JP4295431B2 - 髄膜炎菌性bエピトープの分子模倣物 - Google Patents
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Description
(技術分野)
本発明は、概して細菌病原体に関する。特に、本発明は、自己免疫活性を欠く抗MenB抗体を用いて同定された、Neisseria meningitidis血清型B(MenB)エピトープの分子模倣物に関する。
【0002】
(発明の背景)
Neisseria meningitidisは、細菌性髄膜炎および敗血症の原因因子である。髄膜炎菌は、莢膜および細胞壁の抗原の免疫学的特徴に基づいて血清学的群に分けられる。現在認識されている血清型には、A、B、C、D、W−135、X、Y、Z、および29Eが含まれる。血清型特異性を担うポリサッカライドは、いくつかのこれらの群(A、B、C、D、W−135、およびYを含む)から精製されている。
【0003】
N. meningitidis血清型B(「MenB」)は、合衆国およびヨーロッパに居住する乳児および小児における細菌性髄膜炎の約50パーセントを占める。この生物はまた、若年成人に致死的な敗血症を引き起こす。青年において、外膜タンパク質(OMP)粒子からなる実験的MenBワクチンが、約50%防御的であることが見出されている。しかし、防御は、ワクチン接種された幼児および小児(疾患の最も大きな危険にある年齢群)において観察されていない。さらに、OMPワクチンは、血清型特異的かつサブタイプ特異的であり、そして優勢なMenB株は、地理的および時間的変化の両方を受け、このようなワクチンの有用性を制限する。
【0004】
莢膜ポリサッカライドに基づく有効なワクチンは、血清型A、C、Y、およびW135によって引き起こされる髄膜炎菌性疾患に対して開発されている。しかし、MenBポリサッカライドワクチンを開発する類似の試みは、莢膜MenBポリサッカライド(本明細書中で、「MenB PS」と呼ばれる)の乏しい免疫原性に起因して失敗している。MenB PSは、(N−アセチル(α2→8)ノイラミン酸のホモポリマーである。Escherichia coli K1は、同一の莢膜ポリサッカライドを有する。MenB PSによって惹起される抗体は、宿主のポリシアル酸(PSA)と交叉反応する。PSAは、胎児および新生児組織において豊富に、特に脳組織中に見出される神経細胞接着分子(「NCAM」)上で発現される。PSAはまた、腎臓、心臓、および嗅神経を含む成人組織においてより低い程度にまで見出される。従って、ほとんどの抗MenB PS抗体もまた、自己抗体である。それゆえ、このような抗体は、胎児発達に有害に影響を与えるか、または自己免疫疾患を導く能力を有する。
【0005】
MenB PS誘導体は、MenB PSの不良な免疫原性を回避するための試みにおいて調製されている。例えば、C3〜C8 N−アシル置換MenB PS誘導体が記載されている。Jenningsらに対するEP公開第504,202Bを参照のこと。同様に、Jenningsらに対する米国特許第4,727,136号は、N−プロピオン化MenB PS分子(本明細書中で「NPr−MenB PS」と呼ばれる)を記載する。NPr−MenB PS複合糖質で免疫したマウスは、IgG抗体の高力価を誘発すると報告された。Jenningsら(1986)J. Immunol.137:1708。ウサギにおいて、抗体の2つの異なる集団(2つの異なるエピトープに結合し、1つは天然のMenB PSにより共有されていて、1つは共有されていないと報告されている)が、誘導体を用いて産生された。殺菌活性が、MenB PSと交叉反応しなかった抗体集団において見出された。Jenningsら(1987)J. Exp. Med. 165:1207。この結合体によって惹起された防御的抗体と反応する細菌表面のエピトープの同一性は、未知なるままである。
【0006】
ペプチドは、ポリサッカライド特異的抗体、および他のポリサッカライド結合タンパク質に結合することによってポリサッカライドの模倣物として作用し得る。例えば、コンカナバリンA(ConA)(これは、末端α連結マンノースまたはグルコース残基を有するオリゴサッカライドに結合する)は、pIIIコートタンパク質のアミノ末端に短いペプチド配列を有する細菌性ファージのランダムライブラリー由来のペプチド模倣物を選択するために使用されている。Oldenbergら(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393; Scottら(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5398。同様に、モノクローナル抗体は、ファージライブラリー由来の腺ガン細胞の表面上に存在する炭水化物のペプチド模倣物を同定した。Hoessら(1993)Gene 128:43。
【0007】
ペプチドは、ポリサッカライド特異的抗体もまた惹起し得る。例えば、Westerinkら(1988)Infect. Immun. 56:1120は、N. meningitidis血清型C(「MenC」)莢膜ポリサッカライドに対するモノクローナル抗体を、抗イディオタイプ抗体を惹起するために使用した。抗イディオタイプ抗体で免疫したマウスは、致死的用量のMenC細菌での感染から防御された。これらの実験者らは、引き続き、MenC抗イディオタイプ抗体のペプチドフラグメントが血清抗MenC抗体を誘発し、そして動物をMenC細菌での致死的抗原投与後の菌血症および死から防御することを示した。Westerinkら(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4021。
【0008】
しかし、現在までに、このようなアプローチはMenBワクチンの開発に関して採用されていない。MenBに対する安全でかつ効果的なワクチンの産生が特に望ましいことは、容易に明白である。
【0009】
(発明の要旨)
共有に係る米国特許出願第08/925,002(1997年8月27日出願)において、MenB PS誘導体に対して指向される、多数の機能的に活性な抗体が記載されている。これらの抗体は、宿主組織とは交叉反応しないか、または最小限に交叉反応性であり、従って、自己免疫疾患を惹起するリスクを最小限に提起し、そして本明細書において「非自己反応性」と称する。これらの非自己反応性抗体を本明細書において使用して、ワクチン組成物において使用され得る独特なMenB PSエピトープの分子模倣物を同定する。
【0010】
従って、1つの実施態様において、本発明は、MenB PSの独特なエピトープの分子模倣物に関する。これらの分子模倣物は、宿主組織に対して、交叉反応しないかまたは最小限に交叉反応性であるMenB PS誘導体に対して指向された、機能的に活性な抗体を用いて同定された、新規の化合物からなる。このような新規の分子模倣物は、以下の構造1に代表される:
【0011】
【化23】
【0012】
を有し、ここで:
R1は−NR5R6であり;
R2は−(CH2)p−R11であり、ここでpは0〜8の整数であり;
R3はH、1−6Cアルキル、アリール、アルキルアリール、1−6Cアルケニル、および1−6Cアルキニルであり;
R4は、−NH2、−NHOH、−NHNH2、−OH、−SHまたは以下からなるアミンの群より選択される多価リンカー部分であり:アミノ酸、ペプトイド、ペプチド、および−NH(CH2)qSHであり、ここでqは1〜5の整数であり;
R5は、R2、Hであるか、またはR5およびR6は一緒になって炭素環式またはアリール環を形成し、上記環が必要に応じてN、O、およびSからなる2つまでのヘテロ原子を含み;
R6は、−CO−(CH2)m−R7であり、ここでmは1〜6の整数であり;
R7は、
【0013】
【化24】
【0014】
であり、ここで、nは0〜5の整数であり;
R8は、H,1−3Cアルキルおよびアシルであり;
R9は、−NH2、−NH−NH2、−CONH2、アシル、−COOH、−SH;−S−アルキル、−S−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドであって、ここでn=0のときR9は−NH−NH2ではなく;
R10は、H、1−6Cアルキル、ハロゲン、OH、1−6Cアルコキシ、アシル、アミノ、1−5Cアルキルアミノ、アミド、−COOH、−SH、−S−アルキル、−S−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドであり;そして
R11は、必要に応じて置換されている炭素環式環もしくはアリール、−CH=CH−(CH2)p−CH3、−CF3、−OH、1−6Cアルコキシ、アシル、アミノ、−N(CH3)2、−NH−NH2、アミド、−COOH、−SH;−S−アルキル、−S−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドである。
【0015】
好ましい実施態様において、本発明の分子模倣物は、以下の構造に代表される:
【0016】
【化25】
【0017】
を有し、ここで
XはO、N、SまたはCH2であり;R3はHまたはアルキルであり;R4は−NH2、−NHOH、−NHNH2、−OHまたは−SHであり、そしてp=0〜3である;
【0018】
【化26】
【0019】
を有し、ここで、
XはO、N、SまたはCH2であり;R3はHまたはアルキルであり;R4は−NH2、−NHOH、−NHNH2、−OHまたは−SHであり、そしてp=0〜3である;
【0020】
【化27】
【0021】
を有し、ここで、
XはO、N、SまたはCH2であり;R3はHまたはアルキルであり;R4は−NH2、−NHOH、−NHNH2、−OHまたは−SHであり、そしてp=0〜3である;
【0022】
【化28】
【0023】
および
【0024】
【化29】
【0025】
を有し、ここで、
XはO、N、SまたはCH2であり;R3はHまたはアルキルであり;R4は−NH2、−NHOH、−NHNH2、−OHまたは−SHであり、R8はHまたはCOCH3であり;そしてp=0〜3であり;そして
R9は−COOH、−NH2、−NHNH2または
【0026】
【化30】
【0027】
である;
【0028】
【化31】
【0029】
および
【0030】
【化32】
【0031】
を有し、ここで、
XはO、N、SまたはCH2であり;R3はHまたはアルキルであり;R4は−NH2、−NHOH、−NHNH2、−OHまたは−SHであり、R8はHまたはCOCH3であり;そしてp=0〜3であり;そして
R9は−COOH、−NH2、−NHNH2または
【0032】
【化33】
【0033】
である。
【0034】
別の実施態様において、本発明は、上記に記載のような、MenBの独特なエピトープの分子模倣物を、薬学的に受容可能な賦形剤とともに含む組成物に関する。
【0035】
別の実施態様において、本発明は、哺乳動物被験体において、MenBおよび/またはE.coli K1疾患を、予防するための方法であって、上記組成物の有効量を上記被験体に投与する工程を包含する、方法に関する。
【0036】
別の実施態様において、本発明は、Neisseria meningitidis血清型B(MenB)の独特なエピトープの分子模倣物を単離するための方法に関し、上記方法は:
(a)MenBの独特なエピトープの推定分子模倣物を含む分子の集団を提供する工程;
(b)上記集団を、Neisseria meningitidis血清型B莢膜ポリサッカリド(MenB PS)に対して指向され、そして自己反応性ではない抗体と、ELISAにおいて接触させる工程であって、上記接触させる工程を、上記抗体と、存在する場合上記分子との間の免疫学的結合を可能にして複合体を提供する条件下で実施する、工程;ならびに
(c)該複合体を、上記結合していない分子から分離する工程、
を包含する。
【0037】
別の実施態様において、本発明は、Neisseria meningitidis血清型Bおよび/またはE.coli K1抗体を、生物学的サンプル中で検出するための方法であって、上記方法は以下の工程:
(a)生物学的サンプルを提供する工程;
(b)上記生物学的サンプルと、本発明の分子模倣物とを、Neisseria meningitidis血清型Bおよび/またはE.coli K1抗体が、上記生物学的サンプル中に存在するときに、上記分子模倣物に結合して、抗体/模倣物複合体を形成することを可能にする条件下で、反応させる工程;ならびに
(c)上記複合体の存在または非存在を検出し、それにより、上記サンプル中でのNeisseria meningitidis血清型Bおよび/またはE.coli K1抗体の存在または非存在を検出する工程、を包含する方法に関する。
【0038】
本発明のこれらおよび他の実施態様は、本明細書における開示を参照すれば、当業者は容易に実施する。
【0039】
(発明の詳細な説明)
本発明の実施は、他に示さなければ、当該分野の技術内の免疫学、微生物学、および分子生物学の従来の方法を用いる。このような技術は、文献において十分に説明される。例えば、Sambrookら Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第2版、1989);MorrisonおよびBoyd、Organic Chemistry(第3版、1973);CareyおよびSundberg、Advanced Organic Chemistry(第2版、1985);Smith、M.B.、Organic Synthesis(1994);Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning(1984);およびHandbook of Experimental Immunology、I〜IV巻(D.M. WeirおよびC.C. Blackwell編、1986、Blackwesll Scientific Publication)を参照のこと。
【0040】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形態「a」、「an」、および「the」は、他にその内容が明確にそうではないことを意味するものでないときは、複数の言及を含む。
【0041】
(定義)
本発明を記載するにおいて、以下の用語が用いられ、そして以下に示すように定義されることが意図される。
【0042】
本明細書中で使用される場合「MenB PS誘導体」とは、MenBの天然の莢膜ポリサッカライドの化学的改変によって得られた分子をいう。このようなMenB PS誘導体は、適切なアシル基(例えば、C3〜C8およびより高級なアシル基(ここで用語「アシル基」は任意のアシル化された直鎖状分子、分枝状分子、脂肪族分子、または芳香族分子を含む))との、天然の分子のシアル酸残基N−アセチル基の置換によって改変されているMenB PS分子を含むが、これらに限定されない。本明細書中での使用に対して特に好ましいMenB PS誘導体は、天然のMenB PSのN−アセチル基についてのN−プロピオニル基での置換を含む(本明細書中で「NPr−MenB PS」と称する)。N−アシル置換MenB PS誘導体(NPr−MenB PSを含む)を合成するための方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、Jenningsらの米国特許第4,727,136号およびさらにJenningsらのEP公開番号第504,202 B号に記載される。
【0043】
MenB PSまたはMenB PS誘導体の「分子模倣物」とは、MenB細菌上に発現される少なくとも1つの「独特の」エピトープを機能的に模倣する分子である。「独特のエピトープ」は、宿主組織のポリシアル酸と交叉反応しない(それゆえ自己免疫活性を欠く)か、または最少に交叉反応するかのいずれかである機能的に活性な(例えば、オプソニン媒介性殺菌および/または補体媒介性殺菌)抗MenB抗体の形成を惹起し得るエピトープである。このような分子模倣物は、ワクチン組成物において有用であり、そして以下でさらに記載される診断的な適用または治療的適用のための抗体の惹起において有用である。分子模倣物には、小有機化合物;核酸および核酸誘導体;サッカライドまたはオリゴサッカライド;ペプチド、タンパク質、およびそれらの誘導体を含むペプチド模倣物(例えば、非ペプチド有機部分を含むペプチド、アミノ酸および/またはペプチド結合を含んでもよいし、含まなくてもよいが、ペプチドリガンドの構造的特徴および機能的特徴を保持する合成ペプチド);ピロリジン;N−置換グリシンを含む分子であるペプトイドおよびオリゴペプトイド(例えば、Simonら(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367に記載されるペプトイドおよびオリゴペプトイド));ならびに抗体(これは、抗イディオタイプ抗体を含む)が挙げられるが、これらに限定されない。分子模倣物の同定および生成のための方法は、以下により十分に記載される。
【0044】
用語「アルキル」とは、本明細書において使用される場合、1〜24炭素原子の、分枝もしくは分枝していない、飽和炭化水素基(例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、t−ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなど)、ならびに環式アルキル基(例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなど)をいう。本明細書において、好ましいアルキル基は、1〜12炭素原子を含み、そして最も好ましいアルキル基は、1〜6炭素原子を含む。さらに、これらの基は、必要に応じて、1以上のアルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、アミド、ハロゲン、ニトロ、アシル、カルボキシル、チオール、スルホン酸、スルホンアミドなどにより置換されている。
【0045】
用語「アルケニル」とは、本明細書において使用される場合、2〜24炭素原子の、分枝もしくは分枝していない、少なくとも1つの二重結合を含む炭化水素基(例えば、エテニル、n−プロペニル、イソプロペニル、n−ブテニル、イソブテニル、t−ブテニル、オクテニル、デセニル、テトラデセニル、ヘキサデセニル、エイコセニル、テトラコセニル)、ならびに3〜8、好ましくは5または6の炭素原子の環式アルケニル基などをいう。本明細書において、好ましいアルケニル基は、1〜12炭素原子を含み、そして最も好ましいアルケニル基は、1〜6炭素原子を含む。さらに、これらの基は、必要に応じて、1以上のアルキル、アルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、アミド、ハロゲン、ニトロ、アシル、カルボキシル、チオール、スルホン酸、スルホンアミドなどにより置換されている。
【0046】
用語「アルキニル」とは、本明細書において使用される場合、2〜24炭素原子の、分枝もしくは分枝していない、少なくとも1つの三重結合を含む炭化水素基(例えば、エチニル、n−プロピニル、イソプロピニル、n−ブチニル、イソブチニル、t−ブチニル、オクチニル、デシニル)などをいう。本明細書において、好ましいアルキニル基は、1〜12炭素原子を含み、そして好ましくは、1〜6炭素原子を含む。さらに、これらの基は必要に応じて上記のように置換されている。
【0047】
用語「アリール」とは、本明細書において使用される場合、必要に応じて1以上のへテロ原子(例えば、N、O、およびS)を含む、5員環、6員環または7員環を含む、モノ、ビ、トリおよびテトラ環式芳香族種をいう。例は、以下を含むがこれらに限定されない:フェニル、ベンジル、ナフチル、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、プリン、キノリン、イソキノリン、カルバゾール、フェナントレン、アントラセン、ベンゾピレン、アズレン、インドール、インダンなど。さらに、これらの基は必要に応じて上記のように置換されている。
【0048】
用語「アルキルアリール」とは、本明細書において使用される場合、アルキルに結合したアリール環をいい、ここで用語アルキルおよびアリールは上記のとおりである。
【0049】
用語「炭素環式環」とは、本明細書において使用される場合、上記に記載のようにシクロアルキル、シクロアルケニル、およびシクロアルキニルをいい、必要に応じて、1以上のへテロ原子(例えば、N、OおよびS)を含む。さらに、これらの基は、必要に応じて、上記のように置換されている。
【0050】
用語「アルコキシ」とは、本明細書において使用される場合、単一の末端エーテル結合を介して結合したアルキル基を意図する。すなわち、「アルコキシ」基は、ORとして規定され、ここでRは上記に規定のようなアルキルである。好ましい実施態様において、アルコキシ基は、1〜6の、より好ましくは1〜4の炭素原子を含有する。
【0051】
用語「アシル」とは、分子置換基RCO−をいうためにその従来の意味で用いられ、ここでRは上記に規定されるようなアルキルである。好ましい実施態様において、アシル基は、1〜6、より好ましくは1〜4の炭素原子を含むアルキルを含む。
【0052】
用語「ペプトイド」とは、本明細書において使用される場合、N置換されたグリシンのオリゴマーを含み、そして用語オリゴマーN置換グリシン(NSG)と交換可能に使用される。
【0053】
用語「多価リンカー部分」とは、任意の適切なまたは結合可能な部分に結合され得る、任意の適切なリンカーを表し、これは、セラミドまたはタンパク質もしくはペプチド(多重抗原ペプチドを含む)を含み、そして好ましくは、その上に反応基を有する、他の分子(例えば、分子模倣物など)と共有結合を可能にする基である。
【0054】
用語「抗体」は、ポリクローナル抗体調製物およびモノクローナル抗体調製物ならびにハイブリッド抗体、変化された抗体、F(ab’)2フラグメント、F(ab)分子、Fvフラグメント、ファージ上に提示された単鎖フラグメント可変物(scFv)、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、およびもとの抗体分子の免疫学的結合特性を示すそれらの機能的なフラグメントを含む調製物を含む。
【0055】
本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、均質な抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、それが作製される様式によって限定されない。この用語は、免疫グロブリン分子全体ならびにFab分子、F(ab’)2フラグメント、Fvフラグメント、ファージ上に提示された単鎖フラグメント可変物(scFv)、およびもとのモノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示す他の分子を含む。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は当該分野で公知であり、そして下記により十分に記載される。
【0056】
「抗原」は、本明細書において、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の物質を含むと規定される。「免疫原」は、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原である。
【0057】
「エピトープ」とは、特定のB細胞およびT細胞が応答する抗原上の部位をいう。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用される。タンパク質、ポリサッカリドもしくは他の生体高分子上のB細胞エピトープ部位は、その高分子の異なる部分からの部分から構成され得、これらは折り畳みによって一緒にされている。この種のエピトープは、立体配座的または不連続エピトープといわれる。なぜなら、この部位は、線形な順序で不連続であるが、折り畳まれた立体配座において連続であるポリマーのセグメントから構成されるからである。生体高分子もしくは他の分子の単一のセグメントから構成されるエピトープは、連続もしくは線形的エピトープといわれる。T細胞エピトープは一般的に線形ペプチドに限定される。ペプチドエピトープは、そのエピトープに独特な空間的コンフォメーション中に3つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも5つのこのようなアミノ酸からなり、より通常には少なくとも8〜10のこのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は当該分野で公知であり、そして例えば、X線結晶学、および2次元核磁気共鳴分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、Geysenら(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998(所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法);米国特許第4,708,871号(抗原のエピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順);およびGeysenら(1986)Molecular Immunology 23:709(所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技術)を参照のこと。同じエピトープを認識する抗体が、単純な免疫アッセイにおいて同定され得る。この単純な免疫アッセイは、ある抗体が標的抗原に対する別の抗体の結合をブロックする能力を示す。
【0058】
「独特のMenBエピトープ」は、本明細書において、MenB細菌上に存在するエピトープと規定される。ここで、このエピトープを指向する抗体はMenBに特異的に結合し得、そして宿主組織の表面上に存在するシアル酸残基と交叉反応しないか、または最小限に交叉反応する。従って、1つ以上の「独特のMenBエピトープ」を含むか、または模倣する免疫原は、MenB疾患の予防のためのワクチンにおいて有用であり、そして自己免疫応答を惹起しないか、または自己免疫応答を惹起する最少の危険を与える。
【0059】
本明細書中に記載されるアッセイを使用して決定される、MenBに対する補体媒介性殺菌活性および/またはオプソニン活性を抗体分子が示す場合、その抗体はMenB生物に対する「機能的な活性」を示す。
【0060】
本明細書中に記載される結合アッセイを使用して決定される、宿主組織中のポリシアル酸との交叉反応性免疫学的結合特性をその抗体が示さない場合、「独特の」MenBエピトープに対して特異的な抗体は、「自己免疫活性を欠き」、そして/または「自己反応性ではない」。
【0061】
本明細書中で記載される結合アッセイにおいてポジティブであるとみなされる公知の交叉反応性自己抗体と比較して、宿主組織のポリシアル酸への結合を示すのに約10倍高い抗体濃度を、その抗体が必要とする場合、「独特の」MenBエピトープに対して特異的な抗体は「最小限に自己反応性」を示し、そして/または「最小限に自己反応性」である。
【0062】
本明細書中で使用される用語「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」は、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンが特異的である抗原との間に生じる非共有結合的な相互作用の型をいう。
【0063】
本明細書において使用される場合、「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された組織または液体のサンプルをいい、これらには、例えば、血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髄、胆汁、髄液、リンパ液、皮膚サンプル、皮膚、呼吸管、腸管および尿生殖管の外分泌物、涙、唾液、乳汁、血球、器官、生検を含むがこれらに限定されず、そしてまた、インビトロ細胞培養成分のサンプルは、培養培地中の細胞および組織(例えば、組換え細胞)の増殖/成長から得られた馴化培地および細胞成分を含む。
【0064】
本明細書において使用される場合、用語「標識」および「検出可能な標識」とは、検出可能な分子をいい、これは、放射性同位体、蛍光体、化学発光体、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、色素原、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド(例えば、ビオチンもしくはハプテン)などを含むがこれらに限定されない。用語「蛍光体」とは、検出可能な範囲内で蛍光を示し得る物質もしくはその一部をいう。本発明のもとで使用され得る標識の特定の例は、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン(umbelliferone)、テキサスレッド、ルミノール、NADPHおよびα−β−ガラクトシダーゼを含む。
【0065】
(発明を実施する形態)
本発明は、Neisseria meningitidis血清型B(MenB)の独特なエピトープの分子模倣物の発見(これは、MenBに対して指向された機能的抗体を用いて同定された)に基づく。抗体は、宿主組織中のポリシアル酸と交叉反応しないか、または最小限に交叉反応性であり、それゆえ、この抗体は、宿主組織と高度に交叉反応性である抗体よりも自己免疫活性を惹起する危険性が低い。この模倣物を診断試薬として使用し、そして/または、MenBおよびE.coli K1疾患を予防するための組成物に使用し得る。
【0066】
上記で説明されるように、MenBの天然の莢膜ポリサッカライド(本明細書中で「MenB PS」という)は、ヒトおよび他の哺乳動物被験体において不免疫原性に乏しい。さらに、天然のMenB PSは、自己抗体の産生を惹起し得、それゆえ、ワクチン組成物における使用には不適切であり得る。従って、本発明は、MenB PS誘導体に対して調製された抗体を使用する。これらの抗体は、MenB細菌に対する機能活性(ここで、この機能活性はMenB疾患に対する防御を付与することにおいて重要である)を示すそれらの能力に基づいて選択される。この抗体はまた、最小限または検出不可能な自己免疫活性を示すことに基づいて選択された。
【0067】
より詳細には、MenB PS誘導体は、本発明の分子模倣物を同定するために使用される抗体分子を得るために調製された。この誘導体は、一般に、天然の分子のシアル酸残基N−アセチル基のC3〜C8アシル置換体を含む。特に好ましいMenB PS誘導体は、天然MenB PSのN−アセチル基についてのN−プロピオニル基の置換を含み、これは、本明細書中で「NPr−MenB PS」という。Men PS誘導体を合成するためのこのような誘導体および方法は、例えば、米国特許第4,727,136号およびEP公報第504,202 B号(両者ともJenningsら)に記載される。
【0068】
C3〜C8アシル誘導体は、まず天然のMenB(例えば、N. meningitidis培養物から得られる)を強塩基の存在下で処置して定量的にN−アセチル基を除去し、そしてこの分子のシアル酸残基部分内の反応性アミン基を提供することにより作製され得る。次いで、脱アシル化MenB PSフラグメントはN−アセチル化される。例えば、NPr−MenB PSの場合、脱アシル化分子は、米国特許第4,727,136号(Jenningsら)に記載されるように、無水プロピオン酸または塩化プロピオニルのようなプロピオニル基の供給源を用いてN−プロピオニル化される。N−アセチル化の程度は、例えば、NMR分光学を用いて決定され得る。一般に、反応条件は、N−アセチル化の程度が少なくとも約80%であるように選択される。
【0069】
MenB PS誘導体の免疫原性を増大させるために、誘導体を適切なキャリア分子に結合させて複合糖質を提供し得る。詳細には、十分に規定されそして制御された構造的立体配置を有するN−アセチル化MenB PS複合糖質調製物は、以下に記載のように、中間サイズのN−アセチル化MenBオリゴサッカライドから形成され得る。
【0070】
従って、N−アセチル化MenB PS複合糖質の一群(その一例は、本明細書中で「CONJ−2」といわれる)は、以下のように調製され得る。例えば、NMR分析により決定される場合、実質的に100%のN−アシル化シアル酸残基を有するN−アシル化MenB PS調製物は、緩和な酸性条件下で断片化され、種々の大きさのオリゴサッカライド分子の集団を提供し得る。断片化産物は、例えば、標準的なイオン交換クロマトグラフィー技術を、例えば段階的塩濃度勾配と組合せて使用してサイズ分画され、同質のサイズのN−アシル化MenB分子の画分を提供する。中間サイズのオリゴサッカライドを含む画分(例えば、約5〜約22、好ましくは10〜約20、そしてより好ましくは約12〜約18の平均Dpを有する)は、非還元末端において化学的に末端活性化され、そして還元的アミノ化技術によりタンパク質キャリアに結合され、CONJ−2複合糖質を提供する。首尾良い複合体化は、例えば、ゲル濾過により決定され得、そして最終のサッカライドのタンパク質に対する比率(w/w)は、呈色アッセイにより評価され得る。
【0071】
次いで、MenB PS誘導体(例えば、CONJ−2)から形成される複合糖質を、本明細書中で使用して免疫化宿主における抗サッカライド抗体の形成を惹起する。このような抗体のサブセットは、本明細書中に記載される結合アッセイを用いて決定される場合、MenB細菌に結合するはずであるか、宿主組織シアル酸残基と交叉反応しないはずであるか、または最小限に交叉反応性であるはずである。抗体は、アイソタイプ、精緻な抗原特異性、機能活性、および宿主組織との交叉反応性に関して十分に特徴づけられ得る。
【0072】
例えば、哺乳動物被験体(簡便には、齧歯類およびウサギのような標準的な実験動物)は、複合糖質を含む組成物を、適切なアジュバントと共に免疫してポリクローナル血清の産生を惹起し得る。動物の群は、一般に、その組成物で免疫化され、そして何回か追加免疫される。免疫化された動物由来の抗血清が得られ得、そして宿主組織と交叉反応しないポリクローナル血清は、インサイチュ吸着または従来のアフィニティークロマトグラフィー技術を用いて得られ得る。首尾良い複合糖質抗原は、T細胞依存性抗原の特徴である、実質的なIgG抗MenB PS誘導体−抗体応答を惹起するそれらの能力により同定され得る。高度に免疫原性であり、そして主にIgG抗体を産生することが見い出されている複合体は、本発明の方法における使用について特に好ましい。
【0073】
細菌性抗血清の形成を惹起し得るMenB PS誘導体は、モノクローナル抗体の産生における使用に適している。より詳細には、種々のMenB PS誘導体結合体を提供するために使用されるプロセスは、MenB生物の表面に見い出されるエピトープを模倣し、そして宿主において最小限に発現される独特のサッカライド関連エピトープを提示する優れた免疫原を産生するために設計される。従って、本明細書中に記載されるMenB PS誘導体は、抗MenBワクチンについての独特のエピトープを提供するMenBポリサッカライド抗原の模倣物について検索するのに使用されるMenB特異的な抗体の産生を惹起し得る。
【0074】
従って、本発明の実施において、選択されたMenB誘導体を使用して、モノクローナル抗体およびその機能的等価物を提供する。本明細書中において使用される、特定のモノクローナル抗体に関する用語「機能的等価物」は、以下である分子を意味する:(a)例示的なモノクローナル抗体を交叉ブロックする;(b)問題のMenB PS誘導体または複合糖質に選択的に結合する;(c)本明細書中に記載される結合アッセイを用いて決定される場合、宿主PSA(および、必要に応じて、以下に記載される標準的なアッセイにより決定される場合、MenB細菌性細胞に対する活性(例えば、補体媒介性殺菌活性および/またはオプソニン活性))とは交叉反応しないか、または最小限に交叉反応する。さらに、本発明の特定のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関して本明細書中において使用される場合、用語「子孫」は、世代または核型の同一性に係わらず、親により産生されるモノクローナル抗体を産生する、親のハイブリドーマのすべての誘導体、子孫(issue)、子孫(offspring)を含むことが意図される。
【0075】
モノクローナル抗体は、当該分野で周知の標準的な技術(例えば、KohlerおよびMilstein, Nature(1975)256:495)の方法によって、またはその改変(例えば、Buckら(1982)In Vitro 18:377により記載される))を使用して調製される。代表的には、マウスまたはラットを、タンパク質キャリアに結合しているMenB PS誘導体で免疫し、追加免疫し、そして脾臓(および必要に応じていくつかの大きなリンパ節)を取り出し、そして単一細胞に解離する。所望であれば、脾臓細胞は、細胞懸濁液を抗原でコートされたプレートまたはウェルに適用することにより、スクリーニングされ得る(非特異的接着細胞の除去後)。抗原に特異的な膜結合型イムノグロブリンを発現するB細胞がプレートに結合し、そして懸濁液の残渣とともにはリンス除去されない。次いで、得られたB細胞、またはすべての剥離した脾臓細胞を、ハイブリドーマを形成するためにミエローマ細胞と融合を誘発させる。ハイブリドーマ形成(hybridization)における使用のための代表的なマウスミエローマ株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)から入手可能なミエローマ株を含む。
【0076】
より詳細には、体細胞ハイブリッドは、Buckら(前出)の方法により、アザグアニン耐性非分泌マウスミエローマ細胞株P3X63−Ag8.653(ATCCから入手可能)を用いて調製され得る。ハイブリドーマ細胞株は、一般に限界希釈法によりクローン化され、そして免疫抗原に特異的に結合し、そして無関係の抗原に結合しない抗体の産生についてアッセイされる。次いで、選択されたモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマは、インビトロ(例えば、組織培養瓶または中空繊維反応器中)、またはインビボ(例えば、マウスの腹水)のいずれでも培養される。
【0077】
ハイブリドーマ上清は、例えば、免疫化MenB PS誘導体または天然のMenB PS(NAc−MenB PS)を用いる固相ELISAまたは間接免疫蛍光アッセイのいずれかを用いて、抗MenB PS誘導体反応性抗体についてアッセイされ得る。ハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体の選択性は、競合的特異的結合アッセイ(例えば、阻害ELISAなど)を用いて評価され得る。例えば、緩衝液か、または可溶性MenB PS誘導体もしくはNAc−MenB PSを含む緩衝液のいずれか中に希釈されている抗体分子は、結合したMenB PS誘導体の存在下でELISA容器中で反応される。洗浄後、結合抗体は、二次抗体としての標識抗Ig(抗IgM、IgGおよびIgA)により検出される。可溶性MenB PS誘導体により阻害される抗体は、特異的であると考慮され得、従ってさらなる研究(アイソタイプ決定および交叉反応性、機能活性および自己反応性についてのさらなるスクリーニングを含む)のために選択され得る。
【0078】
特に、部分精製したモノクローナル抗体分子は、その細胞表面上にポリシアル酸残基を発現する宿主細胞に結合するその能力について個々に評価され得る。このような細胞は、自己免疫活性を示す抗体の検出についての代理標的を代表する。1つの標的は、ヒト神経芽腫細胞株CHP−134(これは、Livingstonら(1988)J.Biol.Chem.263:9443に記載されるように、長鎖α2−8ポリシアル酸(NCAM)をその細胞表面上に発現する)を含む。また、Granoff、D.M.ら(1988)The J.of Immunology 160:5028−5036は、ヒトポリシアル酸とは交叉反応しない独特のMenB PSエピトープを規定する殺菌性モノクローナル抗体を記載する。他の適切な標的は、以下を含むがそれらに限定されない:新生児脳細胞、例えば腎臓、心臓および嗅覚神経由来の組織、培養伏在静脈内皮細胞、細胞傷害性Tリンパ球およびナチュラルキラー(NK)細胞。例えば、Brandonら(1993)、Intl.J.Immunopathology and Pharmacology 6:77を参照のこと。ハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体分子は、培養物中の適切な試験細胞集団に添加され得、そしてそのモノクローナル抗体の細胞標的に対する潜在的結合が、標識モノクローナルを用いて直接、または各々のモノクローナル抗体と特異的に反応する適切な標識二次試薬(例えば、StaphylococcusプロテインAおよびGならびに抗マウス抗体分子)を用いて間接的に、検出および定量され得る。試験宿主組織PSAと交叉反応しないか、または最小限の反応性を示す抗体は、本発明の目的について自己反応性とはみなされない。従って、これらの抗体は、さらなる使用に適切である。さらに、試験組織との結合(この結合は試験細胞のノイラミニダーゼでの前処理によっては影響されない)を示すいくつかの抗体もまた、さらなる使用に適切であり得る。このような抗体の自己反応性は、本明細書中で「不定な」と呼ぶ。
【0079】
機能活性は、補体媒介性殺菌活性および/またはオプソニン活性を評価することにより測定され得る。詳細には、抗体の補体媒介性殺菌活性は、Goldら(1970)Infect.Immun. 1:479、Westerinkら(1988)Infect.Immun. 56:1120、Mandrellら(1995)J.Infect.Dis.172:1279、およびGranoffら(1995)Clin.Diagn.Laboratory Immunol. 2:574により記載されるような標準的なアッセイを使用して評価され得る。これらのアッセイにおいて、N.meningitidisを、補体供給源とともに、および試験される抗体とともに反応させる。細菌計数を、種々の試料採取時間で行う。補体媒介性殺菌活性を実証するこれらの抗体は、0時間でのコロニー数と比較した場合、抗体および補体との60分間のインキュベーションの後に測定される生存細菌細胞数において最小50%の減少が実証される場合、本発明の目的上、細菌活性を示すとみなされ、そしてさらなる使用に適切である。
【0080】
補体媒介性溶菌は、浸潤性の髄膜炎菌性疾患に対する宿主保護を担う主要な機構であると考えられる。しかし、証拠は、オプソニン作用の重要な保護役割もまた支持する(例えば、Bjerknesら(1995)Infect.Immun. 63:160を参照のこと)。従って、本明細書中で産生される抗体のオプソニン活性は、機能活性を評価するための第二の手段として、または別の手段として、評価され得る。オプソニンアッセイからの結果は、殺菌性データを補充するために、および保護を与え得る抗体の選択を助けるために、使用され得る。オプソニン活性の評価はまた、本明細書中で、IgG1アイソタイプを有する本発明のマウスモノクローナル抗体の評価のために特に有用である。マウスIgG1は(ヒトIgG1と比較して)、補体の活性化に有効ではない。従って、マウスIgG1抗体は、上記のアッセイにおいて、MenBの補体媒介性溶菌を活性化しない。しかし、IgG1抗NPr−MenB PSモノクローナル抗体の機能活性は、補体の非存在下でのオプソニン作用により評価され得る。
【0081】
種々のオプソニンアッセイ方法が、当該分野で公知であり、そして本発明のモノクローナル抗体の機能活性を評価するために使用され得る。このような標準的なアッセイには、Sjursenら(1987)Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand.,C節 95:283、Halstensenら(1989)Scand. J. Infect. Dis. 21:267、Lehmannら(1991)APMIS 99:769、Halstensenら(1991)NIPH Annals 14:157、Fredlundら(1992)APMIS 100:449、Guttormsenら(1992)Infect. Immun. 60:2777、Guttormsenら(1993)J. Infec. Dis. 167:1314、Bjerknesら(1995)Infect. Immun. 63:160、Hayrinenら(1995)J. Infect. Dis. 171:1481、de Velascoら(1995)J. Infect. Dis. 172:262、およびVerheul, A.F.M.(1991)「Meningococcal LPS Derived Oligosaccharide−Protein Conjugate Vaccines,Immunochemical and Immunological Aspects」,Thesis,Utrecht University,The Netherlands, 112−135頁、によって記載されるものが含まれる。
【0082】
目的の選択されたモノクローナル抗体は、慣用の組織培養方法を用いてインビトロで、または哺乳動物被験体を用いてインビボで拡大され得る。例えば、プリスタン初回刺激マウスは、腹水生成のためにPBS中の対数期ハイブリドーマ細胞を、接種され得る。腹水液は、さらなる精製の前に、−70℃で貯蔵され得る。
【0083】
親のモノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示し得る抗体分子フラグメント(例えば、F(ab’)2、Fv、およびscFv分子)は、公知の技術を使用して生成され得る。Inbarら(1972)Proc. Nat. Acad. Sci.USA 69:2659;Hochmanら(1976)Biochem 15:2706;Ehrlichら(1980)Biochem 19:4091;Hustonら(1988)Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85(16):5879;ならびにHustonら、米国特許第5,091,513号および第5,132,405号;ならびにLadnerら、第4,946,778号。
【0084】
あるいは、インビトロでモノクローナル抗体分子集団を拡大するために、ファージ表示系が使用され得る。Saikiら(1986)Nature 324:163;Scharfら(1986)Science 233:1076;米国特許第4,683,195号および第4,683,202号;Yangら(1995)J Mol Biol 254:392;Barbas,IIIら(1995)Methods:Comp. Meth Enzymol 8:94;Barbas,IIIら(1991)Proc Natl Acad Sci USA 88:7978。
【0085】
一旦生成すると、ファージ表示ライブラリーは、公知の技術を使用して、Fab分子の免疫学的結合親和性を改良するために使用され得る。例えば、Figiniら(1994)J. Mol. Biol. 239:68を参照のこと。
【0086】
ファージ表示ライブラリーから選択されたFab分子の重鎖および軽鎖部分のコード配列は、単離または合成され得、そして発現のために任意の適切なベクターまたはレプリコンにクローン化され得る。例えば、細菌、酵母、昆虫、両生類、および哺乳動物系を含む任意の適切な発現系が使用され得る。細菌における発現系は、Changら(1978)Nature 275:615、Goeddelら(1979)Nature 281:544、Goeddelら(1980)Nucleic Acids Res. 8:4057、欧州出願第EP 36,776号、米国特許第4,551,433号、deBoerら(1983)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21−25、およびSiebenlistら(1980)Cell 20:269に記載されるものを含む。
【0087】
酵母における発現系は、以下に記載されるものを含む:
【0088】
【数1】
【0089】
昆虫における異種遺伝子の発現は、以下に記載されるように達成され得る:米国特許第4,745,051号、欧州出願EP127,839およびEP155,476、Vlakら(1988)J.Gen.Virol.69:765−776、Millerら(1998)Ann.Rev.Microbiol.42:177,Carbonellら(1988)Gene 73:409、Maedaら(1985)Nature 315:592−594、Lebacq−Verheydenら(1988)Mol.Cell.Biol.8:3129、Smithら(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8404、Miyajimaら(1987)Gene 58:273およびMartinら(1988)DNA 7:99。多数のバキュロウイルス株および改変体、ならびに宿主からの対応する許容性昆虫宿主細胞は、以下に記載される:Luckowら(1988)Bio/Technology6:47−55,Millerら(1986)GENERIC ENGINEERING、Setlow、J.K.ら(編),第8巻、Plenum Publishing、277−279頁、およびMaedaら、(1985)Nature315:592−594。
【0090】
哺乳動物発現は、以下に記載されるように達成され得る:Dijkemaら、(1985)EMBO J.4:761、Gormanら(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6777、Boshartら(1985)Cell 41:521、および米国特許第4,399,216号。哺乳動物発現の他の特徴は、以下に記載されるように容易にされ得る:Hamら(1979)Meth.Enz.58:44、Barnesら(1980)Anal Biochem.102:255、米国特許第4,767,704号、同第4,657,866号、同第4,927,762号、同第4,560,655号および米国再発行特許第RE30,985号および国際公開WO90/103430、WO87/00195。
【0091】
上記の本発明の抗MenB抗体は、MenBからの独特のエピトープの分子模倣物を同定するために、多様な分子ライブラリーをスクリーニングするためのレセプターとして簡便に使用される。分子ライブラリーにおいて模倣物を同定するための方法は、一般に1つ以上の以下の手順の使用を含む:(1)固定化標的レセプターでのアフィニティー精製;(2)可溶性レセプターの繋留リガンドへの結合;および(3)溶解性化合物を、抗原競合アッセイにおいて直接的に試験する工程、または生物学的活性について試験する工程。分子模倣物についてスクリーニングされた分子には、小さな有機化合物、有機化合物のコンビナトリアルライブラリー、核酸、核酸誘導体、糖類またはオリゴ糖、ペプトイド、溶解性ペプチド、固相上に繋留されたペプチド、細菌性ファージ表面タンパク質上に提示されるペプチド、細菌性表面タンパク質または抗体、および/または非ペプチド有機部分を含むペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【0092】
例えば、多様な分子種のライブラリーは、コンビナトリアル有機合成を用いて作製され得る。例えば、Gordonら(1994)J. Med. Chem. 37:1335を参照のこと。例えば、ピロリジン、オリゴカルバメート(Choら(1993)Science 261:1303);N−置換グリシンポリマーのようなペプトイド(Simonら(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367);およびビニル性のポリペプチド(Hagiharaら(1992)J. Am. Chem. Soc. 114:6568)が含まれるが、これらに限定されない。
【0093】
当該分野で公知の種々のアプローチが、合成の間にビルディングブロックが加えられる際に、ビルディングブロックを探知するために使用され得、その結果個々のライブラリーメンバーの動作記録が測定され得る。これらのアプローチには、写真平板チップ上のアドレス可能な部位(オリゴカルバメート)、逆重畳積分ストラテジー(ここで、「ヒット」は、部分的な合成ライブラリー(ペプトイド、ペプチド)へのモノマーの再帰性付加を介して同定される)、およびヌクレオチド(Nielsenら(1993)J. Am. Chem. Soc. 115:9812)または他の有機部分(Ohlmeyerら(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922)(「タグ」)の別々の合成によりコンビナトリアルライブラリーをコードすることが含まれる。次いで、各ライブラリーメンバーと結合したコード化タグは、模倣物が選択された後に解読(デコード)され得る。例えば、核酸タグは、DNA配列決定により解読され得る。
【0094】
ペプトイドコンビナトリアルライブラリーは、独特なMenBエピトープの分子模倣物を同定するために特に有用である。ペプトイドは、N−置換グリシンのオリゴマーであり(Simonら(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367)、そして新規の分子の化学的に多様なライブラリーを作製するために使用され得る。モノマーは、t−ブチル−ベース側鎖および9−フルオレニル−メトキシ−カルボニルα−アミン保護を組み込み得る。ペプトイドオリゴマーへのモノマーの集合は、例えば、Zuckermannら(1992)J. Am. Chem. Soc. 114:10646の「サブモノマー法」を用いて、固相上で行われ得る。この方法において、合成は、Rinkアミドポリスチレン樹脂を用いて行われる(Rinkら(1987)Tetrahedron Lett. 28:3787)。樹脂結合アミンは、ジイソプロピルカルボジイミドでのブロモ酢酸のインサイチュ活性化によってブロモアセチル化される。続いて、樹脂結合ブロモアセトアミドはアミンの付加により置換される。このアミンは、さらなる反応基のt−ブチルベース保護を組み込み得る。この2工程サイクルは、所望の数のモノマーが付加されるまで、繰り返される。次いで、オリゴペプチドは、95%トリフルオロ酢酸/5%水での処理により樹脂から遊離される。好ましくは、合成は、ロボットの合成機を用いて行われる。例えば、Zuckermannら(1992)Pept. Protein Res. 40:498およびZuckermanら(1996)Methods in Enzymology267:437を参照のこと。代替において、ペプトイドモノマーのオリゴマー化は、ベンゾトリアゾール−1−イルオキシトリス(ピロリジノ)ホスホニウムヘキサフルオルホスフェートまたはブロモトリス(ピロリジノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートのいずれかにより、インサイチュ活性化によって行われ得る。この代替方法において、他の工程は、α−(9−フルオレニルメトキシカルボニル)アミノ酸を用いる従来のペプチド合成と同一である(例えば、Simonら(1992)前出、を参照のこと)。
【0095】
一旦ペプトイドライブラリーが作製されると、それらは、例えば、本発明のモノクローナル抗体を、コンビナトリアルペプトイドの種々のプールとともに、MenB PS誘導体またはMenB細菌(単独または複合糖質としてのいずれか)でコートしたマイクロタイタープレートのウェルに添加することによってスクリーニングされ得る。インキュベーション期間および非結合抗体を除去するための洗浄の後に、結合抗体の存在は、標準的なELISAアッセイによって決定される。例えば、HarlowおよびLane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988), Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, NY, 553を参照のこと。結合抗体を含まないウェルは、その抗体に結合するペプトイド模倣物の存在を示す。プール中のペプトイド模倣物の特定の詳細な正体は、モノマーユニットを部分的に合成されたライブラリーのメンバーに再帰的に添加することによって決定される。Zuckermannら、(1994) J.Med.Chem. 37:2678。低分子のプールにおける活性化合物を同定するための他の方法は、逆相HPLCまたはアフィニティー選択/質量分析によるプールの分画を含む(Nedved M.L.ら、(1996)Anal.Chem.68:4228)。
【0096】
一旦、推定される分子模倣物が同定され、これらは、上記のように自己反応性を欠落しているかまたは最小限の自己反応性を有する機能的に活性(例えば、細菌性および/またはオポソニンの)である抗体を誘発するそれらの能力について試験される。これらの特性を有する分子模倣物は、さらなる使用(例えばワクチン組成物)において適している。
【0097】
本発明の機能的に活性な抗MenB抗体を用いて同定された分子模倣物は、診断アッセイにおける使用のための抗体試薬を産生するために使用され得る。例えば、分子模倣物と反応性である抗体は、免疫診断技術(例えば、競合、直接反応、またはサンドイッチタイプのアッセイ)を用いて、生物学的サンプル中の細菌抗原を検出するために使用され得る。このようなアッセイとしては、ウエスタンブロット;凝集試験;酵素標識および媒介イムノアッセイ(例えば、ELISA);ビオチン/アビジンタイプアッセイ;ラジオイムノアッセイ;イムノ電気泳動;免疫沈降などが挙げられる。この反応は、一般には標識(例えば、蛍光標識、化学発光標識、放射活性標識、酵素標識)または色素分子の暴露、または模倣物と抗体またはこの模倣物と反応する抗体との複合体の形成を検出するための他の方法を含む。
【0098】
上述のアッセイは、一般に、模倣物−抗体複合体が結合している固相支持体からの液相中の結合していない抗体の分離を含む。本発明の実施において使用され得る固相支持体は以下のものを含む、ニトロセルロースのような基材(例えば、メンブレンまたはマイクロタイターウェルの形態で);ポリ塩化ビニル(例えば、シートまたはマイクロタイターウェル);ポリスチレンラテックス(例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレート);ポリフッ化ビニリデン;ジアゾ化紙;ナイロンメンブレン;活性化ビーズ、磁力応答性ビーズなど。
【0099】
代表的には、固体支持体は、適切な結合条件下で固相成分(例えば、1つ以上のMenB分子模倣物)と最初に反応し、その結果、この成分はこの支持体に十分に固定される。時々、支持体への模倣物の固定は、良好な結合特性を有するタンパク質へ、まずこの模倣物が結合されることにより増強され得る。適切な共役タンパク質は以下を含むがこれらに限定されない、ウシ血清アルブミンを含む(BSA)を含む血清アルブミンのような高分子、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリイン、オボアルブミン、および当業者に周知である他のタンパク質。模倣物を支持体に結合させるために使用され得るたの分子は、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマーなどを含む。これらの分子を抗原と共役させるこのような分子および方法は当業者に周知である。例えば、Brinkley、M.A. Bioconjugate Chem.(1992)3:2−13;Hashidaら、J.Appl.Biochem.(1984)6:56−63;およびAnjaneyuluおよびStaros、International J.of Peptide and Protein Res(1987)30:117−124を参照のこと。
【0100】
固体支持体を固相成分と反応させた後、任意の固定された固相化合物が支持体から洗浄により除去され、次いでこの支持体結合成分を、適切な結合条件下でリガンド部分(例えば、MenBおよび/またはE.coli K1抗体)を含むと思われる生物学的試料と接触させる。いくらかの結合していないリガンドを除去するための洗浄後、二次結合物部分を適切な結合条件下で添加し、ここで、この二次結合物は結合リガンドと選択的に結合し得る。次いで、この二次結合物の存在は、当該分野で周知の技術を使用して検出され得る。
【0101】
より詳細には、ELISA法が使用され得、ここで、マイクロタイタープレートのウェルは、本発明に従う模倣物でコートされる。次いで、抗MenBまたはE.coli K1免疫グロブリン分子を含むかまたは含むと思われる生物学的試料がコートされたウェルに添加される。抗体を固定された模倣物に結合させるために十分なインキュベーション時間の後に、このプレートは洗浄されて結合していない部分を除去し、そして検出可能に標識された二次抗体が添加される。この二次結合分子を任意の捕捉試料抗体と反応させ、このプレートを洗浄し、そして二次結合分子の存在を当該分野で周知の方法を使用して検出する。
【0102】
従って、1つの特定の実施態様において、生物学的試料由来の結合したMenB/E.coli K1抗原リガンドは、抗体リガンドに対して指向される抗体を含む二次結合物を使用して容易に検出し得る。多くの数の抗ウシ免疫グロブリン(Ig)分子が当該分野で公知であり、これらは検出可能な酵素標識(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはウレアーゼ)に対して当業者に公知の方法を使用して容易に結合し得る。次いで、適切な酵素基質を使用して検出可能なシグナルを生成する。他の関連する実施態様では、競合型ELISA技術は、当業者に公知の方法を使用して実施され得る。
【0103】
アッセイはまた溶液中で行われ得、この結果、模倣物およびこれらの模倣物に特異的な抗体は、沈降条件下で複合体を形成する。1つの特定の実施態様において、この模倣物は、固相粒子(例えば、アガロースビーズなど)に対して当該分野で公知の結合技術(例えば、化学的に直接の結合、または間接的な結合)を使用して付着され得る。次いで、この模倣物コート粒子を、MenBおよび/またはE.coli K1に対する抗体を含むことが予測される生物学的試料と適切な結合条件下で接触させる。結合抗体間の架橋は沈降され得、そして洗浄および/または遠心分離を使用してこの試料から分離され得る粒子−模倣物−抗体複合体凝集体の形成を生じる。この反応混合物を、抗体−模倣物複合体の存在または非存在を決定するために多数の標準的な方法のいずれか(例えば、上記のそれらの免疫診断方法)を使用して分析し得る。
【0104】
なおさらなる実施態様では、免疫親和性マトリクスが提供され得、ここで、MenBおよび/またはE.coli K1の抗体を含むことが予測される生物学的試料由来の抗体のポリクローナル集団が基材に固定される。これに関しては、試料の最初のアフィニティー精製は、固定された抗体を使用して実施され得る。従って、得られた試料調製物は、抗MenBおよび/またはE.coli K1部分のみを含み、そのアフィニティー支持体における潜在的な非特異的結合特性を避ける。高収量および抗原結合活性の良好な保持における多くの数の運動抑制免疫グロブリン(インタクトであるかまたは特異的フラグメントのいずれかである)は当該分野で公知である。任意の特定の方法により制限されないが、固定されたプロテインAまたはプロテインGが免疫グロブリンを固定するために使用され得る。
【0105】
従って、一旦、免疫グロブリン分子が免疫親和性マトリクスを提供するために固定されると、標識分子は、適切な結合条件下で結合抗体と接触される。任意の非特異的結合模倣物が免疫親和性支持体から洗浄された後、結合抗体の存在が、当該分野で公知の方法を使用する標識のためのアッセイにより決定され得る。
【0106】
本発明を使用するMenBおよび/またはE.coli K1感染を診断するために特に好ましい方法は、ストリップイムノブロットアッセイ(SIA)技術(例えば、当業者に公知である、伝統的なウェスタンブロッティング技術とドットブロッティングを組み合わせる当業者に公知の方法(例えば、RIBA(商標)(Chiron Corp.,Emeryville, CA)試験)の使用を含む。これらのアッセイにおいて、1つ以上の本発明に従う模倣物が、メンブレン支持体試験ストリップ上の個々の分離したバンドとして固定される。生物学的試料における抗MenBおよび/またはE.coli K1反応の可視化は,比色分析酵素基質とともに抗ヒトIgG酵素結合物を使用して達成される。内部コントロール(例えば、抗ヒトIgMおよびヒトIgGもまた、このストリップ上に存在し得る。このアッセイは手動で実施され得るかまたは自動化フォーマットにおいて使用され得る。
【0107】
上記に記載のアッセイ試薬(本発明の模倣物またはそれらに対する抗体を含む)は、上記のイムノアッセイを行うための、適切な説明書および他に必要とされる試薬と共にキット中で提供され得る。このキットはまた、使用される特定のイムノアッセイに依存して、適切な標識および他のパッケージ試薬および物質(すなわち、洗浄緩衝液など)を含む。上記のような標準的なイムノアッセイは、これらのキットを使用して実施され得る。
【0108】
さらに、分子模倣物組成物、分子模倣物を用いて同定された独特な(例えば、非自己反応性)MenBエピトープは、哺乳動物被験体におけるMenB疾患の診断および予防のために本明細書中で使用され得る。特に、分子模倣体のワクチン組成物は、ワクチン接種した被験者のMenB疾患の予防のために使用され得る。
【0109】
このワクチン組成物は、MenBの分子模倣物、または非自己免疫エピトープの1つ以上を含み得る。ワクチンはまた、他の抗原および免疫調節剤(例えば、免疫グロブリン、サイトカイン、リンホカイン、およびケモカイン:(これらは、IL−2、改変IL−2(cys125→ser125)、GM−CSF、IL−12、γ−インターフェロン、IP−10、MIP1β、およびRANTESを含むがこれらに限定されない))と共に投与され得る。
【0110】
このワクチンは、一般に、1つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル」(例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなど)を含む。さらに、補助物質(例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質など)がこのようなビヒクル中に存在し得る。
【0111】
アジュバントもまた、ワクチンの有効性を増強するために用いられ得る。アジュバントは、ワクチン組成物に直接添加され得るか、または別々に(ワクチン投与と同時または直後のいずれかで)投与され得る。このようなアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:(1)アルミニウム塩(ミョウバン)(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど);(2)水中油型エマルジョン処方物(他の特定の免疫刺激剤(例えば、ムラミルペプチド(下述)または細菌細胞壁成分)を有するまたは有さない):例えば、(a)MF59(国際公開第WO 90/14837号):5%スクワレン、0.5%Tween 80、および0.5%Span 85を含む(必要に応じて、種々の量のMTP−PE(下述)を含むが、必要とされるわけではない)、微小流動機(microfluidizer)(例えば、Model 110Y microfluidizer(Microfluidics、Newton、MA)を用いてサブミクロン粒子に処方された、(b)SAF:10%スクアレン、0.4%Tween 80、0.5%プルロニックブロックポリマーL121、およびthr−MDP(下述)を含む、サブミクロンエマルジョンに微小流動されるか、またはより大きな粒子サイズエマルジョンを生成するようにボルテックスされるかのいずれかである、(c)RibiTMアジュバントシステム(RAS)(Ribi Immunochem、Hamilton、MT):2%スクワレン、0.2%Tween 80、および1つ以上の細菌細胞壁成分(モノホスホリルリピドA(MPL)、トレハロースジミコレート(TDM)、および細胞壁骨格(CWS)からなる群に由来、好ましくは、MPL+CWS(DetoxTM))を含む;(3)サポニンアジュバント(例えば、StimulonTM(Cambridge Bioscience、Worcester、MA)が用いられ得るか、またはそれから生成された粒子であり得る(例えば、ISCOM(免疫刺激複合体));(4)フロイント完全アジュバント(FCA)およびフロイント不完全アジュバント(FICA);(5)サイトカイン(例えば、インターロイキン(IL−1、IL−2など)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、腫瘍壊死因子(TNF)など;ならびに(6)コレラ毒素(CT)、百日咳毒素(PT)、またはE.coli熱不安定性毒素(LT)、特にLT−K63(ここで、リジンは部位63での野生型アミノ酸と置換される)LT−R72(ここで、アルギニンは部位72での野生型アミノ酸と置換される)、CT−S109(ここでセリンは部位109の野生型アミノ酸と置換される)、およびPT−K9/G129(ここでリジンは部位9の野生型アミノ酸と置換され、そしてグリシンが部位129で置換される)(例えば、国際公開WO93/13202およびWO92/19265を参照のこと)のような細菌のADPリボシル化毒素の解毒変異体、;ならびに(7)免疫刺激剤として作用して組成物の効果を増強する他の物質。
【0112】
ムラミルペプチドとしては、N−アセチル−ムラミル−L−スレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、N−アセチル−ノルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(nor−MDP)、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1’−2’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミン(MTP−PE)などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0113】
分子模倣物から形成されたワクチン組成物の有効性を増強するために、模倣物をキャリア分子に結合体化させることが必要であり得る。このようなキャリア分子は、それ自身、有害な抗体の産生を誘導しない。適切なキャリアは、代表的には、大きな、ゆっくりと代謝される高分子(例えば、タンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質集合体(例えば、油滴またはリポソーム)、不活性ウイルス粒子、CRM197(無毒変異ジフテリア毒素)など)である。このようなキャリアは、当業者に周知である。模倣物結合体は、MenB細菌細胞の表面に見られるものに密接に類似するエピトープを発現するそれらの能力について選択される。従って、適切な結合体は、細菌に対して機能活性を有する抗体の形成を惹起し、かつ本明細書中に記載の結合アッセイを用いて決定されるように宿主組織においてポリシアル酸と交差反応しないか、または最小限で交差反応性である。
【0114】
代表的には、ワクチン組成物は、注射用(液体溶液または懸濁液のいずれか)として調製される;注射前に液体ビヒクルに入れて溶液または懸濁液とするのに適切な固体形態もまた、調製され得る。調製物はまた、上述のように、アジュバント効果の増強のために、リポソーム中に乳化またはカプセル化され得るか、あるいは粒子に吸着され得る。
【0115】
このワクチンは、有効量のタンパク質の分子模倣物、および必要に応じて任意の他の上述の成分を含む。「有効量」とは、投与される個体において免疫応答を誘導し、かつ個体において自己免疫応答を刺激する危険性を最小限にとどめる分子の量を意味する。一般に、このような応答は、被験体において、このワクチンに対して分泌性、細胞性、および/または抗体媒介性免疫応答の発達を生じる。通常、このような応答は、以下の効果の1つ以上を含むがこれらに限定されない:免疫クラス(例えば、免疫グロブリンA、D、E、GまたはM)のいずれかからの抗体の産生;Bリンパ球およびTリンパ球の増殖;免疫細胞への活性化、増殖、および分化シグナルの供給;ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、ならびに/または細胞傷害性T細胞および/もしくはγδT細胞集団の拡大。
【0116】
一旦処方されると、ワクチンは、非経口(例えば、注射により、皮下、または筋内のいずれか)に従来通りに投与される。他の投与様式に適切なさらなる処方物としては、経口処方物および肺処方物、坐剤、および経皮適用剤が挙げられる。投与処置は、単回用量スケジュールまたは多回用量スケジュールであり得る。
【0117】
(III.実験)
以下は、本発明を実施するための特定の実施態様の例である。本実施例は、例示の目的にのみ提供され、本発明の範囲をいかなるようにも限定することを意図しない。
【0118】
用いた数字(例えば、量、温度など)に関して正確に記載するよう試みたが、幾分かの実験誤差および偏差はもちろん許容されるべきである。
【0119】
(実施例1)
(「サイズ化」複合糖質の調製)
例示のNPr−MenBオリゴサッカライド破傷風トキソイド結合体ワクチン(本明細書中、以後CONJ−2と称する)を以下のように調製した。MenB BポリサッカライドのN−アセチル基を、ポリサッカライドをNaBH4の存在下で2M NaOH中で6時間、110℃に加熱することにより除去した。脱アセチル化ポリサッカライドを飽和炭酸水素ナトリウム緩衝液中で十分に透析し、次いで過剰のプロピオン酸無水物と共に、室温で12時間、撹拌した。溶液を水中で十分に透析し、N−プロピオニル化髄膜炎菌B(NPr−MenB PS)ポリサッカライドを凍結乾燥により回収した。
【0120】
結合体ワクチンの調製のために、NPr−MenB ポリサッカライドを、10mM酢酸ナトリウム中でpH5.5で50℃で2時間、部分的に加水分解した。得られたオリゴサッカライド混合物をQ−セファロース上で分画した。2〜6の平均重合度(Dp)を有するオリゴサッカライドを、100mM NaClを用いてまず溶出し、そして廃棄した。中間サイズのオリゴサッカライドを500mM NaClを用いて溶出した。続いて、Mono Qカラムを用いる分析用イオン交換クロマトグラフィーにより、中間サイズのオリゴサッカライドがDp 13〜20の大きさの範囲であることを決定した(平均=Dp 13)。
【0121】
末端アルデヒド基を、暗所において室温で15〜30分間、これらを100mM 過ヨウ素酸ナトリウムと反応させることにより、中間サイズのオリゴサッカライドの非還元末端で生成した。過剰のエチレングリコールを用いて酸化反応を停止させ、そしてその生成物をSephadex G−25カラム上で脱塩した。オリゴサッカライド−タンパク質結合体を、40mg/mlのシアノホウ素化水素ナトリウムを有する0.75Mリン酸カリウム緩衝液(pH 9.0)中で末端アルデヒド含有NPr−MenB オリゴサッカライドと破傷風トキソイドとの混合物(それぞれモル比200:1)を、40℃で1日および室温で2日撹拌することにより調製した。得られたNPr−MenB オリゴサッカライド−破傷風トキソイド結合体(CONJ−2)を、溶出緩衝液として50mM リン酸ナトリウム(pH 7.0)、150mM 塩化ナトリウムを用いてSephadex G−100におけるゲル濾過クロマトグラフィーにより最終的に精製した。結合体ワクチンのシアル酸組成およびタンパク質組成をそれぞれ、Svennerholmレゾルシノール反応(Svennerholm, L. (1957) Biochim. Biophys. Acta. 24:604)およびLowryアッセイにより測定した。重量基準で、CONJ−2結合体の最終的な糖対タンパク質比は、0.10〜0.25の範囲であった。
【0122】
(実施例2)
(複合糖質の特徴付け)
CONJ−2複合糖質を以下のように特徴付けた。共有結合性(例えば、NPr−MenB OSとタンパク質キャリアとの間の共有結合を確立する)を示すために、以下を含む多くの物理化学的技術を使用し得る:SDS−PAGE;ウェスタンブロット;Sephadex G−100ゲル濾過;など。本研究の目的のために、SDS−PAGEを使用して、キャリアタンパク質バンド自体と比較した場合、結合体バンドについてより高い分子量へのシフトを示すことによって、NPR−MenB OS/TT CONJ−2複合糖質の共有結合を確立した。CONJ−2複合糖質のウェスタンブロット分析は、TTおよびNPr−MenB PSについてのポジティブ免疫反応性シグナルの、特異的な抗TTおよび抗NPr−MenB PS抗血清との一致によって共有結合性を示した。
【0123】
立体因子に基づいて、CONJ−2複合糖質の調製における大きな分子量のポリサッカライドの代わりのオリゴサッカライドの使用は、タンパク質キャリア分子上へのサッカライド抗原のより高いカップリング効率を可能にする。これらのNPr−MenBオリゴサッカライドに基づく複合体の最終的なサッカライド対タンパク質比は、タンパク質キャリア1個当たり共有結合する約3〜5のNPr−MenBオリゴサッカライド鎖に対応する、約0.10〜0.25に及ぶ。毎重量に基づいて、CONJ−2複合糖質は、以前に報告されたNPr−MenBポリサッカライドに基づく結合体(米国特許第4,727,136号)(ここで、CONJ−2は平均して約7.5〜18.8倍多いサッカライドを含む)より高いサッカライドローディングを有するようである(NPr−MenB PSの分子量として10,000ダルトンを用いる)。
【0124】
さらに、十分に規定された中間体の鎖長(例えば、平均10〜20 Dp)の実質的に均一なサイズのサッカライド部分を有するCONJ−2複合糖質を構築することは、より一貫した免疫学的挙動を呈する複合糖質を生じることが予期される。さらに、Q−Sepharoseクロマトグラフィー精製NPr−MenBオリゴサッカライドの選択的末端活性化(例えば、非還元性末端でのアルデヒド基の選択的導入)は、両方の末端で誘導される「活性な」アルデヒド基を有するNPr−MenB PS分子の使用から生じ得る架橋不均一構造の可能性を回避する。この点において、両末端活性化PS(両方の末端にアルデヒド基を有する)は、N−脱アセチル化手順の間に、予めNaBH4に曝露されたN−アセチル化MenB PSの過ヨウ素酸酸化から誘導され得るようである。
【0125】
(実施例3)
(モノクローナル抗体の調製)
4〜6週齢の雌性CD1マウスを、NPr−MenB OS/TT (CONJ−2)複合糖質抗原および(最後の追加免疫注射を除いて)FCAを含む組成物を用いて、腹腔内注射によってワクチン接種した。ワクチン接種を、1ヶ月間隔で合計2または3投薬量で投与した(追加免疫を含む)。融合の3日前、初回刺激した動物を、アジュバントの非存在下でNPr−MenB OS/TT (CONJ−2)複合糖質抗原で追加免疫した。各用量の最終容量は0.1mlであり、これは2.5μgのシアル酸を含んだ。追加免疫注射後、動物を脾臓摘出し、そして脾臓細胞をミエローマ細胞との融合用に調製した。
【0126】
融合の約1週間前、非分泌マウスP3X63−Ag8.653ミエローマ細胞(ATCC受託番号第ATCC−1580−CRL号から入手可能)を、25mMのHEPES緩衝液およびL−グルタミンを有する完全なRPMI−1640培地(GIBCO BRL 041−02400)で拡大した。細胞培養物を、細胞増殖、細胞数をモニターするため、およびコンタミネーションをスクリーニングするために定期的に評価した。
【0127】
融合の1日目、脾臓細胞、およびパートナーのP3X63−Ag8.653ミエローマ細胞(Ag8細胞)を洗浄し、収集し、そして5:1(脾臓細胞:ミエローマ細胞)の比で混合した。細胞融合を、50%ポリエチレングリコール(PEG)の存在下で37℃にて実施した。生じた細胞ペレットを収集し、そして96ウェル平底細胞培養プレート(COSTAR 3596)中に置き、そして適切な条件下で(例えば、5%CO2中37℃にて)インキュベートした。インキュベーションの1日後、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン(HAT)を含む選択培地を、各ウェルに添加した。
【0128】
増殖し、そして約10〜25%のコンフルエンスを示す細胞を含むウェルからのハイブリドーマを、HAT選択培地中でのインキュベーションの約2週間後にスクリーニングのために選択した。選択したハイブリドーマ上清を、固相アビジン−ビオチン化NPr−MenB PSに基づくELISAアッセイを用いてスクリーニングした。上清における抗体結合の特異性を、インヒビターとして可溶性NPr−MenB PSを用いて決定した。ネガティブコントロールは、RPMI培地、Ag8ミエローマ上清、および無関連のモノクローナル抗体調製物を含んだ。NPr−MenB OS/TT (CONJ−2)複合糖質で免疫したマウス由来のプールしたポリクローナル血清を、ポジティブコントロールとして使用した。上清との一晩のインキュベーション後、反応ウェルを洗浄し、そして結合した免疫グロブリンを、アルカリホスファターゼ標識多価抗マウス免疫グロブリン(IgG、IgA、IgM)を用いて検出した。
【0129】
候補ハイブリドーマを、上記のELISAアッセイにおけるNPr−MenB PSについてのそれらの示された結合親和性に基づいて同定した。高度に反応性の抗体分子を分泌するハイブリドーマを、限界希釈によってクローニングした。詳細には、候補ハイブリドーマ細胞株を、20μlのクローニング/拡大培地(IL6を有する完全 RPMI−1640)中に、Terasakiプレート(NUNC)中0.3、1.0、および3.0細胞/ウェルでプレートした。2週間後、培養物を増殖について視覚的に検査した。頻度分析を、Lefkovitsら(1984) Immun. Today 5 (9): 265によって記載される最小二乗法を用いて実施した。マスターウェル中の反応性上清を同定するために使用されるELISAアッセイを繰り返し、7および14日目の抗体活性を評価した。次いで、選択したクローンを、組織培養および腹水生成におけるその後の使用のために拡大および凍結した。このようにして、39のハイブリドーマのパネルを生成し、そしてそれから得た分泌したモノクローナル抗体分子(「SEAMモノクローナル抗体」、詳細にはモノクローナル抗体SEAM−1〜SEAM−24、SEAM−26、SEAM−28〜SEAM−31、SEAM−33〜SEAM−36、SEAM−38〜SEAM−42、およびSEAM−48と命名した)を、さらなる評価のために調製した。
【0130】
より詳細には、選択したモノクローナル抗体を、組織培養においてか、または腹水液においてのいずれかで、Pristaneで初回刺激した7〜8週齢の雄性Balb/cマウスを用いて生成した。各動物被験体を、ハイブリドーマ細胞での接種の1週間前に、0.5mlのPristaneでの腹腔内注射によって初回刺激した。接種前、ハイブリドーマ細胞濃度を、滅菌したPBSを用いて、2.5×106〜3×106細胞/mlに調整した。初回刺激した動物に、1mlのハイブリドーマ細胞を腹腔内に注射した。ここで、各クローン細胞株を3匹の異なるマウス中に接種した。接種の1〜2週間後、腹水液の回収を開始し、約1週間継続した。回収した液体を、2700rpm(1500×g)にて室温で10分間遠心分離した。上清を収集し、そしてペレットを廃棄した。単離した腹水液を、回収の過程にわたって4℃にて貯蔵し、そして異なる日に回収した液体をプールし、一定分量に分け、そして−70℃にて凍結した。
【0131】
(実施例4)
(モノクローナル抗体の特徴付け)
精製していないモノクローナル抗体の濃度を、ELISA捕捉アッセイおよび放射状免疫拡散アッセイを用いて決定した。詳細には、捕捉ELISA手順を用いて、各抗NPr−MenB PSモノクローナル抗体の濃度を決定した。10mM PBS(pH7.4)において1μg/mlに希釈した100μL/ウェルのアフィニティー精製ウサギ抗マウスIgG、IgM、およびIgA(HおよびL、Zymed)を含むマイクロタイタープレート(Immulon 2、Dynatech Laboratories, Inc.から入手可能)を、4℃で一晩インキュベートした。ウェルを、PBSで3回洗浄後、250μLのブロッキング緩衝液(1%ウシ血清アルブミン(BSA)および0.1%アジ化ナトリウムを含むPBS、pH7.4)で満たし、そして室温にて30〜60分間インキュベートし、非特異的結合部位をブロックした。そのプレートを、洗浄緩衝液(0.1% Tween 20および0.1%アジ化ナトリウムを含むPBS、pH7.4)で3回洗浄した。試験するべき抗体を、希釈緩衝液(1% BSA、0.1% Tween 20、および0.1%アジ化ナトリウムを含むPBS、pH7.4)に希釈し、次いで各ウェル当たり100μlで添加した。プレートを覆い、そして4℃で一晩インキュベートした。マウスIgG1、IgG2b、IgG3、およびIgM免疫グロブリン標準(Southern Biotechnology Associatesから入手可能)を、500ng/ml〜4ng/mlに及ぶ濃度で使用して、抗体濃度を定量するための標準曲線を構築した。
【0132】
一晩のインキュベーション後、ウェルを冷洗浄緩衝液で5回洗浄し、そして希釈緩衝液において1:2000希釈した100μl/ウェルのアルカリホスファターゼ結合抗マウスIgG、IgMおよびIgAポリクローナル抗体(HおよびL、Zymed)とともに、4℃で3時間インキュベートした。次いで、プレートを冷洗浄緩衝液で洗浄し、そして基質緩衝液 (1.0M ジエタノールアミン、0.5mM MgCl2、pH9.8)で1mg/mlに希釈した100μlの新しく調製した基質(p−ニトロフェニルリン酸、Sigma)を各ウェルに添加した。約30分後に405nmでの吸光度値を測定した。モノクローナル抗体調製物の免疫グロブリン濃度を、標準曲線から算出した。
【0133】
放射状免疫拡散アッセイを以下のように実施した。放射状免疫拡散プレートおよび試薬を、The Binding Site Limited (Birmingham, England)から入手した。次いで、アッセイプロトコルは、RIDキットとともに供給された製造業者の具体的な説明書に基づいた。簡単には、キットに供給されたキャリブレーター抗体を、適切な量の蒸留水を用いて再構成した。1:2および1:10希釈のキャリブレーター抗体を調製した。必要ならば、試験サンプルを1% BSAに希釈し得る。キャリブレーター抗体(適切な、1:2および1:10希釈)について10μlのアリコート(IgAおよびIgG2aサブクラス抗体について20μl)および試験サンプルを、プレート上の分離したウェルに適用し、そして室温にて120時間インキュベートした。抗体の濃度を、沈殿物の環の直径を測定し、そしてこれらの値をRIDキットに含まれる参考の表と比較することによって決定した。
【0134】
次いで、組織培養物または腹水液由来のモノクローナル抗体を、以下のように部分的に精製した。モノクローナルを含む組織培養上清または腹水(200mlまたは指示された容量)を、溶液を穏やかに撹拌しながら、等量の冷100%飽和硫酸アンモニウム(SIGMA, Saint Louis, MO)にゆっくりと添加した。このモノクローナル抗体および硫酸アンモニウム混合物を、4℃で一晩インキュベートした。翌朝に、混合物を、均質化のために穏やかに撹拌し、そしてSorvall SS34ローターにおいて5000rpmで、4℃にて30分間遠心分離した。上清をデカントした後、等容量の50%硫酸アンモニウム溶液(すなわち、100%飽和硫酸アンモニウムと同じ容量)を使用して、ペレットを洗浄し、そして再懸濁した。得られた混合物を、Sorvall SS34ローターにおいて5000rpmで、4℃にて30分間遠心分離した。次いで、上清をデカントし、そして排出した。
【0135】
腹水について、ペレットをPBS 緩衝液(50mMのリン酸ナトリウム、150mMの塩化ナトリウム、pH7.4)において、0.3〜0.5容量の開始容量に再構成した。組織培養上清について、このペレットを、PBS 緩衝液の0.1容量の開始容量に再構成した。再構成したモノクローナル抗体および硫酸アンモニウム混合物を透析チューブ(分子量カットオフ10,000〜12,000)に入れ、そして4LのPBS中で一晩透析させた。PBS溶液を、後の2日間にわたって3〜4回交換した。透析チューブからのモノクローナル抗体分子をシリンジ中に移し、そして0.2μmメンブレンフィルターを通して濾過滅菌し、次いで−20℃にて貯蔵した。
【0136】
次いで、部分精製したモノクローナル抗体調製物を(a)免疫グロブリンアイソタイプ、(b)NPr−MenB PSへの濃度依存性結合、(c)種々のNPr−MenBオリゴマーの、NPr−MenB PSへの結合を阻害する能力、(d)天然のMenB PSとの交差反応性、(e)MenBの病原性株との交差反応性、(f)補体媒介性殺菌活性、(g)オプソニン活性、および(h)細胞表面にて長鎖α2−8連結ポリシアル酸を発現する神経芽細胞腫細胞株への結合によって示されるような自己反応性について特徴付けした。これらの実験において、モノクローナル抗体の濃度を、捕捉ELISAおよび上記のRIDアッセイによって測定した。
【0137】
(a)抗体のアイソタイプ分類:
モノクローナル抗体(重鎖および軽鎖)のアイソタイプを、二次アルカリホスファターゼ結合抗体がIgGサブクラス、IgM、IgA、ならびにκ軽鎖およびλ軽鎖に特異的であるという唯一の差異を有する、上記の抗NPr−MenB PS ELISAについてのプロトコルを用いて、ELISAによって決定した。また、キットを使用して、この抗体分子をアイソタイプ分類した。このキットは、異なる型の免疫グロブリンペプチド鎖について特異的なヤギ抗体でコートした分類固着基質からなった。キットは、その基質に対するヤギ抗体に結合するマウスモノクローナル抗体を検出するための、抗マウス免疫グロブリンに特異的なペルオキシダーゼ標識種を提供する。
【0138】
以下で表1に記載するように、39のモノクローナル抗体中のアイソタイプの分布が、1つのIgM、および38のIgG(8つのIgG1、5つのIgG2a、16のIgG2b、および9つのIgG3)からなることを見出した。さらに、すべての抗体分子は、κ軽鎖を有した。
【0139】
【表1】
【0140】
【表2】
【0141】
【表3】
【0142】
(b)NPr−MenB PSへの濃度依存性結合:
固相ELISA手順を用いて、緩衝液のみまたは25μg/mlの可溶性NPr−MenB PSインヒビターの存在下での抗体分子のNPr−MenB PSへの濃度依存的結合を評価した。ビオチン化NPr−MenB PS−ADHを、Suttonら(1985) J.Immunol.Methods 82:215の方法を用いて調製した。10mM PBS(pH 7.4)中の100μl/ウェルのアビジン(4μg/ml Extr Avidin, Sigma)を含むマイクロタイタープレート(Immulon 2、Dynatech Laboratories, Inc.より入手可能)を、4℃で一晩インキュベートした。PBSでの3回の洗浄後、PBS中の100μlのビオチン化NPr−MenB PSを各ウェルに添加し、そして37℃で2時間インキュベートした。このプレートをPBSで3回洗浄し、そしてこのウェルを250μlのブロッキング緩衝液で満たし、そして室温で30〜60分間インキュベートして非特異的結合部位をブロックした。
【0143】
ブロッキング後、このプレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。モノクローナルの種々の希釈の50μlアリコートを、50μlの希釈緩衝液、または1mlあたり50μgの可溶性NPr−MenB PSを含む(25μg/mlの最終インヒビター濃度として)50μlの希釈緩衝液のいずれかで含む複製プレートのウェルへ添加した。次いで、このプレートを覆い、そして4℃で一晩インキュベートした。翌日、このウェルを冷洗浄緩衝液で5回洗浄し、次いで希釈緩衝液において1:2000に希釈された100μl/ウェルのアルカリホスファターゼ結合抗マウスIgG、IgM、およびIgAポリクローナル抗体(Zymed)を用いて4℃で3時間インキュベートした。次いで、このプレートを冷洗浄緩衝液で洗浄し、そして基質緩衝液において1mg/mlに希釈された100μlの新しく調製した基質(p−ニトロフェニルリン酸, Sigma)を各ウェルへ添加した。405nmでの吸光値を約30分後に測定した。
【0144】
表1は、39のSEAMモノクローナル抗体の各々に対ついてELISAにおいて0.5のODをもたらすに必要な抗体のそれぞれの濃度範囲を要約する。示される値における大きな不均一性に対する最も可能性の高い説明は、NPr−MenB PSへの抗体の結合活性の相違である。
【0145】
(c)オリゴマーによるNPr−MenB PSへの抗体結合の阻害:
競合固相ELISA手順を用いて、固相NPr−MenB PSに対するモノクローナル抗体分子の結合を阻害するためのNPr−MenBオリゴマーインヒビターの能力を評価した。アッセイを、モノクローナル抗体を、0.5〜1のODをもたらす濃度まで予め希釈したことを除いては、抗NPr−MenB PS ELISAについて上記のように実施した。モノクローナル抗体を、複製プレートのウェル(各々は、25μg/mlの最終インヒビター濃度をもたらす以下の可溶性インヒビターの1つを含む:高分子量(HMW)NPr−MenB PS;または低分子量(LMW)NPr−MenB OS(3.8の平均Dpを有する))へ添加した。
【0146】
このプレートを覆い、そして4℃で一晩インキュベートした。翌日、このウェルを冷洗浄緩衝液で5回洗浄し、次いで希釈緩衝液において1:2000に希釈された100μl/ウェルのアルカリホスファターゼ結合抗マウスIgG、IgM、およびIgAポリクローナル抗体(Zymed)を用いて4℃で3時間インキュベートした。次いで、このプレートを冷洗浄緩衝液で洗浄し、そして基質緩衝液において1mg/mlに希釈された100μlの新しく調製した基質(p−ニトロフェニルリン酸, Sigma)を各ウェルへ添加した。405nmでの吸光値を約30分後に測定した。阻害パーセントを、インヒビターの非存在下での結合と比較して計算した。
【0147】
HMW NPr−MenB PSインヒビターは、試験された全てのモノクローナル抗体において、約75%〜95%の阻害を与えた。モノクローナル抗体における微細な抗原特異性の差異は、試験されたLMWインヒビターとの異なるそれぞれの阻害パターンから明白である。例えば、NPr−MenB PSへのSEAM−3およびSEAM−18の結合は、NPr−MenB PSの可溶性LMWインヒビターによって完全に阻害される。対照的に、SEAM−2およびSEAM−16は、オリゴマーによって顕著には阻害されない(20%未満)。全てのモノクローナル抗体についてのLMW NPr−MenB OS阻害の結果を表1に示す。さらに、以下に記載のように、モノクローナルの微細な抗原特異性における他の差異は、ELISAにおけるNAc−MenB PSへの交差反応性において観察された差異、および宿主のポリシアル酸への結合における差異によって明白である。
【0148】
(d)NAc−MenB PSとの交差反応性:
モノクローナル抗体を、固相ELISA形式において、NAc−MenB PSの直接的結合によって示されたように、NAc−MenBポリサッカライドへとの交差反応するそれらの能力について評価した。使用された方法は、固相抗原としてビオチン化NPr−MenB PSの代わりに、NAc−MenB PS−ADHを使用したこと以外は、NPr−MenB PS ELISAについての上記の方法と類似した。
【0149】
モノクローナルの種々の希釈の50μlアリコートを、50μlの希釈緩衝液、または1mlあたり50μgの可溶性NAc−MenB PSを含む(25μg/mlの最終インヒビター濃度として)50μlの希釈緩衝液のいずれかを含む複製プレートのウェルへ添加した。次いで、このプレートを覆い、そして4℃で一晩インキュベートした。翌日、このウェルを冷洗浄緩衝液で5回洗浄し、次いで希釈緩衝液において1:2000に希釈された100μl/ウェルのアルカリホスファターゼ結合抗マウスIgG、IgM、およびIgAポリクローナル抗体(Zymed)を用いて、4℃で3時間インキュベートした。次いで、このプレートを冷洗浄緩衝液で洗浄し、そして基質緩衝液において1mg/mlに希釈された100μlの新しく調製した基質(p−ニトロフェニルリン酸, Sigma)を、各ウェルへ添加した。405nmでの吸光値を、約30分後に測定した。
【0150】
46のモノクローナル抗体のそれぞれのNAc−MenB PSとの交差反応性を、高い交差反応性(+++)から交差反応性でない(0)範囲にわたって得点づけした。この結果を表1に示す。見られ得るように、16のモノクローナル抗体が、NAc−MenB PSと交差反応し、そして4つが最小で交差反応した(±)。これらの20のポジティブまたは弱いポジティブなモノクローナル調製物の交差反応性の特異性を、可溶性NAc−MenB PSを用いた結合の阻害によって確認した。26の非交差反応性モノクローナル抗体は、25μg/mlまでの抗体濃度で試験した場合、固相NAc−MenB PSへの顕著な結合は示さなかった。
【0151】
(e)細菌結合アッセイ:
抗N−Pr髄膜炎菌Bポリサッカライド抗体の、病原性細胞株N.meningitidisB群の表面に結合する能力を、間接的免疫蛍光アッセイのフローサイトメトリー検出を用いて決定した。2つの完全に莢膜された髄膜炎菌B試験生物(8047株(殺菌活性の測定のために使用した株、以下を参照のこと)およびNmB株)を使用した。NmBのトランスポゾン含有変異体である第3の非莢膜化株、M7(Stephensら (1991)Infect.& Immun. 59:4097−4102)を、莢膜ポリサッカライドへの抗体結合の特異性についてのネガティブコントロールとして使用した。Mueller−Hinton培地および0.25%グルコース中において対数増殖中期へ増殖された細菌細胞を回収し、そして1mlあたり約108細胞の密度でブロッキング緩衝液において再懸濁した。次いで、モノクローナル抗体(10または100μg/mlの濃度)を添加し、そして氷上で2時間細胞へ結合させた。ブロッキング緩衝液での2回の洗浄後、細胞を、FITC結合F(ab’)2フラグメントヤギ抗マウスIgG(H+L)(Jackson Immune Research, West Grove, PA)とインキュベートし、PBS緩衝液中の0.25%ホルムアルデヒドで固定し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。
【0152】
ポジティブコントロール抗体は、髄膜炎菌特異的血清型決定およびサブタイプ決定モノクローナル抗体(MN2C3B、MN16C13F4、RIVM、Bilthoven、the Netherlands)を含んだ。ネガティブコントロールは、関連しない特異性を有するマウスIgGモノクローナル抗体からなった。
【0153】
表1に要約されるように、24の抗N−Pr髄膜炎菌Bポリサッカライド抗体は、100μg/mlで試験した場合、細菌結合の証拠を示した。2つのさらなる抗体は、莢膜化株および非莢膜化変異株の両方に最小の結合の証拠を示した。これらの抗体の細菌結合を、不定(i)として得点づけした。
【0154】
(f)補体媒介性殺菌活性:
殺菌アッセイを、Mandrellら(1995)J. Infec. Dis. 172:1279に記載される方法を使用して、以下の改変を用いて行った:生物を0.25%グルコース;およびバルビトール緩衝液の代わりにGey緩衝液からなる血清希釈緩衝液を含有するMueller−Hinton培地で増殖させた。いくつかの実験では、補体の異なる供給源を使用した:これらは2つの異なるウサギの乳仔の血清プール(Rab C IおよびRab C IIと呼ばれる)ならびにヒト無ガンマグロブリン血症血清(Hu Cと呼ばれる)を含んだ。
【0155】
補体媒介性細菌溶解を活性化する各モノクローナル抗体の能力を、表1に報告する。ELISAによるNAc−MenB PSと交差反応性である殺菌性抗体の例(例えば、SEAM−18、SEAM−30、およびSEAM−35)がある。NAc−MenB PSとの交差反応性を示さない殺菌性抗体の例(例えば、SEAM−2、SEAM−5、SEAM−7、およびSEAM−8)もまたある。
【0156】
(g)オプソニン活性:
モノクローナル抗体のオプソニン活性を、種々の確立された方法によって測定し得る。Sjursenら(1987)Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand., Sec. C 95:283, Halstensenら(1989)Scand. J. Infect. Dis. 21:267, Lehmannら(1991)APMIS 99:769, Halstensenら(1991)NIPH Annals 14:157, Fredlundら(1992)APMIS 100:449, Guttormsenら(1992)Infect. Immun. 60:2777、Guttormsenら(1993)J. Infec. Dis. 167:1314、Bjerknesら(1995)Infect. Immun. 63:160、およびHayrinenら(1995)J. Infect. Dis. 171:1481。
【0157】
1つのオプソニン作用アッセイにおいて、GN寒天プレート(Greiner Labortechniek, Greiner BV, Alphen a/d Rijn, Netherlands)上で37℃で新たに増殖させたN. menigitidisを使用して、0.1の初期ODを得るように8mlのMueller Hinton培地 (Difco, Detroit, MI)に接種した。細菌を、激しく振盪しながら対数期(0.75〜0.85の660nmでの吸光度)まで増殖させた。細胞を、蓋付きの滅菌のプラスチックチューブに移し、そして10分間3500rpmで遠心分離した。
【0158】
細胞を、4mlの70%エタノールを添加し、そして4℃で少なくとも1時間インキュベートすることによって固定した。固定した細胞を、3500rpmで10分間の遠心分離によって再度ペレット化し、そして滅菌のリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中に1.0のODになるように再懸濁した。細胞懸濁物(1.35ml)をエッペンドルフチューブに添加し、そして5分間10,000rpmで遠心分離した。上清を廃棄し、そして別の1.35mlを同じチューブに添加し、続いて遠心分離して1チューブあたり1×109細胞を得た。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)を含有するPBS(Sigma, St. Louis, MO)の1.0mg/mlの溶液を調製し、そして5分間超音波処理し、次いで5分間10,000rpmで遠心分離した。FITC−PBS溶液(50μl)を各チューブの細菌に添加し、次いで軽度に攪拌しながら37℃にて1時間インキュベートした。PBS(950μl)を各チューブに添加し、そして2分間10,000rpmで遠心分離した。ペレットを1mlのPBSで1回、そして1mlのBSA−Hanks平衡化塩溶液(BSA−HBBS)で1回洗浄した。FITC標識した髄膜炎菌を1%のBSA−HBBS中で再構成し、そして100μlのアリコートに分けた。これを、アッセイでの使用まで−20℃で保存した。
【0159】
ヒト多型性核細胞(PMN)をヘパリン含有チューブ(Becton Dickinson, Mountain View, CA)中の健常な成体の末梢血から単離した。10mlの容量の血液を、等量のリン酸緩衝化生理食塩水(PBS; pH 7.4)で希釈し、そして12mlのhistopaque(密度1.119、Sigma Diagnostics, St. Louis, MO)の上部に10mlのFicoll PaqueTM (Pharmacia, Uppsaila, Sweden)からなるFicoll histopaque勾配に載せた。室温で400×gで20分間の遠心分離後、PMNをhistopaqueの上部から回収し、そして1%のゼラチンを含有する氷冷RPMI培地(Roswell Park Memorial Institute, NY)を添加した。細胞を250×gで遠心分離し、そして残りの赤血球を9mlの氷冷した蒸留水中に細胞を再懸濁することによって溶解させた。1分後、濃縮したPBSおよびRPMI−ゼラチンを添加して細胞懸濁物を等張化した。PMNを遠心分離し、そしてRPMI培地に1×107/mlの密度に再懸濁した。PMNの純度および生存性は95%以上であった。
【0160】
マイクロタイタープレートに、試験されるべきモノクローナル抗体の適切な希釈物(BSA−HBBS中で希釈した)、5μlの10%ヒト補体(BSA−HBBS中)、および25μlのFITC標識した細菌懸濁物を添加して、50μlの全容量にした。選択した抗体を、補体を含まずに、そして3つまでの異なる補体供給源:正常なプールしたヒト血清;無ガンマグロブリン血症血清;およびウサギ乳仔血清を用いて、1〜10%までで補体濃度を変化させて試験した。各アッセイはポジティブおよびネガティブ抗体コントロール、ならびに補体、非オプソニン作用、および細胞のみのコントロールを含んだ。オプソニン作用反応を、30分間37℃にて振盪機上で進行させ、その後、氷上にマイクロタイタープレートに置くことによって反応を停止した。
【0161】
食細胞懸濁物(50μl)を5×106細胞/mlの最終濃度で添加した。これによって10:1の細菌:食細胞の比が得られる。食細胞活動を、振盪機上で37℃で30分間進行させ、その後、それを氷上に置いた。冷BSA−HBBS(100μl)を各ウェルに添加した。プレートを10分間1100rpmで遠心分離した。上清をウェルから吸引し、そして細胞をさらに2回150μlの冷BSA−HBBSで洗浄した。次いで、冷BSA−HBBS(150μl)を添加し、そして得られた細胞懸濁物を滅菌チューブに移した。2%のパラホルムアルデヒド(Polysciences, Inc., Warrington, PA)を含有するPBSの溶液を添加して細胞を固定した。次いでサンプルを、間接的な蛍光フローサイトメトリーによって分析した。
【0162】
16の代表的なSEAMモノクローナル抗体についてのオプソニン作用実験の結果を、表1に報告する。オプソニンであることが見出されている全ての抗体はまた、この補体供給源の少なくとも1つを使用する上記のアッセイにおいて殺菌性であった。しかし、表1に見られ得るように、殺菌性であるがオプソニン性ではない抗体の例(例えば、SEAM−2、SEAM−5、SEAM−7、SEAM−16、およびSEAM−41を参照のこと)がある。
【0163】
(h)自己反応性の評価:
39 SEAMモノクローナル抗体を含有する部分精製された組織培養上清を、宿主のポリシアル酸に対する自己反応性について評価した。1つのアッセイにおいて、モノクローナル抗体を、ヒト神経芽細胞腫細胞株CHP−134(Livingstonら、(1988) J. Biol. Chem. 263:9443)と交差反応するその能力について、間接的免疫蛍光のフローサイトメトリー検出を用いて評価した。このアッセイにおいて、その表面の神経細胞接着分子(NCAM)に結合した長鎖ポリシアル酸(PSA)を発現するCHP−134細胞は、ヒトPSA抗原についての細胞性マーカーとして作用する。コントロール実験において、ほぼコンフルエントな細胞培養物を50mlの遠心管に回収し、そして1000×gで遠心分離した。上清をデカントした後、5mlのブロッキング緩衝液を添加し、細胞を再懸濁した。次いで、細胞を血球計で計数し、そして2つの等しいアリコートに分けた。1方のアリコートを、エキソノイラミニダーゼ(10ユニット/108細胞、SIGMA Chemical Co., Saint Louis, MO)とともに室温で2時間インキュベートした;他方のアリコートを、同様に、しかし酵素なしで処理した。インキュベーションの後、各アリコートからの細胞を、個々の反応管間で、各管が106個の細胞を含むよう分配した。細胞を洗浄するために、2mlのブロッキング緩衝液を各反応管に添加し、その管をSorvall RT−600B中で、20℃、1000rpmで、6分間遠心分離し、そして上清を吸引除去した。洗浄した細胞を、総容量200μlで、抗体を含まずに、または示された濃度(通常10または100μg/ml)の試験抗体(すなわち、SEAM MAb)とともにのいずれかで、氷上で2時間インキュベートした。
【0164】
アッセイにおけるコントロール抗体は、以下を含んでいた:(1)関連しない特異性のIgGモノクローナル抗体(ネガティブコントロールとしての、VIIG10);(2)IgM抗ポリシアル酸モノクローナル抗体(ポジティブコントロールとしての、2−1B);および(3)NCAMのタンパク質骨格に特異的な抗CD56モノクローナル抗体(Immunotech, Marseille, France)。ブロッキング緩衝液(2ml)を各反応管に添加し、そして管をSorvall RT−600B中で、20℃、1000rpmで、6分間遠心分離した。遠心分離の後に、上清を吸引除去し、そして細胞を室温で1時間、150μlのフルオレセインイソチオシアネート(FITC)−結合体化F(ab’)2フラグメントヤギ抗マウスIgG(H+L)(4μg/mlに希釈)(Jackson Immune Research, West Grove, PA)とともにインキュベートした。ブロッキング緩衝液で洗浄した後、PBS緩衝液(50mMリン酸ナトリウム、pH 7.0、150mM塩化ナトリウム)中の400μlの0.25%ホルムアミドを細胞に添加し、そして細胞をFACSCANTM細胞ソーター(Becton−Dickinson, Mountain View, CA)を使用して、フローサイトメトリーによって分析した。
【0165】
全ての抗体を、複製において最終濃度10および100μg/mlの抗体で、未処理細胞、およびノイラミニダーゼで前処理した細胞を使用して試験した。この処理によって、表面ポリシアル酸が切断され、そしてポリシアル酸への抗体結合の特異性についてのアッセイにおけるコントロールを提供する。代表的な実験において、一次抗体なしで、または関連しない抗原特異性を有するコントロールモノクローナル抗体とともにインキュベートした細胞は、非常に小さい蛍光を示す(約98%の細胞が<10ユニットの蛍光を有する)。対照的に、抗NAc MenB PSモノクローナル抗体である2−1Bで処理された実質的に全ての細胞が、強く蛍光を発する。この蛍光は、抗体がノイラミニダーゼで前処理された細胞とともにインキュベートされる場合、コントロールレベルまで減少する。同様に、抗CD56で処理した細胞は、強く蛍光を発する。この抗体を用いて、蛍光は、細胞をノイラミニダーゼで前処理することによって影響を受けない。なぜなら、CD56決定基は、NCAMのタンパク質骨格に位置し、そしてノイラミニダーゼによるポリシアル酸の除去によって影響を受けないからである。
【0166】
SEAM−5抗体は、100μg/mlで試験される場合、検出可能な結合を与えず、このアッセイではネガティブであると考えられる。SEAM−35抗体は、10または100μg/mlで試験した場合、強力なポリシアル酸特異的結合を示し、ポジティブであると考えられる。少数個の抗NPr MenB PSモノクローナル抗体は、100μg/mlで試験された場合、結合を示すが、10μg/mlで試験された場合、ネガティブであるようである(例えば、SEAM−12)。このような抗体は、本出願の目的で、最小限に自己反応性であると考えられる。稀少抗体は、細胞のノイラミニダーゼによる前処理によって影響を受けなかった神経芽細胞株との弱い反応性を有するようであった(例えば、SEAM−7)。このような抗体のポリシアル酸との自己反応性は、アッセイにおいて不定として得点され、そしてこれらの抗体もまた、本出願の目的で、宿主PSAに対して最小の自己反応性を有すると考えられる。
【0167】
表1は、この間接的蛍光フローサイトメトリーアッセイにおいて決定した場合の、各抗体の自己抗体活性を要約する。CHP−134細胞において発現したポリシアル酸抗原との交差反応性は、ELISAアッセイにおいて抗体のNAc−MenB PSとの交差反応性と密接に相関した。表1に示すように、ELISAにおいてNAc−MenB PSと交差反応しなかったモノクローナル抗体は、CHP−134細胞にも結合しなかったが、ELISAにおいてNAc−MenB PSと交差反応した抗体の全てが、PSAともまた交差反応した。2つのアッセイ間のこの相関は、予想されなかった。なぜなら、NAc−MenB PSおよび宿主PSAのポリサッカライド共有結合構造は、同一であると報告されているからである。
【0168】
(実施例5 SEAMモノクローナル抗体を用いたMenB抗原の分子模倣物の同定)
以下の手順を、本発明のSEAMモノクローナル抗体と相互作用する分子模倣物を同定するために実施した。コンビナトリアル合成分子を、上記のZuckermanらの手順に従って合成した(Zuckermannら(1996) Methods in Enzymology 267:437およびZuckermannら(1992) J.Am.Chem.Soc. 114:10646を参照のこと)。分子模倣物を、逆相HPLCによってプールを分画することにより同定した。このプール(約200μlまたはDMSO中10μM/分子溶液)を、Dynamax C18逆相カラム(Varian, Palo Alto,CA)に注入し、そして0.1%トリフルオロ酢酸中0%〜80%(v/v)にアセトニトリルの60分間にわたる直線勾配を用いて溶出した。この画分を凍結乾燥し、そして40μlのDMSOまたはアセトニトリル/水(1:1)に再懸濁した。次いで、各画分のアリコート(5μl)を、ELISAにおいて特定のSEAMモノクローナル抗体のNpr−MenB PSの結合を阻害することによって試験した。次いで、阻害活性を有する画分中の分子を、LC/MS(HP1100 LC/MSD, Hewlwtt−Packard, Palo Alto,CA)によって同定した。
【0169】
上記の標準的なELISAアッセイにおいて、30分でOD405を与えるのに必要な濃度とほぼ等しい濃度までPBS中に希釈したSEAMモノクローナル抗体(100μl)を、Npr−Men PS被膜したプレートのウェルに添加した。DMSO中のコンビナトリアル合成分子の溶液(1〜2μl)を、モノクローナル抗体溶液に添加し(プール中1分子あたり1μMの最終濃度)、そして4℃にて一晩インキュベートした。コントロールを、(1)抗体のみ、(2)緩衝液のみ、ならびに(3)抗体および緩衝液とともに、各々1〜2μlのDMSOとインキュベートした。このプレートをPBSで4回洗浄し、そして以前に記載したように発色させた。プールを、SEAMモノクローナル抗体SEAM−2、SEAM−3、SEAM−5、SEAM−12、SEAM−16、SEAM−18、およびSEAM−28を用いてスクリーニングし、そしてDMSOを用いて抗体と比較した阻害が、インヒビターの非存在下で観察された結合の80%以上である場合、ポジティブであると判断した。
【0170】
上記の構造1の分子模倣物を、ELISAアッセイにおいて特定のSEAMモノクローナル抗体のNPr−MenB PSへの結合を阻害するとして同定した。IC50値(SEAMモノクローナル抗体のNPr−MenB PSへの結合を50%阻害するのに十分な個々の化合物の推定濃度)を、上記のELISAにおけるプールの連続希釈によって決定した。本発明の分子模倣物のIC50濃度は、このプール中で単一の活性分子と仮定して、約3nM〜700nMの範囲である。
【0171】
(実施例6)
(分子模倣物ワクチン組成物の調製)
上記の模倣物に対応する低分子を含有するワクチン組成物を、その模倣物とキャリアタンパク質との、非共有結合、または共有結合によって調製する。疎水基または反応性基を模倣物に付加して、この模倣物のELISAにおいてNPr−MenB PSに対するSEAMモノクローナル抗体の結合を阻害する能力を保持する様式において、低分子模倣物とキャリアタンパク質との会合を促進する。
【0172】
(OMPビヒクルの調製)OMPビヒクルを、Lowellら(1988)(J.Expt.Med.167:658〜663)およびZollingerら(1979)(J.Clin.Invest.63:836〜848)に記載の技術を組み合わせて用いて、Neisseria meningitidis B群の莢膜欠損変異株(M7株)から調製する。手短には、細菌をMHブロス中で増殖し、遠心分離によってペレット化して、0.05M Tris−HCl、0.15M NaCl、および0.01M EDTA(pH7.4)を含む15mlの緩衝液中に再懸濁して、次に30分間、56℃まで暖める。室温まで冷却した後、懸濁液をPolytron(Kinematica GmbH.、Luzern、Switzerland)中で、全速で3分間せん断し、次に16000×gで15分間遠心分離する。生じるペレットを、10mlの緩衝液(500mM 塩化ナトリウム、50mM リン酸ナトリウム)に再懸濁し、5mlの界面活性剤溶液(10% デオキシコール酸ナトリウム(DOC)(Calbiochem、La Jolla、CA)、0.15M グリシン(Biorad、Hercules、CA)、および30mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)(SIGMA、Saint Louis、MO))を用いて処理する。この懸濁液を16,000×gで15分間遠心分離する。次に、上清を収集して、100,000×gで2時間遠心分離する。外膜タンパク質調製物を含むペレットを、10mlの水に再懸濁し、4℃で保存する。
【0173】
外膜タンパク質の10mlの懸濁液を、5mlの界面活性剤溶液で再処理し、次に30分間、56℃まで暖める。冷却後、リポポリサッカライド(LPS)を、第2の界面活性剤溶液(1% DOC、0.05M グリシン、および0.005M EDTA、pH8.8)中の、2cm×20cm Sephadex G−100カラム(Pharmacia Fine Chemicals、Piscataway、N.J.)を使用するクロマトグラフィーによって(1度に2ml)、外膜タンパク質から除去する。ピーク画分を収集し、30℃まで暖め、そして0.2μmメンブレンフィルターを通して、4容量の冷濾過滅菌エタノール中に直接、滅菌濾過する。この混合液を4℃でオーバーナイトインキュベートする。生じる沈殿を16,000×gで10分間の遠心分離によって収集し、1mlの滅菌蒸留水中に再懸濁する。生じるOMP調製物を−60℃で保存する。
【0174】
ラウロイル−Gly−Gly基を含有する分子模倣物を、等重量のラウロイル−Gly−Gly誘導体と界面活性剤溶液(1% DOC、0.05Mグリシン、および0.005M EDTA)中に可溶化したOMPビヒクルとを合わせることによる疎水的相互作用を介して、OMPビヒクルと複合体化する。この溶液を、10,000ダルトンの分子量化カットオフを有する透析チューブ中に配置し、3Lのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS、50mM リン酸ナトリウム、pH7.0、150mM NaCl)に対して、各1Lの24時間にわたる3回の緩衝液交換において透析する。
【0175】
(分子模倣物−キャリアタンパク質結合体の調製)キーホールリンペットヘモシニアン(KLH、例えば、Imject(登録商標)、Pierce、Rockford、IL)を2mlの蒸留水に再懸濁し、最終濃度10mg/mlにする。200μlのこの溶液を、1.5mlの微量遠心管に添加する。N−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルおよびSulfo−SMCC(登録商標)(Pierce、Rockford、IL)のようなマレイミド基を含むヘテロ二官能性架橋剤(2mg)を1mlの結合緩衝液(0.083M リン酸ナトリウム、0.9M 塩化ナトリウム、0.1M EDTA、pH7.2)中に溶解する。100μlのSulfo−SMCC溶液を、直ちにKLH溶液と合わせ、周囲温度において、1時間反応させる。この溶液を、結合緩衝液で平衡化した1.5cm×10cmのSephadex G−25カラムにアプライする。ボイドボリュームに溶出するマレイミド活性化KLHを収集し、保持する。システインアミノ酸を含む上記の分子模倣物を、100μlのDMSO中に再懸濁し、マレイミド活性化KLHの溶液に添加する。混合液を、周囲温度で18時間反応させる。この反応を、最終濃度5mMのβメルカプトエタノールの添加により停止する。最後に、ハプテンキャリア結合体を、PBSで平衡化した2cm×25cmのSephadex G−25カラムでの浸透ゲルクロマトグラフィーによって、精製する。カラムを280nmでのUV吸光度によってモニターする。
【0176】
(実施例7)
(NPr−MenB PSエピトープの低分子模倣物による、NPr−MenB PSへの抗体の結合の阻害)
NPr−MenB PSエピトープの低分子模倣物(構造5A(1)、5B(1)、6A(1)、および6B(2))を上記のように合成した。これらの分子模倣物は、以下の構造を有する:
【0177】
【化34】
【0178】
【化35】
【0179】
【化36】
【0180】
【化37】
【0181】
競合的固相ファージELISA手順を使用して、固相NPr−MenB PSに対するモノクローナル抗体分子の結合を阻害するNPr−MenB PSエピトープの低分子模倣物の能力について評価した。モノクローナル抗体を0.5〜1のODを生じるような濃度にまで、PBS中で予め希釈したことを除いて、オリゴマーELISAによって、NPr−MenB PSに対する抗体の阻害のアッセイを上記のように行った。次に、モノクローナル抗体を、レプリカプレートのウェル(各々は70μlのPBSおよびアセトニトリル/水(1:1)中に希釈された5μlのインヒビターを含み、これを50μlの抗体溶液の添加前に添加した)に添加した。インヒビターおよび抗体を、NPr−MenB PS ELISAプレートとともに、周囲温度で、1時間インキュベートした。4つのSEAM抗体の4つの分子模倣物による阻害の結果を、図1A〜Dのグラフに示す。特に、図1は、構造5A(1)、5B(1)、6A(1)、および6B(1)による、(A)SEAM3(10mg/ml)、(B)SEAM7(10mg/ml)、(C)SEAM18(10mg/ml)、および(D)SEAM30(10mg/ml)の濃度依存性阻害を示す。
【0182】
((a)ELISAプレート上に直接コートした分子模倣物との交差反応性)
モノクローナル抗体を、固相ELISA型式における分子模倣物に対する直接的結合によって示される分子模倣物との交差反応するその能力について評価した。使用した方法は、以下の例外を除き、NPr−MenB PS ELISAについての上記の方法と類似の方法であった。抗体をPBS中に希釈し、そしてプレートを周囲温度で1時間インキュベートした。このプレートを、PBSで5回洗浄し、そして、アルカリホスファターゼ結合体化抗マウスIgG、IgM、およびIgAポリクローナル抗体(Zymed)をPBSで希釈し、ELISAプレート上で周囲温度でインキュベートした。図2は、構造5A(1)、5B(1)、6A(1)、および6B(1)に対する、SEAM3(10mg/ml)、SEAM7(10mg/ml)、SEAM18(10mg/ml)、およびSEAM30(10mg/ml)の結合を示す。
【0183】
(実施例8)
(構造5A(1)、5B(1)、6A(1)、および6B(2)のウシ血清アルブミン結合体の調製)
ジメチルスルホキシド中の構造5A(1)、5B(1)、6A(1)、または6B(2)の溶液(150μl、約50mM)を、ジメチルスルホキシド中の50μlの0.17M MBS(Pierce Chemical Co.、Rockford、IL)と合わせた。約20μlの1M Hepes緩衝液(Sigma)、pH8.0を、反応から放出される酸を中和するために添加した。周囲温度での1時間のインキュベーションの後、0.5mlの10mg/ml BSA(Imject、Pierce)を添加した。周囲温度での18時間のインキュベーションの後、混合液を、PBSで平衡化した10−DGゲル濾過カラム(Bio−Rad、Richmond、CA)に通すことにより精製した。画分(0.5ml)を収集し、BCAタンパク質アッセイ(Pierce)を使用して、タンパク質の存在について試験した。タンパク質を含有する、カラムから溶出する最初の3画分を合わせた。
【0184】
((a)構造5A(1)、5B(1)、6A(1)、および6B(2)のBSA結合体と、SEAM抗体との、交差反応性)
構造5A(1)、5B(1)、6A(1)、および6B(2)のBSA結合体を、PBS中に1:1000で希釈し、各100μlを、マイクロタイタープレート(Immulon2、Dynatech Laboratories、Incより入手可能)のウェルに添加した。このプレートを4℃で、オーバーナイトインキュベーションした。このウェルをPBSを用いて3回洗浄し、250μlのブロッキング緩衝液で満たし、非特異的結合部位をブロックするために周囲温度で30〜60分間インキュベートした。次に、プレートを、洗浄緩衝液で3回洗浄した。試験する抗体を、PBS中に希釈して、次に、各ウェルあたり100μl添加した。このプレートをカバーし、そして4℃でオーバーナイトインキュベートした。
【0185】
オーバーナイトのインキュベーションの後、このウェルをPBSで5回洗浄し、そして、1ウェルあたり100μlの(PBS中で1:2000に希釈した)アルカリホスファターゼ結合体化抗マウスIgG、IgM、およびIgAポリクローナル抗体(Zymed)とともに、周囲温度で1時間インキュベートした。次にプレートをPBSで洗浄し、そして基質緩衝液中に1mg/mlに希釈した新鮮に調製した基質(p−ニトロフェニルホスフェート、Sigma)100μlを、各ウェルに添加した。405nmでの吸光度の値を約30分後に測定した。図3は、上記の構造5A(1)、5B(1)、6A(1)、および6B(1)に対する、SEAM3(10mg/ml)、SEAM7(10mg/ml)、SEAM18(10mg/ml)、およびSEAM30(10mg/ml)の結合を示す。
【0186】
従って、MenBの独特なエピトープの新規分子模倣物、ならびにこれの取得方法、および使用方法を開示する。本発明の好ましい実施態様は、ある程度詳細に記載されているが、明白なバリエーションが、添付の請求の範囲によって規定される本発明の意図および範囲から逸脱することなく、なされ得ることが理解される。
【0187】
(本発明の実施において有用な株の寄託)
以下のハイブリドーマ細胞株の生物学的に純粋な培養物の寄託を、American Type Culture Collection(ATCC)(12301、Parklawn Drive、Rockville、Maryland)に対して行った。示される受託番号が、生存率試験に成功し、そして必要な手数料の支払い後に、割り当てられた。寄託は、特許手続上の目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するプタペスト条約の条項およびその規則のもとになされた(プタペスト条約)。これは、寄託の日より30年間の期間生存可能な培養物の維持を保証する。その寄託された生物は、ブタペスト条約の条文よって、そしてChiron CorporationとATCCとの間の合意に従ってATCCより利用可能となる。このことは、35U.S.C.§122およびそれに従う米国特許庁長官の規則(37C.F.R.§1.12を含む、特に886OG638を参照)に従い、米国特許庁長官によってその生物に対する権利を与えられると決定される者に対し、その子孫についての永久的かつ無制限の利用可能性を保証する。特許の付与に際して、寄託された培養物に対する公衆の利用可能性についての全ての制限は、取り消し不能に除去される。
【0188】
この寄託は、単に当業者の利便性のために提供され、そして35U.S.C.§112のもとで要求される寄託の承認ではない。これらのハイブリドーマの核酸配列、ならびにそれによってコードされる抗体分子のアミノ酸配列は、本明細書において参考として援用され、そして本明細書における記載でのいかなる矛盾の事象においても、支配的である。寄託された物質の製造、使用、または売却のためには、ライセンスが必要とされ得、そして本明細書においては、そのようなライセンスは、全く付与されない。
ハイブリドーマ 寄託日 ATCC番号
SEAM−3 1996年8月16日 HB−12170
SEAM−18 1996年8月16日 HB−12169
SEAM−2 1997年7月30日 CRL−12380
SEAM−12 1997年7月30日 CRL−12381
【図面の簡単な説明】
【図1A】 図1Aは、ELISA形式における、構造5A(1)(黒菱形)、構造5B(1)(黒四角)、構造6A(1)(黒三角)、および構造6B(1)(黒丸)による、NPr−MenB PSへの、(A)SEAM3(10μg/ml)の結合の濃度依存性阻害を示す。
【図1B】 図1Bは、ELISA形式における、構造5A(1)(黒菱形)、構造5B(1)(黒四角)、構造6A(1)(黒三角)、および構造6B(1)(黒丸)による、NPr−MenB PSへの、(B)SEAM7(10μg/ml)の結合の濃度依存性阻害を示す。
【図1C】 図1Cは、ELISA形式における、構造5A(1)(黒菱形)、構造5B(1)(黒四角)、構造6A(1)(黒三角)、および構造6B(1)(黒丸)による、NPr−MenB PSへの、(C)SEAM18(μg/ml)の結合の濃度依存性阻害を示す。
【図1D】 図1Dは、ELISA形式における、構造5A(1)(黒菱形)、構造5B(1)(黒四角)、構造6A(1)(黒三角)、および構造6B(1)(黒丸)による、NPr−MenB PSへの、(D)SEAM30(10μg/ml)の結合の濃度依存性阻害を示す。
【図2】 図2は、ELISA形式における、構造5A(1)(黒棒)、構造5B(1)(白棒)、構造6A(1)(影棒)、および構造6B(1)(斜線棒)に対する、SEAM3(10μg/ml)、SEAM7(10μg/ml)、SEAM18(μg/ml)、およびSEAM30(10μg/ml)の結合を示す。
【図3】 図3は、構造5A(1)、構造5B(1)、構造6A(1)、および構造6B(1)のBSA結合体とSEAM抗体との交叉反応性を示す。特に、図3は、構造5A(1)(黒棒)、構造5B(1)(白棒)、構造6A(1)(影棒)、および構造6B(1)(斜線棒)に対する、SEAM3(10μg/ml)、SEAM7(10μg/ml)、SEAM18(μg/ml)、およびSEAM30(10μg/ml)の結合を示す。
Claims (10)
- ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)血清型B(MenB)の独特なエピトープの分子模倣物を、薬学的に受容可能な賦形剤と組合せて含む、哺乳動物被験体においてナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)血清型B疾患を、予防するための組成物であって、以下の構造:
- 前記分子模倣物がキャリア分子に共有結合している、請求項2に記載の組成物。
- 前記分子模倣物がキャリア分子に非共有結合的に会合している、請求項2に記載の組成物。
- さらに、免疫学的アジュバントを含む、請求項2に記載の組成物。
- 哺乳動物被験体においてナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)血清型B疾患を、予防するための組成物の製造における、請求項1に記載の分子模倣物の使用。
- 前記組成物が免疫学的アジュバントをさらに含む、請求項6に記載の使用。
- 請求項1に記載のナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)血清型B(MenB)の独特なエピトープの分子模倣物を単離するための方法であって、該方法が:
(a)MenBの独特なエピトープの推定分子模倣物を含む分子の集団を提供する工程;
(b)該集団を、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)血清型B莢膜ポリサッカリド(MenB PS)に対して指向され、そして自己反応性ではない抗体と、ELISAにおいて接触させる工程であって、該接触させる工程を、該抗体と存在する場合該分子との間の免疫学的結合を可能にして複合体を提供する条件下で実施する、工程;ならびに
(c)該複合体を、該結合していない分子から分離する工程、を包含する、方法。 - ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)血清型B抗体を、生物学的サンプル中で検出するための方法であって、該方法は以下の工程:
(a)生物学的サンプルを提供する工程;
(b)該生物学的サンプルと、請求項1に記載の分子模倣物とを、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)血清型B抗体が、該生物学的サンプル中に存在するときに、該分子模倣物に
結合して、抗体/模倣物複合体を形成することを可能にする条件下で、反応させる工程;ならびに
(c)該複合体の存在または非存在を検出し、それにより、該サンプル中でのナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)血清型B抗体の存在または非存在を検出する工程、を包含する、
方法。 - ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)血清型B感染を検出するための免疫診断試験キットであって、該試験キットが、請求項1に記載の分子模倣物および該免疫診断試験を行うための指示書を含む、キット。
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