KR20080091777A - Ｄｅ-ｎ-아세틸 시알산 항원, 이에 대한 항체, 및 암치료에서 사용하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 세포 표면 de-N-아세틸화 시알산 항원, 예를 들어 적어도 부분적으로 de-N-아세틸화된 강글리오시드 및/또는 de-N-아세틸화 시알산-변형 세포 표면 단백질을 갖는 암의 진단 및/또는 치료에 관한 조성물 및 방법을 제공한다.
Figure 112008052552933-PCT00025
de-N-아세틸화 시알산 항원, de-N-아세틸화 강글리오시드, 암, 표면 단백질, 백혈병, 흑색종, 림프종, 암 치료, 항암

Description

ＤＥ-Ｎ-아세틸 시알산 항원, 이에 대한 항체, 및 암 치료에서 사용하는 방법{DE-N-ACETYL SIALIC ACID ANTIGENS, ANTIBODIES THERETO, AND METHODS OF USE IN CANCER THERAPY}
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2005년 12월 23일자 제출된 미국 가 출원 제60/753,847호의 우선권을 주장하며, 이 출원은 그 전문이 참고자료로서 본원에 포함된다.
연방정부 지원 연구에 관한 내용
본 발명은 정부의 지원을 받아 행해졌다.
미 국립 알레르기·전염병 연구소와 미 국립보건원에 의해 수여된 승인 번호AI46464 및 AI45642 하에 정부의 지원을 받아서 행해졌다. 정부는 본 발명에 어떤 권리를 가질 수 있다.
배경기술
일반적으로, 항암 면역요법의 목표는 종양 세포로부터 높이 발현되지만 폐기되거나 은닉되지는 않는 안정한 항원을 확인하는 것이며, 그 후 이 항원이 면역요법의 기초로서, 예를 들어 암 백신 항원으로서 또는 항체-기반 암 치료의 표적으로서 사용될 수 있다. 가장 좋은 것은 이러한 종양 항원이 암성 표적 세포에 만족스러울 만큼 특이적인 면역반응을 도출하는 항원이어서, 치료될 대상의 비-암성 세포 와의 교차-반응으로 인해 생길 수 있는 유해한 부작용을 줄일 수 있는 것이다. 교차-반응성이 재증식될 수 있는 세포에 영향을 미치는 경우, 그것은 면역요법의 특이성에 대한 이러한 요건을 완화시킬 수 있다.
예를 들어, 백혈병/림프종을 치료하는데 여타의 항체들이 사용될 수 있지만, 비-호지킨 림프종의 단클론 항체(mAb) 요법을 위한 현재의 표준은 CD20 항원을 인식하는 키메라 쥐/인간 mAb인 RITUXIMAB™이다. CD20은 대부분의 성숙 B 세포 및 B-세포 림프종에서 높이 발현되며, 발현이나 항원 결정소에 대해 비교적 낮은 조정성을 나타내고, 폐기되거나 은닉되지 않는다. 이 항원은 또한 비-암성 B 세포 상의 CD20에도 결합하지만, 이 세포 집단은, 예를 들어 과립구-대식세포 콜로니-자극인자(GM-CSF), 에리트로포에틴(EPO) 등과 같은 면역강화 치료제를 사용한 지지 치료를 통해 회복될 수 있다.
세포 표면 항원에 결합하는 항체의 Fc 영역은 자연살상(NK) 세포를 활성화함으로써 보체 침착 및 세포 용해(보체 의존성 세포독성 또는 CDC) 또는 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)를 매개할 수 있다. 흔하지는 않지만, 항체는 또한 아폽토시스를 야기하는 신호화 경로에 영향을 미치는 세포 표면 항원에 결합함으로써 세포독성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, RITUXIMAB™의 작용 메커니즘은 완전히 이해되지는 않았지만, 항체-의존성 CDC, ADCC, 및 아폽토시스를 야기하는 세포 신호화 경로 활성화의 조합에 의해 CD20-양성 종양 세포 상에서 세포독성 효과를 발휘하는 것으로 드러났다. 리툭시맵의 성공으로 몇 가지 다른 세포성 항원이 CD22, CD30, 및 CD80를 포함하는 mAb를 사용하여 표적화되었다.
항체 투여를 통한 수동적 면역요법에 더하여, 몇 가지 능동적 면역화 전략이 조사되었다. 전형적인 암 백신은 보체, 및 종양 세포의 옵소노파코사이토틱 살작용(opsonophagocytotic killing)을 활성화할 수 있는 체액성 항체 및/또는 세포성 면역반응을 도출할 수 있는 종양 항원의 투여를 포함한다. 전형적인 백신 조성물은 종양 세포 용해물, 및 종양-특이적 항원(예를 들어, 단백질, 강글리오시드(Tai, T., et al. Int J Cancer, 1985. 35:607-12), 항-이디오타입(anti-idiotype) 면역글로불린(Ig), 등(Foon et al. J Clin Oncol, 2000. 18:376-84) 또는 동일한 타입의 비-자가조직 및 자가조직 암으로부터 유래하는 종양-특이적 또는 과발현 단백질의 펩티드 단편(Morioka et al. J Immunol, 1994. 153:5650-8; Morioka, N. et al. Mol Immunol, 1995. 32: p. 573-81)에 기초한 것들을 포함한다.
이들 접근법의 한 제한사항은, 표적 항원이 전형적으로 종양 세포에서 더욱 높이 발현됨에도, 이들은 자가항원이기 때문에 면역원성이 약하다는 것이다. 따라서, 암 백신은 주로 암 항원의 면역원성을 강화시키기 위한 다양한 전략을 사용하는데, 예를 들어 애쥬번트와의 조합, 사이토카인(들)의 투여, 캐리어 단백질 연결, 및 성숙한 수지상 세포의 시험관내 펄스-활성화의 사용 등이 있다. 더 최근의 경향은 환자에 따라 맞춤 제작되는 더욱 정교한 백신 전략을 개발하는 것인데, 여기서는 자가 수지상 세포가 분리되고, 종양 용해물이나 펩티드로 자극된 다음, 그것만이 또는 강한 면역자극성 사이토카인(예를 들어, GM-CSF, 인터류킨 IL-2 및 IL-12, 인터페론 감마)과 조합하여 재주입된다.
발명의 개요
본 발명은 일반적으로 세포 표면 de-N-아세틸화 시알산 항원, 예를 들어 적어도 부분적으로 de-N-아세틸화된 강글리오시드 및/또는 de-N-아세틸화된 시알산-변형 세포 표면 단백질을 갖는 암의 진단 및/또는 치료에 관한 조성물 및 방법을 제공한다.
본 명세서는 본 발명의 다양한 양태를 제공한다. 이들 양태는 다음에 예시되는 구체예들을 포함한다.
한 구체예에서, 암성 세포의 성장을 억제하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 피험자에 존재하는 암성 세포의 세포외 접근가능한 표면에 있는 de-N-아세틸화 시알산(deNAc SA) 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 제약학상 허용되는 제제를 피험자에게 투여하는 것을 포함하며, 투여에 의해서 항체에 의해 결합된 암성 세포 생육성의 감소가 촉진된다. 관련 구체예에서, deNAc SA 에피토프는 세포분열 동안 암성 세포의 표면에 존재한다. 다른 관련 구체예에서, 암은 흑색종, 백혈병, 또는 신경모세포종이다. 항체는 주입 또는 국소 주사에 의해서 투여될 수 있으며, 암성 세포를 제거하기 위한 외과적 개입 전에, 동시에, 또는 이후에 투여될 수 있다. 또한, 항체는 조합요법의 일부로서 투여될 수 있으며, 이 경우 암 화학요법 또는 방사선요법 중 적어도 하나가 피험자에게 투여된다.
또 다른 구체예에서, 피험자에서 암성 세포의 성장을 억제하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 피험자에 존재하는 암성 세포의 세포외 접근가능한 표면에 있는 SEAM-3 반응성 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 제약학상 허용되는 제제를 피험자에게 투여하는 것을 포함하며, 투여에 의해서 항체에 의해 결합된 암성 세포 생육성의 감소가 촉진된다. 관련 구체예에서, SEAM-3 반응성 항원은 세포분열 동안 암성 세포의 표면에 존재한다. 다른 관련 구체예에서, 암은 흑색종, 백혈병, 또는 신경모세포종이다. 항체는 주입 또는 국소 주사에 의해서 투여될 수 있으며, 암성 세포를 제거하기 위한 외과적 개입 전에, 동시에, 또는 이후에 투여될 수 있다. 또한, 항체는 조합요법의 일부로서 투여될 수 있으며, 이 경우 암 화학요법 또는 방사선요법 중 적어도 하나가 피험자에게 투여된다. 한 관련 구체예에서, 항체는 SEAM-3 단클론 항체(ATCC 기탁 번호 HB-12170)이다. 다른 관련 구체예에서, SEAM-3 단클론 항체는 고염 농도 단계를 이용하여 분리되는데, 이것은 SEAM-3 단클론 항체를 포함하는 조성물을 고염 농도 용액 중에서, 이 용액 중에서 SEAM-3 mAb와 하전된 분자의 분리를 촉진하기에 적합한 조건하에서 인큐베이션하는 것이다. 일반적으로 침전물을 제거하고, mAb를 분리함으로써 SEAM-3 mAb가 용액으로부터 분리된다.
또 다른 구체예에서, 피험자에서 암성 세포에 대한 항체를 도출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 de-N-아세틸화 시알산(deNAc SA) 항원 및 애쥬번트를 포함하는 면역원성 조성물을 피험자에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 피험자는 de-N-아세틸화 시알산(deNAc SA) 항원을 특징으로 하는 암에 걸리거나 또는 암에 걸렸을 것으로 의심되고, 상기 투여는 암성 세포의 세포외 접근가능한 표면에 있는 deNAc SA 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 도출하는데 효과적이다. 관련 구체예에서, 암은 흑색종, 림프종, 또는 백혈병, 또는 신경모세포종이다. 다른 관련 구체예에서, 면역원성 조성물의 deNAc SA 항원은 deNAc SA 항원의 엑소시알리다제(exosialidase) 처리에 의해 제조된다. 또 다른 관련 구체예에서, deNAc SA 항원은 deNAc SA 항원 콘쥬게이트로서, 이것은 예를 들어 프로피오닐-연결 또는 아세틸-연결 deNAc SA 항원 콘쥬게이트일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 피험자에서 종양을 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 암에 걸렸을 것으로 의심되는 피험자로부터 획득된 생물학적 샘플을 de-N-아세틸화 시알산(deNAc SA) 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 접촉은 항체와 생물학적 샘플 중의 deNAc SA 에피토프의 특이적 결합에 적합한 조건하에서 행해지고, 이때 항체 결합의 존재 또는 부재에 의해서 피험자 내에 세포 표면 deNAc SA 에피토프를 갖는 암성 세포의 존재 또는 부재가 표시된다.
또 다른 구체예에서, 피험자에서 종양을 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 암에 걸렸을 것으로 의심되는 피험자로부터 획득된 생물학적 샘플을 SEAM-3 반응성 항원과 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 접촉은 항체와 생물학적 샘플 중의 SEAM-3 반응성 항원의 특이적 결합에 적합한 조건하에서 행해지고, 이때 항체 결합의 존재 또는 부재에 의해서 피험자 내에 세포 표면 SEAM-3 반응성 항체를 갖는 암성 세포의 존재 또는 부재가 표시된다. 관련 구체예에서, 항체는 SEAM-3 단클론 항체(ATCC 기탁 번호 HB-12170)이다.
다른 구체예에서, 적합한 deNAc SA 항원인 다당(PS) 유도체를 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 N-아실-만노스아민 및 아민-보호된 만노스아민을 포함하는 성장 배지 중에서 대장균(Escherichia coli) K1 박테리아를 배양하는 것을 포함하며, 상기 박테리아는 보충 만노스아민의 부재시에는 캡슐 다당을 생산하지 못하는 것이고, 배양에 의해서 아민 보호기 및 N-아실화 기를 갖는 아민-보호된 PS 유도체가 생산된다. 관련 구체예에서, 상기 방법은 또한 아민 보호기가 제거되고 탈보호된 잔기와 단백질 캐리어가 결합됨으로써 콘쥬게이트된 PC 유도체가 생산되는 조건하에서 아민-보호된 PC 유도체를 처리하는 것을 포함한다.
또 다른 구체예에서, deNAc SA 항원을 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 N-아실 만노스아민 및 아민-보호된 만노스아민을 포함하는 성장 배지 중에서 포유류 세포를 배양하는 것을 포함하며, 배양에 의해서 포유류 세포의 표면에서 아민 보호기 및 N-아실화 기를 갖는 아민-보호된 deNAc SA 항원이 생산된다. 관련 구체예에서, 상기 방법은 또한 아민 보호기가 제거되고 탈보호된 잔기가 단백질 캐리어와 결합됨으로써 콘쥬게이트된 deNAc SA 항원이 생산되는 조건하에서 아민 보호된 deNAc SA 항원을 처리하는 것을 포함한다. 또한, 상기 방법에 의해서 생산된 아민-보호된 deNAc SA 항원, 상기 방법에 의해서 생산된 세포 표면 deNAc SA 항원을 갖는 포유류 세포, 및 이러한 포유류 세포의 막 및 지질 추출물이 제공된다.
또 다른 구체예에서, 면역원성 조성물을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 de-N-아세틸화 시알산(deNAc SA) 항원을 포함하는 조성물을 엑소시알리다제와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 접촉은 조성물 중의 N-아실화 시알산 중합체 오염물질의 분해를 제공하기에 충분한 조건하에서 행해지고, 접촉에 의해서 deNAc SA 항원-부화 조성물이 제조된다. 또한, 상기 엑소시알리다제 처리 방법에 의해서 제조된 deNAc SA 항원을 포함하는 조성물이 제공된다.
또 다른 구체예에서, 항-deNAc SA 에피토프 항체를 분리하는 방법 및 SEAM-3 단클론 항체를 분리하는 방법이 제공되며, 상기 방법들은 항체를 포함하는 조성물을 고염 농도 용액 중에서 인큐베이션하는 단계, 및 용액으로부터 SEAM-3 mAb를 분리하는 단계를 포함하며, 상기 인큐베이션은 용액 중에서 SEAM-3 mAb와 하전된 분자의 분리를 촉진하기에 적합한 조건하에서 행해진다. 또한, 항-deNAc SA 에피토프 항체와 제약학상 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 제공되며, 이때 항체는 상기 방법에 의해서 분리된 것이다. 또한, SEAM-3 단클론 항체와 제약학상 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 제공되며, 이때 항체는 상기 방법에 의해서 분리된 것이다.
또 다른 구체예에서, 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEAM-3 경쇄 폴리펩티드의 가변영역의 i) 아미노산 잔기 24-39, ii) 아미노산 잔기 55-61, 및 iii) 아미노산 잔기 94-100을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 관련 구체예에서, 암호화된 경쇄 폴리펩티드는 SEAM-3 경쇄 폴리펩티드의 가변영역의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 관련 구체예에서, 이러한 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터 및 재조합 숙주세포가 제공된다.
또 다른 구체예에서, 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEAM-3 중쇄 폴리펩티드의 가변영역의 i) 아미노산 잔기 26-35, ii) 아미노산 잔기 50-66, 및 iii) 아미노산 잔기 101-108을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 관련 구체예에서, 암호화된 중쇄 폴리펩티드는 SEAM-3 중쇄 폴리펩티드의 가변영역의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 다른 관련 구체예에서, 이러한 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터 및 재조합 숙주세포가 제공된다.
또 다른 구체예에서, 항체 콘쥬게이트가 제공되며, 상기 항체 콘쥬게이트는 SEAM-3 단클론 항체(ATCC 기탁 번호 HB-12170)의 항원-결합 부분을 포함하는 항체, 및 공유 결합 부분을 포함하고, 여기서 공유 결합 부분은 폴리에틸렌 글리콜 부분, 항암제, 또는 항체의 항원-결합 부분이다. 관련 구체예에서, 콘쥬게이트의 항체는 SEAM-3 단클론 항체이다.
당업자는 본원의 설명을 읽음으로써 본 발명의 다른 특징들은 쉽게 알 수 있을 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명에 따른 de-N-아세틸화 후의 NmB PS의 구조를 제공한다. R은 대부분의 잔기에서 H로서, 자유 아민(탈아세틸화 기에서)을 만든다. de-N-아세틸화 산물에서 낮은 비율의 잔기에서만 R이 CH3C=O(아세틸기)일 수 있으며, "n"은 이 중합체에 있는 시알산 잔기의 수를 나타내는데, 이것은 본원에 설명된 다른 식에서의 "n"의 값을 가질 수 있다.
도 2는 NmB PS의 산 처리 후 NmB PS에 있는 전술한 잔기의 C1 카르복실기와 C9 히드록실기 사이에 형성된 락톤 부분의 구조를 제공한다.
도 3은 비-환원 단부 말단 잔기에 알데히드기를 갖는 PS 유도체의 구조를 제공한다.
도 4는 SEAM-3에 의한 뉴라미니다제(neuraminidase) 절단으로부터 선별적으로 보호된 PS 유도체의 질량분광도를 나타낸다.
도 5는 각 샘플에 대해 관찰된 질량들과 관찰된 질량들과 일치하는 상응하는 이온의 이론적 질량들을 요약한 표이다.
도 6-15는 도 5에서 확인된 de-N-아세틸화 PS 유도체의 구조를 제공한다.
도 16-18은 실시예 1에서 제조 및 확인된 도데실아민 NmB PS 유도체의 구조를 제공한다.
도 19-33은 본 발명의 전형적인 아실아민 de-N-아세틸화 PS 유도체의 구조를 제공한다.
도 34는 직접 결합 ELISA에 의해서 측정된 SEAM mAb 2, 3, 12, 18, 및 35와 도데실아민 NmB PS 유도체의 결합의 결과를 요약한 표이다. mAb SEAM-3은 미국특허 제6,048,527호에 설명된다.
도 35는 직접 결합 ELISA에 의해서 측정된 SEAM mAb 2, 3, 12, 18, 및 35와 BSA-NmB PS 유도체 콘쥬게이트의 결합의 결과를 요약한 표이다. mAb SEAM-3은 미국특허 제6,048,527호에 설명된다.
도 36은 콜로민산(즉, E. coli K1으로부터 제조된 폴리 알파(2→8) N-아세틸 뉴라민산)(1번 곡선) 및 시알리다제 A로 완벽히 처리된 N-Pr NmB PS의 고성능 음이온 교환 크로마토그래피의 크로마토그램이다.
도 37은 형광 현미경에 의해 측정된 SEAM-12와 NmB 균주 M7의 결합을 예시하는 사진 패널로서, 성장 배지는 N-아실 만노스아민 유도체로 성장 배지가 보충되었다. 좌측 패널: SEAM-12 mAb와 M7의 결합, N-아실 만노스아민 보충; 좌측 중간 패널: N-아실 만노스아민 보충하지 않은 경우 SEAM-12와 M7의 결합; 우측 중간 패널: SEAM-12의 결합, N-트리클로로아세틸 만노스아민 보충; 우측 패널: mAb SEAM-12와 N-트리플루오로아세틸기를 함유하는 캡슐 PS의 결합. mAb SEAM-12는 미국특허 제US 6,048,527호에 설명된다.
도 38은 화학적으로 또는 생합성적으로 제조된 de-N-아세틸 시알산 강글리오시드를 가진 항-de-N-아실 GD3 mAb, GAG2, 및 SEAM-3의 반응성을 나타내는 사진이다. 강글리오시드 유도체는 고성능 박층 크로마토그래피에 의해 분리되고, GAG2(1-3 레인) 또는 SEAM 3(4-6 레인)에 대한 웨스턴 블롯에 의해 검출되었다.
도 39는 인간 정상 조직 및 흑색종 암 조직의 일련의 사진들로서, SEAM-3 및 항-GD3 mAb, R24 결합의 면역조직화학 분석을 나타낸다.
도 40은 인간 암 패널에 대한 SEAM-3 결합의 면역조직화학 분석 결과를 요약한 표이다.
도 41은 SEAM-3와 SK-MEL 28 흑색종 세포의 형광 결합을 나타내는 사진이다(어두운 음영).
도 42는 SEAM-3와 CHP-134 신경모세포종 세포의 형광 결합을 나타내는 사진이다(어두운 음영).
도 43은 SEAM-3와 Jurkat T-세포 백혈병 세포의 형광 결합을 나타내는 사진이다(어두운 음영).
도 44는 Triton X-100의 부재 또는 존재하에서 SK-MEL 28 흑색종 세포에 대한 SEAM-3, 항-GD3 mAb R24, 및 부적합 이소타입-매치 대조군 mAb의 결합을 나타낸 그래프 세트이다.
도 45는 유세포분석법에 의해 Triton X-100의 부재 또는 존재하에서 CHP-134 신경모세포종 세포에 대한 SEAM-3, 항-NCAM mAb, 및 부적합 이소타입-매치 대조군 mAb의 결합을 나타낸 그래프 세트이다.
도 46은 유세포분석법에 의해 Triton X-100 및 가용성 다당 억제제 N-Pr NmB PS의 부재 또는 존재하에서 Jurkat 세포에 대한 SEAM-3 및 부적합 이소타입-매치 대조군 mAb의 결합을 나타낸 그래프 세트이다.
도 47은 5㎍/mL의 SEAM-3의 존재하에서 24시간 동안 세포를 인큐베이션한 후 SK-MEL 28 흑색종 세포의 세포 생육성의 감소를 나타낸 그래프이다.
도 48은 5㎍/mL의 SEAM-3, 항-GD3 mAb R24, 또는 부적합 이소타입-매치 대조군 mAb의 존재하에서 48시간 동안 세포를 인큐베이션한 후 세포 생육성 감소와 아폽토시스성 및 죽은 SK-MEL 28 흑색종 세포의 수의 증가를 비교한 그래프이다.
도 49는 노코도졸 약물 및 항-GD3 mAb R24의 효과와 비교하여 SEAM-3의 존재하에서 SK-MEL 28 흑색종 세포의 pre Go로의 이동을 나타낸 그래프이다.
도 50은 SEAM-3 반응성 항원 및 세포증식 마커 Ki67을 발현한 SK-MEL 28 세포의 퍼센트를 비교한 분포곡선이다.
도 51은 항-MBPS 및 항-N-Pr MBPS mAb의 가변영역의 유전 기원의 비교를 나타낸 표이다.
도 52는 도식으로 나타낸 mAb 735 및 SEAM mAb에 대한 VL 및 VH 서열의 비교이다. 상자 부분들이 상보성 결정 영역(CDR) 루프에 해당한다. GenBank 수탁번호: SEAM 2 VH, DQ113489; SEAM 2 VL, DQ113490; SEAM 3 VH, DQ113491; SEAM 3 VL, DQ113492; SEAM 12 VH, DQ113493; SEAM 12VL, DQ113494; SEAM 18 VH5 DQ113495; SEAM 18 VH, DQ113496; SEAM 35 VH, DQ113497; SEAM 35 VL, DQ113498.
도 53은 도식으로 나타낸 SEAM-3의 중쇄 폴리펩티드의 핵산 및 아미노산 서열이다.
도 54는 도식으로 나타낸 SEAM-3의 경쇄 폴리펩티드의 핵산 및 아미노산 서열이다.
도 55는 항-NmB PS 및 항-N-Pr NmB PS mAb에 대한 각 발현된 서열의 지정된 점라인 유전자 및 아미노산 서열의 비교를 나타낸 표이다.
도 56은 국제 면역유전학 정보 시스템(IMGT) 규정(Lefranc et al. IMGT, the international ImMunoGeneTics information system
Figure 112008052552933-PCT00001
. Nucl. Acids Res. 2005, 33, D593-D597)에 따라 정의된 가변영역 프레임워크 및 CDR에 대한 SEAM-3 경쇄의 DNA 서열의 관계를 도식으로 나타낸 것이다.
도 57은 국제 면역유전학 정보 시스템(IMGT) 규정(Lefranc et al. IMGT, the international ImMunoGeneTics information system
Figure 112008052552933-PCT00002
. Nucl. Acids Res. 2005, 33, D593-D597)에 따라 정의된 가변영역 프레임워크 및 CDR에 대한 SEAM-3 중쇄의 DNA 서열의 관계를 도식으로 나타낸 것이다.
도 58은 국제 면역유전학 정보 시스템(IMGT) 규정(Lefranc et al. IMGT, the international ImMunoGeneTics information system
Figure 112008052552933-PCT00003
. Nucl. Acids Res. 2005, 33, D593-D597)에 따라 정의된 가변영역 D 및 J 사슬에 대한 SEAM-3 중쇄의 DNA 서열의 관계를 도식으로 나타낸 것이다.
본 발명 및 본 발명의 특정한 전형적인 구체예들을 설명하기 전에, 본 발명이 설명된 특정 구체예들에 제한되지 않고, 이러한 구체예들이 물론 변형될 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어들은 특정 구체예를 설명하기 위한 목적일 뿐이며 제한하려는 의도는 없으므로, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이다.
수치 범위가 제공될 경우, 문맥상 명확히 다르게 지시되지 않는 한, 그 범위의 상한과 하한 사이에 들어가는 각 값은 하한의 단위의 1/10까지, 그리고 제시된 범위 내의 어떤 다른 명시된 값이나 중간에 들어가는 값도 본 발명의 범위에 포함된다. 제시된 범위 내에서 구체적으로 제외되는 한계를 조건으로, 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 본 발명의 범위에 역시 포함되는 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있다. 제시된 범위가 하한이나 상한 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 경우, 이들 포함된 양쪽 한계들의 어느 하나를 제외한 범위 또한 본 발명에 포함된다.
달리 한정되지 않는 한, 본원에서 모든 기술용어 및 과학용어들은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 이제 전형적인 방법 및 재료들이 설명되지만, 본원에 설명된 것들과 유사하거나 동등한 어떤 방법 및 재료들도 또한 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있다. 본원에서 언급된 모든 간행물들은 간행물이 인용하고 있는 것에 관한 방법 및/또는 재료들을 개시 및 설명하기 위해 본원에 참고자료로서 포함된다.
본원에서 사용되고 첨부된 청구범위에서 사용된 단수형 "한", "및" 및 "그"는 문맥상 명확히 다르게 지시되지 않는 한 복수의 언급도 포함한다는 것을 유념해야 한다. 따라서, 예를 들어, "항원"에 대한 언급은 이러한 항원의 복수를 포함하며, "펩티드"에 대한 언급은 하나 이상의 펩티드 및 당업자가 알고 있는 그것의 등가물 등등을 포함한다.
본원에서 논의된 간행물들은 본 출원의 제출일 전의 개시된 내용들에 대해서만 제공된다. 본원에서는 어느 것도 본 발명이 선행 발명을 이유로 이러한 간행물들에 선행하여 권리를 받지 못한다는 승인으로서 구성되어서는 안 된다. 더 나아가, 제공된 간행물의 날짜는 실제 간행일과 다를 수 있으며, 이것은 개별적으로 확인될 필요가 있을 수 있다.
발명의 상세한 설명
본원에 개시된 de-N-아세틸 시알산(deNAc SA) 항원 조성물은 암 면역요법에서 유용할 뿐만 아니라 항체-기반 암 화학요법에서 사용될 수 있는 항체의 제조에 유용하다. 따라서, 본 명세서는 deNAc SA 항원, 및 항-종양 면역반응의 도출 및/또는 항-종양 면역반응의 증진에 있어서 이들의 사용 방법을 제공하며, 여기서 종양은 세포 표면 접근가능한 deNAc SA 항원을 갖는 세포를 함유한다.
일반적으로, deNAc SA 항원은 de-N-아세틸 시알산 잔기를 함유하는데, 이 잔기가 피험자에게 투여된 후 암 세포 상의 deNAc SA 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 도출할 수 있다. 어떤 구체예에서, deNAc SA 항원은 인간 조직에 존재하는 자기 폴리시알산(PSA) 항원과 최소 교차-반응성을 갖는 항체반응을 제공한다. 최소 deNAc SA 에피토프는 하나 또는 양 잔기가 de-N-아세틸 잔기를 함유하는 시알산 잔기의 이당이다. 또한, 최소 deNAc SA 에피토프는 C-5 아미노기 상의 N-아세틸기가 자유 아민을 남기면서 제거되거나, 또는 두 잔기 중 하나는 de-N-아세틸화되고 두 번째 잔기가 N-아세틸기(그러나, 어떤 구체예에서는 N-프로피오닐기가 아니다)를 함유하는 하나 이상의 시알산 잔기를 함유하는 이당 단위로서 설명될 수 있다. 이 최소 에피토프를 정의하는 이당 단위는 환원 단부, 비-환원 단부, 또는 시알산 잔기의 중합체 내부에(예를 들어, 다당 내부에) 있을 수 있다. N-아세틸화 잔기를 함유하는 PSA와 관련하여 de-N-아세틸화 잔기는 면역원성으로서, deNAc SA 에피토프와 반응하는 항체를 도출하지만, 인간 PSA 항원과의 반응성은 최소이거나 검출되지 않는다.
Granoff et al., 1998, J Immunol 160:5028(항-N-Pr NmB PS mAb); 미국특허 제6,048,527호(항-NmB 항체); 및 미국특허 제6,350,449호(항-NmB 항체)에 설명된,쥐 항-N-Pr NmB 다당 mAb(단클론 항체)인 SEAM-3을 사용하여 de-N-아세틸화 NmB 다당 에피토프가 확인되었다.
본 발명은 deNAc SA 에피토프, 및 항-deNAc SA 에피토프 항체반응을 도출하기 위해 숙주에 투여하도록 적합하게 된 이것의 제제를 특징으로 한다. deNAc SA 항원 조성물은 항-deNAc SA 에피토프 면역반응, 특히 항-deNAc SA 에피토프 항체반응을 도출하기 위해 피험자에게 투여하도록 적합하게 될 수 있으며, 상기 면역반응은 어떤 암성 세포의 표면에 있는 deNAc SA 에피토프에 대한 것으로서, 이에 대해서 아래 상세히 설명된다. 또한, deNAc SA 항원 조성물은 암성 세포의 표면에 있는 deNAc SA 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는데 사용될 수 있다(예를 들어, deNAc 강글리오시드 또는 deNAc 시알산-변형 표면 접근가능한 단백질). 이러한 항체는 항체-기반 암 치료법에서 유용하다.
본 발명의 다른 특징들이 본원에서 설명되며, 본 명세서를 읽음으로써 당업자는 이들을 쉽게 알 수 있을 것이다.
정의
본원에서 제공되는 정의들은 우선권 출원에서 제시된 것들에 대하여 대비되어야 한다.
용어 "de-N-아세틸 시알산 항원"(이것은 또한 "de-N-아세틸화 시알산 항원" 또는 "deNAc SA 항원"이라고 할 수 있다)은 deNAc 시알산 에피토프(deNAc SA 에피토프)를 갖는 또는 이것을 의태하는 화합물을 말하며, 상기 에피토프는 최소한 시알산 또는 시알산 유도체의 잔기의 이량체에 의해서 정의되고, 이때 이량체는 N-아실화(예를 들어, 아세틸화 또는 프로피오닐화) 시알산 잔기 또는 시알산 유도체 잔기에 인접하여 적어도 하나의 de-N-아세틸화 시알산 잔기를 함유한다. 본 명세서에서 de-N-아세틸 시알산 항원의 예가 제공되며, 제한은 아니지만, de-N-아세틸화 다당 유도체("PS 유도체"), de-N-아세틸화 강글리오시드, 및 시알산 변형 단백질, 특히 포유류 세포, 특히 인간 세포, 더 구체적으로 암 세포의 세포외 표면에서 접근가능한 시알산 변형 단백질의 de-N-아세틸화 유도체를 포함한다. deNAc SA 항원을 출발 분자의 유도체(예를 들어, PS 유도체 또는 강글리오시드 유도체)로서 설명한 것이 de-N-아세틸 시알산 항원의 제조 방법에 관해 제한을 두려는 의도가 아니며, 전형적인 deNAc SA 항원의 구조를 설명하기 위한 편리한 방식으로서 의도된 것임을 유념해야 한다.
"SEAM-3 반응성 항원"은 단클론 항체(mAb) SEAM-3(ATCC 기탁 번호 HB-12170)과 특이적으로 결합하는 에피토프를 갖는 항원을 말한다. 전형적인 SEAM-3 반응성 항원은 작업예에서 제공된다.
"세포 표면 항원"(또는 "세포 표면 에피토프")는 세포분열 동안 우세하게 또는 단지 세포외 접근가능한 항원을 포함하여, 세포의 어떤 세포 주기 단계에서 세포외 접근가능한 세포의 표면에 있는 항원(또는 에피토프)을 말한다. 이와 관련하여, "세포외 접근가능한"은 세포막을 침투할 필요 없이 세포 바깥에 제공된 항체에 의해 결합될 수 있는 항원을 말한다.
본원에서 사용되는 "PS"는 다당, 일반적으로 캡슐형 다당, 특히 하나 이상의 de-N-아세틸화 잔기를 갖는 캡슐형 다당을 말하며, N. meningitidis 또는 대장균의 캡슐형 다당을 포함하고, 특히 관심 있는 것은 N. meningitidis B 군 및 대장균 K1의 캡슐형 다당이다. 본원에서 사용되는 "NmB PS"는 N. meningitidis B 군의 PS를 말한다. 본 명세서 전반에 걸쳐서 NmB PS에 대한 언급은 본 발명의 조성물의 제조 및 사용 방법을 따르는 PS 구조를 예시하는 것이다.
본원에서 사용되는 "PS 유도체"는 변형된, 일반적으로 화학적으로 변형된 다당(PS), 특히 Neisseria meningitidis B군(NmB) 또는 대장균 K1의 PS를 말하며, 특히 관심 있는 것은 하나 이상의 N-아세틸기 대신에 자유 아민(즉, 1차 아민)을 갖는 PS 유도체이다. 어떤 구체예에서, PS 유도체는 NmB이다. 다른 구체예에서, PS 유도체는 생합성적으로 제조된 강글리오시드 유도체(예를 들어, 포유류 세포, 예를 들어 암성 포유류 세포에서 제조된)이다. 본원에서 사용되는 "PS 유도체"는 본원에 설명된 것들과 같은 보호된 PS 유도체를 포함한다.
본원에서 사용되는 "de-N-아세틸화 PS 유도체"는 다당 유도체의 하나 이상의 잔기 중 C-5 위치에 하나 이상의 de-N-아세틸화 잔기, 예를 들어 하나 이상의 자유 아민을 가진 PS 유도체를 말한다. 용어 "de-N-아세틸화 PS 유도체"는 de-N-아세틸화 PS 유도체가 PS 분자로부터 아세틸기를 제거하는 것을 포함하는 과정에 의해 생성된 PS 유도체에 제한된다는 것을 의미하는 것이 아니라, 구체적으로 다르게 지시되지 않는 한, 어떤 적합한 방법(예를 들어, PS 생합성 동안 PS 분자 내로 혼입된 트리할로아실 보호기의 제거에 의해 de-N-아세틸화 PS 유도체에 자유 아민이 생성되는 생합성 방법)에 의해서 생성된 de-N-아세틸화 PS 유도체를 포괄한다는 의미이다. 더 나아가, 본원에서 PS 유도체와 관련하여 "de-N-아세틸화 잔기"는 자생 아세틸기를 대신하여 1차 아민을 갖는 분자에서의 시알산 잔기를 말하기 위해 사용된다.
"자유 아민"과 "1차 아민"은 본원에서 상호 교환하여 사용되며, NH2 기, 예를 들어 RNH2에 있는 것과 같은 NH2를 말하며, 여기서 R은 PS 유도체의 시알산 잔기이다.
"deNAc SA 항원 콘쥬게이트"는 캐리어 분자(예를 들어, 캐리어 단백질)에 연결된, 일반적으로 공유 연결된 deNAc SA 항원을 말한다. 전형적인 de-N-아세틸 시알산 항원 콘쥬게이트는 "PS 콘쥬게이트"를 포함하는데, 이것은 일반적으로 캐리어 분자와 알파(2→8) N-아세틸 뉴라민산 또는 이 단일체 단위를 함유하는 어떤 다른 다당의 동종선형 중합체, 또는 본 발명의 de-N-아세틸화 PS 유도체를 포함하는 그 유도체의 콘쥬게이트를 말한다. 특히 관심 있는 것은 캐리어 단백질과 Neisseria meningitidis 캡슐형 다당(특히, B 군 캡슐형 다당)의 유도체, 특히 본 발명의 de-N-아세틸화 PS 유도체의 콘쥬게이트이다. 또한, 관심 있는 것은 캐리어 단백질과 E. coli K1 캡슐형 다당의 유도체, 특히 본 발명의 de-N-아세틸화 PS 유도체의 콘쥬게이트이다.
de-N-아세틸 시알산 항원과 콘쥬게이트된 캐리어와 관련하여 사용되는 "캐리어"는 일반적으로 항원과 연결되었을 때 T-세포를 활성화하여 모집함으로써 T-세포 의존성 항체 생산을 증대시킬 수 있는 T-의존성 항원으로 작용하는 물질을 말한다. 캐리어 자체가 강한 면역원성일 필요는 없지만, 강한 면역원성 캐리어도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이와 관련하여, 캐리어는 일반적으로 폴리펩티드이며, 이것은 단백질 전체 또는 단백질의 단편일 수 있다.
"콘쥬게이트"는 일반적으로 공유 또는 비-공유의 화학적 연결을 말하며, 일반적으로는 공유 연결을 말하는데, de-N-아세틸화 PS와 캐리어를 가까이 회합시킴으로써 비-콘쥬게이트 de-N-아세틸 시알산 항원에 비해 캐리어-콘쥬게이트 de-N-아세틸 시알산 항원의 면역원성이 증가된다.
본원에서 사용되는 "화학요법"은 질환의 치료에서 제제(예를 들어, 약물, 항체 등), 특히 암성 세포만을 선택적으로 파괴하는 제제(들)의 사용을 말하며, 특히 관심 있는 것은 암의 치료이다.
"면역요법"은 질환 항원에 대한 면역반응을 조정함에 의한 질환(예를 들어, 암)의 치료를 말한다. 본 출원과 관련하여, 면역요법은 항체의 투여에 의해 및/또는 피험자에게 항-종양 항원 면역반응을 도출하는 항원의 투여에 의해 피험자에게 항암 면역반응을 제공하는 것을 말한다.
본원에서 사용되는 "치료" 또는 "치료하는"은 피험자, 일반적으로 포유류 피험자, 일반적으로 인간 피험자에의 어떤 치료학적 개입을 의미하며, (i) 예방, 즉 임상적 증상이 발생하지 못하도록 하는 것, 예를 들어 해로운 상태로의 질환 진행을 예방하는 것을 포함하여, 임상적 증상의 발생 위험의 감소; (ii) 억제, 즉 임상적 증상의 발생 또는 추가의 발생의 정지, 예를 들어 활성 질환의 완화 또는 완전한 억제, 검출가능한 암성 세포의 제거를 포함할 수 있는, 그에 따른 종양 부담의 감소; 및/또는 (iii) 경감, 즉 임상적 증상의 퇴행의 야기를 포함한다.
용어 "보호적 면역"은 포유류에게 투여된 백신 또는 면역화 일정이 질환(예를 들어, 암)을 예방하거나, 발생을 지연하거나, 또는 심각성을 감소시키거나, 또는 질환의 증상들을 줄이거나 또는 전체적으로 제거하는 면역반응을 유도함을 의미한다.
항체 결합과 관련하여 "자기반응성"은 항체가 숙주 항원(예를 들어, 숙주에 자생하는 폴리시알산(PSA))과 유의한 결합을 나타냄을 의미한다. 자기반응성 항체는 숙주 항원(예를 들어, 비-암성 숙주세포 상의 PSA)뿐만 아니라 외래 항원(예를 들어, 암성 세포에 의해 제시된 종양 항원, NmB PS 또는 E. coli K1 PS)과도 결합하는 것들을 포함한다. "비-자기반응성 항체"는 숙주 항원과 유의하게 또는 검출가능하게 결합하지 않는 항체이며, 특히 관심 있는 것은 자생 숙주 항원에 대해 검출가능한 결합을 나타내지 않는 것이다. 관심의 비-자기반응성 항체는 de-N-아세틸 시알산 에피토프(예를 들어, 암성 세포의 de-N-아세틸화 강글리오시드의 deNAc SA 에피토프, NmB PS 또는 E. coli K1 PS의 deNAc SA 에피토프)와 특이적으로 결합하는 항체로서, 이 항체는 항체가 결합하는 세포에 대해 생육성의 감소를 촉진할 수 있다(예를 들어, NmB 및/또는 E. coli K1에 대해 살균성이고 및/또는 암 세포의 세포 생육성 감소를 촉진한다).
문구 "면역반응을 도출하기에 충분한 양으로"(예를 들어, 제제 중에 존재하는 에피토프에 대해)는 특정 항원 제제의 투여 전후에 측정된 면역반응 지표에 검출가능한 차이가 있음을 의미한다. 면역반응 지표는, 제한은 아니지만, 항체 역가 또는 특이성을 포함하며, 효소결합 면역분석법(ELISA), 유세포분석법, 면역침전법, Ouchter-Lowry 면역확산법과 같은 분석법; 예를 들어, 스폿, 웨스턴 블롯 또는 항원 어레이의 결합 검출 분석법; 세포독성 분석법 등에 의해서 검출된다.
용어 "항체"(또한 "면역글로불린"과 상호 교환하여 사용됨)는 다클론 및 단클론 항체 제제(이때 항체는 어떤 관심의 부류일 수 있다(예를 들어, IgM, IgG, 및 이것의 하위 부류)뿐만 아니라, 하이브리드 항체, 변형 항체, F(ab')2 단편, F(ab) 분자, Fγ 단편, 파지 상에 가변적으로 나타나는 단쇄 단편(scFγ), 단쇄 항체, 단일 도메인 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 및 모 항체 분자의 면역학적 결합 특성을 나타내는 기능적 단편들을 포함하는 제제를 포괄한다. 어떤 구체예에서, 예를 들어 암 치료법에서, 보체-매개 사멸 및/또는 항체-의존성 세포 세포독성(ADCD)를 제공하는 항체에 특히 관심이 있다. 본원에서 설명된 항체들은, 예를 들어 방사선 동위원소, 검출가능한 산물을 생성하는 효소, 형광 단백질 등으로 검출가능하게 표지될 수 있다. 더 나아가, 항체는 다른 부분, 예를 들어 세포독성 분자 또는 기타 분자(예를 들어, 암 세포에 항암제를 송달하기 위해), 특이적 결합 쌍의 구성원, 예를 들어 바이오틴(바이오틴-아비딘 특이적 결합 쌍의 구성원) 등에 콘쥬게이트될 수 있다. 또한, 항체는 폴리스티렌 플레이트 또는 비드, 테스트 스트립 등과 같은 지지체(예를 들어, 고체 지지체)에 결합될 수 있다.
면역글로불린 폴리펩티드는 카파 및 람다 경쇄, 및 알파, 감마(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 델타, 엡실론 및 뮤 중쇄, 또는 다른 종에서의 등가물을 포함한다. 전장 면역글로불린 "경쇄"(일반적으로 약 25 kDa 또는 약 214개 아미노산으로 이루어짐)는 NH2-말단에 약 110개 아미노산의 가변영역 및 COOH-말단에 카파 또는 람다 불변영역을 포함한다. 전장 면역글로불린 "중쇄"(약 50 kDa 또는 약 446개 아미노산으로 이루어짐)도 유사하게 가변영역(약 116개 아미노산) 및 전술한 중쇄 불변영역 중 하나, 예를 들어 감마(약 330개 아미노산) 불변영역을 포함한다.
면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변영역은 3개의 과가변영역에 의해 중단되는 "프레임워크" 영역(FR)으로 이루어지며, 이것을 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"이라고 하기도 한다. 프레임워크 영역 및 CDR의 범위는 정확히 정의되어 있다(예를 들어, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. Kabat et al. U.S. Department of Health and Human Services, (1991), 및 Lefranc et al. IMGT, the international ImMunoGeneTies information system
Figure 112008052552933-PCT00004
. Nucl. Acids Res. 2005, 33. D593-D597) 참조). IMGTS 시스템이 어떻게 공식화되었으며, 다른 시스템들과 어떻게 비교되는지를 포함하여, IMGTS 시스템에 대한 상세한 논의가 월드와이드웹 사이트(imgt.cines.fr/textes/IMGTScientiflcChart/Numbering/IMGTnumberingsTable.html)에 제공된다. 상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열은 종 내에서 비교적 보존된다. 항체의 프레임워크 영역은 구성성 경쇄 및 중쇄의 프레임워크 영역과 조합되어 CDR의 위치를 정하여 정렬하는 작용을 한다. CDR은 일차적으로 항원의 에피토프와의 결합을 초래한다.
"키메라 항체"는, 예를 들어 상이한 종의 상이한 항체에 속하는 항체 가변영역 및 불변영역 유전자로부터 전형적으로 유전조작에 의해 구성된 경쇄 및/또는 중쇄 유전자를 갖는 항체를 말한다. 예를 들어, 비-인간(예를 들어, 마우스) 단클론 항체 유전자의 가변 세그먼트가 감마 1 및 감마 3과 같은 인간 불변 세그먼트에 연결될 수 있다. 치료학적 키메라 항체의 한 예는 비-인간(예를 들어, 마우스) 항체의 가변 또는 항원-결합 도메인과 인간 항체의 불변 또는 이펙터 도메인으로 이루어진 하이브리드 단백질이며, 다른 포유류 종들도 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "인간화 항체" 또는 "인간화 면역글로불린"은 인간 항체의 상응하는 위치에 있는 아미노산으로 치환된 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 프레임워크 영역, 불변영역 또는 CDR 안에)을 함유하는 비-인간(예를 들어, 마우스 또는 토끼) 항체를 말한다. 일반적으로, 같은 항체의 비-인간화 버전과 비교하여 인간화 항체는 인간 숙주에서 감소된 면역반응을 야기한다.
본원의 방법에 의해서 설계되어 제조된 인간화 항체가 항원 결합 또는 다른 항체 기능에 실질적으로 아무런 영향이 없는 추가의 보존성 아미노산 치환을 가질 수 있음이 이해된다. 보존성 치환은 다음의 군에 속한 것들과 같은 조합을 의도한다: gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; 및 phe, tyr.
변이체 항체와 같은 폴리펩티드의 "변이체"는 기준 서열, 예를 들어 모 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 변형된 폴리펩티드로서 정의되며, 자연 발생 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 변형은 아미노산 치환, 결실 또는 삽입, 또는 이것들의 조합을 포함한다. 관심의 항체 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드의 변이체들은 그들의 기본적 구조 특징 및 관심의 항원과 결합하는데 있어서의 생물학적 활성, 어떤 구체예에서는 암 세포 생육성의 감소를 행하는데 있어서의 생물학적 활성을 보유한 것들이다.
얼마나 많은 아미노산 잔기가 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는지를 결정하는 길잡이는 폴리펩티드의 서열과 관련된 구조 및 기능을 갖는 폴리펩티드의 서열, 예를 들어 다른 출처로부터의 서열을 비교함으로써(예를 들어, 포유류 출처, 예를 들어 인간, 래트, 마우스 등에서 유래하는 서열들의 비교) 알아낼 수 있다.
항체 특징과 관련하여 용어"항체의 특이적 결합" 또는 "항원-특이적 항체"는 상이한 항원들의 균질 혼합물에 존재하는 특정 항원과 우선적으로 결합하는 항체의 능력을 말한다. 어떤 구체예에서, 특이적 결합 상호작용에 의해 샘플 중의 바람직한 항원과 바람직하지 않은 항원(또는 "표적"과 "비-표적" 항원)이 식별되며, 어떤 구체예에서는 약 10배 내지 100배 이상(예를 들어, 약 1000배 또는 10,000배 이상) 식별된다. 어떤 구체예에서, 항체와 항원이 항체-항원 복합체로 특이적으로 결합할 때 항체와 항원 간의 친화성이 10-6M 미만, 10-7M 미만, 10-8M 미만, 10-9M 미만, 10-9M 미만, 10-11M 미만, 또는 약 10-12M 미만, 또는 그 미만의 KD(해리상수)에 의해 특성화된다.
또한, 다당, 인지질, 단백질 또는 펩티드와 같은 항원을 언급할 때, 특히 다른 분자들의 이종성 집단을 포함할 수도 있는 조건하에서(예를 들어, 샘플 중에서 또는 생체내에서) 항원의 존재를 기초로 하는 및/또는 항원의 존재를 시험하는 결합 반응과 관련하여 문구 "항체와 특이적으로 결합한다" 또는 "와 특이적으로 면역반응성인"이 사용된다. 따라서, 관련 조건하에서(예를 들어, 지정된 면역분석 조건하에서), 특히 항체가 발생하는 표적 항원의 에피토프와의 결합을 비교했을 때, 명시된 항체 또는 항체들은 샘플 중에 존재하는 특정 항원 또는 항원들과는 결합하고, 다른 분자들과는 유의한 양으로 결합하지 않는다.
"치환"은 아미노산 서열 또는 폴리펩티드 또는 핵산과 비교하였을 때, 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드가 다른 아미노산 또는 뉴클레오티드로 대체된 결과이다. 폴리펩티드와 관련하여, 만일 치환이 보존성이라면, 폴리펩티드에 치환되는 아미노산은 그것이 치환하는 아미노산과 유사한 구조적 또는 화학적 특성(예를 들어, 전하, 극성, 소수성 등)을 가진다. 자연 발생 아미노산의 보존성 치환은 일반적으로 제 1 아미노산이 제 1 아미노산과 동일한 군에 있는 제 2 아미노산으로 치환되는 결과를 가져오며, 전형적인 아미노산 군은 다음과 같다: gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; and phe, tyr.
"결실"은 자연 발생 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기가 부재하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 변화로서 정의된다. 폴리펩티드 및 폴리펩티드 구성요소 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 관련하여, 결실은 약 2, 약 5, 약 10, 약 20 이하, 약 30 이하, 또는 약 50 이하, 또는 그 이상의 아미노산의 결실을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 하나 이상의 결실을 함유할 수 있다.
"삽입" 또는 "첨가"는 자연 발생 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기의 첨가를 가져오는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 변화이다. "삽입"은 일반적으로 폴리펩티드 또는 핵산 서열 안에 하나 이상의 잔기가 첨가되는 것을 말하고, "첨가"는 삽입일 수도 있고, 또는 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 첨가된 아미노산 잔기 또는 핵산의 5' 또는 3' 단부에 첨가된 뉴클레오티드를 말할 수도 있다. 삽입 또는 첨가는 약 10 이하, 약 20 이하, 약 30 이하, 또는 약 50 이하, 또는 그 이상의 아미노산으로 이루어질 수 있다.
아래 예시되는 대로, "상응하는 아미노산"은 둘 이상의 아미노산 서열이 정렬되었을 때 동일한 위치(즉, 서로 가로질러 놓인)에 있는 아미노산 잔기이다. 항체 서열을 정렬하여 번호 매기는 방법은 Chothia(상동), Kabat(상동), 및 기타 문헌에 상세히 제시된다. 본 분야에 공지된 대로(예를 들어, Kabat 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, DHHS, Washington, DC 참조), 정렬을 완성하기 위해, 때로 1개, 2개 또는 3개의 갭 및/또는 1개, 2개, 4개 또는 4개 잔기까지, 또는 약 15개 잔기(특히, L3 및 H3 CDR에서)까지의 삽입이 항체의 한쪽 또는 양쪽 아미노산에서 만들어질 수 있다.
"천연" 항체는 항체의 중쇄 및 경쇄 면역글로불린이 다세포생물의 면역 시스템에 의해서 자연적으로 선택된 항체이며, 이와 반대로, 예를 들어 파지 디스플레이, 또는 인간화 항체에 의해서는 비자연적으로 쌍을 이룬 항체가 만들어진다. 이와 같이, 피험자 모 항체는 일반적으로 어떤 바이러스성(예를 들어, 박테리오파지 M13)-유래 서열을 함유하지 않는다. 비장, 림프절 및 골수가 천연 항체를 생산하는 조직의 예이다.
주어진 항체 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드의 변이체와 관련하여, "치환가능한 위치"는, 바람직하게는 항체의 결합 활성의 유의한 감소 없이, 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 폴리펩티드 아미노산 서열의 특정 위치이다. 치환가능한 위치를 확인하는 방법, 및 이들이 어떻게 치환되는지에 대해서는 아래 더 상세히 설명된다. 치환가능한 위치는 또한 "변이 관용 위치"라고도 언급될 수 있다.
아래 더 상세히 설명되는 대로, "모" 항체는 아미노산 변형을 위한 주형 또는 표적인 항체이다. 어떤 구체예에서, 아미노산이 "도너" 항체에 의해 모 항체에 기증됨으로써 변형된 항체가 생성될 수 있다.
아래 더 상세히 설명되는 대로, "관련 항체"는 공통 B 세포 선조를 갖는 세포들에 의해 생산되는 유사한 서열을 갖는 항체이다. 이러한 B 세포 선조는 재배열된 경쇄 VJC 영역 및 재배열된 중쇄 VDJC 영역을 갖는 게놈을 함유하며, 아직 친화성 성숙분열을 겪지 않은 항체를 생산한다. 비장 조직에 존재하는 "나이브" 또는 "버진" B 세포가 전형적인 B 세포 공통 선조이다. 관련 항체들은 항원의 동일한 에피토프와 결합하고, 전형적으로 서열이 매우 유사하며, 특히 L3 및 H3 CDR이 유사하다. 관련 항체들에서 H3와 L3 CDR은 둘 다 동일한 길이를 가지며, 거의 동일한 서열을 가진다(즉, 0, 1 또는 2개의 잔기만 차이 난다). 관련 항체들은 공통 항체 선조에 의하여 관련되며, 항체는 나이브 B 세포 선조에 의해 생산된다. 용어 "관련 항체"는 B-세포에 의해 생산된 공통 항체 선조를 갖지 않는 항체 군을 설명하지는 않는다.
항체의 중쇄 또는 경쇄 "가변영역"은 이 사슬들의 N-말단 성숙 도메인이다. VH는 항체 중쇄의 가변 도메인이다. VL은 항체 경쇄의 가변 도메인으로, 카파(K) 또는 람다 이소타입을 가질 수 있다. K-1 항체는 카파-1 이소타입을 가지고, K-2 항체는 카파-2 이소타입을 가지며, VL은 가변 람다 경쇄이다.
본원에서 사용되는 용어 "단클론 항체"는 동종 항체 집단을 갖는 항체 조성물을 말한다. 이 용어는 항체가 제조된 방식에 의한 제한을 받지 않는다. 이 용어는 전체 면역글로불린 분자뿐만 아니라 Fab 분자, F(ab')2 단편, Fγ 단편, 파지 상에 가변적으로 나타나는 단쇄 단편(scFγ), 항체의 항체-결합 부분과 비-항체 단백질을 포함하는 융합 단백질, 및 모 단클론 항체 분자의 면역학적 결합 특성을 나타내는 다른 분자들을 포괄한다. 다클론 및 단클론 항체의 제조 방법은 본 분야에 공지되어 있으며, 아래 충분히 더 설명된다.
본원에서 상호 교환하여 사용되는 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 어떤 길이의 아미노산의 중합 형태를 말하며, 이것은 코딩 및 비-코딩 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도체화된 아미노산, 및 펩티드 백본이 변형된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 이 용어는, 제한은 없지만, N-말단 메티오닌 잔기가 있을 수도 없을 수도 있는, 이종 리더 서열과 동종 리더 서열의 융합체인 이종 아미노산 서열과의 융합 단백질; 면역학적으로 태그된 단백질; 검출가능한 융합 파트너와의 융합 단백질, 예를 들어 융합 파트너로서 형광 단백질, 베타-갈락토시다제, 루시페라제 등을 포함하는 융합 단백질; 등등을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 어떤 크기를 가질 수 있으며, 용어 "펩티드"는 8-50개 잔기(예를 들어, 8-20개 잔기) 길이의 폴리펩티드를 말한다.
핵산 또는 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 "이종성"은 일반적으로 핵산 또는 폴리펩티드가 이 핵산 또는 폴리펩티드가 회합되거나 연결되는 것과는 다른 기원(예를 들어, 상이한 서열의 분자, 상이한 종 기원, 등)에서 유래하는 것을 의미하며, 따라서 상기 핵산 또는 폴리펩티드는 자연에서 발견되지 않는 것이다. 예를 들어, 융합 단백질에서, 경쇄 폴리펩티드 및 리포터 폴리펩티드(예를 들어, GFP)를 서로 "이종성"이라고 한다. 유사하게, 마우스 항체로부터의 CDR과 인간 항체로부터의 불변영역을 서로 "이종성"이라고 한다.
"분리된"은 화합물이 자연에서 이 화합물을 동반하는 전체 또는 일부 성분들로부터 분리된 것을 의미한다. 또한, "분리된"은 제조과정(예를 들어, 화학적 합성, 재조합 발현, 배양 배지 등) 동안 화합물을 동반하는 전체 또는 일부 성분들로부터 분리된 화합물의 상태를 말한다.
"정제된"은 관심의 화합물이 자연에서 화합물을 동반하는 성분들로부터 분리되어 농후화된 형태로 제공된 것을 의미한다. 또한, "정제된"은 제조과정(예를 들어, 화학적 합성, 재조합 발현, 배양 배지 등) 동안 화합물을 동반할 수 있는 성분들로부터 분리되어 농후화된 형태로 제공된 관심의 화합물을 말한다. 전형적으로, 화합물은 그것이 자연적으로 회합되거나 제조과정 동안 회합되는 유기 분자로부터 적어도 50중량% 내지 60중량% 자유로울 때 실질적으로 순수하다. 일반적으로, 적어도 75중량%, 더 일반적으로 적어도 90중량%, 보편적으로 적어도 99중량%의 관심의 화합물이 제제이다. 예를 들어, 자연 출처(예를 들어, 박테리아)로부터의 추출에 의해, 화합물의 화학적 합성에 의해, 또는 정제와 화학적 변형의 조합에 의해, 실질적으로 순수한 화합물이 획득될 수 있다. 또한, 예를 들어, 관심의 항체와 결합하는 화합물을 가진 샘플을 농후화함으로써 실질적으로 순수한 화합물이 획득될 수 있다. 순도는 어떤 적합한 방법, 예를 들어 크로마토그래피, 질량분광법, HPLC 분석 등에 의해서 측정될 수 있다.
"농후화"는 조성물 중의 물질(예를 들어, 항체 또는 항원)이 실험자 또는 임상학자에 의해 조작됨으로써, 항원 조성물이 획득된 균주 중의 항원의 농도에 비하여, 적어도 2배 이상의 농도(중량 기준), 일반적으로 적어도 3배 이상의 농도(전체 중량 기준), 일반적으로 적어도 10배 이상의 농도로, 더 일반적으로 적어도 100배 이상의 농도, 더욱더 일반적으로 적어도 1,000배 이상의 농도로 존재하게 됨을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 만일 특정 항원의 농도가 전체 제제(또는 총 단백질)의 g 당 1㎍이라면, 농후화된 제제는 전체 제제(또는 총 단백질)의 g 당 적어도 3㎍을 함유할 것이다.
본원에서 사용되는 세포의 "불활성화"는 세포가 세포분열하여 자손을 형성할 수 수 없게 되었다는 것을 의미한다. 그렇지만, 세포는 일정 기간 동안 자극 및/또는 생합성에 반응할 수는 있으며, 이로써, 예를 들어 세포 표면 분자(예를 들어, 세포 표면 단백질 또는 다당)를 생성할 수 있다.
용어 "deNAc SA 항원과 관련하여 면역학적으로 나이브한"은 단독 또는 거대 분자의 환경에서, 면역반응을 야기하기에(예를 들어, 초회 자극) 충분한 양의 본원에 설명된 de-N-아세틸 시알산 항원(예를 들어, PS 유도체)에 노출된 적이 없는 개체(예를 들어, 인간 환자 같은 포유류)를 나타낸다. 만일 개체가 de-N-아세틸 시알산 항원 콘쥬게이트 백신(1회 이상의 투약의)에 노출된 적이 있다면, 이 개체는 항체의 생산에 대한 경향을 가진다.
"초회 자극" 피험자는 면역반응을 도출하기에 충분한 양의 항원(예를 들어, de-N-아세틸화 SA 항원)에 노출(예를 들어, 투여에 의해)되었으며, 이후 동일한 항원 또는 제 2 항원(예를 들어, de-N-아세틸 시알산 항원 콘쥬게이트)에 노출됨으로써 보호성 면역반응을 나타내는 피험자를 말한다.
"임상적으로 관련된 자기항체 반응이 없는"은 종래의 NmB 다당 백신(예를 들어, 미국특허 제4,727,136호에 설명된 PS 콘쥬게이트 백신(N-Pr-NmB 콘쥬게이트 백신)으로 나이브한 피험자를 면역화한 후의 자기항체 생산과 비교하여, 본원에 설명된 면역화 방법을 사용했을 때 자기항체의 생산이 적어도 25%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 그 이상까지 감소된 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 "제약학상 허용되는 부형제"는 피험자에 관심의 화합물(들)의 투여를 위한 제약학상 허용되는 비히클을 제공하는 어떤 적합한 물질을 말한다. "제약학상 허용되는 부형제"는 제약학상 허용되는 희석제, 제약학상 허용되는 첨가제 및 제약학상 허용되는 담체라고 언급된 물질들을 포괄할 수 있다.
본원에서 사용되는 "과 조합하여"는, 예를 들어 제 1 치료법이 제 2 치료법의 투여 전 과정 동안 투여되는 경우; 제 1 치료법이 제 2 치료법의 투여와 중복되는 어떤 기간 동안 투여되는 경우, 예를 들어 제 1 치료법의 투여가 제 2 치료법의 투여 전에 시작되고, 제 1 치료법의 투여가 제 2 치료법의 투여가 끝나기 전에 끝나는 경우; 제 2 치료법의 투여가 제 1 치료법의 투여 전에 시작되고, 제 2 치료법의 투여가 제 1 치료법의 투여가 끝나기 전에 끝나는 경우; 제 1 치료법의 투여가 제 2 치료법의 투여가 시작되기 전에 시작되고, 제 2 치료법의 투여가 제 1 치료법의 투여가 끝나기 전에 끝나는 경우; 제 2 치료법의 투여가 제 1 치료법의 투여가 시작되기 전에 시작되고, 제 1 치료법의 투여가 제 2 치료법의 투여가 끝나기 전에 끝나는 경우의 용법을 말한다. 이와 같이, "조합하여"는 또한 둘 이상의 치료법의 투여를 포함하는 섭생을 말한다. 또한, 본원에서 사용되는 "와 조합하여"는 동일 제제 또는 상이한 제제로, 동일 경로 또는 상이한 경로에 의해, 그리고 동일한 제형 타입 또는 상이한 제형 타입으로 투여될 수 있는 둘 이상의 치료법의 투여를 말한다.
용어 "피험자", "숙주", "환자" 및 "개체"는 본원에서 상호 교환하여 사용되며, 진단법 또는 치료법이 바람직한 어떤 포유류 피험자, 특히 인간을 말한다. 다른 피험자로서 소, 개, 고양이, 기니어피그, 토끼, 래트, 마우스, 말 등등이 있을 수 있다.
본원에 설명된 암 치료법 및 진단법과 관련하여, "피험자" 또는 "환자"는 본원에서 상호 교환하여 사용되며, 종양을 가진 피험자, 종양을 가진 것으로 의심되는 피험자, 종양이 발생할 위험이 있는 피험자를 말하고, 여기서 암은 세포 표면에 de-N-아세틸 시알산 항원(예를 들어, 적어도 부분적으로 de-N-아세틸화된 강글리오시드, de-N-아세틸화 시알산-변형 단백질)을 갖는 암성 세포와 관련된 것이다. 이러한 피험자로부터 획득한 샘플도 마찬가지로 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합하다.
본원에서 사용되는 용어 "결정하는", "측정하는", "평가하는" 및 "분석하는"은 상호 교환하여 사용되며, 정성적 결정 및 정량적 결정을 모두 포함한다.
더 나아가, 어떤 선택적 또는 대안적 구성요소가 배제되도록 청구범위가 작성될 수 있음에 주지한다. 따라서, 본 서술은 청구된 구성요소의 인용과 관련하여 "단독으로", "단지" 등의 배타적 용어의 사용, 또는 "부정적" 제한의 사용에 대한 선행적 기초로서 사용될 것을 의도한다.
deNAc SA 항원 및 콘쥬게이트
본 명세서의 de-N-아세틸 시알산(deNAc SA) 항원은 적어도 시알산 또는 시알산 유도체의 잔기의 이량체의 최소 에피토프를 함유하며, 여기서 이량체는 N-아실화(예를 들어, 아세틸화 또는 프로피오닐화) 시알산 잔기 또는 시알산 유도체 잔기에 인접하여 적어도 하나의 de-N-아세틸 시알산 잔기를 함유한다. 본원에서 deNAc SA 에피토프라고 하는 이 이량체 에피토프는 de-N-아세틸 시알산 항원의 어떤 용매 접근가능한 영역 내에 위치될 수 있다. 예를 들어, de-N-아세틸화 PS 유도체처럼, deNAc SA 항원이 중합체(예를 들어, 다당) 내에 위치되는 경우, deNAc SA 에피토프는 환원 단부, 비-환원 단부, 또는 화합물의 안쪽 내부에 위치될 수 있다(예를 들어, 화합물의 환원 단부 또는 비-환원 단부에서 유래하는 1, 2, 3, 4, 5, 10 또는 그 이상의 잔기). 이량체 에피토프는 deNAc SA 항원 내에 하나 이상의 이량체 단위로서(예를 들어, 연속 또는 비연속 이량체 반복 단위) 존재할 수도 있거나, 또는 deNAc SA에 존재하는 다른 단위 내에, 예를 들어 연속 또는 비연속 반복 단위로서 존재할 수 있는 삼량체 단위 내에 존재할 수도 있다. 본 발명의 범위에 있는 전형적인 분자들이 도 6-33에 제시된다.
출발 물질 또는 백본으로서 박테리아성 PS 또는 강글리오사이드를 갖는 것들을 포함하여, 본원에 설명된 모든 deNAc SA 화합물이 본원에 설명된 면역화, 치료 방법, 및 진단 방법 중 어느 것에 사용될 수 있음을 유념해야 한다. 따라서, 예를 들어, deNAc SA 항원(예를 들어, NmB PS를 사용하여 생성된)은 암 백신과 관련하여 사용될 수 있으며, 암의 치료에 사용될 수 있는 항체를 발생시키는데 사용될 수 있다. 마찬가지로, de-N-아세틸 시알산 항원(예를 들어, 포유류 세포 강글리오시드를 사용하여 생성된 것과 같은)은 NmB 백신과 관련하여 진단 방법에서 NmB를 검출하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 유용한 본원에 설명된 deNAc SA 항원은 일반적으로 적어도 하나의 이량체 에피토프를 포함하며, 완전히 de-N-아세틸화된 다당 또는 적어도 부분적으로 de-N-아세틸화된 다당으로 존재할 수 있고, 동종중합체 또는 이종중합체 분자로 존재할 수 있다. 예를 들어, deNAc SA 항원은 아래 제시된 바와 같이 하나 이상의 구조를 포함할 수 있다(예를 들어, 아래 화학식 I-VIII 참조). deNAc SA 항원은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60개, 또는 그 이상의 시알산 잔기 또는 그 유도체를 포함할 수 있으며, 약 2 내지 약 60, 약 10 내지 약 50, 약 30 내지 약 50, 약 10 내지 20, 또는 약 12 내지 약 18의 중합도(Dp)를 가질 수 있고, 특히 관심 있는 것은 약 2 내지 약 10의 Dp이다. 더 나아가, 더 작은 크기의 deNAc SA 항원은 적합한 크기 및/또는 면역원성을 갖는 분자를 제공하기 위해 변형(예를 들어, 캐리어에 콘쥬게이트, 지질화 등)을 포함할 수 있다. deNAc SA 항원은 de-N-아세틸화 잔기에 인접하여 추가로 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 또는 그 이상을 포함할 수 있으며, 어떤 구체예에서, 특히 deNAc SA 항원이 N-아세틸화 잔기와 de-N-아세틸화 잔기만으로 이루어지고, 더 변형되지 않은 경우(예를 들어, 캐리어와의 콘쥬게이트에 의해 또는 2차 알킬아민을 함유하도록 환원 단부의 시알산 잔기를 변형함에 의해), deNAc SA 항원의 de-N-아세틸화 잔기는 분자의 전체 시알산 잔기의 30% 이하일 수 있고, N-아세틸화 잔기는 분자의 전체 시알산 잔기의 약 70% 이상일 수 있다. 최소 deNAc SA 에피토프가 존재한다는 가정하에서, "de-N-아세틸화"가 시알산 잔기의 중합체에 있는 다수의 de-N-아세틸 시알산 잔기를 말하며, 따라서 "de-N-아세틸화"는 용어 "적어도 부분적으로 de-N-아세틸화된"을 포괄한다는 것을 유념해야 한다.
특히 관심 있는 deNAc SA 항원은, 피험자에게 투여되었을 때, deNAc SA 에피토프를 나타내는 암 세포와 결합하는 항체의 생산을 도출하지만, 피험자의 PSA(비-암성 세포에서 발견되는 인간 PSA)와는 유의한 또는 검출가능한 교차-반응을 나타내지 않는 것들이다. 항-deNAc SA 항원 항체가 deNAc SA 에피토프-제시 암 세포의 생육성의 감소를 촉진하는 것들이다.
일반적으로, 관심의 deNAc SA 항원은 적어도 부분적으로 de-N-아실화됨으로써, deNAc SA 항원이, 예를 들어 다당 잔기 또는 그 유도체로 이루어진 양쪽 이온성 화합물이 되고, 상기 설명된 에피토프를 포함하는 하나 이상의 이량체, 및/또는 하나 이상의 삼량체를 포함하게 된다. de-N-아세틸 PS 유도체와 같은 deNAc SA 항원은 일반적으로 적어도 하나의 이량체 에피토프를 포함하며, 상기 이량체 에피토프는 (1) 제 1 및 제 2 de-N-아세틸화 잔기; (2) 제 1 N-아실화 잔기 및 제 2 인접 de-N-아실화 잔기(즉, 자유 아민기를 갖는 잔기), 이때 N-아실화 잔기는 N-프로피오닐(N-Pr) 기가 아니다; 또는 (3) 제 1 de-N-아실화 잔기(즉, 자유 아민기를 갖는 잔기) 및 제 2 인접 N-아실화 잔기를 갖는 것을 특징으로 한다. 어떤 구체예에서, N-아실화 잔기는 불포화 아실기를 포함한다; 다른 구체예에서, N-아실화 잔기는 N-프로피오닐(N-Pr) 기를 포함하지 않는다(즉, 다이머에 있는 시알산 잔기가 N-프로피오닐화되지 않는다).
본원에서 사용되는바, "아실기"는 포화 또는 불포화 아실기, 일반적으로 포화 또는 불포화 C2-18 아실기, 포화 또는 불포화 C2-16 아실기, 포화 또는 불포화 C2-12 아실기, 포화 또는 불포화 C2-10 아실기, 포화 또는 불포화 C2-8 아실기, 포화 또는 불포화 C2-6 아실기, 포화 또는 불포화 C2-4 아실기, 또는 포화 C2-4 아실기를 포함한다. 본원에서 사용되는 포화 아실기는 포화 알킬기에 연결된 카르보닐을 말하고, 본원에서 사용되는 불포화 아실기는 불포화 알킬기에 연결된 카르보닐을 말한다. 어떤 구체예에서, 특히 관심 있는 것은 불포화 아실기이다. 이량체의 잔기는 시알산 또는 시알산 유도체, 예를 들어 락톤 또는 환상 시알산일 수 있다.
따라서, deNAc SA 항원은 시알산 부분 또는 그 유도체(예를 들어, 락톤, 환상 시알산 등)의 하나 이상의 de-N-아세틸화 잔기를 포함하며, 상기 de-N-아세틸화 잔기는 환원 단부, 비-환원 단부, 또는 시알산 잔기의 중합체의 안쪽에서(즉, 환원 단부와 비-환원 단부 사이) deNAc SA 항원에 위치될 수 있고, 특히 관심 있는 것은 deNAc SA 항원이 다당 중합체의 환원 단부에 de-N-아세틸화 잔기를 갖는 것이다.
단일 이량체 에피토프를 포함하는 구조로서, 또는 둘 이상의 이량체 에피토프를 포함하는 중합체 단위로서 deNAc SA 항원이 제공될 수 있다. deNAc SA 항원은 동종중합체 또는 이종중합체 구조일 수 있으며, 아래 구조 중 하나 이상의 구조로 이루어질 수도 있고, 어떤 구체예에서는 de-N-아세틸화 또는 N-아세틸화 시알산 잔기가 추가될 수도 있다. 화학식이 "n" 단위(예를 들어, 이량체 또는 삼량체 구조 단위)와 관련하여 아래 제공되는 경우, deNAc SA 항원은 이러한 "n" 단위를 다수 포함할 수 있다. 예를 들어, deNAc SA 항원은 주어진 이량체 또는 삼량체 구조의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 연속 또는 비-연속 단위를 포함할 수 있으며, 이 경우 n은 각 단위 내의 연속된 이량체 또는 삼량체 구조의 수를 말한다. 이러한 이량체 및 삼량체 단위는 시알산 잔기에 의해 분리될 수 있다.
더 나아가, deNAc SA 항원은 다당 중합체의 비-환원 말단, 환원-말단, 또는 비-환원- 및 환원-말단 양쪽에서 시알산 잔기 또는 그 유도체에 부착된 추가의 부분을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, deNAc SA 항원은 하기 화학식 I에 의해 표시되는 구조를 포함하는 것들을 포함한다:
Figure 112008052552933-PCT00005
상기 식에서,
X 및 Y는 독립적으로 H, 아민 보호기(예를 들어, 트리할로아실기), 또는 포화 또는 불포화 아실기(일반적으로 포화 아실기)이며, 어떤 구체예에서, X 및 Y는 독립적으로 1) H 또는 아민 보호기; 또는 2) 포화 또는 불포화 아실기이고,
n은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 또는 그 이상, 일반적으로 5 이상, 더 일반적으로 약 10 이상이고, 약 2 내지 약 60, 약 10 내지 약 50, 약 30 내지 약 50, 약 10 내지 20, 또는 약 12 내지 약 18의 중합도(Dp)를 가질 수 있으며, 특히 관심 있는 것은 약 2 내지 약 10의 Dp이고,
더 나아가,
X가 포화 또는 불포화 아실기(어떤 구체예에서는 프로피오닐기 이외의 다른 기, 다른 구체예에서는 불포화 아실기 이외의 다른 기)일 때, Y는 H 또는 아민 보호기이고;
Y가 포화 또는 불포화 아실기(어떤 구체예에서는 프로피오닐기 이외의 다른 기, 다른 구체예에서는 불포화 아실기 이외의 다른 기)일 때, X는 H 또는 아민 보호기이다. 특히 관심 있는 다른 구체예에서, X 및 Y는 독립적으로 H 또는 포화 또는 불포화 아실기, 일반적으로 불포화 아실기이다. 다른 구체예에서, X 및 Y는 독립적으로 아민 보호기(예를 들어, 트리할로아실기) 또는 포화 또는 불포화 아실기, 일반적으로 포화 아실기이다. 어떤 구체예에서, 특히 X 또는 Y가 H 또는 불포화 아실기인 경우, PS 유도체는 90% 미만, 일반적으로 85% 미만, 또는 80% 미만으로 N-아실화되며, 특히 PS 유도체가 적어도 10 또는 20개의 잔기를 포함하는 경우 그러하다.
관심의 구체예에서, 화학식 I의 X는 포화 아실기이고, Y는 H 또는 아민 보 호기이다. 특히 관심 있는 구체예에서, 화학식 I의 X는 아세틸기이고, Y는 H 또는 아민 보호기(예를 들어, 트리할로아실기(예를 들어, 트리할로아세틸기))이다. 관심의 다른 구체예에서, 화학식 I의 X는 포화 아실기이고, Y는 H이다; 또는 X는 아세틸기이고, Y는 H이다.
X 또는 Y가 아민 보호기(예를 들어, 트리할로아실기)인 경우, 이러한 deNAc SA 항원은 본원에서 "보호된 deNAc SA 항원"(예를 들어, "보호된 PS 유도체")fkrh 하며, 이때 아민 보호기는 보호된 deNAc SA 항원의 추가 변형 동안, 예를 들어 분자와 캐리어(예를 들어, 캐리어 단백질)의 콘쥬게이션, 지질 부분의 첨가(예를 들어, 보호된 PS 유도체의 비-환원 단부에 아실아민의 첨가) 등의 추가 변형 동안 아민기가 반응하는 것을 방지하는 작용을 한다. 계속해서 잔기에 자유 아민을 제공하도록 아민 보호기가 변형될 수 있다. 보호된 deNAc SA 항원은 일반적으로 본원에 설명된 구조들에 의해 예시되며, 여기서 아민 보호기는 수소를 대신하여 가변적인 위치에 존재한다. 즉, 자유 아민을 제공하기 위해 deNAc SA 항원에 수소가 있는 것이 바람직한 경우, 보호된 deNAc SA 항원은 자유 아민의 수소를 대신하여 이 잔기에 아민 보호기를 함유한다.
본원에서 사용되는 "아민 보호기"는 분자의 다른 부분에서 일어나는 반응에 질소 원자가 참여하는 것을 방지하기 위해 분자의 아민 질소 원자에 결합된 라디칼 또는 원자단을 말한다. 용어 "아민-보호된"은 분자의 다른 부분에서 일어나는 반응에 질소 원자가 참여하는 것이 방지된 아민 질소 원자를 함유하는 분자의 구조적인 특징을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 전형적인 아민 보호기는, 제한은 아니지만, 카르바메이트, 아미드, N-알킬 및 N-아릴 아민, 이민 유도체, 엔아민 유도체, N-술포닐 등을 포함한다. 더 나아가, 전형적인 아민 보호기는, 제한은 아니지만, 포르밀, 트리플루오로아세틸, 프탈릴 및 p-톨루엔술포닐 등 아실 형; 벤질옥시카르보닐(Cbz) 및 치환 벤질옥시카르보닐, 1-(p-비페닐)-1-메틸에톡시-카르보닐 및 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 등 방향족 카르바메이트 형; tert부틸옥시카르보닐(tBoc), 에톡시카르보닐, 디이소프로필메톡시카르보닐, 및 알릴옥시카르보닐 등 지방족 카르바메이트 형; 시클로펜틸옥시카르보닐 및 아다만틸옥시카르보닐 등 환상 알킬 카르바메이트 형; 트리페닐메틸 및 벤질 등 알킬 형; 트리메틸실란 등 트리알킬실란; 및 페닐티오카르보닐 및 디티오숙시노일 등 티올 함유 형을 포함한다. 아민 보호기 및 보호된 아민기는, 예를 들어 C.B. Reese and E. Haslam, "Protective Groups in Organic Chemistry," J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, New York, N.Y., 1973, Chapters 3 and 4, 및 T. W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis," Second Edition, John Wiley and Sons, New York, N. Y., 1991, Chapters 2 and 3에 설명된다.
더 나아가, 특히 관심 있는 전형적인 아민 보호기는 트리할로아실기류, 예를 들어 트리할로아세틸 및 트리할로프로피오닐기(예를 들어, 트리클로로아세틸, 트리플루오로아세틸, 트리클로로프로피오닐, 트리플루오로프로피오닐) 등을 포함하며, 관심 있는 것은 트리할로아세틸기이다.
한 구체예에서, 화학식 I의 구조를 포함하는 deNAc SA 항원은 아래 설명되는 대로, 예를 들어 C2 케톤, C6 알데히드, C7 알데히드, 또는 C8 알데히드를 통한 공유 부착에 의해서 캐리어(예를 들어, C2-NH-캐리어 단백질 또는 C6-NH-캐리어 단백질)에 콘쥬게이트되며, 캐리어는 환원 또는 비-환원 단부 또는 양쪽 모두에 존재할 수 있다(예를 들어, 유도체 환원 단부의 잔기, 유도체 비-환원 단부의 잔기, 또는 양쪽 모두와의 결합을 통해). 특히 관심 있는 다른 구체예에서, deNAc SA 항원은 화학식 I의 적어도 하나의 이량체를 포함하고, 비-환원 단부에 아실아민(예를 들어, 포화 또는 불포화 아실아민, 일반적으로 포화 또는 불포화 지방 아실아민, 일반적으로 불포화 아실아민(예를 들어, NHC2-18, NHC2-12, NHC2-10, NHC2-8, NHC4-12 등)으로 치환된 N-아실화 또는 de-N-아실화 시알산 잔기를 포함한다(예를 들어, 화학식 IVa 및 IVb의 비-환원 단부에 있는 부분 참조). 특히 관심 있는 것은 캐리어 및/또는 아실아민을 포함하는 이들 후자의 구체예이며, 이 경우 deNAc SA 항원은 화학식 I의 구조에서 X가 H이고 Y가 아세틸기이거나, 또는 X가 아세틸기이고 Y가 H인 구조를 포함한다. 다른 특정 구체예에서, deNAc SA 항원이 화학식 I의 구조에서 X가 H이고 Y가 아세틸기이거나, 또는 X가 아세틸기이고 Y가 H인 구조를 포함하는 경우, PS 유도체는 아래 설명된 대로 애쥬번트와 조합하여 제공되며, 이 경우 PS 유도체와 애쥬번트는 일반적으로 제약학상 허용되는 담체(건성 또는 수성 희석제) 중에 제공된다.
한 구체예에서, 이량체는 이당이며, 상기 이당은 C-5 아미노기 상의 N-아실기가 제거되거나, 또는 2개 잔기 중 하나가 de-N-아세틸화되고, 제 2 잔기는 N-아세틸기(어떤 구체예에서는 N-프로피오닐기가 아니다)를 함유하는 하나 이상의 잔기 를 포함한다. 이 최소 에피토프를 한정하는 이당 단위는 환원 단부, 비-환원 단부, 또는 다당의 내부에 있을 수 있다. deNAc SA 항원이 이당으로서 제공되는 경우, 조성물은 하기 화학식 II의 구조를 가질 수 있다:
Figure 112008052552933-PCT00006
상기 식에서, X 및 Y는 독립적으로 H, 아민 보호기(예를 들어, 트리할로아실기), 또는 포화 또는 불포화 아실기이다; 더 바람직하게, X가 아실기(바람직하게는 프로피오닐기 이외의 다른 기)일 때, Y는 H 또는 아민 보호기이고, Y가 아실기(바람직하게는 프로피오닐기 이외의 다른 기)일 때, X는 H 또는 아민 보호기이다. 특히 관심 있는 구체예에서, X는 아세틸기이고 Y는 H이다. X 및/또는 Y가 아민 보호기인 경우, 화합물은 본원에서 보호된 deNAc SA 항원이라고 하며, 이때 아민 보호기는 상기 설명된 것과 같이 활용될 수 있다. 전형적인 아민 보호기는 상기 설명된 것들이다. 더 나아가, 화학식 I의 deNAc SA 항원에 대해 상기 설명된 대로, 화학식 II의 deNAc SA 항원도 캐리어 및/또는 아실아민을 포함하도록 변형될 수 있으며, 특히 X는 H이고 Y는 아세틸기; 또는 X가 아세틸기이고 Y가 H인 경우에 그러하다.
또한, deNAc SA 항원은 하기 화학식 III에 의해서 표시되는 구조를 포함하는 것들을 포함한다:
Figure 112008052552933-PCT00007
상기 식에서,
X, Y 및 n은 상기 정의된 바와 같고, R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 상기 설명된 바와 같은 아민 보호기(예를 들어, 트리할로아실기); 또는 아실기(예를 들어, 아세틸기)이다. 더 나아가, 화학식 I 및 II의 deNAc SA 항원에 대해 상기 설명된 대로, 화학식 III의 deNAc SA 항원은 캐리어 및/또는 아실아민을 포함하도록 변형될 수 있으며, 관심 있는 것은 보호된 deNAc SA 항원의 변형으로서, 특히 X가 H이고 Y가 아세틸기인 경우와 X가 아세틸기이고 Y가 H인 경우가 그러하다.
다른 구체예에서, deNAc SA 항원은 하기 화학식 IVa 및 IVb에 의해 표시되는 구조를 포함한다:
Figure 112008052552933-PCT00008
Figure 112008052552933-PCT00009
상기 식에서,
X1, X, Y 및 Z는 H, 아민 보호기(예를 들어, 트리할로아실기), 또는 포화 또는 불포화 아실기, 일반적으로 불포화 아실기이며, 일반적으로 X1, X, Y 및 Z는 1) H 또는 아민 보호기, 또는 2) 포화 또는 불포화 아실기(일반적으로 포화 아실기)이고; 단 X, Y 및 Z 중 적어도 하나는 H 또는 아민 보호기이고; X, Y 및 Z 중 적어도 하나는 포화 또는 불포화(일반적으로 포화) 아실기이며; 특히 관심 있는 구체예는 X, Y 및 Z 중 적어도 하나가 H 또는 아민 보호기이고, X, Y 및 Z 중 적어도 하나가 아세틸기이고, 그리고 X, Y 및 Z 중 적어도 하나가 프로피오닐기인 것들이고;
n은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 또는 그 이상, 일반적으로 5개 잔기 이상, 더 일반적으로 약 10개 잔기 이상이고(예를 들어, 중합도(Dp)는 약 2 내지 약 60, 약 10 내지 약 50, 약 30 내지 약 50, 약 10 내지 20, 또는 약 12 내지 약 18이며, 특히 관심 있는 것은 약 2 내지 약 10의 Dp이다);
R1은 포화 또는 불포화 아실아민, 일반적으로 포화 또는 불포화 지방 아실아 민, 일반적으로 포화 아실아민이고(예를 들어, NHC2-18, NHC2-12, NHC2-10, NHC2-8, NHC4-12 등);
R2는 히드록실 또는 상기 설명된 하나 이상의 아실화된, 아민 보호된(즉, 아민 보호기를 갖는, 예를 들어 트리할로아세티화된), 또는 de-N-아세틸화된 시알산 잔기이다. 한 구체예에서, R2는 de-N-아세틸화 시알산 잔기와 아실화 시알산 잔기의 중합체이다(일반적으로, 포화 N-아실기를 갖는 시알산 잔기, 예를 들어 아세틸화 시알산 잔기, 프로피오닐화 시알산 잔기 등).
한 구체예에서, 화학식 IVa 및 IVb의 deNAc SA 항원은 자유 아민(또는 아민 보호기), 아세틸기, 및 프로피오닐기를 각각 적어도 하나를 포함한다. 이 구체예에서, PS 유도체는 화학식 V의 구조에서, X가 H일 때, Y 및 Z가 상이한 아실기로서 아세틸기 또는 프로피오닐기 중 하나이고; X가 아세틸기일 때, Y 및 Z가 상이한 부분으로서 H(또는 아민 보호기) 또는 프로피오닐기 중 하나이고; X가 프로피오닐기일 때, Y 및 Z가 상이한 부분으로서 H(또는 아민 보호기) 또는 아세틸기 중 하나인 구조를 가질 수 있다. 전형적인 구체예들이 도 23-37에 제시된다.
다른 구체예에서, deNAc SA 항원은 하기 화학식 V에 의해서 표시되는 구조를 갖는 적어도 하나의 삼량체를 포함한다고 설명될 수 있다:
Figure 112008052552933-PCT00010
상기 식에서,
X, Y 및 Z는 독립적으로 H, 아민 보호기(예를 들어, 트리할로아실기), 또는 포화 또는 불포화 아실기(일반적으로 포화 아실기)이며; 일반적으로 X, Y 및 Z는 독립적으로 1) H 또는 아민 보호기, 또는 2) 포화 또는 불포화 아실기, 일반적으로 포화 아실기이고; 단 X, Y 및 Z 중 적어도 하나는 H 또는 아민 보호기이고; X, Y 및 Z 중 적어도 하나는 포화 또는 불포화 아실기, 일반적으로 포화 아실기이며; 특히 관심 있는 구체예는 X, Y 및 Z 중 적어도 하나가 H 또는 아민 보호기이고; X, Y 및 Z 중 적어도 하나가 아세틸기이고; X, Y 및 Z 중 적어도 하나가 프로피오닐기인 것들이고;
n은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 또는 그 이상, 일반적으로 약 4개 잔기 이상, 더 일반적으로 약 10개 잔기 이상이고(예를 들어, 중합도(Dp)는 약 2 내지 약 60, 약 10 내지 약 50, 약 30 내지 약 50, 약 10 내지 20, 또는 약 12 내지 약 18이며, 특히 관심 있는 것은 약 2 내지 약 10의 Dp이다).
한 구체예에서, deNAc SA 항원은 각 삼량체가 자유 아민, 아세틸기 및 프로피오닐기를 각각 적어도 하나를 포함하는 혼성 아실 구조를 가진다. 이 구체예에서, deNAc SA 항원은 화학식 V의 구조에서, X가 H일 때, Y 및 Z가 상이한 아실기로서 아세틸기 또는 프로피오닐기 중 하나기고; X가 아세틸기일 때, Y 및 Z가 상이한 부분으로서 H 또는 프로피오닐기 중 하나이고; X가 프로피오닐기일 때, Y 및 Z가 상이한 부분으로서 H 또는 아세틸기 중 하나인 구조를 가진다.
deNAc SA 항원은 C1-4, 일반적으로 C1-3의 포화 또는 불포화, 일반적으로 불포화 알킬기를 갖는 아실 유도체를 포함하며, 예를 들어 아세틸, 프로피오닐, 이소프로필, 부티오닐 등이다. 더 나아가, deNAc SA 항원은 하나 이상의 de-N-아실화 부위를 함유하는 혼성 아실 유도체를 포함하며, 이때 deNAc SA 항원은 상이한 포화 또는 불포화, 일반적으로 포화 아실기를 포함한다.
더 나아가, deNAc SA 항원은 본원에 설명된 deNAc SA 항원의 하나 이상의 시알산 부분에 더하여 또는 대신하여 락톤 부분, 환상 시알산 부분, 또는 다른 시알산 유도체를 함유하는 것들을 포함한다. 예를 들어, 락톤 부분을 갖는 deNAc SA 항원은 하기 화학식 VI의 구조를 포함할 수 있다:
Figure 112008052552933-PCT00011
상기 식에서,
X, Y 및 n은 상기 정의된 바와 같다. 락톤 부분을 갖는 deNAc SA 항원은 본원에 설명된 구조를 갖는 하나 이상의 중합체(예를 들어, 이량체, 삼량체)를 포함하는 이종중합체로 존재할 수 있다.
다른 구체예에서, 시알산 부분 대신에 환상 이민을 포함하고 및/또는 환상 2차 아민 부분(예를 들어, 1-(4-히드록시-5-히드록시메틸-피롤리딘-2-일)-에타논)으로 환원된 deNAc SA 항원은 하기 화학식 VII의 구조를 포함할 수 있다:
Figure 112008052552933-PCT00012
상기 식에서, X 및 n은 상기 정의된 바와 같다. 환상 이민 또는 환상 2차 아민 부분을 갖는 deNAc SA 항원은 본원에 설명된 구조를 갖는 하나 이상의 중합체(예를 들어, 이량체, 삼량체)를 포함하는 이종중합체로 존재할 수 있다.
deNAc SA 항원이 에피토프의 단일 단위(즉, 상기 제시된 바의 2개 잔기, 또는 아래 설명되는 3개 잔기)로서 제공되는 경우, deNAc SA 항원은 통상 캐리어(예를 들어, 단백질 캐리어)에 공유 부착된다. 일반적으로, 그리고 특히 deNAc SA 항원이 이당(예를 들어, 도 11에 도시된), 삼당, 또는 3개 이하의 잔기로 된 다른 분자인 경우, deNAc SA 항원은 C2 케톤을 통해, 또는 과요오드 처리 후 C6 알데히드 를 통해 환원성 아민화에 의해 캐리어 단백질(예를 들어, C2-NH-캐리어 단백질 또는 C6-NH-캐리어 단백질)에 연결될 수 있다. 다른 구체예에서, 아민은 C7, C6, 및/또는 C8에서 알데히드에 연결되며(예를 들어, 도 20-22 참조), 이 결과 불완전한 산화가 일어날 가능성이 있다. C7과의 결합이 가장 일반적이며, C6 및 C8과의 결합이 그 다음으로 일반적이다.
더 나아가, deNAc SA 항원은 지질 부분(예를 들어, 미국특허 제6,638,513호에 설명된 것들)이 부착된 하나 이상의 잔기를 갖는 것들을 포함한다. 또한, deNAc 항원은 N-지방 아실기(예를 들어, N-라우로일, N-올레오일 등)가 부착된 하나 이상의 잔기를 갖는 것들을 포함한다. 특히 관심 있는 것은 N-지방 아실-함유 잔기가, 예를 들어 deNAc SA 항원 시알산 중합체의 시알산 잔기의 50% 이하를 구성함으로써 결과의 deNAc SA 항원이 수용성을 유지하는 deNAc SA 항원이다. 또한, deNAc SA 항원은 하나 이상의 아미드화 시알산 잔기를 갖는 것들을 포함하며, 상기 잔기는 일반적으로 deNAc SA 항원의 중합체의 비-환원 단부에 알킬 2차 아민을 가진다. 하나 이상의 아미드화 시알산 잔기를 갖는 deNAc SA 항원은, 예를 들어 친핵성 치환에 의해 C1 카르복실기에 지방 아민(예를 들어, 도데실아민, 올레오일아민 등)을 연결함으로써 제조될 수 있다. 특히 관심 있는 것은 이러한 C1 아미드 유도체가, 예를 들어 deNAc SA 항원의 잔기의 약 50% 이하를 구성하는 deNAc SA 항원이다. 더 나아가, deNAc SA 항원은 환원 또는 비-환원 단부 또는 양쪽 단부 모두에서 캐리어에 콘쥬게이트된 것들을 포함한다(예를 들어, 유도체의 환원 단부에 있는 잔기, 유도체의 비-환원 단부에 있는 잔기, 또는 양쪽 잔기와의 결합을 통해).
deNAc SA 항원은 상기 설명된 이량체 에피토프 단위(최소 에피토프를 한정하는)가 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60개 또는 그 이상으로 이루어진 동종중합체 또는 이종중합체일 수 있으며, 상기 이량체 단위는 시알산 잔기 또는 그 유도체의 단량체 또는 중합체에 인접하거나 또는 이들에 의해 분리될 수 있다. 어떤 구체예에서, deNAc SA 항원의 N-아실화 잔기는 화합물의 전체 잔기의 90% 미만, 85% 미만, 84% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 또는 55% 미만으로 나타난다.
다른 구체예에서, de-N-아세틸화 잔기 대 N-아실화 잔기의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 또는 5:1 또는 그 이상이다. 특정 구체예에서, de-N-아세틸화 잔기 대 N-아세틸화 잔기의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 또는 5:1 또는 그 이상이다. 다른 특정 구체예에서, de-N-아세틸화 잔기 대 N-프로피오닐화 잔기의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 또는 5:1 또는 그 이상이다. 다른 특정 구체예에서, de-N-아세틸화 잔기 대 N-알킬화 잔기의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 또는 5:1 또는 그 이상이다. 다른 특정 구체예에서, de-N-아세틸화 잔기 대 N-아세틸화 잔기의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 또는 5:1 또는 그 이상이다.
deNAc SA 항원은 조성물에 함유된 deNAc SA 항원과 관련하여 동종성 또는 이종성 조성물로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 하나 이상의 이량체 에피토프 구조, deNAc SA 항원 내에서 이량체 에피토프의 위치, 콘쥬게이트 캐리어 단백질의 존재 또는 부재, Dp, 분자량, de-N-아실화 잔기 대 N-아실화 잔기의 비, N-아실화 정도(예를 들어, N-아세틸화 또는 N-프로피오닐화 정도) 등과 관련하여 동 종성 또는 이종성인 deNAc SA 항원을 포함하는 조성물을 고찰한다.
비-변형 deNAc SA 항원의 항원성 또는 면역원성을 증가시키거나 또는 적어도 실질적으로 유지하면서 다양한 바람직한 속성, 예를 들어 개선된 약물학적 특징을 제공하기 위해 deNAc SA 항원이 변형될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, PS는 중합체 중의 잔기의 수를 확장, 감소함으로써 변형될 수 있다(예를 들어, 상이한 중합도(Dp)를 제공하기 위해). "Dp"는 중합체의 잔기의 수를 의미한다.
또한, N-아세틸화, N-아실화 등의 도중에 화학적 변형의 결과로서 자연 발생 또는 비-자연 발생한 상이한 잔기로의 치환이 일어날 수 있다. 예를 들어, 본원에 설명된 deNAc SA 항원은 지질 부분에 의해 변형될 수 있고(예를 들어, 하기 실시예 1 및 5 및 미국특허 제6,638,513호(Seid)에 설명됨), 캐리어와 콘쥬게이트될 수 있고(예를 들어, 환원 또는 비-환원 단부에서), 락톤, 환상 시알산, 아민 및 환원 이민 구조를 포함할 수 있다. 다른 예에서, deNAc SA 항원은 N-지방 아실기(예를 들어, N-라우로일, N-올레오일 등)의 부착에 의해서 변형될 수 있다. 다른 예에서, deNAc SA 항원은 알킬 2차 아민(예를 들어, C1 아미드 유도체)을 갖는 하나 이상의 시알산 잔기를 포함할 수 있으며, 이것은 예를 들어, 친핵성 치환에 의하여 C1 케토기에 지방 아민(예를 들어, 도데실아민, 올레오일아민 등)을 결합시킴으로써 제조될 수 있다.
해당 de-N-아세틸화 PS가 숙주에서 면역반응을 유도하여 N. meningitidis 캡슐형 다당과 선택적으로 결합하는 한편 숙주 항원(예를 들어 숙주 폴리시알산(PSA)과는 거의 결합하지 않거나 유의하게 결합하지 않는 항체를 생산할 수 있는 한, 본 발명에서 사용되는 deNAc SA 항원(예를 들어, de-N-아세틸화 PS)이 하기 실시예에서 설명된 것들과 동일할 필요는 없다. 따라서, 당업자는 다수의 유도체(아래 상세히 설명된다)가 de-N-아세틸화 PS의 활성에 실질적으로 영향 없이 제조될 수 있다는 것을 인정할 것이다.
de -N- 아세틸화 SA 항원의 제조 방법
아래 더 상세히 설명된 대로, 본 명세서는 deNAc SA 항원의 제조 방법을 제공한다. 한 구체예에서, deNAc SA 항원은 박테리아성 다당의 화학적 변형에 의해서 제조된다. 다른 구체예에서, deNAc SA 항원은 트리할로아세틸 화합물의 존재하에 박테리아(Neisseria meningitidis B 군 또는 대장균 K1) 또는 포유류 세포를 배양한 후, 이어서 세포 표면에서 발현된 PS 유도체 중간체 화합물을 화학적 변형하는 것을 포함하는 생합성 방법을 사용하여 제조된다. 이들 각각이 아래 상세히 설명된다.
박테리아성 PS 를 이용한 de -N- 아세틸화 SA 항원의 제조
한 구체예에서, deNAc SA 항원은 N. meningitidis 또는 E. coli K1, 또는 박테리아성 PS의 다른 적합한 출처로부터의 PS를 de-N-아세틸화한 후, 이어서 부분적으로 re-N-아실화함으로써 제조될 수 있다. 부분적 re-N-아실화에 의해 화합물의 전체 잔기에 대해, 90% 미만, 85% 미만, 84% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 60% 미만 또는 55% 미만, 일반적으로 약 10%, 약 15%, 약 16%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 45%의 N-아실화 잔기를 갖는 de-N-아세틸화 PS 유도체가 생산된다. 이와 관련하여, 본 발명에서는 최종 산물의 아실화 수준을 제어하며, 이 로써 바람직한 수준으로 아실화된 de-N-아세틸화 PS가 제공될 수 있다. 일반적으로, 재-아실화는 아실화 시약의 양을 제한함으로써 제어되거나 방지된다.
또한, deNAc SA 항원은 N. meningitidis 또는 E. coli K1, 또는 박테리아성 PS의 다른 적합한 출처로부터의 PS를 de-N-아세틸화한 후, 이어서 바람직한 비율의 아민 보호된 기와 아실기(예를 들어, 트리할로아세틸 및 아세틸기)의 혼합물로 re-N-아실화함으로써 제조될 수 있으며, 이에 따라 PS 유도체는 화합물의 전체 잔기(화합물은 일반적으로 적어도 10개 또는 적어도 20개의 잔기를 함유한다)에 대해, 90% 미만, 85% 미만, 84% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 55% 미만의 아민 보호된 잔기, 일반적으로 약 10%, 약 15%, 약 16%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 45%의 아민 보호된 잔기(예를 들어, N-트리할로아실화 잔기)를 함유하게 된다. 자유 아미노 기와의 바람직하지 않은 부반응을 줄이기 위해 아민 보호기의 제거 후 최종 산물의 아실화 수준이 제어될 수 있으며, 이로써 바람직한 수준으로 아실화된 deNAc SA 항원이 제공된다. 아민 보호기의 제거에 의해 탈보호 잔기에서 자유 아민이 생성된다. 일반적으로, de-N-아세틸 잔기의 비율은 아민 보호 시약의 양(예를 들어, 트리할로아실화 시약의 양)을 제한함으로써 제어된다.
또한, deNAc SA 항원은 N. meningitidis 또는 E. coli K1, 또는 박테리아성 PS의 다른 적합한 출처로부터의 PS의 생합성에 의해 제조될 수 있으며, 여기서 박테리아 성장 배지는 바람직한 비율의 아민-보호된 만노스아민(예를 들어, N-트리할로아실 만노스아민)과 아실 만노스아민(예를 들어, N-트리할로아세틸 및 N-아세틸 만노스아민)의 혼합물로 보충되고, 이에 따라 박테리아에 의해 발현된 deNAc SA 항원은 생성된 PS의 전체 잔기에 대해서, 90% 미만, 85% 미만, 84% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 또는 55% 미만의 아민-보호된(예를 들어, N-트리할로아실화된) 잔기를 함유하게 된다. 자유 아미노 기와의 바람직하지 않은 부반응을 줄이기 위해 아민 보호기의 제거 후 최종 산물의 아실화 수준이 제어되며, 이로써 바람직한 수준으로 아실화된 deNAc SA 항원이 제공된다. 일반적으로, de-N-아세틸 잔기의 비율은 아민-보호된 만노스아민 시약(예를 들어, N-트리할로아세틸 만노스아민)의 양을 제한함으로써 제어된다.
NmB PS 및 E. coli K1을 포함하여, PS는 본 발명에서 PS 유도체 및 콘쥬게이트 및 다른 분자들에 사용되기에 적합한 전형적인 분자이며, 이러한 출발 물질들은 본 분야에 잘 공지되어 있고, 이들의 분리 및 캐리어와의 콘쥬게이션 방법도 본 분야에 공지되어 있다.
deNAc SA 항원은 어떤 종래의 적합한 수단을 통해 생성될 수 있다. 예를 들어, 한 구체예에서, deNAc SA 항원은 PS의 de-N-아세틸화에 의하여 제조될 수 있는데, 이것은 자생 PS와 염기성 수성 배지를 승온에서, 예를 들어 약 90℃ 내지 110℃에서 그리고 pH 약 13 내지 14(예를 들어, 약 2M 농도의 수산화 나트륨 중에서)에서 접촉시킴으로서 달성될 수 있다. 또는 달리, 수성 용액 중의 히드라진이 사용될 수도 있다. 이 단계에서 de-N-아세틸화 정도는 다양할 수 있는데, 관심 있는 것은 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 99%에서 약 100%이하의 de-N-아세틸화이다. de-N-아세틸화 산물은, 예를 들어 냉각, 중화, 바람직하다면 정제, 및 동 결건조에 의해 회수될 수 있다.
비-수성 및 생합성에 의한 제조 방법이 아래에 그리고 실시예에 상세히 설명된다.
비-수성 제조 방법
한 구체예에서, de-N-아세틸 시알산 항원은 물을 5% 미만 함유하는 극성 양성자성 유기 용매 중에서 PS의 화학적 변형을 통해 제조될 수 있다. NmB PS 유도체를 제조하는데 사용된 수성 용액-기반 방법(예를 들어, 실시예 1에서처럼)에 의하면 보호성 비-자기반응성 mAb(예를 들어, SEAM 2, 3)와 반응성인 물질이 비교적 소량으로 생산된다. 이론과 결부되는 것은 아니지만, 이런 낮은 수율은 상기 설명된 대로 전체 N-아세틸기를 제거하는 것의 실패, PS 아미노기(분자내 COO-와 NH3+ 전하쌍)의 약한 반응성으로 인한 re-N-아실화 양의 정량적 제어의 실패, 아실화 시약의 경쟁적 가수분해, 및/또는 비-환원 단부 알데히드의 제조시 과요오드 처리에 의한 아미노기의 산화 중 한 가지 이상으로 인한 결과이다.
극성 양성자성 유기 용매 중에서, 그리고 바람직한 경우 소량의 물의 존재하에서(예를 들어, 포름아미드, 포름아미드/2.5% 물 혼합물 등) PS의 아실화의 수행, 아미노기 보호(예를 들어, 트리할로아실(예를 들어, 트리클로로아세틸 또는 트리플루오로아세틸) 아미드로), 이후 제거하여 de-N-아세틸 잔기의 예상가능한 부분 생성, 및 아실화 단계 동안 강염기(예를 들어, 수산화나트륨 또는 메톡시드)를 사용하여 아미노기 반응성을 확보하는 방법에 의해 개선된 수율 및 de-N-아세틸화되는 잔기 비율의 개선된 제어가 제공된다.
유기 용매는 어떤 적합한 용매, 일반적으로 극성 양성자성 또는 비양성자성 유기 용매일 수 있다. 전형적인 이러한 용매는 포름아미드, 디메틸포름아미드, 포름아미드/디메틸포름아미드 혼합물 등, 또는 유기 용매와 소량의 물(전형적으로 적어도 약 2% 또는 2.5%의 물, 일반적으로는 10% 미만, 5% 미만)의 혼합물을 포함한다. 성분들, 특히 PS의 용해도를 확보하기 위해 필요에 따라 물이 첨가된다.
분자의 아민기는 그것을 적합한 아민 보호기로 변형함으로써 보호된다. 전형적인 아민 보호기는 상기 설명되었으며, 제한은 아니지만, N-알킬 및 N-아릴 아민을 포함하는 카르바메이트 또는 아미드, 이민 유도체, 엔아민 유도체, N-술포닐 등을 포함한다. 특히 관심 있는 한 구체예에서, 아민 보호기는 트리할로아실 아미드, 일반적으로 C2-12, 더 일반적으로 C2-10, 더 일반적으로 C2-8, 더 일반적으로 C2-6의 트리할로아실기, 가장 일반적으로는 트리할로아세틸 또는 트리할로프로피오닐 보호기이다. 이러한 보호기는 pH 8 이하에서의 안정성, 과요오드산염 존재하에서의 안정성, 및/또는 아래 설명되는 제거의 용이성에 따라 선택될 수 있다. 일반적으로, 아민 보호기는 과요오드산염의 존재하에 N-산화를 방지한다. 이 보호 단계 후에 생성된 deNAc SA 항원의 형태를 본원에서 "보호된 deNAc SA 항원", "보호된 아실화 deNAc SA 항원", "보호된 PS 유도체" 또는 "보호된 아실화 PS 유도체"라고 하며, 이때 화합물은 하나 이상의 아민 보호기(예를 들어, 트리할로아실-보호된 아민기)를 포함한다.
일반적으로, 보호된 deNAc SA 항원의 제조는 상기 설명된 유기 용매의 존재 하에 적어도 부분적으로 de-N-아실화된 PS 분자를 아민 보호기 시약 및 아실화 시약과 접촉시킴으로써 달성된다. 아민 보호 시약은, 예를 들어 트리할로아실화 시약이며, 특히 관심 있는 것은, 예를 들어 트리할로아세트산 무수물 또는 알킬 트리할로아세트산 에스테르이다(예를 들어, 트리클로로아세트산 무수물, 트리플루오로아세트산 무수물, 에틸 트리플루오로아세틸 에스테르, 또는 에틸 트리클로로아세틸 에스테르 등). 아실화 시약은 활성화된 아실기를 제공하며, 이때 활성화된 아실기는 일반적으로 아세틸기 또는 프로피오닐기, 더 일반적으로는 아세틸기이다. 어떤 구체예에서, 트리할로아실화 시약 및 아실화 시약은 혼합물로서 de-N-아세틸화 PS 분자와 접촉된다.
혼합물 중에서 트리할로아실화 시약과 아실화 시약의 상대량은 보호 단계의 최종 산물이 트리할로아실화 잔기와 아실화 잔기를 바람직한 비율로 함유하도록 제공되며, 여기서 트리할로아실화된 기는 일반적으로 최종 산물에 자유 아민을 제공하기 위해 제거된다. 예를 들어, 최종 deNAc SA 항원 산물에서 자유 아민 대 아실화 잔기의 비는 약 1:10, 1:4, 또는 1:1이어야 하고, 트리할로아실화 시약 대 아실화 시약의 비는 약 1:10, 1:4, 또는 1:1의 비로 혼합물 중에 존재한다. 다시 말해서, 혼합물 중 트리할로아실화 시약의 양은 탈보호 후 최종 deNAc SA 항원 산물 중의 바람직한 de-N-아세틸기의 비율과 대략 동일하다(예를 들어, 10%, 25%, 50% 등). 또한, 아실화 시약은 상이한 활성화 아실기(예를 들어, 아세틸, 프로피오닐)의 혼합물로서 제공될 수 있으며, 이로써 PS 유도체에 상이하게 아실화된 기들이 바람직한 비율로 제공된다. 예를 들어, deNAc SA 항원에서 아세틸화 잔기 대 프로피오 닐화 잔기의 비가 2:1 또는 1:1인 경우, 활성화 아세틸기 및 프로피오닐기를 위한 아실화제는 아실화제 혼합물 중에 동일한 또는 유사한 비율로 제공된다.
보호 단계 후에, 보호된 deNAc SA 항원은 바람직하다면, 예를 들어 바람직한 캐리어와의 콘쥬게이션에 의해, 예를 들어 과요오드화 후 환원성 아민화에 의해 변형될 수 있다. 다음에, 자유 아민을 남기면서 보호기가 제거될 수 있으며(예를 들어, 가수분해 또는 환원에 의해서), 이로써 최종 deNAc SA 항원이 제공된다. 아민 보호기는 강한 수성 염기(예를 들어, pH 9 이상)를 사용하는 가수분해에 의해, 환원(예를 들어, 붕수소화나트륨을 사용하는)에 의해, 또는 환원성 아민화에 의한 콘쥬게이트의 제조 도중에 첨가되는 아민에 의해(예를 들어, 실시예 5 참조) 제거될 수 있다. 다음에, 본 분야에 잘 공지된 방법에 따라서 deNAc SA 항원이 분리될 수 있다.
비-수성 제조 방법은 많은 상이한 이유 때문에 바람직할 수 있다. 먼저, 유기 용매 중에서 아실화 반응을 수행하는 것은 사용될 수 있는 아실기의 타입에 많은 유연성을 제공한다. 예를 들어, 유기 용매의 사용은 수성 시스템 중에서 용해성에 관하여 도전받을 수 있는 4개 이상의 탄소로 된 지방 아실기의 사용뿐만 아니라 고도 반응성인 활성화된 아실기(예를 들어, 트리플루오로아세틸 및 트리클로로아세틸)의 사용을 촉진한다. 또한, 유기 용매 중에서의 반응은 시약을 고갈시키는 물 및 OH-와의 경쟁 반응의 거의 없거나 최소이기 때문에 아실화도에 대한 개선된 제어를 제공한다. 결과적으로, 다당과의 아실화 반응이 완전히 진행되도록 설계될 수 있다.
또한, 비-수성 접근법은 보호된 아민기의 사용을 허용한다. 보호되지 않은 채로 남아있을 때, 다당 아민기는 과요오드산염의 존재하에 일어나는 산화와 같은 다른 바람직하지 않은 반응 및 활성화된 카르복실기와의, 또는 비-환원 단부 및 환원 단부 케톤에 도입된 알데히드와의 분자내 반응에 참여할 수 있다. 트리플루오로아세틸 또는 트리클로로아세틸이 바람직한 보호기이며, 이들은 약 8 미만의 pH에서 안정하고, 과요오드산염의 존재하에 안정하며, 수성 염기 중에서 또는 붕수소화나트륨과의 반응에 의해 쉽게 제거되어 de-N-아세틸 잔기를 함유하는 deNAc SA 항원을 생산할 수 있고, 이때 de-N-아세틸 잔기의 퍼센트는 보호기로 유도체화된 아민의 양에 의해 제어된다.
박테리아를 사용한 deNAc SA 항원의 생합성 제조 방법
또 다른 구체예에서, deNAc SA 항원은 하나 이상의 N-아실 만노스아민 유도체의 존재하에서 N-아실 시알산 잔기를 갖는 deNAc SA 항원의 생산을 촉진하는 조건하에 N. meningitidis 박테리아, 특히 B 군 박테리아를 배양함으로써 생성된다. 이것은 바람직한 N-아실기를 갖는 만노스아민 유도체를 박테리아 배양 배지에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.
한 구체예에서, N-아실 만노스아민 유도체는 아민 보호기를 포함하는 만노스아민("보호된 만노스아민" 또는 아민 보호된 만노스아민")으로서, 본원에서는 N-트리할로아실 만노스아민에 의해 예시되며, 박테리아에 만노스아민 유도체를 공급할 수 있는 것이다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 전형적인 아민 보호된 만노스아민은 박테리아의 PS 합성 경로에 편입되어 보호된 deNAc SA 항원을 생산할 수 있는 어떤 아민 보호된 만노스아민을 포함한다. 전형적인 아민 보호된 만노스아민 시약은 N-트리할로아실 만노스아민, 예를 들어 N-트리할로아세틸 만노스아민(예를 들어 N-트리클로로아세틸 만노스아민, 트리플루오로아세틸 만노스아민), N-포르밀 만도스 아민 등을 포함한다. 아민 보호된 만노스아민에 더하여, 배양 배지는 일반적으로 N-아세틸 만노스아민을 또한 포함하며, 이로써 보호된 시알산 잔기와 N-아세틸화 시알산 잔기를 모두 갖는 deNAc SA 항원이 제공된다.
이론에 결부되는 것은 아니지만, 아민 보호된 만노스아민의 존재하에서 배양되었을 때, 캡슐 생합성에 연관되는 박테리아성 효소가 시알산에 아민 보호된 만노스아민을 편입시킨 다음, 이것을 캡슐 다당에 편입시킨다. 표준 발효 및 정제 방법을 사용하여 보호기가 부착된 단량체를 바람직한 비율로 함유하는 보호된 deNAc SA 항원이 생성될 수 있다. 이들 보호기를 함유하는 deNAc SA 항원은, 예를 들어 상기 설명된 구조들을 가질 수 있다.
관련 구체예에서, 혼성 N-아실 시알산 잔기를 갖는 deNAc SA 항원이 바람직한 경우, 배양 배지는 혼성 N-아실 만노스아민 시약을 포함한다. 예를 들어, N-아실 만노스아민은 C1-5, 더 일반적으로 C2-5, 더욱 일반적으로 C2-4, 더 일반적으로 C2-3의 포화 또는 불포화 아실기, 일반적으로 포화 아실기를 포함하며, 특히 관심 있는 것은 아세틸 또는 프로피오닐기이다. 이러한 혼성 N-아실 만노스아민 시약의 존재하에서 박테리아의 배양은 혼성 N-아실 시알산 잔기, 예를 들어 N-아세틸 시알산, N-프로피오닐 시알산 등을 갖는 deNAc SA 항원을 생산할 수 있다. 특히 관심 있는 한 구체예에서, 박테리아는 보호된 만노스아민(예를 들어, N-트리할로아실 만 노스아민)과 N-아실 만노스아민의 혼합물(예를 들어, N-아세틸 만노스아민과 N-프로피오닐 만노스아민의 혼합물)의 존재하에서 배양된다.
한 구체예에서, N. meningitids 박테리아, 바람직하게는 B 군 균주가 N-아실 만노스아민(예를 들어, N-아세틸 만노스아민)과 N-트리할로아실 만노스아민의 혼합물의 존재하에서 배양된다. 다른 구체예에서, 박테리아는 비-캡슐형 균주이며, 배양 배지 중에 보충 N-아세틸 만노스아민의 부재하에서는 PS 캡슐 합성을 결핍한 균주일 수 있다(예를 들어, 하나 이상의 효소에 결함이 있음으로써 성장 배지에 N-아세틸 만노스아민이 보충되지 않는다면 박테리아가 캡슐 PS를 합성할 수 없기 때문에). 예를 들어, 균주는 NmB 균주 M7에서와 같이, N-아세틸-D-글루코사민-6-포스페이트 2 에피머라제(epimerase)에 결함이 있을 수 있다.
배양물 중에서 만노스아민 시약들의 상대량(예를 들어, N-트리할로아실 만노스아민과 N-아세틸 만노스아민의 비)은 생합성 최종 산물이 deNAc SA 항원 안에 상이한 시알산 잔기 및/또는 유도체를 바람직한 비율로 함유하도록 제공된다(예를 들어, deNAc SA 항원 상의 트리할로아실화 잔기 및 아실화 잔기). 일반적으로, 보호기(예를 들어, 트리할로아실화기)가 제거되어 최종 deNAc SA 항원 산물에 자유 아민이 제공된다. 예를 들어, 최종 deNAc SA 항원 선물에서 자유 아민 대 아실화 잔기의 비가 약 1:10, 1:4 또는 1:1이어야 하는 경우, N-트리할로아실 만노스아민 대 만노스아민의 비는 약 1:10, 1:4 또는 1:1이다. 다시 말해서, 배양물 중 N-트리할로아실 만노스아민의 양은 탈보호 후 최종 deNAc SA 항원 산물 중의 바람직한 de-N-아세틸 시알산기의 비율과 대략 동일하다(예를 들어, 10%, 25%, 50%, 등).
유사하게, 배양물 중에서 "비보호" N-아실 만노스아민(아민 보호기를 함유하지 않지만, 예를 들어 N-아실기로서 아세틸기 또는 프로피오닐기를 포함할 수 있는 만노스아민)의 상대량은 deNAc SA 항원 안에 상이한 아실화 시알산 잔기가 바람직한 비율로 제공되도록 제공될 수 있다. 예를 들어, deNAc SA 항원이 2:1 또는 1:1의 아세틸화 잔기 대 프로피오닐화 잔기의 비를 가져야 하는 경우, N-아세틸 만노스아민과 N-프로피오닐 만노스아민은 배양물 중에 동일한 또는 유사한 비율로 제공된다.
다음에, 본 분야에 공지된 방법들을 이용하여 deNAc SA 항원이 박테리아로부터 분리될 수 있다. deNAc SA 항원이 아민 보호기를 함유하는 경우, 이러한 deNAc SA 항원은 추가의 변형, 예를 들어 콘쥬게이트(예를 들어, 비-환원 단부의 과요오드 산화에 의해)를 갖는 deNAc SA 항원을 생성하는데, 또는 중합체(다당)의 비-환원 단부에 알킬 2차 아민, 특히 C1 아미드가 제공되도록 시알산 잔기를 변형하는데 특히 적합하다. 변형이 완료된 후, 트리할로아실 보호기는 상기 설명된 대로 제거될 수 있다. 예를 들어, 보호기는 환원성 아민화(예를 들어, 시아노붕수소화 나트륨을 사용하는)에 의해서 또는 추가의 환원(예를 들어, 붕수소화 나트륨 또는 pH 9 이상의 염기를 사용한 처리)에 의해서 제거될 수 있으며, 이로써 자유 아민이 제공된다.
단편, 재- 아실화 , 및 다른 변형
deNAc SA 항원이 PS의 화학적 변형에 의해 생산되는 경우, de-N-아세틸화의 결과로서 PS의 단편들이 일반적으로 생성되며, 상기 단편들은 일반적으로 약 3,000 내지 약 50,000 달톤 범위의 평균 분자량을 가진다. 본 발명은 PS의 전장 유도체뿐만 아니라 단편들인 deNAc SA 항원을 고찰하며, PS 단편들의 deNAc SA 항원도 고찰한다.
바람직한 경우, 약 pH 8 내지 9의 수성 배지(예를 들어, 수산화나트륨 중에서)에 de-N-아세틸화 PS를 현탁시키고, 그 다음 적합한 아실 무수물을 첨가함으로써 deNAc SA 항원을 제공하기 위한 재-아실화가 수행될 수 있다. 한 구체예에서, 다당 및 아실화제(예를 들어, 아세틸 무수물 또는 프로피온산 무수물)는 모두 유기 용매/물 혼합물(예를 들어, 포름아미드 또는 디메틸포름아미드 중 2%(vol/vol) 물) 중에 제공된다. 이 구체예는 특히 더욱 제어된 수준의 재-아실화를 제공한다. 본 발명의 방법은 산 무수물 또는 아실화제(예를 들어, O-아실 히드록시숙신이미드와 같은 아실-활성 에스테르)를 1몰 당량 미만, 0.75몰 당량 미만, 0.5몰 당량 미만, 0.25몰 당량 미만, 0.1몰 당량 미만, 0.05몰 당량 미만, 0.025몰 당량 미만, 또는 거의 0.02몰 당량으로 사용한다.
O-아실기는 pH를 약 12까지 증가시킴으로써 제거될 수 있다. 다음에, pH를 약 8까지 낮춘 다음(예를 들어, 염산을 첨가하여), 바람직하다면, 예를 들어 투석에 의해 유도체를 정제한다. 더 나아가, 바람직하다면, 반응 산물은 정제 및 동결건조될 수 있다.
결과의 deNAc SA 항원의 N-아실화도는 일반적으로 90% 미만, 85% 미만, 84% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 또는 55% 미만, 일반적으로 10%, 15%, 16%, 25%, 30%, 40%, 또는 45% 이상이다. deNAc SA 항원의 다당의 분자량은 다양할 수 있으며, PS로부터 생산된 deNAc SA 항원은 일반적으로 약 0.5 kDa(예를 들어, 이당) 내지 80 kDa, 약 1 kDa 내지 약 70 kDa, 약 2 kDa 내지 약 60 kDa, 약 3 kDa 내지 약 50 kDa, 약 5 kDa 내지 약 25 kDa, 약 10 kDa 내지 80 kDa, 약 20 kDa 내지 60 kDa, 약 30 kDa 내지 약 50 kDa, 일반적으로 약 0.5 kDa 내지 약 10 kDa의 범위이다.
강글리오시드로부터 deNAc SA 항원의 제조 방법
일반적으로, deNAc SA 항원은 아민-보호된 만노스아민(예를 들어, N-트리할로아실 만노스아민)과 아실 만노스아민(예를 들어, N-트리할로아세틸 및 N-아세틸 만노스아민)의 혼합물로 보충된 성장 배지 중에서 세포를 배양함으로써 포유류 세포(예를 들어, 암성 포유류 세포), 또는 다른 적합한 출처의 강글리오시드 유도체의 생합성에 의해 강글리오시드로부터 제조될 수 있다. 아민 보호된 만노스아민과 아실 만노스아민은 세포에 의해 발현되는 강글리오시드 유도체가 생산된 강글리오시드의 전체 잔기에 대해서, 90% 미만, 85% 미만, 84% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 또는 55% 미만, 일반적으로 10%, 15%, 16%, 25%, 30%, 40%, 또는 45% 이상의 아민-보호된(예를 들어, N-트리할로아실화) 잔기가 함유되도록 하는 바람직한 비율로 배양 배지 중에 제공될 수 있다.
이 방법은 아민 보호기의 제거 후 최종 산물의 아실화 수준을 제어할 수 있으며, 자유 아미노 기와의 바람직하지 않은 부반응을 줄이거나 회피함으로써, 바람직한 수준으로 아실화된 de-N-아세틸화 강글리오시드를 제공할 수 있다. 일반적으로, de-N-아세틸 잔기의 비율은 아민-보호된 만노스아민 시약(예를 들어, N-트리할 로아세틸 만노스아민)의 양을 제한함으로써 제어된다. de-N-아세틸화 산물은 어떤 편리한 방법, 예를 들어 냉각, 중화, 바람직하다면 정제, 및 동결건조에 의해 세포로부터 회수될 수 있다.
생합성 제조 방법이 아래에 그리고 실시예에 상세히 설명된다.
포유류 세포에서 강글리오시드 유도체의 제조에 의한 생합성 deNAc SA 항원 제조
한 구체예에서, 하나 이상의 N-아실 만노스아민 유도체의 존재하에서 그리고 N-아실 시알산 잔기를 갖는 강글리오시드 유도체의 생산을 촉진하는 조건하에 포유류 세포(예를 들어, 바람직한 조직 타입 또는 암 타입의 암성 세포(예를 들어, 원발성 종양 세포, 종양 전이, 또는 종양 셀라인, 예를 들어 흑색종 셀라인(예를 들어, SK-MEL-28 셀라인)를 배양함으로써 deNAc SA 항원이 생성된다. 이것은 바람직한 N-아실기를 갖는 만노스아민 유도체를 세포 배양 배지에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.
바람직한 수준의 강글리오시드를 생산하는 어떤 적합한 포유류 세포가 본 발명의 생합성 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 세포는 강글리오시드를 자연적으로 발현할 수 있거나, 아니면 강글리오시드, 예를 들어 GD3를 발현 또는 과발현하도록 유전조작될 수 있다(예를 들어, Satake et al. J. 2003 Biol. Chem. 278:7942-7948에 설명된 GD3 신타제(ST8Sia-I)로 트랜스펙트된 CHO 세포). 어떤 구체예에서, 생합성 방법에 사용되는 세포는 비-암성 세포에 비해 상승된 수준으로 GD3를 생산하는 암성 세포(예를 들어, 동일한 조직 타입 또는 기원을 갖는)를 사용한다. 전형 적인 세포는, 제한은 아니지만, 신경외배엽 기원의 세포 또는 셀라인, 암 세포 또는 셀라인(예를 들어, SK-MEL-28 세포, SK-MEL-37, M21 세포, MELUR 세포 등) 등을 포함한다.
한 구체예에서, N-아실 만노스아민 유도체는 아민 보호기를 포함하는 만노스아민("보호된 만노스아민" 또는 "아민 보호된 만노스아민")이며, 본원에서 N-트리할로아실 만노스아민에 의해 예시되고, 암성 세포에 만노스아민 유도체를 "공급"할 수 있는 것이다. 본 발명에서 사용하기 적합한 전형적인 아민 보호된 만노스아민은 세포 강글리오시드 합성 경로에 편입되어 보호된 강글리오시드 유도체를 생산할 수 있는 어떤 아민 보호된 만노스아민이다. 전형적인 아민 보호된 만노스아민 시약은 N-트리할로아실 만노스아민, 예를 들어 N-트리할로아세틸 만노스아민(예를 들어, N-트리클로로아세틸 만노스아민, 트리플루오로아세틸 만노스아민), N-포르밀 만노스아민 등을 포함한다. 아민 보호된 만노스아민에 더하여, 배양 배지는 일반적으로 N-아세틸 만노스아민을 또한 포함하며, 이로써 보호된 시알산 잔기와 N-아세틸화 시알산 잔기를 모두 갖는 강글리오시드 유도체가 제공된다.
관련된 구체예에서, 혼성 N-아실 시알산 잔기를 갖는 강글리오시드 유도체가 바람직한 경우, 배양 배지는 혼성 N-아실 만노스아민 시약을 포함한다. 예를 들어, N-아실 만노스아민은 C1-5, 더 일반적으로 C2-5, 더 일반적으로 C2-4, 더 일반적으로 C2-3의 포화 또는 불포화 아실기, 일반적으로 포화 아실기를 포함할 수 있으며, 특히 관심 있는 것은 아세틸 또는 프로피오닐기이다. 이러한 혼성 N-아실 만노스아민 시약의 존재하에서 암성 세포를 배양함으로써 혼성 N-아실 시알산 잔기, 예를 들어 N-아세틸 시알산, N-프로피오닐 시알산 등을 갖는 강글리오시드 유도체가 생산될 수 있다. 특히 관심 있는 구체예에서, 세포는 보호된 만노스아민(예를 들어, N-트리할로아실 만노스아민)과 N-아실 만노스아민(예를 들어, N-아세틸 만노스아민과 N-프로피오닐 만노스아민의 혼합물)의 혼합물의 존재하에서 배양된다.
다른 구체예에서, 포유류 세포(예를 들어, 암 세포)는 N-아실 만노스아민(예를 들어, N-아세틸 만노스아민)과 N-트리할로아실 만노스아민의 혼합물의 존재하에서 배양된다. 배양물 중 만노스아민 시약들의 상대량(예를 들어, N-트리할로아실 만노스아민과 N-아세틸 만노스아민의 비)은 생합성 최종 산물에 강글리오시드 유도체 내에 상이한 시알산 잔기 및/또는 유도체가 바람직한 비율로 함유되도록 제공된다(예를 들어, 강글리오시드 유도체 상의 트리할로아실화 잔기 및 아실화 잔기). 일반적으로, 보호기(예를 들어, 트리할로아실화 기)가 제거되고 최종 강글리오시드 유도체 산물에 자유 아민이 제공된다. 예를 들어, 최종 de-N-아세틸화 강글리오시드 유도체 산물에서 자유 아민 대 아실화 잔기의 비가 약 1:10, 1:4, 또는 1:1이어야 할 경우, N-트리할로아실 만노스아민 대 만노스아민의 비는 약 1:10, 1:4, 또는 1:1이다. 다시 말해서, 배양물 중 N-트리할로아실 만노스아민의 양은 탈보호 후 최종 de-N-아세틸화 강글리오시드 내의 바람직한 de-N-아세틸 시알산기의 비율과 대략 동일하다(예를 들어, 10%, 25%, 50%, 등).
유사하게, 배양물 중에서 "비-보호된" N-아실 만노스아민(아민 보호기를 함유하지 않지만, 예를 들어 N-아실기로서 아세틸 또는 프로피오닐기를 포함할 수 있는 만노스아민)의 상대량은 강글리오시드 유도체 내에 상이하게 아실화된 시알산이 바람직한 비율로 제공될 수 있도록 제공될 수 있다. 예를 들어, 강글리오시드 유도체가 2:1 또는 1:1의 아세틸화 잔기 대 프로피오닐화 잔기의 비를 가져야 하는 경우, N-아세틸 만노스아민과 N-프로피오닐 만노스아민이 배양물 중에 동일한 또는 유사한 비율로 제공된다.
다음에, 강글리오시드로부터 생산된 deNAc SA 항원이 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 세포로부터 분리될 수 있다. 강글리오시드 유도체가 아민 보호기를 함유하는 경우, 이러한 강글리오시드 유도체는 추가 변형을 갖는 강글리오시드 유도체를 생성하는데, 예를 들어 콘쥬게이트를 생성하거나(예를 들어, 비-환원 단부의 과요오드 산화에 의해), 또는 시알산 잔기를 변형하여 강글리오시드 유도체의 비-환원 단부에 알킬 2차 아민, 특히 C1 아미드를 제공하는데 특히 적합하다. 변형이 완료된 후, 트리할로아실 보호기는 상기 설명한 대로 제거될 수 있다. 예를 들어, 보호기는 환원성 아민화(예를 들어, 시아노붕수소화 나트륨을 사용하여) 또는 추가의 환원(예를 들어, 붕수소화 나트륨을 사용하거나 pH 9 이상의 염기로 처리)에 의해 제거되어 자유 아민이 제공될 수 있다.
관련 구체예에서, 전체 세포 및 그것의 막 추출물을 포함하여, 세포 표면 트리할로아실화 강글리오시드 유도체를 갖는 포유류 세포를 포함하는 조성물이 본 발명에 의해 고찰된다. 또한, 본 발명은 이러한 세포로부터 분리된 트리할로아실화 강글리오시드 유도체를 고찰한다. 이에 더하여, 본 발명은 이러한 세포를 사용하여 deNAc SA 항원을 제조하는 방법을 고찰한다. 관련 구체예에서, 본 발명은 세포 표면 de-N-아세틸화 강글리오시드를 갖는 세포, 및/또는 이러한 세포로부터 획득한 막을 갖는 조성물을 제공하며, 이때 세포 또는 막은 본원에 설명된 생화학적 방법을 사용하여 생산된다. 이들 조성물은 de-N-아세틸화 강글리오시드에 특이적인 항체를 도출하는데 사용될 수 있다. 본 분야에서 이용할 수 있는 면역화 프로토콜뿐만 아니라 본원에 설명된 내용들은 바람직한 특이성의 항체를 생산하기 위해 쉽게 개조될 될 수 있다.
DeNAc SA 항원 콘쥬게이트
deNAc SA 항원, 보호된 아민 deNAc SA 항원은 캐리어에 콘쥬게이트됨으로써 deNAc SA 항원-캐리어 복합체가 제공될 수 있다. 콘쥬게이트된 항원-캐리어 복합체는 다수의 캐리어 분자, 다수의 deNAc SA 항원 분자, 또는 이들 둘 다를 포함할 수 있다.
상기 주지될 대로, 콘쥬게이트의 deNAc SA 항원은 상기 설명된 대로 최소 에피토프를 한정하는 이량체로서, 또는 중합 단위(예를 들어, 상기 설명된 에피토프를 한정하는 둘 이상의 이량체 단위)로서 제공될 수 있다. deNAc SA 항원이 중합 구조인 경우, deNAc SA 항원은 동종중합성 또는 이종중합성일 수 있다. 조성물은 중합체 또는 보호된 아민 중합체의 비-환원 말단, 환원 말단 또는 비-환원 말단과 환원 말단 양쪽에 부착된 추가의 잔기를 포함할 수 있다.
캐리어는 면역반응을 증강시킬 수 있는 단백질, 펩티드 T 세포 애쥬번트 또는 어떤 다른 화합물일 수 있다. 단백질은, 제한은 없지만, 바이러스, 박테리아, 기생충, 동물 및 진균 단백질로 구성되는 군에서 선택될 수 있다. 한 구체예에서, 캐리어는 알부민이다. 캐리어는 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 수막구균 외막 단백질 복합체(예를 들어, US 4,707,543; US 6,476,201; US 6,558,677 참조), 또는 박테리아 외피 단백질(재조합 N. meningitidis 포린 B 등)일 수 있다. 이러한 캐리어는 생화학물질 또는 제약 공급 회사로부터 획득되거나, 또는 표준 방법에 의해서 제조될 수 있다(Cruse, J M (ed.) Conjugate Vaccines in Contributions to Microbiology and Immunology vol. 10 (1989)). 캐리어로서 사용하기 적합한 T 세포 에피토프를 함유하는 합성 펩티드는 "보편" T 세포 에피토프(Panina-Bordignon et al. 1989 Eur J Immunol 19:2237) 또는 비-천연 Pan DR 에피토프 펩티드(PADRE) (del Guercio et al 1997 Vaccine 15:441)를 포함할 수 있다. 캐리어로서 기능할 수 있는 다른 단백질을 비롯한 다른 제제들이 면역학 분야의 당업자에게 공지되어 있다.
deNAc SA 항원의 콘쥬게이션을 위한 전형적인 방법은, 반드시 제한되는 것은 아니지만, 미국특허 제4,727,136호; 제5,811,102호(B 군 수막구균 불포화 C3-5 N-아실 유도체 다당 콘쥬게이트를 설명); 제5,969,130호; 및 제6,080,589호에 설명된 것과 같은 PS의 콘쥬게이션을 포함한다. 예를 들어, 콘쥬게이션은 하나 이상의 캐리어 단백질을 통한 공유 부착에 사용하기 위해, deNAc SA 항원의 다당의 비-환원 단부, 환원 단부, 또는 양쪽 모두에 알데히드기를 도입함으로써 달성될 수 있다. 이것은 PS 또는 PS 유도체와, 예를 들어 나트륨 메타 과요오드산염을 접촉시킴으로써 과요오드화를 통해 달성될 수 있다.
deNAc SA 항원이 유도체화되지 않은 아미노기를 포함하는 경우, deNAc SA 항원과 캐리어 단백질 같은 캐리어를 결합하기 위해 사용될 수 있는 과정에 어떤 제 한이 부여될 수 있다. 이 구체예에서, 캐리어는 일반적으로 히드라지드 또는 아디프 히드라지드와 EDAC로 카르복실기에서 활성화된 캐리어 단백질의 반응을 통해 하나 이상의 아지드(히드라지드 또는 아디프 디히드라지드) 기를 함유하도록 변형된다(예를 들어, 미국특허 제6,632,437호). 히드라지드 아미노기의 pKa가 약 2.5이고, 히드라지드가 강한 친핵체이므로, 캐리어 단백질과 다당에 있는 1차 아민이 실질적으로 완전히 양성자화되어 반응성이 저하되는 약 5.5-7.5의 pH에서 이민 콘쥬게이션 반응이 수행될 수 있다.
크기 배제 크로마토그래피(ToyoPerl HW-45F)에 의해서 deNAc SA 항원-단백질 콘쥬게이트 백신이 정제될 수 있다. 단백질 농도는 로우리(Lowry) 단백질 분석에 의해, 콘쥬게이트된 다당의 양은 레조르시놀 분석에 의해서 결정된다(Svennerholm 1957 Biochim biophys Acta 24:604). 단백질과 다당이 공유 연결되었는지 확인하기 위해서, 콘쥬게이트 백신을 SDS-PAGE 상에서 분해하고, 단백질과 다당을 다클론 항-캐리어 단백질 항혈청 및 항-PS mAb를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 개별적으로 검출하여 다당 성분을 검출한다.
한 예에서, deNAc SA 항원이 이량체 에피토프를 포함하는 경우, deNAc SA 항원은 캐리어와의 부착을 제공하도록 변형될 수 있으며, 다음 구조를 가진다:
Figure 112008052552933-PCT00013
상기 식에서,
X, Y는 상기 정의된 바와 같고, R1은 H 또는 아실기(예를 들어, 아세틸기)이다. 다른 구체예에서, R1은 H; 포화 또는 불포화 아실기(예를 들어, 포화 또는 불포화 C2-18 아실기, 포화 또는 불포화 C2-16 아실기, 포화 또는 불포화 C2-12 아실기, 포화 또는 불포화 C2-10 아실기, 포화 또는 불포화 C2-8 아실기, 포화 또는 불포화 C2-6 아실기, 포화 또는 불포화 C2-4 아실기, 포화 C2-4 아실기); N-지방 아실기(예를 들어, N-라우로일, N-올레오일 등); 또는 지방 아민(예를 들어, 도데실 아민, 올레오일 아민 등)으로부터 독립적으로 선택된다. 한 구체예에서, R1은 C4-8 아실기, 예를 들어 n-부타노일, 이소부타노일, n-펜타노일, n-헥사노일, n-헵타노일, 또는 n-옥타노일이거나(예를 들어, 미국특허 제5,576,002호에 설명됨), 또는 불포화 C3-5 아실기, 예를 들어 미국특허 제6,350,449호에 설명된 것들이다.
또 다른 구체예에서, deNAc SA 항원이 삼량체 반복 단위를 포함하는 경우, deNAc SA 항원은 캐리어와의 부착을 제공하도록 변형될 수 있으며, 다음 구조를 가진다:
Figure 112008052552933-PCT00014
X, Y, 및 Z는 독립적으로 H 또는 아민 보호기; 또는 포화 또는 불포화 아실 기(일반적으로 포화 아실기)이며, 단 X, Y 및 Z 중 적어도 하나는 H 또는 트리할로아실기이고, X, Y 및 Z 중 적어도 하나는 포화 또는 불포화 아실기, 일반적으로 포화 아실기이며, 특히 관심 있는 구체예는 X, Y 및 Z 중 적어도 하나가 H(또는 아민 보호기)이고, X, Y 및 Z 중 적어도 하나가 아세틸기이고, X, Y 및 Z 중 적어도 하나가 프로피오닐기인 것들이고;
n은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 또는 그 이상, 일반적으로 약 4개 잔기 이상, 더 일반적으로 약 10개 잔기 이상이며(예를 들어, 약 2 내지 약 60, 약 10 내지 약 50, 약 30 내지 약 50, 약 10 내지 20, 또는 약 12 내지 약 18의 중합도(Dp)를 가지며, 특히 관심 있는 것은 약 2 내지 약 10의 Dp이다);
R1은 H, 아민 보호기, 또는 아실기(예를 들어, 포화 아실기, 예를 들어 아세틸기)이다. 다른 구체예에서, R1은 H; 아민 보호기; 포화 또는 불포화 아실기(예를 들어, 포화 또는 불포화 C2-18 아실기, 포화 또는 불포화 C2-16 아실기, 포화 또는 불포화 C2-12 아실기, 포화 또는 불포화 C2-10 아실기, 포화 또는 불포화 C2-8 아실기, 포화 또는 불포화 C2-6 아실기, 포화 또는 불포화 C2-4 아실기, 포화 C2-4 아실기); N-지방 아실기(예를 들어, N-라우로일, N-올레오일 등); 또는 지방 아민(예를 들, 도데실 아민, 올레오일 아민 등)으로부터 독립적으로 선택된다. 한 구체예에서, R1은 C4-8 아실기, 예를 들어 n-부타노일, 이소부타노일, n-펜타노일, n-헥사노일, n-헵타노일 또는 n-옥타노일(예를 들어, 미국특허 제5,576,002호에 설명 됨), 또는 불포화 C3-5 아실기, 예를 들어 미국특허 제6,350,449호에 설명된 것들이다.
프로피오닐 -연결 또는 아세틸-연결 콘쥬게이트
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식들에 의해 표시된 구조를 포함하는 deNAc SA 항원을 포함하는 조성물을 특징으로 한다:
Figure 112008052552933-PCT00015
상기 식에서,
X, Y, 및 Z는 독립적으로 아크릴기(예를 들어, N-아크릴, 메타크릴) 또는 할로아세틸기(예를 들어, 브로모아세틸, 클로로아세틸)이며, X, Y 및 Z 중 적어도 하나는 H이고, X, Y 및 Z 중 적어도 하나는 포화 아실기이다. deNAc SA 항원은 아크릴 또는 할로아세틸기와의 반응에 의해 공유 연결되는 캐리어 단백질 또는 알킬 2차 아민에 선택적으로 콘쥬게이트될 수 있다. 이 구체예에서 deNAc SA 항원은 일반적으로 중합체 안에 이러한 구조를 하나 이상 가진다. 예를 들어, 상기 구조는, 예를 들어 deNAc SA 항원의 약 10% 내지 100%, 약 25% 내지 90%, 약 50% 내지 75%f로 나타날 수 있다.
프로피오닐-연결 또는 아세틸-연결 deNAc SA 항원 콘쥬게이트는 적어도 부분적으로 de-N-아세틸화 PS(또는 다른 시알산 잔기-함유 중합체, 예를 들어 시알산-변형 단백질 또는 강글리오시드)와 활성화 아크릴산 또는 활성화 할로아세트산을 반응시킴으로써 발생될 수 있으며, 이때 활성화 아크릴산 또는 활성화 할로아세트산은 카르보디이미드와 같은 카르복실 활성화제, 예를 들어 EDC(-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염)와의 반응에 의해 생성된다. 활성화 아크릴산 또는 활성화 할로아세트산의 양은 바람직한 수준의 콘쥬게이션에 따라서 선택될 수 있으며, 예를 들어 PS 내의 deNAc SA의 약 10% 내지 약 100%, 약 25% 내지 약 80%, 약 50% 내지 75%이다.
전형적인 프로피오닐-연결 콘쥬게이트는 하기 화학식들에 의해 표시된 구조를 포함한다:
Figure 112008052552933-PCT00016
상기 식에서,
X는 캐리어 단백질의 반응된 시스테인 잔기의 티올, 또는 반응된 리신, 히스티딘 또는 아르기닌 잔기의 아미노기이고, Y 및 Z는 독립적으로 H 또는 포화 아실기이며, 이때 Y 및 Z 중 적어도 하나는 H이고, Y 및 Z 중 적어도 하나는 포화 아실기이다. 본원에서 고찰된 deNAc SA 항원 콘쥬게이트가 Y에 위치된 아크릴기를 통해 캐리어가 콘쥬게이트된 것들(이때 X 및 Z는 H 또는 포화 아실기이다), 또는 Z에 위치된 아크릴기를 통해 콘쥬게이트된 것들(이때 X 및 Y는 H 또는 포화 아실기이다)을 포함한다는 것이 이해될 것이다.
할로아세틸기와의 반응을 통해 캐리어에 연결된 전형적인 콘쥬게이트는 하기 화학식들에 의해 표시된 구조를 포함한다:
Figure 112008052552933-PCT00017
상기 식에서,
X는 캐리어 단백질의 반응된 시스테인 잔기의 티올, 또는 반응된 리신, 히스티딘 또는 아르기닌 잔기의 아미노기이고, Y 및 Z는 독립적으로 H 또는 포화 아실기이며, 이때 Y 및 Z 중 적어도 하나는 H이고, Y 및 Z 중 적어도 하나는 포화 아실기이다. 본원에서 고찰된 deNAc SA 항원 콘쥬게이트가 Y에 위치된 할로아세틸기를 통해 캐리어가 콘쥬게이트된 것들(이때 X 및 Z는 H 또는 포화 아실기이다), 또는 Z에 위치된 할로아세틸기를 통해 콘쥬게이트된 것들(이때 X 및 Y는 H 또는 포화 아실기이다)을 포함한다는 것이 이해될 것이다.
엑소시알리다제로 deNAc SA 항원 제제의 처리
α(2→8) 글리코시드 결합에서 오염 시알산 중합체(예를 들어, PS 및 OS에서처럼)에 있는 시알산 잔기의 절단을 촉진하기 위한 엑소시알리다제(또한 엑소뉴라미니다제라고도 한다)로의 처리에 의해 deNAc SA 항원을 함유한 조성물에서 deNAc SA 잔기를 함유하지 않는 다당(PS), 올리고당(OS), 또는 다른 N-아실화 시알산 중합체 오염물질이 감소될 수 있고, 이로써 deNAc SA 항원이 농후화된다. 적합한 엑소시알리다제는 Arthrobacter ureafaciens(예를 들어, SIALIDASEA™), Clostridium perfringens(예를 들어, SIALIDASEI™), Vibrio cholerae(예를 들어 SIALIDASEV™), Salmonella typhimurium(예를 들어, SIALIDASET™), 뉴캐슬병 바이러스, 히치너 (Hitchner) B1 균주(예를 들어, SIALIDASEN™)의 엑소시알리다제, 및 α(2→8) 글리코시드 결합을 절단할 수 있는 다른 시알리다제들을 포함한다. 사용하기 적합한 엑소시알리다제는 상업적으로 이용할 수 있다.
시알리다제 처리는, 예를 들어 적합한 pH에서 버퍼(예를 들어, 나트륨 아세테이트 버퍼와 같은 알칼리 아세테이트 버퍼) 중에서 조성물을 인큐베이션함으로써 달성될 수 있으며, 이때 pH는 deNAc SA 항원(예를 들어, PS 유도체)의 분해 및/또는 deNAc SA 항원(예를 들어, PS 유도체)의 가수분해를 피할 수 있도록 선택될 수 있다(예를 들어, 이것은 환상 락톤 잔기와 같은 시알산 유도체의 생산을 가져올 수 있다). 예를 들어, 약 6.5의 pH에서의 샘플의 인큐베이션은 엑소시알리다제 활성을 제공하는 동시에 deNAc SA 항원 분해를 감소시킬 수 있다. 인큐베이션은 어떤 적합한 기간 동안, 예를 들어 수 시간(예를 들어, 5, 10, 12시간, 또는 그 이상) 내지 수일(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5일, 또는 그 이상) 동안 행해질 수 있다. 인큐베이션은 실온(예를 들어, 약 37℃)을 포함하여 어떤 적합한 온도에서 수행될 수 있다. pH가 낮아서 시알산 유도체가 형성된 경우, 조성물을 상승된 pH(예를 들어, pH 6.5 이상, 일반적으로 pH 10 이상)에서 단시간(예를 들어, 30분 내지 1시간) 인큐베이션하여, 예를 들어 환상 락톤을 가수분해할 수 있다.
엑소시알리다제 처리는 deNAc SA 항원 제제, 특히 본원에 설명된 것들과 같은 합성 방법을 사용하여 제조된 제제에 오염물질로서 존재할 수 있는 비-반응성, 전체 N-아실화 시알산 중합체(예를 들어, N-아실화 PS)를 고갈시킨다. 이 방식에서, 엑소시알리다제 처리는 조성물 중에 deNAc SA 항원을 농후화할 수 있다. 예를 들어, 시알리다제 처리는 N-아실화 PS가 60중량% 미만, 또는 40중량% 미만인 조성물을 제공할 수 있다.
엑소시알리다제-처리된 deNAc SA 항원은 어떤 적합한 방법을 사용하여 캐리어 단백질에 콘쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, 엑소시알리다제-처리된 deNAc SA 항원은 N-아실화(예를 들어, 아크릴산 또는 할로아세트산을 사용)에 의해 콘쥬게이션된 후, 이어서 관심의 단백질 캐리어에 콘쥬게이트될 수 있다.
deNAc SA 항원 및 deNAc SA 항원 콘쥬게이트의 면역원성
더 콘쥬게이션되었든 아니든, 또는 표시 구조의 존재 또는 부재하에, 분리된 deNAc SA 항원은 면역원성일 수 있으며, 또는 아니면 면역원성은 콘쥬게이션으로부터 발생할 수도 있다. 면역원성을 측정하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 구성물의 주사 후 시간에 따른 농도, 항원항체 결합력, 및 이소타입 분포의 측정을 포함하여 혈청 항체의 측정을 일차적으로 포함한다. 더 큰 면역원성은 항체의 더 높은 역가 및/또는 증가된 수명에 의해 반영될 수 있다. 면역원성은 시험관내 살균 분석을 사용하여, 또한 면역화된 동물의 혈청이 적합한 동물 시험감염 모델에서 감염 또는 질환에 수동적인 보호를 부여하는 능력에 의해 측정될 수 있다. 면역원성은 치료될 환자 집단에서 또는 상기 환자 집단의 면역반응을 의태하는 집단에서 측정될 수 있다.
주어진 물질의 면역원성을 결정하는 한 수단은 면역화 전에 그리고 deNAc SA 항원 또는 콘쥬게이트로 초회 자극한 후에 동물(예를 들어, 마우스)의 혈청을 획득하는 것이 먼저이며, 그 다음 추가 용량으로 추가 접종한다. 이후, deNAc SA 에피토프에 대한 후-면역화 혈청 결합의 강도를 ELISA를 사용하여 확인하고, 대조군 의사-면역화 동물에 대한 대응하는 결과와 비교한다.
deNAc SA 항원은 deNAc SA 항원 콘쥬게이트에 대한 면역반응을 위해 초회 자극되어 자기 항체의 생성을 줄이거나 피할 수 있으며, de-N-아세틸화 PS로 초회 자극되지 않고 동일한 PS 콘쥬게이트로 백신접종된 개체의 반응에 비해 deNAc SA 항원 콘쥬게이트에 대한 항체 반응이 증강될 수 있다.
항원성 조성물 제제
"항원 조성물", "항원성 조성물" 또는 "면역원성 조성물"은 본원에서 deNAc SA 항원 콘쥬게이트를 비롯한 deNAc SA 항원을 포함하는 조성물을 유전적으로 언급하는데 편리한 제재로서 사용된다. 항원 조성물은 deNAc SA 항원, 그것의 콘쥬게이트, 또는 이들 둘 다를 포함할 수 있다. NmB, E. coli K1, 또는 암 세포, 특히 암 세포에 대한 항체를 돌출하는데 유용한 조성물이 본 발명에 의해 고찰된다.
deNAc SA 항원은 분리된 형태의 이러한 조성물 중에, 또는 막(예를 들어, 소포에, 예를 들어 NmB 균주로부터 생산된 것과 같은, 외막 소포 또는 미세소포) 중에 제공될 수 있다. deNAc SA 항원이 포유류 세포가 관련된 생합성 방법을 사용하여 생성된 경우, deNAc SA 항원은 전체 포유류 세포 또는 포유류 세포의 막 또는 지질 추출물의 표면에 제공될 수 있다. 전체 포유류 세포가 사용된 경우, 일반적으로 포유류 세포는 피험자에게 일단 투여된 후 더 이상의 증식을 방지하기 위해서 불활성화될 것이다. 어떤 물리적, 화학적, 또는 생물학적 불활성화 수단이 사용될 수 있으며, 제한은 아니지만, 선 조사(예를 들어, 적어도 약 5,000 cGy, 일반적으로 적어도 약 10,000 cGy, 더 일반적으로 적어도 약 20,000 cGy); 또는 미토마이신-C 처리(예를 들어, 일반적으로 적어도 10 .mu.g/mL; 더 일반적으로 적어도 약 50㎍/mL)를 포함한다.
한 구체예에서, 특히 deNAc SA 항원이 PS에 의해 생성된 경우, deNAc SA 항원 조성물은 오염 PS 및 OS를 감소시키고 조성물 중에 deNAc SA를 농후화하기 위해서 엑소시알리다제로 처리되었다.
본 발명의 조성물(특히 백신으로 사용하기 적합한 것들)은 면역학적 유효량의 항원뿐만 아니라 필요에 따라 어떤 다른 양립성 성분들을 포함한다. "면역학적 유효량"은 동일한 또는 상이한 일련의 항원성 조성물의 일부로서 단일 투약으로 상기 양을 개체에게 투여하였을 때 세포 표면 접근가능한 deNAc SA 에피토프(예를 들어, 적어도 부분적으로 de-N-아세틸화된 강글리오시드)를 갖는 암성 세포의 증상의 치료 또는 예방에 효과적인 항체반응을 도출하는데 효과적인 것을 의미한다. deNAc SA 항원 조성물은 피험자에서 항-SEAM-3 반응성 항원항체 반응을 도출하기 위해 투여될 수 있다.
투여되는 양은 투여 목표(예를 들어, 인간 피험자에게 면역요법을 제공하기 위해, 하이브리도마를 생성하기 위한 항체 생산을 제공하기 위해(예를 들어, 비-인간 숙주에서처럼), 치료될 개체의 건강 및 신체상태, 연령, 치료될 개체의 분류집단(예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 영장류 등), 개체의 면역 시스템의 항체 생 산 능력, 바람직한 보호 정도, 백신 제제, 의학적 상황에 대한 치료중인 임상의의 평가, 및 다른 관련 요인들에 따라 다양하다.
상기 양은 비교적 넓은 범위일 것으로 예상되며, 통상의 시험을 통해 결정될 수 있다. 투약 치료는 단일 투약 일정 또는 다수 투약 일정(예를 들어, 추가접종 용량을 포함하여)일 수 있다. 백신은 다른 면역조절제와 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 수성 용액 같은, 대체로 식염수 용액 등 용액일 수 있는 제약학상 허용되는 부형제 중에 제공될 수 있거나, 또는 분말 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 조성물은 deNAc SA 항원 및 애쥬번트를 포함할 수 있다. 인체에 사용될 수 있는 공지의 적합한 애쥬번트의 예는, 반드시 제한되는 것은 아니지만, 명반, 알루미늄 포스페이트, 수산화 알루미늄, MF59(4.3% w/v 스쿠알렌, 0.5% w/v Tween 80, 0.5% w/v Span 85), CpG-함유 핵산(여기서 시토신은 메틸화되지 않는다), QS21, MPL, 3DMPL, Aquilla 추출물, ISCOMS, LT/CT 돌연변이, 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드)(PLG) 미세입자, Quil A, 인터류킨 등을 포함한다. 실험 동물에 대해서는 Freund's, N-아세틸-뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르-뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP 11637, nor-MDP라고 한다), N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)에틸아민(CGP 19835A, MTP-PE라고 한다), 및 RIBI를 사용할 수 있으며, RIBI는 2% 스쿠알렌/Tween 80 에멀젼 중에 박테리아, 모노포스포릴 리피드 A, 트레할로스 디미콜레이트 및 세포벽 골격에서 추출된 3가지 성분(MPL+TDM+CWS)을 함유한다. 애쥬번트의 유효성은 면역원성 항원에 대한 항체의 양을 측정함으로 써 결정될 수 있다.
조성물을 유효성을 증강시키는 다른 전형적인 애쥬번트는, 제한은 아니지만, 다음의 것들을 포함한다: (1) 수중유 에멀젼 제제(뮤라밀 펩티드(아래 참조) 또는 박테리아 세포벽 성분 같은 다른 특정한 면역자극제가 있어도 되고 없어도 된다), 예를 들어 (a) MF59™(WO 90/14837; Vaccine design, Chapter 10: the Subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press1995), 5% 스쿠알렌, 0.5% Tween 80, 및 0.5% Span 85 함유(선택적으로 MTP-PE 함유), 미세유화기를 사용하여 서브마이크론 입자로 제조, (b) SAF, 10% 스쿠알렌, 0.4% Tween 80, 5% 플루론산-차단 중합체 L121 및 thr-MDP 함유, 서브마이크론 에멀젼으로 미세유화되거나 또는 와동되어 더 큰 입자 크기 에멀젼 생성, 및 (c) RIBI™ 애쥬번트 시스템(RAS)(Ribi Immunochem, Hamilton, MT), 2% 스쿠알렌, 0.2% Tween 80, 및 하나 이상의 박테리아 세포벽 성분, 예를 들어 모노포스포릴 리피드 A(MPL), 트레할로스 디미콜레이트 (TDM), 및 세포벽 골격(CWS), 바람직하게는 MPL + CWS(DETOX™) 함유; (2) 사포닌 애쥬번트, 예를 들어 QS21 또는 STIMULON™(Cambridge Bioscience, Worcester, MA)가 사용될 수 있거나, 또는 이로부터 생성된 입자, 예를 들어 ISCOM(면역자극 복합체)가 사용될 수 있으며, ISCOMS에는 추가의 디터젼트(detergent)가 결핍됨, 예를 들어 WO 00/07621; (3) 완전 Freund's 애쥬번트(CFA) 및 불완전 Freund's 애쥬번트(IFA); (4) 사이토카인, 예를 들어 인터류킨(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12(WO 99/44636) 등), 인터페론(예를 들어, 감마 인터페론), 대식세포 콜로니 자극인자(M-CSF), 종양괴사인자(TNF) 등; (5) 모노포스포릴 리피드 A(MPL) 또는 3-O-데아실화 MPL(3dMPL), 예를 들어 GB-2220221, EP-A-0689454, 선택적으로 폐렴구균 당류와 함께 사용되었을 때는 명반이 실질적으로 부재, 예를 들어 WO 00/56358; (6) 3dMPL와 예를 들어 QS21 및/또는 수중유 에멀젼의 조합, 예를 들어 EP-A- 0835318, EP-A-0735898, EP-A-0761231; (7) CpG 모티프를 포함하는 올리고뉴클레오티드(Krieg Vaccine 2000, 19, 618-622; Krieg Curr opin Mol Ther 2001 3:15-24; Roman et al., Nat. Med., 1997, 3, 849-854; Weiner et al., PNAS USA, 1997, 94, 10833-10837; Davis et al. J. Immunol 1998, 160, 870-876; Chu et al. J. Exp. Med, 1997, 186, 1623-1631; Lipford et al, Ear. J. Immunol., 1997, 27, 2340-2344; Moldoveami et al, Vaccine 1988, 16, 1216-1224; Krieg et al, Nature 1995, 374, 546-549; Klinman et al, PNAS USA, 1996, 93, 2879-2883; Ballas et al J. Immunol 1996, 157, 1840-1845; Cowdery et al J. Immunol 1996, 156, 4570-4575; Halpern et al., Cell Immunol, 1996, 167, 72-78; Yamamoto et al, Jpn. J. Cancer Res. 1988, 79, 866-873; Stacey et al, J. Immunol, 1996 157, 2116-2122; Messina et al, J. Immunol, 1991, 147, 1759- 1764; Yi et al, J. Immunol, 1996, 157, 4918-4925; Yi et al, J. Immunol., 1996, 157, 5394-5402; Yi et al., J. Immunol, 1998, 160, 4755-4761; 및 Yi et al, J. Immunol, 1998, 160, 5898-5906; 국제특허공개 WO 96/02555, WO 98/16247, WO 98/18810, WO 98/40100, WO 98/55495, WO 98/37919 및 WO 98/52581), 즉 적어도 하나의 CG 디뉴클레오티드 함유, 여기서 시토신은 메틸화되지 않음; (8) 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 폴리옥시에틸렌 에스테르, 예를 들어 WO 99/52549; (9) 옥톡시놀과 조합된 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에 스테르 계면활성제(WO 01/21207) 또는 옥톡시놀과 같은 적어도 하나의 추가 비이온성 계면활성제와 조합된 폴리옥시에틸렌 에틸 에테르 또는 에스테르 계면활성제(WO 01/21152); (10) 사포닌 및 면역자극성 올리고뉴클레오티드(예를 들어, CpG 올리고뉴클레오티드)(WO 00/62800); (11) 면역자극제 및 금속염 입자, WO 00/23105; (12) 사포닌 및 수중유 에멀젼, 예를 들어 WO 99/11241; (13) 사포닌(예를 들어, QS21) + 3dMPL + IM2(선택적으로 + 스테롤), 예를 들어 WO 98/57659; (14) 조성물의 효능을 증강시킬 수 있는 면역자극제로서 작용하는 다른 물질. 뮤라밀 펩티드는 N-아세틸-뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-25 아세틸-노르뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(nor-MDP), N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)에틸아민 MTP-PE) 등을 포함한다. 피험자가 인간일 경우 인체용의 적합한 애쥬번트에 특히 관심이 있다.
항원 조성물은 다른 성분들, 예를 들어 제약 등급의 만니톨, 락토스, 녹말, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 마그네슘, 탄산염 등을 포함할 수 있다. 조성물은 생리학적 조건에 근접하기 위해서 필요할 경우 pH 조정제 및 완충제, 장성 조정제 등, 예를 들어 나트륨 아세테이트, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 나트륨 락테이트 등 제약학상 허용되는 보조 물질을 함유할 수 있다. 이들 제제 중에서 항원 농도는 폭넓게 변할 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식 및 환자의 요구에 따라서, 유체 부피, 점도, 체중 등에 주로 기초하여 선택될 것이다. 결과의 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 젤, 크림, 로션, 연고, 에어로졸 등의 형태일 수 있다.
제약 제제 중에서 본 발명의 항원의 농도는 폭넓게 변할 수 있는데, 즉 중량 기준으로 약 0.1% 미만, 일반적으로 약 2% 또는 적어도 약 2% 내지는 20% 내지 50% 정도, 또는 그 이상이며, 선택된 특정 투여 방식에 따라서 주로 유체 부피, 점도 등에 의해 선택될 것이다.
면역화
deNAc SA 항원(이것은 선택적으로 콘쥬게이션될 수 있다)은 단독으로 또는 다른 백신과 조합하여 사용될 수 있다. 조합하여 사용될 때, 동일한 또는 상이한 제제로 여러 조성물이 제공될 수 있다. 상이한 제제로 투여될 때, 조성물은 동일한 또는 상이한 투약 섭생(예를 들어, 동일한 또는 상이한 경로에 의해, 동일한 또는 상이한 시간에(예를 들어, 같은 날에 또는 다른 날에) 등)으로 투여될 수 있다. 일반적으로 deNAc SA 항원의 투여는 연속하여, 동시에, 또는 혼합물로서 수행될 수 있으며, 이에 대해서는 아래 상세히 설명된다. 연속 투여가 바람직하며, deNAc SA 항원의 투약이 반복된다. 전형적인 면역화 섭생이 아래 상세히 설명된다.
일반적으로, 면역화는 어떤 적합한 경로에 의한 투여에 의해 달성되며, 여기에는 조성물의 경구, 비강, 비인두, 비경구, 장, 위, 국소, 경피, 피하, 근육내, 정제, 고형체, 분말, 액체, 에어로졸 형태, 국소 또는 전신 투여가 포함되며, 추가의 부형제가 사용되기도 한다. 비경구 투여가능한 조성물을 제조하는 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 당업자가 알고 있으며, Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980) 같은 간행물에 상세히 설명된다.
경구 투여시 deNAc SA 항원이 소화로부터 보호되어야 한다는 점이 인정된다. 이것은 전형적으로 deNAc SA 항원을 이것을 산 및 효소 가수분해에 저항성으로 만드는 조성물과 복합체를 만들거나, 또는 리포솜 같은 적합한 저항성 담체에 넣음으로써 달성된다. 관심의 화합물을 소화로부터 보호하는 수단은 본 분야에 잘 공지되어 있다.
혈청 반감기를 증가시키기 위해서, 주사용 항원성 제제는 캡슐화되거나, 리포솜 내강에 도입되거나, 콜로이드로 제조되거나, 또는 펩티드의 연장된 혈청 반감기를 제공하는 다른 종래의 기술이 사용될 수 있다. 리포솜을 제조하는 많은 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어 Szoka et al, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), 미국특허 제4,235,871호, 제4,501,728호 및 제4,837,028호에 설명된 방법들이 있다. 또한, 제제는 제어 방출 또는 서행 방출 형태로 제공될 수 있으며, 항원 제제의 투여는 혼합물로서 또는 연속 방식으로 이루어질 수 있다.
면역요법으로서 사용될 때, 조성물은 질환 및 그 합병증의 발생을 예방하거나 또는 적어도 부분적으로 중지시키기 위해 질환의 위험이 있는 피험자에게 투여될 수 있다. "위험이 있는" 피험자란, 예를 들어 피험자가 한 가지 이상의 질환의 증상 또는 징후를 나타내지만, 확진하기에는 불충분한 피험자 및/또는 질환 가능성을 증가시키는 조건에 노출되었거나 노출될 수 있는 피험자를 말한다. 예를 들어, 항원 조성물은 세포 표면 deNAc SA 에피토프(예를 들어, 적어도 부분적으로 de-N-아세틸화된 세포 표면 강글리오시드)를 갖는 암의 위험이 있는 피험자, 암에 걸린 피험자, 또는 암 전이의 위험이 있는 피험자에게 또한 투여될 수 있다.
이것을 달성하기에 충분한 양이 "치료학적 유효량"으로서 정의된다. 치료학적 용도에 효과적인 양은, 예를 들어 항원 조성물, 투여 방식, 환자의 체중 및 일반적인 건강 상태, 그리고 주치의의 판단에 따를 것이다. 1회 또는 여러 번의 항원 조성물 용량이 환자에게 필요하며 환자가 견딜 수 있는 투약량 및 빈도, 그리고 투여 경로에 따라 투여될 수 있다. 일반적으로, 면역화는 피험자에게 면역반응을 도출하기 위해 제공된다. 본원에서 논의된 대로, deNAc SA 항원 조성물은 면역화가 피험자에 있는 폴리시알산과 유의하게 교차-반응하는 검출가능한 항체를 도출하지 않지만, deNAc SA 에피토프(예를 들어, 암성 세포)와는 특이적으로 결합한다는 이점을 제공할 수 있다.
면역화 섭생
deNAc SA 항원은 선택적 항-deNAc SA 에피토프 항체의 생산을 제공하는 방식으로 숙주에게 투여된다. deNAc SA 항원 조성물은 연속하여 투여될 수 있다. 먼저, 면역학적 유효량의 deNAc SA 항원(이것은 캐리어에 콘쥬게이트될 수 있고, 부형제를 사용할 수도 있다)이 피험자에게 투여된다. 1차 투약은 일반적으로 면역반응(예를 들어, B 및/또는 T 세포 활성화)을 도출하기에 효과적인 양으로 투여된다. 초기 면역화 양은 일반적으로 70kg 환자 당 약 0.001mg 내지 약 1.0mg, 더 일반적으로 70kg 환자 당 약 0.001mg 내지 약 0.2mg, 일반적으로 70kg 환자 당 약 0.005mg 내지 약 0.015mg 범위이다. 특히 항원이 혈류가 아니라 체강이나 기관 내강과 같은 격리된 부위에 투여될 때는 환자 당 하루 0.001 내지 약 10mg의 투약량이 사용될 수 있다. 계속해서 고용량(예를 들어, 10 내지 100mg 이상)의 경구, 비 강, 또는 국소 투여가 가능하다.
1차 deNAc SA 항원 조성물의 투여 후, 1차 용량 노출에 의해서 피험자가 면역학적으로 초회 자극된 후, 치료학적 유효량의 2차 항원 조성물(예를 들어, deNAc SA 항원, 선택적으로 콘쥬게이트되며, 부형제와 함께 사용되기도 한다)이 피험자에게 투여될 수 있다. 추가접종은 초기 면역화 후의 환자의 반응과 상태에 따라 매일, 매주 또는 매달 투여될 수 있다.
1차 항원 조성물에 대한 면역반응은 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다(예를 들어, 초기 면역화 전후에 개체로부터 혈청을 획득하고, 개체의 면역 상태의 변화를 나타냄으로써(예를 들어, 면역침전 분석법, 또는 ELISA, 또는 박테리아 분석법, 또는 웨스턴 블롯,또는 유세포분석법 등) 및/또는 2차 주사에 대한 면역반응의 크기가 2차 주사에 사용된 해당 조성물로 1차 시기 면역화된 대조군 동물에서보다 더 높은 것을 증명함으로써(예를 들어, 면역학적 초회 자극)). 또한, 면역학적 초회 자극 및/또는 1차 항원 조성물에 대한 면역반응의 존재는 1차 면역화 후에 일정 시간 동안 기다림으로써 가정될 수 있으며, 선행 경험에 기초하여, 이 시간은 면역반응 및/또는 초회 자극이 일어나이게 충분한 시간으로서, 예를 들어 2, 4, 6, 10 또는 14주이다. 2차 항원 조성물의 추가접종 용량은 전형적으로 약 약 0.001mg 내지 약 1.0mg 항원이며, 면역원의 성질 및 면역화 경로에 따른다.
어떤 구체예에서, 유효량의 3차 deNAc SA 항원 조성물(예를 들어, deNAc SA 항원, 선택적으로 콘쥬게이트, 부형제와 함께 사용되기도 한다)이 초회 자극되거나 및/또는 2차 항원 조성물에 대한 면역반응이 개시된 후 피험자에게 투여된다. 3차 추가접종은 2차 면역화 후에 피험자의 반응과 상태에 따라서 매일, 매주 또는 매달 투여될 수 있다. 초회 자극 및/또는 2차 항원 조성물에 대한 면역반응의 존재는 2차 항원 조성물에 대한 면역반응을 검출하는데 사용된 것과 동일한 방법에 의해 결정될 수 있다. 초회 자극 및/또는 2차 항원 조성물에 대한 면역반응의 존재는 2차 면역화 후에 일정 시간 동안 기다림으로써 가정될 수 있으며, 선행 경험에 기초하여, 이 시간은 면역반응이 일어나이게 충분한 시간으로서, 예를 들어 2, 4, 6, 10 또는 14주이다. 2차 항원 조성물의 추가접종 용량은 전형적으로 약 0.001mg 내지 약 1.0mg 항원이며, 면역원의 성질 및 면역화 경로에 따른다.
또한, 4차, 5차 또는 6차 항원 조성물 또는 그 이상을 사용하는, 4차, 5차, 6차 또는 그 이상의 추가접종 면역화의 사용이 고찰된다.
한 구체예에서, deNAc SA 항원 조성물은 적어도 1회, 일반적으로 적어도 2회 투여되며, 일부 구체예에서는 2회 이상 투여된다.
한 구체예에서, deNAc SA 항원 조성물(예를 들어, de-N-아세틸화 PS 유도체 또는 de-N-아세틸화 PS 유도체 콘쥬게이트)이 면역반응이 초회 자극되도록 1차 항원 조성물로 투여된다. 이어서 투여되는 항원 조성물(예를 들어, 추가접종 용량)은 동일한 또는 상이한 deNAc SA 항원 조성물일 수 있으며, 제 1 항원 조성물에 대해 초회 자극된 면역반응을 증강시키는 항원성 조성물일 수 있다. 이론과 결부되는 것은 아니지만, deNAc SA 항원 조성물의 초기 초회 자극 용량은 숙주 시알산과 최소한의 교차-반응성을 나타내며, 따라서 이러한 자기반응성 항체의 생산과는 거리가 먼 항체 생산을 향해 숙주의 면역반응을 지시한다. 이 방식에서 숙주의 면역 반응이 일단 초회 자극된 다음에, 자기면역반응을 도출할 수도 있는 항원에의 노출에 의해 숙주 폴리시알산과 교차-반응하는 자기항체의 생산이 감소될 수 있다(비현실적인 또는 임상적으로 관련 없는 생산을 포함한다)
한 구체예에서, 항원 조성물은 deNAc SA 에피토프-함유 항원과 관련하여 면역학적으로 나이브한 포유류 피험자(예를 들어, 인간)에 투여될 수 있다. 다른 구체예(관련될 수도 있고 관련되지 않을 수도 있다)에서, 피험자는 약 5세 또는 더 어린 인간 아이이며, 바람직하게는 약 2세 또는 더 어린 아이이고, 항원 조성물은 다음의 시기 중 하나 이상에서 투여된다: 출생 후 2주, 1개월, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개월, 또는 1년 또는 15, 18, 또는 21개월, 또는 2, 3, 4, 또는 5세. 이러한 어린 피험자의 치료는 신경모세포종 같은 어떤 암의 치료에서 관심이 있을 수 있다.
deNAc SA 항원 조성물은 백신으로서 사용될 수 있고, 투여는 질환 증상의 최초 징후 전에, 가능한 질환의 최초 징후시에, 또는 세포 표면 deNAc SA 에피토프(예를 들어, 적어도 부분적으로 de-N-아세틸화된 강글리오시드)를 갖는 원발성 암 및/또는 암의 전이의 진단 전후에 개시될 수 있다.
항체 생산
deNAc SA 항원을 포함하는 조성물이 본원에 설명된 항체-기반 암 치료법에서 사용하기에 적합할 수 있는 단클론 항체(mAb)를 비롯한 항-deNAc SA 항원 항체를 생산하는데 사용될 수 있음을 쉽게 알 수 있을 것이다. mAb를 생성하는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 항-deNAc SA 에피토프 mAb의 생산에 사용하도록 쉽게 개조된다.
예를 들어, deNAc SA 항원으로 면역화된 동물(일반적으로 비-인간 동물)로부터 자극된 면역세포, 예를 들어 면역화된 동물의 비장에서 유래하는 면역세포를 분리함으로써 mAb 생산을 위한 하이브리도마가 형성될 수 있다. 다음에, 이들 세포를 세포 배양물에서 무한 복제될 수 있는 골수종 세포 또는 형질전환된 세포와 같은 불멸화 세포와 융합하며, 이로써 불멸의 면역글로불린-분비 셀라인이 생산된다. 이용되는 불멸 셀라인은 어떤 영양물의 활용에 필요한 효소의 결핍에 대해서 선별될 수 있다. 많은 이러한 셀라인(골수종 같은)들이 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 티미딘 키나제(TK) 또는 하이포크산틴-구아닌 포스포리복실 트랜스페라제(transferase)(HGPRT)를 포함한다. 이들 결핍은, 예를 들어 하이포크산틴 아미노프테린티미딘 배지(HAT) 상이세 성장하는 능력에 따른 융합 세포의 선별을 허용한다.
이용되는 불멸 융합 파트너는 면역글로불린을 분비하지 않는 계통에서 유래될 수 있다. 결과의 융합 세포, 또는 하이브리도마는 융합 세포만의 생존과 바람직한 단클론 항체의 생산에 대해 스크린된 결과의 콜로니의 생존을 허용하는 조건하에서 배양된다. 이러한 항체를 생산하는 콜로니가 다량의 항체를 생산하도록 클로닝되고 확장되고 성장되는데, 이에 대해서는 Kohler and Milstein, 1975 Nature 256:495(이 내용은 참고자료로서 본원에 포함된다)를 참조한다.
바람직한 항체를 생산하는 하이브리도마의 분비를 확인하고, 이들 하이브리도마 클론을 마우스의 복강에 주사하고 이로부터 복수를 채취함으로써 바람직한 항 -deNAc SA 에피토프 특이성을 갖는 다량의 mAb가 획득될 수 있다. 마우스, 바람직하게는 프리스탄(pristane), 또는 어떤 다른 종양-촉진제로 초회 자극되고, 화학적으로 또는 선 조사에 의해 면역억제된 마우스는 당업자에게 공지된 어려 적합한 계통 중 어느 것일 수 있다. 마우스로부터 복수가 채취되고, 이로부터, 예를 들어 CM Sepharose 칼럼 또는 다른 크로마토그래피 수단에 의해서 단클론 항체가 정제된다. 또는 달리, 하이브리도마는 시험관내 또는 현탁 배양물로서 배양될 수 있다. 뱃치식, 연속 배양, 또는 다른 적합한 배양 과정이 이용될 수 있다. 다음에, 배양 배지 또는 상청액으로부터 단클론 항체가 회수된다.
항-deNAc SA 에피토프 항체의 항원 결합 단편을 포함하여, 항-deNAc SA 에피토프 항체는 유전조작에 의해 생산될 수 있다. 표준 하이브리도마 과정과 마찬가지로 이 기술에서도 항체-생산 세포가 원하는 항원 또는 면역원에 대해서 민감화된다. 면역 비장 세포 또는 하이브리도마로부터 분리된 메신저 RNA를 주형으로 사용하여 PCR 증폭에 의해 cDNA를 제조한다. 각기 초기 항원 특이성의 보유하는 하나의 중쇄 유전자와 하나의 경쇄 유전자를 함유하는 벡터들의 라이브러리가 발현 벡터에 증폭된 면역글로불린 cDNA의 적합한 절편을 삽입함에 의해서 생산된다. 중쇄 유전자 라이브러리와 경쇄 유전자 라이브러리를 조합하여 조합 라이브러리가 구성될 수 있다. 이 결과 중쇄와 경쇄를 함께 발현하는 클론들의 라이브러리가 생겨난다(항체 분자의 Fab 단편 또는 항원 결합 단편과 유사). 이들 유전자를 지닌 벡터들이 숙주(예를 들어, 박테리아, 곤충 세포, 포유류 세포, 또는 다른 적합한 단백질 생산 숙주세포)에 함께 트랜스펙션된다. 항체 유전자 합성이 트랜스펙션된 숙 주에서 유도될 때, 중쇄와 경쇄 단백질은 자체 회합하여 활성 항체를 생산하며, 이것은 항원 또는 면역원을 사용한 스크리닝에 의해 검출될 수 있다.
일단 얻어진 다음, 본원에 설명된 분석 및 치료법에서 사용하기 위해 항체가 분리될 수 있고, 원한다면 정제될 수 있다. 항체의 분리 및 정제는 본 분야에 잘 공지된 기술을 이용하여 달성될 수 있으며, 항체가 자연적으로 관련되거나 제조하는 동안 관련되는 유기 분자로부터 자유로운, 적어도 50중량% 내지 60중량%의 항체-함유 제제가 제공될 수 있다. 항체 제제는 적어도 75중량%, 더 일반적으로 적어도 90중량%, 일반적으로 적어도 99중량%의 항체를 함유하는 것들을 포함한다.
한 구체예에서, 항-deNAc SA 에피토프 항체는 고염 농도의 조건하에서 항체 현택액(예를 들어, 버퍼 중의)을 접촉시킴으로써 오염물질, 특히 양이온계 오염물질로부터 분리된다. 적합한 염은 알칼리 금속염(예를 들어, 알칼리 금속 황산염(예를 들어, 황산나트륨), 알칼린 금속 할로겐화물(예를 들어, 염화나트륨), 알칼리 금속 아세트산염(예를 들어, 아세트산 나트륨) 등을 포함한다. "고염 농도"는 적어도 약 0.5M 이상에서 1M 염까지의 염 농도를 말한다. 항체를 함유하는 고염 용액은 항체로부터 오염물질을 분리하기에 적합한 조건하에서 항체와 양이온계 또는 다른 하전된 오염물질 사이에 존재할 수 있는 이온 및/또는 정전기 결합의 파괴를 제공하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션된다. 적합한 시간 기간은, 제한은 아니지만, 약 12시간, 16시간, 18시간 이상을 포함한다. 용액은 어떤 적합한 온도, 예를 들어 4℃, 37℃ 등에서 인큐베이션될 수 있다. 다음에, 항체가 용액으로부터 분리 및/또는 정제될 수 있다. 예를 들어, 침전물이 제거되도록 항체-함유 용액이 처 리될 수 있으며(예를 들어, 원심분리에 의해), 용액으로부터 항체를 분리하기 위한 추가의 분리 및/또는 정제 기술, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피를 적용할 수 있다. 항체-함유 분획은 투석(예를 들어, 포스페이트 완충 용액(PBS)에 대해) 및 여과에 의해 더 정제될 수 있다. 이러한 고염 처리는 SEAM-3 mAb의 분리 및/또는 정제에 특히 적합한 것으로 판명되었으며, 이로써 세포 표면 SEAM-3 반응성 항원을 제시하는 암성 세포에 대항하는 SEAM-3 mAb 활성에 영향을 미치는 오염물질이 제거된다.
항체-기반 진단제 및 치료제
deNAc SA 항원(비-콘쥬게이트 및 콘쥬게이트 형태를 포함하여)은 항체를 생성하는데 사용될 수 있으며, 이 항체는 진단 분석 및 항체-기반 치료법에서 사용하기 위한 시약으로서 사용될 수 있다. 본 명세서는 deNAc SA 에피토프(예를 들어, de-N-아세틸화 강글리오시드; N. meningitidis PS, 특히 NmB PS; 또는 E. coli K1 PS 등에 존재하는)와 선택적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 제공한다. 이러한 항체는 인간 폴리시알산에 대해서는 검출가능한 결합은 거의 또는 전혀 나타낼 수 없다(즉, 이 항체는 정상(비-암성) 인간 조직상의 PSA와의 유의한 정도의 교차-반응이 없다). 항-deNAc SA 에피토프 항체는 단클론 또는 다클론일 수 있으며, 적합한 부형제와 함께 제공될 수 있다. 어떤 구체예에서, 항체는 지지체 상에 고정될 수 있거나, 또는 바이알, 특히 멸균 바이알 같은 용기 안에 제공될 수 있으며, 용기는 선택적으로 아래 상세히 설명되는 진단 또는 치료 방법에 사용하기 위해 라벨이 붙을 수 있다.
진단제
deNAc SA 에피토프에 반응성인 항체는 면역진단 기술에서 항-deNAc SA 에피토프 항체를 사용하여 세포 표면 접근가능한 deNAc SA 에피토프(예를 들어, de-N-아세틸화 세포 표면 강글리오시드)를 갖는 암성 세포를 가지거나 암성 세포를 가진다고 의심되는 피험자로부터 획득된 생물학적 샘플 중의 deNAc SA 항원을 검출하는데 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 항-deNAc SA 에피토프 항체의 항원 결합 특이성을 활용하여 샘플 중에서 암성 세포 상의 deNAc SA 에피토프의 검출이 촉진될 수 있으며, 이때 숙주-유래 PSA에 대한 결합은 거의 또는 전혀 검출되지 않으므로, 거짓 양성 결과의 발생이 감소된다. 이러한 검출 방법은 진단, 항체가 deNAc SA 에피토프 및/또는 SEAM-3 반응성 항원과 특이적으로 결합하는 경우의 항-deNAc SA 항원-기반 및/또는 항체-기반 치료법에 적합한 피험자의 확인, 치료법의 모니터링(예를 들어, 치료법에 대한 반응 추적) 등에 사용될 수 있다.
적합한 면역진단 기술은, 반드시 제한되는 것은 아니지만, 시험관내 및 생체내(영상화) 방법을 모두 포함한다. 시험관내 방법인 경우, 생물학적 샘플은 deNAc SA 항원이 존재할 수 있는 어떤 샘플일 수 있으며, 제한은 아니지만, 혈액 샘플(전혈, 혈청 등을 포함하여), 조직, 완전 세포(예를 들어, 무손상 세포), 및 조직 또는 세포 추출물을 포함한다. 분석은 광범한 형태를 취할 수 있으며, 예를 들어 경합, 직접 반응 또는 샌드위치형 분석 등이 있다. 전형적인 분석법은 웨스턴 블롯, 교착 시험; 효소-표지 및 매개 면역분석, 예를 들어 ELISA; 바이오틴/아비딘 타입 분석; 방사선 면역분석; 면역전기영동; 면역침전 등을 포함한다. 이 반응들은 일 반적으로 형광, 발광, 방사선 활성, 효소 표지 또는 염료 분자, 또는 샘플 중의 항원과 이와 반응된 항체 또는 항체들의 복합체의 형성을 검출하기 위한 다른 방법과 같은 검출가능한 표지를 포함한다.
분석은 항원-항체 복합체가 결합된 고체상 지지체로부터 액체상의 미결합 항체를 분리하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 고체 지지체는 니트로셀룰로스(예를 들어, 멤브레인 또는 마이크로타이터 웰 형태); 염화폴리비닐(예를 들어, 시트 또는 마이크로타이터 웰); 폴리스티렌 라텍스(예를 들어, 비드 또는 마이크로타이터 플레이트); 불화폴리비닐리덴; 디아조타이즈 페이퍼; 나일론 멤브레인; 활성화 비드, 자기 반응성 비드 등과 같은 기판을 포함한다.
고체 지지체가 사용될 경우, 고체 지지체는 일반적으로 적합한 결합 조건하에서 고체상 성분(예를 들어, 항-deNAc SA 에피토프 항체)와 먼저 반응되며, 이로써 상기 성분이 지지체에 충분히 고정된다. 때로는 지지체에 대한 고정은 항체와 더 우수한 결합성을 갖는 단백질을 먼저 커플링시킴으로써 강화될 수 있거나, 항체 결합 활성 또는 특이성의 유의한 손실 없이 지지체 상에 항체의 고정이 제공된다. 적합한 커플링 단백질은, 제한은 아니지만, 소 혈청 알부민(BSA)을 비롯한 혈청 알부민, 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌, 면역글로불린 분자, 티로글로불린, 오브알부민, 및 당업자에게 잘 공지된 기타 단백질 등의 거대 분자를 포함한다. 항체와 지지체의 결합에 사용될 수 있는 다른 분자는 다당, 폴리아세트산, 폴리글리콜산, 중합 아미노산, 아미노산 공중합체 등을 포함하며, 단 항체 고정에 사용되는 분자는 항원과 특이적으로 결합하는 항체의 능력에 부정적인 영향을 미치지 않아야 한다. 이러한 분자 및 이들 분자와 항원을 커플링하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들어, Brinkley, M. A. Bioconjugate Chem. (1992) 3:2-13; Hashida et al. J. Appl. Biochem. (1984) 6:56-63; 및 Anjaneyulu and Staros, International J. of Peptide and Protein Res. (1987) 30:117-124 참조.
고체 지지체와 고체상 성분의 반응 후, 어떤 고정되지 않은 고체상 성분들이 세척에 의해 지지체로부터 제거된 다음, 지지체-결합된 성분이 적합한 결합 조건하에서 deNAc SA 에피토프를 함유할 것으로 의심되는 생물학적 샘플과 접촉된다. 어떤 미결합 리간드를 제거하기 위한 세척 후, 2차 바인더 부분이 적합한 결합 조건하에서 첨가되며, 이때 2차 바인더는 결합된 리간드와 선택적으로 회합할 수 있다. 다음에, 2차 바인더의 존재 또는 부재가 본 분야에 잘 공지된 기술을 이용하여 검출될 수 있다.
ELISA 방법이 사용될 수 있는데, 이 경우 마이크로타이터 플레이트 웰이 본 발명에 따른 항-deNAc SA 에피토프 항체로 코팅된다. 다음에, deNAc SA 항원(예를 들어, de-N-아세틸화 강글리오시드 같은, deNAc SA 에피토프를 갖는 종양 항원)을 함유하거나 함유할 것으로 의심되는 생물학적 샘플이 코팅된 웰에 첨가된다. 항체 결합이 일어나기에 충분한 인큐베이션 기간 후에, 플레이트(들)을 세척하여 미결합 부분을 제거하고, 검출가능한 표지된 2차 결합 분자가 첨가될 수 있다. 2차 결합 분자는 어떤 포착된 항원과 반응하며, 플레이트를 세척하고, 2차 결합 분자의 존재 또는 부재를 본 분야에 잘 공지된 방법을 이용하여 검출한다.
바람직한 경우, 생물학적 샘플로부터 결합된 deNAc SA 항원의 존재 또는 부 재는 항체 리간드에 대항하는 항체를 포함하는 2차 바인더를 사용하여 쉽게 검출될 수 있다. 예를 들어, 다수의 항-소 면역글로불린(Ig) 분자는, 당업자에게 공지된 방법을 이용하여, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 유레아제 등의 검출가능한 효소 표지와 쉽게 콘쥬게이트될 수 있다고 분 분야에 공지되어 있다. 다음에, 적합한 효소 기질을 사용하여 검출가능한 신호를 생성한다. 다른 관련 구체예에서, 경합 타입 ELISA 기술이 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 실시될 수 있다.
또한, 분석은 용액 중에서 수행될 수 있으며, 이로써 항체와 deNAc SA 항원은 침전 조건하에서 복합체를 형성한다. 예를 들어, 항체는 본 분야에 공지된 커플링 기술을 사용하여, 예를 들어 직접 화학적 또는 간접 커플링에 의해 고체상 입자(예를 들어, 아가로스 비드 등)에 부착될 수 있다. 다음에, 항체-코팅된 입자가 적합한 결합 조건하에서 deNAc SA 항원을 함유한다고 의심되는 생물학적 샘플과 접촉되며, 이로써 입자-항체-deNAc SA 항원 복합체 응집물이 형성되고, 이것은 세척 및/또는 원심분리에 의해 샘플로부터 침전 및 분리될 수 있다. 반응 혼합물은 다수의 표준 방법 중 어느 것을 이용하여, 예를 들어 상기 설명된 면역진단 방법 중 어느 것을 이용하여 분석되어 항체-항원 복합체의 존재 또는 부재가 결정될 수 있다.
진단 분석에 사용되는 시험 샘플은 deNAc SA 항원이 존재할 수 있는 어떤 샘플일 수 있으며, 제한은 아니지만, 혈액 샘플(전혈, 혈청 등을 포함하여), 조직, 완전 세포(예를 들어, 무손상 세포), 및 조직 또는 세포 추출물 함유 세포(예를 들 어, 조직, 분리된 세포 등), 세포 용해물(즉, 비-무손상 세포를 함유하는 샘플)을 포함하며, 각 샘플 타입은 양쪽 타입의 요소를 함유할 수 있다(예를 들어, 세포 샘플은 세포 용해물을 함유할 수 있고, 세포 용해물은 세포를 함유할 수 있다). 어떤 구체예에서, 무손상의 살아 있는 세포를 함유한다고 진단된 피험자로부터의 샘플을 사용하여 분석을 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 다음에, 이 세포의 세포외 표면에서 deNAc SA 항원 검출이 평가될 수 있으며, 더 나아가 세포분열 동안에도 평가될 수 있다.
또한, 진단 분석은 인시튜 수행될 수도 있다. 예를 들어, 항-deNAc SA 에피토프 항체가 검출가능하게 표지되고, deNAc SA 에피토프의 세포 표면 발현을 특징으로 하는 암을 가진다고 의심되는 피험자에게 투여되고, 검출가능하게 표지된 항체와 결합되고, 본 분야에서 이용할 수 있는 영상화 방법을 이용하여 검출된다.
본원에 설명된 진단 분석은 피험자가 deNAc SA 항원-기반 면역요법(예를 들어, deNAc SA 항원 백신 및/또는 항-deNAc SA 항원항체 치료법)을 이용한 치료법에 순응하는 암을 가지는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 진단 분석은 치료법 및 임상의에 의한 치료 섭생의 선택을 위한 정보를 제공할 수 있다.
한 구체예에서, 검출 분석은 샘플 중의 SEAM-3 반응성 항원의 검출을 수반하며, 이때 샘플은 함유할 수 있다. 시험관내 방법인 경우, 생물학적 샘플은 SEAM-3 반응성 항원이 존재할 수 있는 어떤 샘플일 수 있으며, 제한은 아니지만, 혈액 샘플(전혈, 혈청 등을 포함하여), 조직, 완전 세포(예를 들어, 무손상 세포, 즉 투과성화 되지 않은 세포), 또는 세포 용해물(예를 들어, 조직 샘플의 처리에 의해 획 득된 것 등)을 포함한다. 예를 들어, 검출 분석은 조직학적 조직 샘플 중의 세포 상의 SEAM-3 반응성 항원의 검출을 수반할 수 있다. 예를 들어, 조직 샘플은 고정(예를 들어, 포르말린 처리에 의해)되어 지지체(예를 들어, 파라핀) 안에 포매되거나, 비고정 조직으로 냉동될 수 있다.
SEAM-3 반응성 항원은 SEAM-3의 항원-결합 특이성을 갖는 항체, 일반적으로 단클론 항체(mAb)의 특이적 결합의 검출에 의해 검출될 수 있다. 이 구체예에서, SEAM-3 반응성 항원은 세포분열 동안을 포함하여, 어떤 세포 주기 단계에 있는 세포 표면에 존재할 수 있다. 어떤 예에서, 세포분열 동안 SEAM-3 반응성 항원을 제시하는 암이 세포가 무활동 상태일 때는(즉, 세포분열하지 않을 때는) SEAM-3 반응성 항원을 낮은 수준으로 또는 검출 불가능한 수준으로 제시할 수 있음을 유념한다. 그러나, 아래 실시예에서 예시한 대로, SEAM-3 반응성 항원은 투과성화된 시험 세포에서 SEAM-3 반응성 항원을 검출함으로써 비-분열 세포에서 검출될 수 있다. 정상 세포에서의 항체 염색 패턴과 구별되는 SEAM-3 항체(또는 SEAM-3의 항원 결합 특이성을 갖는 항체)에 대한 염색 패턴을 나타내는 시험 암 세포가 SEAM-3 반응성 항원을 나타내는 암성 세포로서 확인된다. 따라서, 이러한 암은 SEAM-3 반응성 항원과 특이적으로 결합하는 항체(mAb SEAM-3)를 사용한 치료법에 순응한다.
본원에 설명된 방법에 따라 deNAc SA 항원으로 면역화함에 의해서 생성된 항체를 포함하여, 상기 설명된 분석 시약들은 적합한 설명서 및 다른 필요 시약들과 함께 키트 형태로 제공될 수 있으며, 이로써 상기 설명된 면역분석을 수행할 수 있다. 또한, 키트는 사용되는 특정한 면역분석에 따라서, 적합한 라벨 및 다른 패키 지 시약 및 재료들(즉, 세척 버퍼 등)을 함유할 수 있다. 상기 설명된 것들과 같은 표준 면역분석법들이 이러한 키트를 사용하여 수행될 수 있다.
항체-기반 치료법
본 발명의 방법을 사용하여 생산된 항체는 포유류 피험자에서, 특히 인간에서 deNAc SA 에피토프를 제시하는 것과 관련된 암을 치료 또는 예방하기 위한 것이다. deNAc SA 항원(콘쥬게이트를 포함하여)을 사용하여 생산된 항체는 피험자에게 투여하기에 적합한 제약 조성물로 제공될 수 있으며, 이로써 항암 치료법이 제공된다.
더 구체적으로, 본원에 설명된 방법에 따라서 생산된 항-deNAc SA 에피토프 항체는, 예를 들어 암성 세포의 생육성 감소를 촉진하기 위해, 예를 들어 면역반응 또는 항암 치료법을 제공하거나 증강시킴으로써, 환자에서 종양 크기를 줄이고, 종양 부하를 줄이고, 및/또는 임상적 성과를 개선하기 위해, 피험자(예를 들어, 인간 환자)에게 투여될 수 있다. 특히, mAb SEAM-3의 결합 특이성을 갖는 항체(따라서 mAb SEAM-3에 의해 결합된 에피토프와 결합하는)는, 예를 들어 암성 세포가 pre-Go 세포 주기 단계에 진입하도록 유도함으로써, 암 세포의 세포 주기를 파괴하고, 이 세포의 아폽토시스로의 진입을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 항체는 선택적으로 암 세포 부위까지의 송달을 위해서, 더 나아가 종양 사멸 또는 청소를 촉진하기 위해서 항암제, 예를 들어 항-증식 부분(예를 들어, VEGF 길항제, 예를 들어 항-VEGF 항체), 독소(예를 들어, 항암 독소, 예를 들어 리신, 슈도모나스 외독소 A 등), 방 사선핵종(예를 들어, 90Y, 131I, 177L 등), 항암제(예를 들어, 독소루비신, 칼리체아미신, 메이탄시노이드 DM1, 오리스타틴 코페시타빈, 5-플루오로우리실, 류코보린, 리리노테칸 등)에 부착될 수 있고 및/또는 개선된 약동학적 프로파일을 제공하도록 선택적으로 변형될 수 있다(예를 들어, PEG화, 과당화 등에 의해).
피험자(예를 들어, 인간 피험자)에게 투여하기에 적합한 항-deNAc SA 에피토프 항체를 생산 및 제조하는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 항체는 유효량의 항체와 제약학적 부형제(예를 들어, 식염수)를 포함하는 제약 조성물로 제공될 수 있다. 제약 조성물은 선택적으로 다른 첨가제(예를 들어, 버퍼, 안정제, 보존제 등)을 포함할 수 있다. 유효량의 항체는 일반적으로 바람직한 기간 동안 피험자에서 항암 면역반응을 증강시키는데 효과적인 양이다. 치료학적 목표(예를 들어, 종양 부하의 감소)는 투약 섭생을 변화시키면서 단일 또는 다수 투약에 의해 달성될 수 있다.
항체가 발생된 종들 이외의 다른 유기체에 투여된 항체는 대체로 면역원성이다. 따라서, 예를 들어, 쥐 또는 돼지의 항체가 인간에게 투여될 경우, 대체로 항체에 대한 면역학적 반응이 유도된다. 항체의 면역원성 특성은 특징적인 인간 서열로 항체의 일부 도는 전부를 변경함으로써 감소되며, 이에 의해 각기 키메라 또는 인간 항체가 생산된다.
특히 관심 있는 것은 mAb SEAM-3의 항원 결합 특이성을 갖는 항체이다. 이러한 항체의 예는 SEAM-3 경쇄 폴리펩티드의 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR2를 포 함하는 경쇄 폴리펩티드(아미노산 잔기 24 내지 39, 아미노산 잔기 55 내지 61, 및 아미노산 잔기 94 내지 100, 각각 도 52에 나타냄)와 SEAM-3 중쇄 폴리펩티드의 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 폴리펩티드(아미노산 잔기 26 내지 35, 아미노산 잔기 50 내지 66, 및 아미노산 잔기 101 내지 108, 각각 도 52에 나타냄)을 갖는 것들을 포함한다. 이러한 항체는 키메라 항체, 인간화 항체 등을 포함한다.
키메라 항체
키메라 항체는 인간 부분과 비-인간 부분을 포함하는 면역글로불린 분자이다. 더 구체적으로, 인간화된 키메라 항체의 항원 조합 영역(또는 가변영역)은 비-인간 출처(예를 들어, 쥐)로부터 유래되고, 키메라 항체의 불변영역(이것은 면역글로불린에 생물학적 이펙터 기능을 부여한다)은 인간 출처로부터 유래된다. 키메라 항체는 비-인간 항체 분자의 항원 결합 특이성과 인간 항체 분자에 의해 부여된 이펙터 기능을 가질 수 있다. 키메라 항체를 생성하는 많은 방법이 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 미국특허 제5,502,167호, 제5,500,362호, 제5,491,088호, 제5,482,856호, 제5,472,693호, 제5,354,847호, 제5,292,867호, 제5,231,026호, 제5,204,244호, 제5,202,238호, 제5,169,939호, 제5,081,235호, 제5,075,431호 및 제4,975,369호 참조). 다른 접근법은 재조합 DNA 기술에 의하여 비-인간 항체의 CDR 영역과 인간 불변영역을 연결함으로써 인간화된 항체를 생성하는 것이다. Queen et al. Proa Natl Acad Scl USA 86:10029-10033 (1989) 및 WO 90/07861 참조.
재조합 DNA 방법은 재조합 발현 시스템에서 키메라 항체를 생성하는데 사용 될 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 벡터는 항-deNAc SA 에피토프 항체를 생산하는 셀라인의 트랜스펙션에 사용된다. 재조합 DNA 벡터는 셀라인에 있는 면역글로불린 불변영역을 암호화하는 유전자의 전부 또는 일부를 대체하는 "대체 유전자"(예를 들어, 대체 유전자는 인간 면역글로불린, 또는 특정 면역글로불린 부류의 불변영역의 전부 또는 일부를 암호화할 수 있다), 및 항체 생산 세포 내에서 면역글로불린 서열과의 표적 상동성 재조합을 허용하는 "표적 서열"(예를 들어, 하이브리도마)을 함유할 수 있다.
다른 예에서, 재조합 DNA 벡터는 바람직한 이펙터 기능(예를 들어, 인간 면역글로불린의 불변영역)을 갖는 항체를 생산하는 셀라인을 트랜스펙션하는데 사용되며, 이 경우 재조합 벡터에 함유된 대체 유전자는 항체 영역의 전부 또는 일부를 암호화할 수 있고, 재조합 벡터에 함유된 표적 서열은 동종성 재조합 및 항체 생산 세포 내에서 표적 유전자 변형을 허용한다. 다른 구체예에서, 가변영역 또는 불변영역의 일부만이 대체된 경우, 결과의 키메라 항체는 동일한 항원-결합을 한정하고 및/또는 여전히 변경된 또는 개선된 동일한 이펙터 기능을 가질 수 있으며, 이로써 키메라 항체는 더 큰 항원 특이성, 더 큰 친화성 결합 상수, 증가된 이펙터 기능, 또는 트랜스펙트된 항체 생산 셀라인 등에 의해서 증가된 분비 및 생산 등을 나타낼 수 있다.
인간 항체
다른 구체예에서, 항-deNAc SA 에피토프 항체는 완전한 인간 항체이다. 인간 항체는 특징적인 인간 폴리펩티드 서열로 주로 이루어진다. 본 발명의 인간 항 체는 광범한 방법에 의해 생산될 수 있다(예를 들어, Larrick et al., 미국특허 제5,001,065호 참조). 인간 항-deNAc SA 에피토프는 트리오마(trioma) 세포(3개 세포, 즉 2개의 인간 세포와 1개의 마우스 세포로부터 전해진)에서 초기에 생산될 수 있다. 다음에, 이 항체를 암호화하는 유전자가 다른 세포, 특히 비-인간 포유류 세포에서 클로닝되고 발현된다. 트리오마 기술에 의해 인간 항체를 생산하는 일반적인 접근법은 Ostberg et al. (1983), Hybridoma 2: 361-367, Ostberg, 미국특허 제4,634,664호, 및 Engelman et al., 미국특허 제4,634,666호에 설명된다. 트리오마는 인간 세포로부터 제조된 평범한 하이브리도마보다 더욱 안정하게 항체를 생산하는 것으로 판명되었다.
암 치료법
deNAc SA 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체는 포유류 피험자, 특히 인간의 항암 치료법에서 사용될 수 있으며, 이때 암성 세포는 세포외 접근가능한 세포 표면에서 deNAc SA 에피토프(예를 들어, 적어도 부분적으로 de-N-아세틸화된 강글리오시드) 상의 deNAc SA 에피토프)를 제시한다. 특히, deNAc SA 항원(deNAc SA 항원 콘쥬게이트를 포함하여)을 사용하여 생성된 항체는 치료가 필요한 피험자에게 투여하기에 적합한 제약 조성물로 제공될 수 있다.
해당 항체의 치료학적 투여는 치료 섭생의 일부로서의 투여를 포함할 수 있는데, 이것은 추가의 표준 항암 치료법과 병용될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있으며, 추가 치료법은, 제한은 아니지만, 화학요법제 및 수술을 포함한다(예를 들어, 아래 더 설명된 것들). 이에 더하여, 해당 항체의 치료학적 투여는 항암 치료법을 사용한 피험자의 치료학적 치료 이후에 행해질 수 있으며, 이 경우 항암 치료법은, 예를 들어 수술, 방사선요법, 화학요법제 투여 등일 수 있다. 특히 관심 있는 것은 단클론 항체, 특히 표적 세포의 보체-매개 사멸, 및/또는 항체-의존성 세포 세포독성-매개 사멸을 제공할 수 있는 단클론 항체의 사용이다.
어떤 구체예에서, 항체는 단독으로 제공될 수 있거나, 또는 화합물의 암 세포로의 송달을 촉진하여 종양 사멸 또는 청소를 촉진하기 위한 화합물, 예를 들어 독소(예를 들어 리신, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소 A 또는 다른 독소), 방사선핵종 또는 다른 세포독성 분자(90Y, 131I, 177L 등)에 선택적으로 부착될 수 있다. 항체(또는 화합물에 결합된 경우, 항체-화합물 콘쥬게이트)는 용액으로 제공될 수 있다(예를 들어, 정상 식염수 용액, PBS, 또는 인간 알부민(5%)과 조합된 정상 식염수 또는 PBS에 희석되어). 항체는 약 0.1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml 범위의 농도로 제공될 수 있으며, 여기에는 약 0.5 mg/ml 내지 약 9 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 약 8 mg/ml, 약 1.5 mg/ml 내지 약 7.5 mg/ml, 약 2 mg/ml 내지 약 7 mg/ml, 약 2.5 mg/ml 내지 약 6.5 mg/ml, 약 3 mg/ml 내지 약 6 mg/ml, 약 3.5 mg/ml 내지 약 5.5 mg/ml, 약 4 mg/ml 내지 약 5 mg/ml 등이 포함된다.
다른 구체예에서, 항체는 하나 이상의 화학요법제(예를 들어, 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손(CHOP))와 조합하여, 및/또는 방사선 치료와 조합하여, 및/또는 외과적 개입(예를 들어, 종양을 제거하기 위한 사전-수술 또는 사후-수술)과 조합하여 투여될 수 있다. 항-deNAc SA 에피토프 항체가 외 과적 개입과 함께 사용된 경우, 항체는 암성 세포를 제거하기 위한 수술 전에, 동시에, 또는 이후에 투여될 수 있으며, 전신적으로 또는 수술 부위에 국소적으로 투여될 수 있다. 단독으로 사용되는 항체 또는 상기 설명된 대로 조합하여 사용되는 항체는 전신적으로(예를 들어 비경구 투여에 의해, 예를 들어 정맥내 경로에 의해) 또는 국소적으로(예를 들어 국소 종양 부위에, 예를 들어 종양내 투여에 의해(예를 들어, 고상 종양에, 림프종 또는 백혈병에서 관련된 림프절에), 고상 종양 공급용 혈관에의 투여 등) 투여될 수 있다. 항체 투여는 주입에 의해 달성될 수 있고, 예를 들어 약 50 mg/h 내지 약 400 mg/h의 속도로 주입하며, 여기에는 약 75 mg/h 내지 약 375 mg/h, 약 100 mg/h 내지 약 350 mg/h, 약 150 mg/h 내지 약 350 mg/h, 약 200 mg/h 내지 약 300 mg/h, 약 225 mg/h 내지 약 275 mg/h가 포함된다. 전형적인 주입 속도는 바람직한 치료학적 용량을 달성할 수 있으며, 바람직한 용량은, 예를 들어 약 0.5 mg/m2/일 내지 약 10 mg/m2/일로서, 여기에는 약 1 mg/m2/일 내지 약 9 mg/m2/일, 약 2 mg/m2/일 내지 약 8 mg/m2/일, 약 3 mg/m2/일 내지 약 7 mg/m2/일, 약 4 mg/m2/일 내지 약 6 mg/m2/일, 약 4.5 mg/m2/일 내지 약 5.5 mg/m2/일이 포함된다. 투여(예를 들어, 주입에 의한)는 바람직한 기간에 걸쳐 반복될 수 있으며, 예를 들어 약 1일 내지 약 5일의 기간에 걸쳐 또는 수일간, 예를 들어 약 5일간 매일 1회, 약 1개월, 약 2개월 등에 걸쳐 반복될 수 있다.
전이의 항체-기반 치료법
암을 치료하는데 있어서 일차적인 문제는 전이 또는 종양의 원발 부위로부터 혈류로 이동하여 먼 부위까지 방출된 후, 먼 부위의 조직에 부착되어 속발성 종양을 형성하려는 경향이다. 이 문제는 대체로 원발성 종양의 외과적 제거 동안 종양 덩어리의 기계적 파괴의 결과로서 악화되며, 그 결과 수술 후 속발 위치에 전이와 유착이 생겨난다. deNAc SA 에피토프(예를 들어, de-N-아세틸 강글리오시드)를 발현하는 세포로 이루어진 원발성 종양의 확인 후 및/또는 종양 제거 수술 후, 항-deNAc SA 에피토프 항체(예를 들어, SEAM-3)로의 치료는 전이에 따른 어떤 암 세포의 유착을 방지할 수 있으며, 이것이 본 발명에서 고찰된다. 이에 더하여, deNAc SA 에피토프(예를 들어, de-N-아세틸 강글리오시드 또는 시알산 변형 단백질)을 발현하는 암 세포와 결합하는 항-deNAc SA 에피토프 항체(예를 들어, SEAM-3)는 보체 독립적인 세포에 대한 세포독성 효과를 제공할 수 있다(실시예 섹션 참조). 따라서, 어떤 구체예에서, 항-deNAc SA 에피토프 항체(예를 들어, SEAM-3)는, 예를 들어 환경적 노출(예를 들어, 약물 치료법), 유전적 결함 등의 결과로서 보체 결함을 갖게 된 암 환자를 치료하는데 유용하다. 보체 결함의 예는 C1, C2, C6, C9, 및 프로페르딘의 억제를 수반하는 것들을 포함한다.
조합 암 치료법
광범한 암 치료법 중 어떤 것이 본원에 설명된 deNAc SA-기반 또는 항-deNAc SA 에피토프 항체-기반 치료법과 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 암 치료법은 수술(예를 들어, 암성 조직의 외과적 제거), 방사선요법, 골수이식, 화학요법제 치료, 생물학적 반응 변형제 치료, 및 전술한 것들의 어떤 조합을 포함한다.
방사선 요법은, 제한은 아니지만, 빔과 같은 외부 적용 출처로부터, 또는 작 은 방사선 활성 출처의 이식에 의해 송달되는 X-선 또는 감마선을 포함한다.
화학요법제는 암 세포의 증식을 감소시키는 비-펩티드(즉, 비-단백질성) 화합물로서, 세포독성제와 세포증식억제제를 포괄한다. 화학요법제의 비제한적 예는 알킬화제, 니트로소유레아, 항대사산물, 항종양 항생제, 식물 (빈카) 알칼로이드, 및 스테로이드 호르몬을 포함한다.
세포 증식을 감소시키는 작용을 하는 제제들은 본 분야에 공지되어 있고 광범하게 사용된다. 이러한 제제는 알킬화제, 예를 들어 질소 머스터드, 니트로소유레아, 에틸렌이민 유도체, 알킬 술포네이트, 및 트리아진을 포함하며, 제한은 아니지만, 메클로레타민, 시클로포스파미드(CYTOXAN™), 멜팔란(L-사르코리신), 카뮤스틴(BCNU), 로뮤스틴(CCNU), 세뮤스틴(메틸-CCNU), 스트렙토조신, 클로로조토신, 우라실 머스터드, 클로르메틴, 이포스파미드, 클로람부실, 파이포브로만, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌티오포스포라민, 부술판, 다카바진, 및 테모졸로미드를 포함한다.
항대사산물 제제는 엽산 유사체, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 및 아데노신 데아미나제 억제제를 포함하며, 제한은 아니지만, 시타라빈(CYTOSAR-U), 시토신 아라비노시드, 플루오로우라실(5-FU), 플록스유리딘(FudR), 6-티오구아닌, 6-메르캅토퓨린(6-MP), 펜토스타틴, 5-플루오로우라실(5-FU), 메토트렉세이트, 10-프로파르길-5,8-디데아자폴레이트(PDDF,CB3717), 5,8-디데아자테트라히드로폴산(DDATHF), 류코보린, 플루다라빈 포스페이트, 펜토스타틴, 및 젬시타빈을 포함한다.
적합한 천연 산물들 및 그 유도체(예를 들어, 빈카 알칼로이드, 항종양 항생 제, 효소, 림포카인, 및 에피포도필로톡신)은, 제한은 아니지만, Ara-C, 파클리탁셀(TAXOL
Figure 112008052552933-PCT00018
), 도세탁셀(TAXOTERE
Figure 112008052552933-PCT00019
), 데옥시코포르마이신, 미토마이신-C, L-아스파라기나제, 아자티오프린; 브레퀴나르; 알칼로이드류, 예를 들어 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈오렐빈, 빈데신 등; 포도필로톡신류, 예를 들어 에토포시드, 테니포시드 등; 항생제류, 예를 들어 안트라시클린, 다우노루비신 염산염(다우노마이신, 루비도마이신, 세루비딘), 이다루비신, 독소루비신, 에피루비신 및 모르폴리노 유도체 등; 페녹시존 비스시클로펩티드류, 예를 들어 닥티노마이신; 염기성 글리코펩티드류, 예를 들어 블레오마이신; 안트라퀴논 글리코시드류, 예를 들어 플리카마이신(미트라마이신); 안트라센디온류, 예를 들어 미톡산트론; 아지리노피롤로 인돌디온류, 예를 들어 미토마이신; 거대고리 면역억제제류, 예를 들어 시클로스포린, FK-506(타크롤리무스, 프로그라프), 라파마이신 등; 등을 포함한다.
다른 항증식성 세포독성제는 나벨빈, CPT-11, 아니스트라졸, 레트라졸, 카페시타빈, 리록사핀, 시클로포스파미드, 이포사미드, 및 드롤록사핀이다.
또한, 항증식 활성을 갖는 미세관에 영향을 주는 제제가 사용하기 적합하며, 제한은 아니지만, 알로콜치신(NSC 406042), 할리촌드린 B(NSC 609395), 콜치신(NSC 757), 콜치신 유도체(예를 들어, NSC 33410), 돌스타틴 10(NSC 376128), 메이탄신 (NSC153858), 리족신(NSC 332598), 파클리탁셀(TAXOL
Figure 112008052552933-PCT00020
), 티오콜치신(NSC 361792), 트리틸 시스테린, 빈블라스틴 술페이트, 빈크리스틴 술페이트, 제한은 아니지만 에포틸론 A, 에포틸론 B, 디스코더몰라이드를 포함하는 천연 및 합성 에포틸론류; 에스트라뮤스틴, 노코다졸 등을 포함한다.
사용하기 적합한 호르몬 조정제 및 스테로이드(합성 유사체를 포함하여)는, 제한은 아니지만, 아드레노코르티코스테로이드류, 예를 들어 프레드니손, 덱사메타손 등; 에스트로겐류 및 프레게스틴류, 예를 들어 히드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 에스트라디올, 클로미펜, 타목시펜 등; 및 아드레노코르티칼 억제제류, 예를 들어 아미노글루테티미드; 17알파-에티닐에스트라디올; 디에틸스틸베스트롤, 테스토스테론, 플루옥시메스테론, 드로모스타놀론, 프로피오네이트, 테스토락톤, 메틸프레드니솔론, 메틸테스토스테론, 프레드니솔론, 트리암시놀론, 클로로트리아니센, 히드록시프로게스테론, 아미노글루테티미드, 에스트라뮤스틴, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 류프롤라이드, 플루타미드(Drogenil), 토레미펜(Fareston), 및 ZOLADEX
Figure 112008052552933-PCT00021
를 포함한다. 에스트로겐류는 증식 및 분화를 자극하므로, 에스트로겐 수용체와 결합하는 화합물이 이 활성을 차단하는데 사용된다. 코르티코스테로이드류는 T 세포 증식을 억제할 수 있다.
다른 화학요법제는 금속 복합체, 예를 들어 시스플라틴(cis-DDP), 카르보플라틴 등; 유레아, 예를 들어 히드록시유레아; 및 히드라진, 예를 들어 N-메틸히드라진; 에피도필로톡신; 토포이소머라제 억제제; 프로카바진; 미톡산트론; 류코보린; 테가푸르; 등을 포함한다. 관심 있는 다른 항증식제는 면역억제제, 예를 들어 미코페놀산, 탈리도마이드, 데스옥시스페르구알린, 아자스포린, 레프루노마이드, 미조리빈, 아자스피란(SKF 105685); IRESSA
Figure 112008052552933-PCT00022
(ZD 1839, 4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-메톡시-6-(3-(4-모르폴리닐)프로폭시)퀴나졸린); 등을 포함한다.
"탁산류"는 파클리탁셀뿐만 아니라 어떤 활성 탁산 유도체 또는 프로드러그를 포함한다. "파클리탁셀"(이것은 본원에서 유사체, 조제, 및 유도체, 예를 들어 도세탁셀, TAXOL™, TAXOTERE™(도세탁셀 조제), 파클리탁셀의 10-데스아세틸 유사체 및 파클리탁셀의 3'N-데스벤조일-3'N-t-부톡시카르보닐 유사체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다)은 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 쉽게 제조될 수 있거나(또한, WO 94/07882, WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076; 미국특허 제5,294,637호; 제5,283,253호; 제5,279,949호; 제5,274,137호; 제5,202,448호; 제5,200,534호; 제5,229,529호; 및 EP 590,267 참조), 또는 예를 들어 Sigma Chemical Co., St. Loui™s, Mo.(T7402, Taxus brevifolia; 또는 T-1912, Taxus yannanensis)를 포함하는 여러 상업적 출처로부터 획득될 수 있다.
파클리탁셀은 파클리탁셀의 보편적인 화학적으로 이용가능한 형태뿐만 아니라 유사체 및 유도체(예를 들어, 상기 주지된 TAXOTERE™ 도세탁셀)와 파클리탁셀 콘쥬게이트(예를 들어, 파클리탁셀-PEG, 파클리탁셀-덱스트란, 또는 파클리탁셀-크실로스)를 말하는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 용어 "탁산"에는 친수성 유도체와 소수성 유도체를 포함하여 여러 공지된 유도체들이 포함된다. 탁산 유도체는, 제한은 아니지만, 국제특허출원 WO 99 /18113에 설명된 갈락토스 및 만노스 유도체; WO 99/14209에 설명된 피페라지노 및 다른 유도체; WO 99/09021, WO 98/22451, 및 미국특허 제5,869,680호에 설명된 탁산 유도체; WO 98/28288에 설명된 6-티오 유도체; 미국특허 제5,821,263호에 설명된 술펜아미드 유도체; 및 미국특허 제5,415,869호에 설명된 탁솔 유도체를 포함한 다. 더 나아가, 파클리탁셀의 프로드러그를 포함하며, 여기에는 제한은 아니지만, WO 98/58927; WO 98/13059; 및 미국특허 제5,824,701호에 설명된 것들이 포함된다.
deNAc SA 항원 면역화-기반 또는 항체-기반 치료법에 순응하는 암
deNAc SA 항원은 세포 표면 deNAc SA 에피토프를 갖는 다양한 암 치료법(암 예방(예를 들어, 암 백신) 및 진단-후 암 치료법을 포함하여) 또는 암 진단제에서 사용된다. 종양을 가지거나, 종양을 가진다고 의심되거나, 종양이 발생할 위험이 있는 피험자가 본원에 설명된 치료법 및 진단에서 고려된다. 이러한 피험자로부터 획득된 샘플이 마찬가지로 본 발명의 방법에 사용하기 적합하다.
세포표면 접근가능한 deNAc SA 에피토프를 갖는 암은 적어도 부분적으로 de-N-아세틸화된 강글리오시드 및/또는 deNAc SA 에피토프를 함유하는 시알산 변형을 갖는 단백질을 갖는 것들을 포함한다. de-N-아세틸화 강글리오시드를 갖는 암들은 설명되었다.
정상 인간 조직에서 de-N-아세틸 시알산 잔기의 존재는 일시적이며 과다성이 매우 낮은 것으로 드러났으며, 소수의 혈관에서만 발견되고, 피부 및 결장에 있는 단핵구에 침윤하며, 피부 멜라닌세포에서는 중간 정도의 수준으로 발견된다. 이것은 흑색종, 백혈병 및 림프종 같은 비정상 세포에서만 우세하게 존재한다. deNAc SA 항원(예를 들어, de-N-아세틸 강글리오시드)의 높은 수준의 발현이 암 세포에서 우세하게 발생하므로, deNAc SA 항원을 사용한 면역화는 보체-매개 세포독성 및 항체-의존성 세포 세포독성에 영향을 미칠 수 있는 항체를 도출하는데 사용될 수 있으며, 종양 성장을 차단할 수 있다. 또한, 일부 강글리오시드에서 발견되는 짧은 de-N-아세틸 시알산 올리고머에 특이적인 항체가 보체-매개 세포독성 및 항체-의존성 세포 세포독성을 행하기 위해 치료학적으로 사용될 수 있으며, 종양 성장을 차단하고, 다른 조직으로 암 세포의 유착 및 침입을 방지할 수 있다.
deNAc SA 에피토프를 제시하는 전형적인 암은 de-N-아세틸 시알산 잔기를 함유하는 de-N-아세틸 강글리오시드를 제시하는 암 세포를 포함한다(예를 들어, GM2알파, GM1알파, GD1베타, GM1b, GD1c, GD1알파, GM3, GM2, GM1, GD13, GT13, GT1h알파, GD3, GD2, GD1b, GT1b, GQ1b, Gomega1h알파, GT3, GT2, GT1c, GQ1c 및 GP1c). 특히 관심 있는 것은 알파 2-8 글리코시드 결합에 의해서 연결된 둘 이상의 시알산 잔기를 함유하는 강글리오시드이며(예를 들어, GD1c, GT13, GD3, GD1b, GT1b, GQ1b, Gomega1h알파, GT3, GT1c, GQ1c, 및 GP1c), 여기서 적어도 하나의 잔기는 de-N-아세틸화된다. 어떤 구체예에서, 알파 2-8 글리코시드 결합에 의해서 연결된 둘 이상의 시알산 잔기를 함유하는 강글리오시드는 GD3 및/또는 GM3 이외의 다른 강글리오시드이다. 어떤 구체예에서, 암의 표적은 de-N-아세틸화 강글리오시드 상에 존재하는 것 이외의 다른 deNAc SA 에피토프이다(예를 들어, 시알산-변형 단백질의 de-N-아세틸화 잔기).
한 구체예에서, SEAM-3 반응성 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 세포 표면에 SEAM-3 반응성 항원이 존재하는 암의 치료에 사용될 수 있으며, 세포분열 동안 세포외 접근가능한 SEAM-3 반응성 항원을 나타내는 암들이 포함된다. SEAM-3 반응성 항원, 특히 세포 표면 SEAM-3 반응성 항원을 제시하는 암들이 단클론 항체 SEAM-3의 항원 결합 특이성을 갖는 항체를 사용한 치료법에 순응하며, 세포분열 동 안 세포외 접근가능한 SEAM-3 반응성 항원을 나타내는 암들이 포함된다.
정상 세포에 대한 손상을 완화하기 위하여, 암 치료법이 지시되는 deNAc SA 에피토프 및/또는 SEAM-3 반응성 항원은 비-암성 세포에 비하여 암 세포 상에서 높은 수준으로 발현될 수 있다는 사실에 유념하여야 하며, 이것은 본원에 개시된 치료법들의 제한은 아니다. 예를 들어, 암이 보충될 수 있는 세포 타입(예를 들어, B 세포, T 세포, 또는 조혈 기원의 다른 세포, 백혈병 및 림프종에서와 같이)을 수반하는 경우, 정상 세포에 대한 항-deNAc SA 에피토프 항체(예를 들어, SEAM-3)의 결합이 허용될 수 있는데, 이는 이러한 세포들의 고갈로 인한 피험자의 손상이 치료될 수 있기 때문이다(예를 들어, 정상 세포의 재거주를 자극하는 약물, 예를 들어 GM-CSF, EPO 등을 사용하여).
본원에서 고찰되는 암에 관련한 방법들은, 예를 들어 항암 백신 또는 치료법으로서 deNAc SA 항원의 사용뿐만 아니라 항암 백신(예를 들어 수동적 면역화에 의한) 또는 치료법들에서 deNAc SA 항원을 사용하여 생성된 항체의 사용을 포함한다. 이 방법들은 암종, 육종, 백혈병, 및 림프종을 포함하는 광범한 암들의 치료 또는 예방과 관련하여 유용하다.
본원에 설명된 방법에 의한 치료법에 순응할 수 있는 암종은, 제한은 아니지만, 식도 암종, 간세포 암종, 기저세포 암종(피부암 형태), 편평세포 암종(여러 조직), 이행세포 암종을 비롯한 방광 암종(방광의 악성 신생물), 기관지 유래 암종, 결장 암종, 결직장 암종, 위 암종, 폐의 소세포 암종 및 비-소세포 암종을 비롯한 폐 암종, 부신피질 암종, 갑상선 암종, 췌장 암종, 유방 암종, 난소 암종, 전립선 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암, 낭선암종, 수질암종, 신장세포 암종, 관상피내암 또는 담관암종, 융모막암종, 생식세포종, 배성 암종, 윌름씨종양, 자궁경부 암종, 자궁 암종, 고환 암종, 골원성 암종, 상피성 암종, 및 비인두 암종을 포함한다.
본원에 개시된 방법에 의한 치료법에 순응할 수 있는 육종은, 제한은 아니지만, 섬유육종, 혼합육종, 지방육종, 연골육종, 척삭종, 골원성 육종, 골육종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 윤활막종, 중피종, 유잉육종, 평활근육종, 횡문근육종, 및 다른 연조직 육종들을 포함한다.
본원에 개시된 방법에 의한 치료법에 순응할 수 있는 다른 고상 종양은, 제한은 없지만, 신경아교종, 별아교세포종, 수질모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 속귀신경집종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 및 망막모세포종을 포함한다.
본원에 개시된 방법에 의한 치료법에 순응할 수 있는 백혈병은, 제한은 아니지만, a) 만성 골수증식성 증후군(다능성 조혈 줄기세포의 신생물성 장애); b) 급성 골수성 백혈병(다능성 조혈 줄기세포 또는 계통 제한적 조혈세포의 신생물성 혈질전환); c) B-세포 CLL, T-세포 CLL 전림프구성 백혈병, 및 유모세포 백혈병을 포함하는 만성 림프구성 백혈병(CLL; 면역학적으로 미성숙하고 기능적으로 불완전한 소 림프구의 클론성 증식); 및 d) 급성 림프모구성 백혈병(림프모구의 축정을 특징으로 함)을 포함한다. 당해 방법을 사용하여 치료될 수 있는 림프종은, 제한은 아니지만, B-세포 림프종(예를 들어, 버킷 림프종); 호지킨 림프종; 비-호지킨 림프 종 등을 포함한다.
본원에 개시된 방법에 따른 치료에 순응할 수 있는 다른 암들은 비정형 수막종(뇌), 섬세포 암종(췌장), 수질 암종(갑상선), 간엽종(장), 간세포 암종(간), 간모세포종(간), 투명세포 암종(신장), 및 종격 신경세포종을 포함한다.
더 나아가, 본원에 개시된 방법을 사용하는 치료에 순응할 수 있는 전형적인 암은, 제한은 아니지만, 신경외배엽 및 상피 기원의 암을 포함한다. 신경외배엽 기원의 암의 예는, 제한은 아니지만, 유잉육종, 척수종양, 뇌종양, 소아 천막상부 원시신경외배엽 종양, 관낭형 암종, 점액성 관상 및 방추세포 암종, 신장종양, 종격종양, 신경교종, 신경모세포종, 및 청소년 및 젊은 성인의 육종을 포함한다. 상피 기원의 예는, 제한은 아니지만, 소세포 폐암, 유방, 눈 수정체, 결장, 췌장, 신장, 간, 난소, 및 기관지 상피의 암을 포함한다. 어떤 구체예에서, 당해 방법은 흑색종의 치료를 포함하지 않는다(즉, 암은 흑색종 이외의 다른 암이다). 다른 구체예에서, 당해 방법은 림프종의 치료를 포함하지 않는다(즉, 암은 림프종 이외의 다른 암이다).
어떤 구체예에서, 본 발명의 방법은 흑색종 및 일부 림프종을 포함하는 de-N-아세틸 강글리오시드를 발현한다고 알려진 암 세포를 치료하는데 사용된다. 전구물질 강글리오시드 GM3 및 GD3를 과발현하는 암은 또한 세포 표면상에서 가장 많은 양의 de-N-아세틸 강글리오시드를 발현할 것으로 예상된다.
한 구체예에서, 암은 SEAM-3 반응성 항원을 제시하는 것이다. SEAM-3 반응성 항원을 제시하는 암은 본 분야에 공지된 방법에 의해 확인될 수 있다. 전형적 인 검출 및 진단 방법이 아래 설명된다.
항암 치료법이 단클론 항체(mAb) SEAM-3의 항원-결합 특이성을 갖는 항체의 투여를 포함하는 경우(아래 상세히 논의됨), 항암 치료법은 특히 분열하는(복제하는, 증식하는) 암성 세포에 지시될 수 있다. 아래 실시예에 나타낸 대로, SEAM-3에 의해서 특이적으로 결합된 에피토프는 세포분열 동안 주로 접근 가능하다. 즉, SEAM-3에 의해 결합된 세포외 접근가능한 항원의 수준은 비-분열 세포에 비해 세포분열 동안 증가되고, SEAM-3의 결합은 세포를 후기(pro-Go 쪽으로)를 향해 보낸다. 대부분의 암은 동일한 타입의 정상세포보다 더 빠르게 분열하므로, SEAM-3 반응성 항원에 결합하는 항체는 항체-기반 암 치료법을 위해 매력적이다.
따라서, 본 명세서는 특히 SEAM-3 mAb의 항원 결합 특이성을 갖는 항체의 투여를 포함하는 암성 세포를 향해 지시되는 항암 치료법을 제공한다. SEAM-3의 항원 결합 특이성을 갖는 항체를 사용한 항체 치료법에 특히 순응하는 암은 세포 증식 마커(예를 들어, Ki-67 항원)를 시험함으로써 및/또는 분열하는 세포에 SEAM-3에 의해 결합된 deNAc SA 에피토프의 접근성을 시험함으로써 확인될 수 있다(예를 들어, 시험관내 분석에서처럼).
SEAM -3 단클론 항체의 항원 결합 특이성을 갖는 항체
본 명세서는 재조합 단클론 항체(mab), 및 이러한 항체를 암호화하는 핵산을 제공하며, 여기서 재조합 mAb는 SEAM-3의 항원 특이성을 갖고, 이 mAb는 암 세포의 표면에 있는 de-N-아세틸화 강글리오시드와 결합하여 암 세포의 세포 생육성 감소를 촉진한다. SEAM-3의 항원 결합 특이성을 갖는 재조합 항체는 적어도 SEAM-3의 항원 결합 부분을 갖는 항체들을 포함한다. 이러한 재조합 mAb는 다음과 같은 일반적인 특징이 있다고 설명될 수 있다:
a) 암성 세포의 세포외 접근가능한 표면에 있는 deNAc SA 에피토프, 특히 deNAc SA 에피토프에 대한 높은 친화성(예를 들어, 약 10-6, 약 10-8 또는 그 이하의 Kd);
b) deNAc SA 항원의 해리에 대한 느린 오프 레이트(예를 들어, 약 1x10-3sec-1 이하의 Koff);
c) de-N-아세틸 잔기를 함유하지 않는 폴리시알산과는 유의하게 결합하지 않음;
d) 시험관내에서 세포 표면 deNAc SA 에피토프(예를 들어, de-N-아세틸 강글리오시드)를 갖는 암성 세포의 유착 상실을 촉진하는 활성; 및
e) 세포 표면 deNAc SA 에피토프 또는 특히 SEAM-3 반응성 항원을 갖는 암성 세포의 생육성 감소를 촉진하는 활성, 이 항체는 세포 주기를 파괴할 수 있고 및/또는 보체와 결합할 수 있고 및/또는 결합된 암 세포에 대해 ADCC를 지시할 수 있다.
면역화-기반 기술에 의해서 그리고 SEAM-3 반응성 항원과 경합하여 결합하는 항체를 스크리닝함으로써 SEAM-3의 항원 결합 특이성을 갖는 항체들이 생산될 수 있다. 이러한 항체는 또한 재조합 방법에 의해 생성될 수 있는데, 재조합 방법은 본원에 개시된 SEAM-3 mAb 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드의 아미노산 및 암호화 폴리뉴클레오티드에 의해 제공된 정보를 이용한다. 예를 들어, SEAM-3의 항원 결합 특이성을 갖는 항체는 SEAM-3 경쇄 폴리펩티드 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3(연속 아미노산 잔기 24-39, 연속 아미노산 잔기 55-61, 및 연속 아미노산 잔기 94-100, 각각 도 52에 나타냄)를 포함하는 재조합 경쇄 폴리펩티드를 제조하고, SEAM-3 중쇄 폴리펩티드 가변영역(연속 아미노산 잔기 26-35, 연속 아미노산 잔기 50-66, 및 연속 아미노산 잔기 101-108, 각각 도 52에 나타냄)의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 제조함으로써 생성될 수 있다. 이들 CDR은 경쇄 폴리펩티드 및 중쇄 폴리펩티드에 각기 제공될 수 있으며, 적합한 프레임워크 잔기가 측면에 있어 SEAM-3의 항원 결합 특이성을 갖는 항원 결합 부위를 형성할 수 있다. 이러한 항체들은 F(ab) 단편, 단쇄 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 등을 포함하는 여러 형태들 중 어느 것을 취할 수 있다.
결합 친화성, 오프 레이트(off rate) 및 다른 항체 결합 운동역학을 측정하는 방법들이 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 이를 사용하여 항체가 deNAc SA 항원에 대하여 높은 친화성과 느린 오프 레이트를 가지는지 결정할 수 있다. 본 분야에 공지된 많은 방법에서 항체 결합 운동역학은 ELISA 방법에 의해 측정되거나, 또는 표면 플라스몬 공명을 측정함으로써 측정될 수 있으며, 표면 플라스몬 공명은, 예를 들어 BIACORE™ 바이오센서(Pharmacia/Pfizer)나 차등 주사 열량법(Bliznukov et al. 2001 Biochemistry (Mosc) 66:27-33)을 이용한다. 표면 플라스몬 공명을 이용하여 항원 항체 결합을 측정하는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있으며(예를 들 어, Methods of Dev. Biol. 2003 112:141-51 및 J. Mol. Recognit. 1999, 12:310-5 참조), 본원에서 사용할 수 있도록 쉽게 개조된다.
어떤 구체예에서, SEAM-3 mAb의 항원-결합 특징을 갖는 재조합 단클론 항체는 SEAM-3 중쇄 가변 도메인의 연속 서열과 실질적으로 동일한(예를 들어, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 98% 동일한) 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 SEAM-3 경쇄 가변 도메인의 연속 서열과 실질적으로 동일한(예를 들어, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 98% 동일한) 경쇄를 가진다. 특정 구체예에서, 재조합 항체는 도 46 및 47에 나타낸 중쇄 또는 경쇄 서열 중 어느 것의 연속 프레임워크 서열 또는 연속 CDR 서열과 실질적으로 동일한(예를 들어, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 98% 동일한) 프레임워크 또는 CDR 아미노산 서열을 가진다. 이러한 폴리펩티드는 SEAM-3의 항원-결합 특이성을 갖는 키메라 항체를 구성하는데 유용하다. 이러한 연속 서열은 경쇄 폴리펩티드(L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3) 및/또는 중쇄 폴리펩티드(H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3)의 CDR들을 포함할 수 있다.
어떤 구체예에서, 재조합 단클론 항체는 SEAM-3 중쇄 또는 경쇄-암호화 핵산과 고 긴축 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해서 암호화된 중쇄 또는 경쇄를 함유한다. 고 긴축 조건은 50℃ 이상에서 0.1x SSC(15mM 식염수/0.15mM 나트륨 시트레이트) 중에서 인큐베이션하는 것을 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 세포에서 SEAM-3 항체 생산의 검출에 유용할 뿐만 아니라, SEAM-3의 항원-결 합 특이성을 갖는 키메라 항체를 구성하는데 있어서도 유용하다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 재조합 단클론 항체는 SEAM-3 중쇄 또는 경쇄-암호화 핵산의 연속 서열과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해서 암호화된 중쇄 또는 경쇄를 함유할 수 있다. 동일성 퍼센트는 더 짧은 서열들의 비교에 기초한다. 디폴트 파라미터를 사용하고 필터는 사용하지 않는 BLASTN (2.0.8) (Altschul et al. (1997) Nucl. Acids. Res. 25:3389-3402)과 같은 잘 공지된 프로그램을 사용하여 서열 비교를 할 수 있다.
재조합 단클론 항체는, 예를 들어 전장 항체, 또는 그것의 어떤 키메라일 수 있다. 키메라 항체 제조 방법은 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Morrison et al. (Science 1985 229:1202); Oi et al. (BioTechniques 1986 4:214); Gillies et al. (J. Immunol. Methods 1989 125:191-202) 및 미국특허 제5,807,715호, 제4,816,567호 및 4,816397호를 참조하며, 이것들은 그 전문이 참고자료로 본원에 포함된다.
SEAM-3의 중쇄 및 경쇄의 CDR의 아미노산 서열이 도 52에 제공되고, SEAM-3 경쇄 및 중쇄에 대한 프레임워크 및 CDR 영역이 각각 도 53 및 54에 한정된다.
또한, 본 명세서는 바람직한 특성(예를 들어, 혈청 반감기, 항암 활성 등의 증가)을 제공할 수 있는 부분과의 콘쥬게이션에 의해 변형된 항체를 제공한다. 이러한 항체 콘쥬게이트가 아래 예시된다.
SEAM -3의 항원 결합 특이성을 갖는 변형 항체
SEAM-3의 항원 결합 영역을 갖는 상기 설명된 재조합 단클론 항체는 deNAc SA 에피토프와 결합하며, 바람직한 활성, 예를 들어 암 세포 생육성의 감소를 촉진하는 능력의 강화, 혈청 반감기 증가, 면역원성 감소 등을 갖는 변형 항체를 제공하기 위해 변형될 수 있다. 변형 항체는 상기 설명된 SEAM-3 단클론 항체의 적어도 하나의 아미노산의 치환, 첨가, 또는 결실에 의해 제조될 수 있다. 한 구체예에서, SEAM-3 항체는 인간 치료용 인간화 항체, 또는 다른 타입의 변형 항체를 제공하기 위해 변형된다. 일반적으로, 이들 변형 항체는 SEAM-3 항체의 일반적인 항원-결합 특징을 가지며, 최소한 SEAM-3 항체 중쇄 폴리펩티드 및 SEAM-3 경쇄 폴리펩티드의 CDR을 함유한다.
만들어질 수 있는 아미노산 치환을 위한 가이드를 첨부된 도면 52, 53 및 54에서 찾을 수 있는데, 이것은 SEAM-3의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드와 암호화 DNA 서열에 있는 CDR 서열 및 위치를 예시한다. 예를 들어, 어떤 구체예에서, 이렇게 확인된 CDR 바깥 영역들에 아미노산 변화(예를 들어, 치환, 특히 보존성 아미노산 치환)를 만듦으로써 변이체가 생성될 수 있다. 더 나아가, 아미노산 치환을 위한 가이드는 다른 항-deNAc SA 에피토프 항체의 아미노산 서열과 SEAM-3의 아미노산 서열을 정렬하고, 보존되거나 또는 가변적인 영역을 표시하고, CDR 바깥에 있는 가변영역들에 변화를 만듦으로써 알 수 있다.
특정 구체예에서, 이들 방법은 하나 이상의 아미노산 치환(예를 들어, 1개, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하 또는 5개 이하, 또는 그 이상, 일반적으로 10 이하, 또는 그 이상)을 만드는 것을 포함한다. 아미노산 치환은 어떤 위치에 있을 수 있 으며, 그 위치에 있는 아미노산이 어떤 동일성을 갖는 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 바람직하게, 변형 항체는 SEAM-3 mAb의 동일한 일반적 특징을 가진다. 한 구체예에서, 본원에서 제공된 서열들과 다른 항체들의 서열들의 정렬에 의해 치환 위치가 확인된 후, 그 위치에 있는 아미노산이 치환될 수 있다. 특정 구체예에서, 아미노산 치환은 인간화 치환(즉, 인간 항체와 더욱 유사한 아미노산 서열을 만드는 치환), 지정 치환(예를 들어, 동일한 군의 관련 항체와 더욱 유사한 항체의 아미노산 서열을 만드는 치환), 무작위 치환(예를 들어, 20개의 자연 발생 아미노산 중 어느 것으로의 치환) 또는 보존성 치환(예를 들어, 치환되는 것과 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로의 치환)일 수 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 변형 항체는 SEAM-3 중쇄 또는 경쇄-암호화 핵산과, 특히 SEAM-3 경쇄 폴리펩티드 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 암호화하는 단편(연속 아미노산 잔기 24-39, 연속 아미노산 잔기 55-61, 및 연속 아미노산 잔기 94-100, 각각 도 52에 나타낸다) 및 SEAM-3 중쇄 폴리펩티드 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 암호화하는 단편(연속 아미노산 잔기 26-35, 연속 아미노산 잔기 50-66, 및 연속 아미노산 잔기 101-108, 각각 도 52에 나타낸다)과 고 긴축 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해서 암호화된 중쇄 또는 경쇄를 함유할 수 있다. 고 긴축 조건은 50℃ 이상에서 0.1x SSC(15mM 식염수/0.15mM 나트륨 시트레이트) 중에서 인큐베이션하는 것을 포함한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 변형 항체는 연속 SEAM-3 중쇄 또는 경쇄-암호화 핵산과 적어도 80% 동일한(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적 어도 98%) 폴리뉴클레오티드에 의해서 암호화된 중쇄 또는 경쇄를 함유할 수 있다. 동일성 퍼센트는 더 짧은 서열들의 비교에 기초한다. 디폴트 파라미터를 사용하고 필터는 사용하지 않는 BLASTN (2.0.8) (Altschul et al. (1997) Nucl. Acids. Res. 25:3389-3402)과 같은 잘 공지된 프로그램을 사용하여 서열 비교를 할 수 있다.
인간화 항체
한 구체예에서, 본 발명은 SEAM-3 단클론 항체의 인간화 버전을 제공한다. 일반적으로, 인간화 항체는 모 비-인간 항체의 프레임워크 영역에 있는 아미노산을 치환함으로써 제조될 수 있으며, 모 비-인간 항체에 비해 인간에게서 덜 면역원성인 변형 항체가 생산된다. 항체는 본 분야에 공지된 여러 기술을 사용하여 인간화될 수 있으며, 예를 들어 CDR-이식(EP 239,400; PCT 공개 WO 91/09967; 미국특허 제5,225,539호; 제5,530,101호; 및 제5,585,089호), 베니어링 또는 리서페이싱(EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28 (4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973(1994)), 및 체인 셔플링(미국특허 제5,565,332호) 등이 있다. 어떤 구체예에서, 프레임워크 치환은 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용 모델링 및 특정 위치에 있는 일반적이지 않은 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다(예를 들어, 미국특허 제5,585,089호; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988) 참조). 본 발명에서 사용하기 위해 고려되는 항체를 인간화하기 위한 추가의 방법들이 미국특허 제5,750,078호; 제5,502,167호; 제5,705,154호; 제5,770,403호; 제5,698,417호; 제 5,693,493호; 제5,558,864호; 제4,935,496호; 및 제4,816,567호, 그리고 PCT 공보WO 98/45331 및 WO 98/45332에 설명된다. 특정 구체예에서, SEAM-3 항체는 공개된 미국특허출원 제20040086979호 및 제20050033031호에 제시된 방법에 따라서 인간화될 수 있다. 따라서, 상기 설명된 SEAM-3 항체는 본 분야에 잘 공지된 방법을 이용하여 인간화될 수 있다.
따라서, 인간화 SEAM-3 항체는 SEAM-3 항체의 미변형 CDR을 함유할 수 있거나, 또는 어떤 구체예에서는 SEAM-3 항체의 변형된 CDR을 함유할 수 있다. SEAM-3 항체의 변형된 CDR을 함유하는 인간화 항체는 SEAM-3 항체의 CDR과 비교하여 일반적으로 1개, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 그리고 어떤 경우 약 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는 CDR을 함유한다. CDR의 특정 치환 위치뿐만 아니라 이들 위치로 치환될 수 있는 도너 아미노산은 본원에 제공된 SEAM-3의 핵산 및/또는 아미노산 서열과 다른 항체의 서열의 정렬에 의해서 결정될 수 있다.
폴리에틸렌글리콜 ( PEG )-변형 항체
본원에서 고찰되는 항-deNAc SA 에피토프 항체는 PEG화된 항-deNAc SA 에피토프 항체를 포함하며, 특히 관심 있는 것은 SEAM-3의 항원 특이성을 갖는 PEG화된 재조합 항-deNAc SA 에피토프 항체이다. 항체의 PEG화를 위한 적합한 방법 및 시약들은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 일반적으로, 항체와의 콘쥬게이션을 위한 적합한 PEG는 일반적으로 실온에서 수용성으로, 일반식 R(O-CH2-CH2)nO-R을 가지며, 이때 R은 수소 또는 알킬 또는 알칸올기와 같은 보호기이고, n은 1 내지 1000의 정수이다. R이 보호기인 경우, 이것은 일반적으로 1 내지 8개의 탄소를 가진다.
많은 구체예에서, PEG는 적어도 하나의 히드록실기, 예를 들어 말단 히드록실기를 가지며, 이 히드록실기는 아미노기, 예를 들어 리신 잔기의 엡실론 아미노기, 폴리펩티드의 N-말단에 있는 자유 아미노기, 또는 아스파라긴, 글루타민, 아르기닌 또는 히스티딘의 아미노기와 같은 어떤 다른 아미노기와 반응성인 작용기를 생성하기 위해 변형된다.
또 다른 구체예에서, PEG는 항체 폴리펩티드에 있는 자유 카르복실기, 예를 들어 항체 폴리펩티드의 카르복실 말단에 있는 자유 카르복실기와 반응성이 되도록 유도체화된다. 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드의 카르복실 말단에 있는 자유 카르복실기와 반응성이 PEG의 적합한 유도체는, 제한은 아니지만, PEG-아민, 및 PEG의 히드라진 유도체(예를 들어, PEG-NH-NH2)를 포함한다.
다른 구체예에서, PEG는 말단 티오카르복실산기, -COSH를 포함하도록 유도체화되며, 이 기는 아미노기와 선택적으로 반응하여 아미드 유도체를 생성한다. 티오산의 반응성 성질 때문에, 다른 것들에 비하여 어떤 아미노기의 선택성이 달성된다. 예를 들어, 적합한 pH 조건에서 -SH는 N-말단 아미노기와의 반응에서 충분한 이탈기 능력을 나타내며, 이로써 리신 잔기의 엡실론 아미노기가 양성자화되고 비-친핵성을 유지하게 된다. 한편, 적합한 pH 조건하에서의 반응은 접근가능한 리신 잔기 중 일부를 선택성을 가지고 반응하도록 만들 수 있다.
다른 구체예에서, PEG는 PEG 사슬의 단부에 N-히드록시 숙신이미데이트와 같은 반응성 에스테르를 포함한다. 이러한 N-히드록시숙신이미데이트-함유 PEG 분자는 중성 6.5-7.5와 같은 특정 pH 조건에서 아미노기와 선택적으로 반응한다. 예를 들어, N-말단 아미노기는 중성 pH 조건하에서 선택적으로 변형될 수 있다. 그러나, 시약의 반응성이 극대화되었다면, 리신의 접근가능한 NH2 기도 반응할 수 있다.
PEG는 항체의 아미노산 잔기에 직접, 또는 링커를 통해 콘쥬게이트될 수 있다. 어떤 구체예에서, 링커가 항체 폴리펩티드에 첨가되어 링커-변형 항체 폴리펩티드가 형성된다. 이러한 링커는 다양한 작용기를 제공하는데, 예를 들어 PEG 시약과 링커-변형 항체 폴리펩티드를 결합시키기 위한 술프히드릴, 아미노, 또는 카르복실기와 같은 반응성 기들을 제공한다.
어떤 구체예에서, 항체 폴리펩티드에 콘쥬게이트된 PEG는 선형이다. 또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드에 콘쥬게이트된 PEG는 분지형이다. 미국특허 제5,643,575호에 설명된 것들과 같은 분지형 PEG 유도체, Shearwater Polymers Inc.의 카탈톡 "Polyethylene Glycol Derivatives 1997-1998"에 설명된 "스타-PEG" 및 멀티-암 PEG가 있다. 스타 PEG는, 예를 들어 미국특허 제6,046,305호를 비롯하여 본 분야에서 설명되었다.
분자량이 약 2 kDa 내지 약 100 kDa 범위인 PEG가 일반적으로 사용되며, PEG와 관련하여 용어 "약"은 폴리에틸렌글리콜의 제조시, 어떤 분자들은 언급된 분자량 이상의, 일부는 이하의 중량을 가질 것이라는 의미이다. 예를 들어, 항체와의 콘쥬게이션에 적합한 PEG는 약 2 kDa 내지 약 5 kDa, 약 5 kDa 내지 약 10 kDa, 약 10 kDa 내지 약 15 IcDa, 약 15 kDa 내지 약 20 kDa, 약 20 kDa 내지 약 25 kDa, 약 25 kDa 내지 약 30 kDa, 약 30 kDa 내지 약 40 kDa, 약 40 kDa 내지 약 50 kDa, 약 50 kDa 내지 약 60 kDa, 약 60 kDa 내지 약 70 kDa, 약 70 kDa 내지 약 80 kDa, 약 80 kDa 내지 약 90 kDa, 또는 약 90 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 가진다.
PEG -항체 콘쥬게이트 제조
상기 논의된 대로, PEG 부분은 항체 폴리펩티드의 N-말단에 있는 또는 근처에 있는, 내부에 있는, 또는 C-말단에 있는 또는 근처에 있는 아미노산 잔기에 직접 또는 링커를 통해 부착될 수 있다. 콘쥬게이션은 용액 중에서 또는 고체상 수행될 수 있다.
N-말단 결합
PEG 부분을 항체 폴리펩티드의 N-말단에 또는 근처에 있는 아미노산 잔기에 부착시키는 방법은 본 분야에 공지되어 있다. 어떤 구체예에서, N-말단이 화학적으로 변형된 항체를 선택적으로 획득하기 위한 공지된 방법이 사용된다. 예를 들어, 특정 단백질에서의 유도체화를 위해 이용할 수 있는 상이한 타입의 1차 아미노기(리신 대 N-말단)의 차등 반응성을 이용하는 환원성 알킬화에 의한 단백질 변형 방법이 사용될 수 있다. 적합한 반응 조건하에서, N-말단에서 카르보닐기 함유 중합체를 사용하여 단백질을 실질적으로 선택적 유도체화하는 것이 달성된다. 이 반응은 단백질의 리신 잔기의 엡실론 아미노기와 N-말단 잔기의 알파 아미노기의 pKa의 차이를 이용하도록 허용하는 pH에서 수행된다. 항체에 PEG 부분을 이러한 선택 적 유도체화에 의해 부착하는 것은 제어된다: 중합체를 사용한 콘쥬게이션은 항체의 N-말단에서 지배적으로 일어나며, 리신 측쇄 아미노기와 같은 다른 반응성 기들의 변형은 유의하게 일어나지 않는다.
C-말단 결합
폴리펩티드의 C-말단에 대해 선택적인 PEG 시약을 이용하여 모노PEG화가 달성될 수 있으며, 이 시약은 스페이서를 사용하거나 사용하지 않고 제조될 수 있다. 예를 들어, 한 단부에서는 메틸에테르로서 변형되고 다른 단부에는 아미노 기능을 갖는 폴리에틸렌글리콜이 출발 물질로서 사용될 수 있다.
축합제인 수용성 카르보디이미드의 제조 또는 획득이 수행될 수 있다. 축합체인 수용성 카르보디이미드와의 커플링 항체는 일반적으로 아미드 결합이 이루어지기에 최적의 pH에서 적합한 완충 시스템을 가진 수성 매체 중에서 수행된다. 분자량을 증가시키기 위해 고분자량 PEG가 단백질에 공유적으로 첨가될 수 있다.
시약 선택은 과정 최적화 연구에 따른 것이다. 적합한 시약의 비제한적 예는 EDC 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드이다. EDC이 수용성이기 때문에 사전에 유기용매에 용해할 필요 없이 반응에 직접 첨가할 수 있다.
PEG 아민의 사용이 명칭 또는 구조에 의해 상기 언급되었지만, 이러한 유도체들은 단지 예시일뿐이며, 항체 단백질의 카르복실기와 축합되는 PEG-NH-NH2에서와 같이 히드라진 유도체와 같은 다른 기들도 사용될 수 있다. 수성상에 더하여, 반응은 고체상에서 수행될 수도 있다. 폴리에틸렌글리콜은 300-40000 범위의 분자량을 갖는 화합물 리스트로부터 선택될 수 있다. 또한, 다양한 폴리에틸렌글리콜 의 선택은 시험관내 및 생체내에서 정제된 유도체의 커플링 효능 및 생물학적 성능에 의해, 즉 순환 시간, 항바이러스 활성 등에 의해 규정될 것이다.
추가하여, 항체 중쇄 및/또는 경쇄 단백질의 C-말단 단부에 적합한 스페이서가 첨가될 수 있다. 스페이서는 SH, NH2 또는 COOH와 같은 반응성 기들을 가질 수 있으며, 적합한 PEG 시약과 커플링되어 고분자량 항체 유도체를 제공한다. 조합된 고체상/용액상 방법이 C-말단 PEG화 항체 폴리펩티드의 제조를 위해 고안될 수 있다.
바람직한 경우, PEG화 항체가 어떤 공지된 방법을 사용하여 PEG화되지 않은 항체로부터 분리되며, 이 방법은, 제한은 아니지만, 이온교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 이것들의 조합을 포함한다.
항체-융합 단백질
또한, 본 발명은 SEAM-3 mAb의 항원 특이성을 갖는 재조합 항체를 고찰하며, 이때 항체는 이종성 단백질을 포함하도록 변형된다. 예를 들어, SEAM-3 중쇄 폴리펩티드 또는 SEAM-3 경쇄 폴리펩티드가 리포터 단백질 또는 바람직한 항암 효과를 갖는 단백질에 연결될 수 있다. 예를 들어, SEAM-3은 2차 항체(또는 적어도 그것의 항원-결합 부분), 예를 들어 중요한 혈관형성 매개자인 혈관내피성장인자(VEGF)에 대항하는 항체와 같은 혈관형성 또는 증식 인자와 특이적으로 결합하는 항체에 콘쥬게이트될 수 있으며, 이 경우 SEAM-3는 특정 암 세포와의 콘쥬게이트를 목표로 하며, 항-VEGF 항체는 VEGF를 불활성화시킴으로써 혈관형성을 억제한다.
한 구체예에서, 본 발명은 이종성 폴리펩티드에 연결된, 즉 자생 SEAM-3 항체에 정상적으로는 회합되지 않는 폴리펩티드에 연결된 SEAM-3 경쇄 폴리펩티드의 CDR 또는 중쇄 SEAM-3 폴리펩티드의 CDR을 제공한다. 핵산 서열이 제공되었을 때 관심의 융합 단백질을 생산하는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있다.
재조합 항체 생산 방법
많은 구체예에서, SEAM-3 단클론 항체, 또는 적어도 SEAM-3 중쇄 폴리펩티드의 CDR 또는 적어도 SEAM-3 경쇄 폴리펩티드의 CDR을 암호화하는 핵산이 숙주세포에 직접 도입되고, 이 세포가 암호화된 항체의 발현을 유도하기에 충분한 조건하에서 인큐베이션된다. 따라서, 본 발명은 적어도 SEAM-3 중쇄 폴리펩티드의 CDR 또는 적어도 SEAM-3 경쇄 폴리펩티드의 CDR을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 숙주세포를 또한 고찰한다.
어떤 적합한 숙주세포, 벡터 및 프로모터가 본 발명의 SEAM-3-암호화 핵산과 함께 사용될 수 있다. 특히 관심 있는 것은 적어도 SEAM-3 중쇄 폴리펩티드의 CDR 및/또는 적어도 SEAM-3 경쇄 폴리펩티드의 CDR을 암호화하는 삽입체를 갖는 벡터이다. 또, 관심 있는 것은 적어도 SEAM-3 중쇄 폴리펩티드의 CDR 또는 적어도 SEAM-3 경쇄 폴리펩티드의 CDR을 암호화하는 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드로서, 여기서 SEAM-3-암호화 서열은 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 전형적인 숙주세포, 벡터, 및 프로모터가 이제 더 상세히 설명될 것이다.
발현 카세트의 발현에 적합한 어떤 세포가 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 효모, 곤충 식물 등의 세포이다. 많은 구체예에서, 포유류 숙주 셀라 인은 항체를 자연적으로 생산하지 않으며, 예를 들어 포유류 세포는 하이브리도마 세포, B 세포 또는 비장 세포가 아니다. 또한, 재조합 항체의 변경된 당화를 제공하는 세포, 또는 당화를 결여한 세포를 사용하는 것이 대상이 될 수 있다. 전형적인 세포는, 제한은 아니지만, 원숭이 신장 세포(COS 세포), SV40에 의해 형질전화된 원숭이 신장 CVI 세포(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포(HEK-293, Graham et al. J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포(CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4216, (1980); 마우스 서톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CVI ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간세포(hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI 세포(Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci 383:44-68 (1982)); NIH/3T3 세포(ATCC CRL-1658); 및 마우스 L 세포(ATCC CCL-I)를 포함한다. 추가의 셀라인들도 당업자에게 분명할 것이다. 광범한 셀라인을 American Type Culture Collection(10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209)로부터 이용할 수 있다.
포유류 숙주세포에서, 다수의 바이러스-기반 발현 시스템이 해당 항체를 발현하기 위하여 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로 사용되는 경우, 관심의 항체 코딩 서열이 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들어 후기 프 로모터와 3부분 리더 서열에 리게이션될 수 있다. 다음에, 이 키메라 유전자가 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 영역(예를 들어, 영역 E1 또는 E3)에의 삽입은 감염된 숙주에서 생존가능하며 항체 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 만들 것이다(예를 들어, see Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359 (1984) 참조). 발현 효율은 적합한 전사 인핸서 요소, 전사 터미네이터 등을 포함시킴으로써 증가될 수 있다(예를 들어, Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544(1987) 참조).
재조합 항체의 장기적인 고-수율 생산을 위해서 안정한 발현이 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 분자를 안정하게 발현하는 셀라인이 유전조작될 수 있다. 바이러스 복제 기원을 함유하는 발현 벡터를 사용하는 것보다는, 숙주세포는 면역글로불린 발현 카세트 및 선택성 마커로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 조작된 세포를 농후 배지에서 1-2일 성장시키고 선택적 배지로 바꾼다. 재조합 플라스미드 내의 선택성 마커가 선택에 대한 저항성을 부여하고, 세포가 염색체에 플라스미드를 안정하게 통합하여 초점이 형성될 때까지 성장하도록 허용하며, 차례로 셀라인으로 클로닝되고 확장된다. 이러한 조작된 셀라인은 항체 분자와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물을 스크리닝하고 평가하는데 특히 유용할 수 있다.
세포에 핵산을 도입하는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 적합한 방법은 전기천공, 입자 총 기술, 인산칼슘 침전, 직접 미세주사 등을 포함한다. 방법의 선택은 일반적으로 형질전환될 세포 타입 및 형질전환이 일어나는 환경(즉, 시 험관내, 생체외, 또는 생체내)에 의존한다. 이들 방법은 Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995에서 일반적으로 논의된다. 어떤 구체예에서는 리포펙타민 및 칼슘 매개 유전자 전달 기술이 사용된다.
해당 핵산이 세포에 도입된 후, 세포는 전형적으로 일반적으로 37℃에서, 때로는 선택하에서, 약 1-24시간 동안 인큐베이션되며, 이로써 항체가 발현된다. 특히 관심 있는 구체예에서, 항체는 전형적으로 세포가 배양되는 배지의 상청액에 분비된다.
일단 본 발명의 재조합 항체 분자가 생산된 다음, 그것은 면역글로불린 분자의 정제를 위한 본 분야에 공지된 어떤 방법에 의해서, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온교환, 친화성, 특히 단백질 A 후 특정 항원에 대한 친화성, 및 크기별 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해성, 또는 단백질 정제를 위한 어떤 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 많은 구체예에서, 항체는 세포로부터 배양 배지로 분비되고, 배양 배지로부터 채집된다.
키트
또한, 상기 설명된 대로, 본원에 개시된 방법을 실시하기 위한 키트가 본 발명에 의해 제공된다. 키트는 키트의 의도된 사용에 따라서, 본원에 설명된 조성물을 하나 이상 포함할 수 있다: 예를 들어, deNAc SA 항원, de-N-아세틸화 PS 생산의 생합성 방법에 사용하기 적합한 세포(상기 방법에 설명된 선택적으로, 아실 만노스아민 및 트리할로아실 만노스아민 시약과 함께), 항-deNAc SA 에피토프 항체, 이것을 암호화하는 핵산(특히 SEAM-3 mAb의 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR을 암호화하는 핵산), 또는 이것을 함유하는 재조합 세포. 키트의 다른 선택적 성분들은 항-deNAc SA 에피토프 항체 또는 deNAc SA 항원을 투여하기 위한 및/또는 진단 분석을 수행하기 위한 버퍼 등을 포함한다. 또한, 키트의 재조합 핵산은 비-SEAM-3 암호화 핵산의 불변영역과의 리게이션을 촉진하기 위한 제한 부위, 다중 클로닝 부위, 프라이머 부위 등을 가질 수 있다. 키트의 여러 성분들은 개별 용기에 존재할 수 있거나, 또는 어떤 양립가능한 성분들은 원한다면 단일 용기에 미리 조합되어 있을 수 있다.
상기 언급된 성분들에 더하여, 당해 키트는 전형적으로 키트의 성분들을 사용하여 개시된 방법을 실행하기 위한 설명서를 더 포함한다. 당해 방법을 실행하기 위한 설명서는 일반적으로 적합한 기록매체에 기록된다. 예를 들어, 설명서는 종이나 플라스틱 등과 같은 기판에 인쇄될 수 있다. 이와 같이, 설명서는 키트의 용기 또는 키트 구성요소(즉, 포장 또는 하위포장과 관련된)의 라벨 등으로서 패키지 삽입물로서 키트에 존재할 수 있다. 다른 구체예에서, 설명서는 적합한 컴퓨터 판독 저장매체, 예를 들어 CD-ROM, 디스켓 등에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로서 존재한다. 다른 구체예에서, 실제 설명서는 키트에 존재하지 않지만, 예를 들어, 인터넷에 의해서 원거리 출처로부터 설명서를 획득하기 위한 수단이 제공된다. 이 구체예의 예는 설명서를 볼 수 있는 및/또는 설명서를 다운로드할 수 있는 웹주소를 포함하는 키트이다. 설명서와 마찬가지로, 설명서를 획득하기 위한 이런 수단도 적합한 기판에 기록된다.
또한, 상기 논의된 바와 같은 프로그래밍을 포함하는 적어도 컴퓨터 판독 매체 및 설명서를 포함하는 키트가 본 발명에 의해서 제공된다. 설명서는 설치 또는 셋업 지시사항을 포함할 수 있다. 설명서는 상기 설명된 옵션 또는 옵션의 조합과 함께 본 발명의 사용을 위한 지시사항을 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, 설명서는 두 종류의 정보를 포함한다.
설명서는 일반적으로 적합한 기록매체에 기록된다. 예를 들어, 설명서는 종이나 플라스틱 등과 같은 기판에 인쇄될 수 있다. 이와 같이, 설명서는 키트의 용기 또는 키트 구성요소(즉, 포장 또는 하위포장과 관련된)의 라벨 등으로서 패키지 삽입물로서 키트에 존재할 수 있다. 다른 구체예에서, 설명서는 프로그램이 존재하는 것과 동일한 매체를 포함하여, 적합한 컴퓨터 판독 저장매체, 예를 들어 CD-ROM, 디스켓 등에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로서 존재한다.
본원에서 설명된 실시예 및 구체예는 예시하기 위한 목적일 뿐이며, 이에 비추어 당업자에게 다양한 변형 또는 변화가 제안될 수 있음과, 이러한 변화가 본 출원의 사상 및 한계와 첨부된 청구항의 범위내에 포함된다는 것이 이해된다. 본원에서 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 모든 목적을 위하여 그 전문이 참고자료로서 본원에 포함된다.
실시예 1
N-아실 NmB PS 및 deNAc SA 에피토프를 갖는 유도체의 제조
아래 주지한 것과 같은 차이가 있지만, 기본적으로는 Guo 및 Jennings의 방 법에 따라 N-아실 Neisseria meningitidis B 군(NmB) 다당(PS)(아실 = 아세틸[Ac] 또는 프로피오닐[Pr])을 제조했으며(Guo, Z. and Jennings, H. in 2001. N-Propin-ylation. In Meningococcal Vaccines: Methods and Protocols. A. J. Pollard, and C. J. M. Maiden, eds. Humana Press Inc., Totowa, N. J., p. 55.), 다음과 같이 deNAc SA 에피토프를 갖는 PS 유도체를 생산하였다. 콜로민산 또는 NmB PS(100mg; EY Laboratories, Inc., San Mateo, CA)와 붕수소화 나트륨(Sigma-Aldrich) 10mg을 2M NaOH 10mL에 용해하고 밀봉된 관(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)에 넣어 2시간 동안 90℃까지 가열했다.
de-N-아세틸화 반응 조건은 Guo 및 Jennings에 의해 설명된 것과 차이가 있다. 완전히 de-N-아세틸화된 PS 유도체를 생산하는 대신, 아래 설명된 레조르시놀 분석에 의해 측정된바, 산물은 전형적으로 20% N-아세틸 잔기를 함유했다. 또한, 용액을 100℃ 이상까지 가열하고 가수분해 시간을 2시간 이상으로 하는 것은 다당의 변성 및 확정적이지 않은 바람직하지 않은 부산물의 생산을 가져온다. 도 1에 전형적인 de-N-아세틸화 PS의 구조를 나타낸다.
본원에 설명된 접근법에 의해서 최소 약 20%의 잔기가 de-N-아세틸화되었기 때문에, 본원의 접근법은 N-아세틸과 N-아실 잔기(예를 들어, N-프로피오닐, N-부타노일 등)의 혼합물을 함유하는 PS 유도체를 제조하는 것뿐만 아니라 N-아세틸화 잔기와 de-N-아세틸화 잔기의 혼합물을 함유하는 PS 유도체를 제조하는데 있어서 이점을 가진다. 또한, 붕수소화 나트륨의 첨가는 PS의 환원 단부에서 케톤을 알코올로 환원시키고, 또한 de-N-아세틸화 아미노기와 환원 단부 잔기의 C2 케톤 사이 에 형성될 수 있는 이민을 2차 아민으로 환원시킨다. 환원 단부 잔기에 N-아세틸기, de-N-아세틸 부위, 및 환상 2차 아민을 갖는 잔기를 함유하는 NmB PS 유도체는 비-자기반응성, 항-N-Pr NmB PS mAb SEAM-3에 의해 결합되었으며(아래 실시예 3 참조), 따라서 암 세포에서 발현되는 de-N-아세틸 시알산 항원(특히 알파(2→8) N-아세틸 뉴라민산의 중합체로)과 반응성인 항체를 도출하는 중요한 항원이다.
용액을 주위 온도까지 냉각한 후, 2M HCl 또는 빙초산으로 용액의 pH를 8.0으로 조정하고 물로 투석하여 동결건조시켰다. 이것을 더 이상 정제하지 않고 아래 설명된 대로 재-아실화하였다.
PS(약 100mg)를 물 3-5mL에 재현탁하고, 0.1M NaOH를 가하여 pH를 8-9로 조정하고, 수 시간에 걸쳐 교반하면서 아실 무수물(예를 들어, 아세트산 무수물 또는 프로피온산 무수물) 0.5mL를 5 알리쿼트로 가하여 자유 아미노기를 아실화하였다(아세트산 무수물은 Guo 및 Jennings에 의해 제조되었던 유도체에는 포함되지 않았다). 또는 달리, 산 0.5mL와 1 당량의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 염산염(EDC, Pierce Chemical Company, Rockford, IL)을 조합하여 카르복실산을 활성화하였다. 소량의 물(약 1mL)을 가하여 EDC를 완전히 용해하였다. 무수물과 마찬가지로, 카르보디이미드-활성화 카르복실산을 수 시간에 걸쳐 교반하면서 동등한 5 알리쿼트로 첨가하였다. 아래 설명된 대로, 캐리어 단백질, 예를 들어 N-아크릴, N-메타크릴, N-브로모아세틸(BrAc) 또는 N-클로로아세틸(ClAc)과의 콘쥬게이트에 사용하기 위한 유도체를 제조하는 것과 같은 어떤 용도에서는, 레조르시놀 분석(아래 설명됨)에 의해 측정된바, 카르복실산의 양이 다당 내의 자유 아민의 비 율까지 감소하였다(예를 들어, 10% 내지 90%). EDC-활성화 아실화 시약 사용의 이점은 이들이 무수물이나 염화아실만큼 물에서 빠르게 가수분해하지 않으며 아민과 더 선택적으로 반응한다는 점이다. 이로써 아실화되는 아미노기의 비율이 보다 잘 제어된다. 가수분해가 서서히 일어나기 때문에, N-아크릴, BrAc 및 ClAc 기의 광범한 가수분해를 가져올 수 있는 pH의 큰 변동을 피할 수 있다. 용액의 pH는 필요에 따라 2M NaOH를 가하여 약 8-9에서 유지하였다. 이 용액을 투석하고 동결건조시켰다.
이 과정에서 대부분의 아미노기가 아실화되고(80%-90%), 일부 아미노기만이 유도체화되지 않고 자유 아미노기로 남는다. 중합체의 비-환원 단부를 포함하여, de-N-아세틸 부위를 갖는 잔기를 함유하는 PS는 SEAM-3에 의해 결합되었으며(아래 실시예 3 참조), 따라서 보호성, 비-자기반응성 항-NmB 캡슐형 항체를 도출하기 위한 중요한 결정소이다.
산성 pH에서 수중 가수분해하여 더 작은 PS 단편들(평균 중합도[Dp] < 20)을 제조하였다. N-아실 NmB PS의 일부(20mg)를 20mM NaOAc(pH 5.5) 5mL에 용해하고 밀봉된 관에 넣어 원하는 단편의 크기에 따라 1-24시간 동안, 전형적으로는 5시간 동안 50℃까지 가열하였다. 용액을 투석하고 동결건조시켰다.
출발 PS보다 평균적으로 더 작은 Dp를 갖는 PS를 제조하는 것에 더하여, 산 처리에 의하여 선행 잔기의 C1 카르복실기와 C9 OH 기 사이에 락톤을 형성한다(도 2). 암 세포에서 발현된 시알산 항원에서는 소량의 락톤을 함유하는 PS가 발생할 수 있다. NmB PS 유도체 제제 중에 소량의 락톤의 존재는 암 세포 표면에서 발현 된 deNAc SA 항원과 반응성인 항체의 도출을 촉진할 수 있다.
캐리어 단백질과의 공유 부착에 사용하기 위해서 PS의 비-환원 단부 및 환원 단부에 알데히드기를 도입하였다. PS(20mg)를 0.1M NaOAc 버퍼(pH 6.5) 1mL에 용해하였다. 메타과요오드산 나트륨(5mg, Sigma-Aldrich)을 가하고, 이 용액을 암소에 30분간 두었다. 10%(wt/vol) 에틸렌글리콜 수용액 0.1mL를 가하여 나머지 NaIO4를 변성시키고 30분간 방치했다. 이 과정에 의해 비-환원 단부 말단 잔기의 C8 및/또는 C7에 알데히드기가 생기고, de-N-아세틸화(상기 참조) 동안 C2 케톤이 알코올로 환원된 환원 단부 말단 잔기를 함유하는 PS에 대해서는 C7에 알데히드기가 생긴다(도 3).
또한, C5 아미노기가 C4 히드록실기 근처에 있으므로 과요오드산염을 사용하여 적은 비율의 de-N-아세틸 잔기를 알데히드로 환원시켰다. SEAM-3에 의해 인식되는 에피토프인 de-N-아세틸 SA 잔기의 파괴를 최소화하기 위하여, 과요오드산염에 의해, N-아크릴, N-BrAc, 또는 N-ClAc 기를 de-N-아실화 및 불완전한 재-아실화의 결과로서 de-N-아세틸 잔기를 함유하게 된 N-Pr 및 N-Ac NmB PS에 교대로 도입하였다. 카르복실산기를 상기 설명된 대로 EDC로 활성화하였다. 반응물에 첨가하는 활성화 카르복실산의 양을 제한하여 PS에 존재하는 자유 아민의 비율만을 아실화하였다(10%-90%). 아크릴, BrAc, 및 ClAc 기는 온건한 조건하에서 캐리어 단백질에 존재하는 티올 및 아미노기와 반응성이며, 따라서 PS 유도체는 과요오드산염으로 PS를 처리함에 의해 야기되는 산화성 손상 없이 캐리어 단백질에 콘쥬게이트될 수 있다.
도데실아민 및 단백질- PS 유도체 콘쥬게이트의 제조
비-환원 단부 또는 환원 단부 알데히드 또는 케톤을 함유하는 NmB PS 유도체 20mg과 도데실아민 10mg을 물 5mL 중에서 조합하여 도데실아민 유도체를 제조하였다. 혼합물을 30분간 교반하면서 약 50℃까지 가열한 후, 시아노붕수소화 나트륨 5mg을 가하였다. 혼합물을 주위 온도에서 24시간 교반한 후, 3-5일간 물에서 투석하여 과잉의 도데실아민을 제거하였다.
SEAM mAb에 대한 도데실아민 유도체의 반응성을 직접 결합 ELISA에 의해 측정했으며, 이때 항원(즉, 도데실아민 PS 유도체)을 4℃에서 마이크로타이터 플레이트 웰 안의 PBS 버퍼 중에서 항원 용액을 하룻밤 인큐베이션함으로써 마이크로타이트 플레이트의 표면에 흡수시켰다. 플레이트를 PBS 버퍼(5x)로 세척하고 1% 소 혈청 알부민(Sigma; 차단 버퍼) 1%를 함유하는 PBS 버퍼로 주위 온도에서 1시간 동안 차단시켰다. 항체를 차단 버퍼로 희석하고 플레이트에 가했다(웰 당 100㎕). 플레이트를 주위 온도에서 4시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBS 버퍼(5x)로 세척하고, 차단 버퍼로 희석한 토끼 항-마우스-알칼리성 포스파타제 콘쥬게이트 항체 (Zymed)를 가했다. 1시간 더 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBS 버퍼(5x)로 세척하고, 1mM MgCl2를 함유하는 50mM 나트륨 카보네이트 버퍼(pH 9)에 용해한 p-니트로페닐 포스페이트 기질을 가하여 결합된 항체를 검출하였다. 주위 온도에서 30분 인큐베이션한 후, BioRad Model 550 마이크로타이터 플레이터 리더를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 결합 실험 결과를 도 34에 나타낸다.
소 혈청 알부민(BSA, Pierce Chemical Co.) 파상풍 톡소이드 5mg과 PS 유도체 또는 말단 단부 알데히드기 또는 N-아크릴, BrAc, 또는 ClAc 기를 함유하는 PS 유도체 10mg을 PBS 버퍼 중에서 조합하여 캐리어 단백질에 콘쥬게이트된 PS 유도체를 제조하였다. 시아노붕수소화 나트륨(알데히드를 함유하는 PS) 5mg을 첨가하거나, 아무것도 첨가하지 않고(N-아크릴, N-BrAc, N-ClAc), 혼합물을 암소에서 주위 온도에서 5일간 교반했다. 용액을 PBS 버퍼 중에서 투석하였다(10-14 kDa 컷오프 멤브레인). mAb와의 PS 유도체-BSA 콘쥬게이트의 반응성을 앞 단락에서 설명한 대로 직접 결합 ELISA에 의해 측정하였다. 결합 실험 결과를 도 35에 나타낸다.
NmB PS 유도체 스톡 용액 중 시알산 및 de-N-아세틸 시알산의 농도를 다음과 같이 변형된 Svennerholm 레조르시놀 반응(S vennerholm, L. (1957) Biochim. Bio-phys. Acta 24:604)에 의해 측정하였다. 물 9.75mL, 0.1M CuSO4·5H2O 0.25mL, mL 당 20mg의 레조르시놀 수용액 10mL, 및 진한 HCl 80mL를 조합하여 레조르시놀 작업 시약을 제조하였다. 레조르시놀 작업 시약(300㎕)를 시알산 또는 de-N-아세틸 시알산 샘플 용액(시알산 50㎍ 이하) 또는 표준 스톡 수용액(300㎕)을 폴리프로필렌 딥 웰(2mL) 마이크로타이터 플레이트에서 조합하였다. 플레이트를 플레이트 커버로 밀봉하고 끓고 있는 수조에서 30분간 가열했다. 주위 온도까지 냉각한 후, 이소아밀 알코올(600㎕)을 가하고 피펫을 이용하여 혼합했다. 상을 분리하고 이소아밀 알코올 층인 상층을 깨끗한 마이크로타이터 플레이트로 옮겼다. 이소아밀 알코올 추출물 250㎕와 하층의 수성 용액을 따로따로 폴리스티렌 마이크로타이터 플레 이트로 옮기고, 495nm 및 580nm에서 흡광도를 측정하였다.
각각 표준 곡선과 비교하여, 580nm에서 이소아밀 알코올 부분의 흡광도로부터 N-아세틸 시알산의 양을 측정하고, 495nm에서 수성 부분의 흡광도로부터 de-N-아세틸 시알산의 양을 측정하였다. 시알산 표준물질에서 발생한 de-N-아세틸화의 양을 측정하여 이 분석의 산 가수분해 단계 동안 발생한 de-N-아세틸화의 양에 대해 de-N-아세틸 시알산의 양을 보정하였다.
장쇄 알킬기를 함유하는 NmB PS 유도체의 역상 HPLC 정제
Poros R1/H 칼럼과 BioCAD 관류 크로마토그래피 워크스테이션을 사용하는 역상 HPLC에 의해 장쇄(즉, ≥ C8) 알킬기(예를 들어, 도데실아민 유도체)를 함유하는 NmB PS 유도체를 분리하였다. 30분에 걸쳐 5mL/분의 유속으로 20mM 암모늄 아세테이트 버퍼(pH 6.5) 중의 0% 내지 80% 아세토니트릴의 구배로 유도체를 용출하였다. 분획들(각각 1mL)을 수집하였다.
96-웰 마이크로 플레이트(Immulon II, Dynatech)의 웰에 각 분획을 100㎕씩 가하고 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하여 mAb(예를 들어, SEAM-3, SEAM-12, Granoff et al., 1998, 상동)와 반응성인 유도체를 함유하는 분획들을 결정하였다. 플레이트를 PBS 버퍼(5x)로 세척하고, 주위 온도에서 1시간 동안 1%(중량/중량) 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS 버퍼(Sigma; 차단 버퍼)로 차단했다. 항체를 차단 버퍼로 희석하여 플레이트에 가했다(웰 당 100㎕). 플레이트를 주위 온도에서 4시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBS 버퍼(5x)로 세척하고, 차단 버퍼로 희석한 토끼 항-마우스-알칼리성 포스파타제 콘쥬게이트 항체(Zymed)를 가하였다. 1시간 더 인큐 베이션한 후, 플레이트를 PBS 버퍼(5x)로 세척하고, 1mM MgCl2를 함유하는 50mM 나트륨 카보네이트 버퍼(pH 9)에 용해한 p-니트로페닐 포스페이트 기질을 가하여 결합된 항체를 검출하였다. 주위 온도에서 30분 인큐베이션한 후, BioRad Model 550 마이크로타이터 플레이트 리더를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다.
NmB PS 의 비-환원 단부 도데실아민 유도체의 MALDI - TOF 질량분광 분석
역상 HPLC로부터 획득한 분획들의 용매를 SpinVac(ThermoSavant)를 사용하여 증발시켰다. 잔류물을 아세토니트릴/물(1:1)에 용해하였다. 아세토니트릴/물 중의 mL 당 3mg 농도의 트리히드록시아세토페논(THAP)의 매트릭스를 표적 위에 스폿팅했다(스폿 당 0.5㎕). 진공하에서 매트릭스 스폿을 건조시킨 후, 매트릭스 스폿 맨 위에 샘플을 스폿팅했다(0.5㎕). 두 포지티브 및 네거티브 선형 방식(30 샷 N2 레이저, 50% 레이저 파워)과 반사면 포지티브 및 네거티브 방식(30 샷 N2 레이저, 50% 레이저 파워)으로 MALDI-TOF(Autoflex, Bruker Daltonics)를 수행하였다. 외부 펩티드(Bruker Daltonics)와 시알산(EY Laboratories) 표준물질을 사용하여 질량 스펙트럼을 검정하였다. 관찰된 질량들의 오차는 ≤ 0.1%인 것으로 추정되었다. 도 16-18에 보호성, 비-자기반응성 항-NmB 캡슐형 mAb SEAM-3에 반응성인 상기 설명된 역상 HPLC에 의해 정제된 NmB PS 제제로부터 MALDI-TOF에 의해 확인된 구조를 나타낸다. 이 유도체들은 de-N-아세틸, N-아세틸, 및 적어도 하나의 de-N-아세틸 잔기를 갖는 N-프로피오닐 잔기의 혼합물을 함유한다.
실시예 2
MALDI - TOF 질량분광 분석에 의한 SEAM -3에 의해서 인식되는 NmB PS 유도체의 구조 결정
SEAM-3를 다음과 같이 자기 비드에 연결하였다. MagnaBind™ 염소 항-마우스 IgG 비드(200㎕; Pierce)를 PBS 버퍼 중에서 SEAM-3 5㎍와 조합하였다. 혼합물을 로테이션 휠 위에서 1시간 동안 주위 온도에서 인큐베이션하였다. 비드를 세척 버퍼로 3회 세척했다. PBS 버퍼 중에 2mM 농도로 BS3™(Pierce)을 첨가하고 주위 온도에서 30분간 휘저어 혼합하여 결합된 항체를 비드와 가교결합시켰다. 10분 동안 트리스를 0.1M(pH 8.0)까지 첨가하여 반응되지 않은 BS3™를 변성시켰다. 비드를 PBS 버퍼로 3회 세척했다. 실시예 1에서 제조된 N-Pr NmB PS(240㎍)을 PBS 버퍼 중에서 세척된 비드에 첨가했다. 혼합물을 로테이션 휠에서 1시간 동안 주위 온도에서 인큐베이션한 후, 미결합 물질을 제거하고, 비드를 세척 버퍼로 2회, 그리고 PBS 버퍼로 1회 세척한 다음, PBS 버퍼 200㎕에 재현탁하였다. 각 시험관에 뉴라미니다제(0.00175 U, EC3.2.1.18; Sigma)를 첨가하고, 혼합물을 로테이션 휠에서 37℃에서 하룻밤 인큐베이션했다. 결합된 PS는 Dp에 관해 비균질하며, 따라서 비드-항체-PS 복합체를 뉴라미니다제로 처리하여 중합체의 비-환원 단부에서 잔기를 제거함으로써 중합체의 크기를 항체에 의한 추가의 소화로부터 보호될 수 있는 길이까지 감소시켰다. 뉴라미니다제로 처리한 후, 비드를 50mM 암모늄 카보네이트 버퍼(pH 8.5)로 3회 세척하고, 결합된 PS를 0.1M 트리에틸아민 수용액으로 최종적으로 용출하였다.
매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간(MALDI-TOF)에 의한 분석을 위 하여, 용출된 PS와 트리에틸아민/물의 용액을 Spin-Vac(Savant)에서 증발시켰다. 건조된 샘플을 50%(vol/vol) 아세토니트릴/물 4㎕에 재현탁하였다. 50% 아세토니트릴/물(0.5㎕) 중의 2',4',6'-트리히드록시아세토페논(THAP, Fluka Chemical) 포화 용액 매트릭스를 스테인리스 스틸 표적 플레이트 위에 스폿팅했다. PS 샘플(2번, 0.5㎕)을 건조된 THAP 스폿의 맨 위에 스폿팅했다. 네거티브 이온 반사면 방식으로 작동하는 Bruker Autoflex MALDI-TOF 질량분광기를 사용하여 샘플을 분석했다.
도 4는 뉴라미니다제 처리 후 SEAM-3에 결합된 PS 유도체의 대표적인 질량 스펙트럼을 나타낸다. 도 5는 각 샘플에 대한 관찰 질량과 관찰 질량과 일치하는 대응 이온의 이론 질량을 나타낸다. PS 유도체의 구조가 도 6 내지 15에 도시된다. 모든 질량은 C-5 아미노기 상의 N-아세틸기가 제거된 하나 이상의 잔기를 함유하는 이당에 상응한다.
실시예 3
시알리다제 소화 및 펄스형 전류 검출기를 구비한 고성능 음이온 교환 크로마토그래피( HPAC-PAD)에 의한 SEAM -3와 결합하는 deNAc SA 에피토프 -함유 N- PR NmB PS 유도체의 분석
아소로박터유레아파덴스(Arthrobacter ureafadens)(SIALIDASE A™, Prozyme, Hayward, CA)로부터의 엑소시알리다제는 de-N-Ac 시알산 잔기로 비-환원 단부 상에서 종결하는 폴리시알산(N-Ac 또는 N-Pr 유도체들)을 소화시킬 수 없다. 따라서, 중합체 전체에 무작위적으로 위치된 de-N-아세틸 잔기를 함유하는 NmB PS 또는 N- Pr NmB PS 제제를 시알리다제 A로 소모성 소화시킴에 의해 시알리다제가 de-N-아세틸 잔기와 만날 때를 제외하고는 폴리시알산이 5-N-아실 뉴라민산으로 전환될 것이다. 이 지점에서 중합체는 더 이상 변성되지 않을 것이다. 또한, 변성되지 않은 시알산 분자는 비-환원 단부에 de-N-아세틸 시알산 잔기를 가진다. SEAM-3이 de-N-아세틸과 N-아실 잔기의 혼합물과 결합한다는 실시예 2에 제시된 결과를 확인하기 위하여, 콜로민산(EY Laboratories)과 N-Pr NmB PS의 제제(각각 10mg)를 50mM NaOAc 버퍼(pH 6.5) 중에 현탁하였다. SIALIDASE A™(0.1 U, Prozyme)을 가하고, 용액을 37℃에서 3일간 인큐베이션하였다.
시알리다제 처리 후에 남은 N-Ac NmB 올리고당(OS) 및 다당(PS) 그리고 N-Pr NmB OS 및 PS의 비율 및 중합도를 HPAC-PAD로 정량하였다. GP40 그래디언트 펌프, 0.1M NaOH (93%) 및 1M NaOAc를 함유하는 0.1M NaOH(7%)로 평형화시킨 PA200 칼럼 및 ED40 전기화학 검출기를 장착한 Dionex(Sunnyvale, CA) 액체 크로마토그래피에 샘플을 주사하였다. 초기 조건에서 시작하여 100% 0.1M NaOH/1M NaOAc까지 선형 구배로 당류를 용출하였다. 칼럼으로부터 용출된 당류를 ED40 전기화학 검출기를 사용하는 펄스형 전류 검출기로 검출하였다.
결과의 크로마토그램은 두 PS의 약 81% 내지 88%가 각각 N-Ac 또는 N-Pr 뉴라민산으로 소화되었고, 나머지 약 12-19%는 약 2 내지 약 18의 Dp를 갖는 올리고당으로 주로 구성되며(도 36), 고분자량 중합체는 극소량 존재하는 것을 나타내었다. HPAC-PAD 분석은 콜로민산 제제가 de-N아세틸화/재-아실화 과정을 겪지 않았음에도 콜로민산과 N-Pr NmB PS 제제가 모두 de-N-아세틸 잔기를 함유하는 것으로 나타난다.
ELISA에서 SEAM-3의 결합을 억제하는 콜로민산 및 N-Pr NmB PS의 능력을 상기 설명한 대로 제조된 시알리다제 A-처리된 콜로민산 및 N-Pr NmB PS와 비교하였다. 마이크로타이터 플레이트(Immulon 2; Dynatech Laboratories, Inc.)의 웰을 포스페이트 완충 식염수(PBS; pH 7.4) 중에서 N-Pr NmB PS-도데실아민(실시예 1에서 설명한 대로 제조된)으로 코팅했다. 플레이트를 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. PBS로 3회 세척한 후, 웰을 200㎕ 차단 버퍼(1% 소 혈청 알부민[BSA, Sigma] 및 0.1% 나트륨 아지드를 함유하는 PBS; pH 7.4)로 채우고, 실온에서 30-60분간 인큐베이션하여 비특이적 결합 부위를 차단하였다. 플레이트를 PBS 버퍼로 3회 세척하였다. 플레이트에서 전체 최종 부피가 50㎕가 되도록 차단 버퍼로 억제제를 연속 희석하였다. 기질에 전개시켰을 때 OD405nm가 0.5가 되는 농도까지 차단 버퍼로 희석한 SEAM-3을 웰에 50㎕ 부피로 첨가했다. 플레이트를 덮고 4℃에서 하룻밤 인큐베이션했다. 다음날 웰을 PBS 버퍼로 4회 세척하고, 차단 버퍼로 1:3000으로 희석한 웰 당 100㎕의 알칼리성 포스파타제-콘쥬게이트 항-마우스 다클론 항체(IgA + IgG + IgM; Zymed)와 함께 주위 온도에서 2시간 인큐베이션하였다. 다음에, 플레이트를 PBS 버퍼로 세척하고, 1mM MgCl2를 함유하는 50mM 나트륨 카보네이트 버퍼(pH 9)의 기질 버퍼 중에 1mg/mL로 희석한 새로 제조한 기질(p-니트로페닐 포스페이트; Sigma)을 100㎕씩 첨가했다. 주위 온도에서 30분 인큐베이션한 후, BioRad Model 550 마이크로타이터 플레이트 리더를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 405nm 흡광도를 SEAM-3만 함유하고 억제제는 함유하지 않는 웰에서 관찰된 흡광도의 50%까지 감소시키는데 필요한 희석도를 측정하여 각 샘플의 상대 활성을 비교하였다.
억제 ELISA에 의해 측정하였을 때, 콜로민산 제제는 SEAM-3과의 결합에 대해 N-Pr NmB PS보다 약 200배 적은 활성을 가졌다. 그러나, HPAC-PAD로 측정하였을 때 80% 이상의 PS가 단일체 N-아실 뉴라민산으로 전환되었음에도, 미처리된 제제와 비교했을 때 엑소시알리다제-처리된 콜로민산 또는 N-Pr NmB PS의 활성에 유의한 차이는 없었다. 이 결과는 SEAM-3에 의해 인식된 에피토프가 de-N-아세틸 잔기를 함유하지 않는 NmB PS 유도체가 아니라 de-N-아세틸과 N-아실 잔기의 혼합물로 이루어진다는 것을 명확히 나타낸다. HPAC-PAD에 의해 특성화된 Dp가 2 내지 약 27 사이에서 변화하므로, de-N-아세틸 잔기는 중합체 내부에 또는 비-환원 단부에 생길 수 있다.
콜로민산 또는 N-Pr NmB PS의 제제에서 SEAM-3에 의해 인식되는 항원의 양은 엑소시알리다제로의 소모성 소화에 영향을 받지 않지만, de-N-아세틸 잔기를 함유하지 않는 제제 중의 비-반응성 분자는 변성된다. 따라서, 소모성 엑소시알리다제 처리는 콜로민산 및 N-Pr NmB PS 제제를 mAb와 결합하는 분자들로 상당히 농후화하는 수단을 제공한다.
실시예 4
deNAc SA 항원과 관련하여 농후화된 PS 유도체를 함유하는 백신의 제조
다음은 시알리다제-기반 농후화 방법 및 아크릴기 또는 할로아세틸기와의 반 응 및 이들을 통한 결합에 의한 콘쥬게이트 생성 방법을 둘 다 사용하여 PS로부터 deNAc SA 항원-함유 백신을 제조하는 방법의 예를 제공한다.
De -N- 아세틸화
콜로민산(100mg, EY Laboratories) 및 붕수소화 나트륨(Sigma-Aldrich) 10mg을 2M NaOH 10mL에 용해하고 밀봉한 가수분해 유리관(Pierce)에 넣어 2시간 동안 90℃까지 가열한다. 이 용액을 주위 온도까지 냉각시키고 빙초산을 첨가하여 용액의 pH를 약 7까지 낮춘다. 용액을 2x 4L 물 중에서 투석(1 kDa 컷오프)하고 동결건조시킨다.
re -N- 아실화
de-N-아세틸화 NmB PS를 물 5mL에 재현탁하고 2M NaOH를 사용하여 pH를 8-9로 조정한다. 아실 무수물(예를 들어, 무수 아세트산 또는 무수 프로피온산)을 수 시간에 걸쳐 교반하면서 0.1mL씩 5번 첨가한다. pH 미터로 pH를 모니터링하여, 필요에 따라 2M NaOH를 사용하여 pH를 8-9로 조정한다. 이전과 같이 용액을 물 중에서 투석하고 동결건조시킨다. 레조르시놀 분석(상기 참조)에 의해 측정된바, 재-아실화 NmB PS는 전형적으로 10%-30%의 de-N-아세틸 시알산을 함유한다. 이 산물은 SIALIDASE A™(Prozyme) 처리에 의해 SEAM-3 반응성 항원과 관련하여 농후화된다.
시알리다제 처리
동결건조된 분말을 50mM 나트륨 아세테이트 버퍼(pH 6.5) 1mL에 재현탁한다. (1 U)를 첨가하고, 용액을 37℃에서 3-7일간 인큐베이션한다. 반응 혼합물을 소량씩 주기적으로 HPAC-PAD 분석하여 반응의 진행을 모니터링한다. 5-N-아실 뉴라민 산이 더 이상 방출되지 않을 때 반응을 종결하고, 1시간 동안 2M NaOH를 사용하여 반응물의 pH를 12까지 증가시켜 환상 락톤을 가수분해하고, 빙초산으로 중화하고, 30 kDa Centricon 멤브레인을 통해 여과하고, 물 중에서 투석하고(1 kDa 투석 관), 산물을 동결건조시킨다.
아크릴산(또는 할로아세트산 )을 사용한 N- 아실화
시알리다제-처리된 부분적으로 de-N-아세틸화된 NmB PS를 물 중에 재현탁하고 2M NaOH를 사용하여 pH를 8-9로 조정한다. re-N-아실화 NmB PS 제제 중에 존재하는 de-N-아세틸 시알산 양의 10% 내지 100%와 동등한 양의 아크릴산(또는 할로아세트산)(전형적으로 레조르시놀 분석에 의해 측정된 시알산 총량의 40%-50%)을 0.9당량의 EDC(Pierce)와 조합한다. 필요에 따라 소량의 물을 첨가하여 EDC를 용해한다. 활성화된 아크릴산(또는 활성화된 할로아세트산)의 용액을 교반하면서 부분적으로 re-N-아실화된 NmB PS 제제에 첨가하고, 필요에 따라 2M NaOH를 첨가하여 pH를 8-9로 유지한다. de-N-아세틸 시알산의 양과 동등한 양의 활성화된 아크릴산(또는 활성화된 할로아세트산)이 반응물에 첨가될 수 있지만, 활성화된 아크릴산의 일부가 가수분해될 것이므로 일부 양의 de-N-아세틸 시알산이 남을 것이다. 1시간 동안 교반한 후, 상기 설명한 대로 반응 혼합물을 투석하고 동결건조시킨다. 캐리어 단백질과의 콘쥬게이션에 사용할 때까지 산물을 -80℃의 암소에 아르곤하에 밀봉하여 보관한다.
캐리어 단백질과의 콘쥬게이션
캐리어 단백질(10mg)을 150mM NaCl을 함유하는 50mM HEPES(pH 8.0)에 용해한 다. 아실-함유 NmB PS 제제를 첨가하고(20mg), 용액을 주위 온도에서 암소에 2시간 동안 방치한다. 다음에, 질량 컷오프 30 kDa의 투석 멤브레인을 사용하여 PBS 버퍼 중에서 용액을 투석한다. 투석된 콘쥬게이트를 최종적으로 멸균 여과하고(0.2μ) 사용할 때까지 4℃에 보관한다. 단백질에 콘쥬게이트된 시알산의 양을 레조르시놀 분석에 의해서 측정하고, PS가 단백질에 공유 결합된 입체구조를 SDS-PAGD 및 SEAM-3를 사용한 웨스턴 블롯 검출에 의해 결정한다.
실시예 5
박테리아성 PS 에 N- 트리클로로아세틸 (또는 트리플루오로아세틸 ) 보호된 시알산 잔기의 생합성 편입 및 PS -단백질 콘쥬게이트 백신을 제조하기 위한 결과의 캡슐형 PS 의 사용
만노스아민 염산염 0.5 밀리몰(108mg)을 나트륨 메톡시드 0.55 밀리몰을 함유하는 메탄올 10mL에 용해하고 4℃까지 냉각시켰다. 무수 트리클로로아세트산(또는 에틸 트리플루오로아세테이트) 0.6 밀리몰을 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 교반했다. 실리카겔 TLC 플레이트 위에 반응 혼합물을 스폿팅하고, 플레이트를 에틸아세테이트, 메탄올, 물(5:2:1)로 전개시키고, 가열에 의해 요오드 증기 또는 닌히드린 시약이 있는 지점에서 만노스아민의 소실을 검출함으로써 반응의 진행을 모니터링했다. 반응 완료시에 AG 501-8X 혼합층 수지(BioRad) 1.5 밀리당량(mEq)과 물 1mL를 첨가하고, 필요에 따라 NaOH 또는 HCl을 첨가하여 pH를 7로 조정한 다음, 혼합물을 1시간 동안 부드럽게 흔들었다. 용매 혼합물과 비드를 분리하고, 동결건조시켜 용매를 제거했다. 필요하다면 TLC에 대해 설명한 것과 동일한 용매 시스템을 사용하는 실리카겔 크로마토그래피에 의해 산물을 더 정제하였다. 원하는 물질을 함유하는 조합 분획들로부터 용매를 증발시켜 제거하였다. 마지막으로, 건조된 산물을 물에 재현탁하고 동결건조시켰다.
5 밀리몰 N-아실 만노스아민, 예를 들어 N-아세틸, N-트리클로로아세틸, N-트리플루오로아세틸 만노스아민 보충된 Muller-Hinton 육즙 중에서 OD620nm 0.1까지 새로 펴 바른 초콜릿 한천 배지 상에서 5% 이산화탄소 존재하에 37℃에서 하룻밤 성장한 NmB 균주 M7의 콜로니를 접종하여 NmB PS에 트리할로아세틸화 만노스아민을 편입시켰다. 균주 M7은 N-아세틸-D-글루코사민-6-포스페이트 2 에피머라제 암호화 유전자를 가로막는 트랜스포존을 함유한다(Swartley et al., 1994, J. Bact. 176:1530; Swartley et al., 1996, J. Bact. 178:4052). 그 결과, 이 박테리아는 성장 배지가 N-아세틸 만노스아민으로 보충되지 않는다면 캡슐 PS를 합성할 수 없다. 따라서, 이 시스템에서 합성된 캡슐 PS의 N-아실 함량은 성장 배지 중에 제공된 N-아실 또는 N-아실 만노스아민의 혼합물에 의해 결정될 수 있다. 박테리아는 37℃에서 하룻밤 동안 OD620nm까지 성장시켰다.
NmB 균주 대신에 E. coli K1의 돌연변이가 상기 생산 방법에서 또한 사용될 수 있다. 캡슐형 PS에 결함이 있는 적합한 E. coli K1 돌연변이는, 예를 들어 기능적 neuC 유전자 산물 발현의 녹아웃에 의해서 생성될 수 있다. neuC가 N-아세틸-D-글루코사민-6-포스페이트 2 에피머라제를 암호화하므로, 이 유전자를 결핍한 E. coli 균주는 캡슐형 PS를 합성할 수 없으며, 따라서 이와 같은 PS 유도체 생산 방법에 사용하기 적합하다.
트리할로아세틸기를 함유하는 캡슐 PS의 생산을 mAb SEAM-12(Granoff et al. (1998) J Immunol 160, 5028-36)를 사용하여 형광현미경으로 M7 생산 균주에 캡슐 PS 존재를 검출함으로써 확인하였다. 이 결과를 도 37에 나타낸다. N-아세틸 만노스아민 보충된 M7과 SEAM-12의 결합은 도 37(패널 A)에 나타내며, 여기서 결합은 검출한 로다민-표지 2차 항체(Zymed)의 적색 형광에 의해 표시된다(도면에서 회색 음영). SEAM-12는 N-아실 만노스아민이 없거나 또는 N-트리클로로아세틸 만노스아민 보충된 M7과는 결합하지 않는다(도 37, 패널 B 및 C). SEAM-12는 트리클로로아세틸기를 함유하는 캡슐 PS와 결합하지 않았는데, 이는 트리클로로메틸기의 큰 크기가 결합을 방해하기 때문이다. 그러나, SEAM-12는 N-트리플루오로아세틸기를 함유하는 캡슐 PS와는 결합하였으며(도 37, 패널 D, 도면에서 회색 음영), 이는 트리플루오로메틸기가 N-아세틸 유도체의 메틸기와 거의 동일한 크기이기 때문이다.
Guo 및 Jennings(Guo, Z. and Jennings, H. in 2001. In Meningococcal Vac-cines: Methods and Protocols. A. J. Pollard, 및 C. J. M. Maiden, eds. Humana Press Inc., Totowa, N.J., p. 41)에 설명된 대로 성장 배지로부터 다당을 정제하였다. 정제된 다당을 산화시키고, 상기 설명한 대로 환원성 아민화에 의해 캐리어 단백질 또는 지방 아민에 콘쥬게이트하고, 붕수소화 나트륨을 사용한 환원에 의해 트리할로아세틸기를 제거하였다. 최종 산물을 상기 설명한 대로 크기 배제 크로마토그래피로 정제하고 PBS 중에서 투석하고 동결건조시켰다.
실시예 6
강글리오시드에 N- 트리클로로아세틸 (또는 트리플루오로아세틸 ) 보호된 시알 산 잔기의 생합성 편입 및 단백질 콘쥬게이트 백신 및 외막 소포 백신을 제조하기 위한 결과의 강글리오시드의 사용
만노스아민 염산염(4.5mmol) 1g을 등량의 나트륨 메톡시드를 함유하는 메탄올 50mL에 용해하고 4℃까지 냉각시켰다. 염화 트리클로로아세트산(또는 에틸 트리플루오로아세테이트) 5.1 밀리몰을 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 필요에 따라 나트륨 메톡시드를 추가로 첨가하여 pH를 약 8로 유지하였다. 실리카겔 TLC 플레이트 위에 반응 혼합물을 스폿팅하고, 플레이트를 에틸아세테이트, 메탄올, 물(5:2:1)로 전개시키고, 요오드 증기가 있는 지점에서 만노스아민의 소실을 검출함으로써 반응의 진행을 모니터링하였다. 반응 완료시에 용매를 증발시켜 제거하였다. 5mL 메탄올로 잔류 고체를 트리튜레이팅(triturating)한 후, 메탄올/클로로포름으로부터 N-트리할로아세틸 유도체를 결정화하였다.
SK-MEL-28 세포를 정사각형 245mm x 245mm 생물분석 접시에서 거의 합류점까지 성장시켰다. 성장 배지(5mM 글루타민, 1mM 나트륨 피루베이트, 0.1mM 비필수 아미노산, 10% 태아 소 혈청, 및 항생제로 보충된 RPMI)를 24시간 동안 트리클로로아세틸 만노스아민을 함유하는 성장 배지로 대체하고, 그 후 세포를 PBS로 3회 세척하고 증류수 중에서 저장성 쇼크에 의해 용해시켰다(4℃에서 1시간). 그 다음, 드라이아이스/37℃ 수조에서 에탄올을 사용하여 냉동/해동을 3 사이클 행하였다. 미가공 막 분획을 4℃에서 20분간 4500g에서 원심분리하여 펠릿으로 만들었다. 펠릿을 동결건조시키고, 30분간 메탄올/클로로포름(1:2, 1:1, 2:1 부피 기준)으로 단계적 세척하여 지질을 추출하였다(Geilen et al 1992, Arch. Biochem. Biophys. 296, 108-114). 산소를 함유하지 않는 질소 기체의 정류 흐름 하에서 유기상을 건조시키고, 200㎕의 클로로포름/메탄올/0.02% CaCl2(50:40:10)에 재현탁하였다.
2.5M 수산화 테트라부틸암모늄 2mL와 부탄올 3mL에 강글리오시드 1mg을 현탁하고, 혼합물을 4시간 > 100℃까지 가열하여 de-N-아실 GM3 및 GD3(Calbiochem)를 제조하였다. 혼합물을 주위 온도까지 냉각한 후, 2M HCl을 첨가하여 pH를 약 7로 조정하고, 부탄올을 N2 흐름 하에서 증발시켜 부탄올을 제거했다. 잔류 수성 층을 PBS 버퍼 중에서 투석하고(1 K 컷오프 투석 관), 더 이상의 정제 없이 ELISA용 항체로서 사용하였다.
추출물 및 화학적으로 de-N-아실화된 GD3 중의 지질을 고성능 박층 크로마토그래피(HPTLC) 및 웨스턴 블롯에 의해 분리하여 분석했다. 강글리오시드 추출물, 붕수소화 나트륨으로 처리하여 트리클로로아세틸 보호기를 제거한 강글리오시드 추출물(1mg/100㎕, 주위 온도에서 2시간 동안), 및 화학적으로 de-N-아실화 GD3의 샘플을 알루미늄 후면 실리카겔 60 HPTLC 플레이트(Merck) 위에 스폿팅하고, 클로로포름/메탄올/0.02% CaCl2(50:40:10) 중에서 플레이트를 전개시켰다. 웨스턴 블롯에 사용된 플레이트를 건조시키고, 헥산/클로로포름(21:8) 중의 0.4% 폴리이소부틸메타크릴레이트 용액에 1분간 담가 두었다. 플레이트를 0.1% 나트륨 아지드를 함유하는 PBS 버퍼 중의 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단하였다. 동일한 차단 버퍼 중의 mAb(5㎍/mL)를 4℃에서 하룻밤 동안 플레이트와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS 버퍼로 3회 세척한 다음, 1% BSA를 함유하는 PBS 중에서 염소 항-마 우스 Ig-HRP 콘쥬게이트(Zymed)와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세척한 후, 기질(HRP 화학발광 시약 플러스, Perkin-Elmer)을 첨가하여 플레이트를 전개시켰다. 발광 이미지를 필름에 캡처하였다.
항-de-N-아실 GD3 mAb와 화학적으로 또는 생합성적으로 제조된 de-N-아세틸 시알산 강글리오시드의 반응성을 평가하기 위한 웨스턴 블롯을 GAG2(레인 1-3, 도 38) 또는 SEAM-3(레인 4-6, 도 38)를 사용하여 수행하였다. GAG2는 de-N-아실 GD3를 함유하는 N. meningitidis 외막 소포(siaD 유전자가 불활성화된 균주 H44/76)로 마우스를 면역화함으로써 de-N-아실 GD3에 대해 제조된 쥐 단클론 항체(IgM)이다(실시예 9). 소포는 아래 설명된 대로 제조하였다. GAG2는 de-N-아실 GD3와는 결합하지만 re-N-아세틸화 GD3와는 결합하지 않는다. 레인 1 및 3은 GD3를 수산화 테트라부틸암모늄으로 처리하여 획득한 강글리오시드이다(즉, 화학적 de-N-아실화). 레인 2, 3, 5 및 6은 N-트리클로로아세틸 만노스아민으로 보충된 배지 중에서 성장한 SK-MEL-28 세포로부터 추출한 강글리오시드이다(즉, 생합성된 N-보호 시알산 함유 강글리오시드). 레인 2 및 5의 지질 추출물을 NaBH4로 처리하여 트리클로로아세틸 보호기를 제거함으로써 de-N-아세틸 시알산 강글리오시드를 생산하였다. 레인 3 및 6은 동일한 지질 추출물을 함유하는데, 이것은 NaBH4로 처리하지 않았다. SEAM-3은 알칼리 처리에 의해 생산된 de-N-아실 강글리오시드의 어느 것과도 반응하지 않았다. GAG2는 용매와 함께 앞쪽으로 이동하는 생합성적으로 생산된 de-N-아세틸 시알산 강글리오시드와 반응하고(레인 2), SEAM-3는 상이한 더 느리게 이동하는 de-N-아세틸 강글리오시드 유도체와 반응한다(레인 5). 레인 3 및 6에서 전 개된 두 mAb의 지질 추출물에 대한 반응성의 결핍은 분리 과정 동안 N-트리클로로아세틸 보호기가 손상되지 않고 있으며, NaBH4로 보호기를 제거한 후 de-N-아세틸 시알산 강글리오시드 유도체가 생산됨을 나타낸다.
도 38의 결과는 SEAM-3이 SK-MEL-28 세포에서 N-트리클로로아세틸-보호된 강글리오시드의 생합성 후, NaBH4로 보호기를 제거함에 의해 제조된 de-N-아세틸 시알산 강글리오시드(레인 5)와는 결합하지만, 보호된 유도체(레인 6) 또는 화학적으로 de-N-아실화된 GD3(레인 6)와는 결합하지 않는다는 것을 증명한다. 추가하여, 알칼리 처리에 의해 제조된 de-N-아실화 GD3에 대해 특이적인 mAb(GAG2)는 NaBH4-처리된 SK-MEL-28 지질 추출물 중의 상이한 더 빨리 이동하는 유도체와 반응한다. 따라서, 여기 설명된 방법은 SEAM-3 같은 mAb와 반응하고, de-N-아세틸 시알산 잔기를 인식하고, de-N-아세틸 시알산 항원을 발현하는 암 세포에 대항하는 세포독성 기능 활성을 갖는 백신 및 진단 항원으로서 사용하기 위한 강글리오시드 유도체를 선별적으로 제조하는데 사용될 수 있다.
실시예 7
deNAc SA 항원의 제조 - N-아세틸과 de -N-아세틸 시알산 잔기의 혼합물을 갖는 강글리오시드 유도체
SK-MEL-28 세포에서 생합성에 의해 얻은 N-트리클로로아세틸/N-아세틸 시알산 강글리오시드 유도체를 클로로포름/메탄올/0.02% CaCl2에 용해하였다. 붕수소화 나트륨으로 환원시켜 N-트리클로로아세틸 아민 보호기를 제거하였다(1mg NaBH4/미가공 지질 추출물 10mg 당). 반응물로부터 침전한 붕산칼슘을 원심분리하여 제거하였다. 지질 유도체를 HPTLC에 의해 분리하였다. SEAM-3 반응성 물질을 함유하는 밴드를 플레이트로부터 긁어 모아 클로로포름/메탄올(1:1)로 추출하였다. 원심분리하여 실리카겔을 제거한 후, N2 하에 추출된 밴드로부터 용매를 건조시켰다.
시알릴 트랜스페라제 유전자 siaD가 불활성화된 Neisseria meningitidis B 군 균주 H44/76으로부터 외막 소포를 제조하였다. A620nm 0.6까지 Muller-Hinton 육즙에서 성장시킨 H44/76 1L로부터 30분간 10,000x g에서 원심분리하여 세포를 펠릿으로 만들었다. 세포 펠릿을 5:1(v/w)의 버퍼 대 바이오매스 비로 10mM EDTA 및 0.5% DOC를 함유하는 0.1M 트리스-HCl(pH 8.6)에 재현탁하였다. 원심분리(20,000x g; 30분; 4℃) 후 상청액을 수집하고, 버퍼 부피를 1/3로 감소시켜 추출을 반복하였다. 조합한 상청액을 초원심분리하고(125,000x g; 2시간; 4℃), OMV 펠릿을 2mM EDTA, 1.2% DOC 및 20% 수크로스를 함유하는 50mM 트리스-HCl 버퍼(pH 8.6)에 재현탁하였다. 표준 단백질 분석법(BCA, BioRad)을 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 지질 피막에 소포 제제 및 Empigen(1% w/v; Calbiochem)을 가하고, 초음파 처리조((Branson)에서 30분간 초음파처리한 후, 4℃에서 교반하면서 하룻밤 방치하였다. 다음에, 혼합물을 5일간 PBS 버퍼 중에서 완전히 투석하였다. 결과의 OMV/강글리오시드 복합체를 멸균 여과하고, 백신접종에 사용할 때까지 냉동시켜 두었다.
실시예 8
N- 트리할로아세틸 /N-아세틸 시알산 강글리오시드 -단백질 콘쥬게이트 백신의 제조
SK-MEL-28 세포에서 N-트리할로아세틸/N-아세틸 시알산 강글리오시드의 생합성으로부터 미가공 지질 분획을 HPTLC로 정제하고, N-트리할로아세틸/N-아세틸 시알산 강글리오시드 유도체를 실시예 7에 설명한 대로 플레이트로부터 추출하였다. 원심분리에 의해 실리카겔을 제거한 후, 스핑고신 이중결합의 오존분해에 의해 강글리오시드에 알데히드기를 만들었다. 알데히드를 역상 HPLC(Waters Bondpak C18 마이크로보어)에 의해 정제하고, 시아노붕수소화 나트륨을 사용한 환원성 아민화에 의해 파상풍 톡소이드와 커플링시켰다. 동일한 반응 혼합물에 과량의 붕수소화 나트륨을 첨가하여 N-트리할로아세틸 보호기를 제거하였다. 반응 혼합물을 PBS 버퍼 중에서 투석하고, 멸균 여과하고, 백신접종에 사용할 때까지 냉동시켜 두었다.
실시예 9
SEAM -3 mAb 의 정제
고체 황산나트륨(Sigma-Aldrich Chemical Co., Saint Louis, MO)을 PBS 중의 SEAM-3 용액(항체 캡처 분석(SouthernBiotech, Birmingham, Al)에 의해 측정된바, 약 30㎍/mL의 항체 농도)에 0.5M의 최종 농도로 첨가했다. 고체 황산나트륨을 완전히 용해한 후, 용액을 4℃에서 약 18시간 인큐베이션하였다. 용액을 원심분리하여(10,000x g) 침전물을 제거하고 여과하였다(0.2μ). 다음에, 항체를 0.5M 황산나트륨을 함유하는 PBS 버퍼로 평형화한 Toyopearl HW55F 칼럼(Supelco, Bellefonte, PA; 1.5mm x 25mm) 상에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 고체상 항원으로서 N-프로피오닐 NmB PS-도데실아민(상기 참조)을 사용하여 ELISA를 행하고, 토끼 항-마우스 IgA, G, M(H 및 L)(Zymed, South San Francisco, CA)에 콘쥬게이트되고 4-니트로페닐포스페이트 기질(Sigma-Aldrich) 전개된 알칼리성 포스페이트를 사용하여 검출하여 활성 항체를 함유하는 분획들을 결정하였다. 활성 항체를 함유하는 분획들을 조합하여 PBS 중에서 투석하고 멸균 여과(0.2μ)하고 4℃에 보관하였다. 정제된 항체의 항체 농도를 항체 캡처 분석(Southern Biotech)으로 결정하였다. 정제된 SEAM-3을 아래 실시예에 사용하였다.
실시예 10
암 세포에서 SEAM -3 반응성 항원의 존재 및 정상 세포에서의 부재
정상 멜라닌 세포와 흑색종 종양 세포 사이에 SEAM-3 반응성 항원의 발현에 차이가 있는지 결정하기 위하여, 각 조직 타입의 얇은 절편의 면역-염색을 수행하였다. SEAM-3에 더하여, 대조군으로서 단독 2차 항체 및 정상 멜라닌 세포에서 발현되고 일부 흑색종에서 과발현되는 강글리오시드 GD3에 결합하는 R24를 포함시켰다(Dippold et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1980. 77(10):6114-8.; Graus, et al., Brain Res, 1984. 324(1):190-4; Houghton et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 1985. 82(4):1242-6; Panneerselvam et al., J Immunol, 1986. 136(7):2534-41; Real et al., Cancer Res, 1985. 45(9):4401-11; Vadhan-Raj et al. J Clin Oncol, 1988. 6(10):1636-48; Welt et al., Clin Immunol Immunopathol, 1987. 45(2):214-29).
조직 절편을 정상 피부(HuSkinTb111, 도 39) 및 2개 인간 흑색종(HuMel1151 및 HuMel4034)의 냉동 샘플로부터 제조하였다. de-N-아세틸 항원이 차단되거나 또는 항원을 함유하는 지질이 추출될 가능성을 방지하기 위해서, 냉동 조직으로 절편을 제조한 다음, 알데히드나 유기 용매로 고정하지 않고 슬라이드 위에서 건조시켰다(Chammas et al. Cancer Res, 1999. 59(6):1337-46). 30분간 0.03% 퍼옥시드 중에서 인큐베이션하여 내인성 퍼옥시다제를 제거한 다음, 버퍼로 세척하고, Vector Labs(Burlingame, CA)의 아비딘/바이오틴 차단 키트를 사용하여 내인성 바이오틴을 차단하였다. 콜라겐과의 비특이적 결합을 1% BSA/PBS로 차단하였다. 다음에, BSA3 또는 mAb R24 또는 SEAM-3을 휴미드 챔버에서 인큐베이션하였다. 버퍼로 헹궈 미결합 항체를 제거하였다. 다음에, DAKO LSAB 키트를 제조자의 지시(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에 따라 사용하여 결합된 항체를 검출하였다. 추가로 세척한 후, Mayer's 헤마톡실린(Vector Labs)을 사용하여 핵을 대조염색하였다.
400x 확대한 결과를 도 39에 나타낸다. 정상 인간 피부의 면역-염색은 항-GD3 mAb R24가 멜라닌 세포(화살표)이며, 피부 진피에 일부 신경 가지가 있음을 확인시켜 준다. SEAM-3는 진피의 신경 유사 구조에 존재하지만 멜라닌 세포에는 존재하지 않는 항원과 결합한다. 2개 흑색종의 염색은 R24가 모든 세포는 아니지만 일부 세포와 강하게 반응한다는 것을 나타낸다. 반면에, SEAM-3 염색은 거의 모든 흑색종 세포에서 더 약하게 염색되었는데, 이것을 어두운 음영 영역으로 표시한다. SEAM-3 염색은 과립상이며 흑색종 세포의 세포내에서 드러난다. 따라서, SEAM-3에 의해 인식되는 항원은 정상 멜라닌 세포에는 검출가능한 정도로 존재하지 않지만, 인간 흑색종 종양에는 존재한다. 아래 설명된 SK-MEL-28 흑색종, CHP-134 신경모 세포종, 및 Jurkat 세포(급성 림프모구성 T 세포 백혈병)에 대한 형광현미경 및 세포독성에 기초하면(하기 참조), 항원은 어떤 성장 단계 동안에 세포 표면에 존재한다(데이터 나타내지 않음). 각 세포 타입(SK-MEL-28 흑색종, CHP-134 신경모세포종, 및 Jurkat 세포)에서 SEAM-3의 세포독성 효과가 관찰되었고, 이것은 세포 표면에 존재하는 항원의 수준에 거의 비례하였다.
실시예 11
인간 종양 유래의 포르말린-고정 파라핀 포매 조직 절편에 SEAM -3 결합
SEAM-3에 의해 인식되는 항원의 초기 면역조직화학 분석을 고정되지 않은 조직에 대해 수행하였는데, 이 경우 포름알데히드와의 반응에 의하여 de-N-아세틸 아미노기가 차단될 수 있다고 생각된다(상기 참조). 이어서, C1 카르복실기와 근접하여 위치한 결과로서 de-N-아세틸 시알산의 아미노기가 비교적 반응성이지 않다는 것이 결정되었다. 따라서, SEAM-3 반응성 항원에 대한 인간 종양의 대규모 스크리닝을 포르말린-고정된 파라핀 포매된 조직 절편을 사용하여 수행하였는데, 이는 이 방법에 의한 샘플의 처리가 세포 구조 특징의 보존성을 상당히 개선하기 때문이다.
인간 조직 마이크로어레이를 US BioMax(Rockville, MD)에서 획득하였다. 조직 마이크로어레이를 크실렌 중에서 파라핀 제거한 다음(2번 교체, 각 10분), 100% 에탄올, 95% 에탄올, 70% 에탄올, 50% 에탄올, 그리고 PBS 버퍼로 연속 5분 세척하여 다시 수화시켰다. 주위 온도에서 5분간 Peroxidazed 1 용액(Biocare, Concord, CA)과 함께 인큐베이션하여 내인성 퍼옥시다제를 차단시켰다. 절편들을 스트렙트아비딘을 함유하는 Terminator(Biocare)로 차단한 다음 PBS 버퍼로 헹구었다. 1차 항체(정제된 SEAM-3(하기 참조), 부적합 IgG2b 대조군 등, 1 내지 5㎍/mL 농도)를 Da Vinci Green 희석 버퍼(Biocare)로 희석하고, 4℃에서 하룻밤 또는 주위 온도에서 1시간 인큐베이션하였다. 슬라이드를 PBS 버퍼로 각 10분간 3회 세척한 다음, 바이오틴 콘쥬게이트된 토끼 항-마우스 IgG 2차 항체(5㎍/mL, Vector Labs, Burli-ngame, CA)와 함께 주위 온도에서 30분간 인큐베이션하였다. PBS 버퍼로 각 10분간 3회 세척한 후, 양고추냉이 퍼옥시다제-스트렙트아비딘 콘쥬게이트(Vector Labs)를 첨가하고, 주위 온도에서 30분간 인큐베이션하였다. 슬라이드를 PBS 버퍼로 각 10분간 3회 세척하고, 과산화수소를 함유하는 AEC 기질(Vector Labs)과 함께 인큐베이션하여 색을 전개시켰다. 샘플에 따라 30초 내지 30분간 색 전개를 진행시킨 다음 물로 세척하여 중단시키고, Hematoxylin QS(Vector Labs)로 대조염색하고, 물로 헹구고, 마지막으로 VectraMount AQ 수성 마운팅 배지(Vector Labs)에 마운팅하여 현미경(Zeiss Axioplan) 아래서 보면서 사진을 찍었다.
47개 인간 종양에 대한 결과를 도 40에 요약한다. 시험된 모든 종양 및 정상 조직은 부적합 이소타입-매치 대조군 mAb(쥐 IgG2b, Southern Biotech)와의 결합에 대해 음성이었다. 염색 강도 및 염색된 세포의 수는 종양 샘플에서 가변적이였으며, 염색되지 않는 것("-"로 표시)에서부터 모든 세포의 검은색 염색("+++"로 표시)까지의 범위로 극도의 변동이 있었다. 시험된 대부분의 종양 샘플은 SEAM-3 결합에 대해 양성이었으며(47개 중 38개), 광범위한 종양 타입에서 나타난다. 전형적으로, 종양 조직에서 관찰된 SEAM-3 결합으로 인한 염색은 "과립상" 외형을 가지며 세포 구조와 일치한다. 정상 세포의 마이크로어레이도 시험하였다. 일반적 으로, "정상" 조직 샘플은 종양과 동일한 피험자로부터 획득했지만, 원발성 종양의 경계 밖의 영역에서 획득하였다. 모든 정상 조직(17개 샘플)은 대조군 mAb와의 결합에 대해 음성이었다. SEAM-3은 17개 샘플 중 15개와의 결합에 대해 양성이었으며, "+"에서 "++"까지의 범위였다. 그러나, 종양 조직에서 관찰된 염색과는 달리, 정상 조직에서 SEAM-3 결합으로 인한 염색은 과립상이 아니며 그 대신에 균질하고, 소수의 세포를 제외하고는 세포 구조와 일치하지 않고, 기질 조직과 연속된다. 현재 시점에서 염색 외형의 차이는 이해되지 않는다.
실시예 12
형광현미경 및 유세포분석에 의한 인간 흑색종 SK - MEL -28, 및 신경모세포종 CHP-134 셀라인에 SEAM -3 결합
SK-MEL-28 세포(Carey et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 1976. 73(9):3278-82)를 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입했다. 세포를 0.1mM 비필수 아미노산, 1.0mM 나트륨 피루베이트, 0.1mM 글루타메이트, 페니실린/스트렙토마이신 및 10% 태아 소 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지 중에서 95% 공기:5% 이산화탄소 하에 37℃에서 통상대로 성장시켰다. 0.25%(w/v) 트립신/0.53mM EDTA 용액으로 처리하여 합류점 세포를 하위 배양하고(1:3 내지 1:8), 세척 및 트리튜레이팅한 다음, 새 성장 배지에 다지 파종하였다. SK-MEL-28 세포는 ATCC 스톡 세포로부터 10 계대까지만 사용하였다. 이들 세포는 강글리오시드 GD3를 발현한다.
인간 T 세포 백혈병 셀라인 Jurkat(Schneider et al., Int J Cancer, 1977. 19(5); Schneider et al. Haematol Blood Transfus, 1977. 20)을 10% FBS, 2mM L- 글루타민을 함유하는 RPMI 1640 중에서 5% 이산화탄소 하에 37℃에서 성장시키고, 약 1:5의 분할비로 3일마다 하위 배양하였다. 원심분리(500g)하여 세포를 수집하고, 새 배지에 재현탁하여 하위 배양하였다. 세포들은 CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD34 항원의 발현에 대해 양성이고, CD8, CD13, CD19, TCR알파/베타, TCR감마/델타의 발현에 대해 음성이다.
CHP-134 신경모세포종 세포(Livingston et al. J Biol Chem, 1988. 263(19): 9443-8)를 0.1mM 비필수 아미노산, 1.0mM 나트륨 피루베이트, 0.1mM 글루타메이트, 페니실린/스트렙토마이신 및 10% 태아 소 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지 중에서 95% 공기:5% 이산화탄소 하에 37℃에서 통상대로 성장시켰다. 세포 산포 시약(CDR, Guava Technologies, Haywood, CA)으로 처리하여 합류점 세포를 하위 배양하고(1:3 내지 1:5), 세척 및 트리튜레이팅한 다음, 새 성장 배지에 다시 파종하였다. 이들 세포는 장쇄 폴리시알산(즉, 폴리 알파 2-8 N-아세틸 뉴라민산)으로 변형된 신경세포 유착 분자(NCAM)를 발현한다.
세포 표면에 대한 SEAM-3의 결합을 관찰하기 위해 유착성 CHP-134 또는 SK-MEL-28 세포(약 105 세포)를 폴리-L-리신(Nunc)으로 처리한 멀티-웰 현미경 슬라이드 상에서 배양하였다. 하룻밤 인큐베이션한 후, 세포를 PBS 버퍼로 부드럽게 세척하고, 얼음 냉각한 1%(v/v) 포름알데히드로 고정시켰다. 20분 후 세포를 PBS로 세척하고, 1시간 동안 3% 염소 혈청 용액으로 비특이적 결합을 차단시켰다. 세포 내부에 존재하는 SEAM-3 반응성 항원의 존재를 관찰하기 위해서 세포를 1시간 동안 3% 염소 혈청 중의 Triton X-100 0.5% w/v로 처리하였다. 1차 항체를 첨가하고 2시간 동안 또는 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 세포를 얼음 냉각한 PBS로 연속하여(적어도 2회) 부드럽게 세척한 다음, Alexa Fluor 488(면역형광 및 공초점), Alexa Fluor 546(공초점), Alexa Fluor 594(면역형광), Alexa Fluor 633(공초점)의 하나와 콘쥬게이트된 이소타입-특이적 2차 항체(염소에서 생산)를 4℃ 암소에서 적어도 1시간 동안 적용하였다(형광단에 콘쥬게이트된 모든 2차 항체는 Invitrogen, Carlsbad, CA에서 얻었다). 다시 연속하여 부드럽게 세척한 후, DAPI를 함유하는 경화 마운팅 배지를 적용하였다.
디지털 카메라를 장착한 Zeiss Axioplan 형광현미경을 사용하여 면역형광을 관찰하였다. 공초점 이미지를 Zeiss Meta510 CLSM(Biological Imaging Facility, University of California, Berkeley, CA)를 사용하여 획득하였고, ImageJ 소프트웨어(NIH)로 분석하였다. 대조군 항체 및 단독 적용한 2차 항체를 통상대로 사용하여 바탕 형광을 평가하였다. GD3에 특이적인 양성 대조군 mAb, R24는 SK-MEL-28 흑색종 세포와의 결합에 대해 양성이었지만, GD3를 발현하지 않는 CHP-134 신경모세포종(Livingston et al. J Biol Chem, 1988. 263(19): 9443-8) 및 Jurkat T 세포 백혈병 세포와의 결합에 대해서는 음성이었다(데이터 나타내지 않음).
도 41 및 도 42는 공초점 현미경에 의해 측정된 SEAM-3와 SK-MEL-28 흑색종 세포 및 CHP-134 세포의 결합으로 인한 세포 표면의 형광을 나타낸다(도면에서 어두운 음영). 각 경우 형광은 세포 표면 전체에서 균일하다. 그러나, 시야에 보이는 세포 전부가 SEAM-3 결합을 나타낸 것은 아니다. 유착성 SK-MEL-28 및 CHP-134 세포에 대해서, SEAM-3 결합에 대해 양성인 세포는 SEAM-3 음성 세포와 형태학적으로 상이하다. 양성 세포는 둥그스름한 모양이지만, 음성 세포는 길쭉한 모양이다. 배양(37℃, 95% 공기:5% 이산화탄소) 중 SK-MEL-28 세포의 저속촬영 사진을 사용하여, 둥그스름한 세포가 죽은 세포가 아니라 세포분열을 하고 있는 세포임을 확인하였다. 세포는 약 3시간 동안 구형 모양을 유지한 후, 2개의 딸세포로 분할되었다.
SK-MEL-28 세포가 GD3 강글리오시드를 과발현하며, 항-GD3 mAb R24에 의한 결합에 대해서 양성임에 유념해야 한다. CHP-134 세포는 GD3 음성이며, R24 mAb에 의해 결합되지 않는다. 더욱이, CHP-134 세포는 GD3를 발현하지 않으므로, 이들은 또한 어떤 de-N-아세틸화 GD3 유도체로 생산하지 않는다. SEAM-3는 SK-MEL-28 세포 및 CHP-134 세포와 모두 결합하므로(사실 CHP-134 세포와의 결합이 더 많이 나타난다), 이들 데이터는 SEAM-3가 GD3 또는 GD3 유도체 이외의 다른 항원과 결합한다는 것을 시사한다. 이에 더하여, SEAM-3는 폴리시알산으로부터 유래하는 항원과는 결합하지 않는데, 이는 그것이 N-CAM을 발현하지 않는 SK-MEL-28 세포와 결합하기 때문이다. 따라서, SEAM-3는 GD3 또는 N-CAM 이외의 다른 항원과 결합한다.
실시예 13
유세포분석에 의해 측정된 SK - MEL -28 흑색종, Jurkat T 세포 백혈병 및 CHP -134 신경모세포종 세포와 SEAM -3 결합
세포(웰 당 약 105)를 바닥이 평평한 96-웰 조직 배양 플레이트(Nunc) 위에 평판하고 성장 배지와 함께 하룻밤 인큐베이션한 후 분석하였다. 트립신(SK-MEL- 28) 또는 CDR(CHP-134)에 의해 플레이트에서 세포를 분리한 다음, 둥근 바닥 96-플레이트에 수집하고 5분간 500g에서 회전시킨 후, 얼음 냉각한 1%(v/v) 포름알데히드로 고정시켰다. 20분 후 세포를 원심분리(상기 참조)하여 펠릿으로 만들고, 1시간 동안 Triton X-100(0.5% w/v)를 함유한 그리고 함유하지 않은 3%(v/v) 염소 혈청 차단 용액과 함께 인큐베이션하였다. 다음에, 1차 항체를 첨가하고 2시간 동안 또는 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 세포를 얼음 냉각한 PBS 중에서 펠릿화 및 재현탁에 의해 2회 세척하였다. 2차 항체(Invitrogen, 상기 설명된 바와 같음)를 4℃ 암소에서 적어도 1시간 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 다시 회전 및 세척(3회)을 연속하여 행한 후, Guava EastCyte 유세포분석기로 결합을 분석하였다. 대조군 샘플을 이소타입-매치 부적합 항체(Southern Biotech)로 처리하였으며, 이것을 바탕 형광을 만드는데 사용하거나, 또는 이 세포에 의해 특이적으로 발현되는 항원에 반응성인 양성 대조군 mAb로 처리하였다(즉, SK-MEL-28 세포에 대한 항-GD3 및CHP-134 세포에서 항-NCAM). 이에 더하여, 세포에 mAb를 첨가하기 전에 50㎍/mL N-Pr NmB PS와 함께 SEAM-3를 예비 인큐베이션하여 Jurkat 세포에 대한 결합 특이성을 나타내었다.
도 44-46에 나타낸 대로, SEAM-3은 3개 셀라인 모두에서 표면에 결합한다(-Triton). 최대 결합량은 CHP-134 세포에서 관찰되었고(도 45), Jurkat 세포에서는 최저였지만(도 46), Jurkat 세포와의 결합도 여전히 유의한 정도였다. 3개 셀라인은 모두 상당한 양의 내부 SEAM-3 반응성 항원(+Triton)을 함유한다.
실시예 14
암 세포의 생육성에 대한 SEAM -3 결합의 효과
SEAM-3 또는 대조군 mAb(부적합 이소타입 IgG2b 또는 항-GD3, R24)의 존재하에 인큐베이션된 SK-MEL-28 세포의 세포 생육성을 제조자의 지시에 따라 ViaCount 시약(Guava Technologies, Hayward, CA)을 사용하여 측정하였다. 간단히 말해서, mAb와 함께 48시간 동한 인큐베이션된 세포를 조직 배양 플레이트로부터 절단시키고(결합 분석에 대한 상기 설명한 대로), 원심분리하여 수집하고, ViaCount 시약에 재현탁하였다. Guava EasyCyte 유세포분석기에 미리 설정된 프로그램을 사용하여 생육성을 분석하였다. 이 프로그램은 아폽토시스에 대한 프리셋 게이트를 가지며, 이것은 우리 연구에 통상대로 포함되었다. 도 47에 나타낸 대로, mAb와 함께 24시간 인큐베이션한 후, SEAM-3은 부적합 IgG2b 대조군 mAb에 비해 생육성 세포의 수를 상당히 감소시킨다(P<0.001, ***로 표시). 도 48에 나타낸 2차 실험에서 SEAM-3은 IgG2B 대조군 mAb에 비해 생육성 세포의 수를 감소시키고(P<0.05, *로 표시), 아폽토시스성 세포(P<0.05) 및 죽은 세포(P<0.01)의 수를 증가시킨다. 유사하게, 양성 대조군 mAb, R24는 음성 대조군에 비해 생육성 세포 수를 감소시키고(P<0.01, **로 표시), 아폽토시스성 세포(P<0.01) 및 죽은 세포(P<0.001) 수를 증가시킨다. 이 결과는 세포 표면에 결합한 SEAM-3가 아폽토시스를 유도하고 세포사를 증가시킨다는 것을 증명한다.
실시예 15
Ki -67 항원의 발현에 의해 측정된 SEAM -3 결합과 세포 증식 사이의 관련성
상기 데이터는 SEAM-3가 어떤 세포분열 단계에 있는 암 세포의 표면에 결합 한다는 것을 시사했다. 이것을 증명하기 위하여, SK-MEL-28 세포를 SEAM-3 결합 및 세포 증식 마커인 Ki-67 항원(Brown et al. Histopathology. 2002, 40:2-11)의 발현에 대해 분석하였다. 세포를 Triton의 부재하에 SEAM-3 결합을 측정하는데 사용된 것과 동일한 과정에 의해 처리하였다. 세척하여 미결합 SEAM-3를 제거한 후, 세포를 0.5% Triton을 함유하는 3%(v/v) 염소 혈청으로 처리하여 항-Ki-67 항체를 진입시켰다. 4℃에서 1시간 후, 항-Ki-67을 첨가하고 2시간 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 다음에, 세포를 원심분리하여 수집하고, PBS로 2회 세척하고, 2개의 형광 표지된 염소 항-마우스 2차 항체를 첨가했는데, 이것은 항 IgG2b-Alexa Flour 594(Invitrogen); 항-IgM-Alexa Flour 488(Invitrogen)이다. 광범한 세척 후 세포를 Guava EasyCyte 유세포분석기로 분석하였다.
세포가 지수 성장기에 있을 때, 약 20%의 세포는 표면에서 SEAM-3 반응성 항원을 발현하고(유세포분석 및 형광현미경 데이터에 의함), 20-25%는 증식 마커 Ki-67을 발현하는(유세포분석에 의함) 것으로 판명되었다. 도 50에 나타낸 대로, Ki-67과 SEAM-3 반응성 항원을 표면에서 모두 발현하는 세포 집단이 있다(약 11%). 그러나, 일부 세포는 Ki-67 항원만을 발현하거나(12%) SEAM-3 반응성 항원만을 발현한다(13%). Ki-67 항원의 검출은 암 생검조직 샘플에서 활발히 분열하고 있는 종양 세포 퍼센트를 결정하는데 사용될 수 있다(Brown et al. Hxstopathology. 2002, 40:2-11). 이 실험을 통해 획득된 수를 "S-기", 성장, 또는 증식 분획이라고 명명한다(Brown et al. Histopathology. 2002, 40:2-11). 실제로, Ki-67은 "S-기"에서부터 적어도 후기까지 증식 내내 존재한다. 유세포분석 이중 표지 실험(도 50)은 세포 표면에서 Ki-67 및 SEAM-3 반응성 항원의 발현이 중첩된다는 것을 나타내며, 이것은 적어도 일부 부분에서, 표면에서의 SEAM-3 반응성 항원 발현이 세포분열의 일부 후기 단계에 연관될 수 있음을 확인시켜 준다.
세포 성장에 대한 SEAM-3 mAb의 영향을 더 평가하기 위하여, SEAM-3로 처리한 후의 세포 주기 단계를 결정하였다. 이 실험에서는 세포를 형광 DNA 결합 염료 프로피듐 요디드로 염색하여 여러 세포 주기 단계에 있는 세포 집단을 특성화하였고, 대조군 항체로서 노코다졸(유사분열 세포를 정지시키는 약물) 및 SEAM-3를 첨가한 것의 효과를 특성화하였다.
약 105 SK-MEL-28 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트 위에 평판하여 유착되도록 두었다. 24시간 후 배지를 항체 또는 약물이 있는 배지로 교체하고 48시간 더 인큐베이션하였다. 세포를 회전시키고(혹시 분리된 어떤 세포를 수집하기 위해), 4℃에서 적어도 30분간 70% 얼음 냉각한 메탄올(적가)에 고정시켰다. 세포를 PBS로 2회 세척하고, DNA만이 염색되도록 확실히 하기 위해서, 고정된 세포를 37℃에서 30분간 리보뉴클레아제 I(100㎍/mL, 출처)로 처리하였다. 프로피듐 요디드(50㎍/mL)를 첨가하고, Guava EasyCyte 유세포분석기를 사용하여 샘플을 분석하였다.
도 49에 나타낸 대로, 이소타입-매치 대조군 항체와 함께 48시간 동안 인큐베이션한 세포는 대부분의 세포(68%)가 Go, 또는 휴지 상태(비-증식)에 있고, 10%는 "S-기"에 그리고 15%는 G2/M 기에 있는 프로파일을 나타내었다. 다른 세포 집단(약 10%)은 pre-Go 기에 있었다. 이 pre-Go 기는 아폽토시스의 표시일 수 있다. SK-MEL-28 세포는 48시간 동안 노코다졸(100nM)로 처리함으로써 G2/M 기(유사분열)에서 정지될 수 있었다(도 49). 이 경우, 약 50%의 세포가 G2/M 기에서 정지되었다. 반면에, SEAM-3와 함께 세포를 인큐베이션한 경우, Go, S-기 및 G2/M 기에 있는 세포 집단이 감소한 반면, pre-Go에 있는 세포의 수는 증가하였다(도 49).
더 나아가, 이 데이터는 SEAM-3이 SK-MEL-28 세포의 생육성을 감소시킨다는 증거를 제공하며, 이는 이 항체의 효과가 세포가 pre-Go 기에 진입하는 것을 촉진한다는 것을 시사한다. 흥미롭게도, 흑색종 세포를 죽인다고 이미 밝혀진 항-강글리오시드 GD3 항체(R24)로 처리된 세포는 유사분열 상태에 있는 세포의 수가 증가하였다. 따라서, 세포 주기/아폽토시스성 메커니즘을 방해하는데 대한 SEAM-3의 작용 메커니즘(들)은 R24에 의해 나타났던 것들과 상이할 수 있다. 이에 더하여, 세포 주기에 대한 효과의 차이는 SEAM-3와 R24가 암 세포 상의 상이한 에피토프에 결합한다는 또 다른 증거이다.
실시예 16
SEAM -3 mAb 를 암호화하는 핵산의 클로닝 및 서열화
항원 인식에 대한 분자적 기초를 조사하기 위하여, N. meningitidis B 군에 대해 살균성인 5개 항-N-Pr NmB PS 쥐 mAb의 가변영역(V) 유전자를 클로닝하고 서열화하였다. 다음의 재료 및 방법을 이 실험에서 사용하였다.
방법 및 재료
mAb . 항-N-Pr NmB PS 쥐 mAb SEAM-2(IgG3), SEAM-3(IgG2b), SEAM-12(IgG2a), SEAM-18(IgG2a)이 이전에 설명된 4개의 우수한 항원 특이성 군을 각각 대표한다 (Granoffet al. (1998) J Immunol 160, 5028-36). 또한, SEAM-35(IgG2a)를 포함시켰는데, 이것은 나머지 4개의 SEAM mAb에 비해 인간 신경세포 셀라인 CHP-134에 의해 발현되는 폴리시알산 항원과 높은 교차-반응성을 나타낸다. mAb들은 보체의 존재하에 살균성이며, 어린 래트 모델에서 수막구균 박테리아에 대한 수동적 보호를 부여한다. SEAM-2 및 SEAM-3은 숙주 시알산에 대해 검출가능한 자기반응성 활성을 갖지 않지만, SEAM-12 및 SEAM-18은 최소한의 교차-반응성을 나타낸다.
dsDNA ELISA . Gilkeson et al. (1993) J Immunol 151, 1353-64에 설명된 방법을 이용하여 dsDNA와 결합하는 mAb를 측정하였다. 양성 대조군 항-DNA mAb는 QED Biosciences(San Diego, CA)로부터, 이소타입-매치 부적합 mAb는 Southern Biotech Inc.(Birmingham, AL)로부터 획득하였다.
V 유전자 서열화. 마우스 하이브리도마 셀라인으로부터의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변영역 유전자를 축퇴 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하고, 숙주로서 E. coli 균주 XL-2 Blue를 이용하여 Wang et al., (2000) J Immunol Methods 233, 167-77에 설명된 대로 벡터 pGEM3zf (Promega, Madison, WI)에 클로닝하였다. LB-암피실린 플레이트 상에서 선별된 각 형질전환체로부터의 플라스미드 DNA를 제조자의 지시에 따라 Qiagen Mini Prep 키트(Qiagen)를 사용하여 분리하였다. 클로닝된 V 유전자들을 BioNexus(Oakland, CA)에 의해 서열화하였다.
V 유전자 서열 분석. mAb 뉴클레오티드 서열을 IGMT/V-QUEST 및 마우스 면역글로불린 뉴클레오티드 서열 데이터베이스를 사용하여 분석하였다. 이 서열 데이터베이스는 Marie-Paule Lefranc(Universite Montpellier II, CNRS, LIGM, IGH, IFR3, Montpellier, France)에 의해 시작되어 운영되는 국제 ImMunoGeneTics
Figure 112008052552933-PCT00023
정보 시스템(IMGT, 인터넷 주소 imgt.cines.fr)의 온라인 웹 기능을 통해서 입수하였다. 데이터베이스에 있는 점라인 서열과 클로닝된 V 유전자 서열의 최근접 매치에 기초하여 잠정적 점라인 유전자를 선별하였다. 아미노산 서열과 유전자 서열을 모두 BLAST(Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res 25, 3389-402)를 이용하여 GenBank 논-리던단트(non-redundant) 서열 데이터베이스에 있는 각 서열과 비교하였다. 추가하여, 항-NmB PS 쥐 mAb, 735(IgG2a)를 발현하는 하이브리도마 클론에 의해 사용된 잠정적 점라인 유전자를 문헌으로부터 확인하였다. 이 mAb는 아미노산 서열만 이용할 수 있었으므로(Klebert et al., (1993) Biol Chem Hoppe Seyler 374, 993-1000; Vaesen et al.(1991) Biol Chem Hoppe Seyler 372, 451-3), 이 mAb에 대한 점라인 유전자를 IGMT/V-QUEST 및 GenBank/EMBL 데이터베이스의 최근접 아미노산 서열 매치에 기초하여 예측한다(Chenna et al., (2003) Nucleic Acids Res 31, 3497-500). 또한, 우리는 Berry 등((2005) Mol Immunol 42, 335-44)에 의해 보고된 항-NmB PS mAb 2-2-B(IgM, Mandrell et al. (1982) J Immunol 129, 2172-8)에 대한 유전자 서열 및 점라인 유전자 지정을 우리의 비교 분석에 포함시켰다.
결과
SEAM -3 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 가변영역의 핵산 및 아미노산 서열의 분석. SEAM-3 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드의 가변영역의 핵산 및 아미노산 서열은 도 51에 제공된다. 도 52 및 53은 SEAM-3 경쇄 및 중쇄 가변영역 DNA 서열을 각각 나타내며, 프레임워크(예를 들어, FR1 - IMTG로 표시; 도 56-58) 및 CDR 영역은 국제 면역유전학 정보 시스템(IMGT) 규정(Lefranc et al. IMGT, the international ImMunoGeneTics information system
Figure 112008052552933-PCT00024
. Nucl. Acids Res., 2005, 33., D593-D597)에 의해 정의된 대로 표시된다.
쥐 항-N- Pr NmB PS mAb 의 가변영역 유전자 활용. 항-N-Pr NmB PS 및 항-NmB PS mAb의 점라인 유전자 활용성을 도 55에 제공된 표에서 비교한다. 각 아미노산 서열은 도 50 및 51에 나타낸다. V 영역 레퍼토리는 비교적 소수의 고도로 관련된 VL 또는 VH 유전자 과에 제한된다. 예를 들어, 상이한 우수한 항원 특이성을 갖는 SEAM-2 및 SEAM-3은 동일한 VL 아미노산 서열을 가지며(도 52), 이 VL 유전자는 자기반응성 항-NmB PS mAb인 2-2-B 및 735를 암호화하는 것과 동일한 과의 유전자 과(IgGKV1)로부터 유래한다(도 55). 유사하게, 상이한 우수한 항원 특이성을 갖는 SEAM-12 및 SEAM-18에 의해서 사용된 VL 유전자도 동일한 과(IgGKV4)로부터 유래한다. SEAM-3 및 SEAM-18의 각 VH 서열은 서로 거의 동일하며(96% 동일성), SEAM-35 VH에 사용된 것과 같은 점라인 유전자 과(IgGHV7S3)로부터 유래한다(도 55). SEAM-2 및 SEAM-12의 점라인 VH 유전자는 서로 상이할 뿐만 아니라 나머지 3개의 항-N-Pr NmB PS mAb와도 상이하지만, SEAM-2에 사용된 점라인 VH 유전자는 2개의 자기반응성 항-NmB PS mAb, 2-2-B 및 735에 의해서 사용된 것들과 관련된다(둘 다 72% 동일성).
항-NmB PS mAb, 2-2-B 및 735는 NmB PS와 반응성이나, 항-N-Pr NmB PS SEAM-2는 그렇지 않다. 따라서, SEAM-2와 자기반응성 mAb인 2-2-B 및 735에서 각 중쇄 및 경쇄 V 아미노산 서열 양자의 근접한 상동성(VH 70%, VL 75%)에 특히 관심이 간 다. 이 두 서열의 가장 두드러진 차이는 중쇄(H-CDR3)에 있는데, SEAM-2는 최소 4개의 아미노산으로 구성되고, 이중 2개는 글리신인데, 이것은 mAb 735의 8개 아미노산 길이와 비교된다.
항-NmB PS mAb 2-2-B의 VL 및 VH 유전자는 이들의 잠정적 점라인 유전자와 비교하여 돌연변이되지 않는다(100% 동일성)(도 55). 유사하게, 항-NmB PS mAb 735의 발현된 VL의 아미노산 서열도 지정된 점라인 유전자 서열과 > 99% 동일하다. 반대로, 항-N-Pr NmB PS mAb는 각 점라인 서열과 비교하여 더 높은 퍼센트의 돌연변이를 가진다(발현된 유전자는 점라인 유전자와 89% 내지 95% 동일하다, 도 55). 또한, 5개의 항-N-Pr NmB PS mAb는 모두 H-CD3에 하나 이상의 아르기닌 잔기를 함유하는데, 이것은 D-J 접합부에서의 편집에 의해 암호화된 것이다. 2개의 항-NmB PS mAb는 어느 것도 H-CDR3에 아르기닌을 함유하지 않는다.

Claims (44)

  1. 피험자에서 암성 세포의 성장을 억제하는 방법으로서, 피험자에 존재하는 암성 세포의 세포외 접근가능한 표면에 있는 de-N-아세틸화 시알산(deNAc SA) 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 제약학상 허용되는 제제를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 투여가 항체에 의해 결합된 암성 세포의 생육성의 감소를 촉진하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, deNAc SA 에피토프가 세포분열 동안 암성 세포의 표면에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 암은 흑색종 또는 백혈병인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 암은 신경모세포종인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 항체를 주입에 의해 또는 국소 주사에 의해 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 투여가 암성 세포를 제거하기 위한 외과적 개입 전에 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 투여가 암성 세포를 제거하기 위한 외과적 개입시에 또는 이후에 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 피험자에게 암 화학요법 또는 방사선요법 중 적어도 하나를 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 피험자에서 암성 세포의 성장을 억제하는 방법으로서, 피험자에 존재하는 암성 세포의 세포외 접근가능한 표면에 있는 SEAM-3 반응성 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 제약학상 허용되는 제제를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 투여가 항체에 의해 결합된 암성 세포의 생육성의 감소를 촉진하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, SEAM-3 반응성 항원이 세포분열 동안 암성 세포의 표면에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 암은 흑색종 또는 백혈병인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 9 항에 있어서, 암은 신경모세포종인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 9 항에 있어서, 항체를 주입에 의해 또는 국소 주사에 의해 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 9 항에 있어서, 상기 투여가 암성 세포를 제거하기 위한 외과적 개입 전에, 동시에, 또는 이후에 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 9 항에 있어서, 피험자에게 암 화학요법 또는 방사선요법 중 적어도 하나를 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 9 항에 있어서, 항체는 SEAM-3 단클론 항체(ATCC 기탁 번호 HB-12170)인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, SEAM-3 단클론 항체가
    용액 중에서 SEAM-3 mAb로부터 하전된 분자의 분리를 촉진하기에 적합한 조건하에서 고염 농도 용액 중에서 SEAM-3 단클론 항체를 포함하는 조성물을 인큐베이션하는 단계; 및
    용액으로부터 SEAM-3 mAb를 분리하는 단계
    의 방법에 의해 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 피험자에서 암성 세포에 대항하는 항체를 도출하는 방법으로서, de-N-아세틸 화 시알산(deNAc SA) 항원 및 애쥬번트를 포함하는 면역원성 조성물을 피험자에 투여하는 단계를 포함하며, 피험자는 de-N-아세틸화 시알산(deNAc SA) 항원을 특징으로 하는 암을 가진 피험자이거나 가진다고 의심되는 피험자이고, 상기 투여가 암성 세포의 세포외 접근가능한 표면에 있는 deNAc SA 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 도출하는데 효과적인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 암은 흑색종 또는 림프종인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 암은 신경모세포종인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 18 항에 있어서, 면역원성 조성물의 deNAc SA 항원을 deNAc SA 항원의 엑소시알리다제 처리에 의해 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 18 항에 있어서, deNAc SA 항원이 deNAc SA 항원 콘쥬게이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, deNAc SA 항원 콘쥬게이트가 프로피오닐-연결 또는 아세틸-연결 deNAc SA 항원 콘쥬게이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 피험자에서 종양을 검출하는 방법으로서, 암을 가진다고 의심되는 피험자로 부터 획득한 생물학적 샘플을 de-N-아세틸화 시알산(deNAc SA) 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 접촉은 생물학적 샘플 중의 deNAc SA 에피토프와 항체의 특이적 결합에 적합한 조건하에서 행해지고, 항체 결합의 존재 또는 부재가 세포 표면 deNAc SA 에피토프를 갖는 암성 세포가 피험자에 존재 또는 부재함의 표시인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 피험자에서 종양을 검출하는 방법으로서, 암을 가진다고 의심되는 피험자로부터 획득한 생물학적 샘플을 SEAM-3 반응성 항원과 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 접촉은 생물학적 샘플 중의 SEAM-3 반응성 항원과 항체의 특이적 결합에 적합한 조건하에서 행해지고, 항체 결합의 존재 또는 부재가 세포 표면 SEAM-3 반응성 항원을 갖는 암성 세포가 피험자에 존재 또는 부재함의 표시인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 항체가 SEAM-3(ATCC 기탁 번호 HB-12170)인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 다당(PS) 유도체의 생산 방법으로서, N-아실-만노스아민 및 아민-보호된 만노스아민을 포함하는 성장 배지 중에서 대장균 K1 박테리아를 배양하는 단계를 포함하며, 보충 만노스아민의 부재하에서 박테리아는 캡슐 다당의 생산을 결핍하고, 상기 배양이 아민 보호기 및 N-아실화 기를 갖는 아민-보호된 PS 유도체의 생산을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 방법이, 아민 보호기를 제거하고 탈보호된 잔기를 단백질 캐리어와 커플링하여 콘쥬게이트된 PS 유도체를 생산하는 조건하에서, 아민-보호된 PS 유도체를 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. deNAc SA 항원의 생산 방법으로서, N-아실-만노스아민 및 아민-보호된 만노스아민을 포함하는 성장 배지 중에서 포유류 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 배양이 포유류 세포의 표면에서 아민 보호기 및 N-아실화 기를 갖는 아민-보호된 deNAc SA 항원의 생산을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 방법이, 아민 보호기를 제거하고 탈보호된 잔기를 단백질 캐리어와 커플링하여 콘쥬게이트된 deNAc SA 항원을 생산하는 조건하에서, 아민-보호된 deNAc SA 항원을 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 면역원성 조성물의 생산 방법으로서, de-N-아세틸화 시알산(deNAc SA) 항원을 포함하는 조성물을 엑소시알리다제와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 접촉은 조성물 중의 N-아실화 시알산 중합체 오염물질의 변성을 제공하기에 충분한 조건하에서 행해지고, 상기 접촉이 deNAc SA 항원-농후화 조성물을 생산하는 것을 특징으 로 하는 방법.
  32. 제 31 항의 방법에 의해 처리된 deNAc SA 항원을 포함하는 조성물.
  33. SEAM-3 단클론 항체를 분리하는 방법으로서, 용액 중에서 SEAM-3 mAb로부터 하전된 분자의 분리를 촉진하기에 적합한 조건하에서 고염 농도 용액 중에서 SEAM-3 단클론 항체를 포함하는 조성물을 인큐베이션하는 단계; 및 용액으로부터 SEAM-3를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 33 항의 방법에 의해 분리된, 분리된 SEAM-3 단클론 항체와 제약학상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  35. SEAM-3 경쇄 폴리펩티드의 가변영역의 i) 아미노산 잔기 24-39, ii) 아미노산 잔기 55-61, 및 iii) 아미노산 잔기 94-100을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  36. 제 35 항에 있어서, 경쇄 폴리펩티드가 SEAM-3 경쇄 폴리펩티드의 가변영역의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  37. 제 35 항의 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  38. 제 35 항의 분리된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 숙주세포.
  39. SEAM-3 중쇄 폴리펩티드의 가변영역의 i) 아미노산 잔기 26-35, ii) 아미노산 잔기 50-66, 및 iii) 아미노산 잔기 101-108을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  40. 제 39 항에 있어서, 중쇄 폴리펩티드가 SEAM-3 중쇄 폴리펩티드의 가변영역의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  41. 제 39 항의 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  42. 제 39 항의 분리된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 숙주세포.
  43. SEAM-3 단클론 항체(ATCC 기탁 번호 HB-12170)의 항원-결합 부분을 포함하는 항체, 및 공유 결합 부분을 포함하며, 공유 결합 부분이 폴리에틸렌 글리콜 부분, 항암제, 또는 항체의 항원-결합 부분인 것을 특징으로 하는 항체 콘쥬게이트.
  44. 제 43 항에 있어서, 항체가 SEAM-3 단클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
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