OMP)で免疫したマウスにおいて惹起され たが、Pep5/OMP単独で免疫したマウスでは惹起されなかった。このことは、この Pep8特異的抗体がPep8を含む免疫原により惹起されたことを示す。 図10は、ELISAアッセイにおける、CD1マウス免疫血清の、NPr-MenB PSまた はNAc-MenB PSとの交差反応性を要約する。3つの免疫原(Pep5/OMP、Pep8/OMP、 およびペプチドPep1-Pep9/OMP)のすべてが、非免疫の対照マウスからの血清プー ル中で検出されなかった、NPr-MenB PSと交差反応する血清抗体を惹起するよう である。しかし、この抗体結合の特異性は確認され得なかった。なぜなら、可溶 性NPr-MenB PSを含むウェル中では有意な阻害が観察されかったからである(デー タは示さず)。固相NPr-MenB PSに対する抗Pep8血清プールの結合を阻害する可溶 性Pep8(アセチル-[Pep8]-アミド)の能力もまた、確認され得なかった。なぜなら 、このペプチドの存在は、可溶性の非関連ペプチド「R1」(アセチル-GLN-TRP-G LU-ARG-THR-TYR-アミド)(配列番号68)の存在下で検出されなかった抗体結合の有 意な増加をもたらしたからである。 SEAMモノクローナル抗体の大規模コレクションの特徴付けからのデータは、EL ISAにおける抗体のNAc-MenB PSに対する結合能力が、CHP-134神経芽腫細胞によ り発現されるPSAに対する結合により評価したときの自己抗体活性の存在と相関 することを示す(表1を参照のこと)。図11は、ELISAアッセイにおける、CD1マ ウス免疫血清のNAc-MenB PSとの交差反応性を要約する。ペプチドでワクチン化 したマウスからプールされた血清のいずれもが、このアッセイではポジティブで はなかった。対照的に、既知の自己抗体活性を持つSEAM抗NPr-MenB PSモノクロ ーナル抗体は、2.0μg/mlで試験したとき、このアッセイで強くポジティブであ った。ELISAによる抗Pep抗血清のNAc-MenB PSとの交差反応性の欠如は、これら の抗体がPSA特異的自己抗体活性を持たないことを示す。 5μgまたは50μgいずれかのPep8/OMPワクチンで免疫されたマウスからプー ルされたCD1血清の補体仲介抗細菌活性を、図12Aおよび12Bにそれぞれ示す。両 方の用量で、このPep8含有ワクチンは、ヒト補体の存在下でMenB株8047の細菌溶 解を仲介し得た血清抗体を惹起した。この抗体の一部分は、アジュバントとして 用いられたOMP粒子により惹起され得た。しかし、100μg/mlの最終血清濃度に おけるラウリル-GLY-GLY-Pep8との反応の阻害により示されるように、1:1000 の血清希釈で、50%またはそれ以上の抗細菌活性が抗Pep8抗体により仲介された 。 従って、抗細菌MenB抗体を惹起し得る、新規なMenB PS抗体、分子ペプチド模 倣学、ならびにそれを得る方法および用いる方法が開示される。本発明の好適な 実施態様がある程度詳細に記載されているが、添付の請求項により規定されるよ うな本発明の思想および範囲から逸脱することなく、自明な改変がなされ得るこ とが理解される。発明の実施に有用な株の寄託 以下のハイブリドーマ細胞株の生物学的純粋培養の寄託がAmerican Type Cult ure Collection(ATCC)、12301 Parklawn Drive、Rockville、Marylandになされ た。示された受託番号は、成功した生存試験、および必要な手数料の支払いの後 に割り当てられた。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関す るブダペスト条約およびそれに基づく規則の条項(ブダペスト条約)の基でなされ た。これは、寄託の日から30年間の生存培養の維持を確実にする。生物は、ブダ ペスト条約の条項の基でATCCにより利用可能となされ、そしてChiron Corporati onとATCCとの間の同意を受け、このことは、それに関して権利を持つと米国特許 商標庁長官により決定された者に、合衆国法典第35巻第122条およびそれに基づ く長官規則(連邦法施行規則第37巻1.12条、特に886 OG 638を参照して)に従って 、その子孫の永久的かつ制限されない利用可能性を確実にする。特許を許可する に際し、寄託された培養の公衆への利用可能性に関するすべての制限は、変更不 能に取り除かれる。 これらの寄託は単に当業者への便宜として提供され、そして寄託が合衆国法典 第35巻第112条の下で必要とされることの認容ではない。これらのハイブリドー マの核酸配列、およびそれによってコードされる抗体分子のアミノ酸配列は、本 明細書の記載となんらかの矛盾がある場合に管理されている。寄託された材料を 作成、使用、または販売するためにライセンスが必要であり得、そして本明細書 によってはこのようなライセンスは許可されない。 ハイブリドーマ 寄託日 ATCC 番号 SEAM-3 1996年8月16日 HB-12170 SEAM-18 1996年8月16日 HB-12169 SEW-2 1997年7月30日 CRL-12380 SEAM-12 1997年7月30日 CRL-12381
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C07K 16/42 C07K 16/42 C12N 5/10 C12P 21/08 C12P 21/08 C12N 5/00 B 【要約の続き】

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.Neisseria meningitidis血清型B莢膜ポリサッカライド誘導体に対する単離 された抗体であって、自己反応性ではない、抗体。 2.前記抗体が、ELISAにおいてNeisseria meningitidis血清型B莢膜ポリサッ カライド(MenB PS)と交差反応しない、請求項1に記載の抗体。 3.前記抗体が、Neisseria meningitidis血清型B生物に対する機能活性を示す 、請求項1に記載の抗体。 4.前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項1に記載の抗体。 5.請求項1に記載の抗体によって結合され得る、独特のNeisseria meningitid is血清型Bエピトープ。 6.請求項2に記載の抗体によって結合され得る、独特のNeisseria meningitid is血清型Bエピトープ。 7.請求項3に記載の抗体によって結合され得る、独特のNeisseria meningitid is血清型Bエピトープ。 8.請求項4に記載の抗体によって結合され得る、独特のNeisseria meningitid is血清型Bエピトープ。 9.請求項4に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。 10.SEAM-2(ATCC番号CRL-12380)、SEAM-3(ATCC番号HB-12170)、SEAM−12 (ATCC番号HB-12169)、およびSEAM-18(ATCC番号CRL-12381)からなる群から選 択されるハイブリドーマ細胞株を同定する特徴を有する、請求項9に記載のハイ ブリドーマ。 11.Neisseria meningitidis血清型B(MenB)の独特のエピトープの分子模倣 物を単離するための方法であって、以下: (a)MenBの独特のエピトープの推定分子模倣物を含む分子の集団を提供する 工程; (b)該分子模倣物が存在する場合には、請求項1に記載の抗体と該分子模倣 物との間の免疫学的結合を可能にする条件下で、該分子の集団を該抗体と接触さ せて複合体を提供する工程;および (c)非結合分子から該複合体を分離する工程、 を包含する、方法。 12.前記分子の集団が、ペプトイドライブラリーを含む、請求項11に記載の 方法。 13.前記分子の集団が、ペプチドライブラリーを含む、請求項11に記載の方 法。 14.前記分子の集団が、ファージディスプレイライブラリーを含む、請求項1 1に記載の方法。 15.請求項11に記載の方法を用いて単離される、Neisseria meningitidis血 清型B(MenB)の独特のエピトープの分子模倣物。 16.請求項1に記載の抗体分子を用いて産生される抗イディオタイプ抗体分子 から構成される、Neisseria meningitidis血清型B(MenB)の独特のエピトープ の分子模倣物。 17.Neisseria meningitidis血清型B(MenB)の独特のエピトープの分子模倣 物であって、配列番号1〜66、および配列番号67からなる群から選択される配列 に実質的に相同であるアミノ酸配列を有するペプチドから構成される、分子模倣 物。 18.前記模倣物が、配列番号8に実質的に相同であるアミノ酸配列を有するペ プチドから構成される、請求項17に記載の模倣物。 19.Neisseria meningitidis血清型B(MenB)の独特のエピトープを、薬学的 に受容可能な賦形剤と組み合わせて含む、ワクチン組成物。 20.Neisseria meningitidis血清型B(MenB)の独特のエピトープの分子模倣 物を、薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて含む、ワクチン組成物。 21.前記分子模倣物が、抗イディオタイプ抗体分子を含む、請求項20に記載 のワクチン組成物。 22.前記分子模倣物が、核酸分子を含む、請求項20に記載のワクチン組成物 。 23.前記分子模倣物が、ペプチド分子を含む、請求項20に記載のワクチン組 成物。 24.前記ペプチド分子が、配列番号1〜66、および配列番号67からなる群から 選択される配列に実質的に相同であるアミノ酸配列を有する、請求項23に記載 のワクチン組成物。 25.前記エピトープが、キャリア分子に共有結合している、請求項19に記載 のワクチン組成物。 26.前記分子模倣物が、キャリア分子に共有結合している、請求項20に記載 のワクチン組成物。 27.前記ペプチド分子が、キャリア分子に共有結合している、請求項23に記 載のワクチン組成物。 28.アジュバントをさらに含む、請求項19に記載のワクチン組成物。 29.アジュバントをさらに含む、請求項20に記載のワクチン組成物。 30.哺乳動物被験体において、Neisseria meningitidis血清型Bおよび/また はE.coli K1疾患を予防するための方法であって、該被験体に請求項19に記載 のワクチンの有効量を投与する工程を包含する、方法。 31.哺乳動物被験体において、Neisseria meningitidis血清型Bおよび/また はE.coli K1疾患を予防するための方法であって、該被験体に請求項20に記載 のワクチンの有効量を投与する工程を包含する、方法。 32.哺乳動物被験体において、Neisseria meningitidis血清型Bおよび/また はE.coli K1疾患を予防するための方法であって、該被験体に請求項23に記載 のワクチンの有効量を投与する工程を包含する、方法。 33.請求項1に記載の抗体を、薬学的に受容可能なビヒクルと組み合わせて含 む、薬学的組成物。 34.哺乳動物被験体において、Neisseria meningitidis血清型Bおよび/また はE.coli K1疾患を処置または予防するための方法であって、該被験体に請求項 33に記載の薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。
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