SU982347A1 - Способ получени гемолизина - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГтаКШИЗИНД путем (иваш1Я гемопизинпродзщирующего -штамма в жидкой питательной среде с последзпющим офде ениём жидкой фазы, содержащей целевой продукт, о т ли ч а ющи йен тем, что, с целью повышени  выхода гемолизина, используют штамм Vibrio Nag Р-11702, а. выращивание ведут на среде, содержащей экстракт дрожжей с 30 мг % аминного азота и.0,3% глицерина.

Description

г

Ф

00

to

со

4

% Изобретение относитс  к медицинской микробиологии. Известен способ получени  гемолизина путем вьфащивани  гемолизинпро уцирующего штамма в жидкой питатель ной среде с последующим отделением жидкой фазы, содержащей целевой продукт 1 . Однако известный способ не обеспе чивает высокого выхода целевого продукта . Целью изобретени   вл етс  повышение выхода гемолизина. Цель достигаетс  тем, что при осуществлении способа получени  гемо лизина путем выра ф вани  гемолизинпродуцирующего штамма в жидкой питательной среде с последунйцим отделением жидкой фазы, содержащей целевой продукт, используют Vibrio Nag Р-11702, а -выраир ванне, ведут на среде, содержащей экстракт дрожжей с 30 мг % аминного азота и 0,3% глицерина. Штамм V. Nag P-t172 вьщелен из речной воды и имеет следующие морфологические и физиологические характе ристики. Клети его в виде изогнутых палочек 9 с умеренно выраженным полиморфизмом , величиной 1,5-2,0 X X ОуЗ-0,4 мк. На пластинах 1,5-2% агаре Мартена (рН 7,6-7,8) через 12-16 ч вибрионы штамма вырастают в виде округлык нежных полупрозрачных в проход щем и слегка голубоватых в отраженном свете колоний. В бульоне и пентонной воде НАГ-вибрион в процессе роста дают разномерное помутне ние и образуют дпенку. Штамм „ Nag Р-11702 обладает оксидазной активностью, ферментирует глюкозу в среде Хью и Лейфсона в аэробных и анаэробных услови х,ферментируют маннит, сахарозуJ маннозу но не расщепл ют арабинозуа лактозу инозит. Обладает протеолитической, диастатической и лецитиназной актив ност ми, образует индол и на продуцирует сероводорода,декарбоксилируе лизин и орнитин, но не имеет дигидр лазы аргинина. Характеризуетс  прот трофным типом питани  на искусствен ных средах. Холерными сыворотками О, йнаба . Огава и R-0 вибрионы этого штамма не агглютинируютс , к холерным фагам С, Эль, Тор, ХДФ-3, 45,5 вибрионы не чувствительны и  вл ютс , нели зогенными. При внутрикишечном зара7 жении кроликов-сосунов НАГ-вибрионы в дозе п-10 не вызывают особых патологических изменений. Штамм несет хромосомальную мутацию к рифампицинорезистентности (более 100 мкг/Дт), котора   вл етс  с одной стороны, его селективным маркером, а с другой способствует лучшей зксперсии исследуемого признака . Так, установлено, что гемолитическа  активность устойчивьк клонов штамма с веро тностью 0,95 вьш:е 631, 5/594,9 ,1/ по сравнению с чувствительными 562,5/530,9-594,1). Штамм V.Nag характеризуетс  выраженной гемолитической- активностью и не обладает гемолизин-дестг. руктивным фактором (энтеротоксином). При сравнительном изучении продукции гемолизина в различных жидких питательных средах сказалось, что в пептоновой воде ее практически не наблюдаетс . В бульонах Мартена, Хоттингера и казеоново-ферментативном гемолитическа  активность очень низка , тогда как в дрожжевой (30 мг % аминного азота) отмечаетс  стимул ци  этой активности. Продукци  гемолизина клетками Р-11702 в жидких питательных средах (37°, рН 7,8, 24 ч инкубации) Гемолитическа  активность, ед/мл культур жидкости Бульон Мартена Бульон Хоттингера Бульон казеиновофермента тивный-2 ,0 Бульон дрожжевой34,0 1%-на  пептонова  вода1,0 Получение гемолизина из клеток предлагаемого штамма продуцента осуществл ют следующим образом. Пример, Взвесь 18 ч агаровой культуры (агар Мартена, рН 7,6) гемолизин-продуцирующего штамма вибриона Р-11702 перенос т в дрожжевой бульон, рН 7,6, приготовленный из очищенного дрожжевого экстракта (30 мг % аминного азота) с 0,3% глицерина . Культуру инкубируют 20-24 ч при,37С со встр хиванием. С целью обеззараживани  за 2 ч до конца срока инкубагщи в культуру добавл ют мертиолат (конечна  концентраци  0,0001%). Клетки отбрасывают центрифугированием при 5000 об/мин, рН надосадочной жидкости устананпивают 7,4 и насыщают до 60%. сухим сульфатом аммони  (рН 7,4). Через 18 ч (4) осадок собирают центрифугированием ., ресуспевдируют в 0,Q1 М фосфатном буфере, рН 7,4, с ЭДТА (0,001 М) и диалиэируют против этого же буфера до полного удалени  следов сернокислого аммони . Проверенный на гемолитическую активность колориметричесКИМ способом препарат подвергают лиофшшзации при естественном подогреве. Удельна  активность вышеуказанного

препарата гемолизина составл ет 250640 усл. ед/мг сухого веса. :

Дл  определени  гемолитической активности необходимо иметь свекую кровь здорового кролика, которую дважды отмьгаают физиологическим раствором с нейтральным. значением рН.. путем центрифугировани  при ЗОбо об/мин, Осадок развод т 1:5 и из полученной суспензии готов т разведение эритроцитов , под которой понимают такую взвесь, котора  после разведени  тилированной водой в 20. раз даёт экстракцию 0,25.

Claims (1)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕМОЛИЗИНА путем выращивания гемолизинпродуцирующего-штамма в жидкой питательной среде с последующим отделением жидкой фазы, содержащей целевой продукт, о тли ч а ющи й с я тем, что, с целью повышения выхода гемолизина, используют штамм Vibrio Nag Р-11702, а выращивание ведут на среде, содержащей экстракт дрожжей с 30 мг X аминного азота и.0,3Z глицерина.

   § £

   с е

   Ф

   00 го со ϊ L -