SU1708846A1 - Штамм бактерий NeISSeRIa меNINGIтIDIS серогруппы В - продуцент капсульного полисахарида и полисахаридно-белкового комплекса - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехноло- '"ии и касаетс  получени  нового штамма бактерий Neisserla meningitidfs-продуцента капсульного В-полисахарида и полисаха-' ридно-белкового комплекса и может быть использовано в производстве менингокок- ковых препаратов. Целью изобретени   в- лйвтс  получение штамма бактерий N.meningitidls серогруппы В № 125 (коллекци  ГИСК им. Л.А.Тарасевича), активно продуцирующего В-полисахарид. Выход наиболее крупных молекул В-полисахарида, выделенного из биомассы предлагаемого штамма, в 1,5 раза выше, чем при использовании известных штаммов. Уровень антител к полисахариду менингококка серогруппы В в сыворотках животных, полученных к пол- исахаридно-ббелковому комплексу предлагаемого штамма менингококка, в 3 раза превосходит уровень аналогичных антител в сыворотках, полученных к полисахаридно- белковому комплексу известного штамма. 3 табл.Изобретение относитс  к биотехнологии и касаетс  получени  нового штамма бактерий Neisserla menlngltldis - продуцента капсульного! В-полисахарида и полиса- харидно-белкового комплекса и может быть использовано в производстве менин- гококковых препаратов.Большинство диких штаммов менингококка серогруппы В продуцирует группос- пецифический капсульный полисахарид (В-полисахарид)-сиаловую кислоту в незначительных количествах, что не позвол ет ис- пользовать эти штаммы в качествепродуцентов В-полисахарида и полисаха- ридно-белкового комплекса.Известны штаммы бактерий Neisserla meningltidls серогруппы В - продуценты капсульного полисахарида.Недостатком этих штаммов  вл етс  небольшой выход В-полисахарида, что выражаетс  в низком уровне антител к В-пол- исахариду у мышей, иммунизированных 10 мкг полисахаридно-белкового антигена внутрибрюшинно.Цель изобретени  - получение штамма бактерий Neisserla menlngltidis серогруппы В NS 125 (коллекци  ГИСК им. Л.А.Тарасеви-XIО 0000Ь. о

Description

ча), активно продуцирующего В-полисахарид .

Штамм получен путем селекции из музейного штамма N.menlngitldis ВС-5, хран щегос  также в коллекции ГИСК им, Л.А.Тарасевича.

Дл  этого из отдельно выросших на чашках Петри с 20%-ным сывороточным агаром Хоттингера колоний отбирали колонии в S-форме . При изучении их в косопровод щем свете и с использованием бинокул рной лупы колонии должны быть  ркие радужные с переходом цвета от оранжевого в зелено-голубой с узким оранжевым или зеленым наружным краем.

8 том случае, когда колонии отвечают описанным требовани м, провод т второй пассаж. Дл  этого типичные колонии в Sформе (по одной) пересевают в пробирки со скошенным сывороточным агаром Хоттиненгера и инкубируют при +37°С в течение 18-20 ч. Провер ют чистоту и морфологию выросших культур в мазках, окрашенных по Грамму в модификации Калины, а также путем посева культур в среды Гисса, серологические свойства - в реакции агглютинации на стекле с гомологичными и гетерологичнымн агглютинирующими менингококковыми сыворотками.

Отобранный штамм, типичный по всем показател м, смывают с кос ка сахарозо-желатиновой средой и лиофильно высушивают. Штамм хран т в лиофильновысушенном со.сто нии с сахарозо-желатиноаым стабилизатором в ампулах в холодильнике при +4-6°С.

Штамм имеет следующую характеристику .

Культура л ьно-морфологические признаки . Мелкие грамотрицательные парные или одиночные кокки одинакового размера. При изучении под электронным микроскопом отмечены закономерные изменени  ультраструктуры клеток в процессе периодического культивировани  в ферментере. В экспоненциальной фазе клетки имеют сохранную ультраструктуру, в том числе полисахаридную микрокапсулу, представл ющую соб.ой мелковетвистый гранул рный компонент, определ емый ультрацитохимической реакцией с рутениевым красным, В фазе максимальной концентрации по вл ютс  лизированные особи, Q большинстве клеток происход т деструктивные изменени .

При визуальном изучении выросших колон лй на плотной среде (1,5% агара Хоттингера с 20% сыворотки крупного рогатого

скота; рост в атмосфере С02 в термостате

при 37°С) и при использовании бинокул рной лупы в естественном освещении колонии в S-форме не более 2 мм в диаметре, прозрачные с голубоватым оттенком, ровными кра ми и голубоватой поверхностью. При изучении колоний в косопроход щем свете (угол наклона светового луча 30) с использованием бинокул рной лупы колонии обладают  рко-оранжевым свечением. Рост штамма возможен на следующих 0 питательных средах: А. Среда Козн-Веллер в модицикации Э.К.Фаньковской, г/л: Кислотный гидролизат казеина18-22

Крахмал растворимый0,5-1,0

5 Однозамещенный

фосфат кали 0,3-0,6

Хлорид магни 0,2-0,5

Сульфат меди0,0005-0,002

Глутаминова  кислота0,5-1,0

0 Цистеин.0,02-0,05

Диализат дрожжей80-100 мл

рН среды6,6-6,8

Б. Синтетическа  среда,г/л: Хлорид кали 0,08-0,010

5 Хлорид натри 5-7

Хлорид аммони 1,24-1,26

Водный сульфат

магни 0,05-0,07

Двузамещенный

0 фосфат.натри  2,3-2,7

Цитрат натри 0,4-0,6

L-Моноглутамат натри 1,2-1,4

L-цистеин гидрохлорид0 ,02-0,04 6 Сульфат железа0,001 рН среды 7,2-7,4 устанавливают с помощью 1N HCI. Непосредственно перед употреблением добавл ют 40%-ный раствор глюкозы из расчета 1,5-1,6 г/л среды. 0 Физиолого-биохимические признаки. Отношение к источникам углерода: при выращивании на среде Гисса с глюкозой или лактозой, или маннитом, или сахарозой или мальтозой сбраживает только глюкоза и 5 мальтоза с образованием кислоты без газа. Отношение к источникам азота: ассимилирует аммонийный азот.

Генетической особенностью штамма  вл етс  его ауксотрофность по цистеину. 0 Не нуждаетс  в витаминах.

Оптимальна  температура роста 3637°С , Рост возможен при рН среды от 6,2 до 7,2, оптимум 7,0.

Аэроб, оптимальный дл  роста  вл етс  5 концентраци  растворенного в среде кислорода 5-20%.

Штамм синтезирует группоспецифический В-полисахарид и большой набор белков с различной молекул рной массой, среди которых преобладает белок с молекул рной массой 41 кд, относ щийс  ксеротипу 2,  вл етс  продуцентом полисахаридбелкового комплекса.

При испытании на белых мышах весом 12-14 г по тесту острой токсичности штамм токсичен. LDso составл ет 4-13 млрд. клеток .

Группова  специфичность штамма. Штамм дает положительную реакцию агглютинации на стекле (3-4 креста) с менингококковой гомологичной серогруппы В сывороткой и не агглютинируетс  с сыворотками других серогрупп: А. С, D. X, Y, Z, 29Е, W - 135. На основе культуры менингококка серогруппы В предложенного штамма получают кроличьи иммунные сыворотки , группоспецифический полисахарид.

Антигенную активность культур изучают через гру поспецифич.ескую активность сывороток. В табл.1 представлены данные реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) титровани  сывороток менингококковых серогруппы В, полученных при иммунизации кроликов культурами менингококка предлагаемого штамма, в сравнеНИИ с аналогичными данными на известных Штаммах. Из таблицы видно, что в зтом тесте наблюдаетс  высока  специфичность и активность сывороток. Кроме этого, можно отметить значительную разницу з титрах антител между сыворотками, полученными при иммунизации культурами менингококка предложенного штамма, и сыворотками, полученными к известным штаммам.

Результаты реакции агглютинации на стекле и по Ноблю полученных нами сывороток с 46 штаммами различных серогрупп также свидетельствуют о высокой активности и строгой групповой специфичности.

Из культуры менингококка предложенного штамма известным методом выдел ли препараты полисахаридно-белкового комплекса .

В указанных препаратах определ ли пептидный состав с помощью злектрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натри . При анализе денситограмм указанных комплексов вы влено, что во всех препаратах присутствует основной пептид с молекул рной массой 41 КД.

Результаты изучени  молекул рных параметров и антигенной активности В-полисахарида и полисахаридно-белкового комплекса, выделенных из биомассы менингококка предложенного штамма, выращенного в синтетической питательной среде, приведены в табл.2 и 3.

Из табл.2 видно, что полисахарид, выделенный из предложенного штамма, содержит в 1,5 раза больше высокрмолекул рного вещества, чем полисахарид из известного штамма. В-полисахариды из биомассы менингококка серогруппы В предложенного штамма были использованы дл  получени  зритроцитарного диагностикума, который характеризовалс  высокой специфичностью и активностью. Это еще раз подтверждает, что предлагаемый штамм  вл етс  продуцентом активного в антигенном отношении группоспецифического В-полисахарида.

Пример. Модифицированную среду Козн-Веллер (см.выше) в обьеме 6 л в ферментере засевают 100 мл инокул та, содержащего 6 X 10 кл/мл. Инокул т получают смыванием с 5 чашек Петри 18-часовой культуры, выросшей на 20%-ном сывороточном агаре Хоттингера.

Культивирование провод т при ,37°С, рН 7,0-7,2 до конца экспоненциальной фазы роста, которую затем поддерживают непрерывно-синхронным способом в течение 72ч.

Последнее осуществл ют следующим образом.

Выращивание штамма ведут при постепенном увеличении частоты вращени  мешалки от (70 об/мин в начале процесса до 450 об/мин в конце экспоненциальной фазы роста). Растворенный в среде кислород от первоначального насыщени  50-60% снижаетс  к 1-2 ч роста до значений, близких к 10%. В дальнейшем процесс до 5-6 ч роста ведут в данных услови х. К 5-6 ч роста (оптическа  плотность (ОД) достигает значений , равных 2±0,2. В этот момент из ферментера сливают половину объема культуры (3 л) и доливают свежую питательную среду до прежнего объема (6 л). После долива питательной среды ОД становитс  равной 1 ± 0,1. Через 1 ч ОД культуры достигает уровн , существовавшего до первого слива культуры, т.е. 2 ±0,2. Врем  генерации 1 ч. В дальнейшем такие сливы культуры с последующими доливами свежей питательной среды производ т периодически через 1 ч до получени  необходимого объема культуры.

В момент долива питательной среды, т.е. в начале каждого цикла уровень растворенного в среде кислорода поднимаетс  до 20% от полного насыщени , затем через 1 ч в момент слива уровень растворенного в среде кислорода падает до 10%.

Дл  получени  1 г полуочищенндго полисахарида менигококка серогруппы В при

культивировании предложенного штамма в указанных выше услови х необходимо 20 л культуры септической плотностью не менее 2 ± 0,2, которую можно получить за 10 - 12 ч культивировани  в ферментере.

Использование предложенного штамма N.menlngltldls позвол ет получить наиболее качественную в антигенном отношении биомассу менингококка и в большем количестве в сравнении с биомассой менингококка известного штамма, так как выход наиболее крупных молекул В-полисахарида, выделенного из биомассы предлагаемого штамма, в 1,5 раза выше, чем при использовании известных штаммов. Кроме того, уровень антител к полисахариду менингококка серогруппы В в сыворотках животных, полученных к полисахаридно-белковому комплексу предлагаемого штамма менингококка, в 3 раза

превосходит уровень аналогичных антител в сыворотках, полученных к полисахариднобелковому комплексу штамма известного. Следовательно, процессы получени  на основе предлагаемого штамма сывороток, Вполисахарида , необходимого дл  производства эритроцитарного диагностикума , и иммуноферментных тест-систем, а также В-полисахаридно-белкового комплекса , идущего на приготовление менингококковой В-вакцины, будут в 2-3 раза более экономичными.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Штамм бактерий Nelsseria menlngltldis

   серогруппы В N2 125 (коллекци  ГИСК им.

   Л.А.Тарасевича) - продуцент капсульного

   полисахарида и полисахаридно-белкового

   комплекса.

   Таблица 1

   Таблица 2

   9

   Титр антител к В-полисахариду в РПГА в сыворотках крови мышей линии СВА, иммурепарат , Nfe низированных препаратом в дозе 2 мкг на мышь (по сиаловой кислоте)

   129 142 143 146 147

   1708846

   10 Таблица 3

   Уровень антител к В-полисахариду в пересчете на мкг иммуноглобулина мл сыворотки

   1/320

   16 16 16 64 32 1/320 1/320 1/1280 1/640