JP2009525947A - 脱アセチル化シアル酸抗原、これに対する抗体、及び癌療法における使用方法。 - Google Patents

脱アセチル化シアル酸抗原、これに対する抗体、及び癌療法における使用方法。 Download PDF

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Abstract

本発明は、一般に、細胞表面脱Ｎ−アセチル化シアル酸抗原、例えば、少なくとも部分的に脱Ｎ−アセチル化されたガングリオシド及び／又は脱Ｎ−アセチル化シアル酸修飾細胞表面タンパク質を有する癌の診断及び／又は治療に関連する組成方法及び組成物を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００５年１２月２３日に出願された米国特許仮出願第６０／７５３，８４７号の優先権の利益を主張するものであり、その全開示内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。
連邦委託研究に関する説明
本発明は、米国国立アレルギー感染症研究所及び米国国立衛生研究所により授与され
た助成金ＡＩ４６４６４号及びＡＩ４５６４２号に基づく政府支援によってなされた。本発明において、政府は一定の権利を有する。
本発明の背景

一般に、抗癌免疫療法のゴールは、癌細胞から高度に発現されるが、減少したり分泌されない安定した抗原を同定することであって、その抗原は免疫療法の基礎、例えば、癌ワクチンの抗原又は抗体ベースの免疫療法のターゲットとして使用されてきた。最適には、そのような腫瘍抗原が許容される程度に癌標的細胞に対して特異的な免疫反応を誘導し、その結果、治療対象の非癌細胞とのクロス反応によって生じる有害な副作用を減少させるものである。クロス反応が、再配置される細胞に対して影響を与える場合には、免疫療法の特異性に対する要件を緩和することが可能であろう。
例えば、他の抗体が白血病／リンパ腫の治療に使用できるけれども、非ホドキンリンパ腫の抗体（ｍＡｂ）療法の現在の標準は、ＣＤ２０抗原を認識するキメラマウス／ヒトｍＡｂのリツキシマブＴＭである。ＣＤ２０は殆どの成熟Ｂ細胞及びＢ細胞リンパ腫中で高度に発現されており、比較的ゆっくりした発現又は抗原決定基の変更を示し、減少したり又は分泌されたりしない。この抗体は、非癌性のＢ細胞上のＣＤ２０にも結合するが、この細胞集団は、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）などの免疫増強治療剤による補助的な処理によって回復することができる。
細胞表面抗原に結合する抗体のＦｃ領域は、補体沈着、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化することによる細胞溶解（補体依存性細胞障害又はＣＤＣ）又は抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を媒介することができる。一般的という程ではないが、抗体はアポトーシスを誘導するシグナル伝達に影響を与える細胞表面抗原と結合することによって、細胞毒性を示すこともできる。例えば、リツキシマブＴＭの作用機序は完全には理解されていないが、そのＣＤ２０陽性腫瘍細胞に対する細胞毒性効果を抗体依存性ＣＤＣ，ＡＤＣＣとの組合せにより、及びアポトーシスを誘導する細胞内情報伝達経路を活性化することにより発揮しているようである。リツキシマブの成功によって、ＣＤ２２、ＣＤ３０及びＣＤ８０を含む幾つかの他の細胞内抗原がｍＡｂｓによって標的とされてきた。
抗体投与と介したポジティブ免疫療法に加えて、幾つかの活性化免疫手段も探索されてきた。例えば、癌ワクチンは、ヒト化抗体及び／又は補体を活性化することができる細胞内免疫応答、及びオプソニン化貪食作用的腫瘍細胞殺傷を誘導するような腫瘍抗原の投与に関する。例えば、ワクチン組成物には、腫瘍細胞溶解物に基づくもの、及び腫瘍特異的抗原（例えば、タンパク質、ガングリオシド（Ｔａｉ，Ｔら，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅ，１９８５．３５：６０７−１２））、抗イディオタイプ免疫グロブリン（Ｉｇ）など（Ｆｏｏｎら Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２０００．１８：３７６−８４）又は同型の非自己及び自己癌由来の腫瘍特異的ペプチド断片又は過剰発現タンパク質（Ｍｏｒｉｏｋａら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９４．１５３：５６５０−８；Ｍｏｒｉｏｋａ，Ｎ．ら，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９５３２：ｐ５７３−８１）が含まれる。
これらのアプローチの限界は、標的抗原が腫瘍細胞中において典型的にはより高度に発現しているけれども、それらは自己抗原であり、従って、免疫原性に乏しいということであった。従って、癌ワクチンはしばしば癌抗原の免疫原性を増強するために種々の手段、例えば、アジュバンドの組合せ、サイトカインとの同時投与、担体タンパク質との連結、及びインビトロにおける成熟樹状細胞のパルス的活性化などを用いる。最近のトレンドは、自己樹状細胞が単離され、腫瘍溶解物又はペプチドによって刺激され、免疫増強サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキンＩＬ−２及びＩＬ１２、インターフェロンγ）の単独又は組合せにより再注射された患者に対して仕立てられた、より手の込んだワクチン化手段を開発してきた。
発明の概要
本発明は、一般的に、細胞表面脱Ｎアセチル化シアル酸抗原、例えば、少なくとも部分的に脱Ｎアセチル化ガングリオシド及び／又は脱Ｎアセチル化シアル酸で修飾された細胞表面タンパク質などを有する癌の診断方法及び／又は治療方法に関連する組成方法及び組成物に関する。
本開示は、本発明の様々な局面に関するものである。これらの開示には以下の実施例が含まれる。
ある実施形態において、癌細胞の成長の阻害方法が提供される。該方法には、細胞外から接近可能な被検対象中の癌細胞表面上に存在する脱Ｎアセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）エピトープと特異的に結合する抗体を含む薬学上受容可能な製剤を被検対象に投与することが含まれ、該投与は、抗体が結合することによって癌細胞の生存の低下を促進する。関連する実施形態では、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープが細胞分裂の間、癌細胞の表面上に存在する。さらなる関連実施形態において、癌はメラノーマ、白血病又は神経芽細胞腫である。該抗体は注入又は局所的注射によって投与することが可能で、癌細胞を除去するための外科的介入の前、外科的介入と同時に、外科的介入の後に投与することができる。該抗体は、組合せ療法の一部として投与することも可能で、この場合、少なくとも１つの癌化学療法又は放射療法が被検対象に施される。
他の実施形態において、被検対象中の癌細胞の成長を阻害する方法が提供され、該方法には、細胞外から接近可能な被検対象中の癌細胞表面上に存在するＳＥＡＭ−３反応性抗原と特異的に結合する抗体を含む薬学上受容可能な製剤を被検対象に投与することが含まれ、該投与は該抗体が結合することによって癌細胞の生存の低下を促進する。関連する実施形態では、ＳＥＡＭ３反応性抗原が細胞分裂の間、癌細胞の表面上に存在する。さらなる関連実施形態において、癌はメラノーマ、白血病又は神経芽細胞腫である。該抗体は注入又は局所的注射によって投与することが可能で、癌細胞を除去するための外科的介入の前、外科的介入と同時に、外科的介入の後に投与することができる。該抗体は、組合せ療法の一部として投与することも可能で、この場合、少なくとも１つの癌化学療法又は放射療法が被検対象に施される。ある関連する実施形態においては、抗体はＳＥＡＭ３モノクローナル抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−１２１７０）である。さらなる関連する実施形態において、ＳＥＡＭ３モノクローナル抗体は高塩濃度ステップを用いて単離することができ、このステップにおいて、高塩濃度溶液中で該溶液中のＳＥＡＭ３ｍＡｂからの荷電分子の分離を促進するために適した条件下にて、ＳＥＡＭ３モノクローナル抗体を含む組成物をインキュベートする。ＳＥＡＭ３ｍＡｂはこの溶液から単離され、通常、沈殿物を除去してさらにｍＡｂを単離する。
他の実施形態において、被検対象中の癌細胞に対し抗体を誘導する方法が提供され、該方法には脱Ｎアセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）抗原及びアジュバントを含む免疫原性組成物を被検対象に投与することが含まれる。該被検対象は脱Ｎアセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）抗原によって特徴付けられる癌を保持するか又は保持しようとしており、そのような投与は細胞外から接近可能な癌細胞表面上のｄｅＮＡｃＳＡエピトープと特異的に結合する抗体の産生を誘導するのに効果的である。関連する実施形態において、癌はメラノーマ、白血病又は神経芽細胞腫である。さらなる関連する実施形態において、免疫原性組成物のｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原のエクソシアリダーゼ処理によって調製される。さらに関連する実施形態において、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原コンジュゲートであり、例えば、プロピオニル結合又はアセチル結合ｄｅＮＡｃＳＡ抗原コンジュゲートでもよい。
他の実施形態において、被検対象中の腫瘍を検出する方法が提供される。該方法には、癌の罹患が疑われる被検対象から取得した生物学的試料を脱Ｎアセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）エピトープと特異的に結合する抗体と接触させることが含まれ、該接触は生物学的試料中のｄｅＮＡｃＳＡエピトープに対する抗体の特異的な結合に適した条件下で行われ、抗体の結合の有無によって、被検対象中の細胞表面ｄｅＮＡｃＳＡエピトープを保持する癌細胞の有無が示される。
他の実施形態において、被検対象中の腫瘍を検出する方法が提供される。該方法には、癌の罹患が疑われる被検対象から取得した生物学的試料をＳＥＡＭ３反応性抗原と特異的に結合する抗体と接触させることが含まれ、該接触は生物学的試料中のＳＥＡＭ３反応性抗原に対する抗体の特異的な結合に適した条件下で行われ、抗体の結合の有無によって、被検対象中の細胞表面ＳＥＡＭ３反応性抗原を保持する癌細胞の有無が示される。関連する実施形態においては、抗体はＳＥＡＭ３モノクローナル抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−１２１７０）である。
他の実施形態において、適切なｄｅＮＡｃＳＡ抗原である多糖（ＰＳ）誘導体を生産する方法に関する。該方法には、大腸菌Ｋ細菌をＮ−アシル−マンノサミン及びアミン保護マンノサミンを含む成長培地中で培養することが含まれ、該細菌はサプリメンタルマンノサミンの非存在下では被膜多糖を生産することができない。該培養は、アミン保護基及びＮ−アシル化基を有するアミン保護ＰＳ誘導体の生産を提供する。関連する実施形態において、該方法には、アミン保護基を除去し、コンジュゲートＰＳ誘導体を生産するために脱保護基をタンパク質担体に結合させる条件下において、アミン保護ＰＳ誘導体を処理することも含まれる。
ある実施形態において、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原を生産する方法が提供される。該方法には、Ｎ−アシル−マンノサミン及びアミン保護マンノサミンを含む成長培地中で哺乳類細胞を培養することが含まれ、該培養は、アミン保護基及びＮ−アセチル化基を有するアミン保護ｄｅＮＡｃＳＡ抗原の哺乳類細胞上への生産を提供する。関連する実施形態において、該方法には、アミン保護基を除去し、コンジュゲートｄｅＮＡｃＳＡ抗原を生産するために脱保護基をタンパク質担体に結合させる条件下において、アミン保護ｄｅＮＡｃＳＡ抗原を処理することも含まれる。本方法によって生産されるアミン保護ｄｅＮＡｃＳＡ抗原も、本方法、及びそのような哺乳類細胞の膜及び脂質溶解物によって生産される細胞表面ｄｅＮＡｃＳＡ抗原を有する哺乳類細胞の場合と同様に生産される。
他の実施形態において、免疫原性組成物を生産する方法が提供される。該方法には、脱Ｎ−アセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）抗原をエクソシアリダーゼと接触させることが含まれ、該接触は組成物中のＮ−アセチル化シアル酸ポリマー夾雑物の分解に十分な条件下で行われ、該接触はｄｅＮＡｃＳＡ抗原に富んだ組成物を生産する。本エクソシアリダーゼ処理法によって調製されるｄｅＮＡｃＳＡ抗原を含む組成物も提供される。
他の実施形態において、抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体を単離する方法、及びＳＥＡＭ３モノクローナル抗体を単離する方法が提供される。これらの方法には、高塩濃度溶液中に抗体を含む組成物をインキュベートすることが含まれ、該インキュベートは、該溶液中のＳＥＡＭ３ｍＡｂからの荷電分子の分離を促進するために適した条件下で行われ、そして、該溶液からＳＥＡＭ３ｍＡｂを単離することが含まれる。また、抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体と薬学上受容可能な担体を含む組成物も提供され、該抗体は本方法によって単離される。また、ＳＥＡＭ３モノクローナル抗体と薬学上受容可能な担体を含む組成物も提供され、該抗体は本方法によって提供される。
他の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドが提供されるが、該ポリヌクレオチドには、ＳＥＡＭ３軽鎖ポリペプチドの可変領域のｉ）アミノ酸残基２４〜３９、ｉｉ）アミノ酸残基５５〜６１、及びｉｉｉ）アミノ酸残基９４〜１００を含む軽鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれる。関連する実施形態において、コードされる軽鎖ポリペプチドには、ＳＥＡＭ３軽鎖ポリペプチドの可変領域のアミノ酸配列が含まれる。さらに関連する実施形態において、該ポリヌクレオチドを含むベクター及び組換体宿主細胞が提供される。
他の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドが提供されるが、該ポリヌクレオチドには、ＳＥＡＭ３重鎖ポリペプチドの可変領域のｉ）アミノ酸残基２６〜３５、ｉｉ）アミノ酸残基５０〜６６、及びｉｉｉ）アミノ酸残基１０１〜１０８を含む重鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれる。関連する実施形態において、コードされる軽鎖ポリペプチドには、ＳＥＡＭ３重鎖ポリペプチドの可変領域のアミノ酸配列が含まれる。さらに関連する実施形態において、該ポリヌクレオチドを含むベクター及び組換体宿主細胞が提供される。
他の実施形態において、抗体コンジュゲートが提供される。該抗体コンジュゲートには、ＳＥＡＭ３モノクローナル抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−１２１７０）の抗原結合部分及び共有結合部分が含まれ、該共有結合部分はポリエチレングリコール部分、抗癌薬、又は抗体の抗原結合部分である。関連する実施形態において、結合される抗体はＳＥＡＭ３モノクローナル抗体である。
本発明の他の特徴は、本開示を読むことで当業者には容易に明らかとなるであろう。
本発明、及び本発明の特定の例示的な実施形態を記載する前に、本発明が、記載される特定の実施形態に制限されず、もちろんそれ自体変化し得ると理解されるべきである。また、本発明の範囲は添付された請求項によってのみ制限されるため、本明細書で使用される専門用語は具体的な実施形態を記載するのみの目的のためであって、限定的であることを意図していないと理解されるべきである。
数値の範囲が提供される場合には、各々の中間にある数値が、文脈が他に明確に指定しない限りは下限値の単位の少数第１位までであり、範囲の上限値、下限値及び規定された範囲内で他に規定もしくは中間にある数値との間にあることが、本発明に包含されることが理解される。これらのより狭い範囲の上・下限値は、規定された範囲内で任意に特に除外される限度値を条件として、独立して、本発明に同様に包含されるより狭い範囲内に含まれてもよい。また、規定された範囲が限度値の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限度値の一方又は両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
他に定義されない限り、本明細書中で用いられるすべての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されたものと類似又は同等のいかなる方法及び材料も本発明の実施又は試験において用いられることができるが、好ましい方法及び材料が以下に記載される。本明細書で言及されたすべての刊行物は、参考として本明細書中に組み込まれ、刊行物が引用されたことに関連して方法及び／又は材料を開示及び記載される。
本明細書、及び添付された請求項で使用されているように、単数形“a”、“an”、及び“the”は、その文脈が他に明確に指定しない限り、複数の指示対象を含むことに注意する必要がある。それ故、例えば“an antigen”への言及は複数個の当該抗原を含んでおり、また、“the peptide”への言及は１個又はそれ以上のペプチドへの言及を含んでおり、その他これらと同等のことは当業者には周知である。
本明細書において説明される刊行物は本出願の提出日に先立って単独でその開示を提供される。本明細書における何物も、かかる刊行物が先願発明であるという理由で、本発明が先行する権利がないことを承認すると解釈されない。さらに、提供された刊行日付は個別に確認される必要のある実際の刊行日付と異なる場合がある。
発明の詳細な説明
ここに開示される脱Ｎアセチルシアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）抗原組成物は、癌の免疫療法並びに抗体ベース癌化学療法で使用され得る抗体の生産において有用である。従って、本開示はｄｅＮＡｃＳＡ抗原、並びに、抗腫瘍免疫応答を誘導すること及び／又は抗腫瘍免疫応答を増強することにおけるそれらの使用方法を提供するもので、該腫瘍には接近可能な細胞表面ｄｅＮＡｃＳＡ抗原を有する細胞が含まれる。
一般に、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原には脱Ｎアセチルシアル酸残基が含まれ、被検対象に投与すると、癌細胞上のｄｅＮＡｃＳＡエピトープに特異的に結合する抗体を誘導することができる。ある実施形態において、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原はヒト組織上に存在するポリシアル酸（ＰＳＡ）自己抗原と最小の交叉反応性を持つ抗体反応を提供する。最小限ｄｅＮＡｃＳＡエピトープはシアル酸残基の二糖であり、その１又は両方の残基には脱Ｎアセチル化残基が含まれる。最小限ｄｅＮＡｃＳＡエピトープは、１又は複数のシアル酸残基を含む二糖のユニットとして記述することもでき、そのＣ−５アミノ基上のＮ−アセチル化基は遊離アミンの状態にするように除去されているか、又は２残基の１つが脱Ｎ−アセチル化され、２つ目の残基にＮ−アセチルグループが含まれる（いくつかの実施形態においては、Ｎ−プロピオニル基ではない）。この最小限のエピトープを決定する二糖ユニットは還元末端側でも、非還元末端側でもよく、あるいは、シアル酸残基のポリマー中にあってもよい（例えば、多糖内）。Ｎ−アセチル化残基を含むＰＳＡ中では脱Ｎアシル化残基は免疫原性であり、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープと反応する抗体を誘導するが、ヒトＰＳＡ抗原とはわずかに反応するか、検出不能な反応性を示す。
脱Ｎアセチル化ＮｍＢ多糖エピトープは、マウス抗Ｎ−Ｐｒ ＮｍＢ多糖ｍＡｂ（モノクローナル抗体）、ＳＥＡＭ３、Granoffら 1998, J Immunol 160：５０２８（抗Ｎ−Ｐｒ ＮｍＢ ＰＳ ｍＡｂｓ）；US 6,048,527（抗ＮｍＢ抗体）；及びUS 6,350,449（抗ＮｍＢ抗体）を用いて同定された。
本発明はｄｅＮＡｃＳＡエピトープ、及び抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体反応を誘導するホストに投与するのに適合された製剤に関する。ｄｅＮＡｃＳＡ抗原組成物は抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ免疫応答、特に、抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体反応を誘導するための被検対象への投与に対して適合させることが可能で、以下に詳細に論じられるように、該免疫応答は、ある癌細胞表面上に存在するｄｅＮＡｃＳＡエピトープに対する免疫応答である。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原組成物は、癌細胞表面上のｄｅＮＡｃＳＡエピトープ（例えば、ｄｅＮＡｃガングリオシド又はｄｅＮＡｃシアル酸修飾表面接近可能タンパク質）と特異的に結合する抗体を産生するために使用することができる。そのような抗体は抗体ベース癌療法において有用である。
本発明の他の特徴がここに開示され、本開示を読んだ当業者において容易に明らかとあんるであろう。
定義
ここに示される定義は優先権出願中に見出されるものとの関連を規制する。
「脱Ｎ−アセチルシアル酸抗原」（「脱Ｎ−アセチル化シアル酸抗原」又は「ｄｅＮＡｃＳＡ抗原」とも記載される）は、ｄｅＮＡｃシアル酸エピトープ（ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ）を有するか又は模倣する化合物のことを指し、該エピトープは、シアル酸又はシアル酸誘導体残基のダイマーによって最小限度に限定され、該ダイマーはＮ−アシル化（例えば、アセチル化又はプロピオニル化）シアル酸残基又はシアル酸誘導体残基に隣接して少なくとも１つの脱Ｎ−アセチル化シアル酸残基を含む。脱Ｎ−アセチルシアル酸抗原の例として、多糖誘導体（「ＰＳ誘導体」）、脱Ｎ−アセチル化ガングリオシド、及びシアル酸修飾タンパク質の脱Ｎ−アセチル化誘導体、特に、哺乳類細胞の細胞外表面に接近可能な部分的にシアル酸修飾したタンパク質、特に、ヒト細胞、さらに特別には、癌細胞、特別には、ヒト癌細胞が提供される。出発分子の誘導体（例えば、ＰＳ誘導体又はガングリオシド誘導体）としてのｄｅＮＡｃＳＡ抗原の記載は、脱Ｎ−アセチルシアル酸抗原の生産方法としして限定されることを意味するものではなく、むしろ、例示としてのｄｅＮＡｃＳＡ抗原の構造を記述する便利な方法としての意味を持つ。
「ＳＥＡＭ３反応性抗原」は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＳＥＡＭ３が特異的に結合するエピトープを持つ抗原を指す。ＳＥＡＭ３反応性抗原の例として、実施例中に示されている。
「細胞表面抗原」（又は「細胞表面エピトープ」）は、細胞の如何なる細胞周期の段階であっても細胞外から接近可能である細胞表面抗原（又はエピトープ）のことであり、細胞分裂の間に主として又は唯一細胞外から接近可能な抗原を含む。この場合「細胞外から接近可能」とは、細胞膜の可溶化を必要とせずに細胞の外側から提供される抗体が結合し得る抗原のことである。
ここで使用される「ＰＳ」は、多糖、普通は被膜多糖、具体的には１つ又はそれ以上の脱アセチル化残基を有する被膜多糖を指し、髄膜炎菌又は大腸菌の被膜多糖を含んでおり、Ｂ群髄膜炎菌及び大腸菌Ｋ１は特に興味深い。ここで使用される「ＮｍＢ ＰＳ」は、Ｂ群髄膜炎菌のＰＳを指す。本明細書全体においてＮｍＢ ＰＳへの言及は、本発明に関する組成物の生成及び方法の使用が可能なＰＳ構造の例示的なものである。
ここで使用される「ＰＳ誘導体」は、修飾された、普通は化学修飾された多糖（ＰＳ）、具体的にはＢ群髄膜炎菌又は大腸菌Ｋ１のＰＳを指し、１つ又はそれ以上のＮ−アセチル基の代わりに遊離アミン（すなわち１級アミン）を有するＰＳ誘導体は特に興味深い。幾つかの実施形態において、ＰＳ誘導体はＮｍＢである。他の実施形態において、ＰＳ誘導体は生合成的生産されたガングリオシド誘導体（例えば、哺乳類細胞中、癌性哺乳類細胞中に生産される）である。ここで使用される「ＰＳ誘導体」にはここで記述されるような保護ＰＳ誘導体が含まれる。
本明細書で使用される「脱Ｎ−アセチル化ＰＳ誘導体」は、１つ又はそれ以上の脱Ｎ−アセチル化残基、例えば、多糖誘導体の１つ又はそれ以上の残基のＣ−５位置に１つ又はそれ以上の遊離アミンを有するＰＳ誘導体を指す。「脱Ｎ−アセチル化ＰＳ誘導体」なる用語は、脱Ｎ−アセチル化ＰＳ誘導体が、ＰＳ分子からアセチル基を除去することを含むプロセスによって生成されるＰＳ誘導体に限定されることを意味するものではないが、その代わり、他に特に指示がない限り、任意の適当な方法（例えば、ＰＳ生合成時にＰＳ分子に組み込まれたトリハロアシル保護基を除去することにより脱Ｎ−アセチル化ＰＳ誘導体中に遊離アミンが生成される生合成的手法によって）で生成される脱Ｎ−アセチル化ＰＳ誘導体を包含することを意味する。さらに、「脱Ｎ−アセチル化残基」は、ここではＰＳ誘導体との関連で、天然アセチル基の代わりに１級アミンを有する分子中のシアル酸残基に言及するのに用いられる。
「遊離アミン」及び「１級アミン」は、ここでは互換的に、例えば、「Ｒ」が本発明のＰＳ誘導体のシアル酸残基であるＲＮＨ２において見られるようなＮＨ２基に言及するのに用いられる。
「ｄｅＮＡｃＳＡ抗原」は、通常、共有結合で担体分子（例えば担体タンパク質）と結合するｄｅＮＡｃＳＡ抗原を指す。例えば、脱Ｎ−アセチルシアル酸抗原コンジュゲートには、「ＰＳコンジュゲート」が含まれ、「ＰＳコンジュゲート」は、担体分子（担体タンパク質など）と、α（２→８）Ｎ−アセチルノイラミン酸又はこのモノマー単位を含む他の多糖体のホモリニアポリマー、又は本発明の脱Ｎ−アセチル化ＰＳ誘導体を含む誘導体とのコンジュゲートを指す。特に興味深いのは、担体タンパク質と髄膜炎菌被膜多糖（具体的にはＢ群被膜多糖体）の誘導体とのコンジュゲート、具体的には、本発明の脱Ｎ−アセチル化ＰＳ誘導体である。また特に興味深いのは、担体タンパク質と大腸菌Ｋ１被膜多糖の誘導体とのコンジュゲート、具体的には、本発明の脱Ｎ−アセチル化ＰＳ誘導体である。
脱Ｎ−アセチルシアル酸抗原とコンジュゲートした担体との関連でここで使用される「担体」は、通常、抗原に結合された場合に、Ｔ細胞を活性化かつ回復するＴ依存性抗原としての機能を果たし、それによりＴ細胞依存性抗体の産生を増大させる物質を指す。強力な免疫原性担体が本発明の範囲内にあるが、担体はそれ自体強力な免疫原性である必要はない。これに関連して、担体は通常ポリペプチドであり、タンパク質の全部又は断片でもよい。
「コンジュゲートした（Conjugated）」は、通常、共有又は非共有の、一般に、共有の化学結合を指し、近位で脱Ｎ−アセチル化ＰＳを担体と結合させ、その結果、コンジュゲートされていない脱Ｎ−アセチルシアル酸抗原と比較して、担体コンジュゲート脱Ｎ−アセチルシアル酸抗原が免疫原性を増大させている。
ここで使用される「化学療法」とは、薬剤（例えば、薬物、抗体など）、特に癌細胞に選択的に破壊性を有する薬剤の、疾患の治療中、特に興味のある癌の治療においての使用のことである。
「免疫療法」とは、疾患抗原に対する免疫反応を調節することによる疾患（例えば、癌）の治療のことを指す。本明細書中では免疫療法は、抗体（例えば、モノクローナル抗体）の投与による被検対象中における抗癌免疫反応を提供すること、及び／又は抗原の投与による被検対象中における抗腫瘍免疫反応の誘導のことを指す。
ここで使用される「治療」又は「治療する」とは、被検対象における何らかの療法介入のことを意味し、通常は哺乳類対象、一般にヒト患者であり、（ｉ）予防、つまり臨床的徴候の進行の危険を減じることで、進行しない臨床的徴候を引き起こすこと、例えば、有害な状態への疾患の進行を妨げることが含まれる；（ｉｉ）阻害、つまり臨床的徴候の進行又は更なる進行を停止させることで、例えば、腫瘍負荷を減少させるように活発な疾患を緩和又は完全に阻害することであり、該減少には検出可能な癌細胞の除去が含まれる；及び／又は（ｉｉｉ）軽減、つまり臨床的徴候の後退、などが含まれる。
「感染防御免疫」なる用語は、哺乳動物に投与されるワクチン又は免疫化スケジュールが、疾患（例えば、癌）の発生を予防・遅延させるか又はその重篤度を軽減させ、又は疾患の症状を軽減又は完全に解消するような免疫応答を誘導することを意味する。
抗体の結合における「自己反応性」とは、抗体が宿主の抗原（例えば、宿主のポリシアル酸（ＰＳＡ）天然物）と結合することを意味する。自己反応性抗体は、外来抗原（例えば、癌細胞によって提示される腫瘍抗原に対して、ＮｍＢ ＰＳ、又は大腸菌Ｋ１ ＰＳに対して）と同様に宿主の抗原（例えば、非癌性宿主細胞上のＰＳＡ）にも結合するものを含む。「非自己反応性抗体」は、宿主の抗原に有意又は検出可能に結合しない抗体であり、特定の対象中の天然宿主抗原に検出可能に結合しない抗体である。興味深い非自己反応性抗体は、脱Ｎ−アセチルシアル酸エピトープ（例えば、癌細胞の脱Ｎ−アセチル化ガングリオシドのｄｅＮＡｃＳＡエピトープ、ＮｍＢ ＰＳ又は大腸菌Ｋ１ ＰＳのｄｅＮＡｃＳＡエピトープ）に特異的に結合する抗体であって、その抗体は、該抗体が結合する細胞に対する生存可能性の減少を促進することができるものである（例えば、ＮｍＢ及び／又は大腸菌Ｋ１に対し殺菌性であり、及び／又は癌細胞の生存可能性の減少を促進する）。
「免疫応答を誘発させるのに十分な量で」（例えば、調製物中に存在するエピトープに対して）という語句は、特定の抗原調製物の投与前と投与後に測定された免疫応答インジケータ間に検出可能な差異があることを意味する。免疫応答インジケータは以下に挙げるものを含むが、これに限定されない： 酵素結合免疫検定（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、免疫沈降、Ｏｕｃｈｅｒ−Ｌｏｗｒｙ免疫拡散；スポット・ウエスタンブロット・抗原アレイなどの結合検出アッセイ；細胞毒性アッセイ、などのようなアッセイによって検出される抗体の力価又は特異性。
「抗体」（また、「免疫グロブリン」と交換可能に使用される）なる用語は、任意の興味あるクラス（例えば、ＩｇＭ，ＩｇＧ及びこれらのサブクラス）であるポリクローナル及びモノクローナル抗体調製物、並びに、ハイブリッド抗体、変性抗体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ）分子、Ｆｖフラグメント、ファージ上で提示される一本鎖化可変部フラグメント（ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び親抗体分子の免疫学的結合特性を示す機能フラグメントを含む調製物を包含する。ある実施形態、例えば、癌療法において、補体媒介殺傷及び／又は抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を発揮する抗体が特に興味深い。ここで記述される抗体は、検出可能に、例えば、ラジオアイソトープ、検出可能産物を生じる酵素、蛍光タンパク質などでラベル化してもよい。抗体は、細胞毒性分などの他の部分、又は他の分子（例えば、癌細胞への抗癌薬の送達を行うため）、ビオチン（ビオチン−アビジン特異的結合ペアー）などの特異的結合メンバーなどとさらにコンジュゲートしてもよい。また、抗体をポリスチレンプレート又はビーズ、テストストリップなどの支持体（例えば、固体サポート）に結合してもよい。
免疫グロブリンポリペプチドには、κとλ軽鎖、及びα、γ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）、δ、ε及びμ重鎖又は他の種の等価物が含まれる。全長免疫グロブリン「軽鎖」（通常、約２５ｋＤａ又は約２１４アミノ酸）には、アミノ末端側に約１１０アミノ酸の可変領域、カルボキシ末端側にκ又はλの定常領域が含まれる。全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０ｋＤａ又は約４４６アミノ酸）には、同様に、可変領域（約１１６アミノ酸）及び上述の重鎖定常領域の一つ、例えば、γ（約３３０アミノ酸）が含まれる。
免疫グロブリン軽鎖又は重鎖可変領域には、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲｓ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって割り込まれる「フレームワーク領域（ＦＲ）」によって公正される。フレームワーク領域とＣＤＲｓの範囲は厳密に定義されている（"Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1991 and Lefranc et al. IMGT, the international ImMunoGeneTies information system（登録商標）. Nucl. Acids Res., 2005, 33., D593- D597)を参照のこと）。ＩＭＧＴＳシステムがどのように定式化され他のシステムとどのように比較されるかを含む、ＩＭＧＴＳシステムの詳細な論述は、ワールドワイドウェブimgt.cines.fr/ textes/ IMGTScientiflcChart/ Numbering/ IMGTnumberingsTable.html.において提供される。異なる軽鎖又は重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内において比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域は、軽鎖及び重鎖を構成する組み合わされたフレームワーク領域であり、ＣＤＲｓを位置づけ並べる役割を果たしている。ＣＤＲｓは主として抗原のエピトープとの結合の原因となっている。
「キメラ抗体」は、典型的には遺伝子工学的に、異なる種などの異なる抗体に属する可変及び定常領域遺伝子から構築された軽鎖及び／又は重鎖遺伝子を有する抗体のことである。例えば、非ヒト（例えば、マウス）モノクローナル抗体由来の遺伝子の可変断片は、例えば、γ１及びγ３などのヒト定常断片と結合してもよい。治療的キメラ抗体の例として、非ヒト（例えば、マウス）抗体由来の可変又は抗原結合ドメインとヒト抗体由来の定常又はエフェクタードメインから構成されるハイブリッドタンパク質であり、他の哺乳類種も使用可能である。
ここで使用される「ヒト化抗体」又は「ヒト化免疫グロブリン」なる用語は、ヒト抗体由来の対応する位置のアミノ酸で置換された、１又は複数のアミノ酸（例えば、フレームワーク領域、定常領域又はＣＤＲ中に）を含む非ヒト（例えば、マウス又はウサギ）抗体 のことである。一般に、ヒト化抗体は、同じ抗体の非ヒト化バージョンと比較すると、ヒト宿主中において免疫応答の低減を生じさせる。
現在の方法によって設計され製造されたヒト化抗体は、抗原結合又は他の抗体機能に本質的な影響を与えない更なる保存的なアミノ酸置換を有すると理解されている。保存的な置換は、以下のグループのアミノ酸のような組合せが意図される：ｇｌｙ，ａｌａ；ｖａｌ，ｉｌｅ，ｌｅｕ；ａｓｐ，ｇｌｕ；ａｓｎ，ｇｌｎ；ｓｅｒ，ｔｈｒ；ｌｙｓ，ａｒｇ；及びｐｈｅ，ｔｙｒ
変異体抗体などのポリペプチドの「変異体」は、１又は複数アミノ酸残基が、参照配列、例えば、天然に存在するポリペプチドであると思われる親ポリペプチド比較して、変更されたポリペプチドとして定義される。そのような変更には、アミノ酸置換、欠失又は挿入、又はそれらの組合せが含まれる。目的の抗体重鎖又は軽鎖ポリペプチドの変異体は、その基本的な構造特性及び対象物である抗原への結合における生物学的活性、ある実施形態においては、癌細胞の生存可能性の効果的な減少における生物学的活性を維持するものである。
多くのアミノ酸のどれが、どのように置換、挿入又は欠失されるか決定する上での指針は、ポリペプチドの配列を関連する構造及び機能をもつポリペプチドの配列、例えば、他のソース由来の配列（例えば、哺乳類ソース、例えば、ヒト、ラット、マウスなどに由来する配列間の比較）と比較することによって見出すことができる。
抗体の特徴における「抗体の特異的結合」又は「抗原特異的抗体」なる用語は、異なる抗原の均質な混合物中に存在する特定の抗原と好適に結合する抗体の能力のことである。ある実施形態において、特異的結合相互作用は、試料中の好ましい又は好ましくない抗原（又は「標的」及び「非標的」抗原）間を区別し、ある実施形態において、約１０から１００又はそれ以上（例えば、約１０００−又は１０，０００倍を越える）を越える。ある実施形態において、抗体と抗原間の親和性は、抗体−抗原複合体間において特異的に結合した場合、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０Ｍ−８未満、１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、又はさらに下回るＫＤ（解離定数）によって特徴付けられる。
多糖、リン脂質、タンパク質、ペプチドなどの抗原に関する場合の「抗体に特異的に結合する」又は「特異的に免疫反応性のという語句は、他分子の不均質な集団（例えば、サンプル又はインビボ中に）も含んでいる試料中の抗原の存在に基づく、及び／又は証拠となる結合反応を指す。従って、関連する条件下（例えば、設定された免疫アッセイ条件下）では、特に抗体が生じた標的抗原のエピトープへの結合と比較した場合、特定の抗体又は抗体類が特定の抗原又は抗原類と結合し、かつ、試料中に存在する他の分子には有意な量で結合しない。
「置換」は、１又は複数のアミノ酸又はヌクレオチドと、各々、アミノ酸配列又はポリペプチド又は核酸と比較して、異なるアミノ酸又はヌクレオチドとの置き換えによって生じる。ポリペプチドの場合、置換が保存的な場合、ポリペプチド中へ置換アミノ酸は、置換されるアミノ酸と類似の構造又は化学的特徴（例えば、電荷、極性、疎水性など）を有している。天然に存在するアミノ酸の保存的置換は、通常、第１のアミノ酸と同じグループ由来の第２のアミノ酸と第１のアミノ酸との置換によって生じ、アミノ酸グループの例として、以下に示す：ｇｌｙ，ａｌａ；ｖａｌ，ｉｌｅ，ｌｅｕ；ａｓｐ，ｇｌｕ；ａｓｎ，ｇｌｎ；ｓｅｒ，ｔｈｒ；ｌｙｓ，ａｒｇ；及びｐｈｅ，ｔｙｒ
「欠失」は、１又は複数のアミノ酸又はヌクレオチド残基が、各々、天然に存在するのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列と比較した場合存在しないようなアミノ酸又はヌクレオチド配列中の変化として定義される。ポリペプチド又はポリペプチドエレメントアミノ酸又はポリヌクレオチド配列の場合、欠失は約２、約５、約１０から約２０まで、約３０まで又は約５０又はそれ以上のアミノ酸の欠失に関する。本発明のポリペプチドは１又は複数の欠失を含んでもよい。
「挿入」又は「付加」は、各々、天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列と比較した場合、１又は複数のアミノ酸又はヌクレオチド残基の付加によって生じるアミノ酸又はヌクレオチド配列中の変化である。「挿入」は、通常、ポリペプチド又は核酸の配列内に１又は複数の残基を付加することを意味し、一方、「付加」は挿入又は、ポリペプチドのＮ−又はＣ−末端にアミノ酸を付加すること又は核酸の５’又は３’末端にヌクレオチドを付加することを指す。挿入又は付加は、約１０まで、約２０まで、約３０まで、約５０まで又はそれよりも多いアミノ酸であってよい。
「対応するアミノ酸」は、以下に例示されるように、１又は複数のアミノ酸配列を一列に並べた場合、同一の位置（即ち、それらは各々向かい合って並ぶ）のアミノ酸残基のことである。抗体配列を一列に並べ、番号付けをする方法は、Chothia前掲、Kabat前掲、などにおいて詳細に述べられている。当該技術分野（例えば、Kabat 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, DHHS, Washington, DCを参照のこと）において知られているように、しばしば、１、２又は３つのギャップ及び／又は１、２、３又は４残基、又は約１５残基までの挿入（特にＬ３及びＨ３ＣＤＲｓ中において）が、アライメントを達成するために抗体のアミノ酸の１又は両方に対して施される。
「天然」抗体は、抗体の軽鎖及び重鎖免疫グロブリンが多細胞生物の免疫システムによって自然に選択されたもので、これとは逆に、非天然にペアー化された抗体は、例えば、ファージディスプレ、又はヒト化抗体によって調製される。このように、対象の親抗体は、通常、任意のウィルス（例えば、バクテリオファーＭ１３）由来配列を含まない。膵臓、リンパ説及び骨髄は、天然抗体を生産する組織の例である。
任意の抗体重鎖又は軽鎖ポリペプチドの変異体の場合、「置換可能な位置」は、好ましくは抗体の結合活性を低下させることなく、異なるアミノ酸によって置換されてもよいポリペプチドアミノ酸配列の特定の位置である。置換可能な位置を同定する方法、及びそれらがどのように置換できるのかについては、以下に詳細に記述される。置換可能な位置は、「変異耐性位置」をも意味する。
以下に詳細に述べられるように、「親」抗体はアミノ酸修飾のテンプレート又は標的である抗体である。ある実施形態において、アミノ酸は、修飾された抗体を製造するために親抗体に対し「ドナー」抗体によって「提供（ｄｏｎａｔｅｄ）」されてもよい。
以下に詳細に述べられるように、「関連する抗体」は、類似した配列を有し、共通のＢ細胞祖先を持つ細胞によって生産される。そのようなＢ細胞祖先には、再構成された軽鎖ＶＪＣ領域及び再構成された重鎖ＶＪＣ領域を持つゲノムが含まれ、まだ、親和性成熟を行っていない抗体を生産する。「ナイーブ」又は「バージン」Ｂ細胞は膵臓組織に存在し、例えば、Ｂ細胞共通祖先である。関連する抗体は、抗原の同一のエピトープと結合し、典型的には、特に、そのＬ３及びＨ３ＣＤＲｓにおいて、非常に配列が類似している。関連する抗体のＨ３及びＬ３ＣＤＲｓは同一の長さ及びかなりの同一性配列を有する（即ち、０，１又は２残基が異なる）。関連する抗体は、ナイーブＢ細胞祖先において産生された抗体である、共通の抗体祖先を介して関連する。「関連する抗体」はＢ細胞によって産生される共通の抗体祖先を持たない抗体グループを論ずる意図はない。
重又は軽抗体鎖の「可変領域」は鎖のＮ末端成熟ドメインである。ＶＨは抗体重鎖の可変ドメインである。ＶＬは抗体軽鎖可変ドメインであり、κ（Ｋ）又はλアイソタイプであってもよい。Ｋ−１抗体はκ−１アイソタイプを有し、Ｋ−２抗体はκ−２アイソタイプを有し、ＶＬは可変λ軽鎖である。
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、均質な抗体集団を有する抗原組成物を指す。該用語は、作製方法によって限定されない。該用語は、Ｆａｂ分子、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ファージ上で提示される一本鎖化可変部フラグメント（ｓｃＦｖ）、抗体及び非抗体タンパク質の抗原結合部分を含む融合タンパク質、及び親モノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示す他の分子と同様に、全免疫グロブリン分子を包含する。ポリクローナル及びモノクローナル抗体の作製方法は、当技術分野で周知であり、以下にさらに詳細に説明する。
「ポリペプチド」及び「タンパク質」なる用語は、ここでは交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態のことを指し、コード化される又は非コード化アミノ酸、化学的又は生化学的に修飾又は誘導されたアミノ酸を含んでもよく、また、修飾されたペプチド骨格を有してもよい。該用語には、限定はしないが、Ｎ末端メチオニン残基を有しても有さなくてもよく、異種性アミノ酸配列との融合、異種性及び同種性リーダー配列との融合；免疫学的タグタンパク質；融合パートナーとして蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどの検出可能な融合パートナーを持つ融合タンパク質；などが含まれる。ポリペプチドは任意のサイズでよく、「ペプチド」なる用語は８−５０残基長（例えば、８−２０残基）のポリペプチドを指す。
核酸又はポリペプチドとの関連で使用される場合、「異種性」は、通常、核酸又はポリペプチドが、異なる起源（例えば、異なる配列、異なる種の起源の配列など）に由来し、該核酸又はポリペプチドが関連付けられ又は結合された結果、核酸又はポリペプチドが天然では見つからないようなものであることを意味する。例えば、融合タンパク質中において、軽鎖ポリペプチド及びレポーターポリペプチド（例えば、ＧＦＰ）が互いに「異種性」であると言われる。同様に、マウス抗体由来のＣＤＲとヒト抗体由来の定常領域が互いに「異種性」であると言われる。
「単離される」とは、ある化合物が、天然の状態でそれを伴う全部又は一部の成分から分離されることを意味する。「単離される」は、また、製造時にそれを伴う全部又は一部の成分（例えば、化学合成、組換え発現、培地など）から分離された化合物の状態を指すことがある。
「精製された」とは、対象化合物が、天然の状態でそれを伴う成分から分離されたことを意味する。また、「精製された」は、製造時にそれを伴う成分（例えば、化学合成、組換え発現、培地など）から分離され、濃縮された状態で提供された対象化合物を指すのに用いられることがある。通常は、少なくとも５０重量％ないし６０重量％の化合物が、天然にそれに付随するか又は製造時に付随する有機分子が存在しない場合に、化合物は実質的に純粋である。調製物は、概ね対象化合物の少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは９９重量％である。実質的に純粋な化合物は、例えば、天然源（例えば、細菌）からの抽出により、化合物の化学合成により、又は精製及び化学修飾の組み合わせにより、得ることができる。また、実質的に純粋な化合物は、例えば、目的の抗体に結合する化合物を有する試料を濃縮することにより得ることができる。純度は、任意の適切な方法、例えば、クロマトグラフィー、質量分析、ＨＰＬＣ分析などにより測定することができる。
「濃縮される」は、組成物中の物質（例えば、抗体又は抗原）が、抗原組成物が得られた株中の該抗原の濃度よりも、総重量で少なくとも２倍高い濃度、好ましくは少なくとも１０倍高い濃度、より好ましくは少なくとも１００倍高い濃度、そして最も好ましくは１，０００倍高い濃度で存在するように、実験者又は臨床医によって操作されることを意味する。従って、例えば、特定の抗原の濃度が、総調製物（又は総タンパク質）のグラムあたり１マイクログラムである場合、濃縮調製物は総調製物（又は総タンパク質）のグラムあたり少なくとも３マイクログラムを含有することになる。
細胞の「不活性化」は、ここでは細胞が子孫を作るための細胞分裂をできないようなることを指す。それにも関わらず、該細胞は、例えば、細胞表面分子（例えば、細胞表面タンパク質又は多糖）の生産を提供するために、ある期間の刺激及び／又は生合成に対して応答することができる。
「ｄｅＮＡｃＳＡ抗原に関し免疫学的にナイーブである」なる用語は、単独又は巨大分子との関連で、免疫応答を引き起こす（例えば、プライムすること）のに十分な量でここに開示される脱Ｎ−アセチルシアル酸抗原（例えば、ＰＳ誘導体）に曝露されたことのない個体（例えば、ヒト患者などの哺乳動物）を意味する。個体が脱Ｎ−アセチルシアル酸抗原コンジュゲートワクチン（１回又はそれ以上の投与）に曝露されたことがある場合、その個体は防御抗体を産生する性向がある。
「プライムされた」対象とは、免疫応答を誘発するのに十分な量で抗原（例えば、脱Ｎ−アセチル化ＳＡ抗原）に曝露されたことがあり（例えば、投与により）、その後同一又は第二抗原（例えば、脱Ｎ−アセチルシアル酸抗原コンジュゲート）に曝露することにより、防御的免疫応答を提供する対象を指す。
「臨床的に妥当でない自己抗体応答」とは、ここに開示される免疫方法を用いることにより、従来のＮｍＢ多糖ワクチン（例えば、米国特許４，７２７，１３６号（N-Pr-NmB conjugate vaccine）に記載のＰＳコンジュゲートワクチン）を用いてナイーブな対象の免疫化を行った後の自己抗体の産生と比較して、自己抗体の産生が少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又はそれ以上減少することを意味する。
ここで使用される「薬学上許容しうる賦形剤」は、被検対象に対象化合物を投与するのに薬学上許容しうるビークルを提供する任意の適切な物質を指す。「薬学上許容しうる賦形剤」は、薬学上許容しうる希釈剤、薬学上許容しうる添加剤、及び薬学上許容しうる担体とされる物質を包含することができる。
ここで使用される「組み合わせて」とは、例えば、第１の療法が第２の療法の施術中の全経過の間施される場合；第２の療法の施術前に第１の療法の施術が開始され、第２の療法の施術終了前に第１の療法の施術が終了するなど、第２の療法の施術とオーバーラップするある一定期間、第１の療法が施される場合；第１の療法前に第２の療法が開始され、第１の療法の終了前に第２の療法が終了する場合；第２の療法が開始される前に第１の療法が開始され、第１の療法が終了する前に第２の療法が終了する場合；第１の療法が開始
される前に第２の療法が開始され、第２の療法が終了する前に第１の療法が終了する場合など、を指す。また、このような場合、「組み合わせて」は、２又は複数の療法の施術に関与する措置も意味することがある。ここで使用される「組み合わせて」とは、同一又は異なる製剤、同一又は異なる経路、及び同一又は異なる投与形態で施術される２又は複数の療法をも意味する。
「被検対象」、「宿主」、「患者」及び「個体」は、診断又は治療が望まれる任意の哺乳動物対象、特に、ヒトを意味するように、ここでは交換可能に用いられる。他の対象としては、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、マウス、ウマなどが含まれる
ここで開示される癌の療法及び診断に関し、「被検対象」又は「患者」は、腫瘍を保持しているか、保持していると疑われるか、又は腫瘍の進行の危険に曝されている被検対象を指し、該癌が細胞表面に脱Ｎ−アセチルシアル酸抗原（例えばは、少なくとも部分的に脱Ｎ−アセチル化されたガングリオシド、脱Ｎ−アセチル化シアル酸修飾タンパク質）を有する癌細胞に関連している場合に、ここでは交換可能に使用されるこのような被検対象由来の試料は本発明の方法において使用するのに適している。
ここで使用される場合、「決定する」、「測定する」及び「評価する」及び「アッセイする」なる用語は、交換可能に使用され、定量的又は定性的判定の両方が含まれる。
請求項は任意の付加的又は選択的な要素を排除するように記載され得ることに留意される。この場合、本主張は、請求項の要素の引用、又は「消極的」な限定の使用と関連して、「単に」、「唯一」などの排除的語法の使用に基づく先行詞として役立つことが意図される。
ＤｅＮＡｃＳＡ抗原及びコンジュゲート
本発明の開示の脱Ｎ−アセチルシアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）抗原には、少なくともシアル酸又はシアル酸誘導体の二量体の最小エピトープが含まれ、該二量体は、Ｎ−アシル化した（例えば、アセチル化又はプロピオニル化した）シアル酸残基又はシアル酸誘導体残基に隣接した少なくとも１個の脱Ｎ−アセチル化されたシアル酸残基を含む。ここでｄｅＮＡｃＳＡエピトープと称される、この二量体エピトープは、脱Ｎ−アセチルシアル酸抗原の任意の溶媒接近可能領域内に配置されることができる。例えば、脱Ｎ−アセチル化ＰＳなどのように、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原がポリマー（例えば、多糖）内に配置される場合、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープは還元末端、非還元末端、又は化合物の内部（例えば、化合物の還元末端・非還元末端から１、２、３，４，５、１０個又はそれ以上の残基）に配置されてもよい。二量体エピトープはｄｅＮＡｃＳＡ抗原内の１個又はそれ以上の
二量体単位として存在することができる（例えば、連続又は非連続の二量体反復単位と
して）か、又はｄｅＮＡｃＳＡ抗原内に存在する他の単位内部に存在することができる（例えば、三量体単位内部に、連続又は非連続の反復単位として存在してもよい）。本発明の範囲内にある例示的な分子を図６−３３に示す。
出発物質又は骨格として細菌性ＰＳ又はガングリオシドを有するものが含まれる、ここで記述されるすべてのｄｅＮＡｃＳＡ化合物は、ここに記載されるすべての免疫、療法、及び診断方法において使用することができる。従って、例えば、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原（例えば、ＮｍＢ ＰＳを用いて作った）は、癌ワクチンに関連して使用することができ、癌の治療に使用される抗体を作るのに使用することができる。同様に、脱Ｎ−アセチルシアル酸抗原（例えば、哺乳類細胞ガングリオシドを用いて作られたものなど）は、ＮｍＢ ＰＳワクチンに関連して使用され、診断においてＮｍＢ ＰＳを検出するために使用される。
ここで記述される、本発明の方法に有用なｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、一般に、少なくと
も１個の二量体エピトープを含み、完全に脱Ｎ−アセチル化された多糖又は少なくと
も部分的に脱Ｎ−アセチル化された多糖に存在することができ、また、ホモポリマー又はヘテロポリマー分子中に存在することができる。例えば、本発明のｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、以下に示すように１つ又はそれ以上の構造を含むことができる（例えば、以下の化学式Ｉ〜ＶＩＩＩを参照）。ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０個又はそれ以上のシアル酸残基、又はその誘導体を含むことができ、重合度（Ｄｐ）が約２〜約６０、約１０〜約５０、約３０〜約５０、約１０〜約２０、又は約１２〜約１８であってよく、Ｄｐが約２〜約１０のものは特に興味深い。より小さなサイズのｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、適当な大きさ及び／又は免疫原性の分子を提供するために、さらに修飾（例えば、担体へのコンジュゲート、脂質化など）を含むことができる。ｄｅＮＡｃＳＡ抗原はさらに、３，４，５，６，７，８，９又は１０個又はそれ以上の隣接した脱Ｎ−アセチル化残基を含むことができ、いくつかの実施形態では、特に、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原がＮ−アセチル化及び脱Ｎ−アセチル化残基のみから構成され、それ以上の修飾（例えば、担体とのコンジュゲートによる、又は還元末端のシアル酸残基を修飾して二級アルキルアミンを含むことによる）を受けていない場合に、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原の脱Ｎ−アセチル化残基は該分子の総残基の３０％又はそれ未満でもよく、また、Ｎ−アセチル化残基は該分子の総残基の約７０％又はそれより多くてもよい。最小限ｄｅＮＡｃＳＡエピトープが存在する場合、「脱Ｎ−アセチル化」とは、シアル酸残基のポリマー中の任意の数の脱Ｎ−アセチルシアル酸残基のことを意味し、その結果、「脱Ｎ−アセチル化」には、「少なくとも部分的に脱Ｎ−アセチル化された」との用語が含まれることに注意する必要がある。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、被検対象に投与された場合に、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープを提示する癌細胞と結合し、被検対象のＰＳＡと（例えば、非癌細胞に見いだされるヒトＰＳＡ）有意又は検出可能な交差反応を起こさない抗体の産生を誘発させる。抗ｄｅＮＡｃＳＡ抗原抗体は、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープを提示する癌細胞の生存可能性の減少を促進する。
一般に、対象のｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、少なくとも部分的に脱Ｎ−アセチル化されており、その結果、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、例えば、多糖残基又はその誘導体からなる双性化合物であって、１又は複数の二量体、及び／又は１又は複数の三量体を含み、前述のようにエピトープを含む。脱Ｎ−アセチルＰＳ誘導体などのｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、一般に、少なくとも１個の二量体エピトープを含み、ただし二量体エピトープは、（１）１番目及び２番目の脱Ｎ−アセチル化残基；（２）１番目のＮ−アシル化残基及び２番目の隣接した脱Ｎ−アシル化残基（すなわち、遊離アミン基を有する残基）であって、ただしＮ−アシル化残基はＮ−プロピオニル（Ｎ−Ｐｒ）基ではない；又は（３）１番目の脱Ｎ−アシル化残基（すなわち、遊離アミン基を有する残基）及び２番目の隣接したＮ−アシル化残基を有することを特徴とする。ある実施形態では、Ｎ−アシル化残基は不飽和アシル基を含む；さらなる実施形態では、Ｎ−アシル化残基はＮ−プロピオニル（Ｎ−Ｐｒ）基を含まない（すなわち、二量体中のシアル酸残基はＮ−プロピオニル化されていない）。
ここで使用される「アシル基」は、飽和又は不飽和アシル基、通常、飽和又は不飽和Ｃ２−１８アシル基、飽和又は不飽和Ｃ２−１６アシル基、飽和又は不飽和Ｃ２−１２アシル基、飽和又は不飽和Ｃ２−１０アシル基、飽和又は不飽和Ｃ２−８アシル基、飽和又は不飽和Ｃ２−６アシル基、飽和又は不飽和Ｃ２−４アシル基、又は飽和Ｃ２−４アシル基を含む。ここで使用される飽和アシル基は、飽和アルキル基に結合したカルボニルを指すことを意図する；ここで使用される不飽和アシル基は、不飽和アルキル基に結合したカルボニルを指すことを意図する。いくつかの実施形態では、不飽和アシル基は特に興味深い。二量体の残基は、ラクトン又は環状シアル酸などのシアル酸又はシアル酸誘導体とすることができる。
従って、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、シアル酸分子部分又はその誘導体（例えば、ラクト
ン、環状シアル酸など）の１又は複数の脱Ｎ−アセチル化残基を含んでおり、その脱Ｎ−アセチル化残基は、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原内部の還元末端・非還元末端に、又はｄｅＮＡｃＳＡ抗原内部（すなわち還元及び非還元末端の間）に配置されることができ、その結果、還元末端に脱Ｎ−アセチル化残基を有するｄｅＮＡｃＳＡ抗原は特に興味深い。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、単一の二量体エピトープを含む構造か、２個又はそれ以上の二量体エピトープを含むポリマー単位として提供されてよい。ｄｅＮＡｃＳＡ抗原はホモポリマー又はヘテロポリマー構造でもよく、いくつかの実施形態では追加の脱Ｎ−アセチル化又はＮ−アセチル化シアル酸残基と同様に、以下の１又は複数の構造から構成されてもよい。「ｎ」単位（例えば、二量体又は三量体の単位）に関して以下の化学式が与えられる場合、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、多数の当該「ｎ」単位を含むことができる。例えば、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、所与の二量体又は三量体構造の２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上の連続又は非連続の単位を含むことができ、ただし「ｎ」は各単位内部の連続した二量体又は三量体構造の数を指す。当該二量体又は三量体構造は、シアル酸残基によって分離されることができる。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、さらに、多糖ポリマーの非還元末端、還元末端、又は非還元・還元末端の両方でシアル酸残基又はその誘導体と結合している追加の分子部分を含むことができる。
ある実施形態において、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、次式により表される構造を有するものを含む：
Figure 2009525947
式Ｉ
式中、Ｘ及びＹは独立してＨ、アミン保護基（例えばトリハロアシル基）、又は飽和もしくは不飽和アシル基（普通は飽和アシル基）であって、いくつかの実施形態では、Ｘ及びＹは独立して、１）Ｈ又はアミン保護基；２）飽和もしくは不飽和アシル基であり、さらに、ｎは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５，５０、５５、６０又はそれ以上、普通は５又はそれより大きく、より普通には約１０又はそれより大きく、また、重合度（Ｄｐ）が約２〜約６０、約１０〜約５０、約３０
〜約５０、約１０〜２０、又は約１２〜約１８であってよく、Ｄｐが約２〜約１０のものは特に興味深く、
またさらに、式中、
Ｘが飽和もしくは不飽和アシル基（いくつかの実施形態ではプロピオニル基以外で、また、さらなる実施形態では不飽和アシル基以外）である場合、ＹはＨ又はアミン保護基で
あって；
Ｙが飽和もしくは不飽和アシル基（いくつかの実施形態ではプロピオニル基以外で、また、さらなる実施形態では不飽和アシル基以外）である場合；ＸはＨ又はアミン保護基である。特に興味深い別の一実施形態では、Ｘ及びＹは独立してＨ又は飽和もしくは不飽和アシル基であって、普通は不飽和アシル基である。さらなる実施形態では、Ｘ及びＹは独立してアミン保護基（例えばトリハロアシル基）又は飽和もしくは不飽和アシル基であって、普通は飽和アシル基である。いくつかの実施形態では、特にＸ又はＹがＨ又は不飽和アシル基である場合、ＰＳ誘導体は９０％未満、普通は８５％未満、又は特にＰＳ誘導体が少なくとも１０ないし２０残基を含む場合は、８０％未満がＮ−アシル化されている。
興味深いある実施形態では、化学式ＩにおけるＸが飽和アシル基で、ＹがＨ又はアミン保護基である。特に興味深いある実施形態では、化学式ＩにおけるＸがアセチル基で、ＹがＨ又はアミン保護基である（例えばトリハロアシル基（例えばトリハロアセチル基））。興味深い別の実施形態では、化学式ＩにおけるＸが飽和アシル基で、ＹがＨであって；又はＸがアセチル基で、ＹがＨである。
Ｘ又はＹがアミン保護基（例えばトリハロアシル基）である場合、当該ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、ここで「保護ｄｅＮＡｃＳＡ抗原」（例えば、保護ＰＳ誘導体）と呼ばれ、例えば分子と担体（例えば、担体タンパク質）とのコンジュゲーションや、脂質部分の付加（例えば、保護ＰＳ誘導体の非還元末端におけるアシルアミンの付加）などのように、保護ｄｅＮＡｃＳＡ抗原をさらに修飾する間に、アミン保護基は、アミン基が反応を受けることを防止するように作用する。続いて、アミン保護基は、残基に遊離アミンを供与するために修飾を受けることができる。アミン保護基が可変位置に水素の代わりに存在する場合、保護ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、一般に、ここに記載の構造によって例示される。これは、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原において遊離アミンを供与するために水素が要求される可能性がある場合、その残基に遊離アミンの水素の代わりにアミン保護基を含む保護ｄｅＮＡｃＳＡ抗原である。
ここで使用される「アミン保護基」は、窒素原子が分子の他の部分で起こる反応に関与するのを妨げるように、アミン分子の窒素原子に結合したラジカル又は原子団を指す。「アミン保護された」なる用語は、それによりその窒素原子が分子の他の部分で起こる反応に関与するのを妨げられるアミンの窒素原子を含む分子の構造的特徴を意味する。
本発明で用いられる例示的なアミン保護基は、カーバメート、アミド、Ｎ−アルキル及びＮ−アリルアミン、イミン誘導体、エナミン誘導体、Ｎ−スルホニルなどを含むが、必ずしもそれらに限定されない。さらに例示的なアミン保護基は：ホルミル、トリフルオロアセチル、フタリル、及びｐ−トルエンスルホニルのようなアシル型；ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）及び置換型ベンジルオキシカルボニル、１−（ｐ−ビフェニル）−１−メチルエトキシ−カルボニル、ならびに９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）のような芳香族カーバメート型；ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）、エトキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、及びアリルオキシカルボニルのような脂肪族カーバメート型；シクロペンチルオキシカルボニル、及びアダマンチルオキシカルボニルのような環式アルキルカーバメート型；トリフェニルメチル及びベンジルのようなアルキル型；トリメチルシランのようなトリアルキルシラン；フェニルチオカルボニル及びジチアサクシニルのようなチオール含有型を含むが、必ずしもそれらに限定されない。アミン保護基及び保護アミン基は、例えばC. B. Reese
and E. Haslam, “Protective Groups in Organic Chemistry,”J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, New York, N. Y., 1973, Chapters 3 and 4, respectively, and T. W. Greene and P. G. M. Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis,” Second Edition, John Wiley and Sons, New York, N. Y., 1991, Chapters 2 and 3に記載されている。
さらに、特に興味深い例示的なアミン保護基は、トリハロアセチル及びトリハロプロ
ピオニル基のようなトリハロアシル基、（例えば、トリクロロアセチル、トリフルオロア
セチル、トリクロロプロピオニル、トリフルオロプロピオニル）などを含んでおり、トリ
ハロアセチル基は興味深い。
特に興味深いある実施形態では、化学式Ｉの構造を含むｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、以下に記載のように、例えばＣ２ケトン、Ｃ６アルデヒド、Ｃ７アルデヒド、又はＣ８アルデヒドを介した共有結合によって担体にコンジュゲートされており（例えば、Ｃ２−ＮＨ−担体タンパク質又はＣ６−ＮＨ−担体タンパク質）、ただし担体は、還元もしくは非還元末端のいずれか、又はその両方に（例えば、該誘導体の還元末端の残基か、該誘導体の非還元末端の残基、又はその両方との結合を介して）存在してよい。特に興味深い他の実施形態では、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は少なくとも化学式Ｉの二量体を１個含み、また、アシルアミンで置換されたＮ−アシル化又は脱Ｎ−アシル化シアル酸残基を非還元末端に有する（例えば、飽和又は非飽和アシルアミン、普通は飽和又は非飽和脂肪族アシルアミン、通常、飽和アシルアミン（例えば、ＮＨＣ２−１８、ＮＨＣ２−１２、ＮＨＣ２−１０、ＮＨＣ２−８、ＮＨＣ４−１２など））（例えば、化学式ＩＶａ又はＩＶｂの非還元末端部分を参照）。担体及び／又はアシルアミンを含むこれらの後者の実施形態は、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原が化学式Ｉの構造を有しており、式中、ＸがＨでＹがアセチル基である場合、又はＸがアセチル基でＹがＨである場合に、特に興味深い。他の特定の実施形態では、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原が化学式Ｉの構造を有しており、式中、ＸがＨでＹがアセチル基である場合、又はＸがアセチル基でＹがＨである場合に、ＰＳ誘導体はアジュバントと組み合わせて供与され、以下に記載のように、ＰＳ誘導体及びアジュバントは、好ましくは薬学上許容しうる担体（乾燥又は水性希釈剤）中に供与される。
ある実施形態では、該二量体は二糖類であって、該二糖類がＣ−５アミノ基上のＮ−アセチル基が除去された１個もしくはそれ以上の残基を含む場合、又は２個の残基のうち１個が脱Ｎ−アセチル化されている場合、第２の残基はＮ−アセチル基を含む（しかし、いくつかの実施形態でＮ−プロピオニル基ではない）。この最小エピトープを規定する二糖単位は、還元末端、非還元末端、又は多糖内部にあってよい。ｄｅＮＡｃＳＡ抗原が二糖類として供与される場合、組成物は以下の構造を有することができる：
Figure 2009525947
式ＩＩ
式中、Ｘ及びＹは独立してＨ、アミン保護基（例えばトリハロアシル基）、又は飽和もしくは不飽和アシル基であって；好ましくはさらに、式中、Ｘがアシル基（好ましくはプロピオニル基以外）である場合にＹはＨ又はアミン保護基であって、また、Ｙがアシル基（好ましくはプロピオニル基以外）である場合にＸはＨ又はアミン保護基である。特に興味深い実施形態では、Ｘがアセチル基で、ＹがＨである。Ｘ及び／又はＹがアミン保護基である場合、化合物はここでｄｅＮＡｃＳＡ抗原と呼ばれ、該保護基は前述のように利用されることができる。例示的なアミン保護基は前述した。化学式ＩＩのＰＳ
誘導体は、化学式ＩのｄｅＮＡｃＳＡ抗原について既述したように、担体及び／又はアシルアミンを含むようにさらに修飾されることができ、具体的には、ＸがＨで、Ｙがアセチル基であり；又はＸがアセチル基で、ＹがＨである。
また、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、次式により表される構造を有するものを含む：
Figure 2009525947
式ＩＩＩ
式中、Ｘ、Ｙ及びｎは上記規定した通りであって、前述のように、Ｒ１及びＲ２は
独立してＨ又はアミン保護基（例えばトリハロアシル基）であり；又はアシル基（例えばアセチル基）である。化学式ＩＩＩのｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、担体及び／又はアシルアミンを含むようにさらに修飾されることができ、化学式Ｉ及びＩＩのｄｅＮＡｃＳＡ抗原について既述したように、保護ｄｅＮＡｃＳＡ抗原の修飾は興味深く、具体的には、ＸがＨならＹがアセチル基であり、Ｘがアセチル基ならＹがＨである。
他の実施形態では、脱Ｎ−アセチル化ＰＳ誘導体は次式により表される構造を有する：
Figure 2009525947
式ＩＶａ
又は、
Figure 2009525947
式ＩＶｂ
式中、Ｘ１、Ｘ、Ｙ及びＺはＨ、アミン保護基（例えばトリハロアシル基）、又は飽和もしくは不飽和アシル基であって、普通は不飽和アシル基であり、普通は式中、Ｘ１、Ｘ、Ｙ及びＺは、１）Ｈ又はアミン保護基、又は、２）飽和もしくは不飽和アシル基（通常、飽和アシル基）であって；少なくともＸ、Ｙ及びＺのうち１つがＨ又はアミン保護基という条件で；また少なくともＸ、Ｙ及びＺのうち１つが飽和もしくは不飽和（通常、飽和）アシル基であって；特に興味深い実施形態では、少なくともＸ、Ｙ及びＺのうち１つがＨ又はアミン保護基であって；少なくともＸ、Ｙ及びＺのうち１つがアセチル基で、少なくともＸ、Ｙ及びＺのうち１つがプロピオニル基であって；
ｎは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５，５０、５５、６０又はそれ以上、普通は５残基又はそれより大きく、より普通には約１０残基又はそれより大きく（例えば、約２〜約６０、約１０〜約５０、約３０〜約５０、約１０〜２０、又は約１２〜約１８の重合度（Ｄｐ）を有し、Ｄｐが約２〜約１０のものは特に興味深い）；
Ｒ１は、飽和又は非飽和アシルアミン、普通は飽和又は非飽和脂肪族アシルアミン、通常、飽和アシルアミン（例えば、ＮＨＣ２−１８、ＮＨＣ２−１２、ＮＨＣ２−１０、ＮＨＣ２−８、ＮＨＣ４−１２など）であって；
Ｒ２は、本明細書記載のように、ヒドロキシル、又は１個ないしそれ以上のアシル化、アミン保護（すなわち、アミン保護基を有する、例えばトリハロアセチル化）、又は脱Ｎ−アセチル化シアル酸残基である。ある実施形態では、Ｒ２は脱Ｎ−アセチル化シアル酸残基及びアシル化シアル酸残基（普通は飽和Ｎ−アシル基を有するシアル酸残基、例えば、アセチル化シアル酸残基、プロピオニル化シアル酸残基など）のポリマーである。
特に興味深い実施形態では、化学式ＩＶａ及びＩＶｂのｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、遊離アミン（又は、アミン保護基）、アセチル基、及びプロピオニル基のそれぞれのうち、少なくとも１個を含む。本実施形態では、ＰＳ誘導体は化学式Ｖの構造を持つことができ、式中、ＸがＨである場合、Ｙ及びＺは異なるアシル基であり、アセチル基又はプロピオニル基のいずれかであって；Ｘがアセチル基である場合、Ｙ及びＺは異なる部分であり、Ｈ（もしくはアミン保護基）又はプロピオニル基のいずれかであって；さらにＸがプロピオニル基である場合、Ｙ及びＺは異なる部分であり、Ｈ（もしくはアミン保護基）又はアシル基のいずれかである。例示的な実施形態を図２３〜３７に示す。
他の実施形態では、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、少なくとも１個の三量体を含むということができ、次式により表される構造を有する；
Figure 2009525947
式Ｖ
式中、Ｘ、Ｙ及びＺは独立してＨ、アミン保護基（例えばトリハロアシル基）、又は飽和もしくは不飽和アシル基（通常、飽和アシル基）であって；通常、式中、Ｘ、Ｙ及びＺは独立して、１）Ｈ又はアミン保護基、又は、２）飽和もしくは不飽和アシル基、通常、飽和アシル基であって；少なくともＸ、Ｙ及びＺのうち１つがＨ又はアミン保護基という条件で；また、少なくともＸ、Ｙ及びＺのうち１つが飽和もしくは不飽和アシル基で、通常、飽和アシル基であって；特に興味深い実施形態では、少なくともＸ、Ｙ及びＺのうち１つがＨ又はアミン保護基であって；少なくともＸ、Ｙ及びＺのうち１つがアセチル基で；少なくともＸ、Ｙ及びＺのうち１つがプロピオニル基であって；
ｎは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５，５０、５５、６０又はそれ以上、普通は４残基又はそれより大きく、より普通には約１０残基又はそれより大きい（例えば、約２〜約６０、約１０〜約５０、約３０〜約５０、約１０〜２０、又は約１２〜約１８の重合度（Ｄｐ）を有し、Ｄｐが約２〜約１０のものは特に興
味深い）。
ある実施形態では、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、各々の三量体が遊離アミン、アセチル基、及びプロピオニル基のそれぞれのうち、少なくとも１個を含む混合アシル構造を有する。本実施形態では、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は化学式Ｖの構造を持つことができ、式中、ＸがＨである場合、Ｙ及びＺは異なるアシル基であり、アセチル基又はプロピオニル基のいずれかであって；Ｘがアセチル基である場合、Ｙ及びＺは異なる部分であり、Ｈ又はプロピオニル基のいずれかであって；さらにＸがプロピオニル基である場合、Ｙ及びＺは異なる部分であり、Ｈ又はアセチル基のいずれかである。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、飽和又は不飽和の、普通は飽和のＣ１−Ｃ４、普通はＣ１−Ｃ３のアルキル基を有するアシル誘導体を含み、例えばアセチル、プロピオニル、イソプロピル、ブチオニルなどを含む。ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、さらに、１又は複数の脱Ｎ−アシル化された部位を有する混合アシル誘導体を含み、該ｄｅＮＡｃＳＡ抗原体は、異なる飽和又は不飽和の、通常、飽和のアシル基を含む。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、さらに、ここに記載のｄｅＮＡｃＳＡ抗原の１又は複数のシアル酸部分に加え、又はその代わりに、ラクトン部分、環状シアル酸部分、又は他のシアル酸誘導体を有するものを含む。例えば、ラクトン部分を有するｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、以下の構造を有することができる：
Figure 2009525947
式ＶＩ
式中、Ｘ、Ｙ及びｎは上記のように定義する。ラクトン部分を有するｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、ここに記載のような構造を有する１個又はそれ以上のポリマー（例えば、二量体、三量体）を含むヘテロポリマー中に存在することができる。
他の例では、環状イミンを含み、及び／又は還元してシアル酸部分の代わりに環状二級アミン部分（例えば、１−（４−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−ピロリジン−２−イル）−エタノン）を得た脱Ｎ−アセチル化ＰＳ誘導体は、以下の構造を有することができる：
Figure 2009525947
式ＶＩＩ
式中、Ｘ及びｎは上記のように定義する。環状イミン又は環状二級アミン部分を有するｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、ここに記載のような構造を有する１個又はそれ以上のポリマー（例えば、二量体、三量体）を含むヘテロポリマー中に存在することができる。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原が、単一の単位のエピトープ（すなわち、前述のような２残基、又は、下述のような３残基）として提供される場合、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、通常は担体（例えば、タンパク質担体）と共有結合で結合する。一般に、そして特に、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原が二糖類（例えば図１１に示すように）、三糖類、又は３残基もしくはそれ以下の他の分子である場合、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、Ｃ２ケトンを介して、又は過ヨウ素酸塩処理後の還元的アミノ化によるＣ６アルデヒドを介して、担体タンパク質に結合されることができる（例えば、Ｃ２−ＮＨ−担体タンパク質又はＣ６−ＮＨ−担体タンパク質）。別の実施形態では、アミンがＣ７、Ｃ６、及び／又はＣ８のアルデヒドに結合され（例えば図２０〜２２参照）、これは不完全酸化の結果である可能性がある。Ｃ７との結合が最も一般的であり、Ｃ６及びＣ８との結合はあまり一般的ではない。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原はさらに、結合脂質部分を有する１又は複数の残基を有するものを含む（例えば、米国特許第６，６３８，５１３号など）。ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、また、結合したＮ−脂肪アシル基を有する１又は複数の残基を有するものを含む（例えば、Ｎ−ラウロイル、Ｎ−オレオイルなど）。特に興味深いのは、Ｎ−脂肪アシル基含有の残基が例えばＰＳ誘導体の残基の５０％又はそれ以下を構成し、結果得られたｄｅＮＡｃＳＡ抗原がさらに水に溶解しうるようなｄｅＮＡｃＳＡ抗原である。ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、また、１又は複数のアミド化されたシアル酸残基を有するものを含み、その残基は、通常、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原ポリマーの非還元末端にアルキル二級アミンを有する。１又は複数のアミド化されたシアル酸残基を有するｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、例えば、求核置換反応により、脂肪族アミン（例えば、ドデシルアミン、オレオイルアミンなど）をＣｌカルボキシル基とカップリングすることにより調製することができる。特に興味深いのは、該Ｃｌアミド誘導体が、例えば、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原の残基の約５０％又はそれ以下を構成するｄｅＮＡｃＳＡ抗原である。ｄｅＮＡｃＳＡ抗原はさらに、還元もしくは非還元末端、又はその両方で担体とコンジュゲートしているものを含む（例えば、該誘導体の還元末端の残基、該誘導体の非還元末端の残基、又はその両方との結合を介して）。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、前述のように２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５，５０、５５、６０又はそれ以上の二量体エピトープ単位（最小エピトープを規定）のホモポリマー、又はヘテロポリマーとすることができ、該二量体単位は、シアル酸残基又はその誘導体のモノマー又はポリマーにより隣接又は分離されることができる。いくつかの実施形態では、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原のＮ−アセチル化残基は、化合物の全残基の９０％未満、８５％未満、８４％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６０％未満、又は５５％未満を示すものを含む。
他の実施形態では、脱Ｎ−アセチル化残基のＮ−アシル化残基に対する比は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、又はそれ以上である。特定の実施形態では、脱Ｎ−アセチル化残基のＮ−アセチル化残基に対する比は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、又はそれ以上である。さらに特定の実施形態では、脱Ｎ−アセチル化残基のＮ−プロピオニル化残基に対する比は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、又はそれ以上である。別の特定の実施形態では、脱Ｎ−アセチル化残基のアルキル化残基に対する比は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、又はそれ以上である。他の特定の実施形態では、脱Ｎ−アセチル化残基のＮ−アセチル化残基に対する比は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、又はそれ以上である。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、その中に含有されるｄｅＮＡｃＳＡ抗原に関して均質又は不均質である組成物として提供されることができる。例えば、本発明は、１又は複数の二量体エピトープ構造、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原内部の二量体エピトープの位置、コンジュゲートされた担体タンパク質の有無、Ｄｐ、分子量、脱Ｎ−アシル化残基のＮ−アシル化残基に対する比、Ｎ−アシル化度（例えば、Ｎ−アセチル化度又はＮ−プロピオニル化）などに関し、均質又は不均質であるｄｅＮＡｃＳＡ抗原を有する組成物を意図している。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、未修飾のｄｅＮＡｃＳＡ抗原の抗原性又は免疫原性の全部を向上又は少なくとも実質的に維持する一方で、種々の所望の特性、例えば改善された薬理学的特性を提供するために修飾されてもよいことは理解されるであろう。例として、ＰＳはポリマー中の残基数の増減により修飾が可能である（例えば、異なる重合度（Ｄｐ）を提供するために）。「Ｄｐ」は、ポリマーの残基数を意味する。
天然又は非天然の異なる残基との置換もまた、例えば脱Ｎ−アセチル化やＮ−アシル化などにおける化学修飾の結果としてなされることができる。例えば、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、脂質部分により修飾されること（例えば、下記の実施例１及び５、ならびに米国特許第６，６３８，５１３号（Seid）に記載のとおり）、担体にコンジュゲート（例えば、還元又は非還元末端において）されることが可能であり、また、ラクトン、環状シアル酸、イミン及び還元イミン構造を有してもよい。他の実施例では、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、Ｎ−脂肪アシル基（例えば、Ｎ−ラウロイル、Ｎ−オレオイルなど）の結合により修飾されることができる。さらなる実施例では、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、アルキル二級アミン（例えば、Ｃｌアミド誘導体）を有する１又は複数のシアル酸残基を含むことができ、例えば、求核置換反応により、脂肪族アミン（例えば、ドデシルアミン、オレオイルアミンなど）をＣｌケト基と結合することにより調製することができる。
髄膜炎菌被膜多糖体に選択的に結合し、かつ宿主抗原（例えば、宿主ポリシアル酸（ＰＳＡ））にほとんど又は全く有意に結合しない抗体の産生を提供する宿主において、主題の脱Ｎ−アセチル化ＰＳが免疫応答を誘導することができる限り、主題の発明で使用されるｄｅＮＡｃＳＡ抗原が、後述の実施例で開示されたものと同一である必要はない。従って、多くの誘導体（さらに詳細を後述する）が実質的に脱Ｎ−アセチル化ＰＳの活性に影響を及ぼすことなく作製されうるということが、当業者には理解されよう。
脱Ｎ−アセチル化ＳＡ抗原の作製方法
下記に詳細に述べるように、本発明の開示は、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原の生産方法を提供する。ある実施形態においてｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、細菌多糖の化学修飾によって生産される。他の実施形態では、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は細菌（髄膜炎菌Ｂ又は大腸菌Ｋ１）又は哺乳類細胞とトリハロアセチル化合物の存在下において培養し、次に、細胞表面上に発現されたＰＳ誘導体中間化合物の化学修飾に関与する生合成法を用いて生産される。これら各々については、下記に詳述される。
細菌ＰＳを用いた脱Ｎ−アセチル化ＳＡ抗原の生産
ある実施形態において、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、髄膜炎菌（N. meningitidis）もしくは大腸菌Ｋ１（E. coli K1）又は他の適当な細菌性ＰＳ供給源のＰＳを脱Ｎ−アセチル化し、次に、部分的に再Ｎ−アシル化することにより生成することができる。部分的な再Ｎ−アシル化は、化合物中の全残基に対して９０％未満、８５％未満、８４％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６０％未満、又は５５％未満であって、通常は、約１０％、約１５％、約１６％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、又は約４５％のＮ−アシル化残基を有する脱Ｎ−アセチル化ＰＳ誘導体の産生を提供する。この関連で、本発明は、所望のアシル化レベルを有する脱Ｎ−アセチル化ＰＳを提供するために、最終生成物中のアシル化レベルの制御を提供する。一般に、再アシル化はアシル化試薬の量を制限することにより制御又は抑制される。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、髄膜炎菌（N. meningitidis）もしくは大腸菌Ｋ１（E. coli K1）又は他の適当な細菌性ＰＳ供給源のＰＳを脱Ｎ−アセチル化し、その次に、アミン保護基とアシル基の混合物（例えば、トリハロアセチルとアセチル基）で再Ｎ−アシル化することによっても、該ＰＳ誘導体が化合物中の全残基に対して９０％未満、８５％未満、８４％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６０％未満、又は５５％未満のアミン保護基、普通は約１０％、約１５％、約１６％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、又は約４５％のアミン保護基（例えば、Ｎ−トリハロアシル基）を有するような所望の比で生成されることができる（ただし、該化合物は、一般に、少なくとも１０ないし２０残基を有する）。最終生成物中のアシル化レベルは、所望のアシル化レベルを有するｄｅＮＡｃＳＡ抗原を提供するために、アミン保護基を除去して遊離アミノ基との不都合な副反応を減少させるように制御することができる。アミン保護基の除去は、脱保護残基の遊離アミンのためである。一般に、脱Ｎ−アセチル基の割合は、アミン保護試薬の量（例えば、トリハロアシル化試薬の量）を制限することにより制御される。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、髄膜炎菌（N. meningitidis）もしくは大腸菌Ｋ１（E. coli K1）又は他の適当な細菌性ＰＳ供給源のＰＳを、アミン保護マンノサミン（例えば、Ｎ−トリハロアシルマンノサミン）とアシルマンノサミン（例えば、Ｎ−トリハロアセチル及びＮ−アセチルマンノサミン）の混合物が添加された細菌増殖培地中で生合成することにより、細菌によって発現された該ＰＳ誘導体が、産生されたＰＳ中の全残基に対して９０％未満、８５％未満、８４％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６０％未満、又は５５％未満のアミン保護（例えば、Ｎ−トリハロアシル化）基を有するような所望の比で生成されることもできる。最終生成物中のアシル化レベルは、所望のアシル化レベルを有するｄｅＮＡｃＳＡ抗原を提供するために、アミン保護基を除去して遊離アミノ基との不都合な副反応を減少させるように制御することができる。一般に、脱Ｎ−アセチル基の割合は、アミン保護マンノサミン試薬（例えば、Ｎ−トリハロアセチルマンノサミン）の量を制限することにより制御される。
ＮｍＢ ＰＳ及び大腸菌Ｋ１を含むＰＳは、本発明におけるＰＳ誘導体及びコンジュゲートならびに他の分子での使用に適する例示的な分子であって、かかる出発原料は、それらの単離及び担体へのコンジュゲートに関する方法と同様に、当技術分野で周知である。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、従来の任意の適切な手段によって生成が可能である。例えば、ある実施態様では、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、天然のＰＳを塩基性の水性媒体に高温で、例えば、約９０℃〜約１１０℃、ｐＨ約１３〜約１４で（例えば、濃度２Ｍの水酸化ナトリウム中で）接触させることにより、達成されることができる。あるいは、ヒドラジン水溶液が使用されてよい。この段階におけるＮ−脱アセチル化度はさまざまであって、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、又は約９９％から約１００％までの目的の脱Ｎ−アセチル化体である。脱Ｎ−アセチル化した生成物は、例えば冷却、中和、必要ならば精製、及び凍結乾燥により、回収することができる。
非水性及び生合成的な生成方法は、実施例と同様に、さらに詳細を後述する。
非水性の生成方法
ある実施形態では、脱Ｎ−アセチルシアル酸抗原は、５％未満の水を含有する極性プロトン性有機溶媒中で生成される。ＮｍＢ ＰＳ誘導体を調製するために使用された水溶液ベースの方法は（例えば、実施例１にあるような）、保護的な非自己反応性のｍＡｂ（例えば、ＳＥＡＭ２、３）とよく反応する物質を比較的少量生成する。理論によって拘束されことはないが、この低収率は、ＰＳアミノ基の反応性の弱さ（分子内ＣＯＯ−及びＮＨ３ ＋電荷が対になること）、アシル化試薬の加水分解の競合、及び／又は非還元末端アルデヒドの調製時における過ヨウ素酸塩によるアミノ基の酸化により、前述のＮ−アセチル基を全部除去できなかったこと、再Ｎ−アシル化を量的に制御できなかったことのうち、１又はそれ以上に起因する。
極性プロトン性有機溶媒中で、また、所望の場合は少量の水の存在下（例えば、ホルムアミド、２．５％水との混合ホルムアミドなど）において、ＰＳのアシル化を行う場合、ＰＳをアシル化し、アミノ基を保護し（例えば、トリハロアシル（例えば、トリハロアセチル又はトリフルオロアセチル）アミドにより）、後にそれを除去して脱Ｎ−アセチル残基の予測可能なフラクションを生成し、また、アミノ基の反応性を確実にするアシル化の段階での強塩基（例えば、水酸化ナトリウム又はメトキシド）の使用は、脱Ｎ−アセチル化された残基のフラクションの改善された収量及びより良い制御を提供する。
有機溶媒は、任意の適当な溶媒とすることができ、通常、極性プロトン性又は非プロトン性有機溶媒である。例示的な該有機溶媒は、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、混合ホルムアミド／ ジメチルホルムアミドなど、又は有機溶媒と少量％の水（典型的には、水が少なくとも約２％ないし２．５％だが、通常、１０％未満、５％未満）の混合物
を含む。成分、特にＰＳの溶解性を確保するために、必要に応じて水を加える。
該分子のアミン基は、適当なアミン保護基で修飾することにより保護される。例示的なアミン保護基は上に記載があり、また、限定されないがカーバメート又はアミドを含み、Ｎ−アルキル及びＮ−アリルアミン、イミン誘導体、エナミン誘導体、Ｎ−スルホルなどを含む。特に興味深い実施形態では、アミン保護基はトリハロアシルアミドであって、一般に、Ｃ２−Ｃ１２、より一般には、Ｃ２−Ｃ１０、より一般には、Ｃ２−Ｃ８、最も一般には、Ｃ２−Ｃ６のトリハロアシル基であり、最も一般にはトリハロアセチル又はトリハロプロピオニルの保護基である。かかる保護基は、好ましくは、ｐＨ８又はそれ以下での安定性、過ヨウ素酸塩存在下での安定性、及び後述のごとく除去の容易さで選択される。一般に、アミン保護基は過ヨウ素酸塩存在下でＮ−酸化を防止する。この保護ステップの後に生成されるＰＳ誘導体の形態は、ここでは「保護ｄｅＮＡｃＳＡ抗原」、「保護アシル化ｄｅＮＡｃＳＡ抗原」、「保護ＰＳ誘導体」又は「保護アシル化ＰＳ誘導体」と呼ばれ、該化合物は１又は複数のアミン保護基（例えば、トリハロアシル−保護アミン基）を有する。
一般に、保護ｄｅＮＡｃＳＡ抗原の産生は、前述の有機溶媒の存在下で少なくとも部分的に脱Ｎ−アセチル化ＰＳ分子をアミン保護基試薬及びアシル化試薬と接触させることによって達成される。例えば、アミン保護試薬はトリハロアシル化試薬とすることができ、例えば、トリハロ酢酸無水物又はアルキルトリハロ酢酸エステルは特に興味深い（例えば、トリクロロ酢酸無水物、トリフルオロ酢酸無水物、トリフルオロ酢酸エチルエステル、又はトリクロロ酢酸エチルエステルなど）。アシル化試薬は活性化アシル基を供与し、該活性化アシル基は、一般に、アセチル基又はプロピオニル基であって、より一般にはアセチル基である。ある実施形態において、トリハロアシル化試薬とアシル化試薬が混合物として、脱Ｎ−アセチル化ＰＳ分子と接触する。
該混合物中のトリハロアシル化試薬とアシル化試薬の相対量は、保護ステップの最終生
成物が、所望の比のトリハロアシル基とアシル基を含有するように供与され、該トリハロアシル基は概ね除去され、最終生成物中に遊離アミンを供与する。例えば、最終ｄｅＮＡｃＳＡ抗原生成物における遊離アミンのアシル基に対する比が約１：１０、１：４、又は１：１である場合、該混合物中に存在するトリハロアシル化試薬のアシル化試薬に対する比はおおよそ、約１：１０、１：４、又は１：１である。つまり、該混合物中のトリハロアシル化試薬の量は、脱保護後の最終ｄｅＮＡｃＳＡ抗原生成物中で所望される脱Ｎ−アセチル基のフラクションとほぼ等しい（例えば、１０％、２５％、５０％など）。アシル化試薬は、また、該ＰＳ誘導体において別にアシル化されたグループの所望の比を供与するために、異なる活性化アシル基（例えば、アセチル、プロピオニル）の混合物として供与されることができる。例えば、該ｄｅＮＡｃＳＡ抗原が、アセチル化残基のプロピオニル残基に対する比が２：１又は１：１を有する場合、活性化アシル及びプロピオニル基を供与するアシル化試薬は、同一又は類似の比でアシル化剤混合物中に供与される。
保護ステップの後、保護ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は所望の通りに修飾することができる。例えば、perioidiationとそれに続く還元的アミノ化等によって所望の担体にコンジュゲートされることができる。保護基は次に、遊離アミンを脱離するために除去され（例えば、加水分解又は還元）、その結果、最終ｄｅＮＡｃＳＡ抗原を提供することができる。アミン保護基は、水性強塩基（例えば、ｐＨ９かそれ以上）を用いた加水分解によるか、還元（例えばナトリウムシアノボロハイドライドを用いて）によるか、もしくは還元的アミノ化によるコンジュゲート調製時に加えられるアミンによって、除去することができる（例えば実施例５を参照）。該ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は次に、当該技術分野において周知の方法に従い単離されることができる。
非水性の産生方法は、多くの種々の理由に関し望まれるものである。第１に、アシル化反応を有機溶媒中で行うことは、使用できるアシル基のタイプにおいて、より大きな自由度を提供する。例えば、有機溶媒の使用は、反応性の高い活性化アシル基と同様、水性系における溶解度に関して問題となりうる炭素数４を超える脂肪アシル基の使用を容易にする（例えば、トリフルオロアセチル及びトリクロロアセチル）。有機溶媒における反応は、また、該試薬を消耗させる水及びＯＨ−との競争反応がないか、又は極微であるため、より優れたアセチル化度の制御を提供する。結果的に、多糖とのアシル化反応はそれらが進行して完了するように設計されるこができる。
また、非水性のアプローチは、保護アミン基の使用を可能にする。多糖のアミン基が保護されないままの場合、過ヨウ素酸塩の存在下での酸化、ならびに活性化カルボキシル基又は非還元末端に導入したアルデヒドと還元末端のケトンとの分子内反応のような、他の望ましくない反応に関与することがある。トリフルオロアセチル又はトリクロロアセチルは、約８未満のｐＨで安定であり、過ヨウ素酸塩の存在下で安定であり、また、塩基水溶液中で、又はナトリウムシアノボロハイドライドで還元されて容易に除去され、保護基で誘導体化されたアミンの量によってその割合が制御されるところの脱Ｎ−アセチル残基を有するｄｅＮＡｃＳＡ抗原を産生することができるため、好ましい保護基である。
細菌を用いたｄｅＮＡｃＳＡ抗原生成の生合成方法
他一実施形態では、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は髄膜炎菌（N. meningitides）、特にＢ群の菌を、Ｎ−アシルマンノサミン誘導体の１又は複数存在下、及びＮ−アシルシアル酸残基を有するｄｅＮＡｃＳＡ抗原の生成を促進する条件下で培養することにより産生される。 これは、所望のＮ−アシル基を有するマンノサミン誘導体を細菌培地中に含ませることで達成される。
ある実施形態では、「バクテリアにマンノサミン誘導体を与えること」を達成するために、Ｎ−アシルマンノサミン誘導体は、アミン保護基の （「保護マンノサミン」又は「アミン保護マンノサミン」）を含むマンノサミンであり、ここでは、Ｎ−トリハロアシルマンノサミンによって例示される。本発明の使用に適したに適したアミン保護マンノサミンの例には、保護ｄｅＮＡｃＳＡ抗原の生成を提供するために、細菌のＰＳ合成経路に取り込まれる任意のアミン保護マンノサミンが含まれる。典型的なアミン保護マンノサミン試薬は、Ｎ−トリハロアシルマンノサミン、例えばＮ−トリハロアセチルマンノサミン（例えばＮ− −トリクロロアセチルマンノサミン、トリフルオロアセチルマンノサミン）、Ｎ−ホルミルマンノサミン等）を含む。アミン保護マンノサミンに加え、その培地には、一般に、Ｎ−アセチルマンノサミンが含まれ、保護シアル酸の残基及びＮ−アセチル化されたシアル酸マンノサミンの残基を有するｄｅＮＡｃＳＡ抗原を提供する。
理論によって拘束されるわけではないが、アミン保護マンノサミンの存在下で培養される場合、被膜生合成に関与する細菌の酵素は、アミン保護マンノサシンをシアル酸に取り込み、次に、被膜多糖に取り込まれる。標準的な発酵及び精製法は、保護基が結合した所望のモノマーの画分を含む、保護ｄｅＮＡｃＳＡ抗原を産生するのに使用することができる。これらの保護基を含むｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、例えば、上述の構造であってもよい。
関連する実施形態では、混合したＮ−アシルシアル酸の残基を有するｄｅＮＡｃＳＡ抗原を所望する場合、培地には混合Ｎ−アシルマンノサミン試薬が含まれる。例えば、Ｎ−アシルマンノサミンは、飽和又は不飽和アシル基、通常は、飽和アシル基であって、Ｃ１−Ｃ５、より一般にはＣ２−Ｃ５、より一般にはＣ２−Ｃ４、より一般にはＣ２−Ｃ３であり、特に興味深いアセチル又はプロピオニル基を持つ。このような混合Ｎ−アシルマンノサミン試薬の存在下でのバクテリアの培養は、Ｎ−アシルシアル酸残基、例えば、Ｎ−アセチルシアル酸、Ｎ−プロピオニルシアル酸などを混合したｄｅＮＡｃＳＡ抗原の生成を提供することができる。特に興味深い実施形態では、細菌は、保護マンノサミン（例えば、Ｎ−トリハロアシルマンノサミン）及びＮ−アシルマンノサミン（例えば、Ｎ−アセチルマンノサミン及びＮ−プロピオニルマンノサミン）の混合物の存在下で培養される。
ある実施形態では、髄膜炎菌（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、好ましくはＢ群株は、Ｎ−アシルマンノサミン（例えばＮ−アセチルマンノサミン）及びＮ−トリハロアシルマンノサミンの混合物の存在下で培養される。他の実施形態では、細菌は無被膜株であり、追加のＮ−アセチルマンノサミンが培養液にない場合、ＰＳ被膜合成において欠陥がある（例えば、１又は複数の酵素の欠陥のため、増殖培地にＮ−アセチルマンノサミンを追加しないと菌被膜ＰＳを合成できない）。例えば、株は、ＮｍＢ Ｍ７株のように、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−６−リン酸２エピメラーゼに欠陥がある可能性がある。
培養物中の相対的なマンノサミン試薬の量（例えば、Ｎ−トリハロアシルマンノサミンとＮ−アセチルマンノサミンの割合）は、生合成最終産物が、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原中において、異なるシアル酸残基及び／又はその誘導体（例えば、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原のトリハロアシル化された残基とアシル化された残基）の所望の割合を包含するように提供される。一般的に、保護基（例えばトリハロアシル化基）は、最終的なｄｅＮＡｃＳＡ抗原生成物中に遊離アミンを提供するために取り除かれる。例えば、最終的なｄｅＮＡｃＳＡ抗原生成物中のアシル化残基に対する遊離アミンの割合が１：１０、１：４、又は１：１である場合、マンノサミンに対するＮ−トリハロアシルマンノサミンの割合は、およそ１：１０、１：４、又は１：１である。つまり、培養物中のＮ−トリハロアシルマンノサミンの量は、脱保護後の最終ｄｅＮＡｃＳＡ抗原産物中の所望の脱Ｎ−アセチルシアル酸基の画分とほぼ等しくなる（例えば１０％、２５％、５０％など）。
同様に、培養物中の「保護されていない」Ｎ−アシルマンノサミン（アミン保護基を含まないが、例えば、Ｎ−アシル基のようなアセチル又はプロプリオニル基で構成されるマンノサミン）の相対的な量は、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原中の種々にアシル化されたシアル酸残基の所望の割合を提供するように、提供される。例えば、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原が、２：１又は１：１のプロピオニル化された残基に対するアセチル化された残基の割合を有する場合、Ｎ−アセチルマンノサミンとＮ−プロピオニルマンノサミンは培養物中に同じ又は近似の割合で供給される。
次に、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、当技術分野で周知の方法で菌から単離することができる。ｄｅＮＡｃＳＡ抗原がアミン保護基を含む場合、このようなｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、特に、さらなる修飾を持つｄｅＮＡｃＳＡ抗原、例えば、コンジュゲート（非還元末端の過ヨウ素酸酸化などによる）などを生成し、ポリマー（多糖）の非還元末端位に、アルキル二級アミン、特に、Ｃ１アミドを供与するためにシアル酸残基を修飾するのに適している。修飾の完了後、トリハロアキル保護基は前述のように取り除くことができる。例えば、保護基は、遊離アミンを提供するために、還元的アミノ化（例えばナトリウムシアノボロハイドライド）又はさらなる還元（例えばナトリウムシアノボロハイドライド又はｐＨ９以上のアルカリで処理）によって除去することができる。
断片、再アシル化及びその他の修飾
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原がＰＳ化学修飾によって生産される場合、ＰＳ断片は、通常、Ｎ−脱アセチル化によって生成され、その断片は、一般的に３，０００から５０，０００ダルトンの範囲の平均分子量を持つ。本発明が、断片だけでなくＰＳの完全長の誘導体であるｄｅＮＡｃＳＡ抗原を考慮する場合、ＰＳ断片の誘導体のｄｅＮＡｃＳＡ抗原も考慮される。
所望の場合は、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原を提供するための再アシル化は、脱−Ｎ−アセチル化ＰＳ誘導体をｐＨ８−９程度の水溶性の溶剤（水酸化ナトリウムなど）で再懸濁し、その後適切な無水アシルを加えることによって実施することができる。ある実施形態では、多糖類及びアシル化試薬（無水アセチル又は無水プロピオン酸など）の両方が、有機溶剤／水溶液（ホルムアミド又はジメチルホルムアミドに水を２％ （ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）加えたものなど）に供給される。この実施形態は、特に、より制御されたレベルの再アシル化を提供する。本発明の方法は１モル当量未満、０．７５モル当量未満、０．５モル当量未満、０．２５モル当量未満、０．１モル当量未満、０．０５モル当量未満、０．０２５モル当量未満、０．０２モル当量未満の無水酸又はアシル化試薬（例えばＯ−アシルヒドロキシコハク酸などのアシル活性エステル）の使用を含む。
Ｏ−アシル基はｐＨを１２程度に上げることで取り除くことができる。このｐＨはその後（塩酸などを加えることにより）８程度まで下げられ、前述の誘導体が透析などによって所望の通りに精製される。所望の場合には、反応生成物は、さらに精製・凍結乾燥することができる。
結果的に生じるｄｅＮＡｃＳＡ抗原のＮ−アシル化の程度は、一般的に９０％未満、８５％未満、８４％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６０％未満、又は５５％未満であり、通常１０％、１５％、１６％、２５％、３０％、４０％もしくは４５％より大きい。ｄｅＮＡｃＳＡ抗原の分子量は様々で、ＰＳから生産されるｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、一般に、約０．５ ｋＤａ（ニ糖類など）から約８０ｋＤａ、約１ｋＤａから約７０ｋＤａ、約２ｋＤａから約６０ｋＤａ、約３ｋＤａから約５０ｋＤａ、約５ｋＤａから約２５ｋＤａ、約１０ｋＤａから約８０ｋＤａ、約２０ｋＤａから約６０ｋＤａ、約３０ｋＤａから約５０ｋＤａの範囲に及び、通常、約０．５ｋＤａから約１０ｋＤａである。
ガングリオシド由来のｄｅＮＡｃＳＡ抗原の製造方法
一般に、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、アミン保護マンノサミン（例えば、Ｎ−トリハロアシルマンノサミン）及びアシルマンノサミン（例えば、Ｎ−トリハロアセチル及びＮ−アセチルマンノサミン）の混合物を添加した成長培地中で細胞を培養することによる、哺乳類細胞（例えば、癌性哺乳類細胞など）又は他の適切なソースのガングリオシド誘導体の生合成によってガングリオシドから生産することができる。アミン保護マンノサミン及びアシルマンノサミンは、細胞によって発現されるガングリオシド誘導体が、生産されるガングリオシドの総残基に対して、９０％未満、８５％未満、８４％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６０％未満又は５５％未満で、通常、１０％、１５％、１６％、２５％、３０％、４０％又は４５％より多いアミン保護（例えば、Ｎ−トリハロアシル化）残基を含むなどの所望の割合で培地中にに供給される。
本方法は、アミン保護基の除去後、遊離アミン基による望ましくない副反応を低減又は回避し、所望のレベルのアシル化を有する脱Ｎ−アセチル化ガングリオシドを提供するように、最終産物のアシル化レベルの制御を提供することができる。一般に、脱Ｎ−アセチル化残基の割合はアミン保護マンノサミン試薬（例えば、Ｎ−トリハロアセチルマンノサミン）の量を制限することによってコントロールされる。Ｎ−アセチル化産物は任意の従来法、例えば、冷却、中和、所望の場合には精製、及び凍結乾燥などによって回収することができる。
生合成生産方法は、実施例中同様、以下に詳細に記述される。
哺乳類細胞におけるガングリオシド誘導体の生産による生合成的ｄｅＮＡｃＳＡ抗原の生産
ある実施形態において、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、１又は複数のＮ−アシルマンノサミン誘導体の存在下、及びＮ−アシルシアル酸残基を有するガングリオシド誘導体の生産を促進する条件下において、哺乳類細胞（例えば、原発性腫瘍細胞、腫瘍の転移、又は腫瘍細胞株例えば、メラノーマ細胞株（例えば、ＳＫ−ＮＥＬ２８細胞株））を培養することによって生産される。この過程は、細胞培養液中に所望のＮ−アシル基を有するマンノサミン誘導体を含ませることにより達成される。
所望のレベルにてガングリオシド産物を提供する任意の適当な哺乳類細胞は、本発明の生合成方法において使用することができる。そのような細胞は、自然状態においてガングリオシドを発現することができ、また、ガングリオシド、例えば、ＧＤ３（例えば、Satake et al. J. 2003 Biol. Chem. 278:7942-7948中に記載のCHO cells transfected with GD3 synthase (ST8Sia-I)を参照のこと）などを発現又は過剰発現するように設計することができる。ある実施形態において、生合成方法で使用される細胞は、非癌性細胞（例えば、同じ組織タイプ又は起源）と比較して上昇したレベルでＧＤ３を生産する癌性細胞を使用する。例えば、そのような細胞には、限定はしないが、神経外胚葉起源の細胞又は細胞株、癌細胞又は細胞株（例えば、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞、ＳＫ−ＭＥＬ−３７、Ｍ２１細胞、ＭＥＬＵＲ細胞など）などが含まれる。
ある実施形態において、Ｎ−アシルマンノサミン誘導体は、アミン保護基の（「保護マンノサミン」又は「アミン保護マンノサミン」）を含むマンノサミンであり、ここでは、Ｎ−トリハロアシルマンノサミンによって例示され、癌性細胞へのマンノサミン誘導体の「給餌」によって達成される。本発明の使用に適したアミン保護マンノサミンの例には、程ガングリオシド誘導体の生産のために供されるガングリオシド合成経路を細胞中に取り込ませることができる任意のアミン保護マンノサミンが含まれる。典型的なアミン保護マンノサミン試薬は、Ｎ−トリハロアシルマンノサミン、例えばＮ−トリハロアセチルマンノサミン（例えばＮ−トリクロロアセチルマンノサミン、トリフルオロアセチルマンノサミン）、Ｎ−ホルミルマンノサミン等）を含む。アミン保護マンノサミンに加え、その培地には、一般に、Ｎ−アセチルマンノサミンが含まれ、保護シアル酸の残基及びＮ−アセチル化シアル酸マンノサミン残基の両方を有するガングリオシド誘導体を提供する。
関連する実施形態において、混合したＮ−アシルシアル酸残基を有するガングリオシド誘導体を所望する場合、培地には混合Ｎ−アシルマンノサミン試薬が含まれる。例えば、Ｎ−アシルマンノサミンは、飽和又は不飽和アシル基、通常は、飽和アシル基であって、Ｃ１−Ｃ５、より一般にはＣ２−Ｃ５、より一般にはＣ２−Ｃ４、より一般にはＣ２−Ｃ３であり、特に興味深いアセチル又はプロピオニル基を持つ。このような混合Ｎ−アシルマンノサミン試薬の存在下での癌性細胞の培養は、Ｎ−アシルシアル酸残基、例えば、Ｎ−アセチルシアル酸、Ｎ−プロピオニルシアル酸などの混合物を有するガングリオシド誘導体の生成を提供することができる。特に興味深い実施形態では、細胞は、保護マンノサミン（例えば、Ｎ−トリハロアシルマンノサミン）及びＮ−アシルマンノサミン（例えば、Ｎ−アセチルマンノサミン及びＮ−プロピオニルマンノサミンの混合物）の混合物の存在下で培養される。
ある実施形態では、哺乳類細胞（例えば、癌細胞）は、Ｎ−アシルマンノサミン（例えばＮ−アセチルマンノサミン）及びＮ−トリハロアシルマンノサミンの混合物の存在下で培養される。培養物中の相対的なマンノサミン試薬の量（例えば、Ｎ−トリハロアシルマンノサミンとＮ−アセチルマンノサミンの割合）は、生合成最終産物が、ガングリオシド誘導体中において、異なるシアル酸残基及び／又はその誘導体（例えば、ガングリオシド誘導体上のトリハロアシル化された残基とアシル化された残基）の所望の割合を包含するように提供される。一般的に、保護基（例えばトリハロアシル化基）は、最終的なガングリオシド誘導体生成物中に遊離アミンを提供するために取り除かれる。例えば、最終的な脱Ｎ−アセチル化ガングリオシド誘導体産物中のアシル化残基に対する遊離アミンの割合が１：１０、１：４、又は１：１である場合、マンノサミンに対するＮ−トリハロアシルマンノサミンの割合は、およそ１：１０、１：４、又は１：１である。つまり、培養物中のＮ−トリハロアシルマンノサミンの量は、脱保護後の最終ｄｅＮＡｃＳＡ抗原産物中の所望の脱Ｎ−アセチルシアル酸基の画分とほぼ等しくなる（例えば１０％、２５％、５０％など）。
同様に、培養物中の「保護されていない」Ｎ−アシルマンノサミン（アミン保護基を含まないが、例えば、Ｎ−アシル基のようなアセチル又はプロプリオニル基で構成されるマンノサミン）の相対的な量は、ガングリオシド誘導体中の種々にアシル化されたシアル酸残基の所望の割合を提供するように、提供される。例えば、ガングリオシド誘導体が、２：１又は１：１のプロピオニル化された残基に対するアセチル化された残基の割合を有する場合、Ｎ−アセチルマンノサミンとＮ−プロピオニルマンノサミンは培養物中に同じ又は近似の割合で供給される。
ガングリオシド誘導体から生産されるｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、当技術分野で周知の方法で細胞から単離することができる。ガングリオシド誘導体がアミン保護基を含む場合、このようなガングリオシド誘導体は、特に、さらなる修飾を持つガングリオシド誘導体、例えば、コンジュゲート（非還元末端の過ヨウ素酸酸化などによる）などを生成し、ポリマー（多糖）の非還元末端位に、アルキル二級アミン、特に、Ｃ１アミドを供与するためにシアル酸残基を修飾するのに適している。修飾の完了後、トリハロアキル保護基は前述のように取り除くことができる。例えば、保護基は、遊離アミンを提供するために、還元的アミノ化（例えばナトリウムシアノボロハイドライド）又はさらなる還元（例えばナトリウムシアノボロハイドライド又はｐＨ９もしくはそれ以上のアルカリで処理）によって除去することができる。
関連する実施形態において、細胞表面トリハロアセチル化ガングリオシド誘導体を有する哺乳類細胞を含む組成物には、全細胞及びその膜抽出物の両方が含まれ、本発明において考慮される。また、本発明は、そのような細胞から単離されたトリハロアシル化ガングリオシド誘導体も考慮する。さらに、本発明はそのような細胞を使用するｄｅＮＡｃＳＡ抗原の製造方法を考慮する。関連する実施形態において、本発明は細胞表面脱Ｎ−アセチル化ガングリオシドを有する組成物、及び／又はそのような細胞から取得される膜を提供し、該細胞又は膜はここで記述される生合成法を用いて生産される。これらの組成物は脱Ｎ−アセチル化ガングリオシドに特異的な抗体を誘導するために使用することができる。免疫方法は当該技術分野並びにここで記述される内容において利用可能であり、所望の特異性の抗体の生産を達成するために容易に適合させることができる。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原コンジュゲート
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原、又は好ましくは保護ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原−担体複合体を供与するため、担体にコンジュゲートすることができる。コンジュゲートされた抗原−担体複合体は複数の担体分子、複数のｄｅＮＡｃＳＡ抗原分子、又はその両方を含むことが可能である。
前述のように、前述のコンジュゲートのｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、前述のように最小限のエピトープを決定するダイマーとして、又はポリマー単位（前述のエピトープを決定する２個以上のダイマー単位など）として供与されることが可能である。ｄｅＮＡｃＳＡ抗原がポリマー構造である場合、そのｄｅＮＡｃＳＡ抗原はホモポリマー状又はヘテロポリマー状である。その組成は、ポリマー又は保護アミンポリマーの非還元、還元末端又はその両方に結合した付加的な残基を含んでもよい。
担体は、タンパク質、ペプチド、T細胞アジュバント又は免疫応答を強化する能力があるその他の化合物である。タンパク質は、限定はしないが、ウィルス、細菌、寄生虫、哺乳類、及び真菌のタンパク質からなるグループから選択することができる。ある実施形態において、担体は、アルブミンである。担体は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、髄膜炎菌外膜タンパク複合体（例えば US4,707,543; US6,476,201; US6,558677を参照）又は細菌外膜（組換え髄膜炎菌ポリンBなど）である。このような担体は生化学又は製薬会社から得るか、標準的な手法（Cruise, J M(ed.) Conjugate Vaccines in Contributions to Microbiology and Immunology vol.10（1989））で調製することができる。担体としての使用に適したT細胞エピトープを含む合成ペプチドは、「一般的な」T細胞エピトープ（Panina-Bordignon et al 1989 Eur J Immunol 19:2237）又は非天然Pan DRエピトープペプチド（PADRE）（del Guercio et al 1997 Vaccine 15:441）を含んでもよい。担体として機能しうる他のタンパクを含むその他の試薬は免疫学の技術分野における当業者に既知である。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原のコンジュゲートのための例示的な手法は、必ずしも限定はしないが、US Pat. Nos. 4,727,136; 5,811,102 （Ｂ群髄膜炎菌不飽和Ｃ３−５Ｎ−アシル誘導体多糖類コンジュゲートの記載）、US 5,969,130; および US 6,080,589に記載されたようにPSコンジュゲートを含む。例えば、１又は複数の担体タンパク質の共有結合に使用するため、コンジュゲートは、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原の多糖の非還元末端、還元末端、又はその両方にアルデヒド基を導入することで達成できる。このようなことは、ＰＳ又はＰＳ誘導体を、例えばメタ過ヨウ素酸ナトリウムなどに接触させて過ヨウ素酸化することにより達成できる。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原が誘導体化されていないアミノ基で構成される場合、一定の制限がｄｅＮＡｃＳＡ抗原を担体タンパク質などの担体に結合させる手順に課される。この実施形態では、担体は一般的に、ＥＤＡＣで活性化されたカルボキシル基における、ヒドラジドまたはアジピン酸ジヒドラジドの担体タンパク質との反応を通じて、１又は複数のアジド（ヒドラジド又はアジピン酸ジヒドラジド）基を含むように改変されている（US Pat, No. 6, 632,437などを参照）。ヒドラジドアミノ基のｐＫａが約２．５であり、またヒドラジドは強い求核試薬であるので、イミンコンジュゲート反応は、担体タンパク質及び多糖上の１級アミンが実質的に完全にプロトン化されており、非反応であるためｐＨ５．５−７．５あたりで行うことができる。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原−タンパク質コンジュゲートワクチンはサイズ排除クロマトグラフィー(ToyoPerl HW-45F)で精製される。タンパク質濃度はＬｏｗｒｙタンパク質定量法、コンジュゲートした多糖類の量はレゾルシノール定量法（Svennerholm 1957 Biochim biophys Acta24:604）によって決定される。タンパク質と多糖が共有結合していることを確認にするため、コンジュゲートワクチンをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、タンパク質と多糖を、ポリクローナル抗担体タンパク抗血清と多糖を検出するための抗ＰＳ ｍＡｂｓを使用して、ウェスタンブロットによって別個に検出する。
ある実施例では、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原が二量体エピトープを有する場合、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は担体に結合を提供するよう修飾されることができ、次式により表される構造を有する：
Figure 2009525947
式ＶＩＩＩ
ここでＸ、Ｙは前述のように定義され、Ｒ１はＨまたはアシル基（例えばアセチル基）である。他の実施例では、Ｒ１はＨ；飽和または不飽和アシル基（例として飽和または不飽和Ｃ２−１８アシル基、飽和または不飽和Ｃ２−１６アシル基、飽和または不飽和Ｃ２−１２アシル基、飽和または不飽和Ｃ２−１０アシル基、飽和または不飽和Ｃ２−８アシル基、飽和または不飽和Ｃ２−６アシル基、飽和または不飽和Ｃ２−４アシル基、飽和Ｃ２−４アシル基）；Ｎ−脂肪酸アシル基（例：Ｎ−ラウロイル、Ｎ−オレオイルなど）；または脂肪酸アミン（ドデシルアミン、オレオイルアミンなど）とは独立して選択される。ある実施例ではＲ１は（例えばUS5,576,002中に記載されているように）ｎ−ブタノイル、イソブタノイル、ｎ−ペンタノイル、ｎ−ヘキサノール、ｎ−ヘプタノイル又はｎ−オクタノイルなどのＣ４からＣ８のアシル基であるか、US6,350,449に記載されているような不飽和Ｃ３−Ｃ５アシル基である。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原が三量体の反復で構成される別のある実施形態では、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、担体に結合を提供するよう修飾されることができ、次式により表される構造を有する：
Figure 2009525947
式ＩＸ
ここで、
Ｘ、ＹおよびＺは独立したＨまたはアミン保護基；または、飽和または不飽和アシル基（通常は飽和アシル基）、但し、少なくともＸ、ＹおよびＺの１つはＨまたはトリハロアシル基；また少なくともＸ、ＹおよびＺの１つは飽和または不飽和アシル基、通常は飽和アシル基で、その中に特に興味深い実施形態があり、それらにおいては少なくともＸ、ＹおよびＺの１つはＨ（又はアミン保護基）、少なくともＸ、ＹおよびＺの１つはアセチル基、そしてＸ、Ｙ及びＺの１つはプロピオニル基である；
ｎは少なくとも１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０又はそれ以上であり、通常はおよそ４以上の残基、より通常にはおよそ１０以上の残基（ポリマー化の程度（Ｄｐ）が２程度から６０程度、１０程度から５０程度、３０程度から５０程度、１０程度から２０程度、１２程度から１８程度であり、Ｄｐが２程度から１０程度が特に興味深い）；そして
Ｒ１はＨ、アミン保護基、またはアシル基（例としてアセチル基などの飽和アシル基）である。他の実施形態では、Ｒ１はＨ；アミン保護基；飽和又は不飽和アシル基（例えば、飽和又は不飽和Ｃ２−１８アシル基、飽和又は不飽和Ｃ２−１６アシル基、飽和又は不飽和Ｃ２−１２アシル基、飽和又は不飽和Ｃ２−１０アシル基、飽和又は不飽和Ｃ２−８アシル基、飽和又は不飽和Ｃ２−６アシル基、飽和又は不飽和Ｃ２−４アシル基、飽和Ｃ２−４アシル基）；Ｎ−脂肪酸アシル基（例としてN-ラウロイル、N-オレオイル）；又は脂肪酸アミン（例えば、ドデシルアミン、オレオイルアミンなど）とは独立して選択される。ある実施形態ではＲ１は（例えばUS5,576,002中に記載されているように）ｎ−ブタノイル、イソブタノイル、ｎ−ペンタノイル、ｎ−ヘキサノイル、ｎ−ヘプタノイルまたは ｎ−オクタノイルなどＣ４からＣ８のアシル基であるか、US6,350,449に記載されているような不飽和Ｃ３−Ｃ５アシル基である。
プロピロニル結合又はアセチル結合コンジュゲート
他の実施形態において、本発明は、次式で表される構造を含むｄｅＮＡｃＳＡ抗原を含む組成物を提供する。が三量体の反復で構成される別のある実施形態では、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、担体に結合を提供するよう修飾されることができ、次式により表される構造を有する：
Figure 2009525947

ここで、Ｘ、ＹおよびＺは独立にアクリル基（例えば、Ｎ−アクリル、メタクリル）又はハロアセチル基（たとえば、ブロモアセチル、クロロアセチル）であり、、少なくともＸ、Ｙ及びＺの１つはＨであり、少なくともＸ、Ｙ及びＺの１つは飽和アシル基である。ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、付加的に、担体タンパク質又は共有結合したアルキル第２アミンとアクリル又はハロアセチル基との反応によってコンジュゲートすることができる。本実施形態において、一般に、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原はポリマー内に配置されるような１又は複数の構造を有する。例えば、上記の構造は、例えば、約１０％〜１００％、約２５％〜９０％、約５０％から７５％のｄｅＮＡｃＳＡ抗原を表す。
プロピロニル結合又はアセチル結合ｄｅＮＡｃＳＡ抗原コンジュゲートは、少なくとも部分的に活性化アクリル酸又は活性化ハロ酢酸と脱Ｎ−アセチル化ＰＳ（又は、シアル酸修飾タンパク質又はガングリオシドなどの他のシアル酸残基含有ポリマー）を反応させることによって生産されが、該活性化アクリル酸又は活性化ハロ酢酸は、例えば、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド）などのカルボジイミドなどのカルボキシ活性化試薬との反応によって生成される。活性化アクリル酸又は活性化ハロ酢酸の量は、例えば、約１０％〜１００％、約２５％〜８０％、約５０％から７５％のＰＳ中のｄｅＮＡｃＳＡ抗原コンジュゲートの所望のレベルに対して選択される。
例えば、プロピロニル結合コンジュゲートには、次式で表される構造が含まれる：
Figure 2009525947
ここで、Ｘは、担体タンパク質の反応性システイン残基又は反応性リジン、ヒスチジン又はアルギニン残基由来のチオール、Ｙ及びＺは独立にＨ又は飽和アクリル基であり、少なくともＹ及びＺはＨであり、少なくともＹ及びＺは飽和アシル基である。ここで考慮されるｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、担体がＹ（Ｘ及びＺはＨ又は飽和アシル基である）に配置されるアクリル基を介してコンジュゲートされ、又はＺ（Ｘ及びＹはＨ又は飽和アシル基である）に配置されるアクリル基を介してコンジュゲートされるものを包含することが理解されるであろう。
ハロアセチル基との反応を介して担体と結合する例示的なコンジュゲートは次式によって表される構造を含む：
Figure 2009525947
ここで、Ｘは、担体タンパク質の反応性システイン残基又は反応性リジン、ヒスチジン又はアルギニン残基由来のチオール、Ｙ及びＺは独立にＨ又は飽和アクリル基であり、少なくともＹ及びＺはＨであり、少なくともＹ及びＺは飽和アシル基である。ここで考慮されるｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、担体がＹ（Ｘ及びＺはＨ又は飽和アシル基である）に配置されるアクリル基を介してコンジュゲートされ、又はＺ（Ｘ及びＹはＨ又は飽和アシル基である）に配置されるアクリル基を介してコンジュゲートされるものを包含することが理解されるであろう。
エキソシアリダーゼによるｄｅＮＡｃＳＡ抗原調製物の処理
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原残基を含まない多糖（ＰＳ）、オリゴ多糖（ＯＳ）又は他のＮ−アシル化シアル酸ポリマー夾雑物は、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原を含む組成物において、シアル酸ポリマー（例えば、ＰＳ及びＯＳなど）を汚染するアル酸残基のα（２→８）−グリコシド結合における切断を促進するエキソシアリダーゼ（また、エキソノイラミニダーゼとも称する）処理によって減少させることができ、その結果、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原を濃縮することができる。適切なシアリダーゼとしては、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ（例えば、ＳＩＡＬＩＤＡＳＥ ＡＴＭ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（例えば、ＳＩＡＬＩＤＡＳＥ ＩＴＭ）、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ（例えば、ＳＩＡＬＩＤＡＳＥ ＶＴＭ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（例えば、ＳＩＡＬＩＤＡＳＥ ＴＴＭ）、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ、Ｈｉｔｃｈｎｅｒ Ｂｌ Ｓｔｒａｉｎ（例えば、ＳＩＡＬＩＤＡＳＥ ＮＴＭ）のエキソシアリダーゼ、及びα（２→８）−グリコシド結合を切断し得るたのエキソシアリダーゼが含まれる。使用に適切なエキソシアリダーゼは市販されている。
シアリダーゼ処理は、例えば、適切なｐＨのバッファー中での組成物のインキュベーションによって達成されるが、該ｐＨはｄｅＮＡｃＳＡ抗原（例えば、ＰＳ誘導体）の分解及び／又はｄｅＮＡｃＳＡ抗原（例えば、ＰＳ誘導体）の加水分解（例えば、シアルラクトン残基などのシアル酸誘導体の生成が起こる）を回避するように選択することができる。例えば、約ｐＨ６．５における試料のインキュベーションは、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原の分解を減少させるエキソシアリダーゼ活性を提供することができる。インキュベーションは任意の適切な期間であり、例えば、数時間（例えば、５，１０，１２時間又はそれ以上）から数日（１，２，３，４，５又はそれ以上の日数）である。インキュベーションは任意の適切な温度で行われ、室温（例えば、約３７℃）が含まれる。低いｐＨはシアル酸誘導体を形成させるが、該組成物は、例えば、サイクリックラクトンなどを加水分解のために短い期間（例えば、３０分から１時間）、ｐＨを上げてインキュベートすることができる。
エキソシアリダーゼ処理により、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原調製物中に夾雑物として存在するであろう非反応性の完全長Ｎ−アシル化シアル酸ポリマー（例えば、Ｎ−アシル化ＰＳ）除去され、部分的にこれらの調製物はここで記述されるような合成方法を用いて調製される。この方法において、エキソシアリダーゼによる処理によって、組成物におけるｄｅＮＡｃＳＡ抗原の濃縮を行うことができる。例えば、シアリダーゼ処理は、Ｎ−アシル化ＰＳ重量で６０％未満又は４０％未満の組成物を提供することができる。
エキソシアリダーゼ処理されたｄｅＮＡｃＳＡ抗原は任意の適切な方法を用いて担体タンパク質とコンジュゲートすることができる。例えば、エキソシアリダーゼ処理ｄｅＮＡｃＳＡ抗原はＮ−アシル化（例えば、アクリル酸又はハロ酢酸を用いて）後、興味のあるタンパク質担体とコンジュゲートすることによてコンジュゲートされる。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原及びｄｅＮＡｃＳＡ抗原コンジュゲートの免疫原性
単離されたｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、さらなるコンジュゲートがあろうとなかろうと、又は提示の構造があってもなくても、免疫原性を持つか、あるいはその代わりに、その免疫原性がコンジュゲートから起こる可能性がある。免疫原性を測定する方法は当業者には周知であり、主に、コンストラクトの注入後の様々な時点での濃度、結合活性、アイソトープ分布などの血清抗体の測定を含む。より大きな免疫原性は、より高い力価及び／又は抗体の寿命の伸びによって反映される。免疫原性は、インビトロバクテリア定量法や、適切な動物のチャレンジモデルにおいて、感染又は疾病に対する受動的な保護を与えるために免疫化した動物の血清の能力によって測定が可能である。免疫原性は治療を受ける患者の集団、又は患者集団の免疫応答を模倣する集団の中で測定が可能である。
特定の物質の免疫原性を決定する特に好ましい手段は、まず動物（例としてマウス）の血清を、免疫化前と、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原で初回抗原刺激し、追加の投与でブーストした後の両方の時点で得ることである。これに続いて、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原エピトープに結合している免疫化後の血清の強度を、ＥＬＩＳＡを用いて確認し、コントロールのモック免疫化動物の対応する結果と比較する。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原に対する免疫応答を初回抗原刺激する結果、自己抗体の生産を減少又は回避し、同一ＰＳコンジュゲートを接種された脱−Ｎ−アセチル化ＰＳで初回抗原刺激されていない個体の反応と比較した場合、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原ジュゲートに対して増強された抗体反応を提供することができる。
抗原性組成物の製剤形態
「抗原組成物」「抗原性組成物」または「免疫原性組成物」は、ここでは、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原コンジュゲートを包含するｄｅＮＡｃＳＡ抗原を含む組成物を便宜上総称して使用される。抗原組成物には、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原、そのコンジュゲートの両方が含まれる。ＮｍＢ ＰＳ、大腸菌 Ｋ１、又は癌細胞に対する抗体を誘発するのに有用な組成物は、本発明により考慮される。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は単離された形態又は膜中（例えば、ＮｍＢ株から生産されるような外膜ベジクル又はマイクロベジクルなどのベジクル）の組成物として提供される。ｄｅＮＡｃＳＡ抗原が哺乳類細胞を含む生合成法を使用して生産される場合、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は哺乳類全細胞表面又は哺乳類細胞の膜若しくは脂質抽出物上に提供される。哺乳類全細胞を使用する場合、哺乳類細胞は、通常、被検対象に投与する際にさらなる増殖を阻害するために不活性化される。任意の物理的、化学的又は生物学的不活性化法が使用され、これには限定はしないが、放射線照射（少なくとも約５，０００ｃＧｙ、一般には少なくとも約１０，０００ｃＧｙ、より一般的には、少なくとも約２０，０００ｃＧｙ）；又はマイトマイシン−Ｃ（例えば、一般には少なくとも１０．ｍｕ．ｇ／ｍＬ；より一般的には少なくとも約５０μｇ／ｍＬ）での処理が含まれる。
ある実施形態において、特に、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原がＰＳによって生産される場合、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原組成物は、該組成物中におけるＰＳ及びＯＳの夾雑を減少させ、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原を濃縮するためにエキソシアリダーゼで処理されている。
本発明の組成物（特に、ワクチンとしての使用に適するもの）には、免疫原的に有効量の抗原、及び必要に応じてその他の適合性のある成分が含まれる。「免疫原的に有効量の」とは、その量の個体への投与、同一又は異なる抗原組成物の、一連の投与の一部としての単一投与で、細胞表面接近可能なｄｅＮＡｃＳＡ抗原（例えば、少なくとも部分的に脱Ｎ−アセチル化されているガングリオシド）を有する癌性細胞の徴候の治療又は予防に対し、効果的な抗体応答を誘導するのに有効であることを意味する。ｄｅＮＡｃＳＡ抗原組成物は被検対象中における抗ＳＥＡＭ３反応抗原抗体応答を誘導するために投与することができる。
投与される量は投与の目的（例えば、ヒト対象中の免疫療法を提供するため、ハイブリドーマを作製するための抗体産生を提供するため（例えば、非ヒト宿主中のように））、治療される個体の健康及び身体的状態、年齢、治療される個体の分類学上のグループ（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、霊長類など）、応対を生産する個体の免疫システムの能力、所望される保護の程度、ワクチンの処方、医学的状況の担当医の評価、その他の要因に応じて変動する。量が日常的な試行を通して決定される比較的広い範囲になることが予測される。投与措置は単一投与スケジュール又は複数回投与スケジュール（例としてブースター投与を含む）が可能である。このワクチンは他の免疫調節性剤と組み合わせて投与できる。
本発明の組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤であって、水溶液、しばしば生理食塩水のような溶液中に供給することができ、又は粉末として供給することができる。本発明の組成物は、本発明のｄｅＮＡｃＳＡ抗原及びアジュバントを含むことができる。ヒトに使用できる、既知の適当なアジュバントは、必ずしも限定はしないが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９（４．３％ ｗ／ｖ スクアレン、０．５％ ｗ／ｖ ツイーン、０．５％ ｗ／ｖ Ｓｐａｎ ８５）、ＣｐＧ含有核酸（シトシンがメチル化されていないもの）、ＱＳ２１、ＭＰＬ、３ＤＭＰＬ、Ａｑｕｉｌｌａからの抽出物、ＩＳＣＯＭＳ、ＬＴ／ＣＴ変異体、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−共重合−グリコリド）（ＰＬＧ）微小粒子、Ｑｕｉｌ Ａ、インターロイキン、などを含む。実験動物に対しては、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ、 Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰｌ １６３７，ノル−ＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパラミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリロキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ，ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、及び、細菌から抽出した３種類の成分である、モノホスホリルリピッドＡ、トレハロースジミコレート及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含むＲＩＢＩを２％ スクアレン／ツイーン８０乳濁液中に含んだものを使用することができる。アジュバントの効果は免疫原性抗原に対する抗体の量を測定することで決定できる。
さらに組成物の効果を強める例示的なアジュバントは下記を含むが、それに限定されな
い。：(１) 水中油型乳剤形態（ムラミルペプチド(下記例参照)、又は細菌細胞壁成分のようなその他特定の免疫賦活性剤があってもなくてもよい。）例として（ａ）Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒを用いてサブミクロンの粒子形状に製剤化された、５％ スクアレン、０．５％ ツイーン８０、及び０．５％ Ｓｐａｎ ８５（任意にＭＴＰ−ＰＥを含む）を含有するＭＦ５９ＴＭ（WO90／14837；Chapter 10 in Vaccine design：the subunit and adjuvant approach，eds. Powell ＆ Newman，Plenum Press 1995）、（ｂ）サブミクロンの乳剤にミクロ流体化された、もしくはより大きな粒子サイズの乳剤を産生するためボルテックスで攪拌された、１０％ スクアレン、０．４％ ツイーン８０、５％ ｐｌｕｒｏｎｉｃ−ｂｌｏｃｋｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌ１２１、及びｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、及び（ｃ）２％ スクアレン、０．２％ ツイーン８０、及び、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）、望ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ＋（ＤｅｔｏｘＴＭ）などの１又は複数の１種類以上の細菌細胞壁成分を含む、ＲＩＢＩＴＭ ａｄｊｕｖａｎｔ ｓｙｓｔｅｍ（ＡＳ）（Ribi Immunochem, Hamilton, MT）；（２）ＱＳ２１又はＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ（Cambridge Bioscience, Worcester, MA）のようなサポニンアジュバントは使用可能であり、又はＩＳＣＯＭｓ（免疫賦活性複合体）のような、それより作られる粒子であって、ＩＳＣＯＭｓは、例えばWO 00/07621のような追加の洗浄剤を欠いてもよい；（３）完全なＦｒｅｕｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＣＦＡ）及び不完全なＦｒｅｕｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＩＦＡ）；（４）インターロイキン（例として、ＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−７，ＩＬ−１２(WO99/44636)など)、インターフェロン(例えば、ガンマインターフェロン)、マイクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＤＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのようなサイトカイン；（５）モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）又は３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、例えば、GB-2220221、EP-A-0689454、ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ、例えば、WO 00/56358とともに使用されるとき、任意にミョウバンの実質的非存在下で；（６）３ｄＭＰＬと、例えばＱＳ２１及び／又は水中油乳剤、例えば、EP-A-0835318, EP-A-0735898, EP-A-0761231との組み合わせ；（７）ＣｐＧモチーフ（Krieg Vaccine 2000, 19, 618−622; Krieg Curr opin Mol Ther 2001 3: 15-24;Roman et al.,Nat. Med, 1997,3,849-854;Weiner et al., PNAS USA, 1997, 94, 10833-10837; Davis et al., J lmmunol 1998,160,870-876;Chu et al., J. Exp. Med, 1997,186,1623-1631; Lipford et al., Ear. J. Immunol., 1997,27,2340-2344;Moldoveami et al, Vaccine, 1988,16,1216-1224, Krieg et al, Nature,1995, 374, 546-549; Klinman et al.,PNAS USA,1996,93,2879-2883;Ballas et al, J. lmmunol 1996,157,1840-1845;Cowdery et al, J. Immunol, 1996,156,4570-4575;Halpen et al, Cell Immunol., 1996,167,72-78;Yamamoto et al., Jpn. J. Cancer Res.,1988,79,866-873;Stacey et al. J. Immunol.,1996,157,2116-2122;Messina et al , J. lmmunol. 1991,147,1759-1764;Yi et al, J. lmmunol, 1996,157,4918-4925;Yi et al, J. lmmunol, 1996,157,5394-5402;Yi et al, J. lmm. 1998,160, 4755-4761;and Yi et al, J. lmmunol, 1998,160,5898-5906;国際出願公開第WO96/02555, WO98/16247, WO98/18810, WO98/40100, WO98/55495, WO98/37919および WO98/52581）で構成されるオリゴヌクレオチド、すなわち、シトシンがメチル化されていない場合、少なくとも1個のCGジヌクレオチドを含むもの；（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル、例としてWO99/52549；（９）ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性物質とオクトキシノールとの併用(WO 01/21207)、またはポリオキシエチレンアルキルエーテル、またはエステル界面活性物質と少なくとも1種類の、オクトキシノールのような非イオン界面活性物質の併用(WO 01/21152)；（１０） サポニンと免疫賦活性のオリゴヌクレオチド(例としてＣｐＧオリゴヌクレオチド)（WO 00/62800）；（１１）免疫賦活薬および金属塩粒子、例としてWO 00/23105；（１２）サポニンおよび水中油乳剤、例としてWO 99/11241；（１３）サポニン（例としてＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ ＋ ＩＭ２（任意に＋ステロール）、例としてWO 98/57659；（１４）前述の組成物の効力を強化する免疫賦活剤として作用するその他の物質。Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ），Ｎ−２５ アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ），Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタニニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリロキシ）−エチルアミン ＭＴＰ−ＰＥ）などのムラミルペプチド。ヒトへの使用に適するアジュバントは被検対象がヒトの場合に特に興味深い。
抗原組成物は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、ブドウ糖、ショ糖、マグネシウム、炭酸塩などの他の成分を含むことが可能である。その組成物は薬学上受容可能な補助的な物質、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを、pHの調整、緩衝液、毒性調整剤などにより生理的条件に近づけるため、必要に応じて含むことができる。これらの組成中の抗原の濃度は広い範囲にわたる可能性があり、主に液量、粘性、体重などにより、投薬の特定の方法と患者の必要性に従って選択される。結果として得られた組成は、溶液、懸濁剤、錠剤、丸薬、カプセル、散剤、ジェル、クリーム、ローション、軟膏、煙霧剤などの形態となることができる。
本発明の医薬製剤の抗体の濃度は広い範囲すなわち、重量で約０．１％以下、通常は２％またはそれ以上から２０％〜５０％、またはそれ以上まで、で変化することが可能であり、主に液量、粘性などにより、選択された投薬の特定の方法に従って選択される。
免疫化
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原（付加的にコンジュゲートされてもよい）は単独で、又はたのワクチンと組み合わせて使用される。組み合わせて使用する場合、様々な組成物を同一又は異なる剤形に供給することができる。異なる剤形で投薬された場合、その組成物は同一又は異なる用法（例として同じまたは異なる経路で、同時又は異なる時点(例として同日または別の日) など）で投与することができる。一般的に、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原の投与は、下記に詳細が記載されているように、連続して、同時に、または混合して行ってもよい。好ましくは、投与は連続で、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原の反復投与である。典型的な免疫化療法はより詳細が後述されている。
一般的に免疫化は、その組成物を、経口、経鼻、経鼻咽頭、非経口、腸内、胃内、局所的、経皮的、皮下、筋肉内への、錠剤、固形、散剤、液体、噴霧剤の形態での投与などの適切な経路を通じて、局所又は全身に、賦形剤を追加又は追加せずに投与することによって達成される。非経口的な投薬可能な組成物の実際の調製方法は、当業者には周知又は明白であり、Remington’s Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania（1980）のような出版物により詳しく記載されている。
経口投与される場合、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は分解から保護されるべきことが理解できる。これは典型的には、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原を酸または酵素加水分解に対して耐性を持たせる組成物と混合するか、リポゾームのような適切な耐性のある担体に詰め込むことで達成される。興味深い化合物を保護する方法は当該技術分野では周知である。
血清の半減期を強化するため、注入される抗原の調製物はカプセル化され、リポソームの内腔に導入し、コロイドとして調製することができ、又は、ペプチドの半減期を延長する他の従来の技法を利用することができる。リポソームを調製するには、例えば、Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467(1980), U.S・Patents Nos. 4,235,871, 4,501,728及び4,837,028に記載されているような様々な手法が使用できる。また、該調製は、抗原調製の放出及び投与に対して制御放出又は持続放出の形態を混在した、又は連続した方法で与えることができる。
免疫療法として使用する場合、該生成物は予防すべき疾患の危険に曝されているか、又は少なくとも疾患の進行は少なくとも部分的に停止しているか又はこれらが組み合わさった状態の被検対象に対し、投与することができる。「危険に曝されている」被検対象は、例えば、１又は複数の疾患のサイン又は徴候を示しているが、ある診断には不十分であり及び／又は疾患の可能性を増加させる状況に曝されていたか又は曝されているものである。例えば、抗原組成物は、細胞表面ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ（例えば、少なくとも部分的に脱Ｎ−アセチル化されている細胞表面ガングリオシド）を有する癌の危険に曝されているか、癌になっているか、癌の転移の危険に曝されている被検対象への投与も含まれる。
上記を達成するのに適合された量は、「療法的有効量」と定義できる。治療上の有効量は、例えば、抗原組成、投与様式、患者の体重及び一般的な健康状態、及び処方を指示する専門家の判断に依存するであろう。抗原組成物の単一又は複数投与は、投与量、および患者に必要かつ許容される頻度、そして投与の経路に依存し得る。一般的に、免疫化は、被験対象の免疫応答を誘発するために与えられる。ここで論じられるｄｅＮＡｃＳＡ抗原組成物は、被検対象のポリシアル酸に有意に交差反応する、検出可能な抗体を誘発せず、かつ、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ（例えば、癌性細胞上の）と特異的に結合する抗体を誘発するという利点を提供することができる。
免疫化療法
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、選択的な抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体の産生を提供するように宿主へ投与される。ｄｅＮＡｃＳＡ抗原組成物は、連続して投与される。まず、免疫原性的に効果がある量のｄｅＮＡｃＳＡ抗原（担体とコンジュゲートしていてもよく、賦形剤のある場合とない場合がある）を被験対象に投与する。初回の用量は一般的に免疫応答を誘発させるのに効果がある量（例としてBおよび／またはT細胞の賦活化）である。初回の免疫化の量は一般的に、７０ｋｇの患者に対して約０．００１ｍｇから約１．０ｍｇの範囲であり、より一般的には７０ｋｇの患者に対して約０．００１ｍｇから約０．２ｍｇの範囲、通常は約０．００５ｍｇから約０．０１５ｍｇの範囲である。特に抗原が、体腔内や臓器の内腔など、隔離した部位に投与され、血流中に投与されない時には、１日に１人の患者につき０．００１から約１０ｍｇまでの用量を使うことができる。実質的に高用量（例として１０から１００ｍｇ以上）は、経口、経鼻、又は局所的な投与で可能である。
初回のｄｅＮＡｃＳＡ抗原組成物投与後、第２の抗原組成物（例えば、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原、任意に、コンジュゲート型のもの、賦形剤のある場合とない場合がある）の治療効果のある用量を、被検対象が初回投与への曝露により免疫学的に初回刺激を受けた後に、被検対象に投与する。このブースターは患者の反応および状態によって、初回の免疫化より数日後、数週間後、または数ヵ月後に投与される。
初回の抗原組成物に対する免疫応答の存在は、周知の手法（例えば、免疫化の前後に個体から血清を取り、その個体の免疫状態の変化を示すことによる、例えば、免疫沈降定量法、またはＥＬＩＳＡまたは殺菌定量法、またはウェスタンブロッティング、またはフローサイトメトリー定量法など）及び／又は２回目の注入に対する免疫応答の大きさが、２回目の注入に使われた物質の組成物で初めて免疫化（例えば、免疫学的初回刺激）された対照動物の応答と比較して高いことを示すことによって決定できる。免疫学的初回刺激及び／又は最初の抗原組成物に対する免疫応答の存在は、予備的な実験に基づいた生じるべき免疫応答及び／又はプライミングに十分な時間−例えば、２，４，６，１０又は１４週間−である最初の免疫後の期間、を待つことが前提とされる。
ある実施形態においては、第３の抗原組成物の有効用量（例えば、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原、場合によってはコンジュゲートされ、賦形剤があってもなくてもよい）が、その個体が初回刺激を受け、及び／又は第２の抗原組成物に対する免疫応答を備えた後に被験対象に投与される。第３のブースターは被験対象の応答および状態によって、２回目の免疫化の数日後、数週間後、または数ヵ月後に投与できる。第２の抗原組成物に対する初回刺激および／または免疫応答の存在は、第２の抗原組成物に対する免疫応答を検出するのに使用されたのと同じ手法で決定できる。第２の抗原組成物に対する初回刺激および／または免疫応答の存在は、２回目の免疫化の後、予備的実験に基づいて、免疫応答が起こるのに十分な期間―例えば、２、４、６、１０または１４週−待つことが前提とされる。第２の抗原組成物のブースト用量は、典型的な場合、約０．００１ｍｇから約１．０ｍｇの抗原で、免疫原の性質および免疫化の経路によって変わる。
第４、第５、第６の抗原組成物を使用した第４、第５、第６又はそれ以上のブースター免疫化も考慮される。
ある実施形態において、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原が少なくとも１回、通常は少なくとも２回投与され、またいくつかの実施形態では２回以上投与される。
ある実施形態において、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原組成物（例えば、脱Ｎ−アセチル化ＰＳ誘導体又は脱Ｎ−アセチル化ＰＳ誘導体コンジュゲート）は、免疫応答の初回刺激を行うために最初の抗原組成物として投与される。続いて投与される抗原組成物（例えば、ブースター投与）は同一又は異なるｄｅＮＡｃＳＡ抗原組成物、又は第１の抗原組成物に対する初回免疫応答をブーストする抗原性組成物が可能である。理論にとらわれず、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原の最初の初回刺激投与は、宿主シアル酸との最小限の交差反応性を示す抗体の生成に対する、宿主の免疫応答に向けられ、その結果、自己反応性の抗体の産生が回避される。一度宿主の免疫応答がこのように初回刺激されると、その後、自己免疫応答を誘発し得る抗原への曝露の結果、宿主シアル酸と公差反応する自己抗体の産生を減じることができる。
ある実施形態では、抗原組成物は、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ含有抗原に関し免疫的にナイーブである哺乳類被検対象（例えば、ヒト）に投与することができる。他の実施形態において、該被検対象は、およそ５歳以下、好ましくは、およそ２歳以下のヒトの子どもであり、抗原組成物は次の１又は複数の時点で投与される：出生後２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１ヶ月、又は１年、１５、１８、２１ヶ月、又は２、３、４、５歳時。このようなより若い被検対象の治療は神経芽細胞種などのある種の癌の治療において関心も持ち得る。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原組成物はワクチンとして使用され、投与は疾患の徴候の最初のサインに先立ち、可能性のある疾患の最初のサインの時、又は細胞表面ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ（例えば、少なくとも部分的に脱Ｎ−アセチル化されるガングリオシド）を有する原発性癌及び／又は転移癌の診断前又は後において、開始される。
抗体の生産
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原を含む組成物が、ここで記述される抗体ベース癌治療での使用に適するモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を含む、抗ｄｅＮＡｃＳＡ抗原抗体の産生に使用し得ることは容易に理解できる。ｍＡｂｓを生産する方法は当該技術分野において周知であり、抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープｍＡｂの生産における使用に容易に適合させることができる。
例えば、ｍＡｂｓ産生のためのハイブリドーマはｄｅＮＡｃＳＡ抗原で免疫した動物（通常は非ヒト動物）由来の刺激された免疫細胞、免疫された動物の膵臓由来の細胞などを単離することによって作製することができる。その後、これらの細胞は、永久に細胞培養において複製することができるミエローマ細胞又はトランスフォームした細胞などの不死化細胞と融合させ、その結果、不死の免疫グロブリン分泌細胞株を生産される。利用される不死化細胞株は、ある栄養素の利用に必要な酵素に欠陥があるように選択される。多くのそのような細胞株（ミエローマなど）は、当業者に知られており、例えば：チミジンキナーゼ（ＴＫ）又はヒポキサンチン−グアニンホスホリボキシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）が含まれる。これらの欠陥によって、例えば、ヒポキサンチンアミノプテリンチミジン培地（ＨＡＴ）中でのその成長能力に従って融合細胞の選択が可能になる。
利用される不死化融合パートナーは免疫グロブリンを分泌しない株から誘導される。融合した細胞又はハイブリドーマは、融合細胞の生存を可能にするが、非融合細胞の生存は可能にしない条件下で培養され、生じたコロニーは所望のモノクローナル抗体の産生に関しスクリーニングされる。そのよな抗体を産生するコロニーはクローン化され、大量の抗体を産生さえるために増幅され、成長させる。Kohler and Milstein, 1975 Nature 256:495 (該開示は出典としてここに取り込む)を参照のこと。
所望の抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ特異性を有する大量のｍＡｂｓは、所望の抗体を産生する分泌ハイブリドーマを同定することによって得ることができ、これらのハイブリドーマクローンをマウスの腹腔内に注射し、その腹水液を回収する。該マウスは、好ましくは、プリスタン又は他の腫瘍プロモーター及び化学的免疫抑制又は放射線照射などでプライミングされ、当該技術分野において知られる種々の適当な系統であってもよい。腹水液はマウスから回収され、そこからモノクローナル抗体が、例えば、ＣＭセファロースカラム又は他のクロマトグラフィー手段で精製される。あるいは、該ハイブリドーマはインビトロ又は懸濁状態で培養される。バッチ連続培養、又は他の適当な培養過程が利用可能である。その後、モノクローナル抗体は培地又は上清から回収される。
抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体の抗原結合断片を含む抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体は、遺伝子操作によって作製することができる。本技術において、標準的なハイブリドーマ法と同様に、抗体産生細胞が消耗の抗原又は免疫原で感作される。免疫された膵臓細胞又はハイブリドーマから単離されたメッセンジャーＲＮＡをＰＣＲ増幅に使用してｃＤＮＡを調製するためのテンプレートとして使用する。最初の抗原特異性を維持する重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子を各々含むベクターのライブラリーが、発現ベクターに増幅免疫グロブリンｃＤＮＡの適当なセクションの挿入により調製される。コンビナトリアルライブラリーは重鎖遺伝子ライブラリと軽鎖遺伝子ライブラリーと組み合わせることにより構築される。この結果、重鎖と軽鎖を共発現するクローン（Ｆａｂ断片又は抗体分子の抗原結合断片に類似する）のライブラリーが生じる。これらの遺伝子を保持するベクターを宿主（例えば、細菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞、又はその他の適当なタンパク質産生宿主細胞）へ同時形質転換する。抗体遺伝子合成が形質転換された宿主へ誘導されると、重鎖及び軽鎖タンパク質は、抗原又は免疫原でスクリーニングすることで検出される活性な抗体を生産するために自己会合する。
抗体が得られれば、単離し、所望の場合、ここで開示されるアッセイ及び療法における使用のために精製する。抗体の単離及び精製は当該技術分野で既知の技術を使用して達成することができ、抗体が天然において結合し、又は製造過程で結合した有機分子を含まない、少なくとも、重量で５０％〜６０％の抗体を含有する調製物を提供することができる。抗体調製物は、少なくとも重量で７５％、より一般的には、少なくとも９０％、一般には、９９％を含むものが含まれる。
ある実施形態において、抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体は、夾雑物、特にカチオン性夾雑物から、高塩濃度の条件下に抗体懸濁物（例えば、バッファー中に）を接触させることにより単離される。適当な塩には、アルカリ金属塩（例えば、アルカリ金属硫酸塩（例えば、硫酸ナトリウム）、アルカリ金属ハロゲン化合物（例えば、塩化ナトリウム）、アルカリ金属酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム））などが含まれる。「高塩濃度」とは、少なくとも約０．５Ｍ又はそれ以上で、１Ｍ塩を含む塩濃度のことである。抗体を含む高塩濃度溶液は抗体から夾雑物を分離するのに適する条件下、抗体とカチオン又は他の荷電夾雑物感に存在するであろうイオン性及び／又は静電的結合の破壊に十分な時間インキュベートされる。適当な時間には、限定はしないが、約１２時間、１６時間、１８時間又はそれ以上が含まれる。溶液は任意の適切な温度、例えば、４℃、３７℃などでインキュベートできる。その後、抗体を単離し、及び／又は溶液から精製することができる。例えば、抗体を含む溶液は沈殿を除去するために（例えば、遠心により）処理することができ、更に単離し、及び／又は精製する技術、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを適用して、溶液から抗体を単離する。抗体を含む画分は、さらに透析（例えば、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ））し、ろ過することによって精製される。このような高塩処理は、細胞表面ＳＥＡＭ３反応性抗原を提示する癌細胞に対するＳＥＡＭ３ｍＡｂ活性に影響する夾雑物の除去を引き起こすため、ＳＥＡＭ３ｍＡｂの単離及び／又は精製に特に適する。
抗体ベースの診断法および治療法
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原（非コンジュゲート及びコンジュゲートフォームを含む）は抗体を産生するのに使用することができ、その抗体を試薬として診断の測定法および抗体ベースの治療法に使用できる。本開示は、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ（例えば、脱Ｎ−アセチル化ガングリオシド上での存在；髄膜炎菌のＰＳ特にＮｍＢ ＰＳ；又は大腸菌Ｋ１ ＰＳなど）に選択的に結合する抗体を含むことに関する。このような抗体はヒトポリシアル酸と殆ど又は全く検出可能な結合を示さない（つまり、該抗体は正常（非癌性）ヒト組織上のＰＳＡと有意な交差反応を起こさない）。ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体は、モノクローン性、又は、ポリクローン性であってよく、適切な賦形剤と共にを供給される。いつくかの実施形態では、抗体は支持体上に固定され、又はバイアル、特に滅菌バイアルなどの容器中に提供され、場合によっては、下記により詳細が記載されているように、診断又は治療法に使用するためにラベリングされる。
診断
ｄｅＮＡｃＳＡエピトープと反応性の抗体は、免疫診断技術において抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体を用いて、細胞表面接近可能ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ（例えば、脱Ｎ−アセチル化細胞表面ガングリオシド）を有する癌性細胞を保持する又は保持することが疑われる被検対象から取得した生物学的試料中に抗原を検出するために使用される。抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体の抗原結合特異性は、この場合、宿主由来ＰＳＡに対して殆ど又は全く検出可能な結合を示さないので、試料中の癌性細胞上のｄｅＮＡｃＳＡエピトープの検出を促進するために使用することができ、その結果、フォルスポジティブの範囲を低下させる。そのような検出方法は、診断、該抗体がｄｅＮＡｃＳＡエピトープ及び／又はＳＥＡＭ３反応性抗原と特異的に結合するような抗ｄｅＮＡｃＳＡ抗原ベース及び／又は抗体ベース療法に適する被検対象の同定、療法のモニターリング（例えば、治療法に対する応答を追跡するために）などにおいて使用可能である。
適切な免疫診断技術には、必ずしも限定はしないが、インビトロ及びインビボ（イメージング）法の両方が含まれる。該方法がインビトロの場合、生物学的試料はｄｅＮＡｃＳＡ抗原が存在する任意の試料であってよく、限定はしないが、血液試料（全血、血清などが含まれる）、組織、全細胞（例えば、無傷の細胞）、及び組織又は細胞の抽出物が含まれる。アッセイは、競合、直接反応、又はサンドイッチ形式のアッセイなど、広範な形式をとることができる。例えば、アッセイには、ウェスタンブロッティング；凝集試験；ＥＬＩＳＡのような酵素標識および媒介免疫試験；ビオチン／アビジン型測定法；放射免疫測定法；免疫電気泳動法；免疫沈降などが含まれる。反応は、一般的に、蛍光性、化学発光性、放射性、酵素的標識又は色素分子のような検出可能標識、又はその他の、試料中の抗原と抗体間の複合体の形成又はそれと反応した抗体の検出法などを含む。
アッセイには、抗原抗体複合体が結合した固体支持体からの液相中への非結合抗体の分離が含まれる。本発明の実施において使用することができる固体支持体には、ニトロセルロース（例えば、膜中又ははマイクロタイターウェルの形式）；ポリ塩化ビニル（例えば、シートやマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズ又はマイクロタイタープレート）；ポリフッ化ビニリデン；ジアゾ化紙；ナイロン膜；活性化ビーズ；磁気反応性ビーズなどのような基質が含まれる。
固体支持体を使用する場合、通常、固体の担体はまず、成分が十分に担体に対して不動化される適切な結合条件の下で、最初固体相の成分（例えば、抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体）と反応させる。しばしば、担体に対する不動化は、より強い結合特性を持つか、又は、又は、抗体結合活性若しくは特異性を有意に失わず、支持体上での抗体の不動化を提供するタンパク質に対する抗体との最小のカップリングによって促進される。適切なカップリングタンパク質には、牛血清アルブミン(BSA)を含む血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、卵白アルブミン、その他の当業者にとって周知のタンパク質などの高分子が含れるが、それに限定されない。抗体を支持体に結合させるのに使用できる他の分子は、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマーなどを含むが、但し、抗体を不動化するのに使用される分子が抗原と特異的に結合する抗体の能力に悪い影響を与えないことが条件である。このような分子およびこれらの分子を抗原にカップリングする手法は、当業者には周知である。例えば、Brinkley, M. A. Bioconjugate Chem.（1992）3:2−13; Hashida et al., J. Appl. Biochem.（1984）6: 56−63; Anjaneyulu and Staros，Intemational J. of Peptide and Protein Res.（1987）30: 117−124。を参照のこと。
固体支持体を固相成分と反応させた後、すべの非不動化固体相成分は、洗浄により支持体から取り除去され、支持体に結合した成分は、次に、適切な結合条件下でｄｅＮＡｃＳＡエピトープを含むと思われる生物的試料に接触させる。洗浄して非結合のリガンドを全て取り除いた後、適切な結合条件下で第２の結合剤部分が加えられ、この第２の結合剤は選択的に結合リガンドに結合する能力がある。二次的結合剤の存在は、当業者には周知の技術を用いて検出できる。
ＥＬＳＡ法を使用することができるが、マイクロタイタープレートのウェルは、本発明のｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体でコーティングされる。ｄｅＮＡｃＳＡ抗原（例えば、脱Ｎ−アセチル化ガングリオシドなどのｄｅＮＡｃＳＡエピトープを持つ腫瘍抗原）を含むか、または含むと思われる生物学的試料が、コートされたウェルに加えられる。抗体を結合させるのに十分なインキュベーションの後、プレートは非結合部分を取り除くため洗浄され、検出可能な程度に標識のついた二次結合分子が加えられる。二次結合分子は、捕獲されたいかなる抗原にも反応することができ、プレートを洗浄し、二次結合分子の存在が当業者には周知の手法で検出される。
所望の場合、生物学的試料由来の結合ｄｅＮＡｃＳＡ抗原の有無は、抗体リガンドに対する抗体を含む二次結合剤を用いて容易に検出できる。例えば、多くの抗ウシ免疫グロブ
リン(Ig)分子が当技術分野では周知であり、当業者には周知の手法を用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスフォターゼ、またはウレアーゼなどの検出可能な酵素標識と容易にコンジュゲートすることができる。次に、適切な酵素基質が検出できるシグナルを発生させるのに用いられる。その他の関連した実施形態では、競合型ELISA技術は当業者には周知の方法を用いて実施することができる。
また、アッセイは、沈降条件下で抗体とｄｅＮＡｃＳＡ抗原が複合体を形成する溶液中でも行うことができる。例えば、当技術分野では周知の、直接化学的または間接カップリングなどによるカップリング技術を用いて、抗体を固相粒子（アガロース・ビーズなど）に結合させることができる。抗体でコートされた粒子は、次に、適切な結合条件下で、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原を含むと思われる生物学的試料と接触させ、洗浄および／または遠心分離を用いて沈降させサンプルから分離できる粒子―抗体―ｄｅＮＡｃＳＡ抗原複合凝集体の形成を提供する。反応混合物は、上記の免疫診断法など、標準的な多くの手法のいずれかを用いて、抗体−抗原複合体の有無を決定するため解析することができる。
診断アッセイに用いられる試験試料は、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原が存在するいかなる試料であってもよく、限定はしないが、血液試料（全血、血清など）、組織（即ち、無傷の細胞を含む試料）、全細胞（例えば、無傷の細胞）、及び組織又は細胞の抽出物（例えば、細胞試料には、細胞抽出物も含まれ、その逆も同様である）が含まれる。ある実施形態においては、無傷の生細胞を含む診断対象の被検対象由来の試料を用いてアッセイを行うことが望ましい。次に、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原の検出は、細胞の細胞外表面上において評価され、さらに、細胞分裂中に評価される。
また、診断アッセイは、インサイツでも実施される。例えば、抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体は検出可能に標識され、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープの細胞表面発現によって特徴付けられる癌に罹患していると疑われる被検対象へ投与され、当該技術分野において利用可能なイメージング法を用いて検出される標識抗体と検出可能に結合する。
ここに記述される診断アッセイは、被検対象がｄｅＮＡｃＳＡ抗原ベース免疫療法（例えば、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原ワクチン及び／又は抗ｄｅＮＡｃＳＡ抗原抗体療法）を用いる治療法の効果を受けやすい癌を保持しているかどうかを決定するのに使用することができる。診断アッセイは、治療法の選択及び医師による治療計画に情報を与えることができる。
ある実施形態において、検出アッセイは、試料中のＳＥＡＭ３反応抗原の検出を含み、試料が包含し、方法がインビトロの場合、該生物学的試料は、ＳＥＡＭ３反応抗原が存在する如何なるサンプルでもよく、限定はしないが、血液試料（全血、血清など）、組織、全細胞（例えば、無傷の細胞、即ち、膜透過されていない細胞）が含まれる。例えば、該アッセイは、組織学的組織試料中の細胞上のＳＥＡＭ３反応抗原の検出が含まれる。例えば、組織試料は、固定され（例えば、ホルマリン処理により）、支持体（例えば、パラフィン中）に包埋され、又は非固定組織に凍結される。
ＳＥＡＭ３反応抗原は、ＳＥＡＭ３の抗原結合特異性を持つ抗体、通常はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって検出される。該実施形態においては、ＳＥＡＭ３反応抗原は、細胞分裂中を含む細胞周期の全ての段階において細胞表面上に存在してもよい。注目すべきは、ある場合に、細胞分裂中にＳＥＡＭ３反応抗原を提示する癌は、細胞が静止期（即ち、細胞分裂を行っていない）にあるとき、ＳＥＡＭ３反応抗原のより低いか又は検出できないレベルを提示することである。しかし、以下の実施例に例示するように、ＳＥＡＭ３反応抗原は膜透過細胞中のＳＥＡＭ３反応抗原を検出することによって非分裂細胞中にＳＥＡＭ３反応抗原を検出することができる。ＳＥＡＭ３抗体（又は、ＳＥＡＭ３の抗原結合特異性を持つ抗体）により、正常細胞における抗体染色パターンと異なる染色パターンを示す試験癌細胞は、ＳＥＡＭ３反応抗原をを示す癌性細胞として同定される。このような版は、ＳＥＡＭ３反応抗原（例えば、ｍＡｂ ＳＥＡＭ３）と特異的に結合する抗体による治療法の効果を受けやすい。
ここで記述される方法に従ってｄｅＮＡｃＳＡ抗原によって免疫されることにより作製される抗体を含む、前述のアッセイ試薬は、適切な指示書及びその他必要な試薬と共に、前述の免疫アッセイを実施するために、キットとして提供される。該キットには、使用される特定の免疫アッセイに従い、適当な標識及びその他のパッケージされた試薬と材料（即ち、洗浄バッファーなど）も含まれる。上述の標準的な免疫アッセイはこれらのキットを使用して実施することができる。
抗体ベース治療法
本発明の方法を用いて作製される抗体は、哺乳類対象、特にヒトにおけるｄｅＮＡｃＳＡエピトープを提示する関連癌を治療又は予防する。ｄｅＮＡｃＳＡ抗原（コンジュゲートを含む）を用いて作製される抗体は、抗癌治療を提供するために、被検対象への投与に適する医薬組成物中に提供される。
さらに特別には、ここに記述される方法に従って作製される抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体は、たとえば、癌性細胞の生存の低下を促進するため、腫瘍サイズを減少させ、腫瘍負荷を減少させる免疫応答又は抗癌治療を提供又は促進するため、及び／又は患者における臨床結果を改善するために、被検対象（例えば、ヒト患者）へ投与することができる。特に、ｍＡｂ ＳＥＡＭ３の結合特異性（その結果、ｍＡｂ ＳＥＡＭ３によって結合されるエピトープに結合する）を有する抗体は癌性細胞の細胞周期を崩壊させ、例えば、前Ｇ０細胞周期時期へ癌性細胞を導入することによって、細胞のアポトーシスへの導入を促進する。場合によっては、抗体は、腫瘍の殺傷又はクリアランスをさらに促進するために癌性細胞部位への輸送のために、抗癌薬、例えば、抗増殖部位（例えば、ＶＥＧＦアンタゴニスト、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）、毒素（例えば、リシン、シュードモナスエキソトキシンＡなどの抗癌毒素）、放射線核種（例えば、９０Ｙ，１３１Ｉ，１７７Ｌなど）、抗癌薬（例えば、ドキソルビシン、カルケアマイシン、メイタンシノイド ＤＭ１、アウリスタチンカウペシタビン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ ｃａｕｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、５−フルオロウリシル、ロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ）、イリノテルカン（ｉｒｉｎｏｔｅｒｃａｎ）など）を結合させることもでき、及び／又は、場合によっては、改善された薬物動態学的プロフィールを提供するために修飾することができる（例えば、ＰＥＧ化、過剰グリコシル化などにより）。
被検対象（例えば、ヒト対象）への投与に適切な抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体を生産し、製剤化する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、抗体は、有効量の抗体及び製薬賦形剤（例えば、生理食塩水）を含む医薬組成物中に提供される。医薬組成物は、場合によっては、他の添加物（例えば、バッファー、安定化剤、保存剤など）を含んでもよい。抗体の有効量は、一般に、所望の期間被検対象中での抗癌免疫応答を増強するために提供するのに効果的な量である。治療上の目的（例えば、腫瘍負荷の低減）は、単一又は種々の投与計画の下における複数回の投与によって達成され得る。
それが作製された種以外の生物に投与された抗体は、しばしば、抗体に対する免疫応答を誘導する。抗体の免疫原的特徴は抗体の一部又全部を性質上ヒト配列へ改変し、その結果、キメラ又はヒト抗体を作製することによって減少する。
特に関心があるのは、ｍＡｂＳＥＡＭ３の抗原結合特異性を有する抗体である。そのような抗体の例には、ＳＥＡＭ３軽鎖ポリペプチドの可変領域のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（アミノ酸残基２４〜３９、アミノ酸残基５５〜６１、及びアミノ酸残基９４〜１００、各々、図５２に示される）を含む軽鎖ポリペプチド、ＳＥＡＭ３重鎖ポリペプチドの可変領域のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（アミノ酸残基２６〜３５、アミノ酸残基５０〜６６、及びアミノ酸残基１０１〜１０８、各々、図５２に示される）を含む重鎖ポリペプチドが含まれる。そのような抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体などが含まれる。
キメラ抗体
キメラ抗体はヒト及び非ヒト部分を含む免疫グロブリン分子である。より、具体的には、ヒト化キメラ抗体の抗原結合領域（又は可変領域）は非ヒトソース（例えば、マウス）に由来し、キメラ抗体の定常領域（免疫グロブリンに生物学的エフェクター機能を付与する）はヒトソースに由来する。キメラ抗体は、非ヒト抗体分子抗原結合特異性とヒト抗体分子によって付与されるエフェクター機能を有する。多くのキメラ抗体の作製方法は、当業者に周知である（例えば、U.S. Pat. Nos. 5,502,167, 5,500,362, 5,491,088, 5,482,856, 5,472,693, 5,354,847, 5,292,867, 5,231,026, 5,204,244, 5,202,238, 5,169,939, 5,081,235, 5,075,431 and 4,975,369を参照のこと）。他に選択可能なアプローチは、組換えＤＮＡ技術により、非ヒト抗体のＣＲＤ領域をヒト定常領域と結合させることによるヒト化抗体の作製である。Queen et al., Proa Natl. Acad. ScL USA 86: 10029-10033 (1989)及びWO 90/07861を参照のこと。
組換えＤＮＡ法は組換体発現システムにおいてキメラ抗体を作製するために使用される。例えば、組換ＤＮＡベクターは抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体を産生する細胞株へトランスフェクトするために使用される。組換ＤＮＡベクターには、細胞株中において、免疫グロブリンの定常領域をコードする遺伝子の全て又は一部を置き換えるために「置換遺伝子」（例えば、置換遺伝子はヒト免疫グロブリン、又は特定の免疫グロブリンクラスの定常領域の全て又は一部をコードする）、及び抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマ）内で免疫グロブリン配列との標的化相同組換を可能ならしめる「標的配列」が含まれる。
他の例において、組換ＤＮＡベクターは所望のエフェクター機能を持つ抗体（例えば、ヒト免疫グロブリンの定常領域）を産生する細胞株へトランスフェクトされ、この場合、組換ベクターに含まれる置換遺伝子は、抗体の全て又は一部が含まれ、組換ベクターに含まれる標的配列により、抗体産生細胞内において相同組換え及び標的遺伝子修飾が可能になる。他の実施形態において、可変又は定常領域の一部のみ置き換える場合、作製されるキメラ抗体は同一の抗原結合性を特徴づけ、及び／又は、同一のエフェクター機能を有し、さらには、キメラ抗体がより優れた抗原特異性、より優れた親和性結合定数、増強されたエフェクター機能、又は、トランスフェクトされた抗体産生細胞などによって増強された分泌及び生産を示すように改変又は改善される。
ヒト抗体
他の実施形態において、抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体は、全体がヒト抗体である。ヒト抗体は、主として、性質上ヒトポリペプチド配列から構成される。本発明のヒト抗体は、様々な方法（例えば、Larrick et al., U.S. Patent No. 5,001,065を参照のこと）によって作製することができる。ヒト抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープは、最初、トリオーマ細胞（３つの細胞、２つはヒトで１つがマウス、に由来する）中で作製される。次に、抗体をコードする遺伝子は、他の細胞、特に非ヒト哺乳類細胞中でクローン化され、発現される。トリオーマ技術によりヒト抗体を作製するための一般的なアプローチは、Ostberg et al. (1983), Hybridoma 2: 361-367, Ostberg, U.S. Patent No. 4,634,664, and Engelman et al., U.S. Patent No. 4,634,666において論じられている。トリオーマは、ヒト細胞から作製した通常のハイブリドーマよりもより安定的に抗体を産生することが見出されている。
癌治療
ｄｅＮＡｃＳＡエピトープに特異的に結合する抗体は、哺乳類対象、特にヒトに関する抗癌治療に用いることができるが、該癌細胞は細胞外接近可能な細胞表面上（例えば、少なくとも部分的に脱Ｎ−アセチル化されたガングリオシド上のｄｅＮＡｃＳＡエピトープ）にｄｅＮＡｃＳＡエピトープを提示する。特に、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原（ｄｅＮＡｃＳＡ抗原コンジュゲートを含む）を用いて作製される抗体は、治療が必要は被検対象への投与に適する医薬組成物中に提供される。
目的の抗体の治療的投与には、投与計画の一部として、限定はしないが、化学療法剤を含む更なる標準的な抗癌治療剤、及び外科的介入（例えば、以下に記載されるような）と組み合わせるか又は組み合わせずに投与することが含まれる。さらに、目的の抗体の治療的投与には、抗癌療法による被検対象の療法後の治療も含まれ、例えば、抗癌治療は、外科的介入、放射線治療、化学療法剤などの投与であってもよい。モノクローナル抗体、特に、対象とする細胞の補体媒介殺傷、及び／又は抗体依存的細胞障害媒介殺傷を提供し得るモノクローナル抗体の使用は特に興味深い。
ある実施形態において、抗体は、単独、又は、場合によっては、腫瘍の殺傷又はクリアランスをさらに促進するために癌性細胞への化合物の輸送を促進する化合物、例えば、毒素（例えば、リシン、シュードモナスエキソトキシンＡなどの抗癌毒素）、放射線核種（例えば、９０Ｙ，１３１Ｉ，１７７Ｌなど）を結合することができる。抗体（又は、化合物に結合される場合は、抗体−化合物コンジュゲート）は、溶液（例えば、通常の生理食塩水、ＰＢＳ中に希釈して、又は通常の生理食塩水又はＰＢＳ中にヒトアルブミン（５％）と組み合わせて）中に提供される。抗体は、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約９ｍｇ／ｍｌ，約１ｍｇ／ｍｌ〜約８ｍｇ／ｍｌ，約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約７．５ｍｇ／ｍｌ，約２ｍｇ／ｍｌ〜約７ｍｇ／ｍｌ，約２．５ｍｇ／ｍｌ〜約６．５ｍｇ／ｍｌ，約３ｍｇ／ｍｌ〜約６ｍｇ／ｍｌ，約３．５ｍｇ／ｍｌ〜約５．５ｍｇ／ｍｌ，約４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌを含む約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌなどの範囲の濃度で提供される。
ある実施形態において、抗体は１又は複数の化学治療剤（例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニソン（ＣＨＯＰ））と組み合わせて、及び／又は放射線治療と組み合わせて、及び／又は外科的介入と組み合わせて（例えば、腫瘍除去のための外科的手術の前又は後）投与され得る。抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体は、外科的介入と関連して使用される場合、癌細胞を除去するための外科的手術の前、同時に、又は後に投与され、全身に又は外科的処置部位に局所的に投与されてもよい。
抗体単独又は上記と組み合わせて、全身（例えば、非経口的投与により、例えば、静脈経由により）又は局所的（例えば、局所的な腫瘍部位に、例えば、腫瘍中への投与（例えば、固体腫瘍中へ、リンパ腫又は白血病と関係するリンパ節中へ）により、固体腫瘍へ供給する血管中への投与など）に投与することができる。抗体の投与は注入、例えば、約７５ｍｇ／ｈ〜約３７５ｍｇ／ｈ，約１００ｍｇ／ｈ〜約３５０ｍｇ／ｈ，約１５０ｍｇ／ｈ〜約３５０ｍｇ／ｈ，約２００ｍｇ／ｈ〜約３００ｍｇ／ｈ，約２２５ｍｇ／ｈ〜約２７５ｍｇ／ｈを含む、約５０ｍｇ／ｈ〜約４００ｍｇ／ｈの速度の注入によって達成することができる。注入の例示的な速度は、例えば、約１ｍｇ／ｍ２／ｄａｙ〜 約９ｍｇ／ｍ２／ｄａｙ，約２ｍｇ／ｍ２／ｄａｙ〜約８ｍｇ／ｍ２／ｄａｙ，約３ｍｇ／ｍ２／ｄａｙ〜約７ｍｇ／ｍ２／ｄａｙ，約４ｍｇ／ｍ２／ｄａｙ〜約６ｍｇ／ｍ２／ｄａｙ，約４．５ｍｇ／ｍ２／ｄａｙ〜約５．５ｍｇ／ｍ２／ｄａｙを含む約０．５ｍｇ／ｍ２／ｄａｙ〜約１０ｍｇ／ｍ２／ｄａｙの所望の治療投与量を達成することができる。投与（例えば、注入によって）は、例えば、約１日から約５日の所望の期間、又は例えば、約５日間、約１月、約２月など、数日毎に１回、繰り返すことができる。
抗体ベースの転移治療法
癌治療に対する第１の問題は、転移あるいは癌の原発部位から放出され、血流中を末端まで循環し、末端部位の組織に接着して第２の腫瘍形成を行う傾向である。外科手術後、集団の機械的破壊の結果、第２部位への転移及び接着が生じるため、この問題は、第１腫瘍の外科的除去の間にしばしば悪化する。ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ（例えば、脱Ｎ−アセチルガングリオシド）を発現する細胞によって構成される第１腫瘍の同定後、及び／又は腫瘍除去後の抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体（例えば、ＳＥＡＭ３）による治療は、転移後の任意の癌細胞の接着を阻害し、本発明において考慮される。さらに、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ（例えば、脱Ｎ−アセチルガングリオシド又はシアル酸修飾タンパク質）を発現する癌細胞と結合する抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体（例えば、ＳＥＡＭ３）は、補体非依存的（実施例のセクションを参照のこと）な細胞に細胞毒性効果を及ぼすことができる。従って、ある実施形態において、抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体（例えば、ＳＥＡＭ３）は、例えば、環境被爆（例えば、薬物治療など）、遺伝的欠陥などの結果、補体が欠損している癌患者を治療する上で有用である。補体欠損の例として、Ｃ１，Ｃ２，Ｃ６，Ｃ９及びプロパージンの阻害に関与するものが含まれる。
組合せによる癌治療法
任意の種々の癌治療法は、ここに記述されるｄｅＮＡｃＳＡベース又は抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体ベースの治療法と組み合わせて使用することができる。このような癌治療には、外科的（例えば、癌組織の外科的除去）、放射線治療、骨髄移植、化学療法的治療、生物学的応答調節治療、及び前述の幾つかの組合せが含まれる。
放射線治療には、限定はしないが、ビームなど外部から提供されるソース、又は小さい放射活性ソースの移植によって提供されるＸ線又はγ線が含まれる。
化学療法剤には、癌細胞の増殖を低減する非ペプチド（即ち、非タンパク質性）化合物であり、また、細胞毒性薬及び細胞増殖抑制薬が含まれる。化学療法剤の非限定的な例として、アルキル化剤、ニトロソウレア、アンチメタボライト、抗腫瘍抗生物質、植物（ビンカ）アルカロイド、及びステロイドホルモンなどが含まれる。
細胞増殖を低減するように機能する薬剤は、当該技術分野において知られており、広く 使用される。そのような薬剤には、ニトロジェンマスタード、ニトロソウレアなどのアルキル化剤、エチレンイミン誘導体、アルキルサルフォネート、及びトリアゼンなどが含まれ、限定はしないが、メクロロエタミン、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮＴＭ）、メルファラン（Ｌ−サルコシル）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン、クロロゾトシン、ウラシルマスタード、クロルメチン、イフォスファミド、クロロアンブシル、ピポブロマン、トリエチレンメルアミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブサルファン、ダカルバジン及びテモゾロミドなどが含まれる。
アンチメタボライト剤には、葉酸アナログ、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、及びアデノシンデアミナーゼ阻害剤が含まれ、限定はしないが、シタラビン（ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ）、シトシンアラビノシド、フルオロフラシル（５−ＦＵ）、フロキシウリジン（ＦｕｄＲ）、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、ペントスタチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキセート、１０−プロパルギル−５，８−ジデアザ葉酸（ＰＤＤＦ，ＣＢ３７１７）、５，８−ジデアザテトラヒドロ葉酸（ＤＤＡＴＨＦ）、ロイコボリン、フルダラビンホスフェート、ペントスタチン、及びゲンシタビンが含まれる。
適切な天然産物及びその誘導体（例えば、ビンカアルカロイド、抗腫瘍抗生物質、酵素、リンフォカイン、及びエピポドフィロトキシンなど）には、限定はしないが、Ａｒａ−Ｃ、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、デオキシコフォルマイシン、マイトマイシン−Ｃ、Ｌ−アスパラギナーゼ、アザチオプリン；ブレキナール；アルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシンなど；ポドフィロトキシン、例えば、エトポシド、テニポシドなど；抗生物質、例えば、アントラサイクリン、ダウノルビシンハイドロクロライド（ダウノマイシン、ルビドマイシン、セルビジン）、イダルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン及びモルポリン誘導体など；フェノキシゾンビスシクロペプチド、例えば、ダクチロマイシン；塩基性糖ペプチド、例えば、ブレオマイシン；アントラキノングリコシド、例えば、プリカマイシン（ミスラマイシン）；アントラセネジオン、例えば、ミトキサントロン；アジリノピロールインドールジオン、例えば、マイトマイシン；マクロサイクリックイムノサプレッサント、例えば、サイクロスポリン、ＦＫ−５０６（タクロリムス、プログラフ）、ラパマイシンなど；等が含まれる。
他の抗増殖細胞毒性薬はナベルビン、ＣＰＴ−１１、アナストラゾール、レトラゾール、カペシタビン、レロキサフィン、シクロホスファミド、イフォサミド及びドロロキサフィンである。
抗増殖活性を持つ微小管影響剤も使用に適しており、限定はしないが、アロコルヒチン（ＮＳＣ ４０６０４２）、ハリコンドリンＢ（ＮＳＣ ６０９３９５）、コルヒチン（ＮＳＣ ７５７）、コルヒチン誘導体（例えば、ＮＳＣ ３３４１０）、ドルスタチン１０（ＮＳＣ ３７６１２８）、メイタンシン（ＮＳＣ １５３８５８）、リゾキシン（ＮＳＣ ３３２５９８）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、ＴＡＸＯＬ（登録商標）誘導体、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、チオコルヒチン（ＮＳＣ ３６１７９２）、トリチルシステリン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、限定はしないが、エポチロンＡ、エポチロンＢ、ジスコデルモリドを含む天然及び合成エポチロン；エストラムスチン、ノコダゾールなどが含まれる。
使用に適するホルモン調節因子及びステロイド（合成アナログを含む）には、限定はしないが、アドレノコルチコステロイド、例えば、プレドニソン、デキサメタソンなど；エストロゲン及びプレゲスチン、例えば、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、メドロキシプロゲステロンアセテート、メゲストロールアセテート、エストラジオール、クロミフェン、タモキシフェン；など；及びアドレノコルチカルサプレッサント、例えば、アミノグルテチミド；１７α−エチニルエストラジオール；ジエチルスチルベストロール、テストステロン、フルオキシメステロン、ドロモスタノロンプロピロネート、テストラクトン、メチルプレドニソロン、メチル−テストステロン、プレドニソロン、トリアメイノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、メドロキシプロゲステロンアセテート、ロイプロリド、フルタミド（Ｄｒｏｇｅｎｉｌ）、トレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）、及びＺＯＬＡＤＥＸ（登録商標）が含まれる。エストロゲンは、増殖と分化を刺激する結果、エストロゲン受容体に結合する化合物はこの活性をブロックするのに使用できる。コルチコステロイドはＴ細胞増殖を阻害する。
他の化学療法剤には、金属錯体が含まれる。例えば、シスプラチン（シス−ＤＤＰ）、カルボプラチンなど；ウレア、例えば、ヒドロキシウレア；及びヒドラジン、例えば、Ｎ−メチルヒドラジン；エピドフィロトキシン；トポイソメラーゼ阻害剤；プロカルバジン；ミトキサントロン；ロイコボリン；テガファー；などが含まれる。他の関心ある抗増殖剤には、イムノサプレッサント、例えば、ミコフェノール酸、タリドミド、デソキシスペルグアリン、アザスポリン、レフルノミド、ミゾリビン、アザスピラン（ＳＫＦ １０５６８５）；ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）（ＺＤ １８３９， ４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−メトキシ−６−（３−（４−モルフォリニル）プロポキシ）キナゾリン）；などが含まれる。
「タキサン」には、パクリタキセル、並びに全ての活性なタキサン誘導体又はプロドラッグが含まれる。「パクリタキセル」（ここではアナログ、製剤、及び、例えば、ドセタキセル、ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、（ドセタキセルの製剤）、パクリタキセルの１０−デスアセチルアナログ、及びパクリタキセルの３’Ｎ−デスベンゾイル−３’Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルアナログなどの誘導体が含まれると理解されるべきである）は当業者に既知の技術を利用して容易に調製することができ（WO94/07882,WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076; U.S. Pat. Nos. 5,294,637; 5,283,253; 5,279,949; 5,274,137; 5,202,448;5,200,534; 5,229,529; and EP 590,267も参照のこと）、例えば、Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. (Taxus brevifolia由来のT7402;又はTaxus yannanensis由来のT-1912)を含む種々の販売元から入手できる。
パクリタキセルは通常の化学的に利用可能なパクリタキセルの形態のみならず、アナログ及び誘導体（例えば、上述のＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドセタキセル）及びパクリタキセルコンジュゲート（例えば、パクリタキセル−ＰＥＧ、パクリタキセル−デキストラン又はパクリタキセル−キシロース）も意味すると理解されるべきである。
「タキサン」という用語には、親水性誘導体及び疎水性誘導体の両方が含まれる種々の既知の誘導体も含まれる。タキサン誘導体には、限定はしないが、国際特許明細書WO 99/18113に記載されるガラクトース及びマンノース誘導体；WO 99/14209中に記述されるピペラジノ及び他の誘導体；WO 99/09021, WO 98/22451,及びU.S. Patent No. 5,869,680中に記述されるタキサン誘導体；WO 98/28288中に記述される６−チオ誘導体；U.S. Patent No. 5,821,263中に記述されるスルフェナミド誘導体；及びU.S. Patent No. 5,415,869中に記述されるタキソール誘導体が含まれる。さらに、限定はしないが、WO 98/58927; WO 98/13059;及びU.S. Patent No. 5,824,701中に記述されるものを含むパクリタキセルの誘導体が含まれる。
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原免疫ベース又は抗体ベース治療法による療法に効果を示す癌
ｄｅＮＡｃＳＡ抗原は、種々の癌治療法（癌予防（例えば、癌ワクチン）及び診断後癌治療法を含む）、又は細胞表面ｄｅＮＡｃＳＡエピトープを持つ癌の癌診断における使用を見出す。腫瘍を保持する、保持することが疑われる、又は進行の危険性のある被検対象は、ここに記述される治療法及び診断に関し考慮される。これらの被検対象から得た試料は、本発明の方法における使用に適している。
細胞表面接近可能なｄｅＮＡｃＳＡエピトープを持つ癌には、少なくとも部分的に脱Ｎ−アセチル化ガングリオシド及び／又は、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープを含むシアル酸修飾を有するタンパク質を保持するものが含まれる。
正常なヒト組織中の脱Ｎ−アセチルシアル酸残基の存在は、一過的で非常に少ない量であり、僅かに血管、皮膚及び大腸中の侵入単核細胞中に、皮膚メラノサイト中に中程度見出されるに過ぎない。メラノーマ、白血病及びリンパ腫などの異常な細胞中にのみ一般的である。ｄｅＮＡｃＳＡ抗原（例えば、脱Ｎ−アセチルガングリオシド）の高レベルの発現は、癌細胞に優位に生じるため、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原による免疫は補体媒介細胞障害及び抗体依存性細胞障害に影響を与える抗体を誘導するために使用可能であり、腫瘍の成長をブロックすることができる。さらに、あるガングリオシド中に見出される短い脱Ｎ−アセチルシアル酸オリゴマーに特異的な抗体は、補体媒介細胞障害及び抗体依存性細胞障害に影響をあたえるように治療上使用することができ、腫瘍の成長をブロックし、他の組織中での癌細胞の接着及び浸潤を妨げることができる。
ｄｅＮＡｃＳＡエピトープを提示する癌の例として、脱Ｎ−アセチルシアル酸残基（ＧＭ２α，ＧＭｌα，ＧＤｌβ，ＧＭＩｂ，ＧＤＩｃ，ＧＤｌα，ＧＭ３，ＧＭ２，ＧＭｌ，ＧＤ１３，ＧＴ１３，ＧＴｌｈα，ＧＤ３，ＧＤ２，ＧＤＩｂ，ＧＴＩｂ，ＧＱＩｂ，Ｇωｌｈα，ＧＴ３，ＧＴ２，ＧＴＩｃ，ＧＱＩｃ及びＧＰＩｃ）を含む脱Ｎ−アセチルガングリオシドを提示する癌細胞が含まれる。特に関心があるのは、２又はそれ以上のα２−８グリコシド結合（ＧＤＩｃ，ＧＤ１３，ＧＤ３，ＧＤＩｂ，ＧＴＩｂ，ＧＱＩｂ，Ｇωｌｈα，ＧＴ３，ＧＴＩｃ，ＧＱＩｃ及びＧＰＩｃ）で結合されるシアル酸残基で少なくとも１残基は脱Ｎ−アセチル化されているものを含むガングリオシドである。ある実施形態において、２又はそれ以上のα２−８グリコシド結合によって結合されるシアル酸残基を含むガングリオシドは、ＧＤ３以外のガングリオシドであり、及び／又はＧＭ３以外である。ある実施形態においては、癌の標的は、脱Ｎ−アセチルガングリオシド（例えば、シアル酸修飾タンパク質の脱Ｎ−アセチル化残基）以外のｄｅＮＡｃＳＡエピトープである。
ある実施形態において、ＳＥＡＭ３反応性抗原と特異的に結合する抗体は、細胞分裂期に細胞外接近可能なＳＥＡＭ３反応性抗原を示す癌を含む、細胞表面上にＳＥＡＭ３反応性抗原を提示する癌の治療に使用される。ＳＥＡＭ３反応性抗原、特に、細胞表面ＳＥＡＭ３反応性抗原を提示する癌は、特に、細胞分裂期に細胞外接近可能なＳＥＡＭ３反応性抗原を示す癌を含む、モノクローナル抗体ＳＥＡＭ３の抗原結合特異性を有する抗体を用いた治療法に影響を受けやすい。
正常細胞のダメージを緩和するために、癌治療法が指向するｄｅＮＡｃＳＡエピトープ及び／又はＳＥＡＭ３反応性抗原は、非癌細胞と比較すると癌細胞上において高いレベルで発現されるが、このことは、ここで開示される治療法に対する限定ではない。例えば、癌が補充される細胞タイプ（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞又は白血病及びリンパ腫など、血球起源の他の細胞）に関する場合、抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体（例えば、ＳＥＡＭ３）の正常細胞に対する結合は、そのような細胞を除去することによる患者に被検対象に対するダメージが治療されるので（例えば、正常細胞の再集団化を刺激する薬物、例えば、ＧＭ−ＣＳＦなどにより）、許容し得る。
ここで考慮される癌に関連する方法は、例えば、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原の抗癌ワクチン又は療法としての使用、並びに、抗癌ワクチン（例えば、パッシブな免疫により）又は療法におけるｄｅＮＡｃＳＡ抗原の使用である。該方法は、癌腫、肉腫、白血病及びリンパ腫を含む多くの癌を治療又は予防する場合に有用である。
ここで開示される方法による治療法に影響を受け得る癌腫は、限定はしないが、食道癌
、肝細胞癌、基底細胞癌膚癌の一形態）、扁平上皮癌（種々の組織）、移行細胞（膀胱の悪性新生物）を含む膀胱癌、気管支原性（肺）癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌、胚の小細胞癌と非小細胞癌を含む肺癌、副腎皮質癌、甲状腺癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、腎細胞癌、上皮内の腺管癌又は、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頚癌、子宮癌、精巣癌、骨原性癌、上皮癌及び鼻咽頭癌が含まれる。
ここで開示される方法による治療法に影響を受け得る肉腫は、限定はしないが、線維肉腫、粘液肉腫、リポ肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨原性肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨膜肉腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、その他の軟組織肉腫が含まれる。
ここで開示される方法による治療法に影響を受けやすい他の固形腫瘍には、限定はしないが、グリオーマ、星状細胞腫、骨芽細胞細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、メナンギオマ（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、メラノーマ、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫が含まれる。
ここで開示される方法による治療法に影響を受けやすい白血病には、限定はしないが、ａ）慢性骨髄増殖症候群（多能性血球幹細胞の腫瘍疾患）；ｂ）急性骨髄性白血病（多能性血球幹細胞の腫瘍性トランスフォーメーション又は制限的分化系列の血球細胞）；ｃ）Ｂ細胞 ＣＬＬ、Ｔ細胞ＣＬＬ 前リンパ球性白血病、及び毛様細胞白血病を含む慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ；免疫的未成熟及び 機能的不完全小リンパ球のクローン性増殖）；及びｄ）急性リンパ性白血病（リンパ芽球腫の蓄積によって特徴付けられる）が含まれる。目的の方法を用いて治療され得るリンパ腫には、限定はしないが、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫）；ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫などが含まれる。
ここで開示される方法による治療に影響を受け得る他の癌には、非定型髄膜腫（脳）、島細胞腺癌、髄様癌（甲状腺）、間葉細胞腫（腸）、肝細胞癌（肝臓）、肝芽腫（肝臓）、明細胞癌（腎臓）及び縦隔神経線維腫が含まれる。
ここで開示される方法による治療に影響を受け得る更なる癌の例には、限定はしないが、神経外胚葉及び上皮起源の癌が含まれる。神経外胚葉起源の癌の例には、限定はしないが、ユーイング肉腫、脊髄腫瘍、脳腫瘍、幼少期のテント上プリマティブ神経外胚葉腫瘍、管状嚢胞癌、粘液管状及び紡錘細胞癌、腎腫瘍、縦隔腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞腫、及び思春期及び青年期の肉腫が含まれる。上皮起源の例には、限定はしないが、小細胞肺癌、胸部、眼レンズ、結腸、膵臓、腎臓、肝臓、卵巣及び気管支上皮の癌が含まれる。いくつかの実施形態において、対象の方法は、メラノーマの治療を含まない（即ち、癌はメラノーマ以外である）。他の実施形態において、対象の方法は、リンパ腫の治療を含まない（即ち、癌はリンパ腫以外である）。
ある実施形態において、本発明の方法はメラノーマ及び他のリンパ腫を含む、脱Ｎ−アセチルガングリオシドを発現することが知られている癌細胞を治療するために使用される。前駆体ガングリオシドのＧＭ３及びＧＤ３は過剰発現する癌は、その細胞表面上に脱Ｎ−アセチルガングリオシドも非常に大量に発現する。
ある実施形態において、癌はＳＥＡＭ３反応性抗原を提示する。ＳＥＡＭ３反応性抗原を提示する癌は、当該技術分野における既知の方法によって同定できる。検出及び診断の例示的方法は後述する。
抗癌療法がモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＳＥＡＭ３（下記に詳述する）の抗原結合特異性を有する抗体の投与を含む場合、該抗癌療法は、特に、分裂（複製、増殖）中の癌細胞に向けられる。下記の実施例に示されるように、ＳＥＡＭ３が特異的に結合するエピトープは、細胞分裂期に優先的に接近できる。つまり、ＳＥＡＭ３が結合する細胞外接近可能なレベルは、非細胞分裂中に比較すると細胞分裂中に増大し、ＳＥＡＭ３の結合は細胞を後期（前Ｇ０期）へと進行させる。ほとんどの癌は同型の正常細胞よりも速く分裂するため、ＳＥＡＭ３反応性抗原に結合する抗体は、抗体ベース癌治療法にとって魅力的である。
従って、本開示は、特に、ＳＥＡＭ３ ｍＡｂの抗原結合特異性を有する抗体の投与に関連する、癌細胞に対する抗癌治療法を提供する。特に、ＳＥＡＭ３の抗原結合特異性を有する抗体を用いた抗体療法の影響を受けやすい癌は、細胞増殖のマーカー（例えば、ｋｉ−６７）を調べることにより、及び／又は分裂細胞におけるＳＥＡＭ３が結合するｄｅＮＡｃＳＡエピトープの接近能力を調べることにより（例えば、インビトロアッセイのように）同定することができる。
ＳＥＡＭ３モノクローナル抗体の抗原結合特異性を有する抗体
本開示は、組換モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）及び該抗体をコードする核酸を提供し、該組換えｍＡｂｓはＳＥＡＭ３の抗原特異性を有し癌細胞表面上の脱Ｎ−アセチルガングリオシドと結合し、癌細胞の細胞生存性の低下を促進する。ＳＥＡＭ３の抗原特異性を有する組換抗体には、少なくともＳＥＡＭ３の抗原結合部分を有する抗体が含まれる。そのような組換えｍＡｂｓは、以下の一般的特徴を持つものとして説明することができる：
ａ）ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ、特に、癌細胞の細胞外接近可能表面上のｄｅＮＡｃＳＡエピトープに対する高い親和性（例えば、Ｋｄ約１０−６、約１０−８又はそれ未満；
ｂ）ｄｅＮＡｃＳＡ抗原との解離に関し遅い解離速度（例えば、Ｋｏｆｆ約１×１０−３ｓｅｃ−１又はそれ未満）；
ｃ）脱Ｎ−アセチル残基を含まないポリシアル酸と有意に結合しない；
ｄ）インビトロにおいて、細胞表面ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ（例えば、脱Ｎ−アセチル化ガングリオシド）を有する癌細胞の接着性の喪失を促進する活性；
ｅ）細胞表面ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ又は特にＳＥＡＭ３反応性抗原を有する癌細胞の生存性の低下を促進する活性、抗体は細胞周期を破壊してもよく、及び／又は補体と結合可能で、及び／又はそれが結合する癌細胞に対するＡＤＣＣが指向されてもよい。
ＳＥＡＭ３の結合特異性を持つ抗体は免疫ベースの技術によって作製することができ、ＳＥＡＭ３反応性抗原と競合的に結合する抗体に関しスクリーニングできる。そのような抗体は、ここで開示されるＳＥＡＭ３ｍＡｂの重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドのアミノ酸及びコード化ヌクレオチドによって提供される情報を用いて、組換法によっても作製することができる。例えば、ＳＥＡＭ３の抗原結合特異性を有する抗体は、ＳＥＡＭ３軽鎖ポリペプチドの可変領域のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（連続するアミノ酸残基２４〜３９、連続するアミノ酸残基５５〜６１、及び連続するアミノ酸残基９４〜１００、各々、図５２に示される）を含む軽鎖ポリペプチド組換体を作製し、及びＳＥＡＭ３重鎖ポリペプチドの可変領域のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（連続するアミノ酸残基２６〜３５、連続するアミノ酸残基５０〜６６、及び連続するアミノ酸残基１０１〜１０８、各々、図５２に示される）を含む重鎖ポリペプチドの組換体を作製することによって調製することができる。これらのＣＤＲｓは、ＳＥＡＭ３の抗原結合特異性を有する抗原結合部位の形体を提供する適切なフレームワーク領域残基が隣接する、軽鎖ポリペプチド及び重鎖ポリペプチドの各々に提供することができる。そのような抗体は、任意の様々な形態、Ｆ（ａｂ）断片、単一鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などが含まれる。
結合親和性、解離速度及び他の抗体結合動力学を測定する方法は、当技術分野において周知であり、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原に対し、抗体が高親和性を有するか、遅い解離速度を有するかどうか決定するために用いることができる。多くの方法において及び当該技術分野において周知であるように、抗体結合動力学は、ＥＬＩＳＡ法、又は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭバイオセンサー（Pharmacea/Pfizer）又は示差走査熱量測定（Bliznukov et al. 2001 Biochemistry (Mosc) 66:27-33）などを使用して表面プラズマ共鳴を測定することにより評価することができる。表面プラズマ共鳴を用いた抗体に対する抗原の結合を測定する方法は、当該技術分野において周知であり（Methods of Dev. Biol. 2003 112:141- 51 and J. MoI. Recognit. 1999 12:310-5）、ここでの使用に容易に適合させることができる。
ある実施形態において、ＳＥＡＭ３ ＭＡｂの抗原結合特性を持つ組換モノクローナル抗体は、ＳＥＡＭ３重鎖可変ドメインの連続配列と実質的に同一（例えば、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％同一）であるアミノ酸配列を有する重鎖、及びＳＥＡＭ３軽鎖可変ドメインの連続配列と実質的に同一（例えば、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％同一）である軽鎖を持つ。特定の実施形態において、組換抗体は、図４６及び４７に示される任意の重鎖又は軽鎖配列の連続するフレームワーク配列又は連続するＣＤＲ入れると実質的に同一（例えば、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％同一）であるフレームワーク又はＣＤＲアミノ酸配列を持つ。このようなポリペプチドはＳＥＡＭ３の抗原結合特異性を持つキメラ抗体を構築するのに有用である。このような連続する配列は、軽鎖ポリペプチド（Ｌ−ＣＤＲ１，Ｌ−ＣＤＲ２，Ｌ−ＣＤＲ３）及び重鎖ポリペプチド（Ｈ−ＣＤＲ１，Ｈ−ＣＤＲ２，Ｈ−ＣＤＲ３）のＣＤＲｓを含むことができる。
ある実施形態において、組換モノクローナル抗体は高いストリンジェントな条件下でＳＥＡＭ３重鎖又は軽鎖コード核酸とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる重鎖又は軽鎖を含む。高いストリンジェントな条件下には、０．１ＸＳＳＣ（１５ｍＭ生理食塩水／０．１５ｍＭクエン酸ナトリウム）中において、５０℃又はより高い温度でインキュベートすることが含まれる。このようなポリヌクレオチドは、細胞中におけるＳＥＡＭ３抗体の生産の検出、並びに、ＳＥＡＭ３の抗原結合特異性を有するキメラ抗体の構築において有用である。
ある実施形態において、本発明の組換モノクローナル抗体は、ＳＥＡＭ３重鎖又は軽鎖コード核酸の連続する配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％）同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコートされる重鎖又は軽鎖を含む。％同一性は比較される配列の短い方に基づいている。デフォルトのパラメーターを用い、フィルターを使用しない、ＢＬＡＳＴＮ （２．０．８）(Altschul et al. (1997) Nucl. Acids. Res. 25:3389-3402)などの 周知のプログラムは、配列比較を行うのに用いられる。
組換えモノクローナル抗体は、例えば、全長の抗体又はその任意のキメラ抗体であってもよい。キメラ抗体を作製する方法は、当該技術分野において既知である。Morrison et al (Science 1985 229:1202); Oi et al (BioTechniques 1986 4:214); Gillies et al. (J. Immunol. Methods 1989 125:191-202) and U.S. Pat. Nos. 5,807,715, 4,816,567 and 4,816397を参照のころ。これらは、全体を出典としてここに取り込む。
ＳＥＡＭ３の重鎖及び軽鎖のＣＤＲｓのアミノ酸配列は、図５２に示され、フレームワーク及びＣＤＲ領域は、ＳＥＡＭ３軽鎖及び重鎖に関し、各々、図５３及び５４に規定されている。
また、本開示は、所望の特徴（例えば、血清中での半減期の延長、抗癌活性など）を供与する部分とのコンジュゲションによって修飾される抗体も提供する。そような抗体コンジュゲートは以下に例示される。
ＳＥＡＭ３の抗原結合特異性を持つ修飾された抗体
ＳＥＡＭ３の抗原結合領域を有する上述の組換えモノクローナル抗体は、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープと結合し、所望の活性、例えば、癌細胞生存性の低下を促進する活性、増強された血清中における半減期、低減された免疫原性などを持つ修飾された抗体を提供するために修飾される。修飾された抗体は、上述のＳＥＡＭ３モノクローナル抗体の少なくとも１アミノ酸の置換、付加又は欠失によって行われてもよい。ある実施形態において、ＳＥＡＭ３抗体はヒトの治療的使用に対するヒト化抗体、又はその他のタイプの修飾された抗体を提供するために修飾される。一般に、これらの修飾された抗体は、ＳＥＡＭ３の通常の抗原結合特性を持ち、少なくともＳＥＡＭ３抗体重鎖ポリペプチド及びＳＥＡＭ３軽鎖ポリペプチドのＣＤＲｓを含む。
実施されるアミノ酸置換の指針は、ＳＥＡＭ３の重鎖及び軽鎖ポリペプチド中のＣＤＲｓ及びの配列と位置、及びコード化ＤＮＡ配列を示す添付の図５２、５３及び５４中に見出すことができる。例えば、ある実施形態において、変異体は、同定されるＣＤＲｓの外側の領域中にアミノ酸変更を行うこと（例えば、置換、特に保存的アミノ酸の置換）によって調製される。アミノ酸置換に関する更なる指針は、他の抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体のアミノ酸配列をＳＥＡＭ３の配列と比較して並べ、保存的又は可変な領域に留意し、ＣＤＲｓの外側に存在する可変領域中に変更を加えることによって見出される。
特定の実施形態において、１又は複数のアミノ酸置換（例えば、１、２まで、３まで、４まで又は５まで、通常、１０又はそれ以上）を行うことがこれらの方法には含まれる。アミノ酸置換は任意の位置でよく、その位置のアミノ酸は任意の同一性のアミノ酸によって置換される。好ましくは、修飾された抗体はＳＥＡＭ３ＭＡｂと同一の一般的特徴を持つ。ある実施形態において、他の抗体の配列とここに提供される配列のアライメントによって、置換位置を同定した後、その位置のアミノ酸を置換してもよい。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、ヒト化置換（即ち、ヒト抗体の配列とより類似するアミノ酸配列を作製する置換）、指向性置換（例えば、同じグループ中の関連抗体の配列とより類似する抗体のアミノ酸配列を作製する置換）、ランダム置換（例えば、任意の２０の天然アミノ酸での置換）又は保存的置換（例えば、置換されるものと類似の生化学的特徴を持つアミノ酸による置換）などである。
ある実施形態において、本発明の修飾された抗体は、ＳＥＡＭ３重鎖又は軽鎖コード化核酸、特に、ＳＥＡＭ３軽鎖ポリペプチドの可変領域のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（連続するアミノ酸残基２４〜３９、連続するアミノ酸残基５５〜６１、及び連続するアミノ酸残基９４〜１００、各々、図５２に示される）をコードする断片、及びＳＥＡＭ３重鎖ポリペプチドの可変領域のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（連続するアミノ酸残基２６〜３５、連続するアミノ酸残基５０〜６６、及び連続するアミノ酸残基１０１〜１０８、各々、図５２に示される）をコードする断片と高いストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる重鎖又は軽鎖を含んでもよい。高いストリンジェントな条件には、０．１ＸＳＳＣ（１５ｍＭ生理食塩水／０．１５ｍＭクエン酸ナトリウム）中において、５０℃又はより高い温度でインキュベートすることが含まれる。
ある実施形態において、本発明の修飾された抗体は、ＳＥＡＭ３重鎖又は軽鎖コード核酸の連続する配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％）同一なポリヌクレオチドによってコードされる重鎖又は軽鎖を含む。％同一性は比較される配列の短い方に基づいている。デフォルトのパラメーターを用い、フィルターを使用しない、ＢＬＡＳＴＮ （２．０．８）(Altschul et al. (1997) Nucl. Acids. Res. 25:3389-3402)などの 周知のプログラムは、配列比較を行うのに用いられる。
ヒト化抗体
ある実施形態において、本発明はＳＥＡＭ３モノクローナル抗体のヒト化バージョンを提供する。一般に、ヒト化抗体は、親非ヒト抗体より、ヒトにおいてより低い免疫原性を持つ修飾された抗体を調製するために、親非ヒト抗体のフレームワーク領域中でのアミノ酸置換により実施される。抗体は、当該技術分野で既知の様々は技術を用いてヒト化されるが、例えば、ＣＤＲ移植（EP 239,400; PCT公開 WO 91/09967; U.S. Pat. Nos. 5,225,539; 5,530,101 ; 及び 5,585,089）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）又はリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91 :969-973 (1994))及び抗体鎖シャッフリング(U.S. Pat. No. 5,565,332）などが含まれる。ある実施形態において、フレームワーク置換は、抗原結合に対して重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲ及びフレームワーク残基の相互作用のモデリング、及び特定の位置における独特なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される（U.S. Pat. No. 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)を参照のこと）。本発明において考慮されるヒト化抗体のさらなる方法は、U.S. Pat Nos. 5,750,078; 5,502,167; 5,705,154; 5,770,403; 5,698,417; 5,693,493; 5,558,864; 4,935,496; 及び4,816,567,及び PCT公開 WO 98/45331及びWO 98/45332中に論じられている。特定の実施形態において、ＳＥＡＭ３抗体は、米国特許明細書第20040086979及び20050033031中に論じられている方法に従ってヒト化することができる。従って、上述のＳＥＡＭ３抗体当該技術分野において周知の方法を用いてヒト化することができる。
従って、ヒト化ＳＥＡＭ３抗体は、ＳＥＡＭ３抗体の改変していないＣＤＲｓを含んでもよく、ある実施形態においては、ＳＥＡＭ３抗体の改変したＣＤＲｓを含んでもよい。ＳＥＡＭ３抗体の改変されたＣＤＲｓを含むヒト化抗体は、ＳＥＡＭ３抗体のＣＤＲｓを比較して、一般に、１、２まで、３まで、４まで、５まで、６まで、７まで、及びある場合には、約１０アミノ酸置換を有するＣＤＲｓを含む。ＣＤＲの特定の置換位置、並びに、これらの位置に置換されるドナーアミノ酸は、他の抗体とここに提供されるＳＥＡＭ３の核酸及び／又はアミノ酸配列のアライメントによって決定することができる。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−修飾抗体
ここで考慮される抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体は、特に関心のあるＳＥＡＭ３の抗原特異性を有する抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体のペグ化組換体と共に、ペグ化抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体を含む。抗体のペグ化のための方法及び試薬は当該技術分野において周知である。一般に、抗体へのコンジュゲーションに適するＰＥＧは、通常、室温で水溶性で、一般式Ｒ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ−Ｒを有し、ここで、ＲはＨ又はアルキル又はアルカノール基などの保護基であり、ｎは１〜１０００の整数である。Ｒが保護基の場合、一般に、１〜８炭素数である。
多くの実施形態において、ＰＥＧは少なくとも１つの例えば、末端水酸基、などの水酸基を有し、水酸基は例えば、リジン残基のεアミノ基、ポリペプチドのＮ末端の遊離アミノ基などのアミノ基、又はアスパラギン、グルタミン、アルギニン又はヒスチジンなどの任意の他のアミノ基と反応する機能基を生じるように修飾される。
他の実施形態において、ＰＥＧは、抗体ポリペプチド中の遊離カルボキシル基、例えば、抗体ポリペプチドのカルボキシ末端の遊離カルボキシル基と反応するように誘導される。重鎖又は軽鎖ポリペプチドのカルボキシル末端の遊離カルボキシル基と反応する適当なＰＥＧ誘導体には、限定はしないが、ＰＥＧ−アミン及びＰＥＧのヒドラジン誘導体（例えば、ＰＥＧ−ＮＨ−ＮＨ２）が含まれる。
他の実施形態において、ＰＥＧは、アミド誘導体を生成するアミノ基と選択的に反応する末端のチオカルボン酸基、−ＣＯＳＨ、を含むように誘導される。チオ酸の反応性により、他に対するあるアミノ基の選択性が達成される。例えば、−ＳＨは、適切なｐＨ条件下でＮ末端アミノ基との反応における十分な放出基としての能力を発揮し、リジン残基のεアミノ基がプロトン化され、非求核的なまま維持される。一方、適切なｐＨ条件下での反応は、選択的に反応する幾つかの接近可能なリジン残基を作り出す。
ある実施形態において、ＰＥＧは、ＰＥＧ鎖の末端にＮ−ヒドロキシサクシミドのような反応性エステルを含む。Ｎ−ヒドロキシサクシミデート−包含ＰＥＧ分子などは、中性の６．５〜７．５の適当なｐＨ条件で選択的なアミノ基と反応する。例えば、Ｎ末端アミノ基は中性のｐＨ条件下で選択的に修飾される。しかし、試薬の反応性が激しい場合、リジンの接近可能なＮＨ２基も反応する。
ＰＥＧは抗体のアミノ酸残基と直接、又はリンカーを介してコンジュゲートされる。ある実施形態において、リンカーは抗体ポリペプチドに付加され、リンカー修飾抗体ポリペプチドを形成する。そのようなリンカーは、種々の機能、例えば、抗体ポリペプチド修飾リンカーとＰＥＧ試薬をカップルさせるために、スルフィドリル、アミノ、又はカルボキシル基などの反応基を提供する。
ある実施形態において、抗体ポリペプチドとコンジュゲートされるＰＥＧは、直鎖状である。ある実施形態において、抗体ポリペプチドとコンジュゲートされるＰＥＧは、分岐状である。米国特許第5,643,575に記述されるような分岐状ＰＥＧ誘導体、Shearwater Polymers, Inc.のカタログ "Polyethylene Glycol Derivatives 1997-1998."に記載されるような「スターＰＥＧ」及びマルチアームＰＥＧである。スターＰＥＧは、例えば、U.S. Patent No. 6,046,305を含む文献中に記載されている。
約２ｋＤａｋから約１００ｋＤａの範囲の分子量を持つＰＥＧが通常使用されるが、「約」なる用語は、ＰＥＧに関しては、ポリエチレングリコールの調製物中において、ある分子が言及された分子量より重いか、いくらか軽いことを示す。例えば、抗体とのコンジュゲーションに適するＰＥＧは、約２ｋＤａから約５ｋＤａ、約５ｋＤａから約１０ｋＤａ、約１０ｋＤａから約１５ｋＤａ、約１５ｋＤａから約２０ｋＤａ、約２０ｋＤａから約２５ｋＤａ、約２５ｋＤａから約３０ｋＤａ、約３０ｋＤａから約４０ｋＤａ、約４０ｋＤａから約５０ｋＤａ、約５０ｋＤａから約６０ｋＤａ、約６０ｋＤａから約７０ｋＤａ、約７０ｋＤａから約８０ｋＤａ、約８０ｋＤａから約９０ｋＤａ、又は約９０ｋＤａから約１００ｋＤａの分子量を持つ。
ＰＥＧ−抗体コンジュゲートの調製
前述のように、ＰＥＧ部分は直接又はリンカーを介して、抗体ポリペプチドのＮ末端又はその近く、内部、又はＣ末端又はその近くのアミノ酸残基と結合することができる。コンジュゲーションは液相又は固相中にて実施することができる。
Ｎ−末端結合
ＰＥＧ部分を抗体ポリペプチドのＮ末端又はその付近のアミノ酸残基と結合させる方法は、当該技術分野において既知である。ある実施形態において、Ｎ末端化学修飾抗体を選択的に取得する既知の方法が使用される。例えば、特定のタンパク質の誘導体化において利用可能な第１アミノ基と異なるタイプの異なる反応性（リジン対Ｎ末端）を利用する還元的アルキル化によるタンパク質修飾方法を使用することができる。適当な反応条件下において、ポリマーを含むカルボニル基を用いて、Ｎ末端においてタンパク質の実質的に選択的な誘導体化を達成することができる。反応は、リジン残基のεアミノ基とタンパク質のＮ末端残基のαアミノ基間のｐＫａの相違をうまく利用することが可能となるｐＨにおいて実施される。そのような選択的な誘導体化により、ＰＥＧ部分の抗体への結合を制御する；ポリマーとのコンジュゲーションは、優先的に抗体のＮ末端に生じ、リジン側鎖アミノ基などの他の反応基の有意な修飾は生じない。
Ｃ−末端結合
モノＰＥＧ化はポリペプチドのＣ末端に選択的なＰＥＧ試薬を使用して達成することができ、スペーサーがあってもなくても調製できる。例えば、一方の末端にメチルエステルを、他方にアミノ基を有するような修飾されたポリエチレングリコールを出発材料として用いてもよい。
水溶性のカルボジイミドを縮合剤として調製又は取得を行うことができる。縮合剤としての水溶性カルボジイミドによる抗体カップリングは、通常、アミド結合に効果的な至適ｐＨ下において、適当なバッファー系の水溶性溶媒中で実施される。高分子量のＰＥＧは分子量を増加させようにタンパク質を共有結合的に付加される。
選択される試薬は至適化実験過程に依存する。非限定的な適切な試薬の例は、ＥＤＣ又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドである。ＥＤＣの水溶性により、前もって有機溶媒に溶解する必要なく、直接反応に添加することができる。
例えば、ＰＥＧアミンの使用が、上記において、名前又は構造により言及されていても、そのような誘導体は単なる例を意味し、抗体タンパク質のカルボキシル基と共に縮合するＥＧ−ＮＨ−ＮＨ２などのヒドラジン誘導体などの他の基も使用可能である。水溶相に加え、該反応は、固相においても実施することができる。ポリエチレングリコールは分子量が３００−４００００の範囲の化合物のリストから選択することができる。種々のポリエチレングリコールの選択は、カップリング効率及び生成された誘導体のインビトロ及びインビボにおける生物学的能力、つまり、循環時間、抗ウィルス活性などによって指示される。
さらに、適当なスペーサーを抗体の重鎖及び／又は軽鎖のＣ末端に付加することができる。スペーサーは、高分子量の抗体誘導体を提供する適当なＰＥＧ試薬とカップルするＳＨ、ＮＨ２又はＣＯＯＨなどの反応基を有してもよい。固相／液相の複合法は、Ｃ末端ペグ化抗体ポリペプチドの調製に関し考案することができる。
所望の場合、ペグ化抗体は、限定はしないが、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びそれらの組合せなどを含む任意の既知の方法を用いて非ペグ化抗体と分離される。
抗体−融合タンパク質
また、本発明はＳＥＡＭ３の抗原特異性を持つ組換抗体も考慮し、該抗体は異種性タンパク質を含むように修飾される。例えば、ＳＥＡＭ３ ＭＡｂ重鎖ポリペプチド又はＳＥＡＭ３軽鎖ポリペプチドは、レポータータンパク質又は所望の抗癌効果を有するタンパク質と連結される。例えば、ＳＥＡＭ３は第２の抗体（又は少なくともその抗原結合部分）、例えば、血管形成の重要なメディエーターである血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に対する抗体などの血管由来因子又は増殖因子と特異的に結合する抗体とコンジュゲートしてもよく、ＳＥＡＭ３は癌細胞に特異的なコンジュゲートを標的化し、抗ＶＥＧＦ抗体はＶＥＧＦを不活性化し、結果的に血管形成を阻害する。
ある実施形態において、本発明は、異種性ポリペプチドとの結合、つまり、天然のＳＥＡＭ３抗体とは通常結合していないポリペプチドと結合するＳＥＡＭ３軽鎖ポリペプチドのＣＤＲ、又はＳＥＡＭ３重鎖ポリペプチドのＣＤＲを提供する。目的の融合タンパク質を作製する方法は、核酸配列が与えられている場合、当技術分野において周知である。
組換え抗体を作製する方法
多くの実施形態において、ＳＥＡＭ３モノクローナル抗体をコードする核酸、少なくともＳＥＡＭ３重鎖ポリペプチドのＣＤＲ又は少なくともＳＥＡＭ３の軽鎖ポリペプチドのＣＤＲをコードする核酸は宿主細胞中へ直接導入され、コードされた抗体の発現を誘導するのに十分な条件下において細胞をインキュベートする。従って、また、本発明は少なくともＳＥＡＭ３重鎖ポリペプチドのＣＤＲ又は少なくともＳＥＡＭ３の軽鎖ポリペプチドのＣＤＲをコードする外来性ポリヌクレオチドを含む組換え宿主をも考慮する。
任意の適当な宿主、ベクター及びプロモーターは、本発明のＳＥＡＭ３コード化核酸と共に使用することができる。特に関心があるのは、少なくともＳＥＡＭ３重鎖ポリペプチドのＣＤＲ及び／又は少なくともＳＥＡＭ３の軽鎖ポリペプチドのＣＤＲをコードするインサートを有するベクターである。また、少なくともＳＥＡＭ３重鎖ポリペプチドのＣＤＲ又は少なくともＳＥＡＭ３の軽鎖ポリペプチドのＣＤＲをコードする核酸配列によって構成されるポリヌクレオチドもまた興味の対象であり、ＳＥＡＭ３コード配列は作用可能に異種性プロモーターと連結される。宿主細胞、ベクター及びプロモーターの例として、より詳細にここに記述される。
発現カセットの発現に適する任意の細胞は、宿主細胞として使用される。例えば、酵母、昆虫、植物などの細胞である。多くの実施形態において、自然に抗体を産生しない哺乳類宿主細胞、例えば、ハイブリドーマＢ細胞又は膵臓細胞ではない哺乳類細胞である。また、組換え抗体の変更されたグリコシル化を提供するか、又はグリコシル化の無い細胞を使用することも興味の対象である。例示的な細胞としては、限定はしないが；サル腎臓細胞（ＣＯＳ細胞），ＳＶ４０でトランスフォームしたサル腎臓ＣＶＩ細胞（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５ １）；ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３，Graham et al. J. Gen Virol. 36:59 (1977))；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ，Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4216, (1980)；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980))；サル腎臓細胞(CVI ATCC CCL 70)；アフリカミドリサル腎臓細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587)；ヒト頚癌（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット細胞（ＢＲＬ ３ Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗｌ３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（ｈｅｐＧ２，ＨＢ ８０６５）；マウス乳腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci 383:44-68 (1982)); ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）；及びマウスＬ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−Ｉ）が含まれる。さらなる細胞株は、当業者にとって明らかであろう。様々な細胞株は、the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209から入手できる。
哺乳類宿主細胞において、多くのウイルスベースの発現システムは、目的の抗体を発現するのに利用される。発現ベクターとしてアデノウイルスが使用される場合、目的の抗体のコード化配列はアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーター及び３部構成（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）のリーダー配列とライゲートされてもよい。このキメラ遺伝子は、次に、インビトロ又はインビボにおける組換えによってアデノウィルスゲノム中に挿入される。ウイルスゲノム（例えば、領域Ｅ１又はＥ３）の非必須領域への挿入の結果、感染宿主中において、生存可能で、抗体分子を発現することができる組換えウイルスが生じる(例えば、Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359 (1984)を参照のこと)。発現効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを包含することによって増強される(例えば、Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)を参照のこと)。
長期間にわたる高収量での組換え抗体の生産に関しては、安定な発現が用いられる。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞株が設計される。複製のウイルスオリジンを含む発現ベクターを使用するよりむしろ、宿主細胞は、免疫発現カッセト及び選択マーカーで形質転換され得る。外来ＤＮＡの導入後、設計された細胞は、栄養豊富な培地中において１〜２日間成長させ、その後、選択培地に変更する。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、染色体中へプラスミドを安定的に導入させることができ、順次、クローン化して細胞株中で増幅させることが可能なフォーカスを形成させるまで成長させる。そのように設計された細胞は、特に、抗体分子と直接又は間接に相互作用する化合物のスクリーニングと評価において有用である。
核酸を細胞内へ導入する方法は当該技術分野において周知である。適当な方法には、エレクトロポレーション、パーティクルガン法、カルシウムリン酸沈殿法、直接的マイクロインジェクションなどが含まれる。方法の選択は、通常、トランスフォームされる細胞のタイプ及びトランスフォーメーションが行われる環境（即ち、インビトロ、エキソビボ又はインビボ）に依存している。これらの方法の一般的な議論は、Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995に見出すことができる。いくつかの実施形態において、リポフェクタミン及びカルシウムを介した遺伝子導入技術が使用される。
対象の核酸が細胞内へ導入された後、典型的には、該細胞は、通常、３７℃で、時には選択された温度で、約１−２４時間の間抗体の発現を可能ならしめるためにインキュベートされる。特に関心のある実施形態において、抗体は、典型的には、細胞が培養される培地の上清へ分泌される。
本発明の組換え抗体分子の生産されると、免疫グロブリンの生成に関する技術分野で既知の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特に、プロテインＡ及びサイズカラムクロマトグラフィー後の特異的抗原に対するアフィニティーなど）、遠心分離、差異溶解度、又はタンパク質の精製に関するその他の標準的な技術によって精製される。多くの実施形態において、抗体は細胞から培地へ分泌され、培地から回収される。
キット
また、本発明により、前述のここに開示される方法を実施するためのキットも提供される。該キットには、キットの使用目的に応じて、１又は複数のここで記述される組成物、例えば、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原、脱Ｎ−アセチル化ＰＳ産物（選択に応じて、前記方法の項で記述されたアシルマンノサミン及びトリハロアシルマンノサミン試薬）、抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体、これをコードする核酸（特に、ＳＥＡＭ３ ＭＡｂの重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲをコードする核酸）、又はこれを含む組換え細胞などが含まれる。キットのその他の任意の構成要素には：抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体を投与するため、及び／又は診断アッセイを実施するためのバッファーなどが含まれる。キットの組換え核酸には、制限酵素サイト、マルチクローニングサイト、プライマーサイトなどが、非ＳＥＡＭ３コード核酸の定常領域とのライゲーションを促進するために含まれる。キットの種々の構成要素は、個別の容器中に存在するか、又は、所望なら、特定の相互に適合性のある要素が単一の容器内に事前に組み合わされている。
前記要素に加えて、対象のキットは、典型的には、開示される方法を実施するために、キットの要素を使用するための指示をさらに含む。対象の方法を実施するための指示は、一般に、適当な記録媒体に記録される。例えば、該指示は、紙又はプラスチックなどの被印刷物状に印刷されてもよい。この場合、指示は、パッケージの内容物として、キット又はその構成要素の容器のラベル（即ち、パッケージ又はサブパッケージに添付されて）としてキット中に存在する。他の実施形態において、指示は、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケットなどの適当なコンピューターに読み込み可能な媒体中に存在する電子保存データファイルとして提示される。さらにその他の実施形態において、実際の指示はキット中には示されていないが、離隔されたソースから指示を取得する方法、例えば、インターネットを介した方法が提供される。本実施形態の例は、指示を閲覧し得るウェッブアドレス、及び／又は指示をダウンロードできるウェッブアドレスを含むキットである。指示と同様に、指示を取得するためのこの手段は適当な素材に記録される。
また、少なくとも、前記プログラムと指示が記録されるコンピューターに読み取り可能な媒体も、対象の発明によって提供される。該指示には、インストール又はセットアップの指示が含まれてもよい。該指示には、前記オプション又はオプションの組合せを伴う発明の使用のための指示が含まれる。特定の実施形態において、該指示には両方のタイプの指示が含まれる。
該指示は、一般に、適当な記録媒体に記録される。例えば、該指示は、紙又はプラスチックなどの被印刷物状に印刷されてもよい。この場合、指示は、パッケージの内容物として、キット又はその構成要素の容器のラベル（即ち、パッケージ又はサブパッケージに添付されて）としてキット中に存在する。他の実施形態において、指示は、同時にプログラムが存在する媒体を含む、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケットなどの適当なコンピューターに読み込み可能な媒体中に存在する電子保存データファイルとして提示される。
実施例
ここに記載される実施例および実施形態は説明のためのみのものであり、それを踏まえた様々な改変や変更は当業者に提案され、本出願及び添付の請求範囲の精神及び範囲に含まれる。ここにおいて引用される全ての出版物、特許、および特許出願は、参照することにより全体としてここに取り込まれる。
実施例１：ｄｅＮＡｃＳＡエピトープを持つＮ−アシルＮｍＢ ＰＳ及び誘導体の調製
髄膜炎菌グループＢ（ＮｍＢ）多糖（ＰＳ）（ａｃｙｌ＝ａｃｅｔｙｌ［Ａｃ］又はｐｒｏｐｉｏｎｙｌ［Ｐｒ］）は、以下のように、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープを有するＰＳ誘導体を生成するため、下記に注記されるような相違を伴う、Guo及びJenningsの方法により調製された(Guo, Z, and Jennings, H. In 2001. N-Propionylation. In Meningococcal Vaccines: Methods and Protocols. A. J. Pollard, and C, J. M. Maiden, eds. Humana Press Inc., Totowa, N.J、P55)。コロミン酸又はＮｍＢ ＰＳ（１００ｍｇ;EY Laboratories, INc., San Mateo, CA） 及び１０ｍｇのホウ化水素ナトリウム（Sigma-Aldrich）は、１０ｍｌの２ＭＮａＯＨに溶解され、密閉した試験管内(Piece Chemical Co., Rockford, IL)で９０℃で２時間熱せられた。
脱−Ｎ−アセチル化反応の条件はGuoおよびJenningsによって記載されたものとは異なる。GuoおよびJenningsが記したように、完全に脱−Ｎ−アセチル化しＰＳ誘導体を使う代わりに、本生成物は、典型的には、下記に記載されるレゾルシノールアッセイによって測定された２０％Ｎ−アセチル残基を含んでいた。また、溶液の１００℃及びそれ以上に加熱、及び２時間よりも長い加水分解時間の結果、多糖及び未確定で望ましくない副産物の分解が生じる。図１は、模範的な脱−Ｎ−アセチル化ＰＳの構造を示す。
ここに記載されているアプローチは、最低でも残基の２０％はＮ−アセチル化されることを提供するため、Ｎ−アセチル及びＮ−アシル残基の混合物（例えば、Ｎ−プロピオニル、Ｎ−ブタノイルなど）を含むＰＳ誘導体を調製することができる利点、並びに、Ｎ−アセチル化及び脱−Ｎ−アセチル化残基の混合を含むＰＳ誘導体も調製できる利点を有している。また、ホウ化水素ナトリウムを追加すると、ＰＳの還元性末端のケトンをアルコールに還元し、また、脱−Ｎ−アセチル化されたアミノ基と還元性末端残基のＣ２ケトンの間に形成されるイミンを二級アミンに還元する。還元末端残基にＮ−アセチル基、脱−Ｎ−アセチル部位、環状２級アミンを持つ残基を含むＮｍＢ ＰＳ誘導体は、非自己反応性、抗Ｎ−Ｐｒ ＮｍＢ ＰＳ ｍＡｂ ＳＥＡＭ３によって結合され（下記の実施例３を参照）、従って、癌細胞に発現される脱Ｎ−アセチルシアル酸抗原（特に、α（２→８）Ｎ−アセチルノイラミン酸）と反応する抗体を誘導する重要な抗原である。
溶液を室温に冷却後、溶液を２ＭＨＣＬでｐＨ８．０に調整し、水に対して透析し、凍結乾燥し、更なる精製を行わずに後述の通り再アシル化した。
遊離アミノ基は、ＰＳ（〜１００ｍｇ）を３−５ｍｌの水に再懸濁し、０．１ＭＮａＯＨを加えてｐＨ８−９に調整し、５アリコート中に０．５ｍｌの無水アシル（例えば、無水酢酸又は無水プロピオン酸）を加えて数時間攪拌した（無水酢酸は、以前Guo and Jenningsによって調製された誘導体中には含まれない）。あるいは、カルボン酸を、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドハイドロクロライド（EDC, Pierce Chemical Company, Rockford,IL）の１当量に０．５ｍｌの酸（カルボン酸）を加えて活性化した。ＥＤＣを完全に溶解させるために少量の水（およそ１ｍｌ）を加えた。無水物と同様に、カルボジイミド活性化酢酸を５当量アリコート添加し、数時間攪拌した。ある実施において、担体タンパク質とのコンジュゲーションでの使用のための誘導体、例えば、Ｎ−アシル、−メタクリル、−ブロモアセチル（ＢｒＡｃ）又はクロロアセチル（ＣｌＡｃ）などの調製などにおいて、後述のように、酢酸の量はレゾルシノールアッセイ（後述）によって測定される多糖中の遊離アミンの量（例えば、１０％〜９０％）の割合に減らされる。ＥＤＣ活性化アシル化試薬を使用する利点は、該試薬が水中において無水物又はアシルクロライドのようには速やかに加水分解されず、アミンとより選択的に反応することである。これにより、アシル化されたアミノ基の割合をよりコントロールすることができる。加水分解が遅いため、Ｎ−アクリル、ＢｒＡｃ及びＣｌＡｃ基の完全な加水分解を生じるｐＨにおける大きなばらつきを回避できる。溶液のｐＨは２ＭＮａＯＨを必要に応じて加えることで〜８−９に維持された。溶液は透析し、凍結乾燥した。
ほとんどのアミノ基はこの方法でアシル化されたが（８０％−９０％）、いくらかのアミノ基は誘導体化されず、遊離アミノ基のままであった。ポリマーの非還元末端を含む脱Ｎ−アセチル化部位を持つ残基を含むＰＳには、ＳＥＡＭ３（以下の実施例３を参照）が結合するので、保護性、非自己反応性の抗ＮｍＢ被膜抗体を誘発するための重要な決定因子である。
ＰＳのより小さな断片（平均ポリマー化程度［Ｄｐ］＜２０）は、酸性ｐＨの水中での加水分解処理によって生成された。Ｎ−アシルＮｍＢ ＰＳ（２０ｍｇ）の一部は、５ｍｌの０．２Ｍ ＮａＯＡｃ，ｐＨ５．５に溶解され、密閉した試験管中で５０℃で１−２４時間、典型的には、所望の断片のサイズに応じて５時間加熱した。溶液は、透析し、凍結乾燥した。
開始した時点のＰＳより平均してＤｐが小さいＰＳを生成することに加えて、酸処理の結果、Ｃ１カルボキシル基と先行する残基（図２）のＣ９ＯＨ基との間にラクトンが形成される。少量のラクトンを含むＰＳは、癌細胞中で発現されるシアル酸抗原中に生じるかもしれない。ＮｍＢＰＳ誘導体調製物中の少量のラクトンは、癌細胞表面上に発現されるｄｅＮＡｃＳＡ抗原と反応する抗体の誘発を促進するかもしれない。
アルデヒド基は担体タンパク質への共有結合に使用するためＰＳの非還元性および還元性末端に導入された。ＰＳ（２０ｍｇ）を１ｍｌの０．１ＭＮａＯＡｃ緩衝液ｐＨ６．５に溶解した。メタ過ヨウ素酸ナトリウム（５ｍｇ、Sigma-Aldrich）が加えられ、溶液は暗所に３０分間置かれた。残ったＮａＩＯ４は、水との混合物である０．１ｍｌの１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）エチレングリコールを添加することによって分解し、３０分放置した。この手順は還元性のない末端残基のＣ８および／またはＣ７にアルデヒド基を生成し、脱アセチル化の間に（上記参照）Ｃ２ケトンがアルコールに還元された還元末端残基を含むＰＳについては、Ｃ７（図３）のアルデヒド基を生成した。
Ｃ５アミノ基はＣ４水酸基に近接するため、脱Ｎ−アセチル残基の一定割合も過ヨウ素酸塩を用いてアルデヒドに酸化された。ＳＥＡＭ３によって認識されるエピトープである脱Ｎ−アセチルＳＡ残基の過ヨウ素酸塩による破壊を最小にするために、Ｎ−アクリル、−ＢＡｃ又は−ＣｌＡｃ基は選択的に、脱Ｎ−アセチル化及び不完全な再アシル化の結果として脱Ｎ−アセチル残基を含むＮ−Ｐｒ及びＮ−ＡｃＮｍＢＰＳ中に導入された。カルボキシル基は前記ＥＤＣによって活性化される。ＰＳ中に存在する遊離アミンのわずかな部分のみが、反応に添加される活性化酢酸の量を制限することによってアシル化された（１０％−９０％）。アクリル、ＢｒＡｃ及びＣｌＡｃ基は、担体タンパク質に存在するチオール及びアミノ基と、穏やかな条件で反応し、その結果、ＰＳ誘導体は過ヨウ素酸塩によるＰＳの処理で引き起こされる酸化ダメージを受けることなく担体タンパク質とコンジュゲートできる。
ドデシルアミンとタンパクＰＳ誘導体コンジュゲート
ドデシルアミン誘導体は、非還元性末端または還元性の末端アルデヒドまたはケトンを含む２０ミリグラムのＮｍＢ ＰＳ誘導体と、５ミリリットルの水中の１０ミリグラムのドデシルアミンとを組み合わせて調製された。混合液を５０℃で３０分間攪拌しながら熱した後、５ｍｇのナトリウムシアノボロハイドライドを加えた。混合物は、室温で２４時間、攪拌され、その後、過剰なドデシルアミンを取り除くため水中で透析を３−５日行った。
ドデシルアミン誘導体のＳＥＡＭ ｍＡｂｓとの反応性は、直接ＥＬＩＳＡに結合させることで決定されたが、その中の抗原（すなわちドデシルアミンＰＳ誘導体など）は、ＰＢＳバッファーの抗原溶液をマイクロタイタープレートのウェル中で、４℃、１晩インキュベートすることにより、マイクロタイタープレート表面に吸着させた。該プレートは、ＰＢＳバッファー（５ｘ）で洗浄され、１％（ｗ／ｗ）のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ；ブロッキング緩衝液）を含むＰＢＳ緩衝液で、１時間室温でブロックされた。抗体は、ブロッキングバッファー中に希釈され、プレートに添加された（ウェルごとに１００マイクロリットル）。室温４時間のプレートのインキュベーションが終わった後、プレートはＰＢＳバッファー（５ｘ）で洗浄され、ブロッキングバッファー中に希釈されたウサギ抗マウスアルカリフォスファターゼコンジュゲート抗体（Zymed）が添加された。さらに、１時間、インキュベーション後、プレートはＰＢＳバッファー（５ｘ）で洗浄され、結合した抗体は１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭの炭酸ナトリウムバッファーｐＨ９中のＰニトロフェニルホスフェート基質を加えることにより検出した。３０分の室温でのインキュベーション後、４０５ｎｍにおける吸光度がBioRad Model 550 microtilter plate readerを使うことによって測定された。結合実験の結果は図３４に示されている。
担体タンパクにコンジュゲートしたＰＳ誘導体は、５ミリグラムのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Piece Chemical Co.,）破傷風毒素を、１０ｍｇのＰＳ誘導体又は非還元性末端アルデヒド基を含むＰＳ誘導体、又はＮ−アクリル、ＢｒＡｃ又はＣｌＡｃ基とＰＢＳバッファー中で混合させることで調製された。５ミリグラムのシアン化ホウ酸水素ナトリウム（ＰＳ含有アルデヒド）が添加されるか、又は添加されずに（Ｎ−アクリル、ＢｒＡｃ又はＣｌＡｃ）、混合液は暗所で５日間攪拌された。該溶液はＰＢＳバッファー中で透析された（１０−１４ｋＤａカットオフ膜）。ＰＳ誘導体−ＢＳＡコンジュゲートのｍＡｂｓとの反応性は、前述のパラグラフに記載されているように、直接結合ＥＬＩＳＡで測定された。結合実験の結果は図３５に示されている。
ＮｍＢ ＰＳ誘導体の原液中のシアル酸と脱−Ｎ−アセチルシアル酸の濃度は、次のように改変したSvennerholmレゾルシノール反応（Svemmerholm, L. (1957) Biochim. Biophys. Acta 24:604）によって測定された。９．７５ミリリットルの水、０．２５ミリリットルの０．１ＭＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ．１０ミリリットルの２０ｍｇ／ｍｌレゾルシノール水溶液、および８０ミリリットルの濃ＨＣＬを混合してレゾルシノール作用試薬を調製した。レゾルシノール作用試薬（３００マイクロリットル）はシアル酸または脱−Ｎ−アセチルシアル酸サンプル溶液（シアル酸は最高５０マイクログラムまで）または水溶液標準原液（３００マイクロリットル）とポリプロピレンの深いウェル（２ミリリットル）のマイクロタイタープレート内で混合された。プレートはプレートカバーで密封され、沸騰した湯に３０分間つけられた。室温まで冷却した後、イソアミルアルコール（６００マイクロリットル）がピペットを用いて加えられ、混合された。相を分離させ、上側のイソアミル層をきれいなマイクロティルタープレートへ移した。２５０マイクロリットルのイソアミルアルコール抽出物および下層の水溶液を別々にポリスチレンのマイクロタイタープレートに移し、吸光度４９５ｎｍ及び５８０ｎｍで測定した。
Ｎ−アセチルシアル酸の量は、イソアミルアルコール画分の５８０ｎｍでの吸光度から決定され、脱−Ｎ−アセチルシアル酸の量は、水溶液画分の４９５ｎｍでの吸光度からそれぞれ標準曲線との比較により決定された。脱−Ｎ−アセチルシアル酸の量は、シアル酸標準中で生じた脱−Ｎ−アセチル化の量を測定することにより、測定法の酸加水分解段階の間に生じた脱−Ｎ−アセチル化の量に修正された。
長鎖アルキル基を含むＮｍＢ ＰＳ誘導体の逆相ＨＰＬＣ
長鎖（すなわち≧８）アルキル基（例えば、ドデシルアミン誘導体）ＮｍＢ ＰＳ誘導体はＰｏｒｏｓ Ｒ１／ＨカラムとＢｉｏＣＡＤ灌流クロマトグラフィーワークステーションを用いて逆相ＨＰＬＣによって分離された。誘導体は０％から８０％のアセトニトリル勾配で、２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファー、ｐＨ６．５中、３０分以上、流量５ｍｌ／ｍｉｎで溶出された。画分（それぞれ１ミリリットル）が回収された。
ｍＡｂｓと反応する誘導体を含む画分（例えば、ＳＥＡＭ３、ＳＥＡＭ１２ Granoff et al. 1998,supra）は、それぞれの画分を１００マイクロリットルずつ９６ウェルマイクロタイタープレート(Immulon II, Dynatech) のウェルに加え、プレートを４℃で１晩インキュベーションすることにより決定された。プレートはＰＢＳバッファー（５ｘ）で洗浄され、１％（ｗ／ｗ）のウシ血清アルブミン（Sigma; ブロッキング緩衝液）を含むＰＢＳバッファーで、室温で1時間ブロックされた。抗体はブロッキングバッファー内で希釈されてプレートに添加された（ウェルごとに１００マイクロリットル）。プレートを室温で４時間インキュベーションした後で、プレートはＰＢＳバッファー（５ｘ）で洗浄され、ブロッキングバッファー内で希釈されたウサギ抗マウスアルカリフォスフォターゼコンジュゲート抗体（Zymed）が添加された。さらに1時間のインキュベーションの後、プレートはＰＢＳバッファー（５ｘ）で洗浄され、１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭの炭酸ナトリウムバッファーｐＨ９に、p-ニトロフェニルホスフェート基質を加えることにより、結合した抗体を検出した。室温で３０分のインキュベーションの後、BioRad Model 550 microtilter plate readerを用いて４０５ｎｍにおける吸光度が測定された。
ＮｍＢ ＰＳの非還元末端ドデシルアミン誘導体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析。
逆相ＨＰＬＣから得られた画分中の溶媒はスピンバック（TermoSavant）を用いて蒸発させた。残留分はアセトニトリル／水（１：１）中に溶解させた。アセトニトリル／水中の３ｍｇ／ｍｌ濃度のトリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）のマトリクスが、ターゲット上にスポットされた（１スポットにつき０．５マイクロリッター）。マトリクススポットを真空下で乾燥させた後、サンプルをマトリクススポットの上にスポットした（０．５マイクロリッター）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Autoflex, Bruker Daltonics）は、正負双方のリニアモード（３０ショットＮ２レーザー、５０％レーザー出力）、レフレクターの正および負モード（３０ショットＮ２レーザー、５０％レーザー出力）で実施された。質量スペクトルは、外部ペプチド（Bruker Daltonics）とシアル酸（EY Scientific）標準を用いて校正された。観察された質量の誤差は、≦０．１％と見積もられた。図１６−１８に、保護性、非自己反応性抗ＮｍＢ被膜ｍＡｂ ＳＥＡＭ ３と反応性があり、前述の記載のように逆性ＨＰＬＣで精製したＮｍＢ ＰＳの調製物からのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって同定された構造式を示す。誘導体は、少なくとも１つの脱−Ｎ−アセチル残基を持つ、脱−Ｎ−アセチル、Ｎ−アセチル、およびＮ−プロピオニル残基の混合物を含む。
実施例２：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による、ＳＥＡＭ３により認識されるＮｍＢ ＰＳ誘導体の構造の決定
ＳＥＡＭ３は以下のようにして磁気ビーズに結合した。ＭａｇｎａＢｉｎｄＴＭヤギ抗マウスＩｇＧビーズ（２００μｌ；Pierce）をＰＢＳバッファー中で５μｇのＳＥＡＭ３と混合した。混合物は、室温で１時間、回転ホイール上でインキュベートされた。ビーズは洗浄バッファーで３回洗浄した。結合した抗体は、ＢＳ３ＴＭ（Pierce）をＰＢＳバッファー中に２ｍＭの濃度で加え、室温で３０分ボルテックスすることによりビーズとクロスリンクした。未反応のＢＳ３ＴＭは、Ｔｒｉｓを０．１Ｍ，ｐＨ８．０で１０分間加えることにより分解した。ビーズはＰＢＳバッファーで３回洗浄した。実施例１で調製されたＮ−Ｐｒ ＮｍＢ ＰＳ（２４０マイクログラム）をＰＳＢバッファーで洗浄したビーズに添加した。混合物を回転ホイールに載せ室温で１時間インキュベートした後、非結合物質を除去し、ビーズを洗浄バッファーで２回、ＰＢＳバッファーで１回洗浄し、その後、２００μｌのＰＢＳバッファーに再懸濁した。ノイラミニダーゼ（０．００１７５Ｕ，ＥＣ ３．２．１．１８；Sigma）が各試験管に加えられ、混合物は３７℃で一晩、回転ホイール上でインキュベートされた。結合ＰＳはＤｐの点では不均一であるので、ビーズ−抗体−ＰＳ複合体は、ノイラミニダーゼとともに処理し、引き続き、残基をポリマーの非還元末端から取り除き、さらに抗体に消化されることから保護されるようポリマーのサイズを小さくする。ノイラミニダーゼ処理の後、ビーズは５０ｍＭの炭酸アンモニウム緩衝液ｐＨ８．５で３回洗浄され、結合ＰＳは、最後に０．１Ｍトリエチルアミン水溶液で溶出した。
マトリクスアシストレーザー脱離イオン化フライト時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析のため、溶出ＰＳ溶液、トリエチルアミン／水はスピンバック（Savant）内での蒸発によって取り除かれた。乾燥したサンプルは４μｌの５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）アセトニトリル／水内に再懸濁された。５０％アセトニトリル／水（０．５μｌ）中の２’，４’，６’−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ，Fluka Chemical）の飽和溶液のマトリクスが、ステンレスの標的プレートの上にスポットされた。ＰＳサンプル（２回、０．５μｌ）は、乾燥したＴＨＡＰの一番上にスポットされた。サンプルはBurker autoflex MALDI-TOF質量分析計を使用して、マイナスイオンレフラクターモードで分析された。
図４は、ノイラミニダーゼ処理の後、ＳＥＡＭ３に結合したＰＳ誘導体の代表的な質量スペクトルを示す。図５は各サンプルの観察された質量、および観察された質量に一致する対応するイオンの理論的質量を示す。ＰＳ誘導体の構造が図６−１５に示されている。全ての質量は１個以上の残基を含むニ糖類に対応し、その中でＣ−５アミノ基のＮアセチル基が除去されている。
実施例３：シアリダーゼ、消化、及びパルス電流計検出器（ＨＰＡＣ−ＰＡＤ）を備えた高速陰イオン交換クロマトグラフィーによる、ＳＥＡＭ３に結合するＮＰｒＮｍＢ ＰＳ誘導体を含んだｄｅＮＡｃＳＡエピトープの分析
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｄｅｎｓ由来のエクソシアリダーゼ（ＳＩＡＬＩＤＡＳＥ ＡＴＭ, Prozyme,Hayward, CA）は脱Ｎ−シアル酸残基を持つ非還元末端状に存在するポリシアル酸（Ｎ−Ａｃ又はＮ−Ｐｒ誘導体）を消化することができない。従って、ポリマー状にランダムに存在する脱Ｎ−アセチル残基を含むＮｍＢ ＰＳ又はＮ−Ｐｒ ＮｍＢ ＰＳのシアリダーゼＡによる完全な消化の結果、シアリダーゼが脱Ｎ−アセチル残基と相対した場合を除き、ポリシアル酸が５−Ｎ−アシルノイラミン酸へ変換される。この時点で、ポリマーの更なる消化が生じる。また、消化されないシアル酸分子は、脱Ｎ−アセチルシアル酸残基を非還元末端の位置に持つ。ＳＥＡＭ３が脱Ｎ−アセチル及びＮ−アシル残基の混合物と結合する実施例２に示される結果を確認するために、コロミン酸（EYLaboratories）及びＮ−Ｐｒ ＮｍＢ ＰＳ（１０ｍｇ）の調製物を５０ｍＭＮａＯＡｃバッファー、ｐＨ６．５に懸濁した。ＳＩＡＬＩＤＡＳＥ ＡＴＭ（０．１Ｕ，Prozyme）を添加し、この溶液を３７℃、３日間インキュベートした。
Ｎ−Ａｃ ＮｍＢオリゴ糖（ＯＳ）及び多糖（ＰＳ）及びシアリダーゼ処理後のＮ−Ｐｒ ＮｍＢ ＯＳ及びＰＳ残存物の画分及びポリマー化のレベルは、ＨＰＡＣ−ＰＡＤで定量化した。試料は、ＰＧ４０グラディエントポンプ、０．１ＭＮａＯＨ（９３％）と１ＭＮａＯＡｃを含む０．１ＭＮａＯＨ（７％）で平衡化したＰＳ２００カラム及びＥＤ４０エレクトロケミカル検出器を備えたＤｉｏｎｅｘ（Synnyvale,CA）液体クロマトグラフィーにインジェクトした。糖は、最初の条件から１００％の０．１ＭＮａＯＨ／１ＭＮａＯＡｃまでの直線濃度勾配で溶出した。
クロマトグラフィーの結果、両方の糖の約８１％から８８％が、各々、Ｎ−Ａｃ又はＮ−Ｐｒノイラミン酸に消化され、主として約２〜１８のＤｐを持つオリゴ糖（図３６）で構成され約１２−１９％とより高分子量のポリマーの極少量が残存することが示された。ＨＰＡＣ−ＰＡＤ分析によって、たとえコロミン酸調製物が脱Ｎ−アセチル化／再アシル化法の対象とされていない場合でも、コロミン酸及びＮ−Ｐｒノイラミン酸調製物の両方が脱Ｎ−アセチル残基を含んでいることが示される。
ＥＬＩＳＡにおいてＳＥＡＭ３の結合を阻害するコロミン酸及びＮ−Ｐｒ ＮｍＢ ＰＳの能力を、前述のように調製したシアリダーゼＡ処理のコロミン酸及びＮ−Ｐｒ ＮｍＢ ＰＳと比較した。マイクロタイタープレートのウェル（Ｉｍｍｕｌｏｎ２;Dynatech laboratories,Inc）を、リン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）中のＮ−Ｐｒ ＮｍＢ ＰＳドデシルアミン（実施例１のように調製）でコートした。該プレートは、一晩、４℃でインキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、ウェルを２００μｌのブロッキングバッファー（１％ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ，Sigma］及び０．１％アジ化ナトリウム；［ｐＨ ７．４］）を含むＰＢＳ）で満たし、非特異的な結合部位をブロックするために室温で３０−６０分インキュベートした。プレートをＰＢＳバッファーで３回洗浄した。インヒビターは、最終総体積５０μｌで連続的にプレート上で希釈した。ＳＥＡＭ３は、基質で現像した場合にＯＤ４０５ｎｍで０．５となる濃度にブロッキングバッファーで希釈し、５０μｌの体積でウェルに添加した。プレートは、カバーをし、一晩、４℃でインキュベートした、次の日、ウェルをＰＢＳバッファーで４回洗浄し、ブロッキングバッファーで１：３０００に希釈した１００μｌ／ウェルのアルカリホスフェートコンジュゲート抗マウスポリクローナル抗体（ＩｇＡ＋ＩｇＧ＋ＩｇＭ；Zymed）で、室温にて、２時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳバッファー及び１ｍＭＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ９の基質バッファー中で１ｍｇ／ｍｌに希釈して新たに調製した基質（ｐ−ニトロフェニルリン酸；Sigma）の１００μｌで洗浄した。室温で３０分インキュベートした後、４０５ｎｍの吸光度を、ＢｉｏＲａｄ Ｍｏｄｅｌ ５５０マイクロプレートリーダーを用いて測定した。各試料の比活性を、インヒビターを含まず、ＳＥＡＭ３を含むウェルで観察された、４０５ｎｍの吸光度が５０％減少するのに必要な希釈率を決定することで比較した。
阻害ＥＬＩＳＡで測定した場合、コロミン酸調製物はＮ−Ｐｒ ＮｍＢ ＰＳに比べ、ＳＥＡＭ３に対する結合活性がおよぼ２００倍低かった。しかし、ＨＰＡＣ−ＰＡＤで決定した場合、８０％以上のＰＳがＮ−アシルノイラミン酸モノマーに変換されていたにもかかわらず、無処理の調製物と比較した、エクソシアリダーゼ処理したコロミン酸又はＮ−Ｐｒ ＮｍＢ ＰＳの活性とは有意な差はなかった。この結果は、ＳＥＡＭ３で認識されるエピトープは、脱Ｎ−アセチル及びＮ−アシル残基の混合物で構成されるが、脱Ｎ−アセチル残基を含まないＮｍＢ ＰＳ誘導体を含まないことが明確に示される。ＨＰＡＣ−ＰＡＤによって特徴付けられるＤｐは２から２７の間で変動するため、脱Ｎ−アセチル残基がポリマーの内部で又は非還元残基において生じ得る。
コロミン酸又はＮ−Ｐｒ ＮｍＢ ＰＳ調製物中のＳＥＡＭ３で認識される抗原の量は、エクソシアリダーゼによる完全消化に影響を受けないが、脱Ｎ−アセチル残基を含まない調製物中の非反応分子は消化される。従って、エクソシアリダーゼ処理による完全消化は、ｍＡｂと結合する分子に関するコロミン酸及びＮ−Ｐｒ ＮｍＢ ＰＳ調製物を非常に濃縮するための手段を提供する。
実施例４：ｄｅＮＡｃＳＡ抗原について濃縮されたＰＳ誘導体を含むワクチンの調製
以下に、シアリダーゼベースの濃縮法及びアシル−又はハロアセチル基を介した結合によるコンジュゲートの形成を用いた、ＰＳ由来のｄｅＮＡｃＳＡ抗原含有ワクチンを作製する方法の例を提供する。
脱Ｎ−アセチル化
コロミン酸（１００ｍｇ、EYLaborarories）及び１０ｍｇ水素化ホウ素ナトリウム（Sigma-Aldrich）を１０ｍｌの２ＭＮａＯＨに溶解し、密封したガラスの加水分解チューブ（Pierce）に入れ、９０℃で２時間熱処理した。溶液は室温まで冷却し、氷酢酸を溶液のｐＨをおよそ７に低下させるまで添加した。溶液を、２ｘ４Ｌの水に透析し（１ｋＤａカットオフ）、凍結乾燥した。
再Ｎ−アシル化
脱Ｎ−アセチル化ＮｍＢ ＰＳは、５ｍｌの水に再懸濁し、ｐＨを２ＭＮａＯＨで８−９に調製した。アシル無水物（例えば、無水酢酸又は無水プロピオン酸）の０．１ｍｌを５回に分けて数時間かけて攪拌しながら添加した。ｐＨをモニターしながら、必要であれば２ＭＮａＯＨで８−９に調製した。溶液は、前述のように水に透析し凍結乾燥した。再アシル化ＮｍＢ ＰＳは、典型的には、レゾルシノールアッセイ（上掲を参照のこと）による測定で、１０％−３０％の脱Ｎ−アセチルシアル酸を含んでいる。産物は、ＳＥＡＭ３と反応する抗原について、ＳＩＡＬＩＤＡＳＥ ＡＴＭ（Prozyme）処理により濃縮した。
シアリダーゼ処理
凍結乾燥粉末を１ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．５に再懸濁し、ＩＵを添加した溶液を３７℃で３−７日間インキュベートした。反応の進行は、除去のためにセントリコン膜（３０ｋＤａカットオフ）でろ過した反応混合物の少量を定期的にＨＰＡＣ−ＰＡＤ分析してモニターした。５−Ｎアシルノイラミン酸の放出がもはや生じない場合、反応を停止させ、シアル酸ラクトンを反応のｐＨを２ＭＮａＯＨで、１時間、１２に上げることによって加水分解し、氷酢酸で中和させ、３０ｋＤａセントリコン膜でろ過し、水に透析して（１ｋＤａの透析チューブ）、産物を凍結乾燥した。
アクリル酸（又はハロ酢酸）によるＮ−アセチル化
シアリダーゼ処理による部分的脱Ｎ−アセチル化ＮｍＢ ＰＳを水に再懸濁し、ｐＨを８−９に２ＭＮａＯＨで調整した。再Ｎ−アシル化ＮｍＢ ＰＳ調製物中に存在する脱Ｎ−アセチルシアル酸の１０％から１００％（典型的には、レゾルシノールアッセイの測定シアル酸の総量の４０％−５０％）と等しいアクリル酸（又はハロ酢酸）の量を、ＥＤＣ（Pierce）の０．９等量と混合する。必要であれば少量の水をＥＤＣを溶解するために添加する。活性化されたアクリル酸（又は活性化されたハロ酢酸）の溶液を部分的に再Ｎ−アシル化されたＮｍＢ ＰＳの調製物に攪拌しながら添加し、必要ならば２ＭＮａＯＨを添加してｐＨを８−９に維持する。脱Ｎ−アセチルシアル酸と等量の活性化されたアクリル酸（又は活性化されたハロ酢酸）の量を反応液に添加するが、脱Ｎ−アセチルシアル酸の一定量は、活性化されたアクリル酸のある量が加水分解されるために、残存する。１時間攪拌後、反応混合物を透析し、前述の通り、凍結乾燥する。産物は、密封し、アルゴン中、暗所にて−８０℃で担体タンパク質とのコンジュゲーションまで保存する。
担体タンパク質とのコンジュゲーション
担体タンパク質（１０ｍｇ）を、１５０ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０に溶解する。アシルを含むＮｍＢ ＰＳ調製物を添加し（２０ｍｇ）、溶液は室温にて、暗所に２日間静置させる。溶液を、３０ｋＤａの分子量カットオフの透析膜を使用してＰＢＳバッファー中に透析する。透析したコンジュゲートを、最後に滅菌的にフィルター（０．２μ）し、使用まで４℃で保存する。タンパク質にコンジュゲートしたシアル酸の量をレゾルシノールアッセイで測定し、ＰＳが共有結合的にタンパク質と結合するコンフォメーションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＡＭ３によるウェスタンブロットで測定する。
実施例５：Ｎ−トリクロロアセチル（又はトリフルオロアセチル）保護シアル酸残基の細菌ＰＳへの生合成的な導入、及び、得られた被膜ＰＳのＰＳ−タンパクコンジュゲートワクチン調製のための使用
０．５ミリモル（１０８ミリグラム）の塩酸マンノサミンを０．５５ミリモルのメトキシドナトリウムを含んだ１０ミリリットルのメタノールに溶解し、４℃に冷却した。０．６ミリモルの無水トリクロロ酢酸（またはトリフルオロ酢酸エチル）を添加し、混合物を２時間攪拌した。反応の進行は反応混合物をシリカゲルＴＬＣプレートにスポットしてプレートをエチルアセテート、メタノール、水（５：２：１）で展開し、開始時点では存在したマンノサミンがヨード蒸気又はニンヒドリン試薬と共に熱処理にって消失するのを検出することによってモニターした。反応の完了後、１．５ミリ当量のＡＧ５０１−８Ｘ混合ベッドレジン（ＢｉｏＲａｄ）と、１０ミリリットルの水が加えられ、必要に応じてＮａＯＨまたはＨＣｌを加えてｐＨを７に調整し、混合物を１時間おだやかに振盪した。溶媒の混合物とビーズを分離し、溶媒は凍結乾燥により除去した。必要に応じて、ＴＬＣのために記載されたのと同じ溶媒システムを使い、シリカゲルクロマトグラフィーによってさらに生成物の精製が実施された。所望の物を含む混合した画分の溶媒は、蒸発によって除去した。最終的に、乾燥した生成物を水中で再懸濁し、凍結乾燥した。
ＮｍＢ株Ｍ７のコロニーを新たに画線したチョコレート寒天プレートに播種し、ＯＤ６２０ｎｍで０．１になるまで一晩３７℃、５％の二酸化炭素中で増殖させ、それを５ミリモルのＮ−アシルマンノサシン、例えば、Ｎ−アセチル、トリクロアセチル、トリフルオロアセチルマンノサミンを追加したＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロスに稙菌することにより、トリハロアセチル化マンノサミンはＮｍＢ ＰＳに取り込まれた。Ｍ７株は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−６−ホスフェート ２ エピメラーゼをコードする遺伝子中に割り込むトランスポゾンを保持している（J. Swartley, J.S.and Stephens, D.S.,1994,J. Bact. 176:1530; Swartley,,,S.,Ahn,J.H. Liu, L-J,Kahler.C.M. and Stephens,D.S., 1996,J. Bact. 178:4）。この結果、増殖培地にＮ−アセチルマンノサミンが追加されないと細菌は被膜ＰＳを合成できなかった。従って、このシステムにおいて合成される被膜ＰＳのＮ−アシル含量は、増殖培地に供給されるＮ−アシルまたはＮ−アシルマンノサミンの混合物によって決定される。細菌は３７℃でＯＤ６２０ｎｍまで一晩、増殖させた。
大腸菌Ｋ１の変異体もＮｍＢ株の代わりに当該生産法において使用することができる。被膜ＰＳに欠損を持つ適切な大腸菌Ｋ１変異体は、例えば、機能的ｎｅｕＣ遺伝子産物の発現をノックアウトすることによって作製することができる。ｎｅｕＣはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−６−ホスフェート ２ エピメラーゼをコードするが、この遺伝子に欠損を持つ大腸菌株は被膜ＰＳを合成することができないので、ＰＳ誘導体の生産方法における使用に適している。
トリハロアセチル基を含む被膜ＰＳの生成は、Ｍ７産生株の被膜ＰＳの有無を検出するために、ｍＡｂ ＳＥＡＭ１２（Granoff et al.(1998) J Immunol 160, 5028-36）を用いて、蛍光顕微鏡で測定することができる。結果は、図３７に示してある。Ｎ−アセチルマンノサミンを追加したＭ７とＳＥＡＭ１２との結合は、図３７（パネルＡ）に示されており、結合は、ローダミンラベル二次抗体（Zymed）の検出される赤色蛍光（図中灰色の斜線）によって示される。Ｎ−アシルマンノサミンがないか、またはＮ−トリクロアセチルマンノサミンの追加ではＳＥＡＭ１２のＭ７との結合はなかった（図３７、パネルＢ及びＣ）。大きなサイズのトリクロロメチル基が結合壊すため、ＳＥＡＭ１２は、トリクロロアセチル基を含む被膜ＰＳと結合しなかった。しかしながら、トリフルオロメチル基はＮ−アセチル誘導体のメチル基と同じサイズに近いため、ＳＥＡＭ１２はＮ−トリフルオロアセチル基を含む被膜ＰＳとは結合する（図３７、パネルＤ、図中の灰色の斜線）。
多糖は、GuoおよびJenningsによって記載されているように、増殖培地から精製された(Guo,Z.and Jennings, H. In 2001.In Meningococcal Vaccines: Methods and Protocols. A. J. Pollard, and C. J. M. Maiden, eds. Humana Press Inc.,‘Totawa, N.J. p41)。精製された多糖は、前述のように還元的アミノ化によって酸化され、担体タンパク質、または脂質アミンにコンジュゲートされ、トリハロアセチル基はホウ化水素ナナトリウムの還元によって除去された。最終生成物は前述のように、サイズ排除クロマトグラフィーで精製され、ＰＢＳに透析され、凍結乾燥された。
実施例６：Ｎ−トリクロロアセチル（又はトリフルオロアセチル）保護シアル酸残基のガングリオシドへの生合成的な導入、及び、得られたガングリオシドのタンパク質コンジュゲートワクチン及び外膜ベシクルワクチン調製のための使用
１ｇの塩酸マンノサミン（４．５ｍｍｏｌ）を等量のナトリウムメトキシドを含んだ５０ｍｌのメタノールに溶解し、４℃に冷却した。５．１ミリモルの無水トリクロロ酢酸（またはトリフルオロ酢酸エチル）を添加し、混合物を２時間攪拌した。ｐＨを〜８に維持するために必要ならば、さらに、ナトリウムメトキシドを添加した。反応の進行は反応混合物をシリカゲルＴＬＣプレートにスポットしてプレートをエチルアセテート、メタノール、水（５：２：１）で展開し、開始時点では存在したマンノサミンがヨード蒸気と共に消失するのを検出することによってモニターした。反応の完了後、溶媒は蒸発により除去した。残った固体を５ｍｌのメタノールで粉砕し、Ｎ−トリハロ酢酸誘導体をメタノール／クロロホルムから結晶化した。
ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞を２４５ｍｍ×２４５ｍｍ四方のバイオアッセイディッシュ（Corning）上でコンフルエントに近い状態まで生育させた。成長培地（５ｍＭグルタミン酸、 １ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１０％胎児ウシ血清、及び抗生物質を添加したＲＰＭＩ）をトリクロロアセチルマンノサミン（５ｍＭ）を含む成長培地に２４時間変えて、細胞を３回ＰＢＳで洗浄後、蒸留水中での低張ショック（１時間、４℃）により溶解させた。その後、ドライアイス上のエタノール／３７℃水浴を使用して、３サイクルの凍結／融解を行った。粗膜画分を４５００ｇで２０分間４℃で遠心して沈殿にした。沈殿は凍結乾燥し、脂質をメタノール／クロロホルム（体積辺り１：２，１：１，２：１）で３０分間ステップワイズに洗浄して抽出した（Geilen et al 1992, Arch. Biochem. Biophys. 296, 108-114）。有機相を酸素フリーの窒素ガスの定常蒸気で乾燥させ、２００μｌのクロロホルム／メタノール／０．０２％ＣａＣｌ２（５０：４０：１０）中に再懸濁させた。
脱Ｎ−アシルＧＭ３及びＧＤ３（Calbiochem）は、１ｍｇのガングリオシドを２ｍｌの２．５Ｍ水酸化テトラブチルアンモニウム及び３ｍｌブタノール中に懸濁させ、混合物を＞１００℃で４時間熱処理して調製した。混合物を室温にまで冷却した後、２ＭＨＣｌを添加してｐＨを約７に調整し、Ｎ２の蒸気下でブタノールを蒸発により除去した。残った水相をＰＢＳバッファーに対して透析し（１Ｋカットオフ透析チューブ）、ＥＬＩＳＡに対する抗原としてさらに修飾することなく使用した。
抽出物中及び化学的脱Ｎ−アシル化したＧＤの脂質を高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）上で分離し、ウェスタンブロッティングにより分析した。ガングリオシド抽出試料、トリクロロアセチル保護基を除去するためにホウ化水素ナトリウムで処理した（１ｍｇ／１００μｌ、室温で２時間）ガングリオシド抽出物、及び化学的に脱Ｎ−アセチル化したＧＤ３をアルミニウムで裏打ちされたシリカゲル６０ＨＰＴＬＣプレート（Merck）及びクロロホルム／メタノール／０．０２％ＣａＣｌ２（５０：４０：１０）中で活性化したプレート上にスポットした。ウェスタンブロッティングに使用したプレートは、乾燥させ、ヘキサン／クロロホルム（２１：８）中の０．４％ポリイソブチルメタクリレート中に１分間、短時間浸した。プレートを、０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳバッファー中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした。同じブロッキングバッファー中でＭＡｂｓ（５μｇ／ｍｌ）とプレートを４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳバッファーで３回洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中でヤギ抗マウスＩｇ−ＨＲＰコンジュゲート（Zymed）とインキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄後、基質（ＨＲＰ Chemiluminescence Reagent Plus、Perkin-Elmerより入手）をプレートを現像するために添加した。蛍光イメージをフィルム上に記録した。
抗脱Ｎ−アシルＧＤ３ｍＡｂと化学的又は生合成的に調製した脱Ｎ−アセチルシアル酸ガングリオシドとの反応性を評価するため、ＧＡＧ２（レーン１−３、図３８）又はＳＥＡＭ３（レーン４−６、図３８）を用いてウェスタンブロットを行った。ＧＡＧ２は、脱Ｎ−アシルＧＤ３を含む髄膜炎菌の外膜ベジクル（ｓｉａＤ遺伝子が不活性化されている株Ｈ４４／７６）でマウスを免疫することにより脱Ｎ−アシルＧＤ３（実施例９）に対して調製したマウスモノクローナル抗体（ＩｇＭ）である。該ベジクルは下記のようにして調製された。ＧＡＧ２は脱Ｎ−アシルＧＤ３には結合するが、再Ｎ−アセチル化ＧＤ３には結合しない。レーン１及び３は、水素化テトラブチルアンモニウムのＧＤ３処理（即ち、化学的脱Ｎ−アシル化）により得られる。レーン２、３、５及び６は、Ｎ−トリクロロアセチルマンノサミン（即ち、ガングリオシドを含有する生合成的Ｎ−保護シアル酸）を追加した培地において生育させたＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞から抽出したガングリオシドである。レーン２及び５の脂質抽出物は、脱Ｎ−アセチルシアル酸ガングリオシドの生成のためトリクロロアセチル保護基を除去するためにＮａＢＨ４で処理した。レーン３及び６にはＮａＢＨ４で処理していない同一の脂質抽出物が含まれる。ＳＥＡＭ３はアルカリ処理によって生じる任意の脱Ｎ−アシルガングリオシドとは反応しない。ＧＡＧ２は、溶媒のフロントと共に移動する生合成的に調製された脱Ｎ−シアル酸ガングリオシドと反応するが（レーン２）、ＳＥＡＭ３はそれと異なるより遅い移動の脱Ｎ−アセチルガングリオシド誘導体と反応する（レーン５）。両方のｍＡｂｓとレーン３及び６の脂質抽出物との反応性の欠如は、Ｎ−トリクロロアセチル保護基が、単離過程中、無傷のままであり、脱Ｎ−アセチルシアル酸ガングリオシド誘導体がＮａＢＨ４による保護基の除去後に生じることを示す。
図３８の結果は、ＳＥＡＭ３が、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞上にＮ−トリクロロアセチル保護ガングリオシドの生合成によって生産され、ＮａＢＨ４で保護基が除去された脱Ｎ−アセチルシアル酸ガングリオシドとは結合するが（レーン５）、保護された誘導体（レーン６）又は化学的に合成ｌされた脱Ｎ−アシル化ＧＤ３（レーン６）とは結合しないことを示す。さらに、アルカリ処理で調製された脱Ｎ−アシル化ＧＤ３に特異的なｍＡｂ（ＧＡＧ２）は、異なる、より速く移動するＮａＢＨ４処理ＳＫ−ＭＥＬ２８脂質抽出物中の誘導体と反応する。従って、ここに記述される方法は、脱Ｎ−アセチルシアル酸残基を認識し、脱Ｎ−アセチルシアル酸抗原を発現する癌細胞に対する細胞障害性機能的活性を持つＳＥＡＭ３などの、Ａｂｓと反応する、ワクチン及び診断抗原としての使用のためのガングリオシド誘導体を選択的に調製するために使用することができる。
実施例７：ｄｅＮＡｃＳＡ抗原・・・Ｎ−アセチル及び脱Ｎ−アセチルシアル酸残基の混合物を有するガングリオシド誘導体の調製
ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞中での生合成によって取得されるＮ−トリクロロアセチル／Ｎ−アセチルシアル酸ガングリオシドを、クロロホルム／メタノール／０．０２％ＣａＣｌ２中に溶解させた。Ｎ−トリクロロアセチルアミン保護基をホウ化水素ナトリウム（１ｍｇＮａＢＨ４／１０ｍｇ粗脂質抽出物）で還元することにより除去した。反応液から沈殿されたホウ酸カルシウムは、遠心によって除去された。脂質誘導体をＨＰＴＬＣで分離した。ＳＥＡＭ３と反応する物質を含むバンドをプレートから掻き出し、クロロホルム／メタノール（１：１）で抽出した。遠心でシリカゲルを除去した後、抽出したバンドから溶媒をＮ２下で乾燥させた。
外膜ベジクルは、シアリルトランスフェラーゼ遺伝子ｓｉａＤが不活性化された髄膜炎菌グループＢ株Ｈ４４／７６から調製した。Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロース中で０．６のＡ６２０ｎｍまで生育させた１リットルのＨ４４／７６細胞を１０，０００×ｇで３０分間遠心して沈殿させた。細胞沈殿物は、１０ｍＭＥＤＴＡ及び０．５％ＤＯＣを含む０．１ＭＴｒｉ−ＨｃＬ，ｐＨ８．６中に、バッファーとバイオマスの比率が５：１（ｖ／ｗ）となるように再懸濁させた。遠心後（２０，０００×ｇ；３０分間；４℃）、上清を回収し、１／３の体積に減らしたバッファーで抽出を繰り返した。上清を混合し、超遠心後（１２５，０００×ｇ；２時間；４℃）、ＯＭＶ沈殿を２ｍＭＥＤＴＡ、１．２％ＤＯＣ及び２０％ショ糖を含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．６に再懸濁させた。タンパク質濃度は標準的なタンパク質アッセイ法（ＢＣＡ，ＢｉｏＲａｄ）を用いて決定した。ベジクルの調製物及びＥｍｐｉｇｅｎ（１％ｗ／ｖ；Calbiochem）を脂質フィルムに加え、バスソニケーター（Branson）で３０分間ソニケートし、一晩、４℃で攪拌した。その後、混合物をＰＢＳバッファー中に５日間完全に透析した。得られたＯＭＶ／ガングリオシド複合体を滅菌フィルターで都下し、ワクチン化に使用するまで凍結させた。
実施例８：Ｎ−トリハロアセチル／Ｎ−アセチルシアル酸ガングリオシドタンパク質コンジュゲートワクチンの調製
ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞中のＮ−トリハロアセチル／Ｎ−アセチルシアル酸ガングリオシドの生合成に由来する粗脂質画分は、ＨＰＴＬＣによって精製し、Ｎ−トリハロアセチル／Ｎ−アセチルシアル酸ガングリオシド誘導体は実施例７に記述するように、プレートから抽出した。遠心により、シリカゲルを除去した後、スフィンゴシン二重結合のオゾン分解によりガングリオシド中にアルデヒド基を生成させた。アルデヒドは逆相ＨＰＬＣ（Waters Bondpak C18 Microbore）で精製し、シアン化ホウ化水素ナトリウムによる還元的アミノ化によって破傷風毒素にカップリングさせた。過剰量のホウ化水素ナトリウムを同じ反応中に添加し、Ｎ−トリハロアセチル保護基を除去した。反応混合物をＰＢＳバッファー中で透析し、滅菌フィルターでろ過後、免疫化に使用するまで凍結させた。
実施例９：ＳＥＡＭ３ＭＡＢの精製
固体の硫酸ナトリウム（Sigma-Aldrich Chemical Co., Saint Louis, MO）を、最終濃度０．５ＭになるようにＰＢＳバッファー中のＳＥＡＭ３（抗体濃度はおよそ３０μｇ／ｍｌ、抗体捕獲アッセイで測定した（SouthernBiotech, Birmingham,Al））溶液に添加した。固体硫酸ナトリウムを完全に溶解した後、溶液をおよそ１８時間４℃でインキュベートした。この溶液を遠心し（１０，０００×ｇ）、沈殿を除去してろ過（０．２μ）した。その後、抗体を、０．５Ｍ硫酸ナトリウムを含むＰＢＳバッファーで平衡化したToyoperal Hw55Fカラム（Supelco, Bellefonte, PA;1.5mm x 25mm）でサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。活性のある抗体を含む画分は、固相抗原としてのＮ−プロピオニルＮｍＢ ＰＳドデシルアミン（上掲を参照のこと）を用いてＥＬＩＳＡ、及びアルカリホスフェートコンジュゲートウサギ抗−マウスＩｇＡ，Ｇ，Ｈ（Ｈ及びＬ）（Zymed, South San francisco, CA）、及び４−ニトロフェニルホスフェート基質（Sigma-Aldrich）による現像による検出により測定した。活性のある抗体を含む画分を混合し、ＰＢＳに対して透析し、滅菌フィルター（０．２μ）でろ過し、４℃で保存した。精製した抗体の濃度は、抗体捕獲アッセイ（Southern Biotech）によって決定した。
精製したＳＥＡＭ３を以下の実施例において使用した。
実施例１０：癌細胞中におけるＳＥＡＭ３反応性抗原の存在及び正常細胞中における不存在
正常メラノサイトとメラノーマ腫瘍細胞間におけるＳＥＡＭ３反応性抗原の発現に違いがあるかどうか調べるため、各タイプの組織の薄層切片の免疫染色を行った。ＳＥＡＭ３に加え、コントロールには、２次抗体のみ、及び正常メラノサイト中に発現し、ある腫のメラノーマで過剰発現するガングリオシドＧＤ３と結合するＲ２４（Dippold et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 1980. 77(10): 6114-8.; Graus, et al., Brain Res, 1984. 324(1): 190-4; Houghton et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 1985. 82(4):1242-6; Panneerselvam et al. J Immunol, 1986.136(7): 2534-41; Real et al. Cancer Res, 1985. 45(9): 4401-11; Vadhan-Raj et al. J Clin Oncol, 1988. 6(10): 1636-48; Welt t al. Clin Immunol Immunopathol, 1987. 45(2): 214-29）が含まれた。
組織切片は正常皮膚（HuSkinTb111 図３９）及び２つのヒトメラノーマ（HuMel1151及びHuMel4034）凍結試料から作製された。脱Ｎ−アセチル抗原をブロッキングし又は抗原を含む脂質を抽出する可能性を防ぐために、切片は凍結組織から調製され、スライドの上で乾燥させたが、アルデヒド又は有機溶媒では固定しなかった（Chammas et al. Cancer Res, 1999. 59(6): 1337-46）。内在性のペルオキシダーゼを０．０３％過酸化物中で３０分間インキュベーションすることで除去し、その後、バッファーで洗浄し、内在性ビオチンをＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ（Burlingame, CA）のアビジン／ビオチンブロッキングキットを用いてブロックした。コラーゲンに対する非特異的結合は、１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロックした。その後、ＢＳＡ又はｍＡｂｓ Ｒ２４又はＳＥＡＭ３を加湿チャンバーでインキュベートした。結合しなかった抗体をバッファーのリンスにより除去した。その後、結合した抗体はＤＡＫＯ ＬＳＡＢキットを用いて指示書に従って検出した（Thermo Fisher Science, Waltham, MA）。さらに洗浄した後、核をＭａｙｅｒ’ｓ ｈｅｍａｔｏｋｙｌｉｎ（Vector Labs）を用いて対比染色した。
４００×倍率の結果を図３９に示す。正常ヒト皮膚の免疫染色は、抗ＧＤ３ ｍＡｂ Ｒ２４が皮膚の真皮中のある神経ツイッグ（ｔｗｉｇｓ）の他、メラノサイト（矢印）を同定することを示す。ＳＥＡＭ３は真皮の神経様構造中の抗原と結合するが、メラノサイト中には存在しない。２つのメラノーマの染色は、Ｒ２４が全部ではないがいくつかの細胞と強く反応することを示す。これに対し、ＳＥＡＭ３染色は弱いながら、黒い斜線部分で示されるようにほぼ全てのメラノーマ細胞が染色される。ＳＥＡＭ３染色はメラノーマ細胞中において顆粒状かつ細胞内に認められるようである。従って、ＳＥＡＭ３によって認識される抗原は正常メラノサイト中では検出できる程度には存在しないが、ヒトメラノーマ腫瘍には存在する。蛍光顕微鏡及び、以下に記述するように、ＳＫ−ＭＥＬ−２８メラノーマ、ＣＨＰ−１３４神経芽細胞腫及びジャーカット細胞（急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病）に対する細胞障害性によれば、その抗原は成長のある段階において細胞表面上に存在する（データは示さず）。ＳＥＡＭ３の細胞障害効果は、各細胞タイプで観察され（ＳＫ−ＭＥＬ−２８メラノーマ、ＣＨＰ−１３４神経芽細胞腫及びジャーカット細胞）、細胞表面上の抗原存在レベルはほぼ比例していた。
実施例１１：ヒト腫瘍由来のホルマリン固定パラフィン包埋組織切片と結合するＳＥＡＭ３
ＳＥＡＭ３によって認識される抗原の最初の免疫組織化学分析は、脱Ｎ−アセチルアミノ基がホルムアルデヒドとの反応によってブロックされることをおそれて（上掲を参照のこと）、非固定組織上で行った。次いで、脱Ｎ−アセチルシアル酸のアミノ基が、Ｃ１カルボキシ基とかなり近接している結果、比較的不反応性であることが明らかとなった。従って、ＳＥＡＭ３反応性抗原の存在に関するヒト腫瘍のラージスケールのスクリーニングを、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を用いて行ったが、それはこの方法による試料の処理は、細胞構造の特徴をかなり改善するからである。
ヒト組織マイクロアレイをＵＳ ＢｉｏＭａｘ（Rockville, MD）から入手した。組織マイクロアレイは、キシレン中（１０分頃に２回交換）で脱パラフィン後、連続的に５分間１００％エタノール、９５％エタノール、７０％エタノール、５０％エタノール及びＰＢＳバッファーで洗浄することにより再水和した。内在性ペルオキシダーゼをＰｅｒｏｘｉｄａｚｅｄ １溶液（Biocare, Concord, CA）でインキュベートしてブロックした。切片は、ストレプタビジンを含むＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（Biocare）でブロックし、ＰＢＳバッファーでリンスした。１次抗体（精製ＳＥＡＭ３（後掲を参照のこと）、関連性のないＩｇＧ２ｂ、など、１から５μｇ／ｍｌの濃度で）をＤａ Ｖｉｎｃｉ Ｇｒｅｅｎ希釈バッファー（Biocare）中で希釈し、各々４℃で一晩又は室温で１時間インキュベートした。スライドは、各々、ＰＢＳバッファーで１０分間３回洗浄し、ビオチンコンジュゲートウサギ抗マウスＩｇＧ２次抗体（５μｇ／ｍｌ、Vector Labs, Burlingame, CA）とインキュベートした。各々ＰＢＳバッファーで１０分間３回洗浄した後、ホースラディッスペルオキシダーゼ−ストレプタビジンコンジュゲート（Vector Labs）を加えて、室温で３０分間インキュベートした。スライドを各々ＰＢＳバッファーで１０分間３回洗浄し、色の発色のために過酸化水素を含むＡＥＣ基質（Vector Labs）でインキュベートした。色の発色は、試料に依存して３０秒から３０分間行わせ、水による洗浄により停止させ、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＱＳ（Vector Labs）で対比染色し、水でリンス後、最後にＶｅｃｔｏｒ Ｍｏｕｎｔ ＡＱ水溶性マウント溶剤中でマウントし、顕微鏡下（Zeiss Axioplan）で観察／写真撮影を行った。
４７のヒトの腫瘍に対する結果を図４０にまとめた。テストを行った全ての腫瘍及び正常組織はアイソタイプが一致するが関連のないコントロールｍＡｂ（マウスＩｇＧ２ｂ、Soutern Biotech）との結合はネガティブであった。染色の強度及び染色される細胞数は、腫瘍試料において、非染色（「−」で示す）から全ての細胞が暗染色される（「＋＋＋」出示す）の範囲にわたり、端から端の間で変動した。テストした腫瘍試料のほとんどは、ＳＥＡＭ３（４７のうち３８）結合に関しポジティブであり、多くの腫瘍タイプに存在した。典型的には、腫瘍細胞において観察されるＳＥＡＭ３結合の結果生じる染色は、「顆粒状」の外観を示し、細胞構造と一致している。正常組織のマイクロアレイもテストした。通常、「正常」組織試料は、腫瘍と同じ患者から取得したが、原発腫瘍のマージンの外側の領域から取得した。全ての正常組織（１７試料）は、コントロールｍＡｂとの結合についてはネガティブであった、ＳＥＡＭ３は１７試料のうち１５に対し、＋から＋＋の範囲で結合に関しポジティブであった。しかし、腫瘍組織で観察とは異なり、正常組織中におけるＳＥＡＭ３結合から得られる染色は、顆粒状ではなく、均一であり、わずかな細胞を除いて細胞構造とは一致しておらず、間質組織と連続的である。現時点で、この染色像の相違は、分かっていない。
実施例１２：蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリーによるヒトメラノーマＳＫ−ＭＥＬ−２８、及び神経芽細胞腫のＣＨＰ−１３４に結合するＳＥＡＭ３
ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞（Carey et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 1976. 73(9): 3278-82）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。細胞を通常通り０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１．０ｍＭピルピン酸ナトリウム、０．１ｍＭグルタミン酸塩、ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％胎児ウシ血清を含むＲＰＭＩ１６４０中で、３７℃、９５％空気：５％ＣＯ２下にて生育させた。コンフルエント細胞を、０．２５％（ｗ／ｖ）のトリプシン／０．５３ｍＭＥＤＴＡ溶液で処理し、洗浄し、新しい培地中に再播種する前にバラバラにしてサブカルチャー（１：３〜１：８）した。ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞は、ＡＴＣＣストック細胞から１０パッセージまでのもののみを使用した。これらの細胞はガングリオシドと反応ＧＤ３を発現する。
ヒトＴ細胞白血病細胞株ジャーカット（Schneider et al. Int J Cancer, 1977.19(5):; Schneider et al. Haematol Blood Transfus, 1977. 20:）を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０中で、５％ＣＯ２下、３７℃で生育させ、３日毎に約１：５の植え継ぎ率でサブカルチャーした、細胞は、遠心（５００ｇ）により回収し、サブカルチャーの前に新しい培地中に再懸濁した。細胞は以下のＣＤ抗原発現についてポジティブである：ＣＤ２，ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ５，ＣＤ６，ＣＤ７，ＣＤ３４、また、ＣＤ８，ＣＤ１３，ＣＤ１９，ＴＣＲα／β，ＴＣＲγ／δの発現についてはネガティブである。
ＣＨＰ−１３４神経芽細胞腫細胞（Livingston et al. J Biol Chem, 1988. 263(19):9443-8）は通常通り０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１．０ｍＭピルピン酸ナトリウム、０．１ｍＭグルタミン酸塩、ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％胎児ウシ血清を含むＲＰＭＩ１６４０中で、３７℃、９５％空気：５％ＣＯ２下にて生育させた。コンフルエント細胞は、Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｐｅｒｓａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（CDR, Guava Technologies, Haywood, CA）で処理し、新しい培地中に再播種する前にバラバラにしてサブカルチャー（１：３〜１：５）した。これらの細胞は、長鎖シアル酸（即ち、ポリα２−８Ｎ−アセチルノイラミン酸）で修飾された神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）を発現する。
細胞表面へのＳＥＡＭ３の結合を観察するために、接着ＣＨＰ−１３４又はＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞（およそ１０５細胞）をポリＬリジン（Nunc）で処理されたマルチウェル顕微鏡スライド上で培養した。一晩のインキュベーションの後、細胞をＰＢＳで穏やかに洗浄し、氷冷した１％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドで固定した。２０分後、細胞は、非特異的結合を３％ヤギ血清溶液で１時間ブロッキングする前に、ＰＢＳで洗浄した。細胞の内部に存在するＳＥＡＭ３反応性抗原の存在を観察するために、細胞を３％ヤギ血清中、トリトンＸ−１００、０．５％ｗ／ｖで１時間処理した。１次抗体を添加し、２時間又は一晩４℃でインキュベートした。細胞を、穏やかに連続的に（少なくとも２回）氷冷ＰＢＳで洗浄した後、Alexa Fluor 488(蛍光及び共焦点), Alexa Fluor 546(共焦点)、Alexa Fluor 594(蛍光), Alexa Fluor 633 (共焦点)で各々コンジュゲートしたアイソタイプ特異的な、２次抗体（ヤギで生産される）を暗所で、４℃、少なくとも１時間反応させた（全てのフルオロフォアと結合した２次抗体は、Invitrogen, Carlsbad, CAから入手した）。さらなる連続的な穏やかな洗浄の後、ＤＡＰＩを含む固化マウンティング溶剤を適用した。
免疫蛍光像はデジタルカメラを備えたZeiss Axioplan Fluorescence Microscpeで観察した。共焦点像は、Biological Imaging Facility, University of California, Berkeley, CA におけるZeiss Meta510 CLSMを用いて観察し、ImageJソフトウェア（NIH）を用いて解析した。使用したコントロール抗体と２次抗体は、通常通り、バックグラウンドの蛍光を評価するために使用した。ＧＤ３に特異的なポジティブコントロールｍＡｂであるＲ２４は、ＳＫ−ＭＥＬ−２８との結合に関しポジティブであったが、ＣＨＰ−１３４神経芽細胞腫（Livingston et al. J Biol Chem, 1988. 263(19): 9443-8）及びＧＤ３を発現していないジャーカットＴ細胞白血病細胞との結合についてはネガティブであった（データは示さず）。
図４１及び図４２は、共焦点顕微鏡によって観察した、ＳＫ−ＭＥＬ−２８メラノーマ細胞とＣＨＰ−１３４細胞に結合するＳＥＡＭ３から生じる細胞表面上の蛍光（図中の暗斜線）を示す。図４３は、蛍光顕微鏡によって観察した、ジャーカット細胞と結合するＳＥＡＭ３を示す。各場合において、蛍光は細胞表面一面に均一である。しかし、視野中の全ての細胞が、ＳＥＡＭ３結合を示すわけではない。接着ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞とＣＨＰ−１３４細胞に関し、ＳＥＡＭ３ポジティブな細胞は、ＳＥＡＭ３ネガティブ細胞と形態学的に異なる。ポジティブ細胞は丸くなっているが、ネガティブ細胞は伸展している。培養（３７℃、９５％空気：５％ＣＯ２）中のＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞のコマ撮り写真を用いて、丸い細胞が死細胞ではなく、細胞分裂を行っていることを確認した。細胞は、娘細胞に分裂する前、およそ３時間球状のままであった。
ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞がＧＤ３ガングリオシドを過剰発現し、抗ＧＤ３ｍＡｂ Ｒ２４による結合に関しポジティブであることが留意される。ＣＨＰ−１３４細胞はＧＤ３ネガティブで、Ｒ２４ｍＡｂには結合しない。さらに、ＣＨＰ−１３４細胞はＧＤ３を発現しないので、任意の脱Ｎ−アセチル化ＧＤ３誘導体も産生しない。ＳＥＡＭ３はＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞とＣＨＰ−１３４細胞の両方と結合するため（実際は、ＣＨＰ−１３４細胞とより強く結合する）、これらのデータは、ＳＥＡＭ３がＧＤ３又はＧＤ３誘導体以外の抗原と結合することを示す。さらに、ＳＥＡＭ３は、Ｎ−ＣＡＭを発現しないＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞と結合するので、ポリシアル酸由来の抗原とは結合しない。従って、ＳＥＡＭ３はＧＤ３又はＮ−ＣＡＭ以外の抗原と結合する。
実施例１３：フローサイトメトリーによるＳＫ−ＭＥＬ−２８メラノーマ、ジャーカット細胞白血病及びＣＨＰ−１３４神経芽細胞腫細胞と結合するＳＥＡＭ３
細胞（およそウェルあたり１０５）を９６ウェルの平底組織培養プレート（Nunc）上にプレーティングし、アッセイの前に一晩、成長培地でインキュベートした。細胞は、９６ウェル丸底プレートに回収する前に、トリプシン（ＳＫ−ＭＥＬ−２８）又はＣＤＲ（ＣＨＰ−１３４）のいずれかによりプレートから剥がし、５００ｇで５分間スピンし、氷冷１％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドで固定した。２０分後、細胞を遠心により沈殿化し（上述）、トリトンＸ−１００（０．５％（ｖ／ｖ））の有る無しで、３％（ｖ／ｖ）ヤギ血清のブロッキング溶液でインキュベートした。１次抗体を加えた後、２時間又は一晩、４℃でインキュベートした。細胞は氷冷ＰＢＳで、沈殿化と再懸濁を２回繰り返して洗浄した。２次抗体（Invitrogen、上述）を少なくとも１時間４℃、暗所にてインキュベートした。さらに一連のスピンと洗浄（３回）の後、結合をGuava EastCycleフローサイトメトリーで解析した。コントロール試料をアイソタイプは同一だが関連性はなく、蛍光のベースラインを形成するために使用される抗体（Southern Biotech）又は、細胞によって発現される抗原と特異的に反応するポジティブコントロールｍＡｂｓ（即ち、ＳＫ−ＭＥＬ−２８について抗ＧＤ３、及びＣＨＰ−１３４細胞に関し抗ＮＣＡＭ）により処理した。さらに、結合の特異性は、細胞にｍＡｂｓを加える前に５０μｇ／ｍｌのＮ−Ｐｒ ＮｍＢ ＰＳとＳＥＡＭ３をプレインキュベートすることにより、ジャーカット細胞に対して示された。
図４４−４６に示されるように、ＳＥＡＭ３は全ての３つの細胞株（−トリトン）表面と結合する。最も多い結合量は、ＣＨＰ−１３４細胞（図４５）について観察され、ジャーカット細胞（図４６）で最も少なかったが、ジャーカット細胞への結合は、まだ有意であった。全ての３つの細胞株には、多くの量の内在性ＳＥＡＭ３反応性抗原が含まれている（＋トリトン）。
実施例１４：癌細胞の生存可能性に対するＳＥＡＭ３結合の影響
ＳＥＡＭ３又はコントロールｍＡｂｓ（関連性のないアイソタイプＴｇＧ２ｂ又は抗体ＧＤ３、Ｒ２４）の存在下でインキュベートしたＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞の細胞生存可能性は、ViaCount Reagent（Guava Technologies, Hayward, CA）を用いて、製造社による指示書のように決定した。簡単には、ｍＡｂｓと４８時間インキュベートした細胞を組織培養プレートから剥がし（結合アッセイについて活性上述したように）、遠心で回収し、ViaCount Reagentに再懸濁した。生存可能性はGuava EasyCyteフローサイトメトリーに予め設定されたプログラムを用いて解析した。プログラムはアポトーシスのために予め設定されたゲートを持ち、通常通り、本研究に取り込まれた。図４７に示すように、ＳＥＡＭ３は、ｍＡｂとの２４時間インキュベーション後、ＳＥＡＭ３は、関連の無いＩｇＧ２ｂコントロールｍＡｂと比較して、生存細胞数を減少させる（＊＊＊はＰ＜０．００１を示す）。図４８に示される第２の実験において、ＳＥＡＭ３は、ＩｇＧ２ｂコントロールｍＡｂと比較して（＊はＰ＜０．０５を示す）、生存細胞数を減少させ、アポトーシス細胞（Ｐ＜０．０５）及び死細胞（Ｐ＜０．０１）を増加させる。同様に、ポジティブコントロールｍＡｂ、Ｒ２４は、ネガティブコントロール細胞と比較して、生存細胞の数を減少させ（＊＊はＰ＜０．０１を示す）、アポトーシス細胞（Ｐ＜０．０１）及び死細胞（Ｐ＜０．００１）を増加させる。この結果は、ＳＥＡＭ３の細胞表面への結合がアポトーシスを誘導し、細胞死を増加させることを示す。
実施例１５：Ｋｉ−６７抗原の発現によって測定されるＳＥＡＭ３の結合と細胞増殖との相関
前記データは、ＳＥＡＭ３が細胞分裂のあるステージにおける癌細胞表面に結合する事を示した。このことを示すために、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞をＳＥＡＭ３結合とＫｉ−６７抗原の発現に関し解析したが、ここで、Ｋｉ−６７は細胞増殖マーカーである（Brown et al. Histopathology. 2002, 40:2-11）。細胞をトリトン不存在下におけるＳＥＡＭ３結合を測定するために使用したのと同一の方法で処理した。非結合ＳＥＡＭ３を洗い流した後、細胞を抗Ｋｉ−６７抗体の侵入を可能ならしめるため、０．５％トリトンを含む３％（ｖ／ｖ）ヤギ血清で処理した。１時間、４℃の後、抗Ｋｉ−６７を加え、氷上で２時間インキュベートした。その後、細胞を遠心で回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、２つの蛍光標識したヤギ抗マウス２次抗体抗体ＩｇＧ２ｂ−Alexa Flour 594（Invitrogen）；抗IgM-Alexa Flour 488（Invitrogen）、を加えた。さらに洗浄した後、細胞をGuava EasyCyteフローサイトメトリーで解析した。
細胞が対数増殖期にある場合、およそ２０％の細胞がＳＥＡＭ３反応性抗原をその表面上発現し（フローサイトメトリー及び蛍光顕微鏡のデータによる）、２０−２５％が増殖マーカのＫｉ−６７を発現する（フローサイトメトリーのデータによる）ことが明らかとなった。図５０に示されるように、Ｋｉ−６７とＳＥＡＭ３反応性抗原の両方をその表面上に発現する細胞集団（およそ１１％）が存在する。しかし、Ｋｉ−６７（１２％）のみ及びＳＥＡＭ３反応性抗原のみ（１３％）を発現する一定の細胞が存在する。Ｋｉ−６７抗原の検出は、癌の生検試料中のアクティブに分裂している腫瘍細胞のパーセンテージを測定するために使用することができるであろう（Brown et al. Histopathology. 2002, 40:2-11）。本調査を通じて得られた株は、「Ｓ期」、成長、又は増殖画分と言われる（Brown et al. Histopathology. 2002, 40:2-11）。実際、Ｋｉ−６７は「Ｓ期」から少なくとも終期までの増殖を通じて存在する。フローサイトメトリー二重標識実験（図５０）は、細胞表面上のＫｉ−６７及びＳＥＡＭ３反応性抗原の発現がオーバーラップすることを示し、また、少なくとも一定の部分において、表面上におけるＳＥＡＭ３反応性抗原の発現が細胞分裂の一定の後期に関与するかもしれないことを確認する。
さらに、細胞成長に対するＳＥＡＭ３ｍＡｂの影響を評価するため、ＳＥＡＭ３で処理後の細胞周期のステージを測定した。この実験において、細胞を細胞周期の色々なステージにある細胞集団、及び添加したコントロール抗体、ノコダゾール（細胞を核分裂期に停止させる薬剤）及びＳＥＡＭ３の影響を特徴付けするために蛍光ＤＮＡ結合色素であるヨウ化プロピジウムで染色した。
およそ１０５のＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞を９６ウェル組織培養プレートにプレーティングし、接着させた。２４時間後、培地を抗体又は薬剤のいずれかを含むものと交換し、さらに４８時間インキュベートした。細胞をスピンし（剥がれた全ての細胞を回収するため）、７０％の氷冷メタノール（１滴づつ滴下する）で３０分間、４℃で固定した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＤＮＡのみが染色されることを保証するために、固定した細胞をリボヌクレアーゼＩ（１００μｇ／ｍｌ、ソース）で３０分間、３７℃で処理した。ヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌ）を加え、試料をGuava EasyCyteフローサイトメトリーを用いて解析した。
図４９に示されるように、アイソタイプの一致するコントロール抗体と４８時間インキュベートした細胞は、多くの細胞（６８％）がＧ０期又は静止状態（非増殖）に存在するが、１０％は「Ｓ期」にあり、さらに１５％はＧ２／Ｍ期にあるプロファイルを示した。細胞のさらなる集団（およそ１０％）は、前Ｇ０期に存在した。この前Ｇ０期は、アポトーシスを暗示する。ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞は、ノコダゾール（１００ｎＭ）で４８時間処理することにより、Ｇ２／Ｍ期（核分裂期）に停止される（図４９）。この場合、およぼ５０％の細胞がＧ２／Ｍ期に停止した。これに対し、細胞をＳＥＡＭ３でインキュベートすると、Ｇ０、Ｓ期及びＧ２／Ｍ期の集団が減少するが、前Ｇ０期の数は増加する。
本データは、さらにＳＥＡＭ３がＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞の生存可能性を減少させるさらなる証拠を提示するが、このことは、抗体の影響が細胞の前Ｇ０期への導入を促進することであることを示唆する。興味深いことに、抗ガングリオシドＧＤ３抗体（Ｒ２４）で処理された細胞は、以前、メラノーマ細胞を殺傷することが示されていたが、核分裂期細胞数を増加させた。従って、細胞周期中断／アポトーシスメカニズムにおけるＳＥＡＭ３の作用機序は、Ｒ２４によって示されるものとは異なる。さらに、細胞周期に対する影響のこの違いは、ＳＥＡＭ３及びＲ２４が癌細胞上の異なるエピトープに結合するとの更なる証拠である。
実施例１６：ＳＥＡＭ３ＭＡＢをコードする核酸のクローニング及び配列決定
抗原認識に関する分子的基礎を調べるため、髄膜炎菌グループＢに対して殺菌性の５つの抗Ｎ−Ｐｒ ＮｍＢ ＰＳマウスｍＡｂｓの可変領域（Ｖ）遺伝子をクローニングし配列決定した。以下の材料と方法は、本実施例において使用された。
方法と材料
ｍＡｂｓ
抗Ｎ−Ｐｒ ＮｍＢ ＰＳマウスｍＡｂｓＳＥＡＭ２（ＩｇＧ３）、ＳＥＡＭ３（ＩｇＧ２ｂ）、ＳＥＡＭ１２（ＩｇＧ２ａ）、ＳＥＡＭ１８（ＩｇＧ２ａ）は、以前記述された４つの優れた抗原特異性グループの各々を代表する（Granoffet al. (1998) J Immunol 160, 5028-36）。ＳＥＡＭ３５（ＩｇＧ２ａ）は、他の４つのＳＥＡＭｍＡｂｓよりもより強くＣＨＰ−１３４ヒト神経細胞株によって発現されるポリシアル酸抗原と交差反応するため、これも含めた。該ｍＡｂｓは、補体の存在下において殺菌性を有し、髄膜炎菌に対し、幼生ラットモデルにおいて受動的な保護を与える。ＳＥＡＭ２とＳＥＡＭ３は、宿主ポリシアル酸との検出可能な自己反応活性を示さないが、ＳＥＡＭ１２とＳＥＡＭ１８は最小限の交差反応を示す。
ｄｓＮＤＡ ＥＬＩＳＡ
ｄｅＤＮＡと結合するｍＡｂはGilkeson et al. (1993) J Immunol 151, 1353-64によって記述された方法を用いて測定された。ポジティブコントロール抗ＤＮＡｍＡｂは、QED Biosciences（San Diego, CA）から入手し、アイソタイプは一致するが関連性のないｍＡｂｓはSouthern Biotech Inc.（Birmingham, AL）から入手した。
Ｖ遺伝子の配列決定
マウスハイブリドーマ細胞株由来の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子を縮重プライマーを用いてＰＣＲによって増幅し、ベクターpGEM3zf（Promega,Madison,WI）中に、Wang et al. (2000) J Immunol Methods 233, 167-77 によって記述されるように、大腸菌株ＸＬ−２Ｂｌｕｅを宿主としてクローン化した。ＬＢ−アンピシリンプレート上で選択される個々の形質転換体由来のプラスミドＤＮＡをQiagen MiniPrep（Qiagen）を使用し、製造者の指示書に従って単離した。クローン化されたＶ遺伝子はBioNexus(Oakland, CA)で配列決定した。
Ｖ遺伝子配列の解析
ｍＡｂヌクレオチド配列は、ＩＧＭＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ、及びMrie-Paule Lefranc(Universite Montpellier II, CNRS, LIGM, IGH, IFR3, Montpellier, France)によって開始され調整されたインターナショナルImMunoGeneTics（登録商標）インフォメーションシステムのオンラインウェッブ設備を介したマウス免疫グロブリンヌクレオチオ配列データベースを用いて解析した。予想される生殖系列遺伝子は、データベース中の生殖系列配列とクローン化したＶ遺伝子配列間における最も近い一致度に基づいて選択された。アミノ酸及び遺伝子配列の両方は、BLAST (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res 25, 3389-402)を用いて、GenBank非縮退排列データベース中の各配列に対して比較した。さらに、抗ＮｍＢ ＰＳマウスｍＡｂ、７３５（ＩｇＧ２ａ）を発現するハイブリドーマクローンによって使用される予想される生殖系列遺伝子は、文献から同定された。このｍＡｂアミノ酸配列のみが利用可能であるため（Klebert et al. 1993 Biol Chem Hoppe Seyler 374, 993-1000; Vaesen et al. (1991) Biol Chem Hoppe Seyler 372, 451-3）、このｍＡｂに対する予想された生殖系列遺伝子は、ＩＧＭＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ及びＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータベース(Chenna et al. (2003) Nucleic Acids Res 31, 3497-500)中で最も一致するアミノ酸配列に基づいている。我々は、また、我々の比較分析において、Berry et al. ((2005) MoI Immunol 42, 335-44)によって報告された抗ＮｍＢ ＰＳ ｍＡｂ２−２−Ｂ（ＩｇＭ, Mandrell et al. (1982) J Immunol 129, 2172-8）に関する、遺伝子配列及び生殖系列遺伝子評価を含めた。
結果
ＳＥＡＭ３重鎖及び軽鎖ポリペプチドの可変領域の核酸及びアミノ酸配列
ＳＥＡＭ３の重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの可変領域の核酸及びアミノ酸配列は、図５１に示される。図５２及び５３は、ＳＥＡＭ３の軽鎖及び重鎖可変領域ＤＮＡ配列を、各々、フレームワーク（例えば、ＦＲ１−ＩＭＴＧ；として示す；図５６−５８）及び、International Immunogenetics Information System (IMGT) の定義(Lefranc et al. IMGT, the international ImMunoGeneTics information systemR. Nucl. Acids Res., 2005, 33., D593- D597)によって定められるＣＤＲ領域と共に示す。
マウス抗Ｎ−Ｐｒ ＮｍＢ ＰＳ ｍＡｂｓの可変領域遺伝子の使用
抗Ｎ−Ｐｒ ＮｍＢ ＰＳと抗ＮｍＢ ＰＳ ｍＡｂｓに関する生殖系列遺伝子の使用は、図５５に示される表に比較される。それぞれのアミノ酸配列は図５０及び５１に示される。Ｖ遺伝子領域のレパートリーは、相対的にそれ程高くない関連ＶＬ又はＶＨ遺伝子ファミリーに制限される。例えば、ＳＥＡＭ２及びＳＥＡＭ３は、異なる優れた抗原特異性を示し、同一のＶＬアミノ酸配列（図５２）を有し、ＶＬ遺伝子は、自己反応性抗ＮｍＢ ＰＳ ｍＡｂｓ、２−２−Ｂ及び７３５（図５５）をコードするのと同一のファミリー遺伝子ファミリー（ＩｇＧＫＶ１）に由来する。同様に、ＳＥＡＭ１２及びＳＥＡＭ１８によって使用されるＶＬ遺伝子は、異なる優れた抗原特異性を有し、同一のファミリー（ＩｇＧＫＶ４）に由来する。ＳＥＡＭ３とＳＥＡＭ１８のＶＨ配列は、各々かなりの同一性を示し（９６％同一）、ＳＥＡＭ３５ＶＨ（図５５）に使用される同一の生殖系列ファミリー（ＩｇＧＨＶ７Ｓ３）に由来する。ＳＥＡＭ２及びＳＥＡＭ１２に対する生殖系列ＶＨ遺伝子は、各々異なり、他の３つの抗Ｎ−Ｐｒ ＮｍＢ ＰＳ ｍＡｂｓと異なるが、ＳＥＡＭ２に使用される生殖系列ＶＨ遺伝子は、２つの自己反応性抗ＮｍＢ ＰＳ ｍＡｂｓｍ２−２−Ｂ、７３５（双方７２％同一）に使用されるものと関連している。
抗ＮｍＢ ＰＳ ｍＡｂｓ、２−２−Ｂ及び７３５は、ＮｍＢ ＰＳと反応するが、抗Ｎ−Ｐｒ ＮｍＢ ＰＳ ＳＥＡＭ２は反応しない。従って、ＳＥＡＭ２と自己反応性ｍＡｂｓ２−２−Ｂ及び７３５（ＶＨ ７０％、ＶＬ ７５％）間の重鎖及び軽鎖Ｖアミノ酸配列の各々の近接した相同性は、興味深い。２つの配列間の最も著しい相違は、ｍＡｂ７３５の長さ８アミノ酸に比べると、ＳＥＡＭ２が最小４アミノ酸からなり、そのうち２つがグリシンである、重鎖（Ｈ−ＣＤＲ３）中にある。
抗ＮｍＢ ＰＳ ｍＡｂ ２−２−ＢのＶＬ及びＶＨ遺伝子はそれらの予想される生殖系列遺伝子と比較すると、変異していない（１００％同一）。同様に、抗ＮｍＢ ＰＳ ｍＡｂ ７３５の発現ＶＬのアミノ酸配列は、相当する生殖系列遺伝子のものと＞９９％同一である。これに対し、抗Ｎ−Ｐｒ ＮｍＢ ＰＳ ｍＡｂｓは、各生殖系列配列と比較すると、より多くの変異パーセンテージを有する（発現遺伝子は８９％〜９５％生色系列配列と同一、図５５）。また、５つ全ての抗Ｎ−Ｐｒ ＮｍＢ ＰＳ ｍＡｂｓは、１又は複数のアルギニン残基をＨ−ＣＤ３中に含んでおり、これは、Ｄ−Ｊジャンクションにおけるエディティングによってコードされる。２つの抗ＮｍＢ ＰＳ ｍＡｂｓは、Ｈ−ＣＤ３中にアルギニンを含まない。
図１は本発明の脱Ｎアセチル化によるＮｍＢＰＳの構造を示す。Ｒは遊離アミン（脱アセチル化グループ）を提供する多くの残基上のＨである。脱Ｎアセチル化産物の少ない部分において、ＲはＣＨ３Ｃ＝Ｏ（アセチル化グループ）であってもよい。「ｎ」はポリマー中のシアル酸残基数を表し、ここに記載される他の化学式中の「ｎ」の値でもよい。 図２は、次のＮｍＢＰＳ酸処理前のＮｍＢＰＳ中のＣ１カルボキシル基とＣ９ヒドロキシル基間に形成されるラクトン部分の構造を表す。 図３は、非還元末端残基にアルデヒド基を持つＰＳ誘導体の構造を提供する。 図４は、ＳＥＡＭ３によるノイラミニダーゼ切断から選択され保護されたＰＳ誘導体のマススペクトルを示す。 図５は、各サンプルに関し観察された質量と観察された質量と一致するイオンに対応する理論的な質量をまとめた表である。 図６〜図１５は、図５で同定された脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図６〜図１５は、図５で同定された脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図６〜図１５は、図５で同定された脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図６〜図１５は、図５で同定された脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図６〜図１５は、図５で同定された脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図６〜図１５は、図５で同定された脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図６〜図１５は、図５で同定された脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図６〜図１５は、図５で同定された脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図６〜図１５は、図５で同定された脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図６〜図１５は、図５で同定された脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図１６〜図１８は、実施例１で調製された同定されたドデシルアミンＮｍＢＰＳ誘導体の構造を示す。 図１６〜図１８は、実施例１で調製された同定されたドデシルアミンＮｍＢＰＳ誘導体の構造を示す。 図１６〜図１８は、実施例１で調製された同定されたドデシルアミンＮｍＢＰＳ誘導体の構造を示す。 図１９〜図３３は、本発明の例示的なアシルアミン脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図１９〜図３３は、本発明の例示的なアシルアミン脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図１９〜図３３は、本発明の例示的なアシルアミン脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図１９〜図３３は、本発明の例示的なアシルアミン脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図１９〜図３３は、本発明の例示的なアシルアミン脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図１９〜図３３は、本発明の例示的なアシルアミン脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図１９〜図３３は、本発明の例示的なアシルアミン脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図１９〜図３３は、本発明の例示的なアシルアミン脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図１９〜図３３は、本発明の例示的なアシルアミン脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図１９〜図３３は、本発明の例示的なアシルアミン脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図１９〜図３３は、本発明の例示的なアシルアミン脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図１９〜図３３は、本発明の例示的なアシルアミン脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図１９〜図３３は、本発明の例示的なアシルアミン脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図１９〜図３３は、本発明の例示的なアシルアミン脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図１９〜図３３は、本発明の例示的なアシルアミン脱Ｎアセチル化ＰＳ誘導体の構造を示す。 図３４は、直接結合ＥＬＩＳＡによって測定されたＳＥＡＭｍＡＢＳ２，３，１２，１８及び３５のドデシルアミンＮｍＢＰＳ誘導体への結合結果をまとめたものである。ｍＡｂＳＥＡＭ３はＵＮ６，０４８，５２７中に記載されている。 図３５は、直接結合ＥＬＩＳＡによって測定されたＳＥＡＭｍＡＢＳ２，３，１２，１８及び３５のＢＳＡ−ＮｍＢＰＳ誘導体コンジュゲートへの結合結果をまとめたものである。ｍＡｂＳＥＡＭ３はＵＮ６，０４８，５２７中に記載されている。 図３６は、コロミン酸（即ち、大腸菌Ｋ１から調製されたポリα（２→８）Ｎ−アセチルノイラミン酸）（曲線１）及びシアリダーゼＡで完全に処理したＮ−ＰｒＮｍＢＰＳの高速陰イオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラフである。 図３７は、ＮｍＢ株Ｍ７に対するＳＥＡＭ１２の蛍光顕微鏡で測定した結合を示す写真のパネルであるが、成長培地にはＮ−アシルマンノサミン誘導体が添加された。左のパネル：ＳＥＡＭ１２ｍＡｂのＮ−アシルマンノサミンを添加したＭ７に対する結合；左中パネル：ＳＥＡＭ１２ｍＡｂのＮ−アシルマンノサミンを添加していないＭ７に対する結合；右中パネル：ＳＥＡＭ１２ｍＡｂのＮ−トリクロロアセチルマンノサミンを添加による結合；右パネル：ＳＥＡＭ１２のＮ−トリフルオロアセチル基を含む被膜ＰＳに対する結合。ｍＡｂＳＥＡＭ３はＵＮ６，０４８，５２７中に記載されている。 図３８は、抗脱ＮアシルＧＤ３ｍＡｂ，ＧＡＧ２，及びＳＥＡＭ３と化学的又は生化学的に調製された脱Ｎアセチルシアル酸ガングリオシドとの反応性を示す写真である。ガングリオシド誘導体は、高速薄層クロマトグラフィーにより分離し、ＧＡＧ２（レーン１−３）又はＳＥＡＭ３（レーン４−６）のいずれかを用いたウェスタンブロッティングにより検出された。 図３９は、ＳＥＡＭ３、抗ＧＤ３ｍＡｂｓ、Ｒ２４の結合に関する免疫組織化学的解析を示す、ヒト正常及びメラノーマ癌組織の一連の写真である。 図４０は、ヒト癌パネルに対するＳＥＡＭ３結合の免疫組織化学的解析結果をまとめた表である。 図４１は、ＳＥＡＭ３のＳＫ−ＭＥＬ２８メラノーマ細胞（暗い影）に対する蛍光結合を示す写真である。 図４２は、ＳＥＡＭ３のＣＨＰ−１３４神経芽細胞腫（暗い影）に対する蛍光結合を示す写真である。 図４３は、ＳＥＡＭ３のジャーキットＴ細胞白血病細胞（暗い影）に対する蛍光結合を示す写真である。 図４４は、ＳＥＡＭ３、抗ＧＤ３ｍＡｂｓ、Ｒ２４及び無関係のアイソタイプ（ｉｓｔｏｔｙｐｅ）の一致したコントロールｍＡｂのＳＫ−ＭＥＬ２８メラノーマ細胞に対するトリトンＸ−１００の存在下及び非存在下におけるフローサイトメトリーによる結合を示すグラフである。 図４５は、ＳＥＡＭ３、抗ＮＣＡＭｍＡｂ及び無関係のアイソタイプ（ｉｓｔｏｔｙｐｅ）の一致したコントロールｍＡｂのＣＨＰ−１３４神経芽細胞腫細胞に対するトリトンＸ−１００の存在下及び非存在下におけるフローサイトメトリーによる結合を示すグラフである。 図４６は、ＳＥＡＭ３及び無関係のアイソタイプ（ｉｓｔｏｔｙｐｅ）の一致したコントロールｍＡｂのジャーキット細胞に対するトリトンＸ−１００及び可溶性多糖阻害剤、Ｎ−ＰｒＮｍＢの存在下及び非存在下におけるフローサイトメトリーによる結合を示すグラフである。 図４７は、５μｇ／ｍｌのＳＥＡＭ３の存在下において２４時間細胞をインキュベートした後のＳＫ−ＭＥＬ２８メラノーマ細胞の細胞生存可能性の減少を示すグラフである。 図４８は、５μｇ／ｍｌのＳＥＡＭ３、抗ＧＤ３ｍＡｂ、Ｒ２４又は無関係のアイソタイプ（ｉｓｔｏｔｙｐｅ）の一致したコントロールｍＡｂの存在下において４８時間細胞をインキュベートした後のアポトーシスを起こし及び死滅したＳＫ−ＭＥＬ２８メラノーマ細胞の増加と細胞生存可能性の減少を示すグラフである。 図４９は、ノコダゾール及び抗ＧＤ３ｍＡｂＲ２４の影響と比較した、ＳＥＡＭ３存在下における前Ｇ０へのＳＫ−ＭＥＬ２８メラノーマ細胞のシフトを示すグラフである。 図５０は、ＳＥＡＭ３反応性抗原を発現するＳＫ−ＭＥＬ２８細胞と細胞増殖マーカーのＫｉ６７の割合を比較したスキャッタープロットである。 図５１は、抗ＭＢＰＳと抗Ｎ−ＰｒＭＢＰｓｍＡｂｓの可変領域の遺伝的起源の比較を示す表である。 図５２は、ｍＡｂ７３５とＳＥＡＭｍＡｂｓに関するＶＬとＶＨ配列の比較を示す模式図である。ボックス部分は相補性決定領域（ＣＤＲ）ループに対応する。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＳＥＡＭ２ ＶＨ，ＤＱ１１３４８９；ＳＥＡＭ２ ＶＬ，ＤＱ１１３４９０；ＳＥＡＭ３ ＶＨ，ＤＱ１１３４９１；ＳＥＡＭ３ ＶＬ，ＤＱ１１３４９２；ＳＥＡＭ１２ ＶＨ，ＤＱ１１３４９３；ＳＥＡＭ１２ ＶＬ，ＤＱ１１３４９４；ＳＥＡＭ１８ ＶＨ，ＤＱ１１３４９５；ＳＥＡＭ１８ ＶＨ，ＤＱ１１３４９６；ＳＥＡＭ３５ ＶＨ，ＤＱ１１３４９７；ＳＥＡＭ３５ ＶＬ，ＤＱ１１３４９８ 図５３は、ＳＥＡＭ３の重鎖ポリペプチドの核酸及びアミノ酸配列示す模式図である。 図５４は、図５３は、ＳＥＡＭ３の軽鎖ポリペプチドの核酸及びアミノ酸配列示す模式図である。 図５５は、抗ＭｍＢ ＰＳ及び抗Ｎ−Ｐｒ ＮｍＢ ＰＳに関する、アサインされた生殖細胞遺伝子及びアミノ酸配列と各々の発現配列との比較を示す表である。 図５６は、国際免疫原性情報システム（ＩＭＧＴ）の定義（Lefranら IMGT, the international ImMunoGeneTics ingormation system（登録商標） Nucl. Acids Res., 2005,33,D593-D597）によって定義される可変領域フレームワーク及びＣＤＲｓに対するＳＥＡＭ３軽鎖のＤＮＡ配列の関連性を示す模式図である。 図５７は、国際免疫原性情報システム（ＩＭＧＴ）の定義（Lefranら IMGT, the international ImMunoGeneTics ingormation system（登録商標） Nucl. Acids Res., 2005,33,D593-D597）によって定義される可変領域フレームワーク及びＣＤＲｓに対するＳＥＡＭ３重鎖のＤＮＡ配列の関連性を示す模式図である。 図５８は、国際免疫原性情報システム（ＩＭＧＴ）の定義（Lefranら IMGT, the international ImMunoGeneTics ingormation system（登録商標） Nucl. Acids Res., 2005,33,D593-D597）によって定義される可変領域Ｄ及びＪ鎖に対するＳＥＡＭ３重鎖のＤＮＡ配列の関連性を示す模式図である。

Claims (44)

  1. 被検対象中の癌細胞の成長を阻害する方法であって：
    細胞外から接近可能な被検対象中の癌細胞表面上に存在する脱アセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）に特異的に結合する抗体を含む、薬学上受容可能な製剤を、被検対象に投与し、該投与が抗体が結合する癌細胞の生存可能性を減少させる方法。
  2. ｄｅＮａｃＳＡエピトープが細胞分裂の間癌細胞表面上に存在する請求項１に記載の方法。
  3. 癌がメラノーマ又は白血病である請求項１に記載の方法。
  4. 癌が神経芽細胞腫である請求項１に記載の方法。
  5. 抗体が注入又は局所注射によって投与される請求項１に記載の方法。
  6. 該投与が癌細胞を除去するための外科的介入の前である請求項１に記載の方法。
  7. 該投与が癌細胞を除去するための外科的介入と同時又は外科的介入後である請求項１に記載の方法。
  8. 被検対象への癌の化学療法又は放射線療法の少なくとも１つを行うことをさらに含む請求項１に記載の方法。
  9. 被検対象中の癌細胞の成長を阻害する方法であって：
    細胞外から接近可能な被検対象中の癌細胞表面上に存在するＳＥＡＭ−３反応性抗原に特異的に結合する抗体を含む、薬学上受容可能な製剤を、被検対象に投与し、該投与が抗体が結合する癌細胞の生存可能性を減少させる方法。
  10. ＳＥＡＭ−３反応性抗原が細胞分裂の間癌細胞表面上に存在する請求項９に記載の方法。
  11. 癌がメラノーマ又は白血病である請求項９に記載の方法。
  12. 癌が神経芽細胞腫である請求項９に記載の方法。
  13. 抗体が注入又は局所注射によって投与される請求項９に記載の方法。
  14. 該投与が癌細胞を除去するための外科的介入の前、外科的介入と同時又は外科的介入後である請求項９に記載の方法。
  15. 被検対象への癌の化学療法又は放射線療法の少なくとも１つを行うことをさらに含む請求項９に記載の方法。
  16. 前記抗体がＳＥＡＭ３モノクローナル抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−１２１７０）である請求項９に記載の方法。
  17. ＳＥＡＭ３モノクローナル抗体が：
    高塩濃度溶液中にＳＥＡＭ３モノクローナル抗体を含む組成物をインキュベートし、該インキュベートが溶液中のＳＥＡＭ３ｍＡｂからの荷電分子の分離を促進するために適する条件下で行われ：及び
    該溶液からＳＥＡＭ３ｍＡｂを単離することを含む方法によって単離される、請求項１６に記載の方法。
  18. 被検対象中の癌細胞に抗体を誘導する方法であって、該方法が：
    被検対象に脱Ｎアセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）抗原とアジュバントを含む免疫原性組成物を投与し、該被検対象が脱Ｎアセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）抗原によって特徴付けられる癌を保持するか又は保持が疑われており、該投与が細胞外から接近可能な癌細胞の表面上のｄｅＮＡｃＳＡ抗原に特異的に結合する抗体の生産を誘導するのに有効であることを含む方法。
  19. 癌がメラノーマ又は白血病である請求項１８に記載の方法。
  20. 癌が神経芽細胞腫である請求項１８に記載の方法。
  21. 免疫原性組成物のｄｅＮＡｃＳＡ抗原がｄｅＮＡｃＳＡ抗原のエクソシアリダーゼ処理によって調製される請求項１８に記載の方法。
  22. ｄｅＮＡｃＳＡ抗原がｄｅＮＡｃＳＡ抗原コンジュゲートである請求項１８に記載の方法。
  23. ｄｅＮＡｃＳＡ抗原コンジュゲートがプロピオニル結合又はアセチル結合ｄｅＮＡｃＳＡ抗原コンジュゲートである請求項２２に記載の方法。
  24. 被検対象中の腫瘍を検出する方法であって、該方法が：
    脱Ｎアセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）エピトープと特異的に結合する抗体と、癌を保持するか又は保持が疑われている被検対象から得た生物学的試料を接触させ、該接触が生物学的試料中のｄｅＮＡｃＳＡエピトープと抗体との特異的な結合にとって適切な条件下でおこなわれ；
    抗体の結合の有無が被検対象中の細胞表面ｄｅＮＡｃＳＡエピトープを保持する癌細胞の有無を表示する方法。
  25. 被検対象中の腫瘍を検出する方法であって、該方法が：
    ＳＥＡＭ３反応性抗原と特異的に結合する抗体と、癌を保持するか又は保持が疑われている被検対象から得た生物学的試料を接触させ、該接触が生物学的試料中のＳＥＡＭ３反応性抗原と抗体との特異的な結合にとって適切な条件下でおこなわれ；
    抗体の結合の有無が被検対象中の細胞表面ＳＥＡＭ３反応性抗原を保持する癌細胞の有無を表示する方法。
  26. 前記抗体がＳＥＡＭ３モノクローナル抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−１２１７０）である請求項２５に記載の方法。
  27. 多糖（ＰＳ）誘導体を生産する方法であって、該方法が：
    大腸菌Ｋ１細菌をＮ−アセチルマンノサミン及びアミン保護マンノサミンを含む成長培地中で培養し、該細菌が追加のマンノサミンの非存在下では、被膜多糖類の生産ができず；
    該培養によってアミノ保護基及びＮ−アセチル化基を有するアミン保護ＰＳ誘導体が生産される方法。
  28. 前記方法が：
    アミン保護基を除去し、脱保護残基をコンジュゲートＰＳ誘導体を生産するためのタンパク質担体に連結させる条件下でアミン保護ＰＳ誘導体を処理することをさらに含む請求項２７に記載の方法。
  29. ｄｅＮＡｃＳＡ抗原を生産する方法であって、該方法が：
    Ｎ−アセチル−マンノサミン及びアミン保護マンノサミンを含む成長培地中で哺乳類細胞を培養し、該培養が哺乳類細胞表面上にアミノ保護基及びＮ−アセチル化基を有するアミン保護ｄｅＮＡｃＳＡ抗原の生産が提供される。
  30. 該方法が：
    アミン保護基を除去し、脱保護基をコンジュゲートＰＳ誘導体を生産するためのタンパク質担体に結合させる条件下でアミン保護ｄｅＮＡｃＳＡ抗原を処理することをさらに含む請求項２９に記載の方法。
  31. 免疫原性組成物を生産する方法であって、該方法が：
    脱Ｎアセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）抗原を含む組成物とエクソシアリダーゼをと接触させ、該接触が該組成物中のＮ−アセチル化シアル酸ポリマー夾雑物の分解を引き起こすのに十分な条件下で行われ；
    該接触がｄｅＮＡｃＳＡ抗原に富む組成物を生産する方法。
  32. 請求項３１に記載の方法によって処理されたｄｅＮＡｃＳＡ抗原を含む組成物。
  33. ＳＥＡＭ３モノクローナル抗体を単離する方法であって、該方法：高塩濃度溶液中にＳＥＡＭ３モノクローナル抗体を含む組成物をインキュベートし、該インキュベートが溶液中のＳＥＡＭ３ｍＡｂからの荷電分子の分離を促進するために適する条件下で行われ：及び
    該溶液からＳＥＡＭ３ｍＡｂを単離することを含む方法。
  34. 単離されたＳＥＡＭ３モノクローナル抗体と薬学上受容可能な担体を含む組成物であって、単離されたＳＥＡＭ３モノクローナル抗体が請求項３３に記載の方法によって単離される組成物。
  35. 以下のものを含む軽鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
    ＳＥＡＭ３軽鎖ポリペプチドの可変領域の
    ｉ）アミノ酸残基２４〜３９、
    ｉｉ）アミノ酸残基５５〜６１、及び
    ｉｉｉ）アミノ酸残基９４〜１００
  36. 軽鎖ポリペプチドがＳＥＡＭ３軽鎖ポリペプチドの可変領域のアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  37. 請求項３５に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
  38. 請求項３５に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む組換体宿主細胞。
  39. 以下のものを含む重鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
    ＳＥＡＭ３重鎖ポリペプチドの可変領域の
    ｉ）アミノ酸残基２６〜３５、
    ｉｉ）アミノ酸残基５０〜６６、及び
    ｉｉｉ）アミノ酸残基１０１〜１０８
  40. 重鎖ポリペプチドがＳＥＡＭ３重鎖ポリペプチドの可変領域のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  41. 請求項３９に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
  42. 請求項３９に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む組換体宿主細胞。
  43. ＳＥＡＭ３モノクローナル抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−１２１７０）の抗原結合部分含む抗体、及び
    ポリエチレングリコール部分、抗癌薬、又は抗体の抗原結合部分である共有結合部分を含む抗体コンジュゲート。
  44. 抗体がＳＥＡＭ３モノクローナル抗体である請求項４３に記載の方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010532389A (ja) * 2007-07-03 2010-10-07 チルドレンズ ホスピタル アンド リサーチ センター アット オークランド ポリシアル酸誘導体、製造方法、ならびにがん抗原産生の増強およびターゲティングにおける使用
JP2010534196A (ja) * 2007-07-03 2010-11-04 チルドレンズ ホスピタル アンド リサーチ センター アット オークランド オリゴシアル酸誘導体、製造方法および免疫学的使用

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2008272854B2 (en) 2007-07-03 2014-03-13 Children's Hospital & Research Center At Oakland Inhibitors of polysialic acid de-N-acetylase and methods for using the same
EP2281004A4 (en) * 2008-04-14 2012-02-15 Proscan Rx Pharma Inc PROSTATE-SPECIFIC MEMBRANANT ANTIBODIES AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENTS
CA2761310C (en) 2009-05-07 2017-02-28 Charles S. Craik Antibodies and methods of use thereof
FR2955321B1 (fr) 2010-01-21 2012-02-10 Rhodia Operations Procede d'oxydation d'hydrocarbures
WO2014120555A1 (en) 2013-01-31 2014-08-07 The Regents Of The University Of California Antibodies specific for urokinase-type plasminogen activator and methods of use thereof
CN106102776B (zh) 2014-01-24 2020-02-14 圣安德鲁斯大学董事会 免疫调节化合物
GB201616009D0 (en) 2016-09-20 2016-11-02 Univ Court Of The Univ Of St Andrews The Treatment and/or prevention of sepsis
GB201616007D0 (en) 2016-09-20 2016-11-02 Univ Court Of The Univ Of St Andrews The Novel Adjuvants
GB201616006D0 (en) 2016-09-20 2016-11-02 Univ Court Of The Univ Of St Andrews The Cell modulation
CN112795583A (zh) * 2020-11-16 2021-05-14 上海大学 重组唾液酸外切酶的制备方法、表达基因、重组表达载体及构建方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001500372A (ja) * 1996-08-27 2001-01-16 カイロン コーポレイション 独特の髄膜炎菌性ｂエピトープを規定するモノクローナル抗体およびワクチン組成物の調製におけるそれらの使用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2279134A1 (en) * 1999-07-29 2001-01-29 Tianmin Liu Novel strategy for carbohydrate-based therapeutic vaccines
EP1784428A2 (en) * 2004-06-23 2007-05-16 Children's Hospital & Research Center at Oakland Polysaccharide derivatives and uses in induction of an immune response

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001500372A (ja) * 1996-08-27 2001-01-16 カイロン コーポレイション 独特の髄膜炎菌性ｂエピトープを規定するモノクローナル抗体およびワクチン組成物の調製におけるそれらの使用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6012014229; Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ．５９, 1999, ｐ．１３３７-１３４６ *
JPN6012014231; Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｖｏｌ．７３, 200504, ｐ．２１２３-２１２８ *
JPN6012051206; Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１６０, 1998, ｐ．５０２８-５０３６ *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010532389A (ja) * 2007-07-03 2010-10-07 チルドレンズ ホスピタル アンド リサーチ センター アット オークランド ポリシアル酸誘導体、製造方法、ならびにがん抗原産生の増強およびターゲティングにおける使用
JP2010534196A (ja) * 2007-07-03 2010-11-04 チルドレンズ ホスピタル アンド リサーチ センター アット オークランド オリゴシアル酸誘導体、製造方法および免疫学的使用
JP2015057391A (ja) * 2007-07-03 2015-03-26 チルドレンズ ホスピタル アンド リサーチ センター アット オークランド オリゴシアル酸誘導体、製造方法および免疫学的使用

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